一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用
阅读：648发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种放射抗拒性 肺 癌全细胞 疫苗 及其制备方法和应用，具体地，本发明建立了一个放射抵抗性显著提高的放射抗拒性肺癌细胞株，保藏号为CCTCC C201537，利用该细胞株制备得到肺癌 全细胞疫苗 ，通过动物实验证实该肺癌全细胞疫苗具备显著抑制小鼠肺癌 肿瘤 生长、促进移植瘤细胞凋亡、降低移植瘤免疫逃逸PDL‑1蛋白表达的作用，且与CpG ODN联用抑瘤作用更加显著，并且部分小鼠肿瘤完全消失，获得持久特异性 抗肿瘤效果 。本发明为肺癌 治疗 和 预防 术后转移复发提供了新思路和方法。，下面是一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种放射抗拒性肺癌细胞株，其特征在于，所述的放射抗拒性肺癌细胞株的保藏号为CCTCC C201537。
2.权利要求1所述的放射抗拒性肺癌细胞株的用途，其特征在于，所述的用途选自：
a)制备肺癌全细胞疫苗；
b)建立放射抗拒性肺癌动物模型；
c)筛选对抗放射抗拒性肺癌的药物。
3.一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗，其特征在于，所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗由保藏号为CCTCC C201537的放射抗拒性肺癌细胞株制备得到。
4.根据权利要求3所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗，其特征在于，所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗的制备方法为：收集所述的放射抗拒性肺癌细胞株的培养液，灭活细胞后超声粉碎细胞，充分混匀制得所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗。
5.权利要求3或4所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
6.权利要求3或4所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗在制备抑制肺癌肿瘤生长、延长肺癌肿瘤患者的生存时间或提高肺癌患者肿瘤免疫功能的药物中的用途。
7.一种预防和/或治疗肺癌的药物，其特征在于，所述的药物由CpG ODN和权利要求3或
4所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗以及药学上可接受的载体组成。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述的CpG ODN是CpG ODN1826。
9.权利要求7所述的药物在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
10.权利要求7所述的药物在制备抑制肺癌肿瘤生长、延长肺癌肿瘤患者的生存时间或提高肺癌患者肿瘤免疫功能的药物中的用途。
一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 肺癌是许多国家常见的恶性肿瘤之一，已经成为人类因肿瘤致死的首位病因，最新调查显示其已占据中国男性恶性肿瘤发病率及男女恶性肿瘤病死率的首位。常规治疗手段包括手术、放疗和化疗，目前疗效不理想。这些治疗手段在杀伤或清除肿瘤细胞的同时极易损伤正常组织，尤其是伤害在机体抗肿瘤防御中占重要地位的免疫系统。患者肿瘤细胞自身的免疫逃逸和免疫系统的功能障碍促进了肿瘤的发生和发展。因而肿瘤的免疫治疗是多年来肿瘤治疗研究领域倍受关注的热点。其中，肿瘤细胞疫苗是研究较早的一种免疫疗法，然而在大多数情况下，由于肿瘤细胞的弱免疫原性以及机体对肿瘤的免疫反应是无效或微弱的，限制了其抗肿瘤的效果。因此，如何提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤效果是目前抗肿瘤研究的方向。
