抗人ADRB3单克隆抗体及其在疾病诊断和治疗中的应用
阅读：814发布：2020-07-15
专利汇可以提供抗人ADRB3单克隆抗体及其在疾病诊断和治疗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了β3肾上腺素受体（ADRB3）作为检测多种 疾病 的标志物的应用，以及抗人ADRB3单克隆 抗体 在制备疾病诊断或疾病 治疗 药物中的应用。ADRB3涉及参与多种 信号 通路，可以作为多种疾病的诊断标志物和治疗靶点；抗人ADRB3单克隆抗体具有抗癌、抗炎、抗毒、抗休克、抗过敏、抗 病毒感染 性疾病、抗 自身免疫性疾病 、抗再生功能障碍导致的疾病、抗恶病质、抗心脑 血管疾病 、抗神经退行性疾病、调控自噬和抗衰老等作用，具有重要的医药价值和研究应用前景。，下面是抗人ADRB3单克隆抗体及其在疾病诊断和治疗中的应用专利的具体信息内容。
1.人β3肾上腺素受体作为检测G0期细胞、肿瘤细胞、人髓源性抑制细胞、造血干细胞、淋巴系祖细胞、淋巴细胞、调节性T细胞、髓系祖细胞、髓系细胞、破骨细胞或小胶质细胞的标志物的应用。
2.人β3肾上腺素受体作为肿瘤、炎症、脓毒症、哮喘、糖尿病、多器官功能障碍综合征、病毒感染性疾病、衰老性疾病、贫血、严重创伤、过敏性疾病、恶病质、中毒性疾病、自身免疫性疾病、器官移植免疫排斥、肺动脉高压、急性冠脉综合征、心脑血管疾病、骨退行性变、MDSC相关性疾病、肥厚型心肌病或神经退行性疾病的诊断标志物或治疗靶点的应用。
3.人β3肾上腺素受体作为检测诊断肿瘤细胞恶性程度、肿瘤病情程度、肿瘤大小、分期、转移情况、预后和/或疗效的标志物，评价细胞增殖能力和/或细胞分化能力的标志物，和评价细胞特异免疫功能和/或细胞衰老程度的标志物的应用。
4.制备抗人β3肾上腺素受体的单克隆抗体的多肽片段，其特征在于，包括但不限于以下多肽：人ADRB3全长蛋白、ADRB3蛋白的N端1-155位氨基酸残基片段、ADRB3蛋白的C端156-
408位氨基酸残基片段、ADRB3蛋白中的296-317位氨基酸残基的亮氨酸拉链片段、ADRB3蛋白中的351-369位氨基酸残基的核定位序列、ADRB3蛋白中的1-36位氨基酸残基的E1片段、ADRB3蛋白中的101-111位氨基酸残基的E2片段、ADRB3蛋白中的134-155位氨基酸残基的I2片段、ADRB3蛋白中的315-326位氨基酸残基的E4片段、ADRB3蛋白中的348-408位氨基酸残基的I4片段、344-349位的氨基酸残基片段、143-148位氨基酸残基的ITIM1片段、140-146位氨基酸残基的ITIM1片段、202-207位氨基酸残基的ITIM2片段、199-204位氨基酸残基的ITIM2片段、212-217位氨基酸残基的ITIM3片段。
5.抗人ADRB3单克隆抗体在调控细胞周期和有丝分裂功能中的应用。
6.抗人ADRB3单克隆抗体在调控肿瘤细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞、髓源性抑制细胞、调节性T细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞、造血干细胞、肝细胞、心肌细胞、破骨细胞、神经元的增殖和分化中的应用。
7.抗人ADRB3单克隆抗体在鉴定或筛选G0期细胞中的应用。
8.抗人ADRB3单克隆抗体在诊断恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症、Treg相关性疾病中的应用。
9.抗人ADRB3单克隆抗体在制备治疗P62，HK2，GAPDH，VEGF，Cyclin D1，CDK3，CDK4，Rb，Ki-67，mTOR，Rictor，AKT，Tubulin，TRAF6，PD-L1，P53，P63，IL-2，IL-6，IL-10，TGFβ和/或TNFa信号通路相关疾病的药物中的应用。
10.抗人ADRB3单克隆抗体在制备治疗肿瘤、炎症、脓毒症、哮喘、糖尿病、内毒素血症、感染性休克、多器官功能障碍综合征、急性化脓性感染、再生功能障碍导致的疾病、病毒感染性疾病、淋球菌感染、衰老性疾病、贫血、严重创伤、过敏性疾病、恶病质、中毒性疾病、自身免疫性疾病、器官移植免疫排斥、肺动脉高压、急性冠脉综合征、心脑血管疾病、骨退行性变、肥厚型心肌病、MDSC相关性疾病、神经退行性疾病或精神疾病的药物，或在制备延缓衰老和/或调控恢复免疫系统功能的药物中的应用。
11.抗人ADRB3单克隆抗体在作为或制备治疗恶性肿瘤药物、抑制肿瘤转移药物、治疗不孕不育药物、抗病毒疫苗、抗肿瘤疫苗、治疗血栓栓塞性疾病药物、抗血小板药物、抗粒细胞药物、化疗药物增敏剂、止血药物、降血压药物、治疗酒精和毒品成瘾的药物、补体激动剂、免疫佐剂、双特异性抗体、诱导分化剂、肿瘤多药耐药逆转剂、器官移植免疫抑制剂、去乙酰化酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂中的应用。
12.抗人ADRB3单克隆抗体在判断恶性肿瘤患者的预后和监测治疗效果中的应用。
13.抗人ADRB3单克隆抗体在制备护肤类化妆品中的应用。
14.抗人ADRB3单克隆抗体在调控心脏、肝脏、骨髓、胰腺、脑、神经、肾脏、肺或肌肉组织的再生中的应用。
15.抗人ADRB3单克隆抗体在调控糖酵解、自噬、核仁功能、核糖体合成、溶酶体功能、线粒体功能或细胞骨架中的应用。
16.抗人ADRB3单克隆抗体作为涂层药物在制备药物洗脱支架或洗脱球囊方面的应用。
17.抗ADRB3嵌合抗原受体修饰后的T淋巴细胞在制备治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症、动脉粥样硬化、病毒感染、神经退行性疾病或衰老性疾病药物中的应用。
18.抗ADRB3嵌合抗原受体修饰后的巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞或粒细胞在作为或制备治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、炎症、病毒感染、神经退行性疾病或衰老性疾病的药物中的应用。
19.抗人ADRB3单克隆抗体，其特征在于，该抗体选自：
（1）由2015年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：
C2015146的杂交瘤细胞株5D1产生的单克隆抗体；
（2）由2016年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为C2016202的杂交瘤细胞株5B8产生的单克隆抗体；
（3）由2015年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：
C2015147的杂交瘤细胞株4G7产生的单克隆抗体；
（4）由2016年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为C2016203的杂交瘤细胞株5D9产生的单克隆抗体；
（5）具有由杂交瘤细胞株5D1、5B8、4G7或5D9产生的单克隆抗体的结合特性的单克隆抗体；
（6）与能结合由杂交瘤细胞株5D1、5B8、4G7或5D9产生的单克隆抗体的表位结合的单克隆抗体；
（7）在竞争性结合测定中与由杂交瘤细胞株5D1、5B8、4G7或5D9产生的单克隆抗体竞争的单克隆抗体；
（8）能特异性结合ADRB3的兔单克隆抗体、鼠源性、嵌合性、全人源性抗体、单域抗体、单链抗体、Fab抗体片段、合成抗体；
（9）与下述ADRB3抗原表位中的一个或几个结合从而调控 ADRB3蛋白活性的抗ADRB3抗体：
S212，S239，S349，C110，C189，T65，T140，S191，Y336，Y346，K151，R152，C153，P343，P350，P368，P369，P371，P377，P381，P391，P394，H190，H288，N8，N26，T150，T108，T114，G41，G106，G146，G271，G295，G383，G402，C275，C363，Y145，Y145，Y204，Y214，Y236，Y346；其中，S：
丝氨酸，C：半胱氨酸，T：苏氨酸，Y：酪氨酸，K：赖氨酸，R：精氨酸，C：半胱氨酸，P：脯氨酸，H：
组氨酸，N：天冬酰胺；
（10）特异性结合ADRB3的抗体，其包含：
