技术领域
[0001] 本
发明属于抗肿瘤小分子干扰RNA载体、癌症
基因治疗、核
磁共振成像和分子靶 向领域。具体涉及一种载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针的制备方法。
背景技术
[0002] 抗肿瘤小分子干扰RNA(简称：siRNA)是一种具有21〜25核苷酸序列的小RNA分 子，由Dicer (RNAase III家族中对双链RNA具有特异性的酶）的ATP依赖性RNA酶切割双 链RNA所形成。siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰
复合体，此 复合体通过
碱基互补
配对识别靶mRNA并使其降解，从而导致特定基因沉默。
[0003] 癌症的发生可以看作是一种基因的
疾病，即某些原癌基因被一些特殊的内源或外 源性的因子所激活，从而引起的细胞的各种形态学和生理生化的转变，进行非
机体控制的 持续分裂增殖，最终耗竭机体导致死亡。癌症的基因治疗是继手术、化疗、放疗后的新型治 疗手段，它利用基因转移技术将正常或野生型等外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正 肿瘤相关基因的结构与功能
缺陷，或者阻断癌症基因的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。
[0004] 肿瘤靶向治疗是针对导致细胞恶性转化的环节，使用某些能与这些靶分子特异结 合的
抗体、配体等，定向引导治疗药物至肿瘤靶部位，从而在分子
水平逆转该恶性
生物学行 为，抑制肿瘤细胞生长。目前已有贝伐单抗、曲妥单抗、阿仑单抗、西妥昔单抗、托西莫单抗 等多种抗体被美国食品和药物管理局（FDA)批准应用于靶向抗肿瘤治疗。
[0005] 分子影像学是利用现有的一些医学影像技术对人体内部生理或病理过程在分子 水平上进行无损伤的、实时的成像，是将分子生物学技术和现代
医学影像学相结合的产物。 其中
核磁共振成像具有极高的空间分辨
力和组织分辨力，是分子影像学中的重要研究手 段。核磁共振
分子成像能够对肿瘤进行早期及特异性的诊断，并能监测抗肿瘤治疗的效果。 构建具有肿瘤的分子成像与治疗共同作用的靶向纳米分子探针是癌症诊断与基因治疗领 域的研究热点。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种载抗肿瘤SiRNA磁性纳米探针的制备方法。用于靶向传递抗肿 瘤siRNA至目标靶点，实现肿瘤的基因治疗，并同时携带超
顺磁性四
氧化三
铁纳米颗粒，可 利用核磁共振成像技术特异性诊断和实时监测肿瘤治疗效果。
[0007] 本发明的磁性纳米探针是这样实现的：首先将
水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗 粒和siRNA通过静电作用相互结合形成复合物，然后采用复乳化法将复合物包载于羧基封 端的聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（简称：PLGA-C00H)中制备纳米粒，再通过
碳二亚胺法 连接上单克隆抗体，最终获得载抗肿瘤siRNA的磁性纳米探针。具体包括以下步骤：
[0008] (1)将抗肿瘤小分子干扰RNA溶于DEPC水中，加入乙酰化小
牛血清
白蛋白或低分 子量肝素钠混勻，加入水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒中，4°C
冰箱孵育lh，形成水相 复合物；3[0009] (2)将羧基封端的聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物溶于二氯甲烷中，加入上述水相复 合物，形成初乳后溶于聚乙烯醇的DEPC水溶液中，挥去
有机溶剂，离心，
超滤，水洗3〜5次 得到纳米粒溶液；
[0010] (3)将上述纳米粒溶液浓缩，加入pH = 5的2-吗啉乙磺
酸溶液活化，超滤，溶于 PH = 7. 4的PBS缓冲液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3- 二甲基
氨基丙基）碳酰 二亚胺
盐酸盐，孵育池，加入单克隆抗体，4°C冰箱孵育过夜，脱盐柱纯化，得载抗肿瘤小分 子干扰RNA的磁性纳米探针。
