癌症是折磨许多人的疾病，并且是人类和非人动物中死亡的主要 原因。癌症一般包括少数细胞不受控制的分离，其然后产生许多新的 细胞。因而，许多抗癌药物是抑制或停止细胞生长的试剂。虽然这种 化学治疗剂改善了患有赘生性疾病的患者的存活率，与许多化学治疗 剂相关的严重副作用限制了它们的使用，并破坏了已经被癌症削弱的 患者的健康状态。因而需要新的试剂，其展现对癌细胞的增强的选择 性，并且能够控制瘤细胞的增殖。
许多抗癌剂的一个主要难题是它们的特异性。抗癌药物需要区分 癌性的细胞和非癌性的细胞。然而，在这一点上大量的抗癌药物是不 加选择的。一般地，抗癌试剂具有阴性的血液学效果(例如，停止骨 髓和淋巴组织中成形的元件的有丝分裂和离解)和免疫抑制作用(例 如，降低细胞计数)，也可以对上皮组织(例如，肠粘膜)、生殖组织 (例如，精子发生的损伤)以及神经系统有严重的影响。参见，例如， P.Calabresi and B.A.Chabner，In：Goodman and Gilman，The Pharmacological Basis of Therapeutics(Pergamon Press，8th Edition)(pp. 1209-1216)。
需要的是抗癌试剂，其可以有益地治疗选定的肿瘤类型，或优选 的各种肿瘤类型，并且特别适合于侵入性肿瘤。此外，虽然这种抗癌 试剂应当是有效的，它们也应当很少展现或不展现毒性。
发明概述
本发明提供了用于促进在中的细胞凋亡的组合物和方法，其涉及 提高Nod1表达或NOD1活性。
因而，本发明的一个方面是促进哺乳动物中肿瘤退化的方法，其 涉及向所述哺乳动物施用提高Nod1表达或NOD1活性的试剂。可以 用本发明的方法治疗的肿瘤的实例包括脑、膀胱、宫颈、结肠、胆囊、 肾脏、肝脏、肺、胰腺、卵巢、前列腺、皮肤、胃或甲状腺肿瘤。在 某些实施方式中，所述肿瘤是雌激素敏感性肿瘤或乳腺肿瘤。
提高NOD1活性的试剂的实例包括具有以下序列的肽：D-Ala-L- Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)、γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸 (iE-DAP)、γ-D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸 (γTriDAP)，和其组合。这些肽可以活化NOD1蛋白，由此Nod1依 赖性途径引起细胞凋亡。可以提高NOD1活性的试剂的另一个实例是 NOD1多肽。在某些实施方式中，所述NOD1多肽可以是人类NOD1 多肽，例如，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的人类NOD1多 肽。
可以提高Nod1表达的试剂的一个实例是包含编码NOD1多肽的 片段的核酸。NOD1多肽的序列的实例包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。编码NOD1多肽的核酸片段的一个实例包括SEQ ID NO：2。 所述核酸可以进一步包括调节元件，例如，启动子、增强子、转录终 止信号，或其组合。所述核酸可以是表达盒或表达载体或基因递送载 体的一部分。
可以与提高Nod1表达或NOD1活性的试剂联合施用其他活性成 分。例如，可以与这些试剂联合施用有效量的肿瘤坏死因子。在某些 实施方式中，肿瘤坏死因子α可以增强Nod依赖性细胞凋亡途径。此 外，可以与所述试剂一起施用有效量的放线菌酮，以提高Nod1表达 或NOD1活性。此外，可以与所述试剂联合施用一种或多种化学治疗 化合物。
可以用于本发明的组合物和方法的化学治疗化合物的实例包括六 甲密胺、博来霉素、马利兰、亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡氮芥、 苯丁酸氦芥、顺铂、克拉屈滨、Crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、 氮烯唑胺、放线菌素、红比霉素、多西他赛、阿霉素、表柔比星、依 托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环 磷酰胺、伊立替康、脂质体阿霉素、环己亚硝脲、苯丙氨酸氮芥、巯 基嘌呤、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、喷司 他丁、甲基苄肼、雷替曲塞、链脲霉素、优福定、泰莫佐罗、硫替派、 巯基鸟嘌呤/硫鸟嘌呤、拓扑替康、苏消安、长春花碱、长春新碱、去 乙酰长春酰胺、长春烯碱和其组合。
所述试剂可以局部地施用到肿瘤的位点，和/或被配制用于持续释 放。
本发明的另一个方面是一种组合物，其包括载体、包含编码NOD1 多肽的片段的核酸，以及有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸 (γTriDAP)、γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、γ-D- Gln-DAP(iQ-DAP)或D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)，其中 所述组合物被配制用于向肿瘤的局部施用。所述NOD1多肽可以，例 如，包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。编码NOD1多肽的核酸 片段的实例是SEQ ID NO：2。在所述组合物中采用的核酸可以进一 步包括调节元件，例如，启动子、增强子、转录终止信号，或其组合。 所述核酸可以是表达盒或表达载体。所述核酸包含基因递送载体。本 发明的组合物也可以包括其他活性成分，例如，有效量的肿瘤坏死因 子α或化学治疗化合物。所述组合物可以被配制用于局部地施用到肿 瘤的位点，和/或被配制用于持续释放。
本发明的另一个方面是促进乳腺肿瘤细胞中细胞凋亡的方法，包 括用有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)接触乳腺肿瘤 细胞。
本发明的另一个方面是促进雌激素敏感性肿瘤细胞中细胞凋亡的 方法，包括用有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)接触 乳腺肿瘤细胞。
附图说明
附图1A-C说明了在TNF诱导的细胞凋亡中涉及的Nod1。附图1A 提供了突变基因的示意图，其产生了TNFα抗性表型，后来被鉴定为 带有blasticidine(blast)基因插入的Nod1突变。带有这种Nod1突变 的细胞系是MCF7-C20细胞系。来自pDisrup逆转录病毒构建体的插 入被绘制到Nod1基因上。与Nod1基因融合的blasticidine的接点出 现在富亮氨酸区域8(LRR8)和富亮氨酸区域9(LRR9)之间Nod1 基因的3′末端。因此LRR9和LRR10区域是blasticidine插入的3′。附 图1B显示了在MCF-7C20细胞中NOD1蛋白不以可检测数量存在。 制备来自MCF-7亲本(称为“wt”)和MCF-7C20细胞的细胞提取物， 用单克隆抗NOD1抗体免疫沉淀(上画面)或直接加载到SDS-PAGE 凝胶上(下画面)，然后转移到PVDF膜上。使用相同的单克隆抗膜 抗体通过免疫印迹来分析印迹。附图1C显示了与MCF-7C20细胞相 比，MCF-7细胞对于TNF诱导的细胞凋亡更有抗性。用升高浓度的TNF (0-40ng/ml)处理MCF-7和MCF-7C20细胞20h。通过碘化丙锭(PI) 排出分析和流式细胞计来测定细胞生存力。图表显示，MCF-7C20细 胞显著更可能经历细胞凋亡。
附图2A-D显示了在γTriDAP处理时MCF-7细胞经历细胞凋亡。 附图2A说明了NOD1是γTriDAP诱导的细胞死亡所需的。在存在(阴 影柱)或缺少(空心柱)放线菌酮(CHX)(3μg/ml)的情况下，用 γTriDAP或αTriDAP(各50μg/ml)处理表达正常水平的NOD1的 MCF-7 Blasto细胞、表达很少或不表达NOD1的MCF-7 C20细胞、 或过量表达NOD1的MCF-7 Nod1细胞48h。对照分析接受培养基 (Med)代替γTriDAP或αTriDAP。在48h孵育之后，收获细胞，并 与碘化丙锭(PI)孵育(4μg/ml)。通过流式细胞计分析来测定细胞 生存力。数据显示的是至少四个独立实验的代表性实验。附图2B显 示了在用单独的载体转染的MCF-7 Blasto细胞中、具有内源Nod1基 因破坏的MCF-7 C20细胞中、或被工程化以过量表达NOD1的MCF- 7 Nod1细胞中的NOD1表达水平。在MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和 MCF-7 Nod1细胞中NOD1的表达通过使用单克隆抗Nod1抗体的 western印迹来分析。附图2C说明了在γTriDAP处理的MCF-7 Nod1 细胞中的形态变化。将细胞播种到4孔室载玻片上，并用γTriDAP/放 线菌酮(CHX)(画面b、d、f)或单独的CHX(画面a、c、e)处理。 细胞用DAPI(画面c、d)或TUNEL(画面e、f)染色，固定并在相 差(画面a、b)或荧光(画面c-f)显微镜下观察。附图2D显示了， 通过两种广谱的caspase抑制剂，z-VAD-FMK和Boc-D-FMK，在MCF-7 Nod1细胞中的γTriDAP诱导的细胞凋亡减少或消除。用z-VAD或 Boc-D-FMK caspase抑制剂(各50μM)预处理MCF-7 Nod1细胞30 分钟，之后添加γTriDAP/CHX 48h。用碘化丙锭(PI)孵育细胞，通 过流式细胞计测量凋亡性细胞死亡。
附图3通过western分析说明了，向MCF-7细胞添加γTriDAP， 而不是无效的对照物三肽αTriDAP，引起了聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP)的蛋白水解裂解和capases 6、7、8和9的蛋白水解裂解。 在存在或缺少CHX(0.5μg/ml)的情况下用γTriDAP、αTriDAP或 培养基(对照)刺激之后，通过MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和MCF-7 Nod1 细胞的Western印迹分析所检测的PARP和各种caspases的裂解。收 获细胞，经历western印迹，使用与其反应的抗体检测PARP、caspases、 p20、p41/43和p35。
附图4A-C显示了NOD1突变体V41Q对γTriDAP起反应，并且 保持了细胞凋亡途径中的功能，而NOD1突变体K208R对于γTriDAP 不敏感，并且在细胞凋亡途径中是没有活性的。附图4A图示说明了 在用培养基(Med.，对照)或γTriDAP处理后不同的细胞系中细胞凋 亡细胞的百分比。NOD1 V41Q和K208R突变体通过定点诱变来构建。 V41Q突变处于NOD1的CARD结构域中，而K208R突变被认为阻 断由Nod/NBD结构域介导的寡聚反应所需的构象变化。编码这些 NOD1 V41Q和K208R突变多肽的构建体转染到MCF-7 C20细胞中， 进行细胞凋亡分析。如所示，V41Q突变体保持了NOD1活性，但K208R 突变体没有。附图4B显示了，NOD1突变体和野生型多肽的表达水 平基本上是相同的。附图4C通过western分析说明了，在MCF-7细 胞中的NOD1表达是PARP的蛋白水解裂解和capases 6、7、8和9的 蛋白水解裂解所需的。PARP和各种caspases的裂解通过不表达NOD1 的MCF-7 C20细胞、以及已经将Nod1构建体重组导入MCF-7 C20细 胞中的MCF-7C20 Nod1细胞的Western印迹分析来检测。在存在或 缺少放线菌酮(CHX)(0.5μg/ml)的情况下用γTriDAP或培养基(对 照)刺激细胞24h。然后收获细胞，进行western印迹。使用与之反应 的抗体检测PARP、caspases、p20、p41/43和p35。
附图5A-C说明了在MCF-7细胞中Nod2不诱导细胞凋亡。在附 图5A中，在存在或缺少CHX的情况下用NOD1配体γTriDAP或Nod2 配体胞壁酰二肽(MDP)(各20μg/ml)处理MCF-7 Blasto、MCF-7 Nod1和MCF-7 Nod2 48h。然后用PI孵育细胞，通过流式细胞计测量 细胞凋亡性细胞死亡。如所示，γTriDAP刺激细胞凋亡，但Nod2配 体不。在附图5B中，NOD1和NOD2的表达通过Western印迹分析 来确认，使用用于重组蛋白的检测的抗Myc抗体。附图5C显示了 MCF-7 Nod2细胞响应MDP，如通过白细胞介素-8(IL-8)分泌所检 测的。在存在或缺少CHX(0.5μg/ml)的情况下用γTriDAP或MDP 刺激MCF-7 Blasto、MCF-7 Nod1和MCF-7 Nod2细胞24h。然后收获 细胞上清液，分析IL-8分泌。
附图6A-D说明了，caspase 8和caspase 9是γTriDAP诱导的细胞 凋亡所需的。附图6A显示了不同caspase抑制剂对γTriDAP诱导的细 胞凋亡的影响。在用γTriDAP/CHX刺激48h之前，用沿着附图6A的 x轴列出的caspase的抑制剂预处理MCF-7 Nod1细胞30分钟。然后 用碘化丙锭孵育细胞，通过流式细胞计测量细胞生存力。所有抑制剂 在100μM的浓度使用。附图6B显示了，当Nod1与caspase 9共表 达时，检测到NOD1的高分子量形式，表明NOD1与caspase 9相互 作用。在这个实验中，在存在空载体、Myc-Nod1或Myc-NOD2的情 况下，293细胞用编码FLAG-caspase 9的载体共转染。用抗-FLAG抗 体免疫沉淀(IP)细胞提取物，使用多克隆抗-Myc抗体通过免疫印迹 (WB)来揭示共沉淀的蛋白质。附图6C显示了，CLARP完全地阻 止γTriDAP诱导的细胞凋亡，而Bcl2仅仅部分地抑制γTriDAP诱导的 细胞凋亡。在存在或缺少CHX(3μg/ml)的情况下用γTriDAP不处 理或处理MCF-7CLARP、MCF-7CLARP/Nod1、MCF-7Bcl2和MCF- 7Bcl2/Nod1细胞。然后用碘化丙锭孵育细胞，通过流式细胞计测量细 胞凋亡性细胞死亡。附图6D显示了Western印迹，说明了在MCF-7 细胞中表达CLARP、Bcl2和NOD1，表明在附图6C中观察到的结果 是由于CLARP和Bcl2之间的功能差异，而不是这两种蛋白质的表达 水平中的差异。
附图7A-C说明了，野生型RIP2和RIP2的激酶缺陷的(KD)突 变在NOD 1细胞凋亡途径中是功能性的。然而，缺少CARD结构域的 RIP2作为NOD1信号转导的显性阴性抑制剂起作用。附图7A图形地 说明了在野生型RIP2、RIP2KD和RIP2ΔCARD细胞中细胞凋亡的 细胞的百分比。用野生型Myc-RIP2、Myc-RIP2 KD和Myc-RIP2Δ CARD稳定地转染MCF-7细胞，在存在或缺少CHX(3μg/ml)的情 况下，用γTriDAP不处理或处理48h。用PI孵育细胞，通过流式细胞 计测量细胞凋亡性细胞死亡。附图7B显示了RIP2多肽被表达，如通 过用多克隆抗Myc抗体对细胞提取物的免疫沉淀以及使用单克隆抗 Myc 9E10抗体的免疫印迹所确认的。附图7C说明了在RIP2野生型、 MCF-7 RIP2 KD和RIP2ΔCARD细胞中JNK的磷酸化的γTriDAP诱 导。如所示，在存在放线菌酮的情况下，表达野生型RIP2或RIP2 KD 的MCF-7细胞对γTriDAP的暴露2h诱导JNK的磷酸化。然而，在同 样方式处理的RIP2ΔCARD细胞中没有观察到JNK的这种磷酸化。
附图8A-D说明了，在NOD1和TNF α之间存在协同的相互关系。 附图8A图形地说明了，当NOD1的浓度从0.0提高到100μg/ml以 及TNFα的浓度从0.5ng/ml提高到1ng/ml时，细胞凋亡细胞的百分 比以剂量特异性方式提高。附图8B图形地说明了，当放线菌酮的浓 度从0.0提高到3μg/ml以及TNFα的浓度从0.5ng/ml提高到1ng/ml 时，细胞凋亡细胞的百分比以剂量特异性方式提高。附图8C图形地 说明了，虽然γTriDAP在存在TNFα的情况下提高细胞凋亡，无效对 照三肽αTriDAP实际上可以抑制细胞凋亡，甚至在更高的TNFi剂量 下。附图8D说明了在MCF-7细胞对TNFα的暴露之后在各个时点的 NOD1表达。
附图9A-C说明了在另一个人类乳腺癌细胞系、SKBR3癌细胞系 中的NOD1表达。附图9A(上部)图形地说明了作为TNFα浓度的 函数的、细胞凋亡的SKBR3野生型和SKBR3 Nod1细胞的百分比。 附图9A(底部)底部说明了作为γTriDAP浓度的函数的细胞凋亡的 SKBR3野生型和SKBR3 Nod1细胞的百分比。附图9B(顶部)图形 地说明了通过碘化丙锭(PI)或Dioc6在不同条件下观察到的细胞凋 亡的SKBR3细胞的百分比。采用的条件在以下的Western印迹中指示。 使用的缩写如下：CHX(放线菌酮)、TNF(TNFα)、γTri(γTriDAP)、 αTri(αTriDAP)。附图9B2提供了western分析，说明了聚(ADP- 核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解裂解和caspase 3、7和8的蛋白水 解裂解。在以下的Western印迹指定的条件下刺激之后，通过MCF-7 细胞的Western印迹细胞分析来检测PARP和各种caspases的裂解。 收获细胞，经历western印迹，使用其反应性抗体检测PARP、caspases、 p20、p41/43和p35。附图9C图形地说明了在以下柱形图指定的条件 下观察到的野生型、表达NOD1的、和表达CLARP的SKBR3细胞 的细胞凋亡百分比。使用的缩写：CHX(放线菌酮)、TNF(TNFα)、 gTri(γTriDAP)、gTC(γTriDAP+CHX)、aTC(αTriDAP+CHX)。
附图10A、B和C提供了用野生型MCF-7乳腺癌细胞、NOD1敲 除的MCF-7细胞和Nod1-转染的MCF-7细胞分别接种的小鼠的图像。 用3×106人类乳腺癌细胞皮下地接种小鼠。箭头指示皮下的肿瘤，其 在附图10B的放大图像中示出。
附图11A-D说明了在SCID小鼠中Nod1的存在阻止肿瘤生长。 附图11A图形地说明了，在用MCF-7 C20(左侧)和MCF-7 C20/Nod1 (右侧)细胞注射的小时中，作为时间的函数的肿瘤体积。将细胞(3 ×106个细胞/小鼠)注射到雌性SCID小鼠的肋部。每周测量肿瘤大 小，根据公式(W2×L)/2来确定体积。每条线代表在一个小鼠中观 察到的肿瘤(n＝4)。如所说明的，在接受表达Nod1的肿瘤细胞 (C20/Nod1)的小鼠中肿瘤体积减少。相比之下，在接受不表达Nod1 的肿瘤细胞(C20细胞)的小鼠中肿瘤体积增加。附图11B图形地说 明了在注射MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和MCF-7 C20/Nod1细胞(3 ×106个细胞/小鼠)之前植入雌激素弹丸到小鼠中，除了肿瘤细胞表 达Nod1时(C20/Nod1细胞)，都提高肿瘤生长。阴影柱代表接受雌 激素弹丸的小鼠获得的结果，而空心柱代表从未接受雌激素弹丸的小 鼠获得的结果。如上所述测定肿瘤体积。附图11C图形地说明了在用 MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和MCF-7 RIP2ΔCARD细胞注射的小鼠中 随着时间的肿瘤体积。如所示，在接受MCF-7RIP2ΔCARD细胞(*) 的小鼠中的肿瘤体积大约表达一定Nod1的小鼠中的(Blasto，实心菱 形)，但小于不表达Nod1的小鼠中的(C20，实心正方形)。附图11D 图形地说明了作为雌激素浓度的函数的肿瘤细胞生长。如所示，不表 达Nod1的肿瘤细胞9MCF-7 C20细胞)和表达突变的RIP2的肿瘤细 胞(MCF-7 RIP2ΔCARD细胞)对于雌激素更敏感，并展现了提高的 肿瘤生长。MCF-7 Blasto、MCF-7 C20、MCF-7 C20/Nod1和MCF-7 RIP2 ΔCARD细胞暴露于提高浓度的17β-雌二醇，用3H-胸腺嘧啶脉冲， 通过液体闪烁来测定细胞生长。数据是至少3个独立实验的代表。
附图12A-C说明了在各种MCF-7肿瘤细胞系中雌激素提高 γTriDAP诱导的细胞凋亡，它莫西芬抑制γTriDAP诱导的细胞凋亡。 附图12A图形地说明了在升高数量的雌激素以及放线菌酮(CHX)或 CHX加γTriDAP(γTri)中培养的MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF- 7C20/Nod1细胞中的细胞凋亡百分比。附图12B图形地说明了在升高 数量的它莫西芬以及放线菌酮(CHX)或CHX加γTriDAP(γTri)中 培养的MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和MCF-7 C20/Nod1细胞中的细胞 凋亡百分比。对于雌激素研究，在活性炭处理的培养基中培养MCF-7 细胞，并在存在升高浓度的雌激素(E2)的情况下用γTriDAP/CHX刺 激，通过碘化丙锭(PI)排出来测量细胞生存力。对于它莫西芬研究， 在添加γTriDAP/CHX之前用它莫西芬处理细胞，通过PI排出来测量 细胞生存力。附图12C显示了来自体外培养的细胞(左侧)和体内肿 瘤细胞(右侧)的细胞溶胞产物的免疫印迹，说明了雌激素受体的表 达在表达Nod1的细胞中降低。来自MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和MCF-7 C20/Nod1细胞，以及来自从肿瘤分离的细胞的总蛋白提取物，使用针 对雌激素受体(ERα)的抗体的免疫印迹来分析，ERK2作为加载对 照。
附图13A-D说明了RIP2是Nod1细胞凋亡途径的重要成分。附 图13A显示了，在肿瘤细胞系中激酶缺陷性RIP2(RIP2 KD)的稳定 表达敏化了这些细胞对Nod1或Nod2活化剂诱导的细胞凋亡性细胞 死亡。用Myc-Nod1、Myc-RIP2(野生型)、Myc-RIP2 KD和Myc-RIP2 ΔCARD稳定转染MCF-7细胞。然后在存在或缺少CHX(3μg/ml) 的情况下用γTriDAP、αTriDAP和MDP(各20μg/ml)处理测试细 胞，而对照细胞不用这些试剂处理。然后用碘化丙锭(PI)孵育细胞， 通过流式细胞计测量细胞凋亡性细胞死亡。附图13B说明了在附图13A 中描述的相同MCF-7细胞系中细胞凋亡时TNF的影响。用TNF(10 ng/ml)处理这些细胞系18小时，如附图13A描述的评定细胞凋亡性 细胞死亡。在所有测试的细胞系中TNF提高细胞凋亡。附图13C显 示了，与MCF-7 Nod1细胞相比，MCF-7 RIP2 KD细胞展现了提高的 γTriDAP诱导的细胞凋亡。在存在CHX、存在升高浓度的γTriDAP或 MDP的情况下孵育细胞48hr，如附图13A描述的评定细胞凋亡性细 胞死亡。附图13D说明了在存在CHX(0.5mg/ml)或TNF的情况下 在γTriDAP刺激后MCF-7 Blasto、MCF-7 Nod1和MCF-7 RIP2野生型 细胞的IL-8分泌。孵育之后，收获细胞上清液，分析IL-8分泌。
发明详述
根据本发明，提高的Nod1表达或NOD1活性引起肿瘤退化。因 而本发明涉及向受试者施用提高Nod1表达或NOD1活性的NOD1多 肽、Nod1核酸和试剂作为抗肿瘤治疗。在某些实施方式中，提高Nod1 表达或活性的试剂包括NOD1的肽活化剂，例如γ-D-谷氨酰基-内消旋 -二氨基庚二酸(iE-DAP)、γ-D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二 氨基庚二酸(γTriDAP)，和其组合。虽然本发明预期治疗任何类型的 肿瘤，本发明的组合物和方法对于治疗雌激素敏感的肿瘤和/或乳腺癌 肿瘤也具有特别的实用性。
NOD1