[0003] 中国期刊《广东药学院学报》，2008年02期，刊出的论文“Lewis全细胞肿瘤疫苗防治C57BL/6小鼠Lewis肺癌的实验研究”，探讨了Lewis全细胞肿瘤疫苗对小鼠Lewis肺癌的防治作用。方法：用Lewis全肿瘤疫苗免疫C57小鼠4次，其中首次免疫用含弗氏佐剂油剂疫苗，第4次免疫的同时在小鼠右腋下接种Lewis肺癌细胞，定期观察小鼠成瘤情况及小鼠免疫状态变化，用流式细胞术检测疫苗组和对照组小鼠外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD19+B细胞百分比，以及CD4/CD8的变化。结果显示：疫苗组与对照组小鼠成瘤率、成瘤时间、肿瘤大小差异均无显著性；疫苗组与对照组相比，其外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比差异无显著性，CD4/CD8比值的差异也无显著性，疫苗组外周血CD19+B淋巴细胞百分比略高于对照组，差异有显著性(P＝0.014)。结论：用Lewis肿瘤全细胞疫苗不能提高C57BL/6小鼠的T淋巴细胞免疫功能，可以提高其B淋巴细胞免疫，但不能使小鼠获得有效的免疫保护。
[0004] 目前尚未见针对肺癌且免疫原性强、抑瘤作用显著、效果持久的全细胞疫苗。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用。
[0006] 本发明提供了一种放射抗拒性肺癌细胞株，所述的放射抗拒性肺癌细胞株的保藏号为CCTCC C201537。
[0007] 本发明还提供了所述的放射抗拒性肺癌细胞株的用途，所述的用途选自：
[0008] a)制备肺癌全细胞疫苗；
[0009] b)建立放射抗拒性肺癌动物模型；
[0010] c)研究肺癌放射抗拒性的机理机制；
[0011] d)筛选对抗放射抗拒性肺癌的药物。
[0012] 本发明还提供了一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗，所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗由保藏号为CCTCC C201537的放射抗拒性肺癌细胞株制备得到。
[0013] 作为本发明的一种优选实施方式，所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗的制备方法为：收集所述的放射抗拒性肺癌细胞株的培养液，灭活细胞后超声粉碎细胞，充分混匀制得所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗。
[0014] 本发明还提供了所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
[0015] 本发明还提供了所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗在制备药物中的用途，所述的药物的用途选自：
[0016] a)抑制肺癌肿瘤生长；
[0017] b)延长肺癌肿瘤患者的生存时间；
[0018] c)提高肺癌患者的肿瘤免疫功能。
[0019] 本发明还提供了一种预防和/或治疗肺癌的药物，所述的药物由CpG ODN和所述的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗以及药学上可接受的载体组成。
[0020] 作为本发明的一种优选实施方式，所述的CpG ODN是CpG ODN1826。
[0021] 本发明还提供了所述的药物在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
[0022] 本发明还提供了所述的药物的制药用途，所述的制药用途选自：
[0023] a)抑制肺癌肿瘤生长；
[0024] b)延长肺癌肿瘤患者的生存时间；
[0025] c)提高肺癌患者的肿瘤免疫功能。
[0026] 本发明优点在于：
[0028] 2、本发明利用所述的放射抗拒性肺癌细胞株制备了放射抗拒性肺癌全细胞疫苗，且证实该疫苗具有显著抑制小鼠肺癌肿瘤生长、促进移植瘤细胞凋亡、降低移植瘤免疫逃逸PDL-1蛋白表达的作用。显著优于正常的LLC Lewis肺癌细胞株，且发明人在研究过程中证实其效果显著优于建立的其他放射抗拒性肺癌细胞株。
[0029] 3、本发明提供了放射抗拒性肺癌细胞株与CpG ODN的组合物，该组合物具备协同作用，抑瘤作用十分显著，并且部分小鼠肿瘤完全消失，获得持久特异抗肿瘤效果。
[0030] 本发明为肺癌治疗和预防术后转移复发提供了新思路和方法，可采用X线多次照射制备放射抗拒性肺癌细胞株，制备肺癌全细胞疫苗，再结合CpG ODN从而使小鼠获得主动特异性抗肿瘤免疫功能。附图说明
