紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用
阅读：1018发布：2020-09-25
专利汇可以提供紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种中药材新用途，即紫景天在制备 治疗 肿瘤 药物中的应用。本项目通过采用系统预试法与LC-MS联用技术，对紫景天进行化学成分分析，确定了其主要化学成分或化合物结构类型。并完成了紫景天抗肿瘤活性部位的确定。在前期预试实验的 基础 上，用 水 醇法提取，提取液减压回收 乙醇 至无醇味后,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇 溶剂 萃取，得到相应的 有机溶剂 萃取物和 水溶性 部分。在细胞水平上评价了各部位对肿瘤细胞的抑制作用，确定了紫景天抗肿瘤的活性部位。并进一步对紫景天水煎液进行了体内抗肿瘤实验，表明紫景天具有一定的抗肿瘤活性。对紫景天日后成品药物开发利用、临床提供了科学依据。，下面是紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用专利的具体信息内容。
紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用
[0001] 技术领域
[0002] 本发明涉及一种中药材新用途，即紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用。 背景技术
[0003] 在现有技术中，紫景天为景天科（Crassulaceae）植物紫八宝Hylotelephium purpureum(L.)Holub 的全草，又名紫八宝，景天科。多年生草本。块根多数，胡萝卜状。茎直立，单生或少数聚生，高16～70cm。叶互生，卵状长圆形至长圆形，长2～7cm，宽0.5～3cm，先端急尖，钝，上部叶无柄，基部圆，下部叶基部楔形，边缘有不整齐牙齿。花序伞房状，花密生，花梗长4mm；萼片5，卵状披针形，长2mm，先端尖，基部合生；花瓣5，紫红色，长圆状披针形，长5～6mm，急尖，自中部向外反折；雄蕊10，与花瓣稍同长；鳞片5，线状匙形，长
1mm，先端稍宽，有缺刻；心皮5，直立，椭圆状披针形，长6mm，两端渐狭，花柱短。蓇葖果。种子小，卵状椭圆形，长1mm，褐色花期7～8月，果期9月。生于海拔420～1550m的山坡草原上或林下阴湿山沟边。分布于新疆阿勒泰、辽宁、吉林、黑龙江。
1mm，先端稍宽，有缺刻；心皮5，直立，椭圆状披针形，长6mm，两端渐狭，花柱短。蓇葖果。种子小，卵状椭圆形，长1mm，褐色花期7～8月，果期9月。生于海拔420～1550m的山坡草原上或林下阴湿山沟边。分布于新疆阿勒泰、辽宁、吉林、黑龙江。
[0004] 紫景天在《中国长白山药用植物彩色图志》有记载（作者：严仲铠 李万林,出 版 社：人民卫生出版社,出版时间：1997年10月）。
[0005] 《特种经济动植物》2008年第8期刊登了王海娟、李海洋文章“紫景天的栽培利用”。
[0006] 中国发明专利说明书公布了<紫景天总黄酮及其提取方法和药物用途>发明专利申请,申请号: CN201010621895.2 申请日:2010.12.31 申请公布号: CN102068482A 申请公布日: 2011.05.25。紫景天总黄酮在制备治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡和牙周炎的药物中的应用。具有清热解毒，收敛止血，消肿生肌的功能。用于治疗或预防复发性口疮、口腔溃疡、牙周炎及相关口腔疾病。
[0007] 上述文献均没有报导紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用。
发明内容
[0008] 本发明的目的是针对上述不足而提供一种紫景天新的医药用途，即紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0009] 本发明的技术解决方案是：紫景天在制备治疗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤是指肺癌。紫景天制备方法步骤如下：取紫景天的干燥根及根茎切段，分别加8、8、6倍量的水煎煮三次，每次1h，合并煎液、浓缩制得。
[0010] 以紫景天为原料,采用常规提取方法提取有效部位即可。最后做成的药物剂型可以是制药行业常用剂型。可以加上常用的药物载体(如赋形剂或辅料),如可以制成片剂、胶囊剂（软胶囊剂）、颗粒剂、口服液、散剂、丸剂、液体制剂或其它常规制剂，不限于此。