[0011] 本发明所述DEPC水为焦碳酸二乙酯处理的超纯水，所用器皿经焦碳酸二乙酯处理。
[0012] 本发明所述低分子量肝素钠的平均分子量小于8000道尔顿。
[0013] 本发明所述水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒的粒径小于50nm，磁饱和强度值 为40〜lOOemu/g，水溶液中分散后表面电荷呈阳性。
[0014] 本发明所述单克隆抗体为贝伐单克隆抗体、曲妥单克隆抗体、阿仑单克隆抗体、西 妥昔单克隆抗体或托西莫单克隆抗体。
[0015] 本发明所述载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针具有抑制肿瘤细胞生长的作用。
[0016] 本发明所述载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针可以作为
造影剂，应用于实时 监测肿瘤病变和治疗中的变化情况。
[0017] 本发明与
现有技术相比，具有如下有益效果：
[0018] 1.采用带正电荷的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒与带负电荷的乙酰化白 蛋白或低分子量肝素钠稀释的抗肿瘤siRNA通过静电吸引方式结合，形成的复合物
稳定性 好；
[0019] 2.采用羧基封端修饰的聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物作为高分子基包载物，使得 所制备的纳米粒表面具有可化学键接的活性位点；
[0020] 3.采用碳二亚胺法在纳米粒表面连接单克隆抗体，使整个纳米探针具有较高的特 异性识别作用；
[0021] 4.通过本发明制备的纳米探针既可传递抗肿瘤siRNA用做肿瘤基因治疗，又可同 时携带超顺磁性
纳米粒子进入肿瘤部位，方便肿瘤的分子影像诊断与实时检测肿瘤治疗效
附图说明
[0022] 图1为本发明
实施例3在作用4¾后，利用MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结
具体实施方式
[0023] 以下的实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0024] 实施例1
[0025] 取IOD的抗肿瘤siRNA溶于50 μ L焦碳酸二乙酯（简称：DEPC)水中，加入50 μ L
质量浓度10%的乙酰化
小牛血清白蛋白，混勻器上涡旋震荡ailin，加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超顺磁性四氧化三铁（简称：USPI0)纳米粒子的DEPC水溶液，4°C冰箱孵育Ih得 SPIO-siRNA 复合物。
[0026] 取IOmg PLGA-C00H溶于2mL 二氯甲烷中，加入SPIO-siRNA复合物，超声30秒， 形成油包水型初乳，在超声的条件下，将初乳慢慢滴加到30mL质量分数2 %的聚乙烯醇 (简称：PVA)的DEPC水溶液中，挥去
有机溶剂，2500rpm离心去除大颗粒杂质，6000rpm 超滤管离心（滤膜截留分子量为20kDa)去除PVA乳化剂，水洗3〜5次，得纳米粒 SP10-s i RNA-PLGA-C00H。
[0027]将上述 SPIO-siRNA-PLGA-COOH纳米粒溶液浓缩至 ImLJnAlOmL 0. lmol/L pH为 5的2-吗啉乙磺酸溶液活化lOmin，超滤离心2次，纳米粒重分散于5mL pH = 7. 4的PBS 缓冲液中，加入NHS和EDC各100 μ g，孵育2h，加入50 μ L贝伐单抗(AbAvastin)，4°C冰箱孵 育过夜，脱盐柱（PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)纯化去除小 分子杂质，得载siRNA的磁性纳米探针SPIO-siRNA-PLGA-AbAvastin。
[0028] 实施例2
[0029] 取20D的抗肿瘤siRNA溶于50 μ L DEPC水中，加入50 μ L质量浓度10%的乙酰化 小牛血清白蛋白，混勻器上涡旋震荡2min，加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超顺磁性四氧化 三铁纳米粒子的DEPC水溶液，4°C冰箱孵育Ih得SPIO-siRNA复合物。