[0031] 图1.LLC细胞与R-LLC细胞照射后存活情况。
[0032] 图2.多靶单击模型拟合LLC、R-LLC细胞存活曲线。
[0033] 图3.LLC和R-LLC细胞Survivin蛋白的表达情况。
[0034] 图4.LLC细胞与R-LLC细胞分泌细胞因子水平的比较。
[0035] 图5.各组小鼠肿瘤生长曲线。注：Control(阴性对照组)、CpG(CpG组)、CpG+LLC(CpG联合LLC瘤苗组)、CpG+R-LLC(CpG联合R-LLC瘤苗组)、LLC(LLC瘤苗组)、R-LLC(R-LLC瘤苗组)。
[0036] 图6.各组小鼠Kaplan-Meier曲线。
[0037] 图7.各组小鼠移植瘤细胞凋亡病理图(200×)。注：A阴性对照组；B CpG组；C LLC瘤苗组；D R-LLC瘤苗组；E CpG+LLC瘤苗组；F CpG+R-LLC瘤苗组。
[0038] 图8.不同免疫方法小鼠移植瘤凋亡率的比较。
[0039] 图9.不同免疫方法小鼠移植瘤PDL-1mRNA表达水平比较。
[0040] 图10.Western-blotting检测各组小鼠移植瘤PD-L1蛋白的表达。
[0041] 图11.各组小鼠移植瘤PD-L1蛋白表达密度值分析。
具体实施方式
[0042] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0043] 实施例1本发明的放射抗拒性肺癌细胞株的建立
[0044] 1细胞培养与照射方法
[0045] LLC Lewis肺癌细胞株(简称LLC细胞，购于ATCC)用含10％胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱内培养，将细胞传代至指数生长期使用。用直线加速器6MV X线照射，源皮距100cm，表面覆1cm厚组织补偿胶。
[0046] 2放射抗拒性细胞株R-LLC的建立
[0047] 取指数生长期LLC细胞，消化成单细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，待细胞生长至指数生长期后，予照射野7cm×7cm，6MV X射线，吸收剂量率200cGy/min照射5Gy后继续常规培养，待细胞达指数生长期末时，消化细胞，将适量细胞接种传代，待细胞再次达到指数生长期时再照射相同剂量。重复以上过程，总共照射6次，获得放射抗拒性细胞株R-LLC(该细胞株已于2015年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，保藏编号为CCTCC C201537，培养物名称为放射抗拒性Lewis肺癌细胞株R-LLC，下文中简称R-LLC)，整个照射及培养过程共约4个月。对反复放射线照射得到细胞株R-LLC常规传代>10代后用于下述实验。
[0048] 3辐射抵抗性的验证
[0049] 3.1CCK-8实验
[0050] 在96孔板中配制各100μl的LLC和R-LLC细胞悬液(约5000个细胞左右)。将培养板在培养箱预培养24h。随后将其分别接受0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量的照射，24h后向培养板加入10μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h。用酶标仪测定细胞悬液在450nm处的吸光度。
[0051] 3.2克隆扩增实验
[0052] 取对数生长期的LLC和R-LLC细胞接种于6孔板，贴壁12h后，单次剂量照射分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，随后将细胞用胰酶消化，吹打成单细胞悬液，分别计数后将其接种于60mm的培养皿中(不同照射剂量、不同细胞/孔)继续培养14d，中间换液1次，最后用4％多聚甲醛固定、亚甲蓝染色。计算集落数(>50个细胞的集落)和接种效率(PE)，并计算细胞存活分数(SF)。集落形成率(PE)＝各组集落数/接种细胞数；细胞存活分数(SF)＝(处理组PE/对照组PE)×100％。应用Graphpad prim 5版软件，单击多靶模型拟合两组细胞存活曲线，计算两组细胞放射生物学参数D0(平死剂量)、N(外推值)、Dq(准阈剂量)和SF2的值。D0指细胞存活率下降到照射前的37％所需的照射剂量，N为外推数或靶数。若从存活分数1.0(100％存活)处作一条与横坐标平行的线与存活曲线直线部分的外推线相交，交点在剂量轴上的投影点即为准域剂量(Dq)。Dq是衡量肩区大小的参数。N和Dq的大小代表细胞累积亚致死性损伤的能力与损伤的修复能力有关。Dq的计算公式如下：Dq＝D0*lnN。SF2指细胞照射
