肿瘤侵染和转移是一种癌症细胞致命性地全身扩散的生物学现 象。首先，脱离初发位置(例如上皮组织)的癌症细胞破坏将它们与其 他组织隔离的基底膜。部分侵染细胞能够穿透围绕血管的基膜以及排列 其上的内皮细胞层，从而随血流而自由循环。最后，癌症细胞到达毛细 血管，吸附并且再次穿透毛细血管壁，形成二级肿瘤。也许，只有少于 10000分之1的脱离初发位置的癌症细胞能够存活并在另一个组织形成 克隆(参见Erkki Ruoslahti，科学美国人，72-77，1996年9月)。
因此，肿瘤转移和侵染需要细胞和胞外基质(ECM)间的粘性相 互作用。在肿瘤转移期间，肿瘤细胞能够引起内皮细胞收缩，暴露出内 皮细胞下基底膜，使肿瘤细胞有效地粘附到周围基质的ECM蛋白质上 (参见Hynes，R.O.细胞48：549，1987)。这些基质蛋白质通过结合特 异的细胞表面受体(包括整联蛋白家族的成员)促进细胞粘着。
就结构而言，每个整联蛋白是由非共价相连的α和β亚基组成的异 二聚体。人们认为β1亚家族是胞外基质粘着的主要媒介。已有报导说 β1整联蛋白可能有其它功能，例如介导细胞-细胞的直接粘着(参见 Larjava，H.等，细胞生物学杂志，110：803-815，1990)。在白细胞上发 现的β2亚家族包含介导细胞-细胞相互作用的受体。β3亚家族包括血 小板糖蛋白IIb/IIIa复合体和玻连蛋白受体，它可能在肿瘤侵染和转移 的发展过程中起重要作用(参见Albelda，S.M.等，癌症研究，50： 6757-6764，1990)。
跨越细胞膜的整联蛋白受体复合体将一个细胞的完整细胞骨架与 胞外环境连接起来。人们认为细胞粘附分子(如纤维蛋白原、玻连蛋白 和层粘连蛋白)的通用序列或特有核心序列导致了细胞粘连，以及细胞 的扩散或整合。
另一方面，肿瘤发生和转移与整联蛋白的生物作用密切关联(参见 Giancotti F.G.和Rouslahti E.，细胞60：849-859，1990；Hynes R.O.细 胞69：11-25，1992；Nip J.等，临床研究杂志96：2096-2103，1995)。
纤维蛋白原受体α5β1的过量表达抑制了中国仓鼠卵巢细胞的转 化表现型。在ras-转化的啮齿动物细胞中，整联蛋白α5β1减少(参见 Plantefaben L.C.和Hynes R.O.细胞56：281-290，1989)，超纤维蛋白 原(多聚体纤维状形式的纤维蛋白原)阻止了肿瘤的转移和形成(参见 Pasqualini R.，等，天然药物2：1197-1203，1996)。
整联蛋白αvβ3是多数恶性细胞的特有标记，暗示这种粘连受体 在人黑素瘤的恶性生长中起关键作用(参见Albelda S.M.等，癌症研究 50：6757-6764，1990)。整联蛋白αvβ3基因的表达和产生的粘连表 型直接参与人黑素瘤的体外增殖(参见Felding-Hamermann，临床研究 杂志89：2018-2022，1992).