a) 包含下列的重链互补决定区：
i) 含有与 SEQ ID NO：1、4、7、10具有至少 70% 的序列同一性的氨基酸序列的第一互补决定区；
ii) 含有与 SEQ ID NO：2、5、8、11具有至少 80% 的序列同一性的氨基酸序列的第二互补决定区；
iii) 含有与 SEQ ID NO：3、6、9、12具有至少 80% 的序列同一性的氨基酸序列的第三互补决定区；和
b) 包含下列的轻链互补决定区：
i) 含有与 SEQ ID NO：13、16、19、22具有至少 80% 的序列同一性的氨基酸序列的第一互补决定区；
ii) 含有与 SEQ ID NO：14、17、20、23具有至少 80% 的序列同一性的氨基酸序列的第二互补决定区；和
iii) 含有与 SEQ ID NO： 15、18、21、24具有至少 80% 的序列同一性的氨基酸序列的第三互补决定区；
c) 人源化抗体的重链可变区包含与 SEQ ID NO：25 具有至少 70% 的序列同一性的氨基酸序列；和/或
d) 人源化抗体的轻链可变区包含与 SEQ ID NO：26 具有至少 70% 的序列同一性的氨基酸序列。
20.具有ADRB3激活作用的ADRB3抗体、ADRB3激动剂或利用基因重组技术生产的人
ADRB3蛋白在制备促进细胞融合的诱导剂或制备促进白细胞生长的生长剂中的应用。
21.可以产生抗ADRB3抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述抗ADRB3抗体能够与下述ADRB3抗原表位中的一个或几个结合从而调控 ADRB3蛋白活性：S212，S239，S349，C110，C189，T65，T140，S191，Y336，Y346，K151，R152，C153，P343，P350，P368，P369，P371，P377，P381，P391，P394，H190，H288，N8，N26，T150，T108，T114，G41，G106，G146，G271，G295，G383，G402，C275，C363，Y145，Y145，Y204，Y214，Y236，Y346；其中，S：丝氨酸，C：半胱氨酸，T：苏氨酸，Y：酪氨酸，K：赖氨酸，R：精氨酸，C：半胱氨酸，P：脯氨酸，H：组氨酸，N：天冬酰胺。
抗人ADRB3单克隆抗体及其在疾病诊断和治疗中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及免疫调节信号通路技术。更具体地， 涉及抗人β3肾上腺素受体的单克隆抗体在制备抗癌、抗炎、抗毒、抗休克、抗 过敏、抗病毒感染、抗自身免疫病、抗恶病质、抗动脉粥样硬化、抗神经退行变、 调控自噬和抗衰老药物中的新用途。
背景技术
[0002] 人体内的β3肾上腺素受体(Adrenoceptor Beta 3，ADRB3，B3AR，beta3 adrenoceptor，β3受体)是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，为G蛋白耦联型。 目前对于ADRB3的研究主要集中于对体脂、血糖与血脂水平、胰岛素分泌及作 用的影响。
[0003] 而对于ADRB3在恶性肿瘤、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、炎症、脓毒症、 多器官功能障碍综合征、病毒感染、自身免疫性疾病、器官移植免疫排斥、衰老、 骨质疏松症、严重创伤、中毒、恶病质等疾病领域的作用，尚无相关研究和报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供人ADRB3及其单克隆抗体在治疗肿瘤(恶性肿瘤)、 炎症(机体慢性系统性炎症)、脓毒症、哮喘、糖尿病、多器官功能障碍综合 征、病毒感染、衰老性疾病、贫血、严重创伤、过敏性疾病、恶病质疾病、中 毒、自身免疫性疾病、器官移植免疫排斥、肺动脉高压、动脉粥样硬化、神经 退行性疾病、骨质疏松症等骨退行性变疾病、肥厚型心肌病或阿尔茨海默病等 疾病方面的应用。
[0005] 本发明上述目的是通过公开了以下技术方案予以实现的：
[0006] 人β3肾上腺素受体(ADRB3)作为检测G0期细胞、肿瘤细胞、人髓源性 抑制细胞(MDSC)、造血干细胞、淋巴系祖细胞、淋巴细胞、髓系祖细胞、髓 系细胞、破骨细胞或小胶质细胞的标志物的应用。特别是作为检测原始粒细胞、 早幼粒细胞、中幼粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤 相关巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞、调节性T细胞、异型淋巴细胞、T细胞、 B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞、浆细胞、原始淋巴细胞或幼稚淋巴细胞的标 志物的应用。
[0007] 人β3肾上腺素受体作为肿瘤(恶性肿瘤)、炎症(机体慢性系统性炎症)、 脓毒症、哮喘、糖尿病、多器官功能障碍综合征、病毒感染性疾病、衰老性疾 病、贫血、严重创伤、过敏性疾病、恶病质疾病、中毒性疾病、自身免疫性疾 病、器官移植免疫排斥、肺动脉高压、急性冠脉综合征、心脑血管疾病(如动 脉粥样硬化)、骨退行性变、MDSC相关性疾病、肥厚型心肌病或神经退行性 疾病(如阿尔茨海默病)的诊断标志物或治疗靶点的应用。
[0008] 人β3肾上腺素受体作为检测诊断肿瘤细胞恶性程度、肿瘤病情程度、肿瘤 大小、分期、转移情况、以及预后和疗效的标志物，评价细胞增殖能力和/或细 胞分化能力的标志物，和评价特异免疫功能和/或衰老程度的标志物的应用。
[0009] 制备抗人β3肾上腺素受体的单克隆抗体的多肽片段，包括但不限于以下多 肽：人ADRB3全长蛋白、ADRB3蛋白的N端1-155位氨基酸残基片段、ADRB3 蛋白的C端156-408位氨基酸残基片段、ADRB3蛋白中的296-317位氨基酸的 亮氨酸拉链片段、ADRB3蛋白中的351-369位氨基酸的核定位序列、ADRB3蛋 白中的1-36位氨基酸的E1片段、ADRB3蛋白中的101-
111位氨基酸残基的E2 片段、ADRB3蛋白中的134-155位氨基酸的I2片段、ADRB3蛋白中的
315-326 位氨基酸的E4片段、ADRB3蛋白中的348-408位氨基酸的I4片段、344-349位 的氨基酸残基片段、143-148位的ITIM1片段、140-146位的ITIM1片段、202-207 位的ITIM2片段、
199-204位的ITIM2片段、212-217位的ITIM3片段。
111位氨基酸残基的E2 片段、ADRB3蛋白中的134-155位氨基酸的I2片段、ADRB3蛋白中的
315-326 位氨基酸的E4片段、ADRB3蛋白中的348-408位氨基酸的I4片段、344-349位 的氨基酸残基片段、143-148位的ITIM1片段、140-146位的ITIM1片段、202-207 位的ITIM2片段、
199-204位的ITIM2片段、212-217位的ITIM3片段。
[0010] 抗人ADRB3单克隆抗体在调控肿瘤细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞、髓 源性抑制细胞、调节性T细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞的增殖和分化中的应 用。起到抗癌、抗炎、逆转肿瘤免疫耐受的作用。
[0011] 抗人ADRB3单克隆抗体在制备治疗P62，HK2，GAPDH，VEGF，Cyclin D1， CDK3，CDK4，Rb，Ki-67，mTOR，Rictor，AKT，Tubulin，TRAF6，PD-L1， P53，P63，IL-2，IL-6，IL-10，TGFβ或TNFa信号通路相关疾病的药物中的应 用。
[0012] 抗人ADRB3单克隆抗体在制备治疗肿瘤、炎症(机体慢性系统性炎症)、 脓毒症、哮喘、糖尿病、内毒素血症、感染性休克、多器官功能障碍综合征、 急性化脓性感染、再生功能障碍导致的疾病、病毒感染性疾病、淋球菌感染、 衰老性疾病、贫血、严重创伤、过敏性疾病、恶病质疾病、中毒性疾病、自身 免疫性疾病、器官移植免疫排斥、肺动脉高压、急性冠脉综合征、心脑血管疾 病(如动脉粥样硬化)、骨退行性变、肥厚型心肌病、MDSC相关性疾病、神 经退行性疾病(如阿尔茨海默病)或精神疾病的药物，或在制备延缓衰老和/ 或调控恢复免疫系统功能(包括非特异免疫和特异免疫)的药物中的应用。