2Gy后的存活分数。
2Gy后的存活分数。
[0053] 4细胞株相关蛋白及细胞因子的检测
[0054] 4.1Western Blot
[0055] LLC细胞和R-LLC细胞培养至指数生长期后，用冷细胞裂解液(含1:100的PMSF(苯甲基磺酰氟)提取蛋白质，Bradford法(考马斯亮兰法)测定所提取蛋白的含量。每个孔道加入含50μg的两组细胞的蛋白样品。电泳后，湿转法将凝胶转移到PVDF膜。转膜完成后将膜用5％脱脂奶粉室温封闭2h。之后加入Survivin一抗(1:800稀释)，置于摇床上4℃孵育过夜。
次日，膜用TBS-T(三乙醇胺缓冲盐水溶液)洗涤三次，每次间隔为15分钟，洗膜后加入羊抗兔二抗(1:4000)。最后用millipore公司显影液于上海Tanon化学发光成像系统检测和分析蛋白条带。
次日，膜用TBS-T(三乙醇胺缓冲盐水溶液)洗涤三次，每次间隔为15分钟，洗膜后加入羊抗兔二抗(1:4000)。最后用millipore公司显影液于上海Tanon化学发光成像系统检测和分析蛋白条带。
[0056] 4.2TNF-α、IL-12的检测
[0057] 分别取1×105个处于对数生长期的LLC和R-LLC细胞，接种于六孔板内，待细胞贴壁生长至指数生长期，收集培养液上清，4000转15分钟离心除去死细胞及细胞碎片，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、IL-12细胞因子浓度水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书要求进行。以上实验每个药物浓度设3个平行样，均重复3次。
[0058] 5结果
[0059] 5.1不同剂量X线照射后LLC细胞与R-LLC细胞存活分数
[0060] 如图1所示，经过不同剂量X线照射后LLC细胞和R-LLC细胞的存活分数有明显差别，R-LLC细胞存活分数明显高于LLC细胞(p<0.05)，显示了明显的辐射抵抗。
[0061] 5.2不同剂量X线照射后LLC细胞与R-LLC细胞克隆扩增的变化
[0062] 如图2所示，R-LLC细胞起始处肩部增宽，显示了明显的辐射抵抗，其射线平均致死剂量D0与LLC细胞相比分别是(1.397±0.128)Gy和(1.053±0.214)Gy，R-LLC细胞的放射抵抗性约是LLC细胞的1.33倍。两组细胞在不同剂量照射时的放射生物学参数D0值(平均致死剂量)、Dq值(准阈剂量)和外推N值(靶数)、SF2值见表1。
[0063] 表1 LLC、R-LLC细胞在不同剂量照射时的放射生物学参数比较
[0064]
[0065] 5.3Western Blot检测Survivin蛋白表达水平
[0066] 由图3可知，R-LLC细胞Survivin蛋白的表达要明显高于LLC细胞，R-LLC细胞产生辐射抗拒性可能还与Survivin蛋白水平的上调有关(t＝15.31，p<0.05)。5.4LLC细胞及R-LLC细胞分泌TNF-α、IL-12水平比较
[0067] ELISA法检测细胞因子结果显示，LLC细胞TNF-α和IL-12浓度分别为(18.35±1.539)ng/ml和(12.10±0.969)ng/ml，R-LLC细胞分泌的水平分别为(23.12±0.648)ng/ml和(15.28±0.440)ng/ml，R-LLC细胞分泌的TNF-α和IL-12水平均比LLC细胞分泌的高(*：t＝2.867和3.014，p<0.05)，如图4所示。
[0068] 实施例2本发明的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗的制备
[0069] 对反复放射线照射得到R-LLC细胞常规传代>10代，取指数生长期R-LLC细胞，收集培养液上清后计数板计数，用培养液上清调整细胞浓度至为5.0×106个/ml，首先通过反复冻融(液氮中冻10min，再迅速移入37℃水浴箱中10min，重复四次)灭活细胞，于冰上超声细胞粉碎机粉碎(功率130W/20KHz，时间3s，10-15次)细胞，涡旋振荡器充分震荡制备瘤苗，瘤6
苗最终浓度为1.0×10个瘤细胞/0.2ml。
苗最终浓度为1.0×10个瘤细胞/0.2ml。
[0070] 实施例3CpG ODN1826联合本发明的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗的抗肿瘤作用[0071] 1方法
[0072] 1.1免疫方式及实验分组