[0011] 本发明的优点是：本项目通过采用系统预试法（试管反应与薄层层析）与LC-MS联用技术，对紫景天进行化学成分分析，确定了其主要化学成分（多糖类、黄酮类、强心苷、香豆素类、蒽醌类等化学成分）或化合物结构类型。并完成了紫景天抗肿瘤活性部位的确定。在前期预试实验的基础上，用水醇法提取，提取液减压回收乙醇至无醇味后,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取，得到相应的有机溶剂萃取物和水溶性部分。在细胞水平上评价了各部位对肿瘤细胞的抑制作用，确定了紫景天抗肿瘤的活性部位。并进一步对紫景天水煎液进行了体内抗肿瘤实验，表明紫景天具有一定的抗肿瘤活性。对紫景天日后成品药物开发利用、临床提供了科学依据。
[0013] 图1是Fr-1对Lewis 肺癌细胞细胞毒性线性关系。
[0014] 图2是Fr-3对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验线性关系图。
[0015] 图3是Fr-4对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验线性关系图。
[0016] 图4是Fr-5对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验线性关系图。
具体实施方式
[0017] 实验例1—紫景天抗肿瘤有效部位筛选
[0018] §1.1 样品制备
[0019] 制得紫景天5个部位，分别标号为Fr-1、Fr-2、Fr-3、Fr-4、Fr-5，制备过程如下：
[0020] Fr-1代表紫景天水煎液，取紫景天的干燥根及根茎0.5kg（切成1cm，备用），分别加8、8、6倍量的水煎煮三次，每次1h，合并煎液浓缩至1000ml制得。
[0021] Fr-2代表紫景天的醇提液。取紫景天的干燥根及根茎0.5kg（切成1cm，备用），加95%的乙醇分别回流提取1h、1h，合并回流液制得。
[0022] Fr-3 、Fr-4、 Fr-5分别代表紫景天提取液减压回收乙醇至无醇味后,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取，萃取四次，每次萃取试剂用量为原溶剂量的一半。
[0023] §1.2 细胞株
[0024] Lewis肺癌细胞，由中国医学科学院药物研究所肿瘤中心提供，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中用DMEM培养。
[0025] §1.3试药及器材
[0026] 10%胎牛血清：HyClone公司；
[0028] 低温高速离心机：Kendro仪器公司；
[0029] 磁力搅拌器：KIKA出品；
[0030] 冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；
[0031] 离心机1-B：SIGMA公司；
[0032] 回旋振荡器HY-5：国华公司；
[0033] CO2培养箱：SANYO；
[0034] 超净工作台：哈尔滨市东联公司；
[0035] MH-I型微量振荡器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；
[0036] 酶标仪：久宇鑫泰生物技术有限公司；
[0037] 微量移液器：Eppendorf公司。
[0038] §1.4实验方法(MTT法)
[0039] 1.4.1 MTT溶液的配制
[0040] 称取0.5 gMTT，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22 μm微孔滤膜除菌，4℃避光保存。
[0041] 1.4.2 MTT操作步骤
[0043] 2、加药：用适宜的溶剂溶解药物（水溶性的药物要滤过除菌，脂溶性的药物即用DMSO溶解的药物，DMSO终浓度要低于0.1%，否则会对细胞产生毒性作用）稀释成不同的浓度加入到板孔内，每个浓度设3个孔，另设加细胞和培养液不加药的3孔为对照组。
[0044] 3、培养细胞：将培养板放入CO2孵箱，37℃、饱和湿度、5％CO2条件下培养3天。
[0045] 4、呈色：培养3天后，每孔加MTT溶液15 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。
[0046] 5、比色：选择适宜的波长（参考文献选择570nm），在酶标仪上测定各孔A值，记录结果。
[0047] 6、细胞增殖抑制率=（A对照-A药物）/A对照×100%。
[0048] 7、IC50值的计算，采用下述表格中的数据，在Excel中分别以浓度和抑制率为横纵坐标做散点图，导出回归方程，设定y（抑制率）等于50时的x值即为IC50值，单位mg/mL。
[0049] §1.5实验结果
[0050] 表1 Fr-1对Lewis肺癌细胞毒性实验结果
[0051]浓度(mg/mL) A值 抑制率(％)
0.1667 0.1340 79.12
0.0833 0.1915 72.36
