首页 / 专利库 / 疗法 / 疫苗 / 全细胞疫苗 / 人胚肺成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用

人胚纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用

阅读:37发布:2020-05-14

专利汇可以提供人胚纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了人二倍体 成 纤维 细胞 株Walvax-2在制备甲肝 疫苗 中的应用,人二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感,采用Walvax-2生产甲肝疫苗,可得到一种 抗原 纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍 体细胞 甲肝病毒纯化疫苗。,下面是人胚纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用专利的具体信息内容。

1.人胚二倍体纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的应用。
2.人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备治疗甲型肝炎病的疫苗中的应用。

说明书全文

人胚纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用

[0001] 发明所属领域:
[0002] 本发明属于疫苗技术领域,具体地说,本发明涉及人二倍体成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用,以及人二倍体成纤维细胞株在治疗甲型肝炎病的疫苗中的应用。背景技术:
[0003] 甲型肝炎(hepatitis A)又被称为甲肝,是由甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)引起的肝脏炎症病变为主的传染性疾病,是我国重要的卫生问题。以粪-口传播为主,任何年龄均可患病,但主要为儿童及青少年,病死率低,重症病人多为儿童。
[0004] HAV属于小核糖核酸病毒科,单列属。无包膜,直径为27nm~32nm,二十面立体对称的球形颗粒。具有嗜肝性,对环境耐受性强,耐酸、耐热,对20%乙醚及氯仿等不敏感。甲、β-丙内脂、高压均可使其灭活。HAV有多个基因型及一个血清型。
[0005] 1978年Provost和Hilleman从绒猴肝脏组织中提取得到HAV,1979年体外培养甲型肝炎病毒成功,至20世纪90年代中期,甲肝减毒活疫苗及甲肝灭活疫苗正式投入生产,甲肝疫苗的研究经历了漫长的时间及无数的实验。到目前为止,甲肝疫苗已经被证实是安全且有效的。
[0006] 全世界每年需要近1亿人份的HAV疫苗,因此需要大规模及高产量的HAV疫苗的生产。我国《中国药典》2010版三部规定“冻干甲型肝炎减毒活疫苗”及“甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)”的细胞培养基质为2BS株及KMB17株或其他经批准的人二倍体细胞株。2BS株及KMB17株均为我国自行研制的人源二倍体成纤维细胞,属于贴壁生长细胞。此类细胞生长和正常功能表达的前提条件是附着培养容器表面生长。当生产需要量少时,可采用转瓶、细胞培养瓶等进行培养,但这些培养容器表面积小,培养量少,不利于工业大规模生产。现阶段许多类型的细胞工厂投入疫苗生产,细胞工厂可大量增加培养表面积,提高每个单元的生产能,并很好的解决细胞贴壁生长及病毒滴度问题。但工业大规模生产仍需要大批量的细胞工厂,高成本限制了其工业生产的扩大及商业开发的潜能。因此经济上,使用生物反应器培养病毒是病毒性疫苗生产的最佳方法。
[0007] 使用微载体的生物反应器培养过程中,微载体为细胞生长提供了大量的表面积,实现了高密度培养,是一个高效的生产系统。该系统可以提供均质的细胞培养环境,更易于细胞稳定的生长及产物的高效表达。脊髓灰质炎及狂犬疫苗的生物反应器培养方式投入生产,证明了此方法在工艺放大时的优势及商业上的潜力。