[0013] 抗人ADRB3单克隆抗体在作为或制备治疗恶性肿瘤药物、抑制肿瘤转移药 物、治疗不孕不育药物、抗病毒疫苗、抗肿瘤疫苗、治疗血栓栓塞性疾病药物、 抗血小板药物、抗粒细胞药物、化疗药物增敏剂、止血药物、降血压药物、治疗 酒精和毒品成瘾的药物、补体拮激动剂、免疫佐剂、双特异性抗体、诱导分化剂、 肿瘤多药耐药逆转剂、器官移植免疫抑制剂、去乙酰化酶抑制剂、弹性蛋白酶抑 制剂中的应用。
[0014] 抗人ADRB3单克隆抗体在判断恶性肿瘤预后和监测治疗效果中的应用。
[0016] 抗人ADRB3单克隆抗体在调控心脏、肝脏、骨髓、胰腺、脑、神经、肾脏、 肺、肌肉等组织的再生中的应用。
[0017] 抗人ADRB3单克隆抗体在调控糖酵解、自噬、核仁功能、核糖体合成、溶 酶体功能、线粒体功能、细胞骨架中的应用。
[0018] 抗人ADRB3单克隆抗体作为涂层药物在制备药物洗脱支架或洗脱球囊方面 的应用。
[0019] 抗人ADRB3单克隆抗体在鉴定、筛选G0期细胞中的应用。
[0020] 抗人ADRB3单克隆抗体在调控肿瘤细胞、干细胞、粒细胞、单核-巨噬细胞 和淋巴细胞的细胞周期和有丝分裂功能中的应用。
[0021] 抗人ADRB3单克隆抗体在诊断恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症、Treg相 关性疾病等疾病中的应用。具体地，可利用ADRB3抗体检测血液、脑脊液、胸 水和腹水等体液中的可溶性ADRB3，用于诊断恶性肿瘤等。
[0022] 抗ADRB3嵌合抗原受体修饰后的T淋巴细胞在制备治疗恶性肿瘤、自身免 疫性疾病、炎症、动脉粥样硬化、病毒感染、神经退行性疾病(如阿尔茨海默 病)或衰老性疾病药物中的应用。
[0023] 抗ADRB3嵌合抗原受体修饰后的巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞或粒细 胞在作为或制备治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、炎症、病毒 感染、神经退行性疾病或衰老性疾病的药物中的应用。
[0024] 抗人ADRB3单克隆抗体，该抗体选自：
[0025] (1)由2015年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号 为CCTCC No：C2015146的杂交瘤细胞系5D1产生的单克隆抗体；保藏单位地 址为中国.武汉.武汉大学。
[0026] (2)由2016年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏 号为CCTCC No：C2016202的杂交瘤细胞系5B8产生的单克隆抗体；保藏单位 地址为中国.武汉.武汉大学。
[0027] (3)由2015年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号 为CCTCC No：C2015147的杂交瘤细胞系4G7产生的单克隆抗体；保藏单位地 址为中国.武汉.武汉大学。
[0028] (4)由2016年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏 号为CCTCC No：C2016203的杂交瘤细胞系5D9产生的单克隆抗体；保藏单位 地址为中国.武汉.武汉大学。
[0029] (5)具有由杂交瘤细胞系5D1、5B8、4G7或5D9产生的单克隆抗体的结 合特性的单克隆抗体；
[0030] (6)与能结合由杂交瘤细胞系5D1、5B8、4G7或5D9产生的单克隆抗体 的表位结合的单克隆抗体；
[0031] (7)在竞争性结合测定中与由杂交瘤细胞系5D1、5B8、4G7或5D9产生 的单克隆抗体竞争的单克隆抗体；
[0032] (8)能特异性结合ADRB3的兔单克隆抗体、鼠源性、嵌合性、全人源性 抗体、单域抗体、单链抗体、Fab抗体片段、合成抗体；
[0033] (9)与下述ADRB3抗原表位中的一个或几个结合从而调控ADRB3蛋白 活性的抗ADRB3抗体：
[0034] S212，S239，S349，C110，C189，T65，T140，S191，Y336，Y346，K151， R152，C153，P343，P350，P368，P369，P371，P377，P381，P391，P394，H190， H288，N8，N26，T150，T108，T114，G41，G106，G146，G271，G295，G383， G402，C275，C363，Y145，Y145，Y204，Y214，Y236，Y346；包括但不限于 上述表位；其中，S：丝氨酸，C：半胱氨酸，T：苏氨酸，Y：酪氨酸，K：赖 氨酸，R：精氨酸，C：半胱氨酸，P：脯氨酸，H：组氨酸，N：天冬酰胺；
[0035] (10)特异性结合ADRB3的抗体，其包含：
[0036] a)包含下列的重链互补决定区：
[0037] i)含有与SEQ ID NO：1、4、7、10具有至少70％的序列同一性的氨基酸 序列的第一互补决定区；
[0038] ii)含有与SEQ ID NO：2、5、8、11具有至少80％的序列同一性的氨基 酸序列的第二互补决定区；
[0039] iii)含有与SEQ ID NO：3、6、9、12具有至少80％的序列同一性的氨基 酸序列的第三互补决定区；和
[0040] b)包含下列的轻链互补决定区：
[0041] i)含有与SEQ ID NO：13、16、19、22具有至少80％的序列同一性的氨 基酸序列的第一互补决定区；
[0042] ii)含有与SEQ ID NO：14、17、20、23具有至少80％的序列同一性的氨 基酸序列的第二互补决定区；和
[0043] iii)含有与SEQ ID NO：15、18、21、24具有至少80％的序列同一性 的氨基酸序列的第三互补决定区；
[0044] c)人源化抗体的重链可变区(variable region,V区)包含与SEQ ID NO： 25具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列；和/或
[0045] d)人源化抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO：26具有至少70％的序列 同一性的氨基酸序列。
[0046] 另外，具有ADRB3激活作用的ADRB3抗体、ADRB3激动剂或利用基因重 组技术生产的人ADRB3蛋白在制备促进细胞融合的诱导剂中的应用，以及在制 备促进白细胞生长剂中的应用，也都在本发明的保护范围之内。
[0047] 能够产生与上述ADRB3抗原表位中的一个或几个结合从而调控ADRB3蛋 白活性的抗ADRB3抗体的杂交瘤细胞株，也在本发明的保护范围之内。
[0048] 具体优选地，所述杂交瘤细胞株包括以下四株：
[0049] 一株杂交瘤细胞株5D1，于2015年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为CCTCC No：C2015146。保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
[0050] 一株杂交瘤细胞株5B8，于2016年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为CCTCC No：C2016202。保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
[0051] 一株杂交瘤细胞株4G7，于2015年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为CCTCC No：C2015147。保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
[0052] 一株杂交瘤细胞株5D9，于2016年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为CCTCC No：C2016203。保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