0.0417 0.2277 66.99
0.00417 0.4626 34.33
0.1667 0.1340 79.12
0.0833 0.1915 72.36
0.0417 0.2277 66.99
0.00417 0.4626 34.33
[0052] 见图1，是Fr-1对Lewis 肺癌细胞细胞毒性线性关系。
[0053] 表2 Fr-2对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验结果
[0054]浓度(mg/mL) A值 抑制率（%）
2.952 0.2788 62.07
1.476 0.8899
0.7381 0.7885
0.369 0.9349
0.1845 0.9160
2.952 0.2788 62.07
1.476 0.8899
0.7381 0.7885
0.369 0.9349
0.1845 0.9160
[0055] 表3 Fr-3对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验结果
[0056]浓度(mg/mL) A值 抑制率（%）
0.4762 0.1787 66.19
0.2381 0.2842 55.71
0.119 0.5536 20.11
0.00595 0.6588 6.48
0.000595 0.6975 3.97
0.4762 0.1787 66.19
0.2381 0.2842 55.71
0.119 0.5536 20.11
0.00595 0.6588 6.48
0.000595 0.6975 3.97
[0057] 见图2，是Fr-3对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验线性关系图。
[0058] 表4 Fr-4对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验结果
[0059]浓度(mg/mL) A值 抑制率（%）
4.571 0.1022 86.10
2.286 0.1572 78.61
1.143 0.3735 49.18
0.5714 0.6574 10.56
4.571 0.1022 86.10
2.286 0.1572 78.61
1.143 0.3735 49.18
0.5714 0.6574 10.56
[0060] 见图3，是Fr-4对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验线性关系图。
[0061] 表5 Fr-5对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验结果
[0062]浓度（mg/ml) A值 抑制率（%）
0.4464 0.1268 80.24
0.2232 0.1470 78.79
0.1116 0.1538 77.70
0.01116 0.2076 70.53
0.001116 0.6502 10.46
0.4464 0.1268 80.24
0.2232 0.1470 78.79
0.1116 0.1538 77.70
0.01116 0.2076 70.53
0.001116 0.6502 10.46
[0063] 见图4，是Fr-5对Lewis 肺癌细胞细胞毒性实验线性关系图。
[0064] 由上述图表，按1.4.2项下IC50计算方法计算各部位对Lewis 肺癌细胞的IC50分别为0.01818 mg/mL（Fr-1）、0.3093 mg/mL（Fr-3）、1.1771mg/mL（Fr-4）和0.01107 mg/mL（Fr-5）。
[0065] §1.6结论
[0066] 由以上图表数据可以看出，样品Fr-2只在2.952 mg/mL显示了抑制作用，其他浓度出现阴性结果，表明紫景天醇提液对Lewis 肺癌细胞没有细胞毒性；样品Fr-3、Fr-4的IC50分别是0.3093 mg/mL、1.1771mg/mL，低浓度对Lewis 肺癌细胞细胞没有杀伤作用。
[0067] 样品Fr-1的IC50是0.01818 mg/mL具有细胞毒性，即紫景天的水煎液具有一定的抗肿瘤作用。
[0068] 实验例2
[0069] 紫景天水煎液对C57BL/6荷瘤小鼠lewis肺癌的抑瘤作用研究
[0070] §1.1仪器与材料
[0071] §1.1.1药物与试剂
[0072] 取适量紫景天，粉碎，过40目筛，加8倍量水煎煮两次，每1h次，合并煎出液，真空低温干燥，研磨成粉，每100g生药可制成膏粉18.5g，备用；注射用顺铂（冻干型）(20mg/瓶，齐鲁制药有限公司，批号8080341DC)；其它试剂均为分析纯。
[0073] §1.1.2 实验动物
[0074] C57BL/6小鼠，60只，SPF级，雄性，6~8周，体重(20±2)g, 购于北京中国医学科学院动物实验中心，动物合格证号：SCXK（京）2010-0017; Lewis肺癌细胞，由中国医学科学院药物研究所肿瘤中心提供。