血管发生是已有血管派生出新血管的生物过程(参见：Folkman J. 和D’Amore P.A.细胞87：1153-1155，1996)。这一过程在实体瘤发 展以及正常发育、伤口愈合和发炎过程中都发挥关键作用，平滑肌和内 皮细胞中的血管细胞粘连分子致力于该过程的调节(参见Nguyen M. 等，自然365：267，1993)。
肿瘤的血管发生表型转变可能是由于参与血管发生的正负调节因 子失衡导致的。近来，有报导说存在两种细胞因子依赖性血管发生途 径，这两种途径由不同的血管细胞整联蛋白αvβ3和αvβ5确定，αv β3和αvβ5在血管发生的血管细胞中表达，并在碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF) 和人肿瘤碎片诱导的血管发生中起重要作用(参见Friedlander M.等，科 学270：1500-1502，1995)。αvβ3整联蛋白的激活刺激了促进血管生 长和分化的存活信号，这表明通过细胞因子和整联蛋白受体进行的信号 活动与新血管的生长关系密切(参见Brooks Pγ.C.等，细胞79：1157- 1164，1994)。
另一方面，已经鉴定到如下几种内源血管发生抑制因子：干扰素 α，γ(参见Friesel R.等细胞生物学杂志104：689-696，1987；Ezekowitz R.A.等，N.Engl.J.Med.324：1456-1463，1992)；干扰素诱导蛋白10(参见 Angiolillo A.L等，实验医学杂志182：155-162，1995；Strieter R.M.等， 生物化学和生物物理学研究通讯210；51-57，1995)；特异性抑制内皮 细胞增殖的血管紧张素和endostatin(参见O’Reilly M.S.等细胞79： 315-328，1994；O’Reilly M.S.等，细胞88：277-285，1997)；gro-β(参 见Cao Y.等，实验医学杂志182：2069-2077，1995)；催乳素的16 kDaN- 末端片段(参见Clapp C.等，内分泌学133：1292-1299，1993)；以及 血小板因子4(参见Maione T.等，科学247：77-79，1990；Gupta S.K. 等，美国科学院学报92：7799-7803，1995)。
众所周知，解整联蛋白是一类主要来源于蛇毒的小蛋白质(参见 Niewiarowski S.等，Semin.Hematol.3l：289-300，1994)。多数解整联蛋 白含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)序列，这些序列是血小 板纤维蛋白原蛋白受体α2bβ3识别的结构区，同时它们也是包括αv β3和αvβ5在内的几种整联蛋白的有效拮抗物。有几篇报导论述，含 有RGD序列的解整联蛋白通过阻断肿瘤细胞与ECM的粘连而抑制肿瘤 转移(参见Trikna M.等，癌症研究54(8)：4993-4998，1994)。
经鉴定，整联蛋白αvβ3是鸡胚胎和人体新生血管的标记(参见 Brooks，P.C.等，科学264：569-571，1994)。抗αvβ3单克隆抗体能够 诱导新生血管内皮细胞衰亡，干扰新血管发生。应用含有阻断配体与整 联蛋白αvβ3结合的RGD序列的合成肽抑制了鸡尿囊绒毛膜(CAM) 上肿瘤诱导的血管发生(参见Brooks，P.C.等，细胞99：1157-1164， 1994)，同时还抑制了协助内皮细胞粘连和分散的血管生成素的功能。 最近，报导了一种来源于蛇毒的解整联蛋白—trifavin，它能够抑制TNF- α诱导的血管发生。这些发现意味着解整联蛋白、合成RGD肽和抗αv β3单抗可以开发成为有效的抗肿瘤试剂。
与先前的报导一致，本发明人从韩国蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液中分离到Salmosin，经鉴定：它是一种新的具有血小 板凝集强抑制活性的7.5kDa蛋白质(参见韩国专利NO：142606，SEQ ID NO：1)；并且它含有已知的抑制配体与整联蛋白αvβ3结合的RGD 序列。
在目前情况下，我们有充分的理由开发研制含有从韩国蛇 Agkistrodon halys brevicaudus毒液得到的活性成分Salmosin的抗肿瘤 药。
发明概述