[0053] 具体地，本发明通过大量的研究和探索，公开了ADRB3及抗ADRB3多克 隆抗体的以下作用和应用：
[0054] 本发明公开了ADRB3是新的免疫调节受体和肿瘤标记物，公开了ADRB3 的生理功能和在疾病病理机制中的作用，同时公开了抗人ADRB3单克隆抗体及 其应用。本发明中的抗体特异性针对人ADRB3的氨基酸序列，该抗体能够特异 性结合ADRB3并调节其生物学活性。该抗体调节肿瘤细胞、造血干细胞、髓系 祖细胞、淋巴系祖细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单核-巨噬细胞的分化和功能， 起到抗癌、抗炎症、逆转肿瘤免疫耐受的作用。本抗体能诱导T淋巴细胞(T细 胞)的分化成熟，恢复其凋亡能力，增强特异免疫功能。本抗体还能诱导肿瘤细 胞分化，抑制其增殖，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体 依赖性细胞毒性作用(CDC)和直接作用(包括阻断细胞周期、抑制核糖体合成、 降低线粒体膜电位、诱导凋亡、抑制线粒体自噬、抑制磷酸戊糖途径、抑制糖酵 解、减少酮体合成和降低脂代谢等机制)来杀伤肿瘤细胞。本发明的抗体通过小 鼠杂交瘤技术而获得并经过人源化改造。本发明公开了这些抗体的抗原表位和生 产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中杂交瘤细胞株包括但不限于5D9和5B8， 于2016年12月12日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO：C2016203和CCTCC NO：C2016202，杂交瘤细胞能够分泌ADRB3 单克隆抗体。本发明涉及的ADRB3抗体“变体”的氨基酸序列含有一个或多个相 对于所述序列而言的“保守”氨基酸改变，优选的抗体构架及恒定域为人类构架和 人类恒定域。本发明公开了该抗体的应用及其检测试剂盒的开发，抗人ADRB3 单克隆抗体可以用于免疫印迹、荧光原位杂交技术、免疫沉淀、免疫组化、酶联 免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光、磁珠分选、免疫胶体金检测和流式细胞术等免 疫学实验，定量和定性检测人血清、人组织细胞、人体分泌物和人细胞培养物中 可溶性ADRB3蛋白或ADRB3蛋白片段。本发明的抗人ADRB3单克隆抗体可 用于激活或阻断ADRB3的作用。
[0055] 本发明公开了ADRB3是新的免疫编辑因子和肿瘤标记物，ADRB3调节免 疫细胞的寿命和免疫应答，在免疫抑制性的调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)、髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、肿瘤浸润 性中性粒细胞(tumor infiltrating neutrophils，TINs)和很多类型的癌细胞中表达。 ADRB3存在膜性和可溶性两种形式，检测组织细胞和体液中ADRB3的含量有 助于预测治疗效果、疗法适用性和疾病诊断。机体免疫系统能够改变肿瘤细胞、 病原体感染的细胞和老化细胞等异常细胞的表型，降低其免疫原性和危险性，缺 乏免疫原性和危险信号的细胞不能被免疫系统识别，逃避机体免疫攻击，这一过 程称为免疫编辑。免疫编辑加重癌细胞的恶性程度，促进癌细胞发生远处转移。 免疫编辑是双向的过程，肿瘤细胞被编辑的同时，还会影响免疫系统。肿瘤的 ADRB3信号分子使免疫系统生成大量的中性粒细胞，这通常是炎症反应的一部 分，但ADRB3改变中性粒细胞行为，使中性粒细胞不去消灭肿瘤，反而保护肿 瘤免受T细胞杀伤。本发明人发现，肿瘤细胞和病毒诱导淋巴细胞、粒细胞等免 疫细胞高表达ADRB3，ADRB3保护免疫细胞免于死亡，阻滞免疫识别所需的危 险信号的释放，使肿瘤细胞和病毒不被免疫系统识别而避免被清除。ADRB3抗 体阻断ADRB3信号通路，“定点”清除表达诱导型ADRB3的免疫细胞，恢复淋 巴细胞的正常死亡和凋亡，使免疫系统能够识别并清除病原体、癌细胞，维持人 体的健康。
[0056] ADRB3在低分化的细胞中大量存在，特别是在幼稚型的免疫细胞和癌细胞 的细胞核中表达。分化成熟的细胞中仅在胞浆和膜上有微量ADRB3，细胞核中 几乎没有。ADRB3在肿瘤中过度表达并通过阻滞淋巴细胞分化来抑制T细胞对 肿瘤的攻击。ADRB3阻滞免疫细胞和癌细胞的分化，促进低分化的淋巴细胞增 殖，防止淋巴细胞死亡或凋亡。ADRB3是诱发癌症和促进肿瘤进展的关键蛋白。 与CTLA-4、PD-1等免疫检查点蛋白不同，ADRB3是诱导型蛋白，在正常细胞 中很少存在，而在病理情况下存在于肿瘤细胞和肿瘤微环境中的免疫细胞， ADRB3促进形成肿瘤增殖的免疫微环境。PD-1或CTLA-4基因敲除小鼠会出现 严重的自身免疫性疾病，ADRB3基因敲除小鼠不会患癌症、动脉粥样硬化、老 年痴呆和自身免疫病，寿命显著延长。作为抗癌药，ADRB3抗体优于化疗药物 (如阿霉素)和免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitor，ICI)。化疗 药物作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，无选择性地杀伤增殖能力强的肿瘤 细胞和正常细胞，但对休眠期的癌细胞无效。ICI抑制淋巴细胞凋亡，其杀伤肿 瘤的能力不尽人意而且引起自身免疫病。采用化合物抑制剂或中和抗体阻断 ADRB3信号通路可有效抑制肿瘤生长，能够杀伤增殖期和休眠期的癌细胞，诱 导肿瘤细胞和幼稚型淋巴细胞分化成熟。既能降低肿瘤的恶性程度，也能恢复免 疫细胞的抗癌功能。由于正常淋巴细胞和组织细胞几乎没有ADRB3，本抗体不 会损伤正常的免疫系统和组织，是高效、广谱、低毒、靶点特异的抗癌药物。
[0057] 肿瘤细胞产生并释放ADRB3，对免疫细胞进行免疫编辑，抑制T细胞、NK 细胞和中性粒细胞的功能，使肿瘤逃避免疫监视。交感神经-肾上腺髓质通过 ADRB3调控免疫编辑，ADRB3是维持神经-内分泌-免疫网络稳态的关键蛋白， 疾病和衰老是神经-内分泌-免疫网络自稳调节紊乱而发生的异常生命活动。 ADRB3抗体抑制ADRB3活性以及该蛋白介导的免疫编辑，使免疫系统重新识 别并清除肿瘤细胞、病原体感染的细胞和老化细胞，本抗体具有抗癌、抗炎、促 进再生、抗衰老的作用。
[0058] 本发明公开了ADRB3是一种新的淋巴细胞抑制分子，ADRB3有3个免疫 受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif,ITIM)，ITIM 氨基酸序列如下：ITIM 1：(143)LRYGAL(148)或(143)LRYGTL(148)或(140) LRYRAV(146)；ITIM 2：(202)IPYALL(207)或(202)MPYVLL(207)或 (199)VPYALL(204)；ITIM 3：(212)SFYLPL(217)。ADRB3抑制淋巴 细胞分化成熟和自我识别，使淋巴细胞不能清除老化和受损的细胞，对自身正常 细胞产生免疫杀伤。T细胞活性受到ADRB3的调控，病毒感染或肿瘤都会通过 增强T细胞ADRB3信号通路而抑制免疫应答，使T细胞无法清除慢性感染细胞 和肿瘤细胞。与淋巴细胞的固有免疫抑制分子如CD28家族蛋白不同，ADRB3 是疾病诱导性表达。正常情况下，淋巴细胞膜上有少量ADRB3。在肿瘤、病毒 感染、自身免疫病等病理状态下，固有免疫细胞(如中性粒细胞)或肿瘤细胞诱 导淋巴细胞大量产生ADRB3，从胞浆穿梭入核及核仁，影响淋巴细胞的表观遗 传学，调控基因表达，增强核仁功能，改变淋巴细胞表型，促进抑制性淋巴细胞 的增殖，抑制特异免疫而加速疾病进展。ADRB3对淋巴细胞的免疫抑制作用会 反馈性增强固有免疫细胞的活性，特别是中性粒细胞和巨噬细胞，导致机体处于 炎症状态。肿瘤、病毒增加淋巴细胞的诱导型ADRB3表达，阻止淋巴细胞凋亡， 而死亡的淋巴细胞对于免疫系统来说是危险信号，死亡的免疫细胞使处于静息状 态的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)转变成激活态，进而提呈抗原 而激活T细胞，起到抗癌和清除病原体的作用。ADRB3抗体杀死高表达诱导型 ADRB3的粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，释放危险信号，激活特异免疫系统， 恢复淋巴细胞的抗癌功能。ADRB3抗体特异性清除含有诱导型ADRB3的“致病 性”淋巴细胞，不损伤正常的淋巴细胞，恢复淋巴细胞的正常死亡和凋亡，使免 疫系统正常化，避免发生自身免疫。ADRB3抗体治疗机制保证了本抗体在临床 中的广泛用途。