先天的免疫系统由识别微生物、病毒、异常/损伤的宿主细胞等等 成分的受体家族组成，启动宿主反应来消除和杀死侵入的有机体或除 去不正常的宿主细胞。近来，称为Nod/Caterpillar家族的细胞内、细 胞胞浆蛋白家族已经与先天免疫反应相联系。这个家族的所有成员具 有两个保守的结构域；核苷酸结合寡聚反应结构域(NBD/NOD)和 羧基末端富亮氨酸重复(LRR)区域。家族成员的氨基终端区域，称 为效应物结构域，含有可变的结构，其包括caspase募集结构域 (CARD)、pyrin、BIR和其他结构域。
Nod/Caterpillar家族的两个成员已经特别地与针对感染的天生免 疫反应相联系。这些成员被称为NOD1(CARD4)和NOD2(CARD15)。 NOD1和NOD2的效应物结构域分别由一个和两个CARD结构域组 成。NOD1和NOD2最先被提示是作为细菌脂多糖受体(LPS)的细 胞内蛋白质。随后，发现的是，NOD配体来自细菌肽聚糖(PGN)而 不是来自LPS。因而NOD1和NOD2可能作为感染期间细菌或细菌产 物的细胞内感受器起作用。然而，迄今为止进行的研究表明，NOD1 或NOD2缺陷的小鼠不是与免疫缺陷或提高的感染敏感性相关的明显 的显性表型。
NOD1和NOD/Caterpillar家族的其他成员的核酸和氨基酸序列可 以在本领域中，例如在NCBI数据库中找到。参见网站 ncbi.nlm.nih.gov。例如，人类NOD1的一个氨基酸序列在以下提供以 便参考，为SEQ ID NO：1(NCBI登记号码Q9Y239；gi：20137579)。
1    MEEQGHSEME IIPSESHPHI QLLKSNRELL VTHIRNTQCL
41   VDNLLKNDYF SAEDAEIVCA CPTQPDKVRK ILDLVQSKGE
81   EVSEFFLYLL QQLADAYVDL RPWLLEIGFS PSLLTQSKVV
121  VNTDPVSRYT QQLRHHLGRD SKFVLCYAQK EELLLEEIYM
161  DTIMELVGFS NESLGSLNSL ACLLDHTTGI LNEQGETIFI
201  LGDAGVGKSM LLQRLQSLWA TGRLDAGVKF FFHFRCRMFS
241  CFKESDRLCL QDLLFKHYCY PERDPEEVFA FLLRFPHVAL
281  FTFDGLDELH SDLDLSRVPD SSCPWEPAHP LVLLANLLSG
321  KLLKGASKLL TARTGIEVPR QFLRKKVLLR GFSPSHLRAY
361  ARRMFPERAL QDRLLSQLEA NPNLCSLCSV PLFCWIIFRC
401  FQHFRAAFEG SPQLPDCTMT LTDVFLLVTE VHLNRMQPSS
441  LVQRNTRSPV ETLHAGRDTL CSLGQVAHRG MEKSLFVFTQ
481  EEVQASGLQE RDMQLGFLRA LPELGPGGDQ QSYEFFHLTL
521  QAFFTAFFLV LDDRVGTQEL LRFFQEWMPP AGAATTSCYP
561  PFLPFQCLQG SGPAREDLFK NKDHFQFTNL FLCGLLSKAK
601  QKLLRHLVPA AALRRKRKAL WAHLFSSLRG YLKSLPRVQV
641  ESFNQVQAMP TFIWMLRCIY ETQSQKVGQL AARGICANYL
681  KLTYCNACSA DCSALSFVLH HFPKRLALDL DNNNLNDYGV
721  RELQPCFSRL TVLRLSVNQI TDGGVKVLSE ELTKYKIVTY
761  LGLYNNQITD VGARYVTKIL DECKGLTHLK LGKNKITSEG
801  GKYLALAVKN SKSISEVGMW GNQVGDEGAK AFAEALRNHP
841  SLTTLSLASN GISTEGGKSL ARALQQNTSL EILWLTQNEL
881  NDEVAESLAE MLKVNQTLKH LWLIQNQITA KGTAQLADAL
921  QSNTGITEIC LNGNLIKPEE AKVYEDEKRI ICF
人类Nod1的核苷酸序列也是可获得的，NCBI登记号码BC040339 (gi：25955660)，以下列出为SEQ ID NO：2以便参考。
1    CCCGGCCCCG GCGTCCCCGG ACCATGGCGC TCTCCGGGCT
41   CTTCTCTAGC TCTCAGCGGC TGCGAAGTCT GTAAACCTGG
81   TGGCCAAGTG ATTGTAAGTC AGGAGACTTT CCTTCGGTTT
121  CTGCCTTTGA TGGCAAGAGG TGGAGATTGT GGCGGCGATT
161  ACAGAAAACG TCTGGGAAGA CAAGTTGCTG TTTTTATGGG
201  AATCGCAGGC TTGGAAGAGA CAGAAGCAAT TCCAGAAATA
241  AATTGGAAAT TGAAGATTTA AACAATGTTG TTTTAAAACA
281  TTCTAACTTC AAAGAATGAT GCCAGAAACT TAAAAAGGGG
321  CTGCGCAGAG TAGCAGGGGC CCTGGAGGGC GCGGCCTGAA
361  TCCTGATTGC CCTTCTGCTG AGAGGACACA CGCAGCTGAA
401  GATGAATTTG GGAAAAGTAG CCGCTTGCTA CTTTAACTAT
441  GGAAGAGCAG GGCCACAGTG AGATGGAAAT AATCCCATCA
481  GAGTCTCACC CCCACATTCA ATTACTGAAA AGCAATCGGG
521  AACTTCTGGT CACTCACATC CGCAATACTC AGTGTCTGGT
561  GGACAACTTG CTGAAGAATG ACTACTTCTC GGCCGAAGAT
601  GCGGAGATTG TGTGTGCCTG CCCCACCCAG CCTGACAAGG
641  TCCGCAAAAT TCTGGACCTG GTACAGAGCA AGGGCGAGGA
681  GGTGTCCGAG TTCTTCCTCT ACTTGCTCCA GCAACTCGCA
721  GATGCCTACG TGGACCTCAG GCCTTGGCTG CTGGAGATCG
761  GCTTCTCCCC TTCCCTGCTC ACTCAGAGCA AAGTCGTGGT
801  CAACACTGAC CCAGTGAGCA GGTATACCCA GCAGCTGCGA
841  CACCATCTGG GCCGTGACTC CAAGTTCGTG CTGTGCTATG
881  CCCAGAAGGA GGAGCTGCTG CTGGAGGAGA TCTACATGGA
921  CACCATCATG GAGCTGGTTG GCTTCAGCAA TGAGAGCCTG
961  GGCAGCCTGA ACAGCCTGGC CTGCCTCCTG GACCACACCA
1001 CCGGCATCCT CAATGAGCAG GGTGAGACCA TCTTCATCCT
1041 GGGTGATGCT GGGGTGGGCA AGTCCATGCT GCTACAGCGG
1081 CTGCAGAGCC TCTGGGCCAC GGGCCGGCTA GACGCAGGGG
1121 TCAAATTCTT CTTCCACTTT CGCTGCCGCA TGTTCAGCTG
1161 CTTCAAGGAA AGTGACAGGC TGTGTCTGCA GGACCTGCTC
1201 TTCAAGCACT ACTGCTACCC AGAGCGGGAC CCCGAGGAGG
1241 TGTTTGCCTT CCTGCTGCGC TTCCCCCACG TGGCCCTCTT
1281 CACCTTCGAT GGCCTGGACG AGCTGCACTC GGACTTGGAC
1321 CTGAGCCGTG TGCCTGACAG CTCCTGCCCC TGGGAGCCTG
1361 CCCACCCCCT GGTCTTGCTG GCCAACCTGC TCAGTGGGAA
1401 GCTGCTCAAG GGGGCTAGCA AGCTGCTCAC AGCCCGCACA
1441 GGCATCGAGG TCCCGCGCCA GTTCCTGCGG AAGAAGGTGC
1481 TTCTCCGGGG CTTCTCCCCC AGCCACCTGC GCGCCTATGC
1521 CAGGAGGATG TTCCCCGAGC GGGCCCTGCA GGACCGCCTG
1561 CTGAGCCAGC TGGAGGCCAA CCCCAACCTC TGCAGCCTGT
1601 GCTCTGTGCC CCTCTTCTGC TGGATCATCT TCCGGTGCTT
1641 CCAGCACTTC CGTGCTGCCT TTGAAGGCTC ACCACAGCTG
1681 CCCGACTGCA CGATGACCCT GACAGATGTC TTCCTCCTGG
1721 TCACTGAGGT CCATCTGAAC AGGATGCAGC CCAGCAGCCT
1761 GGTGCAGCGG AACACACACA GCCCAGTGGA GACCCTCCAC
1801 GCCGGCCGGG ACACTCTGTG CTCGCTGGGG CAGGTGGCCC
1841 ACCGGGGCAT GGAGAAGAGC CTCTTTGTCT TCACCCAGGA
1881 GGAGGTGCAG GCCTCCGGGC TGCAGGAGAG AGACATGCAG
1921 CTGGGCTTCC TGCGGGCTTT GCCGGAGCTG GGCCCCGGGG
1961 GTGACCAGCA GTCCTATGAG TTTTTCCACC TCACCCTCCA
2001 GGCCTTCTTT ACAGCCTTCT TCCTCGTGCT GGACGACAGG
2041 GTGGGCACTC AGGAGCTGCT CAGGTTCTTC CAGGAGTGGA
2081 TGCCCCCTGC GGGGGCAGCG ACCACGTCCT GCTATCCTCC
2121 CTTCCTCCCG TTCCAGTGCC TGCAGGGCAG TGGTCCGGCG
2161 CGGGAAGACC TCTTCAAGAA CAAGGATCAC TTCCAGTTCA
2201 CCAACCTCTT CCTGTGCGGG CTGTTGTCCA AAGCCAAACA
2241 GAAACTCCTG CGGCATCTGG TGCCCGCGGC AGCCCTGAGG
2281 AGAAAGCGCA AGGCCCTGTG GGCACACCTG TTTTCCAGCC
2321 TGCGGGGCTA CCTGAAGAGC CTGCCCCGCG TTCAGGTCGA
2361 AAGCTTCAAC CAGGTGCAGG CCATGCCCAC GTTCATCTGG
2401 ATGCTGCGCT GCATCTACGA GACACAGAGC CAGAAGGTGG
2441 GGCAGCTGGC GGCCAGGGGC ATCTGCGCCA ACTACCTCAA
2481 GCTGACCTAC TGCAACGCCT GCTCGGCCGA CTGCAGCGCC
2521 CTCTCCTTCG TCCTGCATCA CTTCCCCAAG CGGCTGGCCC
2561 TAGACCTAGA CAACAACAAT CTCAACGACT ACGGCGTGCG
2601 GGAGCTGCAG CCCTGCTTCA GCCGCCTCAC TGTTCTCAGA
2641 CTCAGCGTAA ACCAGATCAC TGACGGTGGG GTAAAGGTGC
2681 TAAGCGAAGA GCTGACCAAA TACAAAATTG TGACCTATTT
2721 GGGTTTATAC AACAACCAGA TCACCGATGT CGGAGCCAGG
2761 TACGTCACCA AAATCCTGGA TGAATGCAAA GGCCTCACGC
2801 ATCTTAAACT GGGAAAAAAC AAAATAACAA GTGAAGGAGG
2841 GAAGTATCTC GCCCTGGCTG TGAAGAACAG CAAATCAATC
2881 TCTGAGGTTG GGATGTGGGG CAATCAAGTT GGGGATGAAG
2921 GAGCAAAAGC CTTCGCAGAG GCTCTGCGGA ACCACCCCAG
2961 CTTGACCACC CTGAGTCTTG CGTCCAACGG CATCTCCACA
3001 GAAGGAGGAA AGAGCCTTGC GAGGGCCCTG CAGCAGAACA
3041 CGTCTCTAGA AATACTGTGG CTGACCCAAA ATGAACTCAA
3081 CGATGAAGTG GCAGAGAGTT TGGCAGAAAT GTTGAAAGTC
3121 AACCAGACGT TAAAGCATTT ATGGCTTATC CAGAATCAGA
3161 TCACAGCTAA GGGGACTGCC CAGCTGGCAG ATGCGTTACA
3201 GAGCAACACT GGCATAACAG AGATTTGCCT AAATGGAAAC
3241 CTGATAAAAC CAGAGGAGGC CAAAGTCTAT GAAGATGAGA
3281 AGCGGATTAT CTGTTTCTGA GAGGATGCTT TCCTGTTCAT
3321 GGGGTTTTTG CCCTGGAGCC TCAGCAGCAA ATGCCACTCT
3361 GGGCAGTCTT TTGTGTCAGT GTCTTAAAGG GGCCTGCGCA
3401 GGCGGGACTA TCAGGAGTCC ACTGCCTCCA TGATGCAAGC
3441 CAGCTTCCTG TGCAGAAGGT CTGGTCGGCA AACTCCCTAA
3481 GTACCCGCTA CAATTCTGCA GAAAAAGAAT GTGTCTTGCG
3521 AGCTGTTGTA GTTACAGTAA ATACACTGTG AAGAGACTTT
3561 ATTGCCTATT ATAATTATTT TTATCTGAAG CTAGAGGAAT
3601 AAAGCTGTGA GCAAACAGAG GAGGCCAGCC TCACCTCATT
3641 CCAACACCTG CCATAGGGAC CAACGGGAGC GAGTTGGTCA
3681 CCGCTCTTTT CATTGAAGAG TTGAGGATGT GGCACAAAGT
3721 TGGTGCCAAG CTTCTTGAAT AAAACGTGTT TGATGGATTA
3761 GTATTATACC TGAAATATTT TCTTCCTTCT CAGCACTTTC
3801 CCATGTATTG ATACTGGTCC CACTTCACAG CTGGAGACAC
3841 CGGAGTATGT GCAGTGTGGG ATTTGACTCC TCCAAGGTTT
3881 TGTGGAAAGT TAATGTCAAG GAAAGGATGC ACCACGGGCT
3921 TTTAATTTTA ATCCTGGAGT CTCACTGTCT GCTGGCAAAG
3961 ATAGAGAATG CCCTCAGCTC TTAGCTGGTC TAAGAATGAC
4001 GATGCCTTCA AAATGCTGCT TCCACTCAGG GCTTCTCCTC
4041 TGCTAGGCTA CCCTCCTCTA GAAGGCTGAG TACCATGGGC
4081 TACAGTGTCT GGCCTTGGGA AGAAGTGATT CTGTCCCTCC
4121 AAAGAAATAG GGCATGGCTT GCCCCTGTGG CCCTGGCATC
4161 CAAATGGCTG CTTTTGTCTC CCTTACCTCG TGAAGAGGGG
4201 AAGTCTCTTC CTGCCTCCCA AGCAGCTGAA GGGTGACTAA
4241 ACGGGCGCCA AGACTCAGGG GATCGGCTGG GAACTGGGCC
4281 AGCAGAGCAT GTTGGACACC CCCCACCATG GTGGGCTTGT
4321 GGTGGCTGCT CCATGAGGGT GGGGGTGATA CTACTAGATC
4361 ACTTGTCCTC TTGCCAGCTC ATTTGTTAAT AAAATACTGA
4401 AAACACTAAA AAAAAAAAAA AA
NOD1蛋白看起来在细菌识别中具有重要作用，可以作为细胞区 室内的特异性宿主模式识别受体起作用。近来的研究显示，NOD1是 在含有二氨基庚二酸的细菌肽聚糖的宿主识别中所必需的 (Chamaillard等人.，Nature Immunology，DOI：10.1038/ni945，June 8， 2003)。NOD1识别的核心组织是二肽，γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基 庚二酸(也称为iE-DAP)。这种二肽已知仅存在于有限数量的细菌中 (Escherichia coli和几种革兰氏阳性细菌，例如Bacillus subtilis和 Listeria monocytogenes)。
发明人发现了，NOD1使细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感化， 并且在缺少任何其他已知的细胞凋亡触发的情况下，NOD1特异性配 体诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡。使用动物模型的体内研究说明和强调 了NOD1在肿瘤退化中具有的作用。特别地，如此处所示，置入SCID 小鼠的MCF-7乳腺肿瘤细胞的异种移植物一般形成肿瘤。然而，稍 后，这些肿瘤一般会退化，即使没有抗肿瘤治疗。但是，当NOD1-/-MCF-7 肿瘤细胞移植到小鼠中时，肿瘤不会退化，反而继续生长(参见附图 10)。当将NOD1功能添加回Nod1-/-MCF-7肿瘤细胞时(通过适合的 遗传构建体的转染)，通过移植这些NOD1表达细胞产生的肿瘤现在 将会退化。因此，NOD1表达可以帮助控制肿瘤细胞生长，并且可以 引起肿瘤细胞的细胞凋亡。
本发明还提供了保持了细胞凋亡活性的NOD1突变(V41Q)多 肽。这种V41Q突变NOD1多肽的序列以下作为SEQ ID NO：3提供， V41Q突变是粗体和下划线的。
1    MEEQGHSEME IIPSESHPHI QLLKSNRELL VTHIRNTQCL
41   QDNLLKNDYF SAEDAEIVCA CPTQPDKVRK ILDLVQSKGE
81   EVSEFFLYLL QQLADAYVDL RPWLLEIGFS PSLLTQSKVV
121  VNTDPVSRYT QQLRHHLGRD SKFVLCYAQK EELLLEEIYM
161  DTIMELVGFS NESLGSLNSL ACLLDHTTGI LNEQGETIFI
201  LGDAGVGKSM LLQRLQSLWA TGRLDAGVKF FFHFRCRMFS
241  CFKESDRLCL QDLLFKHYCY PERDPEEVFA FLLRFPHVAL
281  FTFDGLDELH SDLDLSRVPD SSCPWEPAHP LVLLANLLSG
321  KLLKGASKLL TARTGIEVPR QFLRKKVLLR GFSPSHLRAY
361  ARRMFPERAL QDRLLSQLEA NPNLCSLCSV PLFCWIIFRC
401  FQHFRAAFEG SPQLPDCTMT LTDVFLLVTE VHLNRMQPSS
441  LVQRNTRSPV ETLHAGRDTL CSLGQVAHRG MEKSLFVFTQ
481  EEVQASGLQE RDMQLGFLRA LPELGPGGDQ QSYEFFHLTL
521  QAFFTAFFLV LDDRVGTQEL LRFFQEWMPP AGAATTSCYP
561  PFLPFQCLQG SGPAREDLFK NKDHFQFTNL FLCGLLSKAK
601  QKLLRHLVPA AALRRKRKAL WAHLFSSLRG YLKSLPRVQV
641  ESFNQVQAMP TFIWMLRCIY ETQSQKVGQL AARGICANYL
681  KLTYCNACSA DCSALSFVLH HFPKRLALDL DNNNLNDYGV
721  RELQPCFSRL TVLRLSVNQI TDGGVKVLSE ELTKYKIVTY
761  LGLYNNQITD VGARYVTKIL DECKGLTHLK LGKNKITSEG
801  GKYLALAVKN SKSISEVGMW GNQVGDEGAK AFAEALRNHP
841  SLTTLSLASN GISTEGGKSL ARALQQNTSL EILWLTQNEL
881  NDEVAESLAE MLKVNQTLKH LWLIQNQITA KGTAQLADAL
921  QSNTGITEIC LNGNLIKPEE AKVYEDEKRI ICF
突变V41Q存在于Nod1的CARD结构域中，早先被报道破坏 Caspase 9与Nod1的结合。然而，与表明V41Q突变抑制Nod1依赖 性细胞凋亡的早先的结果相反，发明人进行的实验显示V41Q突变多 肽在细胞凋亡途径中是活性的(附图4)。
肿瘤
本发明的组合物和方法在各种癌症和肿瘤的治疗中是有用的，包 括但不限于雌激素敏感性肿瘤，以及乳腺、膀胱、宫颈、结肠、胆囊、 肾脏、肝脏、肺、胰腺、卵巢、前列腺、皮肤、胃、甲状腺等等的肿 瘤。在某些实施方式中，本发明的组合物可以用于治疗或预防癌症， 例如膀胱、乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺，包括小细胞肺癌、食道、 胆囊、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺、前列腺和皮肤，包括鳞状细 胞癌的癌症；淋巴系统的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白 血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、 Hodgkin′s淋巴瘤、非Hodgkin′s淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burkett′s淋 巴瘤；骨髓系统的造血肿瘤，包括急性和慢性粒性白血病、脊髓发育 不良综合征和早幼粒细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤 和横纹肌肉瘤；中央和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神 经细胞瘤、胶质瘤和许旺氏细胞瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细 胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、keratoxanthoma、甲状腺滤 泡癌症和Kaposi′s肉瘤。在某些实施方式中，本发明可以用于治疗或 预防乳腺癌症和肿瘤。
例如，NOD1多肽、Nod1核酸、可以提高NOD1表达或活性试 剂，或其组合，可以单独地、与其他因子例如TNF组合地至少到肿瘤 内或邻近肿瘤，来引起肿瘤细胞经历细胞凋亡。因而，本发明的组合 物和方法可以用于治疗癌症。
调节NOD1表达和活性
根据本发明的，提高的NOD1表达和/或NOD1活性促进了肿瘤 的退化。因此，本发明提供了治疗和防止哺乳动物中肿瘤生长的方法， 通过向所述哺乳动物施用NOD1多肽、Nod1核酸、提高NOD1表达 和/或活性的试剂、或其组合。提高NOD1表达或活性的试剂包括可 以提高NOD1的转录、翻译或活性的任何试剂。