[0008] 美国专利WO95/24468公开了微载体培养MRC-5细胞生产HAV的方法,在细胞-病毒培养物中收获了一定量的甲肝病毒。瑞士专利WO2003/049767公布了一种用微载体无血清培养Vero细胞大规模生产甲型肝炎病毒的方法。中国专利CN 101406699A公布了一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法。
[0009] 从现有技术来看,无论是MRC-5、2BS或是KMB-17,均在病毒疫苗生产中使用多年,安全性不容置疑。但缺点是细胞未推广使用及细胞代次高,限制了病毒产量的提高和进一步使用。人二倍体成纤维细胞株Walvax-2在中国专利201210371784.X已公开,但此细胞是否对甲肝病毒敏感及是否可利用其生产甲肝病毒疫苗不得而知。发明内容:
[0010] 本发明的一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用,人胚肺二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感,使用此细胞生产甲肝病毒疫苗可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞甲肝病毒纯化疫苗。
[0011] 本发明的另一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备治疗甲型肝炎病疫苗中的应用
[0012] 本发明公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的应用。
[0013] 本发明还公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备治疗甲型肝炎病的疫苗中的应用。
[0014] 本发明的人胚肺二倍体成纤维细胞株在中国专利201210371784.X已公开,为人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C201055,保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC,位于湖北省武汉市武汉大学校内,邮编430072,电话:027-68752319,Email:cctcc@whu.edu.cn。
[0015] Walvax-2细胞株对甲型肝炎病毒株敏感,且病毒产量高。将甲肝病毒接种至Walvax-2细胞上,在34~35℃常规培养下,就能生产高滴度的病毒疫苗原液;病毒原液通过抽提、浓缩、纯化、灭活并加入保护剂,就形成甲肝病毒灭活疫苗原液。疫苗原液分装后冻干即为冻干甲型肝炎灭活疫苗。
[0016] Walvax-2细胞株对现在流行的疫苗株敏感如H2株,YN5株,L-A-1株。在本发明中采用的甲型肝炎病毒,为甲型肝炎病毒YN5株,按专利程序要求在2001年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号是CCTCC NO:V200104,此病毒在专利02106985.9中已公开,处于公开状态,科学工作者可向该菌种保藏中心按章索取;人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,CCTCC NO:C201055按专利法要求寄存在中国典型培养物保藏中心,处于公开状态,科学工作者可向该菌种保藏中心索取;MRC-5(ATCC CCL171),WI-38(ATCC CCL75)登载于美国典型培养物保藏中心的目录中,处于公开状态,科学工作者可向该菌种保藏中心索取。本发明中对照细胞KMB-17,2BS登载于中国典型培养物保藏中心的目录中,处于公开状态,科学工作者可向该菌种保藏中心索取。
[0017] 本发明中,HAV是指甲肝病毒。
[0018] 采用人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2生产的甲肝病毒灭活疫苗与MRC-5,WI-38,KMB-17,2BS细胞生产的甲肝病毒灭活疫苗相比,本发明的优点主要体现在以下几个方面:
[0019] 1)对现用于甲肝病毒灭活疫苗用毒种具有很好的敏感性,适应性,病毒产量高,制成的疫苗免疫原性好。
[0020] 2)人胚肺二倍体成纤维细胞株适应在细胞工厂或生物反应器工艺上或在微载体上进行很好的适应,适合大规模生产和应用。
[0021] 3)人源Walvax-2细胞基质培养HAV,避免了非人源宿主细胞蛋白残留,降低了培养过程中的外源因子污染,疫苗有更高的安全性。
[0022] 4)所制备的疫苗安全性高,免疫效果好,使用方便,纯度高,本发明的生产方法制备的甲肝灭活疫苗产生的ED50显著低于GSK的甲肝灭活疫苗。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明,而不能限制本发明的保护范围。
[0024] 实施例1用Walvax-2细胞株制备甲型肝炎灭活疫苗
[0025] 1.1细胞工厂制备Walvax-2细胞
[0026] Walvax-2细胞20代复苏于T75瓶中,细胞活率99%以上,37℃±0.5℃密闭培养,直至细胞覆盖培养生长面,用0.25%胰蛋白酶消化,以1:2的分种率传代培养,至可用于生物反应器中大规模生产细胞量。将细胞消化后收集至三瓶中等待接种病毒。细胞培养液中细胞生长培养基为含体积百分比为10%新生血清的MEM营养液
[0027] 1.2Walvax-2细胞接种HAV病毒
[0028] 收集好的Walvax-2细胞取样计数,调细胞浓度并接种甲型肝炎病毒YN5株CCTCC NO:V200104,感染复数MOI为0.5,于37℃条件下吸附30min,并不时摇动,使病毒充分接触细胞。
[0029] 1.3Walvax-2细胞大规模生产HAV
[0030] 提前将化好的生物反应器及微载体高压灭菌,通过补液将细胞培养液灌入反应容器中,溶液的加入量为反应器体积的70%,微载体10g/L溶液,pH在6.5~7.5之间,搅拌速度为40rpm,平衡反应器及微载体系统,使环境适于培养Walvax-2细胞。
[0031] 将实施例1中1.2的HAV病毒吸附后的Walvax-2细胞转入生物反应器中培养,5
接种浓度为10个/ml。以临界离底速度搅拌,使细胞吸附于微载体后,调整转速为40rpm,培养Walvax-2细胞在微载体上形成单层,培养系统为细胞培养液,通过灌注方式培养。待每个微载体的细胞贴壁率达80%以上时,将培养系统调整为病毒维持液继续培养。病毒维持液中病毒生长培养基为含体积百分比为2%新生牛血清的MEM营养液。初期维持0.3~
1.0培养体积/天,随着细胞病毒在生物反应器中培养时间的增加,逐步增加更换的溶液体积,调整至0.5~2.5培养体积/天。维持液的更换速度可依据溶液系统中乳酸及葡萄糖含量等检测结果的变化调整。以15L生物反应器为例,参数为pH为7.0~7.4,溶浓度为50%,搅拌速度为45rpm,温度为35℃±0.5℃,培养28天收获。结果如表1所示,甲肝病毒滴度随培养时间的增长而提高,在28天的时候滴度达到最高。
[0032] 表1生物反应器培养Walvax-2细胞及上清液中HAV滴度
[0033]
[0034] 1.4灭活甲肝疫苗的制备
[0035] 在本发明提供的甲肝灭活疫苗制备工艺,收集生物反应器培养消化后获得的细胞病毒液,冷却至4℃。并在4℃条件下超声破碎细胞,超声频率为600~750赫兹,每次超声时间为10s,间隔4s。细胞破碎率达95%以上时即可。收集细胞病毒混合液,离心6000rpm,20min,收集上清液。向上清液中加入氯仿抽提,体积比为1:1,混匀,4℃条件下抽提液离心,
8000rpm,5~10min,离心后明显可见混合液分为上下两层,收集上层清液。根据抽提效果抽提3~5次,收集抽提后溶液。
[0036] 采用100kDPall膜对抽提后收集的溶液超滤浓缩至原体积的1/5,然后再采用0.01M的PBS恢复到原体积,继续采用0.01M的PBS超滤浓缩至原体积的1/5,如此操作,反复3次,最后一次浓缩到原体积的1/10,浓缩液过滤澄清。0.2M的NaCl平衡Sepharose
4Fast Flow琼脂糖凝胶柱(GE XK 50/100),流速为13ml/min,平衡5~10个柱体积后,测定出液端pH,pH在7.0~7.4之间,即可上样。