本发明人从韩国蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液分离并纯 化了Salmosin，克隆了其cDNA，并在大肠杆菌中大量表达重组 Salmosin。然后，他们在发现Salmosin能够强烈抑制肿瘤血管发生(癌 症细胞生长和转移的关键)，而不影响正常内皮细胞的增殖的基础上， 研制了包含活性成分Salmosin(含有RGD序列的解整联蛋白)的抗肿 瘤药。
因此本发明的首要目的是提供包含来源于韩国蛇Agkistrodon halys brevicaudus毒液的活性成分Salmosin的抗肿瘤药。
附图简述
以下结合附图的详细描述，将进一步显示本发明的上述和其他目的 及特点。其中：
图1是编码磷酸核糖激酶的重组表达载体ΔpMA-PRK153的基因 图谱。
图2A是编码由PRK153、尿激酶裂解位点和Salmosin组成的融合 蛋白的重组表达载体ΔpMASIN1的基因图谱。
图2B是重组Salmosin和分离的Salmosin的SDS-PAGE模式照片。
图3显示Salmosin抑制B16黑素瘤细胞转移的鼠肺照片。
图4A是显示Salmosin对bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)刺激 的BCE(牛毛细管内皮)细胞增殖的抑制作用曲线图。
图4B是显示抗-αvβ3单抗和Salmosin对bFGF刺激的BCE细胞 增殖的抑制作用曲线图。
图5A是显示bFGF诱导的CAM(鸡尿囊绒毛膜)血管发生的照 片。
图5B是显示抗-αvβ3单抗对bFGF诱导的CAM血管发生抑制作 用的照片。
图5C是显示Salmosin对bFGF诱导的CAM血管发生抑制作用的 照片。
图6A是显示Salmosin或其它抗αvβ3整联蛋白的拮抗剂(即抗- αvβ3抗体或GRGDSP)对玻连蛋白和BCE细胞粘连的抑制作用曲线 图。
图6B是显示Salmosin或其它抗αvβ3整联蛋白的拮抗剂(即抗- αvβ3抗体或GRGDSP)对Salmosin和BCE细胞粘连的抑制作用曲线 图。
图7显示了鼠肺照片，表明Salmosin对转移性Lewis肺肿瘤生长 的抑制作用(上：PBS处理，下：Salmosin处理)。
图8是显示Salmosin对实体性Lewis肺肿瘤生长抑制作用的曲线 图。
发明详述
本发明人从韩国蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液分离并纯 化到Salmosin，筛选出其cDNA，并在大肠杆菌中大量表达了重组 Salmosin。他们研究了分离的Salmosin和重组Salmosin在体内和体外对 肿瘤转移和生长的生物学作用。结果发现：Salmosin强烈抑制αvβ3整 联蛋白的功能(该功能是肿瘤血管发生的关键)，并且有效地抑制肿瘤 的转移和生长。 下面进一步说明本发明。
用一系列柱层析从韩国蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液中 分离并纯化出Salmosin，并从Agkistrodon halys brevicaudus毒腺的cDNA 文库中克隆出其cDNA。为了研究Salmosin是否能抑制肿瘤细胞的转 移，将Salmosin与黑素瘤细胞混合，注射到鼠尾侧静脉。Salmosin在体 外不能阻断肿瘤细胞自身增殖，而是以剂量依赖的方式阻断肿瘤细胞的 血管发生。这些发现有力地提示Salmosin对肿瘤转移的抑制效果是由于 它阻断了与肿瘤转移相关的整联蛋白的功能，而非它的细胞毒性。基于 这种思路，本发明人通过BCE细胞增殖实验，研究Salmosin是否能阻 断与肿瘤血管发生有关的αvβ3整联蛋白的功能。结果发现，Salmosin 阻断了肿瘤诱导的血管发生，而不影响已有血管或已有血管发生；并且 发现Salmosin对BCE细胞增殖的抑制效果是由于Salmosin与BCE细胞 表面的玻连蛋白受体—αvβ3整联蛋白的直接结合所致。
另一方面，众所周知，解整联蛋白阻断转移性肿瘤形成克隆，但不 清楚解整联蛋白能否阻断已形成的转移性肿瘤的生长。因此，为了检测 Salmosin对转移性肿瘤生长的影响，将转移性Lewis肺肿瘤细胞注射给 鼠，克隆形成后，注射Salmosin。结果证明：转移性肿瘤生长被有效地 抑制了，而不产生任何细胞毒症状，Salmosin还能阻断实体瘤的生长。