因而，通过施用NOD1多肽(例如，SEQ ID NO：1)、编码NOD1 多肽的核酸(例如，包含SEQ ID NO：2的核酸)，肿瘤退化的发生率 可以被提高或促进。编码NOD1的核酸可以置于表达盒中，和/或在 载体中维持，以便操作、表达和复制。以下更详细地说明了产生编码 NOD1并且可以表达NOD1多肽的核酸的方法。
提高NOD1表达或活性的试剂包括增强NOD1活性的小的肽基配 体。例如，γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、γ-D-Gln- DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)和其组合， 可以提高NOD1表达或活性。在某些实施方式中，仅γ-D-谷氨酰基-内 消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)或仅γ-D-Gln-DAP(iQ-DAP)，或仅D- Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)被使用或施用。在其他实施方式 中，γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、γ-D-Gln-DAP (iQ-DAP)和/或D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)的组合被使 用或施用。
本发明进一步提供了在受试者中调节NOD1活性的方法，包括提 供能够改变受试者的NOD1活性的试剂；在一定条件下向受试者施用 所述试剂，从而改变受试者的NOD1活性。在某些实施方式中，向受 试者施用所述试剂引起受试者内肿瘤的退化。本发明不局限于特定的 化合物。实际上，各种化合物是期待的，包括但不限于，包含D-Ala- L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)的肽、谷氨酰胺-二氨基庚二酸二肽 和包含谷氨酸-二氨基庚二酸二肽(例如，iE-DAP、iQ-DAP、iE-DAP 或iQ-DAP的类似物、iE-DAP或iQ-DAP的小分子模拟物)的肽。
联合治疗
本发明预期采用NOD1促进剂和其他可用的抗肿瘤治疗剂的组合 的组合物和方法。常规的抗肿瘤剂的剂量通常保持尽可能低，因为在 较高的剂量可能观察到副作用。根据本发明，NOD1和/或提高NOD1 表达或活性的试剂与可用的抗肿瘤剂的组合，可以改善所述抗肿瘤剂 有效的癌症的范围(spectrum)，并且降低所需的所述抗肿瘤剂的剂量。 因而，本发明预期当前的NOD1相关试剂与一种或多种抗肿瘤或制癌 试剂的组合。本领域技术人员可获得的任何抗肿瘤和制癌试剂可以与 当前的NOD1相关试剂一起使用。然而，在某些实施方式中，选择的 抗肿瘤或抗癌试剂具有不同的作用机制，或针对多少不同类型的癌症 或肿瘤起作用。例如，本发明的NOD1相关试剂可以与制癌试剂或免 疫活化剂组合，来组合NOD1的前细胞凋亡效果以及所述制癌试剂的 抗赘生效果，和/或由所述免疫活化剂诱导的前免疫反应。进一步的， 在某些情况下，除了这些方法之外进行放疗或外科治疗来改善治疗的 效果。
可以与本发明的NOD1相关试剂一同使用的其他化学治疗剂的实 例包括六甲密胺、博来霉素、马利兰、亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、 卡氮芥、苯丁酸氦芥、顺铂、克拉屈滨、Crisantaspase、环磷酰胺、 阿糖胞苷、氮烯唑胺、放线菌素、红比霉素、多西他赛、阿霉素、表 柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达 比星、异环磷酰胺、伊立替康、脂质体阿霉素、环己亚硝脲、苯丙氨 酸氮芥、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫 杉醇、喷司他丁、甲基苄肼、雷替曲塞、链脲霉素、优福定、泰莫佐 罗、硫替派、巯基鸟嘌呤/硫鸟嘌呤、拓扑替康、苏消安、长春花碱、 长春新碱、去乙酰长春酰胺、长春烯碱和其组合。
在某些实施方式中，与一种或多种激素联合施用NOD1相关试剂。 例如，可以与一种或多种雄激素、黄体酮、雌激素或抗雌激素联合施 用NOD1相关试剂。通过向对雌激素起反应的细胞或组织发挥对抗效 应，或通过与雌激素竞争位于细胞表面的受体位点，抗雌激素起作用。 例如，药物它莫西芬(商品名：Nolvadex)或Arimidex(Anastrozole) 是可以使用的抗雌激素。它莫西芬已经用于乳腺癌的治疗，并用以降 低高风险妇女中的乳腺癌发病率。如在此所示的，添加它莫西芬部分 地阻断了γTriDAP-Nod1诱导的细胞死亡。因此，在某些情况下，它莫 西芬可以不用于本发明的NOD1组合物中。然而，在其他例子中，当 被包括在包含了NOD1试剂施用的治疗方案中时，它莫西芬可能是有 用的。
在另一个实施方式中，本发明的NOD1相关试剂与肿瘤坏死因子 α(TNFα)联合施用。TNFα是商业上可获得的，例如，来自Pro-Spec Tany TechnoGene Ltd.(Israel)。肿瘤坏死因子的序列可以在 ncbi.nlm.nih.gov的NCBI数据库中找到。人类TNFα的序列的一个实 例以下在SEQ ID NO：4中提供。
1    MSTESMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSLFSFLI
41   VAGATTLFCL LHFGVIGPQR EESPRDLSLI SPLAQAVRSS
81   SRTPSDKPVA HVVANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR
121  DNQLVVPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA
161  VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE TPEGAEAKPW YEPIYLGGVF
201  QLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYFGI IAL
细胞凋亡
如在此描述的，NOD1可以促进肿瘤细胞的细胞凋亡。为了治疗 或防止肿瘤生长，本领域技术人员可以选择采用抗肿瘤剂与在此描述 的NOD1相关试剂的组合。含有各种抗肿瘤剂以及本发明的NOD1相 关试剂的组合物，可以在本领域技术人员可用的各种方法中测试，来 确定这些组合物是否最佳地促进肿瘤退化和/或肿瘤细胞的细胞凋亡。
例如，通过检测细胞凋亡期间产生的DNA片段的3′-OH游离末 端的TUNEL(TdT介导的dUTP断口-末端标记)标记，可以分析细 胞凋亡(Gavrieli等人.(1992)J.Cell Biol.119：493)。TUNEL分析 一般包括向180-bp(碱基对)的寡聚DNA片段添加催化地添加核苷 酸以检测所述片段，所述核苷酸以及与发色团系统结合或与荧光标签 结合。180-bp寡聚体的DNA阶梯的存在是细胞凋亡的指示。根据 TUNEL方法检测细胞死亡的步骤是商业上可获得的，例如，来自 Boehringer Mannheim(Cell Death试剂盒)和Oncor(apoptag Plus)。
当前可获得的另一个细胞凋亡标志物是annexin，以商标 APOPTESTTM销售。annexin标志物被用于“细胞凋亡检测试剂盒”中， 其也是商业上可获得的，例如，来自R & D Systems。在细胞凋亡期 间，细胞膜的磷脂不对称性改变，从而磷脂被暴露在外膜上。Annexins 是在存在钙的情况下结合磷脂的蛋白质的同源物组。第二试剂可以用 于与检测annexin的试剂碘化丙锭(PI)连接，其是DNA结合荧光染 料。当细胞群体暴露于两种试剂时，细胞凋亡的细胞对于annexin阳 性地染色，对于PI阴性地染色，坏死的细胞对于两者都是染色阳性的， 而活细胞对于两者是染色阴性的。测试细胞凋亡的其他方法是本领域 已知的，可以用于本发明的方法中。
肿瘤退化可以通过使用动物模型来评定，例如，本领域技术人员 可获得的任何动物模型，或在此描述和说明的异种移植模型。
异种移植模型
本发明还提供了异种移植模型，其包括能够在小鼠中形成肿瘤的 细胞系。当用这些异种移植细胞接种小鼠时，肿瘤出现。本发明的异 种移植细胞系缺少Nod1功能，在此有时称为Nod1-/-细胞。令人惊讶 地，具有相同遗传背景、除了存在与零Nod1等位基因相对的野生型 之外的细胞，形成很快退化的肿瘤。仅缺乏Nod1功能的Nod1-/-细胞 形成继续生长的肿瘤。根据本发明的，这些分离的Nod1-/-细胞对于研 究肿瘤和肿瘤退化是有用的。本发明的Nod1-/-细胞因而可以用于开发 化学治疗剂，和用于研究肿瘤发生的机制。
本发明的分离的Nod1-/-细胞系的一个实例是MCF-7C20细胞系。 当C20克隆被移植到雄性小鼠中时，发明人观察到了更健壮的肿瘤生 长。聚合酶链式反应扩增研究确定了，在MCF-7C20细胞中，和在重 组导入了功能性的NOD1等位基因的MCF-7C20细胞(即，C20Nod1 细胞)中，没有孕激素受体。进一步的PCR研究揭示了，雌激素受体 α存在于所有三种MCF7细胞类型(野生型MCF-7细胞、MCF-7C20 细胞和MCF-7C20Nod1细胞)的每一种中。
Nod1表达盒和载体
根据本发明的，NOD1多肽可以重组地产生，然后纯化，用于作 为抗肿瘤剂向受试者施用。在另一个实施方式中，编码NOD1的核酸 可以置于表达盒和/或表达载体中。这些NOD1表达盒和表达载体也 可以作为抗肿瘤剂向受试者施用。因此，本发明提供了Nod1表达盒 和Nod1表达载体。
NOD1多肽的哺乳动物表达可以如Dijkema等人.，EMBO J. (1985)4：761，Gorman等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b) 79：6777，Boshart等人.，Cell(1985)41：521和美国专利No.4,399,216 中描述的实现。哺乳动物表达的其他特征可以如Ham and Wallace， Meth.Enz.(1979)58：44，Barnes and Sato，Anal.Biochem.(1980) 102：255，美国专利Nos.4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655， WO 90/103430、WO 87/00195和美国专利No.RE 30,985中描述的来 便利化。使用这种Nod1核酸可以增加或替换内源Nod1基因的表达。
Nod1核酸可以置于线性或环形分子内。它们可以置于自主复制 的分子内，或没有复制序列的分子内。它们可以通过它们自身，或通 过其他调节序列来调节，这是本领域已知的。编码NOD1的核酸构建 体可以包括转录调节元件，例如，启动子元件、增强子或UAS元件， 和转录终止子信号，用于控制Nod1序列在细胞中的转录。
Nod1核酸可以用于表达盒或基因递送载体中，以向细胞、优选 的真核细胞中递送Nod1 mRNA、全长NOD1蛋白、NOD1融合蛋白、 NOD1多肽，或NOD1多肽的片段。根据本发明，基因递送载体可以 是，例如，裸质粒DNA，病毒表达载体，或连同脂质体或凝聚剂的本 发明的Nod1核酸。
Nod1核酸可以使用本领域可获得的各种技术导入适合的宿主细 胞中，例如转铁蛋白聚阳离子介导的DNA转移，用裸的或密封的核 酸转染、脂质体介导的DNA转移、DNA包被的乳液珠子细胞内转运、 原生质体融合、病毒感染、电穿孔、核酸微注射步骤的使用和磷酸钙 介导的转染。
在本发明的一个实施方式中，所述基因递送载体包含启动子和 NOD 1编码核酸。可以使用的启动子的实例包括组织特异性启动子和 通过细胞增殖激活的启动子，例如胸苷激酶和胸苷酸合成酶启动子。 其他优选的启动子包括通过病毒的感染激活的启动子，例如α-和β- 干扰素启动子，和可以被激素例如雌激素激活的启动子。可以使用的 其他启动子包括Moloney病毒LTR、CMV启动子和小鼠白蛋白启动 子。
基因递送载体可以包含病毒序列，例如病毒复制起点或包装信 号。这些病毒序列可以选自例如星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳 多空病毒、副粘病毒、细小病毒、微小RNA病毒、痘病毒、逆转录 病毒、togavirus或腺病毒的病毒。在某些实施方式中，所述基因递送 载体是重组逆转录病毒载体。重组逆转录病毒和其各种用途以及在许 多参考文献中描述了，包括，例如Mann等人.，Cell 33：153，1983， Cane and Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349，1984，Miller 等人.，Human Gene Therapy 1：5-14，1990，美国专利Nos.4,405,712、 4,861,719和4,980,289以及PCT申请Nos.WO 89/02,468、WO 89/05,349 和WO 90/02,806。可以在本发明中使用许多逆转录病毒基因递送载 体，包括例如在EP 0,415,731；WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；美国专利No.5,219,740；WO 9311230；WO 9310218；Vile and Hart，Cancer Res.53：3860-3864，1993；Vile and Hart， Cancer Res.53：962-967，1993；Ram等人，Cancer Res.53：83-88， 1993；Takamiya等人.，J.Neurosci.Res.33：493-503，1992；Baba等 人.，J.Neurosurg.79：729-735，1993(美国专利No.4,777,127、GB 2,200,651、EP 0,345,242和WO91102805中描述的那些。
可以利用的逆转录病毒的实例包括禽白血病病毒(ATCC Nos. VR-535和VR-247)、牛白血病毒(VR-1315)、鼠白血病毒(MLV)、 貂细胞灶诱导病毒(Koch el al.，J.Vir.49：828，1984；和Oliff等人.， J.Vir.48：542，1983)、鼠肉瘤病毒(ATCC Nos.VR-844，45010和 45016)、网状内皮组织增殖病毒(ATCC Nos.VR-994、VR-770和 45011)、劳氏肉瘤病毒、Mason-Pfizer猴病毒、狒狒内生病毒、内源 的猫科逆转录病毒(例如，RD114)和用作逆转录病毒载体的小鼠或 大鼠gL30序列。从中可以产生重组逆转录病毒的MLV毒株包括4070A 和1504A(Hartley and Rowe，J.Vir.19：19，1976)、Abelson(ATCC No. VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graffi(Ru等人.，J.Vir.67： 4722，1993；和Yantchev Neopksma 26：397，1979)、Gross(ATCC No. VR-590)、Kirsten(Albino等人.，J.Exp.Med.164：1710，1986)、Harvey 肉瘤病毒(Manly等人，J.Vir 62：3540，1988；和Albino等人，J.Exp. Med.164：1710，1986)和Rauscher(ATCC No.VR-998)以及Moloney MLV(ATCC No.VR-190)。可以使用的非小鼠逆转录病毒是劳氏肉瘤 病毒，例如Bratislava(Manly等人.，J.Vir.62：3540，1988；和Albino 等人.，J.Exp.Med.164：1710，1986)、Bryan高滴度(例如，ATCC Nos. VR-334，VR-657，VR-726，VR-659和VR-728)、Bryan标准(ATCC No. VR-140)、Carr-Zilber(Adgighitov等人.，Neoplasma 27：159，1980)、 Engelbreth-Holm(Laurent等人.，Biochem Biophys Acta 908：241， 1987)、Harris、Prague(例如，ATCC Nos.VR-772，和45033)或 Schmidt-Ruppin(例如ATCC Nos.VR-724、VR-725、VR-354)病毒。
根据在此提供的公开和标准的重组技术(例如，Sambrook等人.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition(1989)，Sambrook 等人.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition(2001) 以及Kunkle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：488，1985)，可以容易 地使用上述逆转录病毒的任一种来组合或构建逆表达基因递送载体。 逆表达表达载体的部分可以来自不同的逆转录病毒。例如，逆转录病 毒LTR可以衍生自鼠肉瘤病毒，来自劳氏肉瘤病毒的tRNA结合位点， 来自鼠白血病毒的包装信号，以及来自禽白血病病毒的第二链合成起 点。通过导入合适的包装细胞系，这些重组逆转录病毒载体可以用于 产生转导感受态逆转录病毒载体颗粒(参见，1991年11月29日体积 的系列No.071800,921)。
可以产生重组逆转录病毒，其指导重组逆转录病毒基因组向宿主 细胞DNA的特定区域的位点特异性整合。这种位点特异性整合对于 突变或替换内源NOD1基因是有用的。通过掺入到逆转录病毒颗粒中 的嵌合的整合酶，可以介导位点特异性整合(参见，1995年5月22 日提交的系列No.08/445,466)。优选的是，重组病毒基因递送载体是 复制缺陷的重组病毒。
适合与上述逆转录病毒基因递送载体使用的包装细胞系可以容易 地制备(参见WO 92/05266)，并用于产生生产者细胞系(也称为载 体细胞系或“VCL”)用于重组病毒颗粒的生产。在本发明的某些实 施方式中，包装细胞系由人类(例如HT1080细胞)或貂母细胞系制 成，从而容许产生能够在人类血清的钝化中存活的重组逆转录病毒基 因递送载体。这种重组逆转录病毒基因递送载体的构建在WO 91/02805 中详细描述了。这些重组逆转录病毒基因递送载体可以用于通过将它 们导入合适的包装细胞系来产生转导感受态的逆转录病毒颗粒。类似 地，根据在此提供的公开(还参见，Berkner，Biotechniques 6：616-627， 1988和Rosenfeld等人，Science 252：431-434，1991、WO 93/07283， WO 93/06223和WO 93/07282)，可以容易地制备和使用腺病毒基因递 送载体。
基因递送载体也可以是重组腺病毒基因递送载体。根据在此提供 的公开和本领域可获得的信息(参见，例如Berkner，Biotechniques 6： 616，1988以及Rosenfeld等人.，Science 252：431，1991，WO 93/07283， WO 93/06223和WO 93/07282)，可以容易地制备和使用这种工具。也 可以构建和使用腺相关病毒基因递送载体来体内或体外地递送本发明 的蛋白质或核酸到细胞中。在Chatteijee等人.，Science 258：1485-1488 (1992)，Walsh等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.89：7257-7261(1992)， Walsh等人.，J.Clin.Invest.94：1440-1448(1994)，Flotte等人.，J.Biol. Chem.268：3781-3790(1993)，Ponnazhagan等人.，J.Exp.Med.179： 733-738(1994)，Miller等人，Proc.Natl Acad.Sci.91：10183-10187 (1994)，Einerhand等人，Gene Ther.2：336-343(1995)，Luo等人， Exp.Hematol.23：1261-1267(1995)和Zhou等人，Gene Therapy 3： 223-229(1996)中描述了腺相关病毒基因递送载体的体外使用。这些 工具的体内使用在Flotte等人.，Proc.Natl Acad.Sci.90：10613-10617 (1993)以及Kaplitt等人，Nature Genet.8：148-153(1994)中描述 了。
在本发明的另一个实施方式中，基因递送载体来自被膜病毒。这 种被膜病毒包括甲病毒，例如在1995年3月15日添加的美国系列号 No.08/405,627，WO 95/07994中描述的。甲病毒，包括Sindbis和ELVS 病毒，可以是用于本发明的核酸的基因递送载体。在WO 94/21792、 WO 92/10578和WO 95/07994中描述了甲病毒。可以构建和使用几种 不同的甲病毒属基因递送载体来根据本发明将核酸递送到细胞中。这 种系统的代表性实例包括在美国专利NO.5,091,309和5,217,879中描 述的那些。在某些实施方式中，用于本发明的甲病毒属基因递送载体 包括在WO 95/07994中描述的那些。
重组病毒载体也可以是基于Sindbis病毒的重组甲病毒属病毒载 体。可以容易地制备Sindbis构建体，以及许多类似的构建体。Sindbis 病毒基因递送载体一般包含能够启动Sindbis病毒转录的5′序列、编 码Sindbis非结构蛋白的核苷酸序列、被钝化以防止片段转录的病毒 连接区，以及Sindbis RNA聚合酶识别序列。任选的，病毒连接区可 以被修改，从而核酸转录被降低、提高或维持。本领域的普通技术人 员将理解的是，来自其他甲病毒的相应区域可以在上述那些中使用。
甲病毒衍生的基因递送载体的病毒连接区可以包含第一病毒连接 区，其已经被钝化以阻止核酸的转录，和第二病毒连接区，其已经被 修饰从而核酸转录被降低。甲病毒衍生的载体也可以包括能够从cDNA 启动病毒RNA的合成的5′启动子，以及控制转录终止的3′序列。
可以在本发明中使用的其他重组被膜病毒基因递送载体包括来自 Semliki Forest病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、Middleberg病 毒(ATCC VR-370)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、 委内端拉马脑炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249； ATCC VR-532)的那些，以及在美国专利5,091,309和5,217,879中， 和在WO 92/10578中描述的那些。