[0037] 将上述浓缩液加入已平衡好的Sepharose 4FF琼脂糖凝胶柱上,上样量为80ml,用0.2M的NaCl流洗,流速约8ml/min,在线检测波长为280nm的紫外吸光值变化,分段收集峰的流出液。经ELISA试验检测,收集纯化后的HAV病毒液,加入终浓度为200μg/ml甲醛灭活,以1:4000比例,37~40℃灭活12天。灭活病毒原液经0.2μm除菌过滤,即为灭活的HAV原液。
[0038] 在本发明中公开的甲肝灭活疫苗,调整HAV含量并添加保护剂,分装,最终使每剂疫苗含纯化的灭活HAV病毒4800EU/ml。
[0039] 在本发明中冻干甲肝疫苗采用常规冻干方法,将原液与保护剂的混合液,分装在1.0ml/支的西林瓶中,-40℃预冻8小时,-10~-28℃真空干燥24小时,20~28℃干燥6小时,西林瓶封口压盖。
[0040] 实施例2不同浓度甲肝灭活疫苗的免疫原性检测
[0041] 采用小鼠体内效力检测甲肝灭活疫苗的免疫原性。ED50为半数有效量,指疫苗在一群动物中引起半数动物特异性抗体阳性反应的剂量。同一种动物在不同疫苗或相同疫苗不同含量中,ED50值越低越说明某动物产生特异性抗体的能力越高。
[0042] 采用本发明的生产方法制备一批甲肝灭活疫苗,批号为20110403,病毒滴度为40960EU/ml,调整甲肝抗原含量分别为2000EU/0.5ml、2400EU/0.5ml、2800EU/0.5ml及
3200EU/0.5ml。小鼠选取4~6周龄的ICR小鼠260只(SFP级)。每个抗原浓度的甲肝灭活疫苗(含Al(OH)3佐剂(1.0mg/ml)与不含Al(OH)3佐剂)分别作4倍系列稀释,各稀释3个稀释度,每个稀释度免疫10只小鼠。同时设阴性对照组-第9组,10只小鼠免疫生理盐;佐剂对照组-第10组,10只小鼠免疫1.0mg/ml的Al(OH)3佐剂。各组接种样品体积均为0.5ml/只,免疫28天后采集并分离血清,-4℃保存备用。采用甲型肝炎病毒抗体(HAV Ab)酶联免疫试剂盒检测,诊断试剂由北京万泰生物药业有限公司生产。
[0043] 结果如表2所示,当甲肝病毒抗原含量为2400EU/0.5ml时,ED50最低,即特异性抗体应答能力最强。1.0mg/ml Al(OH)3佐剂可提高本方法制备的甲肝灭活疫苗在小鼠体内的效力检测结果。
[0044] 表2不同抗原量的甲肝灭活疫苗在小鼠中的体内效力检测结果
[0045]
[0046] 实施例3甲肝灭活疫苗与现有甲肝疫苗的小鼠体内效力对比
[0047] 选取4~6周龄的ICR小鼠190只,随机分成七组。前三组作为试验疫苗组,30只/组,后三组作为对照疫苗组,30只/组,第七组为阴性对照组,10只/组。实验疫苗组小鼠接种的疫苗采用本发明所述的甲肝灭活疫苗,采用甲肝病毒HZD接种新人源二倍体细胞Walvax-2细胞,经过生物反应器培养,收获,纯化,灭活并加入Al(OH)3佐剂制成,0.5ml/支,含灭活甲肝病毒2400EU,Al(OH)3终浓度为1.0mg/ml,连续生产三批,批号为:
20111007、20111108及20111209。每个批号的甲肝灭活疫苗(含Al(OH)3佐剂1.0mg/ml)作4倍系列稀释,共稀释3个稀释度,每个稀释度免疫10只小鼠,共90只。对照疫苗组小鼠接种的疫苗为史克公司(GSK)生的甲肝灭活疫苗(批号为YHAVB440BA(2次试验)及YHAVB483AA),0.5ml/支,每个批号的甲肝疫苗作4倍系列稀释,共稀释3个稀释度,每个稀释度免疫10只小鼠,共90只。每支抽取0.5ml免疫小鼠,含甲肝灭活病毒720El.U/0.5ml。
阴性对照组,10只小鼠,每支免疫0.5ml生理盐水,结果见表3。
[0048] 对结果进行统计学分析,结果显示两种甲肝灭活疫苗的抗体反应明显不同,本发明的生产方法制备的甲肝灭活疫苗产生的ED50显著低于GSK的甲肝灭活疫苗(P<0.05)。由于ED50检测值越低说明ICR小鼠的抗体应答水平越高,因此本发明的甲肝灭活疫苗的特异性抗体应答能力强于GSK的甲肝疫苗。
[0049] 表3冻干甲肝灭活疫苗的小鼠体内效力检测与现有甲肝疫苗效力对比[0050]
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