以下实施例用于进一步阐述本发明，它们不应认为是对发明范围的 限定。 实施例1：从毒液中分离Salmosin
为了从韩国蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液中纯化 Salmosin，将lml毒液悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5，缓冲液A) 中至体积为10ml，装入用缓冲液A平衡的苯胺-琼脂糖(Sepharose)柱 (Pharmacia-LKB，Sweden)，洗脱流速为30ml/小时。收集未与柱结合的 组分，用缓冲液A悬浮，再装入DEAE-Toyopearl柱(2.5×5.0cm) (Pharmacia-LKB，Sweden)，洗脱流速为60ml/小时。以25mM、50mM、 100mM和1M NaCl的浓度进行分步洗脱，用超滤系统(Amicon，USA.) 浓缩活性级分。浓缩物装入TSK-G2000柱(7.5×300cm) (Toyosoda，Japan)，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗脱。汇合活性级分，浓 缩后装入用0.1％TFA(三氟乙酸)溶液平衡的反相Vydac C18柱 (2.5×300cm)(Vydac，USA)。然后，用所述TFA溶液和20％(v/v) 乙腈溶液交替洗柱子，用20-60％(v/v)线性梯度的乙腈将蛋白质洗脱 到所述TFA溶液中。 实施例2：重组Salmosin的表达和纯化
为了克隆编码Salmosin的cDNA，用Agkistrodon halys brevicaudus 毒腺cDNA文库作模板进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应中，寡 聚d(T)作为3’引物，用根据Salmosin N-末端氨基酸序列(—EECDCG —)推断的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)作为5’引物。用琼脂糖凝 胶电泳纯化290bp的PCR产物，将其克隆到载体pCPII(Invitrogen，USA) 上。分析克隆的DNA序列(SEQ ID NO：3)，由所述DNA序列翻译 产生的氨基酸序列与分离到的Salmosin序列一致。表达重组Salmosin 时，使用了大肠杆菌表达载体ΔpMA-PRK153(见图1)。在这种载体 中，在araB启动子的调控下，目标蛋白表达为与磷酸核糖激酶(PRK) 形成的融合蛋白。为了方便进行亚克隆，通过将由PCR产生的DNA片 段引入BamHI和XhoI位点而将之修蚀。同时在磷酸核糖激酶和Salmosin 编码序列之间引入尿激酶裂解位点，将制备得到的表达载体命名为Δ pMASINI(见图2A)。在图2A中，ParaB代表araB启动子，PRK(1-153) 代表包含1到153氨基酸序列的蛋白质，UK代表尿激酶裂解位点。将 该表达载体转化大肠杆菌菌株MC1061。转化子在1升2×YT培养基中 生长，用1％阿拉伯糖(w/v)诱导，37℃培养18小时，至600nm波长 吸光度为0.3。Salmosin表达成为不溶的内涵体，将内涵体重悬浮于沉 淀洗涤溶液(0.5％Triton X-100，1mM EDTA，1mM DTT)，以12000rpm 离心20分钟，除去污染的大肠杆菌蛋白质。再洗3次后，沉淀溶解于 20ml 8M脲溶液(8M脲，20mM Tris-HCl，pH7.8，20uM DTT)，4℃保 温24小时。离心后，澄清的上清液在4℃对4L透析缓冲液(80mM NaCl， 20mM Tris-HCl，pH7.8，0.03％SDS)透析。随后在室温用尿激酶裂解重新 折叠的融合蛋白30分钟，比率为400mg融合蛋白对1U尿激酶。将10mg 裂解蛋白质装入用20mM Tris-HCl，(pH8.0)缓冲液平衡的DEAE- Toyopearl柱子，用含有50mMNaCl的同一缓冲液洗脱。汇合活性级分， 浓缩后加入TSK-G200 HPLC柱子(2.15×30cm)，用PBS洗脱。随后， 为了除去不当裂解的Salmosin，将活性级分加入半制备C18 HPLC柱(1.0 ×20cm)，用0.1％TFA溶液中的20-40％(v/v)线性梯度的乙腈洗脱。 实施例3：重组Salmosin和分离的Salmosin的比较实验