[0075] §1.1.3 主要仪器
[0076] 双人净化工作台（苏州净化设备有限公司SW-CJ2D），相差显微镜（美国AO），N6单头旋转血流变仪（北京普利生仪器中心LBY-N6），真空干燥箱（六门圆筒全自动型，南京瑞奥电热科技有限公司），转轮式切片机（郑州博邦科贸有限公司 KD202A）。
[0077] §1.2实验方法
[0078] §1.2.1 Lewis肺癌转移模型建立
[0079] 液氮冻存的小鼠Lewis肺癌细胞复苏后，接种于三只C57BL/6小鼠右腋窝下传代，取接种10d 的生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，用75%乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块（g）：生理盐水（mL）为 1∶3的比例加入4 ℃ 预冷的生理盐水轻轻
7
研磨，制成细胞悬液，过300目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×10/ mL，台盼兰（Tryan blue）拒染试验示活细胞数> 95% 。取近交系C57BL/6 小鼠，雄性，共50只，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋[5] 6
部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL （含肿瘤细胞数约为2×10/ mL） 。
7
研磨，制成细胞悬液，过300目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×10/ mL，台盼兰（Tryan blue）拒染试验示活细胞数> 95% 。取近交系C57BL/6 小鼠，雄性，共50只，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋[5] 6
部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL （含肿瘤细胞数约为2×10/ mL） 。
[0080] §1.2.2动物分组及给药
[0081] 接种后次日，将50只造模动物随机均分为 5组： 肿瘤模型组（阴性对照组）、阳性[6]药对照组（顺铂组） 、紫景天水煎液高、中、低3个剂量组（15，10，5g/kg）；ig（灌胃给药）给药，1次/d，连续20d；阳性药对照组给动物ip（腹腔注射）顺铂1mg/kg，1次/d，连续给药
3d；肿瘤模型组ig蒸馏水，1次/d，连续20d；所有动物ig的体积均为0.4ml/只。
3d；肿瘤模型组ig蒸馏水，1次/d，连续20d；所有动物ig的体积均为0.4ml/只。
[0082] §1.2.3测定荷瘤抑瘤率
[0083] 小鼠取血后，颈椎脱臼，固定于鼠板上，用75%乙醇消毒操作部位皮肤，解剖小鼠，剥离瘤体，于分析天平上进行称重，并计算肿瘤生长抑制率，肿瘤生长抑制率% =（模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%
[0084] §1.3 实验结果
[0085] §1.3.1动物一般状况
[0086] 接种后7d，各实验组小鼠右前肢腋下均可触及黄豆大小瘤块，10d 后各实验组小鼠瘤体生长速度明显加快，出现行动迟缓，食量减少，聚集、不活泼等现象，其中模型组小鼠最为明显，顺铂组小鼠给药结束后，曾出现过一次性大便稀薄、食量减少及竖毛现象；17d后各实验组小鼠明显消瘦，聚集，活动量减少，并出现少数死亡。实验前后小鼠体重比较，各实验组小鼠体重均有所增长，但顺铂组小鼠平均体重增长最低。
[0087] §1.3.2抑瘤率
[0088] 实验结果显示，与肿瘤模型组比较，顺铂有明显抑瘤作用，抑瘤率为28.3% ，低、中、高3个剂量紫景天水煎液具有一定的抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的作用（P<0.05），抑瘤率分别为15.6%，17.0% ，19.3% 。见表 6。
[0089] 表6 紫景天水煎液对C57BL/6荷瘤小鼠lewis肺癌的抑瘤实验结果
[0090]
[0091] §1.4 实验结论
[0092] §1.4.1 紫景天水煎液顺铂组、低剂量组、中剂量组、高剂量组对肺癌小鼠肿瘤生长均有抑制作用，且剂量越高对肿瘤生长的抑制作用越明显。
[0093] §1.4.2 紫景天水煎液顺铂组、低剂量组、中剂量组、高剂量组均可减少肺癌小鼠瘤细胞增生，其中以顺铂组减少肿瘤细胞增生最明显，但基抑瘤率仍然较低。
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