适用于本发明的其他病毒基因递送载体包括，例如，来自脊髓灰 质炎病毒(Evans等人.，Nature 339：385，1989，和Sabin等人，J.Biol. Standardization 1：115，1973)(ATCC VR-58)；鼻病毒(Arnold等人.， J.Cell.Biochem.L401，1990)(ATCC VR-1110)；痘病毒，例如金丝 雀痘病毒或牛痘病毒(Fisher-Hoch等人，PROC.NATL.ACAD.SCI. U.S.A.86：317，1989；Flexner等人.，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86， 1989；Flexner等人，Vaccine 8：17，1990；美国专利Nos.4,603,112 和4,769,330；WO 89/01973)(ATCC VR-111；ATCC VR-2010)；SV40 (Mulligan等人.，Nature 277：108，1979)(ATCC VR-305)，(Madzak 等人，J.Gen.Vir 73：1533，1992)；流感病毒(Luytjes等人.，Cell 59： 1107，1989；McMicheal等人.，The New England Journal of Medicine 309：13，1983；和Yap等人.，Nature 273：238，1978)(ATCC VR-797)； 细小病毒，例如腺病毒相关病毒(Samulski等人.，J.Vir.63：3822，1989， 和Mendelson等人，Virology 166：154，1988)(ATCC VR-645)；单 纯性疱疹病毒(Kit等人.，Adv.Exp.Med.Biol.215：219，1989)(ATCC VR-977；ATCC VR-260)；Nature 277：108，1979)；人类免疫缺陷性 病毒(EPO 386,882，Buchschacher等人.，J.Vir.66：2731，1992)； 麻疹病毒(EPO 440,219)(ATCC VR-24)；A(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)，Aura(ATCC VR-368)，Bebaru病毒(ATCC VR-600；ATCC VR-1240)，Cabassou(ATCC VR-922)，Chikungunya病毒(ATCC VR-64；ATCC VR-1241)，Fort Morgan(ATCC VR-924)，Getah病毒 (ATCC VR-369；ATCC VR-1243)，Kyzylagach(ATCC VR-927)，Mayaro (ATCC VR-66)，Mucambo病毒(ATCC VR-580；ATCC VR-1244)， Ndumu(ATCC VR-371)，Pixuna病毒(ATCC VR-372；ATCC VR-1245)， Tonate(ATCC VR-925)，Triniti(ATCC VR-469)，Una(ATCC VR-374)， Whataroa(ATCC VR-926)，Y-62-33(ATCC VR-375)，O′Nyong病毒， 东方脑炎病(ATCC VR-65；ATCC VR-1242)，西方脑炎病毒(ATCC VR-70；ATCC VR-1251；ATCC VR-622；ATCC VR-1252)，和冠状病 毒(Hamre等人.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.121：190，1966)(ATCC VR-740)。
本发明的核酸也可以与凝聚剂组合来形成基因递送载体。在某些 实施方式中，所述凝聚剂是聚阳离子，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚 鸟氨酸、鱼精蛋白、精胺、亚精胺和腐肉胺。在凝聚剂和核酸之间产 生连接的许多适合的方法是本领域已知的(参见，例如，1994年12 月30日提交的系列号No.08/366,787)。
在选择性的实施方式中，Nod1核酸或Nod1多肽与脂质体缔合来 形成基因递送载体。脂质体是小的、脂质泡囊，由被脂双分子层封闭 的含水区室组成，一般是球形或稍微长形的结构，直径数百埃。在适 合的条件下，脂质体可以与细胞的质膜融合，或与内在化了脂质体的 细胞内的内吞泡囊的膜融合，从而释放它的内容物到细胞质中。然而， 在与细胞的表明相互作用之前，脂质体膜作为相对不可渗透的层起作 用，其隔离并保护了它的内含物，例如，远离降解性酶。此外，由于 脂质体是合成的结构，可以产生包含期望的特征的特别设计的脂质 体。参见Stryer，Biochemistry，pp.236-240，1975(W.H.Freeman， San Francisco，Calif)；Szoka等人.，Biochim.Biophys.Acta 600：1， 1980；Bayer等人.，Biochim.Biophys.Acta.550：464，1979；Rivnay 等人.，Meth.Enzymol.149：119，1987；Wang等人.，PROC.NATL.ACAD. SCI.U.S.A.84：7851，1987，Plant等人.，Anal.Biochem.176：420， 1989，以及美国专利No.4,762,915。脂质体可以密封各种核酸和多肽 分子，包括DNA、RNA、质粒、包含在本发明中公开的那些核酸的 表达构建体，和Nod1多肽。
用于本发明的脂质体制品包括阳离子的(带正电的)、阴离子的 (带负电的)和中性的制品。阳离子脂质体已经显示了介导质粒DNA (Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416，1987)、mRNA (Malone等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077-6081，1989)和 纯化的转录因子(Debs等人，J.Biol.Chem.265：10189-10192，1990) 以功能形式的细胞内递送，阳离子脂质体是容易获得的。例如，N[1- 2，3-dioleyloxy)丙基]-N，N，N-三乙基胺(DOTMA)脂质体是以商标 LipofectinTM可从GIBCO BRL，Grand Island，N.Y获得的。还参见Feigner 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US491：5148-5152.87，1994。其他商业上 可获得的脂质体包括Transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE (Boerhinger)。其他阳离子脂质体可以从易于获得的材料使用本领域 可用的技术来制备。对于DOTAP(1，2-二(油酰基氧基)-3-(三甲 基胺)丙烷)脂质体的合成，参见，例如Szoka等人.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 75：4194-4198，1978；和WO 90/11092。
类似地，阴离子和中性脂质体是容易获得的，例如从Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)，或可以使用易于获得的材料容易地制备。 这些材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰 胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰乙醇 胺(DOPE)等。这些材料也可以与DOTMA和DOTAP起始材料以 适合的比例混合。使用这些材料制造脂质体的方法是本领域公知的。
脂质体可以包括多层泡囊(MLV)、小单层泡囊(SUV)或大单 层泡囊(LUV)。使用本领域已知的方法制备各种脂质体-核酸复合物。 参见，例如Straubinger等人，METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)， Vol.101，pp.512-527；Szoka等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87： 3410-3414，1990；Papahadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta 394： 483，1975；Wilson等人.，Cell 17：77，1979；Deamer and Bangham， Biochim.Biophys.Acta 443：629，1976；Ostro等人.，Biochem.Biophys. Res.Commun.76：836，1977；Fraley等人.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 76：3348，1979；Enoch and Strittmatter，Proc.Natl.Acad Sci.USA 76： 145，1979；Fraley等人.，J.Biol.Chem.255：10431，1980；Szoka and Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：145，1979；以及 Schaefer-Ridder等人.，Science 215：166，1982。
此外，可以包括脂蛋白与本发明的核酸一同用于向细胞递送。这 种脂蛋白的实例包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。也可以 使用这些蛋白的突变体、片段或融合物。也可以使用天然发生的脂蛋 白的修饰体，例如乙酰化的LDL。这些脂蛋白可以将核酸的递送靶向 表达脂蛋白受体的细胞。在某些实施方式中，如果脂蛋白与核酸一同 包括，在组合物不包括其他靶向配体。
也可以使用Nod1核酸向特定组织的受体介导的靶向递送。在例 如Findeis等人.(1993)，Trends in Biotechnol.11，202-05；Chiou等 人.(1994)，Gene Therapeutics：Methods and Applications of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff，ed.)；Wu & Wu(1988)，J.Biol.Chem.263， 621-24；Wu等人.(1994)，J.Biol.Chem.269，542-46；Zenke等人. (1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，3655-59；Wu等人.(1991)， J.Biol.Chem.266，338-42中描述了受体介导的DNA递送技术。
在另一个实施方式中，裸露核酸分子被用作基因递送载体，例如， 如WO 90/11092和美国专利No.5,580,859中描述的。这种基因递送载 体可以是DNA或RNA，在某些实施方式中，与灭活的腺病毒连接。 Curiel等人.，Hum.Gene.Ther.3：147-154，1992。其他适合的载体包 括DNA-配体(Wu等人.，J.Biol.Chem.264：16985-16987，1989)、 脂质-DNA组合物(Feigner等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413 7417，1989)、脂质体(Wang等人，Proc.Natl.Acad Sci.84：7851-7855， 1987)和微注射(Williams等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.88：2726-2730， 1991)。
通过将核酸包被在生物可降解的乳液珠子上，可以提高裸露的核 酸摄取入细胞的效力。这种方法利用了观察结果，当在培养中与细胞 孵育时，乳液珠子被有效地转运和浓缩在细胞的核周区域。当注射到 肌肉中时，然后珠子将被转运到细胞中。在由乳液珠子启动的内吞作 用之后，核酸包被的乳液珠子将被有效地转运到细胞中，因而提高基 因转移和表达效力。这种方法可以通过处理珠子来提高它们的疏水 性，从而促进内涵体的破坏和核酸向细胞质中的释放来进一步改善。
编码NOD1的核酸可以按类似方式导入细胞中。机械方法，例如 显微注射、脂质体介导的转染、电穿孔或磷酸钙沉淀，可以用于将NOD1 核酸构建体导入细胞中，促进细胞凋亡和/或肿瘤细胞死亡。做为选择， 如果希望细胞稳定地保持DNA构建体，DNA构建体可以在质粒上提 供，并作为独立的元件维持，或整合到细胞的基因组中，这是本领域 已知的。
内源NOD1基因在细胞中的表达也可以通过同源重组与内源 NOD1基因按读码框地导入DNA构建体来改变，所述DNA构建体包 含NOD1目标序列、调节序列、外显子和未配对的剪接供体部位，从 而形成包含所述DNA构建体的同源重组细胞。新的转录单位可以用 于如希望的打开或关闭NOD1基因。影响内源基因表达的这种方法在 美国专利No.5,641,670中教导了。
释放的NOD1核酸向细胞系或组织的基因组中的整合可以通过本 领域已知的方法来监视。例如，可以进行递送的NOD1核酸的Southern 印迹。递送的核酸的片段的大小方面的改变指示整合。递送的核酸的 复制可以特别通过检测标记的核苷酸的掺入、结合与NOD1探针杂交 来检测。NOD1核酸的表达可以通过检测与递送的核酸杂交的NOD1 mRNA的产生，或通过检测NOD1蛋白来监视。NOD1蛋白可以免疫 检测。
RIP2调节剂
根据本发明的，当“激酶缺陷的”RIP2在细胞中表达时，细胞对 于细胞凋亡被敏化。如在此使用的，“激酶缺陷的”RIP2是指基本上 没有激酶功能的RIP2多肽。因此，本发明提供了没有激酶功能的RIP2 多肽，RIP2激酶抑制剂以及用于表达激酶缺陷的RIP2的表达盒和表 达载体。
RIP2是丝氨酸/苏氨酸激酶，其在它的羧基末端含有CARD结构 域，并且显示了在过量表达系统中诱导NF-κB活化。RIP2还显示了 在调节先天和适应性免疫反应中起到作用。Rip2缺陷的小鼠仅仅具有 针对Toll样受体激动剂，例如脂多糖(LPS)的减弱的免疫反应。
RIP2的序列可以在例如NCBI数据库中获得。参见网站 ncbi.nlm.nih.gov。例如，人类RIP2的一个氨基酸序列在以下提供以便 参考，为SEQ ID NO：5(NCBI登记号码AAC27722；gi：3342910)。
1    MNGEAICSAL PTIPYHKLAD LRYLSRGASG TVSSARHADW
41   RVQVAVKHLH IHTPLLDSER KDVLREAEIL HKARFSYILP
81   ILGICNEPEF LGIVTEYMPN GSLNELLHRK TEYPDVAWPL
121  RFRILHEIAL GVNYLHNMTP PLLHHDLKTQ NILLDNEFHV
161  KIADFGLSKW RMMSLSQSRS SKSAPEGGTI IYMPPENYEP
201  GQKSRASIKH DIYSYAVITW EVLSRKQPFE DVTNPLQIMY
241  SVSQGHRPVI NEESLPYDIP HRARMISLIE SGWAQNPDER
281  PSFLKCLIEL EPVLRTFEEI TFLEAVIQLK KTKLQSVSSA
321  IHLCDKKKME LSLNIPVNHG PQEESCGSSQ LHENSGSPET
361  SRSLPAPQDN DFLSRKAQDC YFMKLHHCPG NHSWDSTISG
401  SQRAAFCDHK TTPCSSAIIN PLSTAGNSER LQPGIAQQWI
441  QSKREDIVNQ MTEACLNQSL DALLSRDLIM KEDYELVSTK
481  PTRTSKVRQL LDTTDIQGEE FAKVIVQKLK DNKQMGLQPY
521  PEILVVSRSP SLNLLQNKSM
如上所指出的，以及在实施例中更详细地说明的，当RIP2的另 一个结构域和功能(例如，CARD结构域)主要是功能性的时，表达 激酶缺陷的RIP2的细胞对于细胞凋亡被敏化。因此，本发明涉及通 过用可以抑制RIP2激酶的试剂接触细胞使细胞对细胞凋亡敏化的方 法。在另一个实施方式中，本发明涉及通过向哺乳动物施用治疗有效 量的RIP2激酶抑制剂来在动物中治疗癌症的方法。RIP2激酶抑制剂 也可以与NOD1多肽或Nod1核酸，或调节NOD1活性的试剂联合施 用。
任何可用的RIP2抑制剂可以在本发明的组合物和方法中使用， 在某些实施方式中，可以使用p38抑制剂来抑制RIP2激酶功能。例 如，可以用于抑制RIP2的p38抑制剂包括2-(4-氯苯基)-4-(4-氟 苯基)-5-嘧啶-4-基-1，2-二氢-吡唑啉酮-3、SC68376、SB203580(Iodo)、 SB202190、SB203580、SB203580(砜)、PD169316、SB220025、 SKF-86002、SB239063或ML 3163。以下提供了SB220025、SB203580 和PD169316的结构。

这些抑制剂可以在与用于抑制p38的浓度可比较的浓度下使用。
在另一个实施方式中，本发明提供了通过观察测试试剂是否可以 抑制RIP2激酶活性来鉴定RIP2抑制剂的方法。这种方法可以在体外 或体内进行。在缺乏测试试剂的情况下进行RIP2分析时，可以包括 对照物。在存在测试试剂的情况下RIP2活性降低表明所述测试试剂 是RIP2抑制剂。
组合物
施用NOD1多肽和NOD1配体，包括它们的盐以及NOD1核酸和 /或RIP2激酶抑制剂来促进细胞凋亡和肿瘤退化、调节NOD1活性， 或来实现与癌症状况或与不适当细胞生长相关的其他疾病相关的至少 一种症状。如在此描述的，可以包括其他试剂，例如，抗肿瘤剂、化 学治疗剂、TNF、RIP2激酶抑制剂、RIP2激酶缺陷多肽、编码RIP2 激酶缺陷多肽的核酸，等等。
为了实现期望的效果，可以作为单独的或分开的剂量施用NOD1 多肽、配体、核酸和与其他试剂的组合。例如，NOD1多肽、配体和 核酸可以以至少约0.01mg/kg到约500至750mg/kg、至少约0.01mg/kg 到约300至500mg/kg、至少约0.1mg/kg到约100至300mg/kg或至 少约1mg/kg到约50至100mg/kg体重的剂量施用，尽管其他剂量可 以提供有益的结果。施用的数量将取决于各种因素变化，包括但不限 于，选择的多肽、配体或核酸、哺乳动物的疾病、体重、身体状况、 健康、年龄，要实现预防还是治疗、以及所述多肽、配体或核酸是否 被化学上修饰。这些因素可以由临床医师采用动物模型或本领域可用 的其他测试系统容易地确定。
根据本发明的治疗试剂的使用可以是以单剂量、以多剂量、以连 续或间歇方式，取决于，例如，接受者的身体条件、施用的目的是治 疗性还是预防性，以及熟练医师已知的其他因素。本发明的多肽、配 体、核酸和其他试剂的施用可以在预定的时段是基本上连续的，或可 以是一系列间隔的剂量。局部和全身性施用都是预期的。
为了制备组合物，合成或获得多肽、配体、核酸和试剂，根据需 要或期望来纯化，然后冻干并稳定化。然后可以调节所述多肽、配体 或核酸到合适的浓度，并任选的与其他试剂组合。包括在单位剂量中 的给定多肽、配体或核酸的绝对重量可以广泛地变化。例如，可以施 用约0.01到约2g、或约0.1到约500mg的至少一种本发明的多肽、 核酸或抗体，或多种多肽、配体和核酸。做为选择，单位剂量可以从 约0.01g到约50g、从约0.01g到约35g、从约0.1g到约25g、从 约0.5g到约12g、从约0.5g到约8g、约0.5g到约4g，或从约0.5g 到约2g变动。
本发明的多肽、配体或核酸的日剂量也可以变化。这种日剂量可 以在例如约0.1g/天到约50g/天、从约0.1g/天到约25g/天、从约0.1g/ 天到约12g/天、从约0.5g/天到约8g/天、从约0.5g/天到约4g/天、 和从约0.5g/天到约2g/天的范围内。
因而，包含本发明的治疗性多肽、配体或核酸的一种或多种适合 的单位剂型可以通过各种途径施用，包括口服、胃肠外的(包括皮下 的、静脉内的、肌肉内的和腹膜内的)、直肠、皮肤、穿表皮的、胸 内的、非营养膜和鼻内的(呼吸性)途径。在某些实施方式中，NOD1 多肽、配体或核酸局部地向肿瘤或癌症位点施用。
治疗试剂也可以配制用于持续释放(例如，使用微囊化作用，参 见WO 94/07529和美国专利No.4,962,091)。当合适时，所述制剂可 以方便地以分散的单位剂型呈现，可以通过药物领域公知的任何方法 来制备。这些方法可以包括将治疗试剂与液体载体、固体基质、半固 体载体、细分散的固体载体或其组合混合，然后，如果需要，将产物 导入或成形为期望的递送系统。
当本发明的治疗试剂准备用于口服施用时，它们一般与药学上可 接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来形成药物制剂或单位剂型。对于 口服施用，所述治疗试剂可以呈现为粉未、颗粒制剂、溶液、悬浮液、 乳剂，或处于天然的或合成的聚合物或树脂中用于从咀嚼用胶摄取活 性成分。治疗试剂也可以作为弹丸、舔剂或糊剂存在。口服施用的本 发明的治疗试剂也可以被配制用于持续释放，例如，治疗试剂可以被 包被、微囊密封，或置于持续递送装置中。这种制剂中的总活性成分 包括制剂重量的0.001到99.9％。
“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或盐与制剂的 其他成分相容，并且对于其接受者无害。
含有本发明的治疗试剂的药物制剂可以使用公知的和易于获得的 成分通过本领域已知的步骤来制备。例如，可以与常见的赋形剂、稀 释剂或载体配制治疗试剂，并形成片剂、胶囊、溶液、悬浮液、粉末、 气雾剂等等。适合于这些制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括缓 冲液，以及填料和膨胀剂，例如淀粉、纤维素、糖类、甘露醇和硅衍 生物。也可以包括结合试剂，例如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟 丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物，藻酸盐、明胶和聚乙烯-吡咯烷 酮。可以包括增湿试剂，例如甘油，崩解剂例如碳酸钙和碳酸氢钠。 也可以包括用于延缓溶解的试剂，例如石蜡。还可以包括重吸收加速 剂，例如季铵化合物。可以包括表面活性剂，例如十六醇和单硬脂酸 甘油酯。可以添加吸附性载体，例如高岭土和斑脱土。还可以包括润 滑剂，例如滑石粉、钙和硬脂酸镁，和固体聚乙二醇。还可以添加防 腐剂。本发明的组合物还可以含有增稠剂，例如纤维素和/或纤维素衍 生物。它们也可以含有树胶，例如黄原胶、瓜耳胶或碳树胶或阿拉伯 树胶，或作为选择，聚乙二醇、有机皂土和蒙脱土，等等。
例如，含有本发明的治疗试剂的片剂或锭剂可以包括缓冲试剂， 例如碳酸钙、氧化镁和碳酸镁。锭剂和片剂也可以包括无活性成分， 例如纤维素、预胶化淀粉、二氧化硅、羟基丙基甲基纤维素、硬脂酸 镁、微晶纤维素、淀粉、滑石粉、二氧化钛、苯甲酸、柠檬酸、玉米 淀粉、矿物油、聚丙二醇、磷酸钠、硬脂酸锌，等等。含有至少一种 本发明的治疗试剂的硬或软胶胶囊可以含有无活性成分，例如明胶、 微晶纤维素、十二烷基硫酸钠、淀粉、滑石粉和二氧化钛等等，以及 液体载体例如聚乙二醇(PEG)和植物油。此外，含有本发明的一种 或多种治疗试剂的肠包被的锭剂或片剂被设计以在胃中抵抗离解，并 溶于十二指肠的更为中性和碱性的环境。
本发明的治疗试剂也可以配制为酏剂或溶液，用于方便的口服施 用，或配制为适合于肠胃外施用，例如通过肌肉内的、皮下的、腹膜 内的或静脉途径施用的溶液。本发明的治疗试剂的药物制剂也可以采 用含水或无水溶液或分散体的形式，或作为选择，采用乳剂或悬浮液 或油膏剂的形式。
因而，治疗试剂可以被配制用于肠胃外施用(例如，通过注射， 例如，弹丸注射或连续输注)并可以以安瓿瓶中、预填充的注射器、 小体积的输注容器或在多剂量容器中的单位剂量形式呈现。如上所 述，可以添加防腐剂来帮助维持剂型的搁置期。活性多肽、核酸或抗 体和其他成分可以形成在油或水载体中的悬浮液、溶液或乳剂，可以 含有配方试剂，例如悬浮、稳定和/或分散试剂。做为选择，活动多肽、 核酸或抗体和其他成分可以以粉未的形成，通过无菌分离无菌的固 体，或通过从溶液冻干，用于在使用前与合适的载体，例如无菌无热 原的水构造。
这些制剂可以含有本领域公知的药学上可接受的载体、赋形剂和 佐剂。例如，可能的是使用一种或多种生理学观点上可接受的有机溶 剂来制备溶液，除了水之外，所述有机溶剂选自溶剂，例如丙酮、乙 醇、异丙醇、乙二醇醚例如以名称“Dowanol”聚二醇和聚乙二醇销 售的产品，短链酸的C1-C4烷基酯，乙基或异丙基乳酸，脂肪酸甘油 三酯例如以名称“Miglyol”销售的产品，十四烷酸异丙酯，动物、矿 物和植物油以及聚硅氧烷。
如果希望，有可能添加选择抗氧化剂、表面活性剂、其他防腐剂、 成膜剂、角质层分离剂或抗阻塞(comedolytic)试剂、芳香剂、调味 剂以及着色剂。可以添加抗氧化剂，例如叔丁基对苯二酚、丁基羟基 苯甲醚、丁基化羟基甲苯以及α-生育酚和其衍生物。
此外，多肽、配体和核酸很好地适合于制剂为持续释放的剂型等。 所述制剂可以这样组成，从而它们可能在一定时期内，例如在肠道或 呼吸道的特定部分释放治疗试剂。可以从聚合物，例如聚交酯-羟乙酸 盐、脂质体、微乳剂、微粒、纳粒或蜡来制成包被、包膜和保护性基 质。这些包被、包膜和保护性基质对于包被内在设备，例如展幅、导 管、腹膜透析桶、泄液装置等等是有用的。