为了比较上述实施例1和2中制备的Salmosin的物化性质和生物 活性，分别进行了N-端测序，血小板凝集检测和SDS-凝胶电泳。结果 显示：重组Salmosin的N-端序列以EAGEEC起始，这与分离的Salmosin 的一致，它们对血小板凝集的抑制活性也相同。并且，SDS-PAGE结果 表明重组Salmosin的大小与分离Salmosin完全相同(见图2B)。图2B 中，1道是重组Salmosin，M道是分子量标记，2道是分离的Salmosin。 据此清楚地表明，重组Salmosin折叠正确，并具有与分离Salmosin同 样的生物活性。 实施例4：Salmosin抑制肿瘤转移
为了研究体内Salmosin对肿瘤转移的抑制效果，将Salmosin与B16 黑素瘤细胞一起注射给C57BL/6鼠(Charles river，Japan)。用0.02％EDTA 分离B16黑素瘤细胞，轻轻地重新悬浮在无血清RPMI-1640培养基中， 至浓度为7.5×105/ml。然后将Salmosin(250,500,1250ug/kg鼠)与细 胞混合制备含有指定量Salmosin或PBS的单细胞悬液，取200ul单细 胞悬液注射入鼠尾侧静脉。14天后，处死鼠，利用解剖显微镜计数肺黑 素瘤克隆。结果发现，与PBS处理的对照组相比，C57BL/6鼠肺内的转 移克隆急剧减少(见表1)。如表l所示，Salmosin对克隆形成的抑制 是剂量依赖性的；低剂量Salmosin(250μg/kg鼠)能抑制肺内的克隆 形成，但给予更高剂量的Salmosin时，几乎检测不到克隆。这些发现与 组织化学分析结果相符(见：图3：A，正常肺；B，PBS处理；C，250 ug Salmosin/kg处理；D，1250ug Salmosin/kg处理)。
表1：Salmosin处理对肿瘤转移的抑制    Salmosin   (ug/kg鼠)   鼠数量    肺肿瘤克隆    的平均数   抑制率    (％)     0     8     144±40     0     250     7     49±22     66     500     7     3±2     98     1250     6     1±1     99
另外，根据将B16黑素瘤细胞体外与Salmosin温育，不影响它们 随后的增殖率这一实验事实，表明Salmosin对肿瘤转移的抑制不是由细 胞毒性引起的。
基于Salmosin对B16黑素瘤细胞粘连和侵染ECM的抑制效果，这 些实验证据有力地提示，Salmosin作为肿瘤细胞表面的整联蛋白受体拮 抗剂，抑制肿瘤转移。 实施例5：Salmosin抑制血管发生
实施例5-1：BCE(牛毛细血管内皮)细胞增殖检测
应用BCE细胞增殖检测系统，检查Salmosin对血管发生的抑制效 果。制备来自牛肾上腺的BCE细胞初级培养物，随后该细胞在含有 3ng/ml bFGF、补充有10％胎牛血清的Dulbeco′s基本培养基(DMEM) 上维持培养。将上述BCE细胞在凝胶状24-槽培养板上铺板，37℃、 5％CO2培养24小时。培养后，培养基换成含有5％胎牛血清的DMEM， 并将Salmosin加入培养基。培养20分钟后，用溶于上述培养基的bFGF (1ng/ml)处理细胞，72小时后，用胰蛋白酶分离细胞，计量细胞数。 结果发现Salmosin能够以剂量依赖性方式抑制bFGF刺激的BCE细胞 增殖。Salmosin浓度为0.1-0.2ug/ml(对应13-27nM)时观察到半最高 抑制(见图4A)。另外，Salmosin处理使bFGF刺激的BCE细胞发生 显著的形态变化，成为球形。但是，缺乏bFGF时，用20ug/ml Salmosin 处理(这是Salmosin对bFGF诱导的增殖产生最高抑制所需剂量)不能 抑制细胞增殖(见图4A框中的示意图)。另一方面，经检查抗αvβ3 的单抗能有效抑制bFGF诱导的BCE细胞增殖(见图4B)。
实施例5-2：CAM(鸡尿囊绒毛膜)检测