[0073] 每组20只小鼠，各组小鼠均先免疫CpG ODN1826(购于上海生工生物工程股份有限公司，商品号：9103288756)三次，接下来再免疫瘤苗三次，每组小鼠均每五天重复免疫，按照免疫方式不同分为以下六组：
[0074] (a)阴性对照组(Control)：每只小鼠皮下注射PBS 0.15ml作为CpGODN1826药物对照，后皮下多点注射无血清培养液0.2ml作为瘤苗对照；
[0075] (b)CpG ODN组(CpG)：每只小鼠每次皮下注射CpG ODN1826 0.15mg，后皮下多点注射无血清培养液作为瘤苗对照；
[0076] (c)LLC瘤苗组(LLC)：每只小鼠皮下注射PBS作为CpG ODN药物对照，后每只小鼠每次皮下注射1.0×106个LLC瘤苗(0.2ml)；
[0077] (d)R-LLC瘤苗组(R-LLC)：每只小鼠开始皮下注射PBS作为CpG ODN药物对照，后每只小鼠每次皮下注射1.0×106个R-LLC瘤苗(0.2ml)；
[0078] (e)CpG ODN+LLC瘤苗组(CpG+LLC)：每只小鼠每次皮下注射CpG ODN1826 0.15mg，后每只小鼠皮下多点注射1.0×106个LLC瘤苗(0.2ml)；
[0079] (f)CpG ODN+R-LLC瘤苗组(CpG+R-LLC)：每只小鼠每次皮下注射CpG ODN1826 0.15mg，后每只小鼠皮下多点注射1.0×106个R-LLC瘤苗(0.2ml)。
[0080] 1.2移植瘤模型的建立及观察
[0081] LLC Lewis肺癌细胞传代至指数生长期后，调整细胞浓度为1.0×107个/ml，各组小鼠于免疫结束后一周在右腋部皮下注射0.2ml LLC Lewis肺癌细胞悬液，共120只，即为移植瘤模型，每组随机选取10只观察其自然生长过程，隔日观察并记录小鼠皮下移植瘤大小情况，当皮下移植瘤直径2mm时定义为成瘤时间，由专人用游标卡尺实际测量肿瘤的最大长径，体积(V)＝1/6AB2π(A＞B)，A为肿瘤测量的最大长径，B为与A垂直的最大横径。依据各组小鼠只数计算肿瘤平均体积，绘制肿瘤生长曲线，绘制肿瘤生长曲线。观察终点定为接种肿瘤细胞后60天，得出成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长曲线及小鼠生存分析。
[0082] 1.3CpG ODN1826联合本发明的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗对移植瘤细胞凋亡的影响
[0083] 各组剩余小鼠于种瘤后第18天各实验组摘眼球取血处死9只小鼠后(对照组有1只小鼠死亡，CpG+R-LLC有两只小鼠未成瘤，故共8只)，剥取肿瘤组织。
[0084] 1)标本固定：剥离瘤体后，用4％多聚甲醛固定3天；
[0085] 2)脱水：将固定的瘤体于自动脱水机中脱水24h；
[0089] 6)脱蜡：切片浸于二甲苯溶液中进行脱蜡两次，每次30分钟；
[0091] 8)滴加0.1％TritonX-100，4℃，2m，PBS冲洗2min，3次；
[0092] 9)滴加50μl Tunel反应液，37℃孵育1h，PBS冲洗2min，3次；
[0093] 10)滴加POD 50μl，37℃孵育1h，PBS冲洗2min，3次；
[0094] 11)显色：滴加50μl DAB显色。镜下控制显色时间，待阳性部位着色而背景无着色时终止反应，蒸馏水冲洗。
[0095] 结果判断：凋亡细胞胞核被染成棕黄色。随机选取10个高倍镜视野，计数1000个肿瘤细胞中阳性细胞数。由两名病理科医生双盲计数。计算凋亡率＝(凋亡细胞数/细胞总数)×100％。
[0096] 1.4CpG ODN1826联合本发明的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响
[0097] 1)荷瘤小鼠血清中IL-10和TNF-α的测定
[0098] 每实验组各剩余小鼠于接种肿瘤细胞后第18天，每组9只(CpGODN+R-LLC瘤苗免疫组有两只小鼠未成瘤，故为8只)，均摘眼球取血入抗凝管中，离心机离心，1200转/分钟，离心10分钟。取上层血浆约0.5mL左右，置于1.5mL聚丙二醇脂试管内，存于-80℃冰箱内保存。用BIO-RAD蛋白磁珠试剂盒测定小鼠血清中IL-10和TNF-α的含量，操作方法参照试剂盒说明书进行。结果经计算机处理得到血清中IL-10和TNF-α含量。
[0099] 2)对小鼠移植瘤重量及免疫器官脾的影响