对于表面施用，治疗试剂可以按本领域已知的配制，用于直接向 目标区域应用。主要为局部施用而调节的形式采取例如乳膏剂、奶、 凝胶剂、分散体或微乳剂、增稠到更大或较低程度的洗液、浸透板、 软膏剂或棒、气雾制剂(例如，喷雾或泡沫)、肥皂、洗涤剂、洗液 或肥皂块的形式。用于这个目的的其他常规形式包括伤口敷料、包被 的绷带或其他聚合物覆盖物、软膏剂、乳膏剂、洗液、糊剂、胶状物、 喷雾和气雾剂。因而，本发明的治疗试剂可以经由用于皮肤施用的贴 片或绷带来递送。做为选择，多肽、配体和/或核酸可以配制成粘附性 聚合物，例如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙烯基醋酸酯共聚物的一部分。 对于长期应用，可能期望的是使用微孔的和/或可吸入的衬垫叠层，从 而皮肤的水化或浸渍可以被最小化。衬垫层可以是将提供期望的保护 和支持功能的任何适合的厚度。适合的厚度一般是从约10到约200 微米。
例如，软膏剂和乳膏剂可以与水性或油性基质配制，添加适合的 增稠剂和/或胶凝剂。洗液可以与水性或油性基质配制，一般也将含有 一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。治 疗试剂也可以经由离子电渗来递送，例如，如美国专利NO.4,140,122； 4,383,529；或4,051,842中公开的。在表面制剂中存在的本发明的治 疗试剂的重量百分数将取决于各种因素，一般是制剂总重量的0.001％ 到95％，一般是按重量的0.01-85％。
滴剂，例如滴眼剂或滴鼻剂，可以在含水或无水基质中用一种或 多种治疗试剂来配制，还含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。 方便地从密封的包装递送液体喷雾。滴剂可以经由有盖的简单眼滴 瓶、或经由适合于滴状递送液体内容物的塑料瓶、经由特定形状的闭 合物来递送。
治疗试剂可以进一步配制用于在口腔或咽喉中表面施用。例如， 活性成分可以配制为进一步包含调味的基质、通常为蔗糖和阿拉伯树 胶或黄芪胶的锭剂；在惰性基质例如明胶和甘油、或者蔗糖和阿拉伯 树胶中包含组合物的锭剂；以及在适合的液体载体中包含本发明的组 合物的嗽口水。
本发明的药物制剂可以包括，作为任选的成分，药学上可接受的 载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂、以及在本领域中可用的盐类型。这 些物质的实例包括生理盐水溶液，例如生理学缓冲的盐水溶液和水。 在本发明的药物制剂中有用的载体和/或稀释剂的特定非限制性实例包 括水和生理学可接受的缓冲盐水溶液，例如pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲 盐水溶液。
本发明的治疗试剂也可以向呼吸道施用。因而，本发明还提供了 用于本发明的方法中的气雾剂药物制剂和剂型。一般地，这些剂型包 含有效治疗或预防特定癌症、肿瘤、症候或相关疾病的临床症状的数 量的、至少一种本发明的试剂。按照本发明的方法治疗的癌症的一种 或多种症状的任何统计学上显著的减弱被认为是本发明的范围内的这 种癌症的治疗。
做为选择，对于通过吸入或吹入的施用，组合物可以采取干粉的 形式，例如治疗试剂与适合的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合 物。粉未组合物可以以单位剂型存在于，例如胶囊或盒，或例如明胶 或泡罩包装中，从中粉末可以借助吸入器、吹入器或计量的吸入器来 施用(参见，例如，在Newman，S.P.in Aerosols and the Lung，Clarke， S.W.and Davia，D.eds.，pp.197-224，Butterworths，London，England， 1984中公开的密封的计量吸入器(MDI)和干粉吸入器)。
当以气雾剂或吸入的形式施用时，本发明的治疗试剂还可以在水 溶液中施用。因而，其他气雾剂药物制剂可以包含，例如，生理学可 接受的缓冲盐水溶液，含有约0.1mg/ml和约100mg/ml之间的、特 异于要治疗的症候或疾病的一种或多种本发明的治疗试剂。不溶或悬 浮在液体中的细分散的固体多肽、配体或核酸颗粒形式的干燥气溶 胶，在本发明的实践中也是有用的。本发明的多肽、配体或核酸可以 配制为扑粉，并包含具有约1和5μm之间，作为选择2和3μm之 间的平均粒子大小的细散颗粒。细散颗粒可以通过使用本领域的已知 技术的粉碎和筛滤来制备。所述颗粒可以通过吸入预定量的细分散的 材料来施用，所述材料可以是粉末的形式。要理解的是，在每种剂型 的单个气雾剂剂量中含有的活性成分的单位含量，本身不必构成用于 治疗特定感染、症候或疾病的有效量，因为必需的剂量可以通过施用 多个剂量单位来达到。此外，单独地、或在一系列施用中使用低于剂 型中的剂量，可以达到有效量。
对于通过吸入向上呼吸道(鼻子)或下呼吸道施用，本发明的治 疗试剂方便地从喷雾器、或密封的包装、或递送气溶胶喷射的其他方 便的装置来释放。密封的包装可以包括适合的推进剂，例如二氯二氟 甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他适合的气体。对 于加压的气雾剂来说，剂量单位可以通过提供阀门来递送计量的数量 来确定。喷雾器包括但不限于在美国专利NO.4,624,251；3,703,173； 3,561,444和4,635,627中描述的那些。在此公开的气雾剂递送系统类 型可以从许多商业的来源获得，包括Fisons Corporation(Bedford， Mass.)、Schering Corp.(Kenilworth，NJ)和American Pharmoseal Co. (Valencia，CA)。对于鼻内施用，治疗试剂也可以经由滴鼻剂、液体 喷雾来施用，例如经由塑料瓶喷雾器或计量吸入器。典型的喷雾器是 Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
此外，活性成分也可以与其他治疗试剂组合使用，例如，止痛药、 抗炎症试剂、抗组胺剂、抗微生物剂、支气管扩张剂等等，无论用于 描述的条件还是某些其他条件。
本发明进一步涉及用于调节Nod1表达的包装的药物组合物，例 如试剂盒或其他容器。所述试剂盒或容器容纳了用于调节Nod1基因 表达的治疗有效量的药物组合物，和用于使用所述药物组合物来调节 Nod1基因表达的说明书。所述药物组合物包括至少一种本发明的Nod1 核酸，为治疗有效量从而Nod1基因表达被调节。所述组合物也可以 含有抗肿瘤剂或化学治疗剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节NOD1活性的包装 的药物组合物。所述试剂盒或容器容纳了用于调节NOD1活性的治疗 有效量的药物组合物，和用于使用所述药物组合物来调节NOD1活性 的说明书。所述药物组合物包括至少一种本发明的NOD1多肽或NOD1 配体，为治疗有效量从而NOD1活性被调节。
将参考以下详细的实例进一步说明本发明，所述实施例为了例示 本发明而给出，而不意图受限于此。
实施例1：NOD1诱导引起肿瘤退化
该实施例说明了，Nod1使细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感化， 并且在缺少任何其他已知的细胞凋亡触发的情况下，NOD1特异性配 体诱导MCF-7乳腺癌细胞中的细胞凋亡。采用体内动物模型来证明 NOD1在肿瘤退化中的作用，其涉及用SCID小鼠进行异种移植。这 些数据表明，Nod1在控制肿瘤细胞生长中起到关键作用。
材料和方法
细胞培养.人类乳腺癌细胞系MCF-7和SKBR3维持在补充有10％ 胎儿牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和10μg/ml链霉素 的、Dulbecco的修改的Eagle’s培养基中。
哺乳动物表达构建体和定点诱变.人类FLAG-Nod1、FLAG-Nod2 cDNAs获自Dr Gabriel Nuez，并在Y.Ogura等人，J.Biol.Chem.276， 4812(2001)中描述了。人类Myc-RIP2 wt和Myc-RIP2(K47A)是 来自Dr.C.Vincenz(University of Michigan Medical School)的惠赠。 通过定点诱变构建Nod1突变体(V41Q和K208R)。通过删除羧基末 端CARD结构域并克隆到pcDNA4/Myc/His质粒(Invitrogen，Carlsbad， CA)中来产生Myc-RIP2ΔCARD。核苷酸序列全部通过DNA测序 来确认。
逆转录病毒转染.这项研究中使用的各种基因克隆到pMSCV- Blasto、pBabe-Puro或pBabe-Neo逆转录病毒载体中。使用可获得的 步骤稳定转染MCF-7细胞。简要地，用编码选定的Nod1、Nod1和其 他蛋白质的逆转录病毒载体转染兼嗜性293细胞。转染后24小时， 在32℃将细胞孵育过夜来产生病毒颗粒。第二天用含有重组逆转录病 毒颗粒的含病毒293细胞上清液感染目标细胞。用10μg/ml稻瘟散-S (Calbiochem EMD Biosciences Inc.，San Diego，CA)、500μg/ml庆 大霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)或5μg/ml嘌呤霉素(Calbiochem) 来选择细胞。通过Western印迹分析确认所有构建体的表达。为了确 定17β-雌二醇(Calbiochem)的效果，在补充有5％活性炭脱去的FCS 的无酚红DMEM中培养细胞。将细胞播种到具有各种浓度的17β-雌 二醇(E2)的96孔平板中24h，并用3H-胸腺嘧啶(1μCi/孔，MP Biomedicals，Irvine，CA)脉冲。在玻璃纤维过滤器上收获细胞，通 过液体闪烁来测量放射性。
Western印迹分析和免疫沉淀.广泛地洗涤细胞，并使用含有50 mM Hepes、100mM NaCl、2mM EDTA、10％甘油、1％Nonidet P-40、 14μM抑胃肽A、100μM亮抑酶肽、3mM苯甲脒、1mM PMSF、 1mM焦磷酸钠、10mM原钒酸钠、100U/ml抑蛋白酶肽和100mM 氟化钠的裂解缓冲液裂解。在冰上孵育30分钟之后，细胞溶胞产物 进行离心(14000rpm，10分钟，4℃)，回收上清液。为了免疫沉淀， 细胞溶胞产物与5μg抗体在恒定搅动下在4℃混合3小时。容许免疫 复合物结合20μl蛋白A-Sepharose珠子过夜，用裂解缓冲液洗涤珠子 三次。在SDS-PAGE上分离免疫沉淀物，转移到PVDF膜上。
细胞生存力分析.碘化丙锭排出分析：如所指出的刺激细胞2天。 随后，收获细胞，在FACS缓冲液(含有1％FCS和0.1％NaN3的PBS) 中洗涤两次，重悬浮在含有碘化丙锭(PI)的FACS缓冲液(4μg/ml) 中。使用FACSCalibur流式细胞计(Becton Dickinson，Mountain View， CA)分析细胞死亡的程度。DAPI染色：MCF-7细胞置于室载玻片中， 刺激2天。用PBS洗涤细胞，细胞凋亡的核用1μg/ml DAPI(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)染色。在4％多聚甲醛中固定细胞，通 过荧光显微术检查。
TUNEL染色：用γTriDAP处理细胞，根据厂家的说明书(ROCHE， Indianapolis，IN)通过TUNEL(TdT介导的UTP断口-末端标记)分 析来监视细胞凋亡的核。
IL-8 ELISA.转染的HeLa细胞的培养上清液中IL-8的浓度使用96 孔免疫平板(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)通过ELISA来 测量。使用用于捕获的mAb MAB208和生物素化的多克隆兔抗人IL- 8Ab(R & D Systems，Minneapolis，MN)，随后是用于检测的链霉抗 生物素蛋白HRP，来进行ELISA。
裸鼠中的人类异种移植.将MCF-7 Blasto、MCF-7 C20和MCF-7 C20/Nod1细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤一次，重悬浮到1.5×107/ml 的浓度。将200微升的每种悬浮液皮下地接种到无胸腺SCID/SCID或 SCID/Nod(非肥胖性糖尿病性)雌性小鼠的肋部。每周评定肿瘤大小。 计算肿瘤体积。
结果
Nod1在TNFα和Nod1配体诱导的细胞凋亡中具有作用。乳腺癌 上皮细胞系MCF-7已经广泛地用于研究由生物学信号例如TNFα或 由细胞毒性药物诱导的细胞凋亡。MCF-7细胞系也被用作模型来研究 雌激素阳性乳腺癌(Simstein等人，Exp.Biol.Med.228：995-1003 (2003))。
MCF-7细胞起初在采用逆转录病毒介导的诱变的遗传筛选中使 用，来鉴定TNFα诱导的细胞死亡所需的基因。在MCF-7细胞暴露 于逆转录病毒构建体之后，选择TNFα抗性的克隆，然后在TNFα抗 性克隆中鉴定突变基因。抗性克隆之一含有破坏的Nod1基因；这个 TNFα抗性克隆的细胞系被称为MCF7-C20。来自逆转录病毒构建体 的pDisrup插入被定位到Nod1基因的3′部分，在富亮氨酸区域9和10 的区域内(LRR9-10；参见附图1A)。这个插入位于Nod1编码区域 中的blasticidine开放阅读框中。blasticidine-Nod1融合mRNA的示意 图在附图1A中示意地显示。进行使用抗人Nod1单克隆抗体的Western 印迹分析来测试NOD1蛋白是否在MCF7-C20细胞中表达。在亲本 MCF-7细胞溶胞产物(标记为“wt”)中检测到内源的NOD1蛋白， 但是MCF-7 C20细胞溶胞产物的Western印迹未能揭示Nod1的可检 测表达，表明在MCF-7 C20中功能性的Nod1等位基因被破坏(附图 1B)。
MCF-7 C20细胞系根据布达佩斯条约的条款在2006年2月23日 保藏在美国典型培养物保藏所(10801 University Blvd.，Manassas，Va.， 20110-2209 USA(ATCC))，ATCC登记号No.ATCC Number。
Nod1功能的损失在细胞凋亡中具有显著的影响。特别地，与表 达Nod1的亲本MCF-7细胞相比，MCF-7C20细胞(没有Nod1表达) 对于TNFα诱导的细胞凋亡显著更有抗性(附图1C)。这些数据表明， Nod1是MCF-7细胞内TNFα途径中的敏化剂，Nod1促进了MCF-7 乳腺癌细胞中的细胞凋亡。
为了进一步研究Nod1在细胞凋亡中的作用，各种细胞类型与特 异性活化Nod1的Nod1配体D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP) 孵育。测试的细胞类型包括亲本MCF-7细胞系、Nod1缺陷的MCF-7 C20克隆、和工程化以含有其他人类Nod1等位基因从而Nod1被过量 表达的细胞系(MCF-7Nod1)。为了确定C20细胞对γTriDAP诱导的 细胞凋亡的抗性是否由缺少Nod1引起，在MCF-7C20细胞中稳定表 达人类Nod1来产生Nod1充足的C20细胞(C20/Nod1)。作为另一个 对照，用空的逆转录病毒载体转染亲本MCF-7细胞系来产生MCF-7 Blasto细胞。在存在或缺少放线菌酮(CHX)的情况下用γTriDAP处 理细胞，然后通过碘化丙锭染色和流式细胞计来测定细胞死亡。
在存在放线菌酮的情况下，野生型MCF-7细胞对γTriDAP的暴露 诱导了约25％的细胞死亡(附图2A，左上画面，阴影柱)。在用单独 的放线菌酮(空心柱)或单独的γTriDAP处理的野生型细胞中，没有 观察到细胞死亡。相比之下，MCF-7C20(没有Nod1表达)细胞对 γTriDAP加放线菌酮的影响有完全的抗性，在这些细胞中基本上没有 观察到细胞凋亡提高(附图2A，右上画面)。Nod1向MCF-7C20细 胞中的重新导入修复了这些细胞对γTriDAP诱导的细胞凋亡的完全敏 感性(附图2A，右下画面)。放线菌酮和γTriDAP的组合在稳定过量 表达Nod1的MCF-7细胞中诱导了扩大的细胞死亡，48h处理后这些 MCF-7Nod1细胞中细胞死亡几乎达到60％(附图2A，右下画面)。
Nod1配体γTriDAP是细胞凋亡的最佳的诱导所需的。当存在放线 菌酮的情况下与MCF-7细胞孵育时，称为αTriDAP的无活性对照三 肽不诱导细胞死亡(附图2A中的αTri)，αTriDAP中mesoDAP结合 与α位置中的Glu，而不是如γTriDAP中的γ位置。
作为对照，使用培养基(“Med”)代替γTriDAP或αTriDAP。添 加培养基对于细胞凋亡基本上没有效果。在MCF-7Blasto和MCF- 7Nod1细胞中内源Nod1的表达、Nod1的过量表达通过免疫沉淀和 Western印迹分析来确认(附图2B)。在MCF-7 C20细胞中没有看到 这种表达(附图2B)。这些数据显示了，在存在γTriDAP的情况下Nod1 使得MCF-7乳腺癌细胞对细胞凋亡敏感化。
然而，在野生型细胞中用γTriDAP单独处理细胞不诱导细胞凋亡。 反而，添加γTriDAP和放线菌酮是观察到细胞凋亡之前必需的。前细 胞凋亡试剂例如放线菌酮是观察到细胞凋亡之前经常需要的。然而， 使用MCF-7细胞注意到的对γTriDAP或TNFα的敏感性的改变，使用 其他的细胞凋亡刺激，包括doxirubicin和喜树碱没有发现，其中亲本 和C20细胞对于细胞死亡是相等地敏感的(数据未显示)。
用γTriDAP处理的MCF-7细胞的亮显微镜观察揭示了细胞凋亡和 非坏死的形态变化特征(附图2C，画面a-b)。然而，为了确认γTriDAP 诱导的细胞死亡实际上是细胞凋亡，进行DAPI和TUNEL染色。如 附图2C所示，在用γTriDAP处理之后MCF-7细胞核含有浓缩的染色 质，如DAPI染色所示(画面c-d)，通过TUNEL染色观察到核碎裂 (画面e-f)。在未处理的细胞中没有检测到核染色。
进一步确认了，使用两种广谱的caspase抑制剂，z-VAD-FMK和 Boc-D-FMK，获得了γTriDAP诱导的细胞凋亡。z-VAD-FMK和Boc- D-FMK都取消γTriDAP诱导的细胞死亡(附图2D)。最后，向MCF-7 细胞添加γTriDAP，而不是无效的对照三肽αTriDAP，引起了聚(ADP- 核糖)聚合酶(PARP)和capases 6、7、8和9的蛋白水解裂解(附 图3，9B)。MCF-7细胞已知缺乏caspase 3，在亲本MCF-7细胞或MCF-7 C20细胞中caspase 3的表达没有改变对γTriDAP的反应模式(数据未 显示)。
因而，多个细胞系的增加表明，在MCF-7细胞中存在由Nod1的 同源配体γTriDAP诱导的特异性细胞凋亡途径，这种途径需要Nod1 蛋白的存在。
为了进一步确定MCF-7C20细胞对γTriDAP诱导的细胞凋亡的抗 性来自Nod1的缺乏，人类Nod1在MCF-7C20细胞中稳定表达，来 产生表达Nod1的MCF-7C20细胞(MCF-7C20/Nod1)。Nod1向这些 Nod1缺陷细胞中的重导入修复了这些细胞对γTriDAP的完全敏感性 (附图2A)，并引起caspase和PARP裂解(附图3)。
为了确定在其他人类细胞系中是否存在Nod1依赖性细胞凋亡， 检查了一系列上皮细胞系，其中Nod1被稳定表达以增强对于Nod1 途径活化的敏感性。在存在或缺少CHX(C)的情况下用TNFα(T) 和γTriDAP(γ)处理细胞，通过PI染色作为细胞凋亡的度量来监视生 存力(表1)。
表1：在TNFα和γTriDAP处理之后的细胞生存力

在测试的细胞系中，SK-BR3和A431细胞都揭示了Nod1依赖性 细胞凋亡途径。然而，与MCF-7系相比，这些细胞仅当γTriDAP与TNF α和CHX同时添加时经历细胞凋亡。CaCo2和HT29响应于TNFα 和CHX经历细胞凋亡，但当同时通过γTriDAP活化Nod1途径时没有 观察到协同效应。其他系例如293细胞对γTriDAP诱导的细胞死亡有 抗性，即使在添加TNFα和CHX时。Nod1依赖性细胞凋亡的缺乏不 是γTriDAP不能活化NOD1的结果，因为表达Nod1的293细胞不响 应于Nod1配体释放IL-8。尽管存在No？蛋白，HT29和CaCo2细胞 在细胞凋亡和IL-8释放分析中对γTriDAP很少起反应，表明缺少一种 或多种正调节剂，或存在强的负调节途径。尽管涉及复杂的相互作用， 在一些上皮细胞系，包括SK-BR3和A431细胞系中，Nod1依赖性细 胞凋亡是可证明的。
NOD1在SKBR3人类乳腺癌细胞系中表达，如上所指出，也调 节那些癌细胞中的细胞凋亡。与过量表达Nod1的SKBR3相比，SKBR3 野生型细胞展现了作为TNFα或γTriDAP浓度的函数的较少的细胞凋 亡(附图9A)。此外，细胞凋亡的SKBR3细胞的百分比取决于培养 条件而改变(附图9B)。如附图9B所示，当细胞本领域γTriDAP(γTri) 加TNFα(TNF)和放线菌酮(CHX)时，SKBR3细胞的细胞凋亡是 最高的。无活性γTriDAP类似物αTriDAP(αTri)的替代引起降低的 细胞凋亡。已经暴露于这些试剂的SKBR3细胞的溶胞产物的western 分析显示了，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和capases 3、7和8 经历了蛋白水解裂解。附图9C图形地说明了在存在不同试剂的情况 下培养SKBR3细胞之后观察到的野生型、表达NOD1的、和表达 CLARP的SKBR3细胞的细胞凋亡百分比。如所指示的，当存在放线 菌酮(CHX或C)、TNFα(TNF或T)和γTriDAP(γTri)时(即，“gTC” 组合)，SKBR3细胞的细胞凋亡是最高的。然而，在各种培养条件下， CLARP表达不提高细胞凋亡。
人类Nod1的早先的结构-功能研究表明，P-环残基(K208)是短 暂地过量表达的Nod1蛋白在293细胞中活化NF-κB所需的。其他 研究表明，K208的突变阻断了由核苷酸结合/寡聚反应(NBD/NOD) 结构域介导的寡聚反应所需的构象变化。在Nod1的CARD结构域中 的突变V41Q也显示了破坏caspase 9对Nod1的结合，在293细胞的 短暂转染研究期间产生了Nod1依赖性细胞凋亡的抑制。
进行进一步的实验来确定那个NOD1结构域是细胞凋亡所需的。 如附图4A所示，K208R突变体取消了γTriDAP加放线菌酮的效果， 而V41Q突变体具有很少的或没有显著效果。这些突变的Nod1多肽 被有效地表达，如通过附图4B中描绘的Western印迹所显示的。因 而，这些多肽的不同效果不是由于表达水平中的差异。反而，这些数 据表明了，介导寡聚反应所需的构象变化的核苷酸-结合/寡聚反应 (NBD/NOD)结构域，是Nod1细胞凋亡所需的。
进一步的实验显示，虽然在MCF-7C20细胞中γTriDAP诱导的IL-8 产生被抑制(数据未显示)，当野生型Nod1在MCF7-C20Nod1细胞 中表达时(附图5C)，或当V41Q Nod1突变体在MCF-7C20(即， MCF-7C20V41Q)细胞中表达时(数据未显示)，这种IL-8产生被恢 复。然而，K208R Nod1突变多肽在MCF-7C20(即，MCF-7C20K208R) 细胞中的表达不修复γTriDAP诱导的细胞凋亡。
Nod2活化在MCF-7细胞中不诱导细胞凋亡
还进行了实验来确定Nod2通过其特异性活化剂胞壁酰二肽 (MDP)的活化是否将在亲本MCF-7细胞中或在过量表达Nod2的 MCF-7细胞(MCF-7 Nod2)中启动细胞凋亡。因而，将γTriDAP或 MDP添加到这些细胞系的每一种，测量细胞凋亡(附图5A)和IL-8 产生(附图5C)。用MDP加CHX处理的MCF-7Nod2细胞不经历提 高的细胞凋亡。相比之下，正如所料，γTriDAP添加产生了细胞死亡。 MDP处理确实在MCF-7 Nod2细胞中引起IL-8分泌(附图5C)。Nod1 和Nod2在MCF-7稳定转染子中的表达通过免疫印迹来确认(附图 2B)。MCF-7 C20细胞与Nod2的互补在添加MDP或γTriDAP之后不 引起细胞凋亡(数据未显示)。
涉及Nod1依赖性细胞凋亡的caspase