通过CAM(鸡尿囊绒毛膜)检测，检查Salmosin对体内肿瘤诱导 的血管发生的抑制效果。将三天龄受精鸡卵小心地打出裂缝，用透明胶 带封好。37℃，60％湿度保温10天，该受精卵发育为胚胎。之后，将 6ng bFGF植入每个胚胎的CAM，诱导新血管发生。保温24小时后，用 5μg Salmosin，5μg抗αvβ3的单抗(阳性对照)或PBS(磷酸盐缓 冲液，阴性对照)处理每个胚胎的CAM。72小时后，在立体显微镜下 观察CAM上的血管(见图5A、5B和5C)。观察到：PBS处理时，新 血管发生无可见变化(见图5A)，而用Salmosin或抗αvβ3的单抗处 理时，新血管发生被抑制(见图5B和5C)。特别是发现Salmosin能使 bFGF诱导的新血管破裂，表明Salmosin能抑制肿瘤诱导的新血管发 生，而不影响已有血管或属于正常生理现象的血管发生。 实施例6：Salmosin抑制BCE细胞粘连
为了研究BCE细胞增殖是否被Salmosin与αvβ3整联蛋白(BCE 细胞表面的一种玻连蛋白受体)的直接结合所抑制，检查了Salmosin 抑制BCE细胞粘连玻连蛋白的能力：用溶于PBS的Salmosin(1ug/槽) 和玻连蛋白(0.5ug/槽)包被96槽微板，4℃，16小时。清洗该微板， 用10mg/ml热变性牛血清清蛋白保温1小时以封闭存留的蛋白质结合位 点，用前用PBS洗。用胰蛋白酶-EDTA分离BCE细胞，在PBS中洗三 次，重悬浮于无血清DMEM。5×104个细胞与Salmosin、抗αvβ3的单 抗、合成的RGD肽(GRGDSP)或合成的RGE肽(GRGETP)预保温 20分钟，并将之均分到上述板的各个槽中，然后在37℃，5％CO2，95％ 空气中继续保温1小时。用PBS洗去未结合的细胞，然后固定结合在板 上的细胞，并用考马斯蓝染色。测量每个槽在540nm的光吸收，确定相 对细胞数。结果发现：Salmosin与bFGF诱导的细胞预保温，能够高度 抑制BCE细胞与玻连蛋白粘连(见图6A)；抗αvβ3的单抗强烈抑制 细胞与Salmosin粘连(见图6B)；合成RGD肽(GRGDSP)也能够抑 制细胞与玻连蛋白或Salmosin粘结(见图6A和6B)。这些结果清楚地 显示，Salmosin与BCE细胞上的αvβ3整联蛋白结合，从而阻断了整 联蛋白介导的细胞粘着。 实施例7：Salmosin对转移性肿瘤生长的抑制
已有报导，解整联蛋白通过阻断肿瘤细胞附着到内皮，从而抑制肺 肿瘤克隆的形成。但是，不清楚解整联蛋白是否抑制肺转移性肿瘤的生 长。为了研究Salmosin对转移性肿瘤生长的抑制效果，将来源于ATCC (Rockville，USA.)的1.5×105个Lewis肺肿瘤细胞注射入8周龄的 C57BL/6雄鼠侧尾静脉，鼠体内形成转移性克隆。4天后，对鼠静脉注 射Salmosin，每天一次，剂量为1.25mg/kg/天；4周后，处死鼠，分离 肺；在解剖镜下计数肺肿瘤克隆数目。所有测试鼠都没有发现可辨认的 毒性症状。结果显示，Salmosin显著抑制转移性肿瘤的生长(见表2)。 在这方面，Salmosin对转移性肿瘤生长的抑制效果可以解释为：Salmosin 结合了肿瘤血管发生所必须的αvβ3整联蛋白。
表2：Salmosin处理对肺部转移性Lewis肺瘤生长的抑制   Salmosin  (mg/kg鼠) 鼠的数量  肺瘤克隆的均值   抑制   (％)     0     4     15±6    0     4     4     0.8±0.7    93
另外，进行了组织化学分析来研究Salmosin对肺部转移肺瘤的抑 制效果。该肺组织在Bouin’s溶液中固定4小时，依照标准操作包埋 在石蜡中。4μm厚切片在胰蛋白酶中，37℃浸泡10分钟，然后用PBS 清洗。上述切片用苏木精和曙红染色，随后制片。在Salmosin处理的动 物肺中几乎没有观察到肿瘤克隆(见图7)，这与PBS处理的对照鼠完 全不同。图7分别显示了放大400倍(左)和200倍(右)的照片，暗 示Salmosin对转移性肿瘤生长的抑制效果与它对血管发生(次级肿瘤生 长所必需)的抑制作用密切相关。 实施例 8：Salmosin抑制实体瘤的生长
为了检查Salmosin在实体瘤生长中的作用，将Lewis肺瘤细胞(1 ×106)皮下注射到C57BL/6鼠背部中线，使之长成至少100-200mm3 的一块。将鼠随机分为两组后，一组动物在远离肿瘤的位置皮下注射 Salmosin的PBS液(10mg/kg鼠)，每天一次；另一组作为对照，只注 射PBS。每天同一时间测量各组动物的肿瘤体积，当对照鼠开始死亡 时，终止实验。结果观察到，Salmosin处理强烈抑制实体瘤的生长(见 图8)。