[0059] 本发明公开了过度表达或者功能增强的ADRB3引起癌症、自身免疫病和衰 老。过度活化的ADRB3干扰天然免疫对特异免疫的调控，造成淋巴细胞“重编 程”而去分化为无功能的幼稚细胞，淋巴细胞不能识别异己与自我组织，使肿瘤 细胞逃逸免疫和引起自身免疫病。阻断ADRB3信号通路后，能恢复免疫正常化， 使T细胞清除癌细胞和老化细胞，避免自身免疫损伤。ADRB3是联系天然免疫 与特异性免疫的关键环节，ADRB3增强中性粒细胞和巨噬细胞引起的天然免疫 反应，刺激淋巴细胞增殖。本发明人发现，携带鼠乳腺癌病毒的MMTV-PyVT 小鼠剔除ADRB3基因后，不会产生乳腺肿瘤。ADRB3基因敲除小鼠寿命延长， 不发生自身免疫病和癌症，外源性肿瘤细胞亦无法在其体内生长。ADRB3基因 敲除小鼠血清中的炎性因子如IL-4、IL-6水平明显降低，粒细胞数量减少。本发 明人研制了阻断人ADRB3的单克隆抗体并用于治疗肿瘤和自身免疫病。ADRB3 抗体增强小鼠的特异性抗肿瘤反应，减轻系统性炎症。ADRB3抗体治疗4T1乳 腺癌细胞荷瘤小鼠，抑制原位瘤的增殖和远处转移，减少中性粒细胞、MDSC和 Treg，激活补体、NK细胞和CD8+T细胞的抗癌活性，降低中性粒细胞-淋巴细 胞比值(NLR)，发挥抗癌和抗炎作用。ADRB3抗体在体外刺激人淋巴细胞分 化，诱导产生具有抗癌活性的CD8+T细胞。
[0060] 本发明公开了一种新的调控固有免疫和特异免疫的机制，即交感神经-肾上 腺髓质首先激活粒细胞和单核-巨噬细胞中组成性表达的ADRB3来活化固有免 疫细胞，然后促进淋巴细胞诱导性表达ADRB3来抑制淋巴细胞的活化。焦虑、 抑郁等高水平的心理压力通过ADRB3来降低机体的免疫功能，增加患癌、糖尿 病、动脉粥样硬化、老年痴呆等疾病的风险。ADRB3异常活化将造成固有免疫 和特异免疫系统的紊乱，表现为以中性粒细胞为代表的髓系细胞过度激活，而淋 巴细胞不能活化，中性粒细胞数量和占白细胞的百分比均升高，增高NLR，引 起机体慢性系统性的炎症。ADRB3介导的炎症是自身免疫病、肿瘤、动脉粥样 硬化、阿尔茨海默病和衰老的共同病理机制。肿瘤的病理过程最为典型，早期原 位癌阶段主要是ADRB3活化局部组织中的中性粒细胞和巨噬细胞，上调炎性因 子水平，癌组织在局部浸润性生长；如果ADRB3的活性持续亢进，粒细胞、脾 脏、肝脏、肿瘤细胞分泌可溶性ADRB3，诱导淋巴细胞表达ADRB3。淋巴细胞 中的ADRB3改变表观遗传修饰，抑制淋巴细胞分化成熟，引起肿瘤远处转移。 在肿瘤发展过程中，固有免疫细胞ADRB3的异常要早于特异免疫细胞的异常， 固有免疫细胞抑制淋巴细胞的免疫识别功能。目前肿瘤免疫治疗主要是增强淋巴 细胞介导的特异免疫功能，没有理想的靶点来调控固有免疫细胞，导致抗癌效果 差并易引起自身免疫病。ADRB3抗体能够解除中性粒细胞、巨噬细胞对淋巴细 胞的抑制作用，恢复淋巴细胞对肿瘤的免疫识别。ADRB3抗体升高淋巴细胞在 白细胞中的百分比，降低NLR，起到抗炎、抗癌的作用，避免自身免疫病的发 生。
[0061] 肿瘤细胞诱导淋巴细胞高表达ADRB3，促进细胞膜和胞浆的ADRB3穿梭 入核，使淋巴细胞逃逸死亡。肿瘤免疫治疗的关键是恢复淋巴细胞正常死亡或凋 亡，死亡的淋巴细胞能发挥其最大的免疫功能。现有的肿瘤免疫治疗方法多是增 加T细胞增殖，防止T细胞凋亡，早期可能有效，但往往复发。本发明提出新 的肿瘤免疫治疗策略，即诱导T细胞死亡，但要准确控制T细胞死亡的数量。 ADRB3抗体从小剂量开始应用，一旦观察到肿瘤缩小或中性粒细胞数量低于1， 000/mm3，即可减量或停用，防止过量的ADRB3抗体损伤正常的T细胞。
[0062] 增加淋巴细胞的ADRB3表达量，能防止淋巴细胞死亡，减少危险信号，起 到诱导免疫耐受的作用，防止发生器官移植后的免疫排斥反应。ADRB3激动剂 和利用基因重组技术生产的人ADRB3蛋白药物可以作为免疫抑制剂，用于治疗 移植物抗宿主病、排斥反应、过敏性疾病。采用ADRB3重组蛋白预处理移植物， 能够预防和减轻排斥反应。对于因宿主炎症亢进而导致的移植物排斥反应，应用 ADRB3抗体通过抗炎而起到减轻排斥反应的作用。
[0063] ADRB3表达于T细胞、B细胞、NK细胞、APC和肿瘤细胞膜，整合抑制 性信号，调控淋巴细胞的活化。癌细胞和APC的表面和胞内存在大量圆锥型的 “ADRB3分形”结构，“ADRB3分形”维持免疫细胞与肿瘤细胞的黏附界面，使它 们能够牢牢结合。圆锥型的ADRB3复合物始于细胞膜，贯穿胞浆，延伸到细胞 核，形成一条通道。细胞外的物质如神经递质、病原体等利用该通道进入细胞核， 调控细胞DNA复制和基因表达，影响细胞的分化和增殖。ADRB3抗体破坏免 疫细胞与肿瘤细胞的黏附，阻滞肿瘤细胞对APC的免疫编辑。ADRB3调节免疫 突触的形成和信号转导，募集其他的免疫信号分子(例如PD-1)并传递信号。 ADRB3信号通路向胞内传递抑制性信号，对T细胞、B细胞的活化起负调节作 用。ADRB3分别在初始T细胞的初级反应阶段和活化阶段、记忆性T细胞的再 次反应阶段起到重要的负调控作用。高表达ADRB3基因的效应性T细胞具有抗 凋亡能力而存活下来，发育为记忆性T细胞。ADRB3促进CD4+T细胞增殖，增 强Treg的活性，抑制CD8+T细胞的活化，导致淋巴细胞不能清除癌细胞、病原 体感染的细胞和老化细胞，引起恶性肿瘤、动脉粥样硬化、自身免疫疾病、阿尔 茨海默病和衰老。
[0064] 本发明人发现ADRB3参与抗原加工处理及提呈过程，调节机体的免疫识别 与免疫应答。ADRB3聚集在APC和淋巴细胞相互接触的部位，有利于细胞间粘 附复合物稳定，促进树突状细胞、巨噬细胞和粒细胞粘附到淋巴细胞。APC中 的ADRB3参与处理抗原，导致处理后的肿瘤抗原信息丢失而不能被淋巴细胞识 别。ADRB3通过以下机制来调节抗原处理过程：①.ADRB3具有乙酰化酶功能， 调控抗原信息的乙酰化修饰，乙酰化修饰后的肿瘤抗原不能保留其抗原性，不能 激活T细胞。②.ADRB3促进APC中含有抗原信息的内吞泡自噬。ADRB3促进 溶酶体成熟，含有抗原的内吞泡与溶酶体融合，加速内吞泡自噬性降解，清除肿 瘤的抗原信息，抑制特异免疫系统对肿瘤的免疫识别与应答。
[0065] 癌症病人的肿瘤细胞、淋巴细胞和粒细胞中ADRB3表达量均明显增加，抑 制T细胞活化所需的第二信号系统，T细胞变成免疫应答无能，使肿瘤逃避免疫。 肿瘤细胞能模仿APC而高表达ADRB3，ADRB3改变肿瘤细胞的表观遗传学修 饰，使肿瘤细胞具有与APC相似的基因表达谱而伪装成“APC”。由恶性程度低 的肿瘤细胞伪装而成的“APC”，不具有抗原提呈功能。由恶性程度高的肿瘤细胞 伪装而成的“APC”，不仅具有抗原提呈功能，还能抑制T细胞攻击癌细胞。除了 抑制淋巴细胞的功能外，ADRB3还能诱导癌细胞转变成为淋巴细胞，干扰特异 免疫系统的功能。癌症患者的淋巴细胞大量表达ADRB3，这些ADRB3+的淋巴 细胞可能由癌细胞分化而来，异型淋巴细胞更有可能是来源于癌细胞。
[0066] ADRB3定位在细胞膜、溶酶体、线粒体、核糖体、细胞核和核仁等不同细 胞器，调控所在细胞器的功能。ADRB3具备在胞浆合成后快速转运入核并且能 在核浆之间来回穿梭的特性，在胞核及胞浆之间充当运输载体及进行信号传递， 调控DNA复制和基因表达。核内的ADRB3促进G0期细胞进入增殖期，癌细 胞中的ADRB3多位于细胞核，提示ADRB3刺激癌细胞的恶性增殖。阻滞细胞 膜和胞浆ADRB3的入核能力，能够抑制癌细胞的增殖。ADRB3基因表达和蛋 白定位在恶性程度不同的肿瘤细胞中存在明显差异。在恶性程度低的癌细胞，ADRB3表达量少，大部分定位在细胞核，细胞膜上较少。恶性程度高的癌细胞， ADRB3大量表达，多分布在核仁、细胞浆和细胞膜，即刺激细胞增殖，又有利 于与免疫细胞接触而发挥免疫抑制作用。在肿瘤患者中，ADRB3通过以下途径 抑制淋巴细胞：①、APC吞噬肿瘤细胞后，肿瘤细胞来源的ADRB3在APC中 蓄积，诱导APC向淋巴细胞传递抑制性信号；②、肿瘤细胞膜上的ADRB3直 接接触并抑制淋巴细胞；③、肿瘤细胞分泌可溶性ADRB3或包含ADRB3的外 泌体，作为信号分子调节淋巴细胞。本发明中的ADRB3抗体拮抗ADRB3的免 疫抑制功能，ADRB3抗体与癌症病人免疫无能的淋巴细胞一起培养，可以解除 淋巴细胞的无能状态，重新恢复淋巴细胞的正常功能，起到治疗癌症的作用。