[0100] 各组荷瘤小鼠相应处置结束后，剥离瘤块称重，取脾并测重量，计算抑瘤率和脾指数。抑瘤率＝(1-实验组的平均瘤重/对照组的平均瘤重)×100％。脾指数＝脾重量/(小鼠重量-肿瘤重量)(mg/g)。
[0101] 1.5RT-PCR检测各组小鼠移植瘤PD-L1mRNA的表达水平
[0102] 用Trizol试剂盒提取新鲜肿瘤组织(约50mg)的总RNA，定量后逆转录成cDNA(85℃4min，4℃60min)，随后用引物进行PCR扩增，95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火32s，40个循环数；最后95℃15s、60℃延伸1min。PDL-1引物序列：上游引物(SEQ ID NO.1)5'-TATCACGGCTCCAAAGGACT-3'；下游引物(SEQ ID NO.2)5'-ACCACTAACGCAAGCAGGTC-3'。β-actin引物序列(SEQ ID NO.3)：上游引物5'-CATTGCCGACAGGATGCAG-3'；下游引物(SEQ ID NO.4)5'-CTCGTCATACTCC TGCTTGCTG-3'。
[0103] 1.6Western Blot检测各组小鼠移植瘤PD-L1蛋白表达水平
[0104] 取各组小鼠新鲜肿瘤组织约50mg用10％SDS冷细胞裂解液(含1:100的PMSF)提取蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定所提取蛋白的浓度。每个孔道加入含50μg的两组细胞的蛋白样品。电泳后，湿转法将凝胶转移到PVDF膜。转膜完成后将膜用10％脱脂奶粉室温封闭2h。之后分别加入PD-L1一抗(1:300稀释)及内参α-Tublin一抗(1:2000稀释)，置于摇床上室温放置30min后4℃孵育过夜。次日，膜用TBS-T(三乙醇胺缓冲盐水溶液)洗涤三次，每次
10min，洗膜后加入二抗(1:5000)，室温孵育1h。二抗孵育结束后TBS-T洗涤三次，每次
10min。最后用millipore公司显影液于上海Tanon化学发光成像系统检测和分析蛋白条带。
10min，洗膜后加入二抗(1:5000)，室温孵育1h。二抗孵育结束后TBS-T洗涤三次，每次
10min。最后用millipore公司显影液于上海Tanon化学发光成像系统检测和分析蛋白条带。
[0105] 2结果
[0106] 2.1移植瘤模型建立结果及成瘤时间
[0107] 用于观察接种移植瘤后小鼠生存时间的6组共60只C57BL/6J小鼠右腋皮下接种LLC Lewis肺癌细胞后，成瘤时间为6-9天：在接种后第六天，对照组和CpG组均有3只小鼠于右腋下刚扪及肿瘤、LLC组有4只、R-LLC组有2只，CpG+LLC组于第七天有3只小鼠刚扪及肿瘤，而CpG+R-LLC组至第八天有5只小鼠均才扪及肿瘤。统计成瘤时间，CpG+R-LLC组最晚，为9.00±1.69天，CpG+LLC组成瘤时间为8.90±1.45天，两组相比无统计学差异，而与对照组及其他实验处理组相比则有统计学差异(p<0.05)，而且于观察终点(接种移植瘤后第60天)我们发现CpG+R-LLC免疫处理组有两只小鼠无瘤生存，其成瘤率为80％，其余各组均100％成瘤，具体如表2所示。
[0108] 表2 各组小鼠皮下接种LLC Lewis肺癌细胞后的成瘤率和成瘤时间
[0109]
[0110] 注：a与对照组比t＝4.200和3.491,p<0.01；b与CpG组比t＝3.735和3.188,p<0.01；c与LLC组比t＝2.114和2.211,p<0.05；d与R-LLC组比t＝2.298和2.154,p<0.05。
[0111] 2.2肿瘤生长情况
[0112] 不同免疫处理组小鼠在接种相同数量LLC Lewis肺癌细胞后，随着观察时间的延长，各免疫组小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢，至接种第9天起，对照组、CpG组、LLC瘤苗组、R-LLC组各组小鼠的平均肿瘤体积与CpG+R-LLC组相比显示出统计学差异(p<0.05)，而其余各组间均无统计学差异；至接种第11天起，对照组小鼠平均肿瘤体积与R-LLC组、CpG+LLC组、CpG+R-LLC组相比有统计学差异(p<0.05)，CpG组、LLC组平均肿瘤体积与CpG+LLC组和CpG+R-LLC组相比有统计学差异(p<0.05)，R-LLC组小鼠平均肿瘤体积与CpG+R-LLC组相比有统计学差异(p<0.05)；至接种第13天起，发现对照组小鼠平均肿瘤体积与LLC组相比也开始显示出统计学差异(p<0.05)；至接种第15天起，发现CpG+LLC组与CpG+R-LLC组肿瘤平均体积相比有统计学差异(p<0.05)。且至观察终点(接种后第60天)，CpG+R-LLC组中的两只小鼠仍未见皮下移植瘤生长。具体肿瘤生长曲线见图5。