现在要理解的是，细胞凋亡在由特异性caspase启动的独特的细 胞内途径的活化之后发生。为了获得关于Nod1依赖性途径中的起始 caspase的信息，使用具有针对caspase的可变特异性的药理学和生物 学抑制剂。广谱的抑制剂z-VAD几乎完全地阻断γTriDAP诱导的细胞 凋亡(附图6A)。相比之下，caspase 1、2、6和7的特异性抑制剂仅 对细胞凋亡具有很少的影响(附图6A)。然而，caspase 9抑制剂LEHD 和caspase 8抑制剂IETD具有显著的抑制效果，抑制作用水平类似于 z-VAD所见的(附图6A)。这些数据表明，caspase 8和9在γTriDAP 诱导的细胞凋亡启动方面可能的作用。
已经描述了两种主要的细胞凋亡途径，内在(线粒体、压力诱导 的)和外在(受体介导的)途径。参与细胞凋亡的caspase似乎被编 组成分级的级联，caspase 9和caspase 8分别是内在和外在途径中的上 游起始物。为了区分这些途径，使用几种蛋白抑制剂，其通过转染导 入细胞。
首先，测试了CLARP(Flip)转染子。CLARP被认为是caspase 8 的特异性抑制剂，具有两个死亡效应物结构域(DED)并具有无活性 的caspase结构域。CLARP已知与caspase 8和FADD相互作用，从 而特异性地抑制由各种配体-受体对，包括Fas、TNFα和TRAIL诱导 的细胞凋亡。为了确定CLARP对γTriDAP诱导的细胞死亡的影响， 建立MCF-7细胞系，其单独地或在存在Nod1的情况下稳定表达 CLARP(MCF-7 CLARP)。当用γTriDAP/CHX孵育MCF-7CLARP细 胞时，细胞死亡被完全抑制，表明Nod1诱导的细胞凋亡途径与由 caspase 8启动的途径重叠(附图6C，上部画面)。
另一种抗细胞凋亡蛋白质Bcl-2已经显示了组织细胞色素C从线 粒体释放，从而阻断Apaf1/caspase 9复合物的活化。产生过量表达Bcl-2 的稳定的MCF-7细胞系，在这种表达Bcl-2的MCF-7细胞中评估Nod1 活化时的细胞死亡。如附图6C(底部画面)所示，Bcl-2的过量表达 仅部分地阻止γTriDAP诱导的细胞死亡。
已知MCF-7细胞缺乏Caspase III。发明人的进一步研究确定了， Caspase III在亲本MCF-7或MCF-7C20细胞中的表达不改变这些细胞 对Nod1配体γTriDAP的反应模式(数据未显示)。这些实验表明， Caspase 8在MCF-7细胞中启动γTriDAP诱导的细胞凋亡中起到重要 作用。另外的支持，虽然是间接的，来自这样的发现，未能影响caspase 9的No d1的V41Q突变，在支持γTriDAP诱导的细胞凋亡(附图4A) 和IL-8产生(数据未显示)方面与野生型Nod1等价。
CARD结构域而非激酶活性是Nod1诱导的细胞凋亡所需的。
RIP2是含有CARD结构域的蛋白激酶。已经证明了RIP2在Nod1 信号转导中是重要的，其引起NF-κB活化(Kobayashi等人.Nature 416：194-99(2002)；Chin等人.Nature 416：190-94(2002))。RIP2 经由CARD-CARD相互作用与Nod1的结合被认为对于NF-κB活化 是必需的，因为缺少CARD结构域的RIP2作为Nod1信号转导的显 性阴性抑制剂起作用。
在MCF-7细胞中表达几种RIP2突变体来评估RIP2激酶活性在 γTriDAP诱导的细胞凋亡中的作用。缺少CARD结构域的RIP2的表 达完全取消了Nod1诱导的细胞死亡(附图7A)。相比之下，相对于 在表达正常水平Nod1的亲本MCF-7Blasto细胞中所见的细胞凋亡水 平，野生型RIP2或无催化活性的RIP2(RIP2 KD)的表达提高了细 胞凋亡的程度(附图7A，13A)。相比仅表达Nod1的细胞(附图13C) 或亲本MCF-7Blasto细胞(数据未显示)，表达野生型RIP2和RIP2KD 构建体的细胞对于更低浓度的γTriDAP是敏感的，并且更快死亡。此 外，MDP在表达RIP2 KD的细胞中诱导高水平的细胞凋亡是有效的， 但在表达野生型RIP2或RIP2ΔCARD的细胞中不是(附图13A)。与 表达Nod1的细胞相比，在RIP2 KD细胞中MDP还诱导了更高水平 的细胞凋亡(附图13C)。然而，在表达野生型RIP2、RIP2 KD和RIP2 ΔCARD的细胞中，TNFα诱导了类似水平的细胞凋亡(附图13B)。 在表达野生型RIP2的细胞中γTriDAP诱导的IL-8分泌是最高的(附 图13D)。所研究的每种转染的细胞系表达近似相同数量的或突变RIP2 (附图7B)，表明表达水平不是细胞死亡方面的差异的原因。因而， Nod1依赖性细胞凋亡途径需要RIP2CARD结构域，但令人惊讶的是， 不需要RIP2激酶活性。
还检查了RIP2表达对γTriDAP诱导的JNK磷酸化的影响(附图 7C)。在存在放线菌酮的情况下，表达野生型RIP2或RIP2 KD的MCF-7 细胞对γTriDAP的暴露2h诱导JNK的磷酸化(附图7C)。然而，γTriDAP 和放线菌酮对RIP2ΔCARD细胞没有这种影响。
因而Nod1需要RIP2(支架蛋白激酶)用于调节雌激素敏感性肿 瘤生长。然而，虽然雌激素敏感性肿瘤生长的Nod1-RIP2调节需要RIP2 CARD结构域，它不需要RIP2激酶活性来为Nod1依赖性细胞凋亡和 肿瘤生长的抑制提供合适的下游信号。用p38获得了类似的结果(数 据未显示)。在RIP2ΔCARD细胞中MAPK活化的缺乏不是由于改变 的MAPK激酶信号转导，因为在所有转染子中IL-1强烈诱导JNK磷 酸化。因而，γTriDAP在MCF-7细胞中的活性需要RIP2而不是它的 激酶活性。
这些数据表明了，Nod1下游的蛋白激酶RIP2/RICK，可能是Nod1 前细胞凋亡途径的关键成分，因为RIP2的显性阴性形式的表达消除 了γTriDAP诱导的细胞死亡。
Nod1控制肿瘤形成。Nod1依赖性细胞凋亡途径在许多生物进程 中可能是重要的，包括肿瘤细胞生长调节和恶性细胞经历细胞死亡的 衰减，引起肿瘤发生。在SCID小鼠中的肿瘤生长异种移植模型被用 于检查Nod1在肿瘤生长和肿瘤排斥中起到的作用。MCF-7Blasto、 MCF-7C20和MCF-7C20Nod1细胞的群体(各自总计约3×106个细 胞)，单独地皮下注射到雌性小鼠的肋部来在SCID/SCID或SCID/Nod1 小鼠中诱导肿瘤生长。在注射后一周直到8周，每周记录动物的肿瘤 形成。
在注射后前几个星期，所有三种细胞群体相等地生长肿瘤，因而 到注射后15天，在所有小鼠中存在近似计算出的肿瘤体积10mm3。 因而，在导入小鼠后约15天，MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF- 7C20Nod1细胞都可以产生肿瘤。
然而，从MCF-7Blasto和MCF-7C20Nod1细胞形成的肿瘤在剩余 的8周实验中几乎消失。由MCF-7Blasto和MCF-7C20Nod1细胞产生 的初始肿瘤很快地大小降低，并且退化(附图10)。仅MCF-7C20细 胞的注射在注射位点产生了大的圆形肿瘤，其不退化并持续生长。这 些结果表明，Nod1的缺乏容许肿瘤生长，而Nod1的存在引起肿瘤退 化。
因为这些研究是在SCID小鼠中进行的，在异种移植的肿瘤生长 中免疫系统的作用可以忽略。此外，在接受MCF-7Blasto和MCF- 7C20Nod1细胞的动物中肿瘤的缺乏不是由于降低的增殖潜力，因为 在此研究的每种MCF-7系，包括表达MCF-7Blasto、MCF-7Nod1、 MCF-7C20和MCF-7C20Nod1的细胞系，在组织培养条件下和在软琼 脂菌落形成分析中具有相同的生长特性(数据未显示)。
三个独立实验的结果的概述在表2中显示，其中在实验1和2中 使用SCID/SCID小时，在实验3中使用SCID/Nod小鼠。
表2：MCF-7细胞系诱导的肿瘤发生率
  细胞系  实验1  实验2  实验3   总共   野生型MCF-7  2/8  0/8  0/6   2/22   MCF-7C20  7/8  4/8  5/6   16/22   MCF-7C20Nod1  1/8  1/8  0/6   2/22
这些结果表明，Nod1功能的丧失(当使用MCF-7 C20细胞时) 提高了肿瘤不退化的可能性。Nod1功能的替换(当使用MCF-7 C20 Nod1细胞时)，或Nod1表达的诱导，提高了肿瘤退化的可能性。
还进行了一个实验，其中从带有肿瘤的SCID/SCID小鼠收获肿 瘤，所述小鼠在3.5周前用MCF-7C20和MCF-7C20Nod1细胞注射。 然后切碎肿瘤组织，放入组织培养烧瓶中。在约一周后，除去任何剩 余的实体肿瘤组织，添加10μg/ml杀稻瘟菌素。然后在存在杀稻瘟 菌素的情况下在标准条件下维持播种的细胞6个世代。然后使用这些 细胞注射天然SCID小鼠，在60天的时间内测量肿瘤体积改变的时间 过程。
含有肿瘤衍生的MCF-7C20或MCF-7C20Nod1细胞的小鼠都开始 生长肿瘤。到注射后15天，两种细胞类型产生了近似的计算出的肿 瘤体积50mm3。在这个实验的剩余40天期间，从MCF7-C20Nod1细 胞形成的肿瘤退化到最低限度可检测的大小(＜10mm3)，而由MCF- 7C20细胞产生的肿瘤生长到200-270mm3的最大体积(附图11A-C)。
这些结果进一步证实了，肿瘤细胞中的Nod1表达可以引起肿瘤 细胞细胞凋亡和肿瘤退化。
由于MCF-7响应于TNFα经历细胞凋亡，使用中和鼠TNFα的 仓鼠单克隆抗体(Bancroft等人.J.Immunol.143：127-30(1989))来 进一步检查TNFα在Nod1诱导的细胞凋亡中的作用。这种抗体的存 在不抑制细胞凋亡，因为当接种MCF-7 Blasto或MCF-7 Nod1细胞时 没有形成肿瘤。此外，如在早先的实验中观察到的，当将MCF-7 C20 细胞注射到小鼠中时，肿瘤生长。
再一次，在至少表达Nod1的肿瘤细胞之后肿瘤的缺乏不是由于 与MCF-7 C20细胞相比降低的MCF-7 Blasto和MCF-7 C20/Nod1细 胞增殖速度，因为研究的每种MCF-7系在培养和软琼脂菌落形成分 析中具有相同的生长特征。此外，通过其他因子的简单细胞凋亡阻断 可能不是产生肿瘤生长的机制，因为CLARP(c-FLIP)是caspase 8 的特异性抑制剂，MCF-7 c-FLIP/CLARP细胞在裸鼠中不能形成肿瘤 (数据未显示)。
雌激素的作用
在初步实验中，当将C20克隆移植到雄性小鼠中时观察到更健壮 的肿瘤生长，暗示了雌性相关的激素在肿瘤退化中的作用。通过各种 遗传学靶点的聚合酶链式反应扩增的进一步研究，产生了观察结果， 在C20细胞系中缺乏孕激素受体，而它存在于野生型细胞中，和更重 要地存在于C20Nod1细胞中。此外，PCR分析也揭示了雌激素受体 α存在于三种MCF7细胞类型的每一种中。
在大多数研究中，在裸鼠中MCF-7细胞的肿瘤形成需要雌激素 对肿瘤发生的补充，即使在以高浓度接种细胞时。为了进一步检查雌 激素在肿瘤发生中的作用，将所有三种细胞系连同雌激素弹丸注射到 小鼠中(附图11B)。正如所料，当存在雌激素时，在注射MCF-7 Blasto 细胞的小鼠中肿瘤生长。用MCF-7 C20细胞注射的小鼠产生肿瘤，当 存在雌激素弹丸时其生长得更大。有趣地，接受MCF-7 C20/Nod1的 小鼠在存在雌激素弹丸的情况下不生长肿瘤。这些数据表明，Nod1 抑制雌激素依赖性肿瘤生长。
为了进一步证明Nod1途径在肿瘤生长中的作用，研究了RIP2的 显性阴性等位基因(RIP2ΔCARD)的表达，来确定这种等位基因是 否也可以干扰MCF-7细胞生长肿瘤的能力。附图11C显示了，这些 RIP2ΔCARD细胞生长肿瘤，然而肿瘤小于在MCF-7 C20细胞中观察 到的。结合起来，这些数据表明了，Nod1在肿瘤生长中具有关键作 用，Nod1的存在起到了雌激素依赖性肿瘤生长的阻碍物的作用。
为了获得对这种假说的另外的支持，当细胞在缺乏雌激素的培养 基中生长的条件下观察了MCF-7细胞系对雌激素诱导的增殖的敏感 性。在这些条件下，响应于添加的雌激素，MCF-C20细胞以及MCF- 7 RIP2ΔCARD细胞经历了强的增殖，而亲本和MCF-7 C20/Nod1细 胞系都没有被刺激增值(附图11D)。然而，对MCF-7 C20细胞观察 到的雌激素诱导的增殖通过在培养基中添加它莫西芬被阻断(数据未 显示)。
为了确定雌激素的存在是否调节Nod1诱导的细胞凋亡途径，在 含有活性炭处理的血清的培养基中培养细胞。在C20细胞的细胞凋亡 中，雌激素具有很少的或没有影响，所述C20细胞基本上不表达Nod1， 其基本上不展现细胞凋亡(附图12A，中间画面)。当在缺乏类固醇 的情况下培养时，C20/Nod1和Blasto细胞对于γTriDAP诱导的细胞凋 亡更有抗性(没有类固醇C20/Nod1细胞展现了10％细胞凋亡，相对 有类固醇的80％，附图12A，下部画面)。因而，针对细胞凋亡的抗 性通过添加雌激素被逆转，从而细胞凋亡以雌激素浓度的剂量依赖性 方式提高(附图12A)。相反，添加它莫西芬部分地阻断了γTriDAP-Nod1 诱导的细胞死亡(附图12B)。最后，Nod1的过量表达显著地降低了 内源雌激素受体α(ERα)的表达而不影响用作加载对照的ERK2的 表达(附图12C)。类似地，在从预培养的肿瘤分离的细胞中观察到ER α表达的降低(附图12C，右侧画面)。这些数据表明，Nod1途径影 响ERα表达水平，并因而影响MCF-7乳腺癌细胞对于发展肿瘤的敏 感性。
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本申请要求2005年2月25日提交的美国临时系列号NO. 60/656,175、2005年12月22日提交的美国临时系列号No.60/752,794 的提交日的利益，其内容通过引用合并在此。
政府资金
在此描述的发明在国家卫生研究所授予的拨款编号AI15136之下 由美国政府的支持而做出。在本发明中美国政府拥有某些权利。
序列表
<110>The Scripps Research Institute
     Ulevitch，Richard J.
     da Silva，Jean
     Han，Jiahuai
<120>作为抗肿瘤剂NOD1
<130>1361.057WO1
<150>US 60/656,175
<151>2005-02-25
<150>US 60/752,794
<151>2005-12-22
<160>5
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>953
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Met Glu Glu Gln Gly His Ser Glu Met Glu Ile Ile Pro Ser Glu Ser
1               5                   10                  15
His Pro His Ile Gln Leu Leu Lys Ser Asn Arg Glu Leu Leu Val Thr
            20                  25                  30
His Ile Arg Asn Thr Gln Cys Leu Val Asp Asn Leu Leu Lys Asn Asp
        35                  40                  45
Tyr Phe Ser Ala Glu Asp Ala Glu Ile Val Cys Ala Cys Pro Thr Gln
    50                  55                  60
Pro Asp Lys Val Arg Lys Ile Leu Asp Leu Val Gln Ser Lys Gly Glu
65                  70                  75                  80
Glu Val Ser Glu Phe Phe Leu Tyr Leu Leu Gln Gln Leu Ala Asp Ala
                85                  90                  95
Tyr Val Asp Leu Arg Pro Trp Leu Leu Glu Ile Gly Phe Ser Pro Ser
            100                 105                 110
Leu Leu Thr Gln Ser Lys Val Val Val Asn Thr Asp Pro Val Ser Arg
         115                120                 125
Tyr Thr Gln Gln Leu Arg His His Leu Gly Arg Asp Ser Lys Phe Val
    130                 135                 140
Leu Cys Tyr Ala Gln Lys Glu Glu Leu Leu Leu Glu Glu Ile Tyr Met
145                 150                 155                 160
Asp Thr Ile Met Glu Leu Val Gly Phe Ser Asn Glu Ser Leu Gly Ser
                165                 170                 175
Leu Asn Ser Leu Ala Cys Leu Leu Asp His Thr Thr Gly Ile Leu Asn
            180                 185                 190
Glu Gln Gly Glu Thr Ile Phe Ile Leu Gly Asp Ala Gly Val Gly Lys
        195                 200                 205
Ser Met Leu Leu Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Ala Thr Gly Arg Leu
    210                 215                 220
Asp Ala Gly Val Lys Phe Phe Phe His Phe Arg Cys Arg Met Phe Ser
225                 230                 235                 240
Cys Phe Lys Glu Ser Asp Arg Leu Cys Leu Gln Asp Leu Leu Phe Lys
                245                 250                 255
His Tyr Cys Tyr Pro Glu Arg Asp Pro Glu Glu Val Phe Ala Phe Leu
            260                 265                 270
Leu Arg Phe Pro His Val Ala Leu Phe Thr Phe Asp Gly Leu Asp Glu
        275                 280                 285
Leu His Ser Asp Leu Asp Leu Ser Arg Val Pro Asp Ser Ser Cys Pro
    290                 295                 300
Trp Glu Pro Ala His Pro Leu Val Leu Leu Ala Asn Leu Leu Ser Gly
305                 310                 315                 320
Lys Leu Leu Lys Gly Ala Ser Lys Leu Leu Thr Ala Arg Thr Gly Ile
                325                 330                 335
Glu Val Pro Arg Gln Phe Leu Arg Lys Lys Val Leu Leu Arg Gly Phe
            340                 345                 350
Ser Pro Ser His Leu Arg Ala Tyr Ala Arg Arg Met Phe Pro Glu Arg
        355                 360                 365
Ala Leu Gln Asp Arg Leu Leu Ser Gln Leu Glu Ala Asn Pro Asn Leu
    370                 375                 380
Cys Ser Leu Cys Ser Val Pro Leu Phe Cys Trp Ile Ile Phe Arg Cys
385                 390                 395                 400
Phe Gln His Phe Arg Ala Ala Phe Glu Gly Ser Pro Gln Leu Pro Asp
                405                 410                 415
Cys Thr Met Thr Leu Thr Asp Val Phe Leu Leu Val Thr Glu Val His
            420                 425                 430
Leu Asn Arg Met Gln Pro Ser Ser Leu Val Gln Arg Asn Thr Arg Ser
        435                 440                 445
Pro Val Glu Thr Leu His Ala Gly Arg Asp Thr Leu Cys Ser Leu Gly
    450                 455                 460
Gln Val Ala His Arg Gly Met Glu Lys Ser Leu Phe Val Phe Thr Gln
465                 470                 475                 480
Glu Glu Val Gln Ala Ser Gly Leu Gln Glu Arg Asp Met Gln Leu Gly
                485                 490                 495
Phe Leu Arg Ala Leu Pro Glu Leu Gly Pro Gly Gly Asp Gln Gln Ser
            500                 505                 510
Tyr Glu Phe Phe His Leu Thr Leu Gln Ala Phe Phe Thr Ala Phe Phe
        515                 520                 525
Leu Val Leu Asp Asp Arg Val Gly Thr Gln Glu Leu Leu Arg Phe Phe
    530                 535                 540
Gln Glu Trp Met Pro Pro Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ser Cys Tyr Pro
545                 550                 555                 560