给药和有效剂量
虽然Salmosin的有效剂量随病人的年龄、体重和病情进展而变， 优选非肠道给药，一次剂量为0.5-10mg/kg/天，本领域技术人员可以根 据经验区别对待。
急性毒理实验
为了检查Salmosin的急性毒性，给雄性C57BL/6鼠皮下注射7天 Salmosin，统计死亡鼠个数以确定LD50。测量结果LD50大约为 1000mg/kg，表明含有Salmosin的抗肿瘤药物在有效剂量范围内足够安 全。
本发明的含有活性成分Salmosin和可药用载体的药物组合物，可 以以注射剂剂型给药。注射剂还可以包含等渗水溶液或悬液，可药用载 体包括防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于改变渗透压的盐或缓冲 液。
虽然说明和描述本发明的具体实施例使用黑素瘤细胞和Lewis肺 瘤细胞作为受测肿瘤细胞，然而本发明的抗肿瘤试剂可以对多种肿瘤有 效，例如皮肤癌、喉癌、子宫癌、结肠癌、肺癌和骨髓癌。
正如以上说明和显示，本发明提供一种含有活性成分Salmosin的 抗肿瘤试剂。本发明论证：Salmosin是一种新的阻断αvβ3整联蛋白功 能、强烈抑制肿瘤血管发生、肿瘤转移以及实体瘤生长的解整联蛋白。 在抑制肿瘤生长，而对已有血管和正常血管发生没有任何不利影响的有 效剂量范围内，Salmosin未呈现细胞毒性。据此，Salmosin可以用于研 制对多种癌症有效的抗肿瘤药物。 序列表 申请人      金斗植 发明名称    含有活性成分SALMOSIN的抗肿瘤药物 在先申请号  KR98-23778 在先申请日  1998-06-23 在先申请号  KR 99-20579 在先申请日  1999-06-04 序列数      3 软件类型    KOPATIN 1.0 SEQ ID NO：1 氨基酸数   73 分子类型   PRT 来源       Agkistrodon halys brevicaudus SEQ ID NO：l的序列描述 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys 1               5                   10                  15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly
        20                  25                  30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg
    35                  40                  45 Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala
50                  55                  60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65                  70 SEQ ID NO： 2 核苷酸数    20 分子类型    DNA 来源        合成序列 <220> 链型        单链寡核苷酸 SEQ ID NO：2的序列描述 ggngargart gygaytgygg    20 SEQ ID NO：3 核苷酸数   222 分子类型    DNA 来源        Agkistrodon halys brevicaudus SEQ ID NO：3的序列描述 gaggccggag aagaatgtga ctgtggctct cctggaaatc cgtgctgtga tgctgcaacc  60 tgtaaactga gacaaggagc acagtgtgca gaaggactgt gctgtgacca gtgcagattt  120 atgaaagaag gaacaatatg ccggagagca acgcgtgatg acctggatga ttactgcaat  180 ggcatatctg ctggctgtcc cagaaatccc ttccatgcct aa                     222