[0113] 2.3小鼠肿瘤重量及抑瘤率
[0114] 如表3所示，CpG+LLC免疫组小鼠瘤重低于对照组、CpG组、LLC组、R-LLC组，差异有统计学意义(p＜0.05)；CpG+R-LLC组小鼠瘤重明显低于其他各组，统计学检验表明其与对照组、CpG组、LLC组、R-LLC组和CpG+LLC组之间均有显著差异(p＜0.05)，抑瘤率亦明显升高。
[0115] 表3 各组小鼠肿瘤重量与抑瘤率的比较
[0116]
[0117] 注：a与对照组相比t＝2.413,2.742,2.589,4.883和6.548,p<0.05；b与CpG组相比tc d＝3.942和7.532,p<0.05；与LLC组相比t＝3.449和6.917,p<0.05；与R-LLC瘤苗组相比t＝
3.739和7.377,p<0.05；e与CpG+LLC瘤苗组相比t＝2.250,p<0.05。
3.739和7.377,p<0.05；e与CpG+LLC瘤苗组相比t＝2.250,p<0.05。
[0118] 2.4小鼠生存分析
[0119] 观察各实验组每组10只移植瘤小鼠模型其自然生长及生存时间，我们发现对照组小鼠从皮下接种肿瘤第18天即开始有死亡，至第51天对照组10只小鼠全部死亡，各免疫组小鼠从接种肿瘤第32天至34天才开始死亡，而CpG+R-LLC组小鼠从接种肿瘤第38天才开始出现死亡，且有两只小鼠未成瘤。对照组、CpG组、LLC瘤苗组、R-LLC瘤苗组、CpG+LLC瘤苗组、CpG+R-LLC瘤苗组小鼠的平均生存时间分别是36.2、41.3、44.6、43.7、43.5和50.4天，中位生存时间分别是36、41、43、40、42和51天，Log Rank检验比较各实验组之间小鼠生存有统计学意义(x2＝14.843，p<0.05)，如图6所示为各组小鼠生存Kaplan-Meier曲线。
[0120] 2.5CpG ODN1826联合本发明的放射抗拒性肿瘤全细胞疫苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响
[0121] 2.5.1对小鼠血清TNF-α、IL-10含量的影响
[0122] 各组不同免疫方式小鼠血清中TNF-α、IL-10的变化(见表4)：CpG+R-LLC组血清中TNF-α含量明显升高，与对照组及其他疫苗免疫组相比较差异具有显著性(p＜0.05)；CpG+R-LLC组血清中IL-10含量明显降低，与对照组及其他疫苗免疫组相比较差异具有显著性(p＜0.05)。
[0123] 2.5.2对小鼠免疫器官脾的影响
[0124] 各组小鼠脾指数变化(见表4)：根据瘤重及鼠重计算得出脾指数，结果表明各免疫组小鼠脾指数较对照组均升高明显，统计学检验显示差异明显(p＜0.05)，但不同免疫组小鼠之间统计学检验则无显著性差异(p>0.05)。
[0125] 表4 各组小鼠血清TNF-α、IL-10含量的比较
[0126]
[0127] 注:a与对照组相比
[0128] t＝2.945,2.236,2.571,4.870,7.732,2.224,2.787,2.281,4.170,5.472,2.732,2.154,2.470,2.575和2.244,p<0.05；b与CpG组相比t＝2.249,5.300,2.818和4.925,p<
0.05；c与LLC瘤苗组相比t＝2.348,5.021,2.151和4.488,p<0.05；d与R-LLC瘤苗组相比t＝
4.726和3.097,p<0.05；e与CpG联合LLC瘤苗组相比t＝2.856和2.956,p<0.05。2.6CpG ODN1826联合本发明的放射抗菌性肿瘤全细胞疫苗对移植瘤细胞凋亡的影响[0129] 用TUNEL法检测各组小鼠移植瘤细胞凋亡情况，显微镜(200倍)下可见，阳性细胞即凋亡细胞固缩，细胞核中沉淀有棕黄色颗粒，常聚集在核周边；非凋亡的细胞核呈蓝色，如图7所见；统计各实验组肿瘤细胞凋亡率，结果分别为(2.42±0.61)％、(3.53±0.81)％、(3.40±0.67)％、(3.51±0.85)％、(7.44±1.01)％、(9.97±1.73)％。可以看出，CpG+LLC免疫组及CpG+R-LLC免疫组小鼠其移植瘤细胞凋亡率较其他四组明显升高，且CpG+R-LLC免疫组小鼠肿瘤细胞凋亡率最高(p<0.01)，见图8。