Pro Phe Leu Pro Phe Gln Cys Leu Gln Gly Ser Gly Pro Ala Arg Glu
                565                 570                 575
Asp Leu Phe Lys Asn Lys Asp His Phe Gln Phe Thr Asn Leu Phe Leu
            580                 585                 590
Cys Gly Leu Leu Ser Lys Ala Lys Gln Lys Leu Leu Arg His Leu Val
        595                 600                 605
Pro Ala Ala Ala Leu Arg Arg Lys Arg Lys Ala Leu Trp Ala His Leu
    610                 615                 620
Phe Ser Ser Leu Arg Gly Tyr Leu Lys Ser Leu Pro Arg Val Gln Val
625                 630                 635                 640
Glu Ser Phe Asn Gln Val Gln Ala Met Pro Thr Phe Ile Trp Met Leu
                645                 650                 655
Arg Cys Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Gln Lys Val Gly Gln Leu Ala Ala
            660                 665                 670
Arg Gly Ile Cys Ala Asn Tyr Leu Lys Leu Thr Tyr Cys Asn Ala Cys
        675                 680                 685
Ser Ala Asp Cys Ser Ala Leu Ser Phe Val Leu His His Phe Pro Lys
    690                 695                 700
Arg Leu Ala Leu Asp Leu Asp Asn Asn Asn Leu Asn Asp Tyr Gly Val
705                 710                 715                 720
Arg Glu Leu Gln Pro Cys Phe Ser Arg Leu Thr Val Leu Arg Leu Ser
                725                 730                 735
Val Asn Gln Ile Thr Asp Gly Gly Val Lys Val Leu Ser Glu Glu Leu
            740                 745                 750
Thr Lys Tyr Lys Ile Val Thr Tyr Leu Gly Leu Tyr Asn Asn Gln Ile
        755                 760                 765
Thr Asp Val Gly Ala Arg Tyr Val Thr Lys Ile Leu Asp Glu Cys Lys
    770                 775                 780
Gly Leu Thr His Leu Lys Leu Gly Lys Asn Lys Ile Thr Ser Glu Gly
785                 790                 795                 800
Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Ala Val Lys Asn Ser Lys Ser Ile Ser Glu
                805                 810                 815
Val Gly Met Trp Gly Asn Gln Val Gly Asp Glu Gly Ala Lys Ala Phe
            820                 825                 830
Ala Glu Ala Leu Arg Asn His Pro Ser Leu Thr Thr Leu Ser Leu Ala
        835                 840                 845
Ser Asn Gly Ile Ser Thr Glu Gly Gly Lys Ser Leu Ala Arg Ala Leu
    850                 855                 860
Gln Gln Asn Thr Ser Leu Glu Ile Leu Trp Leu Thr Gln Asn Glu Leu
865                 870                 875                 880
Asn Asp Glu Val Ala Glu Ser Leu Ala Glu Met Leu Lys Val Asn Gln
                885                 890                 895
Thr Leu Lys His Leu Trp Leu Ile Gln Asn Gln Ile Thr Ala Lys Gly
            900                 905                 910
Thr Ala Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ser Asn Thr Gly Ile Thr Glu
        915                 920                 925
Ile Cys Leu Asn Gly Asn Leu Ile Lys Pro Glu Glu Ala Lys Val Tyr
    930                 935                 940
Glu Asp Glu Lys Arg Ile Ile Cys Phe
945                 950
<210>2
<211>4422
<212>DNA
<213>人类
<400>2
cccggccccg gcgtccccgg accatggcgc tctccgggct cttctctagc tctcagcggc 60
tgcgaagtct gtaaacctgg tggccaagtg attgtaagtc aggagacttt ccttcggttt 120
ctgcctttga tggcaagagg tggagattgt ggcggcgatt acagaaaacg tctgggaaga 180
caagttgctg tttttatggg aatcgcaggc ttggaagaga cagaagcaat tccagaaata 240
aattggaaat tgaagattta aacaatgttg ttttaaaaca ttctaacttc aaagaatgat 300
gccagaaact taaaaagggg ctgcgcagag tagcaggggc cctggagggc gcggcctgaa 360
tcctgattgc ccttctgctg agaggacaca cgcagctgaa gatgaatttg ggaaaagtag 420
ccgcttgcta ctttaactat ggaagagcag ggccacagtg agatggaaat aatcccatca 480
gagtctcacc cccacattca attactgaaa agcaatcggg aacttctggt cactcacatc 540
cgcaatactc agtgtctggt ggacaacttg ctgaagaatg actacttctc ggccgaagat 600
gcggagattg tgtgtgcctg ccccacccag cctgacaagg tccgcaaaat tctggacctg 660
gtacagagca agggcgagga ggtgtccgag ttcttcctct acttgctcca gcaactcgca 720
gatgcctacg tggacctcag gccttggctg ctggagatcg gcttctcccc ttccctgctc 780
actcagagca aagtcgtggt caacactgac ccagtgagca ggtataccca gcagctgcga 840
caccatctgg gccgtgactc caagttcgtg ctgtgctatg cccagaagga ggagctgctg 900
ctggaggaga tctacatgga caccatcatg gagctggttg gcttcagcaa tgagagcctg 960
ggcagcctga acagcctggc ctgcctcctg gaccacacca ccggcatcct caatgagcag 1020
ggtgagacca tcttcatcct gggtgatgct ggggtgggca agtccatgct gctacagcgg 1080
ctgcagagcc tctgggccac gggccggcta gacgcagggg tcaaattctt cttccacttt 1140
cgctgccgca tgttcagctg cttcaaggaa agtgacaggc tgtgtctgca ggacctgctc 1200
ttcaagcact actgctaccc agagcgggac cccgaggagg tgtttgcctt cctgctgcgc 1260
ttcccccacg tggccctctt caccttcgat ggcctggacg agctgcactc ggacttggac 1320
ctgagccgtg tgcctgacag ctcctgcccc tgggagcctg cccaccccct ggtcttgctg 1380
gccaacctgc tcagtgggaa gctgctcaag ggggctagca agctgctcac agcccgcaca 1440
ggcatcgagg tcccgcgcca gttcctgcgg aagaaggtgc ttctccgggg cttctccccc 1500
agccacctgc gcgcctatgc caggaggatg ttccccgagc gggccctgca ggaccgcctg 1560
ctgagccagc tggaggccaa ccccaacctc tgcagcctgt gctctgtgcc cctcttctgc 1620
tggatcatct tccggtgctt ccagcacttc cgtgctgcct ttgaaggctc accacagctg 1680
cccgactgca cgatgaccct gacagatgtc ttcctcctgg tcactgaggt ccatctgaac 1740
aggatgcagc ccagcagcct ggtgcagcgg aacacacaca gcccagtgga gaccctccac 1800
gccggccggg acactctgtg ctcgctgggg caggtggccc accggggcat ggagaagagc 1860
ctctttgtct tcacccagga ggaggtgcag gcctccgggc tgcaggagag agacatgcag 1920
ctgggcttcc tgcgggcttt gccggagctg ggccccgggg gtgaccagca gtcctatgag 1980
tttttccacc tcaccctcca ggccttcttt acagccttct tcctcgtgct ggacgacagg 2040
gtgggcactc aggagctgct caggttcttc caggagtgga tgccccctgc gggggcagcg 2100
accacgtcct gctatcctcc cttcctcccg ttccagtgcc tgcagggcag tggtccggcg 2160
cgggaagacc tcttcaagaa caaggatcac ttccagttca ccaacctctt cctgtgcggg 2220
ctgttgtcca aagccaaaca gaaactcctg cggcatctgg tgcccgcggc agccctgagg 2280
agaaagcgca aggccctgtg ggcacacctg ttttccagcc tgcggggcta cctgaagagc 2340
ctgccccgcg ttcaggtcga aagcttcaac caggtgcagg ccatgcccac gttcatctgg 2400
atgctgcgct gcatctacga gacacagagc cagaaggtgg ggcagctggc ggccaggggc 2460
atctgcgcca actacctcaa gctgacctac tgcaacgcct gctcggccga ctgcagcgcc 2520
ctctccttcg tcctgcatca cttccccaag cggctggccc tagacctaga caacaacaat 2580
ctcaacgact acggcgtgcg ggagctgcag ccctgcttca gccgcctcac tgttctcaga 2640
ctcagcgtaa accagatcac tgacggtggg gtaaaggtgc taagcgaaga gctgaccaaa 2700
tacaaaattg tgacctattt gggtttatac aacaaccaga tcaccgatgt cggagccagg 2760
tacgtcacca aaatcctgga tgaatgcaaa ggcctcacgc atcttaaact gggaaaaaac 2820
aaaataacaa gtgaaggagg gaagtatctc gccctggctg tgaagaacag caaatcaatc 2880
tctgaggttg ggatgtgggg caatcaagtt ggggatgaag gagcaaaagc cttcgcagag 2940
gctctgcgga accaccccag cttgaccacc ctgagtcttg cgtccaacgg catctccaca 3000
gaaggaggaa agagccttgc gagggccctg cagcagaaca cgtctctaga aatactgtgg 3060
ctgacccaaa atgaactcaa cgatgaagtg gcagagagtt tggcagaaat gttgaaagtc 3120
aaccagacgt taaagcattt atggcttatc cagaatcaga tcacagctaa ggggactgcc 3180
cagctggcag atgcgttaca gagcaacact ggcataacag agatttgcct aaatggaaac 3240
ctgataaaac cagaggaggc caaagtctat gaagatgaga agcggattat ctgtttctga 3300
gaggatgctt tcctgttcat ggggtttttg ccctggagcc tcagcagcaa atgccactct 3360
gggcagtctt ttgtgtcagt gtcttaaagg ggcctgcgca ggcgggacta tcaggagtcc 3420
actgcctcca tgatgcaagc cagcttcctg tgcagaaggt ctggtcggca aactccctaa 3480
gtacccgcta caattctgca gaaaaagaat gtgtcttgcg agctgttgta gttacagtaa 3540
atacactgtg aagagacttt attgcctatt ataattattt ttatctgaag ctagaggaat 3600
aaagctgtga gcaaacagag gaggccagcc tcacctcatt ccaacacctg ccatagggac 3660
caacgggagc gagttggtca ccgctctttt cattgaagag ttgaggatgt ggcacaaagt 3720
tggtgccaag cttcttgaat aaaacgtgtt tgatggatta gtattatacc tgaaatattt 3780
tcttccttct cagcactttc ccatgtattg atactggtcc cacttcacag ctggagacac 3840
cggagtatgt gcagtgtggg atttgactcc tccaaggttt tgtggaaagt taatgtcaag 3900
gaaaggatgc accacgggct tttaatttta atcctggagt ctcactgtct gctggcaaag 3960
atagagaatg ccctcagctc ttagctggtc taagaatgac gatgccttca aaatgctgct 4020
tccactcagg gcttctcctc tgctaggcta ccctcctcta gaaggctgag taccatgggc 4080
tacagtgtct ggccttggga agaagtgatt ctgtccctcc aaagaaatag ggcatggctt 4140
gcccctgtgg ccctggcatc caaatggctg cttttgtctc ccttacctcg tgaagagggg 4200
aagtctcttc ctgcctccca agcagctgaa gggtgactaa acgggcgcca agactcaggg 4260
gatcggctgg gaactgggcc agcagagcat gttggacacc ccccaccatg gtgggcttgt 4320
ggtggctgct ccatgagggt gggggtgata ctactagatc acttgtcctc ttgccagctc 4380
atttgttaat aaaatactga aaacactaaa aaaaaaaaaa aa                    4422
<210>3
<211>953
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的NOD1突变体
<400>3
Met Glu Glu Gln Gly His Ser Glu Met Glu Ile Ile Pro Ser Glu Ser
1               5                   10                  15
His Pro His Ile Gln Leu Leu Lys Ser Asn Arg Glu Leu Leu Val Thr
            20                  25                  30
His Ile Arg Asn Thr Gln Cys Leu Gln Asp Asn Leu Leu Lys Asn Asp
        35                  40                  45
Tyr Phe Ser Ala Glu Asp Ala Glu Ile Val Cys Ala Cys Pro Thr Gln
    50                  55                  60
Pro Asp Lys Val Arg Lys Ile Leu Asp Leu Va1 Gln Ser Lys Gly Glu
65                  70                  75                  80
Glu Val Ser Glu Phe Phe Leu Tyr Leu Leu Gln Gln Leu Ala Asp Ala
                85                  90                  95
Tyr Val Asp Leu Arg Pro Trp Leu Leu Glu Ile Gly Phe Ser Pro Ser
            100                 105                 110
Leu Leu Thr Gln Ser Lys Val Val Val Asn Thr Asp Pro Val Ser Arg
        115                 120                 125
Tyr Thr Gln G1n Leu Arg His His Leu Gly Arg Asp Ser Lys Phe Val
    130                 135                 140
Leu Cys Tyr Ala Gln Lys Glu Glu Leu Leu Leu Glu Glu Ile Tyr Met
145                 150                 155                 160
Asp Thr Ile Met Glu Leu Val Gly Phe Ser Asn Glu Ser Leu Gly Ser
                165                 170                 175
Leu Asn Ser Leu Ala Cys Leu Leu Asp His Thr Thr Gly Ile Leu Asn
            180                 185                 190
Glu Gln Gly Glu Thr Ile Phe Ile Leu Gly Asp Ala Gly Val Gly Lys
        195                 200                 205
Ser Met Leu Leu Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Ala Thr Gly Arg Leu
    210                  215                  220
Asp Ala Gly Val Lys Phe Phe Phe His Phe Arg Cys Arg Met Phe Ser
225                 230                 235                 240
Cys Phe Lys Glu Ser Asp Arg Leu Cys Leu Gln Asp Leu Leu Phe Lys
                245                 250                 255
His Tyr Cys Tyr Pro Glu Arg Asp Pro Glu Glu Val Phe Ala Phe Leu
            260                 265                 270
Leu Arg Phe Pro His Val Ala Leu Phe Thr Phe Asp Gly Leu Asp Glu