[0067] 本发明公开了一种新的调控细胞增殖和分化的机制，即交感神经-肾上腺髓 质系统激活细胞膜上的ADRB3来刺激细胞增殖并抑制分化，ADRB3在恶性肿 瘤细胞、髓系祖细胞、淋巴祖细胞、原始淋巴细胞、幼稚淋巴细胞和造血干细胞 的增殖中起到关键作用。本发明公开了ADRB3是评价细胞增殖能力的“增殖标 志物”，ADRB3越多，细胞的增殖能力越强。目前常用的增殖标志物是Mcm、 Ki-67和PCNA，此3种蛋白共同的缺点是不能在G0期细胞中表达，仅能在G1 中期后表达，这些标志物不能准确反映组织细胞的增殖能力，存在“诊断空隙”。 ADRB3的优势是在包括G1早期的整个增殖期和G0期都有表达，能更全面、准 确的反映细胞的增殖能力，是优于Mcm、Ki-67和PCNA的细胞增殖标志物。作 为评价细胞增殖能力的标志蛋白，ADRB3用于基础与临床研究，筛选药物，评 价人类疾病的动物模型，研究衰老、干细胞、应激、肿瘤、再生、细胞周期、 G0期的机制，是判断病人预后，指导诊断、治疗的有效工具。
[0068] 本发明公开了ADRB3是评价细胞分化能力的“分化标志物”，ADRB3越多， 细胞的分化能力越差。对于癌细胞来说，ADRB3越多，分化程度越低，恶性程 度越高。ADRB3是研究诱导分化药物的靶点蛋白，基于ADRB3，利用计算机辅 助药物设计和化合物库筛选苗头化合物，用于研制抗癌、抗病毒、抗炎、抗阿尔 茨海默病、抗动脉粥样硬化、抗心衰和抗衰老药物。
[0069] ADRB3存在于初始T细胞，接受交感神经直接调控，防止初始T细胞死亡。 但导致一些无功能和对自身细胞有杀伤作用的初始T细胞存活，引起自身免疫性 疾病。检测T细胞ADRB3含量，可以作为特异性免疫系统功能的重要指标。T 细胞中ADRB3含量越多，其抗原识别功能越差，更易于损伤正常组织细胞，ADRB3+T细胞是导致自身免疫的罪犯细胞。
[0070] 本发明公开了一种新的调控T细胞增殖和分化的机制，即交感神经-肾上腺 髓质系统激活造血干细胞和外周免疫器官T细胞的ADRB3来刺激T细胞增殖和 分化。ADRB3促进G0期的造血干细胞和T细胞进入细胞周期而发生有丝分裂。 正常情况下，交感神经-ADRB3通路调控成人T细胞增殖和分化，维持免疫系统 的稳态。病理情况下，过度活化的ADRB3导致成熟T细胞去分化或转分化而失 去特异免疫功能，引起自身免疫、变态反应等。
[0071] 青春期前的胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所，此后胸腺逐渐退化。成 年人的胸腺功能低下，骨髓中造血干细胞或前T细胞不能在胸腺内分化成为具有 免疫活性的T细胞，脾脏和肝脏是成人T细胞的发育场所。本发明公开了交感 神经-ADRB3信号通路调控成人脾脏和肝脏中的T细胞增殖和分化。脾脏和肝脏 特有NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的发育分化依赖于ADRB3调 控网络。在ADRB3正常情况下，脾不产生中性粒细胞。活性异常的ADRB3引 起脾产生大量中性粒细胞，抑制脾脏中的巨噬细胞及淋巴细胞的功能，巨噬细胞 的抗原提呈能力降低，辅助性T淋巴细胞的数量减少，抑制性T淋巴细胞数量 相对增高，不能清除衰老的血细胞、病原体和异物，导致肿瘤免疫抑制和人体衰 老。阻滞ADRB3，能够恢复脾脏淋巴细胞的特异免疫功能，延缓衰老。
[0072] ADRB3调控肝脏造血免疫组织的发育分化，促进肝脏产生粒细胞、淋巴细 胞、巨噬细胞、NK细胞和淋巴细胞，促进天然免疫细胞富集在肝脏。交感神经 -ADRB3信号通路活性亢进状态下，会上调肝脏的造血功能，增加中性粒细胞的 产生，引起自身免疫病和癌症。正常肝细胞中，大部分ADRB3分布在胞浆，少 部分位于细胞核。肝炎患者肝细胞浆ADRB3含量增加，ADRB3增加肝细胞核 糖体功能，促进肝脏合成C反应蛋白、补体、凝血因子，加重全身性炎症反应。 ADRB3刺激肝脏中炎性细胞浸润，高表达ADRB3的粒细胞、淋巴细胞、巨噬 细胞和NK细胞在肝组织中的数量均明显增多。肝癌和肝硬化患者中，肝细胞中 ADRB3含量增加，主要分布在细胞核，肝脏中ADRB3+粒细胞数量增加。核中 的ADRB3会唤醒G0期的肝细胞，进入增殖期，促进癌变。肝脏中ADRB3+粒 细胞是形成转移灶的环境细胞，ADRB3抗体抑制乳腺癌细胞的肝转移。ADRB3 抗体能够恢复肝脏的造血和免疫功能，抑制肝脏炎症，减少肝纤维化，用于治疗 肝炎和肝硬化。
[0073] ADRB3促进造血干细胞增殖，诱导造血干细胞分化为T细胞。ADRB3调 控T细胞增殖和分化的机制如下：①、肾上腺素和去甲肾上腺素激活G0期T细 胞膜上的ADRB3，活化P62/mTOR/AKT信号通路，增加Ki-67、CDK3、Cyclin D1等蛋白的合成，诱导成熟的T细胞发生“去分化”，进入增殖期。②、T细胞 膜上活化的ADRB3内陷入胞后，在胞浆中形成二聚体，暴露亮氨酸拉链结构域， 沿着微管被转运入核，结合到核DNA。胞浆中的ADRB3可以与c-Myc形成异 源二聚体，通过结合于启动子区的E盒结构对基因进行转录激活调控。③、 ADRB3具有乙酰化酶的功能，增加核小体H3组蛋白乙酰化修饰，改变细胞的 表观遗传状态，帮助解开紧密压缩的染色质，有利于增殖相关的基因转录。
[0074] 细胞有丝分裂结束后，ADRB3被泛素化降解，新生T细胞逐渐分化成熟。 如果ADRB3bright的降解受限，幼稚型ADRB3 T细胞(ADRB3强阳性的T细胞) 不能分化成熟，机体将处于特异免疫功能缺陷状态。ADRB3抗体封闭淋巴系祖 细胞和幼稚型T细胞膜上ADRB3的配体结合域，竞争性抑制儿茶酚胺对ADRB3 的活化，使淋巴细胞离开增殖期，诱导淋巴细胞进入G0期而发生分化，发育成 为具有清除癌细胞、病原体和老化细胞功能的成熟T细胞。
[0075] 本发明公开了淋巴细胞ADRB3表达量是衡量特异免疫功能和衰老程度的指 标，淋巴细胞ADRB3表达量越高，特异免疫功能越低下，机体的衰老程度越重， 死亡风险越高。
[0076] 本发明公开了检测血液中的淋巴细胞ADRB3表达量来筛查早期癌症病人。 正常人的成熟淋巴细胞不表达或少量表达ADRB3，表达量少于中性粒细胞。肿 瘤细胞和粒细胞诱导淋巴细胞表达ADRB3，抑制淋巴细胞的活化。如果淋巴细 胞的ADRB3表达量接近或超过中性粒细胞，并蓄积在细胞核和核仁中，该类细 胞为ADRB3bright淋巴细胞，说明细胞未分化或发生去分化，丧失抗癌功能。采 用ADRB3抗体，检测外周血中ADRB3高表达伴Ki-67阴性(ADRB3bright Ki-67-) 淋巴细胞，可以作为体检指标，用来筛查早期癌症病人。ADRB3bright Ki-67-淋巴 细胞占淋巴细胞总数的10％以上，提示为肿瘤高危人群或早期癌症患者。如果外 周血50％以上的淋巴细胞是ADRB3高表达伴Ki-67阳性(ADRB3bright Ki-67+)， 说明幼稚型淋巴细胞不能分化成熟，特异免疫功能严重缺陷，提示癌症进入进展 期。
[0077] 本发明公开了ADRB3是肿瘤标志物(tumor marker)，与正常细胞相比， 癌细胞ADRB3表达量显著增加。ADRB3表达量与病情严重程度、肿瘤大小或 分期有相关性；ADRB3浓度变化与治疗效果相关，浓度降低说明治疗有效；疾 病复发时ADRB3水平明显升高，检测ADRB3浓度可以预测复发。除了检测肿 瘤组织中的ADRB3表达量外，ADRB3抗体还能检测尿液、痰液、腹水、胸水、 脑脊液、支气管肺泡灌洗液中的脱落细胞的ADRB3表达量，适用于普通人群的 癌症筛查和癌症病人的诊断。
[0078] 本发明公开了检测肿瘤组织中的ADRB3融合基因和ADRB3基因突变、缺 失、插入、重复、染色体易位重排等，对于指导肿瘤病人的治疗具有重要的参考 价值。