0.05；c与LLC瘤苗组相比t＝2.348,5.021,2.151和4.488,p<0.05；d与R-LLC瘤苗组相比t＝
4.726和3.097,p<0.05；e与CpG联合LLC瘤苗组相比t＝2.856和2.956,p<0.05。2.6CpG ODN1826联合本发明的放射抗菌性肿瘤全细胞疫苗对移植瘤细胞凋亡的影响[0129] 用TUNEL法检测各组小鼠移植瘤细胞凋亡情况，显微镜(200倍)下可见，阳性细胞即凋亡细胞固缩，细胞核中沉淀有棕黄色颗粒，常聚集在核周边；非凋亡的细胞核呈蓝色，如图7所见；统计各实验组肿瘤细胞凋亡率，结果分别为(2.42±0.61)％、(3.53±0.81)％、(3.40±0.67)％、(3.51±0.85)％、(7.44±1.01)％、(9.97±1.73)％。可以看出，CpG+LLC免疫组及CpG+R-LLC免疫组小鼠其移植瘤细胞凋亡率较其他四组明显升高，且CpG+R-LLC免疫组小鼠肿瘤细胞凋亡率最高(p<0.01)，见图8。
[0130] 2.7RT-PCR检测各组小鼠移植瘤PD-L1mRNA的表达水平
[0131] 结果如图9所示，扩增结果提示CpG联合本发明的放射抗拒性肿瘤全细胞疫苗免疫组小鼠移植瘤PD-L1mRNA水平呈下降趋势，但与其他组相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
[0132] 2.8Western Blot检测各组小鼠移植瘤PD-L1蛋白表达水平
[0133] 如图10所示，CpG+R-LLC免疫组小鼠移植瘤PD-L1蛋白表达水平降低，但与对照组及其他四组免疫组小鼠相比，差异无统计学意义，p>0.05，如图11所示为各组小鼠移植瘤PD-L1蛋白表达密度值分析。
[0134] 实施例4本发明的放射抗拒性肺癌全细胞疫苗联合CpG ODN1826与其它疫苗抗肿瘤作用的比较
[0135] 发明人在研究过程中利用LLC Lewis肺癌细胞株还建立了另外一株放射抗拒性肺癌细胞株Rc-LLC，经检测，其细胞存活分数相比于LLC细胞有所提高，但是提高的幅度与R-LLC相比，具有显著性差异(p<0.05)。平均致死剂量D0为(1.184±0.152)Gy。
[0136] 同样地，发明人将上述放射抗拒性肺癌细胞株Rc-LLC与CpG ODN1826联用，通过动物实验测试了其抗肿瘤作用，具体方法参见实施例3。结果如下：
[0137] 1)移植瘤模型建立结果及成瘤时间：小鼠右腋皮下接种LLC Lewis肺癌细胞后，在接种后第六天，CpG+Rc-LLC组有2只小鼠刚扪及肿瘤。成瘤时间为8.93±1.60天，与CpG+R-LLC组相比无统计学差异。于观察终点(接种移植瘤后第60天)成瘤率为100％。
[0138] 2)肿瘤生长情况：至接种第13天起，CpG+Rc-LLC的平均肿瘤体积与CpG+R-LLC组相比显示出统计学差异(p<0.05)，具体为0.48cm3。
[0139] 3)小鼠肿瘤重量及抑瘤率：CpG+Rc-LLC组小鼠瘤重低于其他各组，与CpG+LLC组之间无显著差异(p>0.05)，与CpG+R-LLC组相比有显著差异(p＜0.05)，抑瘤率为67.35％。
[0140] 4)小鼠生存分析：CpG+Rc-LLC组小鼠平均生存时间为45.1天，中位生存时间为45天。CpG+Rc-LLC组和CpG+R-LLC组小鼠生存有统计学意义(p<0.05)。
[0141] 5)小鼠血清TNF-α、IL-10含量的影响：CpG+Rc-LLC组血清中TNF-α含量有所升高，但升高程度与CpG+R-LLC组相比差异具有显著性(p＜0.05)。
[0142] 6)小鼠免疫器官脾的影响：CpG+Rc-LLC组小鼠脾指数相比于对照组升高，为9.73±2.52，但与CpG+R-LLC组相比无显著性差异(p>0.05)。
[0143] 7)对移植瘤细胞凋亡的影响：CpG+Rc-LLC组肿瘤细胞凋亡率结果为(3.94±0.96)％，相比于CpG+R-LLC免疫组小鼠移植瘤细胞凋亡率具有极显著差异(p<0.01)。
[0144] 8)小鼠移植瘤PD-L1mRNA和PD-L1蛋白的表达水平
[0145] CpG+Rc-LLC组小鼠PD-L1mRNA水平下降，PD-L1蛋白表达水平也降低，但与其他各组免疫组小鼠相比，差异均无统计学意义(p>0.05，p>0.05)。
[0146] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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