[0030] 取IOmgPLGA-COOH溶于2mL 二氯甲烷中，加入SPIO-siRNA复合物，超声30秒，形 成油包水型初乳，在搅拌的条件下，将初乳慢慢滴加到30mL质量分数2%的PVA的DEPC水 溶液中，挥去有机溶剂，2500rpm离心去除大颗粒杂质，6000rpm超滤管离心（滤膜截留分子 量为20kDa)去除PVA乳化剂，水洗3〜5次，得纳米粒SPI0-siRNA-PLGA_C00H。
[0031]将上述 SPI0-siRNA-PLGA-C00H纳米粒溶液浓缩至 ImLJnAlOmL 0. lmol/L pH为 5的2-吗啉乙磺酸溶液活化lOmin，超滤离心2次，纳米粒重分散于5mL pH = 7. 4的PBS 缓冲液中，加入NHS和EDC各100 μ g，孵育2h，加入50 μ L曲妥单抗（Ablteeeptin)，4°C冰箱孵 育过夜，脱盐柱（PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)纯化去除小 分子杂质，得载siRNA的磁性纳米探针SPI0-siRNA-PLGA-AbHerceptin。
[0032] 实施例3
[0033] 取20D的抗肿瘤siRNA溶于50 μ L DEPC水中，加入50 μ L质量浓度10%的低分子 量肝素钠，混勻器上涡旋震荡2min，加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳 米粒子的DEPC水溶液，4°C冰箱孵育Ih得SPIO-siRNA复合物。
[0034] 取20mg PLGA-C00H溶于2mL 二氯甲烷中，加入SPIO-siRNA复合物，超声30秒， 形成油包水型初乳，在超声的条件下，将初乳慢慢滴加到50mL质量分数1 %的PVA的DEPC 水溶液中，挥去有机溶剂，2500rpm离心去除大颗粒杂质，6000rpm超滤管离心（滤膜截留 分子量为20kDa)去除PVA乳化剂，水洗3〜5次，重分散于IOmL DEPC水中，得纳米粒 SP10-s i RNA-PLGA-C00H。
[0035]取 5ml 上述 SPI0-siRNA-PLGA-C00H 纳米粒溶液浓缩至 lmL，加入 IOmL 0. Imol/ LpH = 5的2-吗啉乙磺酸溶液活化lOmin，超滤离心2次，纳米粒重分散于5mL pH = 7. 4 的PBS缓冲液中，加入NHS和EDC各100 μ g，孵育2h，加入50 μ L托西莫单抗(Ab丽)，4°C冰 箱孵育过夜，脱盐柱（PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)纯化去 除小分子杂质，得载siRNA的磁性纳米探针SPI0-siRNA-PLGA-AbTMM。[0036] 实施例4
[0037] 对本发明制备的磁性纳米探针进行抗肿瘤药效学试验：
[0038]
肺癌细胞系似49、肝癌细胞系H印G2和胃癌细胞系SGC7901在含15%胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，简称：FBS)的DMEM完全培养基(GIBC0公司，美国)培养，培养条件 为37°C，5% CO2
培养箱中湿润培养。将4. 0 X IO4ceIVcm2细胞接种于96孔板，孵育24h使细 胞贴壁后，设立空白对照组、载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针处理组和阴性对照组， 每组平行设3个复孔。孵育44h后弃去上清培养液，每孔加入20 μ L新配制的5g/L 3-(4, 5-二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐（简称：MTT)，孵育4h，移去上清液，加入150 μ L 二甲基亚砜溶解，混勻后用酶标仪在490nm
波长处测定吸光度，计算肿瘤细胞抑制率。
[0039] 图1为作用4¾后MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果。结果显示，经过本发 明载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针作用后的肺癌细胞系AM9、肝癌细胞系HepG2和 胃癌细胞系SGC7901的分裂明显减少，细胞生长受到明显抑制，载抗肿瘤小分子干扰RNA磁 性纳米探针在0〜60 μ M对肿瘤细胞系的抑制作用逐渐增强。