        275                 280                 285
Leu His Ser Asp Leu Asp Leu Ser Arg Val Pro Asp Ser Ser Cys Pro
    290                 295                 300
Trp Glu Pro Ala His Pro Leu Val Leu Leu Ala Asn Leu Leu Ser Gly
305                 310                 315                 320
Lys Leu Leu Lys Gly Ala Ser Lys Leu Leu Thr Ala Arg Thr Gly Ile
                325                 330                 335
Glu Val Pro Arg Gln Phe Leu Arg Lys Lys Val Leu Leu Arg Gly Phe
            340                 345                 350
Ser Pro Ser His Leu Arg Ala Tyr Ala Arg Arg Met Phe Pro Glu Arg
        355                 360                 365
Ala Leu Gln Asp Arg Leu Leu Ser Gln Leu Glu Ala Asn Pro Asn Leu
    370                 375                 380
Cys Ser Leu Cys Ser Val Pro Leu Phe Cys Trp Ile Ile Phe Arg Cys
385                 390                 395                 400
Phe Gln His Phe Arg Ala Ala Phe Glu Gly Ser Pro Gln Leu Pro Asp
                405                 410                 415
Cys Thr Met Thr Leu Thr Asp Val Phe Leu Leu Val Thr Glu Val His
            420                 425                 430
Leu Asn Arg Met Gln Pro Ser Ser Leu Val Gln Arg Asn Thr Arg Ser
        435                 440                 445
Pro Val Glu Thr Leu His Ala Gly Arg Asp Thr Leu Cys Ser Leu Gly
    450                 455                 460
Gln Val Ala His Arg Gly Met Glu Lys Ser Leu Phe Val Phe Thr Gln
465                 470                 475                 480
Glu Glu Val Gln Ala Ser Gly Leu Gln Glu Arg Asp Met Gln Leu Gly
                485                 490                 495
Phe Leu Arg Ala Leu Pro Glu Leu Gly Pro Gly Gly Asp Gln Gln Ser
            500                 505                 510
Tyr Glu Phe Phe His Leu Thr Leu Gln Ala Phe Phe Thr Ala Phe Phe
        515                 520                 525
Leu Val Leu Asp Asp Arg Val Gly Thr Gln Glu Leu Leu Arg Phe Phe
    530                 535                 540
Gln Glu Trp Met Pro Pro Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ser Cys Tyr Pro
545                 550                 555                 560
Pro Phe Leu Pro Phe Gln Cys Leu Gln Gly Ser Gly Pro Ala Arg Glu
                565                 570                 575
Asp Leu Phe Lys Asn Lys Asp His Phe Gln Phe Thr Asn Leu Phe Leu
            580                 585                 590
Cys Gly Leu Leu Ser Lys Ala Lys Gln Lys Leu Leu Arg His Leu Val
        595                 600                 605
Pro Ala Ala Ala Leu Arg Arg Lys Arg Lys Ala Leu Trp Ala His Leu
    610                 615                 620
Phe Ser Ser Leu Arg Gly Tyr Leu Lys Ser Leu Pro Arg Val Gln Val
625                 630                 635                 640
Glu Ser Phe Asn Gln Val Gln Ala Met Pro Thr Phe Ile Trp Met Leu
                645                 650                 655
Arg Cys Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Gln Lys Val Gly Gln Leu Ala Ala
            660                 665                 670
Arg Gly Ile Cys Ala Asn Tyr Leu Lys Leu Thr Tyr Cys Asn Ala Cys
        675                 680                 685
Ser Ala Asp Cys Ser Ala Leu Ser Phe Val Leu His His Phe Pro Lys
    690                 695                 700
Arg Leu Ala Leu Asp Leu Asp Asn Asn Asn Leu Asn Asp Tyr Gly Val
705                 710                 715                 720
Arg Glu Leu Gln Pro Cys Phe Ser Arg Leu Thr Val Leu Arg Leu Ser
                725                 730                 735
Val Asn Gln Ile Thr Asp Gly Gly Val Lys Val Leu Ser Glu Glu Leu
            740                 745                 750
Thr Lys Tyr Lys Ile Val Thr Tyr Leu Gly Leu Tyr Asn Asn Gln Ile
        755                 760                 765
Thr Asp Val Gly Ala Arg Tyr Val Thr Lys Ile Leu Asp Glu Cys Lys
    770                 775                 780
Gly Leu Thr His Leu Lys Leu Gly Lys Asn Lys Ile Thr Ser Glu Gly
785                 790                 795                 800
Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Ala Val Lys Asn Ser Lys Ser Ile Ser Glu
                805                 810                 815
Val Gly Met Trp Gly Asn Gln Val Gly Asp Glu Gly Ala Lys Ala Phe
            820                 825                 830
Ala Glu Ala Leu Arg Asn His Pro Ser Leu Thr Thr Leu Ser Leu Ala
        835                 840                 845
Ser Asn Gly Ile Ser Thr Glu Gly Gly Lys Ser Leu Ala Arg Ala Leu
    850                 855                 860
Gln Gln Asn Thr Ser Leu Glu Ile Leu Trp Leu Thr Gln Asn Glu Leu
865                 870                 875                 880
Asn Asp Glu Val Ala Glu Ser Leu Ala Glu Met Leu Lys Val Asn Gln
                885                 890                 895
Thr Leu Lys His Leu Trp Leu Ile Gln Asn Gln Ile Thr Ala Lys Gly
            900                 905                 910
Thr Ala Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ser Asn Thr Gly Ile Thr Glu
        915                 920                 925
Ile Cys Leu Asn Gly Asn Leu Ile Lys Pro Glu Glu Ala Lys Val Tyr
    930                 935                 940
Glu Asp Glu Lys Arg Ile Ile Cys Phe
945                 950
<210>4
<211>233
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1               5                   10                  15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
            20                  25                  30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
        35                  40                  45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro
    50                  55                  60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65                  70                  75                  80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
                85                  90                  95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
            100                 105                 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
        115                 120                 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
    130                 135                 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
                165                 170                 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
            180                 185                 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225                 230
<210>5
<211>540
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Met Asn Gly Glu Ala Ile Cys Ser Ala Leu Pro Thr Ile Pro Tyr His
1               5                   10                  15
Lys Leu Ala Asp Leu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Ala Ser Gly Thr Val
            20                  25                  30
Ser Ser Ala Arg His Ala Asp Trp Arg Val Gln Val Ala Val Lys His
        35                  40                  45
Leu His Ile His Thr Pro Leu Leu Asp Ser Glu Arg Lys Asp Val Leu
    50                  55                  60
Arg Glu Ala Glu Ile Leu His Lys Ala Arg Phe Ser Tyr Ile Leu Pro
65                  70                  75                  80
Ile Leu Gly Ile Cys Asn Glu Pro Glu Phe Leu Gly Ile Val Thr Glu
                85                  90                  95
Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asn Glu Leu Leu His Arg Lys Thr Glu
            100                 105                 110
Tyr Pro Asp Val Ala Trp Pro Leu Arg Phe Arg Ile Leu His Glu Ile
        115                 120                 125
Ala Leu Gly Val Asn Tyr Leu His Asn Met Thr Pro Pro Leu Leu His
    130                 135                 140
His Asp Leu Lys Thr Gln Asn Ile Leu Leu Asp Asn Glu Phe His Val
145                 150                 155                 160
Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Trp Arg Met Met Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Ser Ser Lys Ser Ala Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Tyr
            180                 185                 190
Met Pro Pro Glu Asn Tyr Glu Pro Gly Gln Lys Ser Arg Ala Ser Ile
        195                 200                 205
Lys His Asp Ile Tyr Ser Tyr Ala Val Ile Thr Trp Glu Val Leu Ser
    210                 215                 220
Arg Lys Gln Pro Phe Glu Asp Val Thr Asn Pro Leu Gln Ile Met Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Val Ser Gln Gly His Arg Pro Val Ile Asn Glu Glu Ser Leu Pro
                245                 250                 255
Tyr Asp Ile Pro His Arg Ala Arg Met Ile Ser Leu Ile Glu Ser Gly
            260                 265                 270
Trp Ala Gln Asn Pro Asp Glu Arg Pro Ser Phe Leu Lys Cys Leu Ile
        275                 280                 285
Glu Leu Glu Pro Val Leu Arg Thr Phe Glu Glu Ile Thr Phe Leu Glu
    290                 295                 300
Ala Val Ile Gln Leu Lys Lys Thr Lys Leu Gln Ser Val Ser Ser Ala
305                 310                 315                 320
Ile His Leu Cys Asp Lys Lys Lys Met Glu Leu Ser Leu Asn Ile Pro
                325                 330                 335
Val Asn His Gly Pro Gln Glu Glu Ser Cys Gly Ser Ser Gln Leu His
            340                 345                 350
Glu Asn Ser Gly Ser Pro Glu Thr Ser Arg Ser Leu Pro Ala Pro Gln
        355                 360                 365
Asp Asn Asp Phe Leu Ser Arg Lys Ala Gln Asp Cys Tyr Phe Met Lys
    370                 375                 380
Leu His His Cys Pro Gly Asn His Ser Trp Asp Ser Thr Ile Ser Gly
385                 390                 395                 400
Ser Gln Arg Ala Ala Phe Cys Asp His Lys Thr Thr Pro Cys Ser Ser
                405                 410                 415
Ala Ile Ile Asn Pro Leu Ser Thr Ala Gly Asn Ser Glu Arg Leu Gln
            420                 425                 430
Pro Gly Ile Ala Gln Gln Trp Ile Gln Ser Lys Arg Glu Asp Ile Val
        435                 440                 445
Asn Gln Met Thr Glu Ala Cys Leu Asn Gln Ser Leu Asp Ala Leu Leu
    450                 455                 460
Ser Arg Asp Leu Ile Met Lys Glu Asp Tyr Glu Leu Val Ser Thr Lys
465                 470                 475                 480
Pro Thr Arg Thr Ser Lys Val Arg Gln Leu Leu Asp Thr Thr Asp Ile
                485                 490                 495
Gln Gly Glu Glu Phe Ala Lys Val Ile Val Gln Lys Leu Lys Asp Asn
            500                 505                 510
Lys Gln Met Gly Leu Gln Pro Tyr Pro Glu Ile Leu Val Val Ser Arg
        515                 520                 525
Ser Pro Ser Leu Asn Leu Leu Gln Asn Lys Ser Met
    530                 535                 540