[0079] ADRB3在造血干细胞、淋巴系祖细胞和淋巴细胞(B细胞、T细胞、NK细 胞)、髓系祖细胞和髓系细胞(红、粒、单核、巨核系细胞)、肿瘤细胞、破骨细 胞、小胶质细胞中表达量较高。特别是在原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞 (Tumor-associated macrophages,TAM)、肥大细胞、树突状细胞(DC)、异型淋 巴细胞(abnormal lymphocyte)、Treg、浆细胞、原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞中 均有ADRB3高表达。本发明公开了ADRB3是髓系细胞和幼稚型淋巴细胞的抗 原标志物，人体内的ADRB3主要在髓系细胞中表达，成熟淋巴细胞没有或有少 量ADRB3，但幼稚型淋巴细胞ADRB3表达升高。淋巴细胞和中性粒细胞的 ADRB3过度激活，抑制免疫监视和免疫防御，是多种疾病发生的基础。ADRB3 抑制髓系祖细胞和淋巴系祖细胞的分化，削弱了对抗癌细胞、病毒和其他病原微 生物的防御机制。癌细胞、病原微生物和老化细胞能够激活中性粒细胞和淋巴细 胞的ADRB3信号通路，刺激成熟的中性粒细胞和淋巴细胞发生去分化 (dedifferentiation)，变成低分化的幼稚或原始细胞，抑制免疫系统的监视、防 御、调控作用。ADRB3抗体阻滞ADRB3的免疫抑制功能，诱导肿瘤细胞、髓 系祖细胞和淋巴系祖细胞的分化，阻断成熟的中性粒细胞和淋巴细胞去分化，恢 复淋巴细胞、中性粒细胞和补体系统的正常功能。
[0080] 细胞分化功能障碍是大多数疾病如肿瘤、心血管病、炎症和衰老发生的根本 原因。肿瘤的本质是细胞分化功能障碍，但表现为恶性增殖，治疗肿瘤的关键是 恢复癌细胞的分化能力。本发明人发现ADRB3是调控分化的关键蛋白，阻滞 ADRB3后，恢复肿瘤细胞的分化能力，分化为正常或接近正常的细胞。
[0081] 淋巴细胞分化缺陷导致的功能低下是产生恶性肿瘤和自身免疫病的基础。心 肌细胞、神经元等分化障碍会导致心功能衰竭和神经退行性病变。重要脏器的分 化功能缺陷是衰老产生的关键因素。本发明人提出关于衰老和疾病产生机制的 “二次分化障碍打击”假说，疾病的发生是由于细胞分化缺陷而产生了无功能的细 胞，这是第一次“分化障碍打击”。免疫系统正常情况下，可以清除无功能的细胞 而使机体不发病。但如果免疫细胞的分化出现障碍，引起机体免疫功能缺陷，免 疫细胞不能清除由第一次“分化障碍打击”所产生的肿瘤细胞、老化细胞和无功能 细胞，将导致第二次“分化障碍打击”而发病。本发明人发现心肌梗塞后，坏死心 肌浸润大量ADRB3高表达的炎细胞，阻碍心脏干细胞向成熟型心肌细胞的分化， 而发生不完全分化，成为幼稚型心肌细胞和成纤维细胞，导致心肌重构和心衰。 ADRB3基因敲除的小鼠结扎左冠状动脉前降支，制造心梗后心衰模型，与 ADRB3野生型小鼠比较，ADRB3-/-小鼠的左室射血分数(LVEF)显著升高，心肌 重构不明显。与青壮年ADRB3-/-小鼠(10～30周龄)相比，老年小鼠(70周龄) 的LVEF没有明显降低，部分70周龄的ADRB3-/-小鼠LVEF甚至高于10周龄 小鼠。本发明人构建了Apo E和ADRB3双基因敲除小鼠，用高脂饲料喂养，发 现Apo E和ADRB3双基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的数量明显少于Apo E敲 除小鼠。双敲小鼠的学习记忆能力强于Apo E敲除小鼠，寿命也明显延长。本发 明人发现，人肿瘤组织中浸润大量ADRB3高表达的粒细胞、巨噬细胞和淋巴细 胞，这些炎细胞通过直接接触癌细胞和释放ADRB3的形式，诱导癌细胞大量表 达ADRB3，加重癌细胞的分化障碍，增加癌细胞的恶性程度，引起远处转移和 耐药。综上所述，敲除ADRB3基因或采用中和抗体阻滞ADRB3，可以恢复组 织细胞和免疫细胞的分化功能，避免二次“分化障碍打击”，利用人体的免疫细胞 来清除病原微生物、癌细胞和受损的组织细胞。
[0082] 本发明公开了ADRB3诱发细胞融合(cell fusion)，ADRB3激动剂和利用基 因重组技术生产的人ADRB3蛋白药物可以作为促进细胞融合的诱导剂，用于体 细胞杂交、动植物远缘杂交育种、淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。具有亮 氨酸拉链(leucine zipper)结构域的ADRB3能够拉近独立的生物膜，继而促使 膜合为一体，有利于不同种类细胞间的生物膜融合而促进组织器官的形成。在线 粒体等细胞器的形成、原核细胞向真核细胞、单细胞生物向多细胞生物进化的过 程中，ADRB3起到了重要作用。ADRB3促进不同蛋白融合，如促进与早幼粒细 胞白血病相关的PML-RARα融合蛋白形成。ADRB3基因与其他原癌基因的融合 会促进肿瘤的进展。ADRB3介导的细胞融合引起染色体不稳定，细胞融合造成 的中心体过多(3个及以上)会导致三或四极有丝分裂或分裂时间延长。本发明人 发现ADRB3增加中心体的数量(图14B)，增加多倍体形成。ADRB3介导的 细胞融合有助于肿瘤的形成，巨噬细胞、中性粒细胞或淋巴细胞通过高的ADRB3 融合能力，在肿瘤细胞融合中具有重要作用。ADRB3诱导粒细胞与癌细胞融合， 增加癌细胞的异质性和表型不稳定性，产生比亲本更具恶性的细胞，加快肿瘤转 移，使癌细胞耐药。在病毒(如人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 HTLV-1、EBV)介导的细胞融合过程中，ADRB3起到关键作用。ADRB3抗体 能够阻滞病毒介导的细胞融合。
[0083] 本发明人发现活化的ADRB3会使细胞发生去分化，改变基因表达谱和表观 遗传修饰，转变细胞表型。ADRB3有亮氨酸拉链结构域，具有结合DNA和RNA 的能力，也能介导各种转录因子的二聚或多聚化。ADRB3与其它转录因子形成 寡聚体，结合到基因的启动子，激活或抑制靶基因的转录。细胞膜上活化的 ADRB3内陷进入胞浆，形成同源或异源二聚体，具有乙酰基转移酶功能的 ADRB3结合到3000余个基因(基因组约12％基因)的启动子，调控核小体组蛋 白的乙酰化状态，促进与细胞增殖相关的基因转录，刺激肿瘤细胞、淋巴系祖细 胞和髓系祖细胞的增殖而抑制分化成熟。
[0084] 本发明公开了一类在细胞核中高表达ADRB3分子的淋巴细胞，该型淋巴细 胞不表达或低表达髓系细胞的标志蛋白--髓过氧化物酶(myeloperoxidase， MPO)，具有向髓系细胞分化的潜能。本发明人将该型细胞命名为MPOdim/- ADRB3+淋巴细胞，该型淋巴细胞是淋巴系祖细胞或原始淋巴细胞。MPOdim/- ADRB3+淋巴细胞的增殖和分化受到ADRB3的调控，当ADRB3活性或表达量 增加时，该型淋巴细胞将向髓系细胞分化，表现为MPO的表达增加，细胞核发 生粒细胞样改变，核型为肾形、分叶状、不规则形。ADRB3诱导MPOdim/-ADRB3+淋巴细胞向髓系细胞分化而减少淋巴细胞，导致中性粒细胞和巨噬细胞数量增 加，引起T细胞耗竭。
[0085] MPOdim/-ADRB3+淋巴细胞具有免疫抑制功能，交感神经系统通过ADRB3 调控该型细胞，维持固有免疫和适应免疫的平衡。正常人体内，MPOdim/-ADRB3+淋巴细胞数量较少，但在癌症、阿尔茨海默病、病毒性肝炎、自身免疫性疾病患 者和老年人的外周血、脾脏、肝脏和dim/- +骨髓中大量存在。MPO ADRB3淋巴细 胞刺激癌细胞增殖，且这种活性具有广谱性，对乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、 胶质瘤、黑色素瘤、白血病、肉瘤等都有促进增殖作用。MPOdim/-ADRB3+淋巴 细胞促进肝炎病毒、艾滋病病毒等病毒的感染和复制。ADRB3抗体抑制 MPOdim/-ADRB3+淋巴细胞的功能，阻断其向髓系细胞转分化，促进其分化为成 熟的淋巴细胞。
[0086] 本发明公开了ADRB3诱导外周血和骨髓中的CD4或CD8单阳性T细胞去 分化为CD4+CD8+双阳性(double positive，DP)T细胞，ADRB3抑制DPT细胞 凋亡并促进DPT细胞增殖，增加其在血液中的含量。在老年人、病毒感染、肿 瘤、自身免疫病患者中，外周血CD4+CD8+DPT细胞显著增加。ADRB3抗体阻 滞DPT细胞增殖而减少其数量，适用于治疗因DPT增加而导致的疾病和衰老。
[0087] 本发明公开了ADRB3促进CD8+T细胞跨系转分化(trans-differentiation) 为髓系细胞中的MDSC和中性粒细胞。ADRB3一方面减少体内CD8+T细胞数 量，造成CD8+T细胞耗竭；另一方面增加Treg、MDSC和中性粒细胞在血液、 骨髓、脾脏和淋巴结内的比例和数量，引起全身性炎症。
[0088] 本发明公开了ADRB3增加异型淋巴细胞的增殖，异型淋巴细胞核发生粒细 胞样改+变，表现为肾形、分叶状、不规则形，该异型淋巴细胞的特征是高表达 ADRB3。ADRB3异型淋巴细胞是引起恶性肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病、 动脉粥样硬化、老年痴呆和衰老的原因之一。ADRB3抗体减少ADRB3+异型淋 巴细胞数量，抑制其功能。
[0089] 本发明公开了ADRB3是一种新的B细胞表面分子，ADRB3调控B细胞增 殖、分化、凋亡与免疫应答，ADRB3表达在B细胞和浆细胞的胞质和细胞膜。 胞质含大量ADRB3的B细胞是一类新型B细胞，该B细胞亚群参与天然免疫 反应，具有促进免疫应答的作用，过度活化之后造成机体损害。
[0090] 本发明公开了一种鉴定浆细胞的方法，即采用ADRB3抗体做免疫荧光或免 疫组化，如果ADRB3大量蓄积在淋巴细胞的胞质中，该类细胞即为浆细胞。 ADRB3影响B细胞和浆细胞活性，增加相关表面标志如CD19的合成，促进浆 细胞合成自身抗体。ADRB3抗体可抑制B细胞产生免疫球蛋白，减少自身抗体 的合成，用于治疗自身免疫性疾病。
[0091] 本发明公开了ADRB3是一类模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，具有以下功能：①调理作用；②抑制补体活化；③吞噬和自噬作用；④启 动免疫细胞活化和炎性信号转导。ADRB3与病原体相关分子模式的相互识别和 作用是启动固有免疫应答的关键。ADRB3能够识别细菌的脂多糖(LPS)、脂蛋白 (BLP)、肽聚糖(PGN)、酵母菌的甘露聚糖等。ADRB3调控其他的模式识别受体 (如Toll受体、清道夫受体、甘露糖受体和C类凝集素)的活性与信号转导。ADRB3 调控由NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和肥大细胞等介导的天 然免疫应答。ADRB3是炎症前反应的重要受体，通过调控模式识别受体来识别 细菌、真菌及病毒成分，在病原体感染细胞过程中起着重要作用。ADRB3使病 原体能够在细胞中存活，机制如下：1.ADRB3促进自噬，而自噬促进胞内的病 毒、细菌或寄生虫等病原体复制和释放。2.ADRB3减少活性氧的产生，而活性 氧自由基能够杀灭外来病原体。3.细胞膜ADRB3介导细菌、真菌、病毒、寄生 虫等病原体的黏附、融合和进入，ADRB3是病毒-宿主细胞间膜融合的关键融合 蛋白。病原体进入宿主细胞后，在ADRB3的帮助下建立一种安全屏障—液泡 (vacuole)，能够逃脱溶酶体的消化。ADRB3抗体能清除细胞内的细菌、真菌、 病毒、寄生虫等病原体。
[0092] 非特异性免疫(固有免疫)是一切免疫防护能力的基础，能够启动和参与特 异性免疫(适应性免疫)应答。血液中可溶性ADRB3的含量，可以作为非特异 性免疫系统功能的重要指标。当前的免疫治疗药物大多是针对特异免疫细胞，忽 视了数量巨大的非特异免疫细胞，导致单用免疫治疗的有效率低下。ADRB3调 控以中性粒细胞为代表的非特异性免疫反应，也会影响后续的淋巴细胞介导的特 异性免疫。本发明的ADRB3抗体能同时调控非特异免疫和特异免疫细胞的功能， 使免疫系统恢复正常，用于治疗免疫系统紊乱导致的疾病。
[0093] 本发明公开了ADRB3调节造血干细胞增殖，可以增强体内的造血干细胞的 再生能力，刺激骨髓加速造血。ADRB3在干细胞表面表达，影响粘附因子的分 布和数量。ADRB3抗体改变骨髓中造血干细胞与胞外基质的结合强度而使造血 干细胞进入到外周血，利用ADRB3抗体可以分离收集造血干细胞，用于外周血 造血干细胞移植。
[0094] 本发明公开了ADRB3是调节骨髓粒系造血的主要细胞因子，可作用于粒系 造血祖细胞，促进其增殖、分化，并可增加粒系终末分化细胞即外周血中性粒细 胞的数目与功能。ADRB3刺激粒、单核-巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血 释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性粒细胞的多种功能。ADRB3激动剂和利用基 因重组技术生产的人ADRB3蛋白药物可以作为促进白细胞生长剂，用于预防和 治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生 异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒 细胞减少的恢复加快。适应症：1.骨髓移植时促进中性粒细胞数的增加。2.预防 抗肿瘤化疗药物引起的中性粒细胞减少症及缩短中性粒细胞减少症的持续期间； 急性淋巴细胞白血病。3.骨髓增生异常综合征的中性粒细胞减少症。4.再生障碍 性贫血的中性粒细胞减少症。5.先天性及原发性中性粒细胞减少症。6.免疫抑制 治疗(肾移植)继发的中性粒细胞减少症。7.肝衰竭。
[0095] ADRB3调节骨髓造血，促进血红细胞生长。ADRB3激动剂和利用基因重组 技术生产的人ADRB3蛋白药物可以作为促进红细胞生长剂，用于治疗贫血症。 ADRB3激动剂、具有ADRB3激活作用的ADRB3抗体和ADRB3重组蛋白因子 改善运动机体的携氧能力，提高运动成绩，修复受损组织，可以用于运动员的训 练和受伤后的康复。
[0096] 本发明公开了ADRB3是一种新的炎症因子，以自分泌和旁分泌方式发挥促 炎效应，ADRB3信号通路调控全身性感染和自身免疫性疾病的病理过程。 ADRB3信号通路调控中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞中P62， Elastase，HK2，GAPDH，Cyclin D1，P21，P16，P27，Ras，CDK3，CDK4， Rb，Ki-67，mTOR，Rictor，c-Myc,Rheb，PI3K，AKT，Tubulin，Actin，VEGF， TRAF6，PD-L1，ZAP70，P53，Interleukin 6(IL-6)，IL-10，IL-4，IL-5，IL-2， MPO，IFN-γ，GM-CSF，C反应蛋白，乙酰基转移酶Tip60，TGF-β和TNFα等 蛋白分子。
[0097] 本发明公开了ADRB3是髓源性抑制细胞(MDSC)的生物标志物，ADRB3 在MDSC中高表达，MDSC的生长发育依赖ADRB3。ADRB3促进MDSC增殖， ADRB3抗体抑制MDSC功能，治疗产生耐药和复发的肿瘤病人。
[0098] 本发明公开了Ki-67和ADRB3同时出现在恶性肿瘤病人的MDSC、淋巴细 胞、单核-巨噬细胞和中性粒细胞中，Ki-67和ADRB3双阳性(Ki-67+ADRB3+) 粒细胞数量与肿瘤患者预后不良正相关，该类型细胞是原始或幼稚型粒细胞，具 有诱导T细胞逆分化为幼稚型T细胞的能力。ADRB3和Ki-67共定位在粒细胞 胞浆中，ADRB3增强粒细胞核糖体功能，促进合成Ki-67和其他细胞生长因子。 粒细胞释放Ki-67和生长因子，刺激G0期的淋巴细胞和肿瘤细胞进入增殖期。 Ki-67+ADRB3+粒细胞是病情加重的标志性细胞，其数量的持续增加，高度提示 患者发生转移或复发。
[0099] 本发明公开了一类新的中性粒细胞，这类细胞大量产生和分泌ADRB3分子， 命名+为ADRB3粒细胞，该型细胞抑制机体的天然免疫，调控淋巴细胞的发育成 熟。肿瘤病人、病毒或细菌感染者体内ADRB3+粒细胞含量和百分比明显增加。 肿瘤病人特别是慢性粒细胞白血病患者的脾脏是ADRB3+粒细胞产生的活跃器 官，而来源于脾的ADRB3+粒细胞会促进肿瘤进展和转移。化疗后的肿瘤病人脾 脏、骨髓和外周血中，白细胞中的ADRB3+粒细胞比例明显升高，ADRB3+粒细 胞促进G0期的肿瘤细胞进入增殖期，导致癌症复发。脾动脉置管灌注ADRB3 抗体有利于靶向杀伤ADRB3+粒细胞，防止肿瘤转移。
[0100] ADRB3+粒细胞黏附、携带肿瘤细胞发生远处转移。ADRB3延迟中性粒细 胞的死亡，增加中性粒细胞在组织中的浓度。ADRB3增加核糖体的功能，刺激 中性粒细胞合成、释放炎性因子和生长因子，诱导新生血管生成，加强炎性反应。 ADRB3保护线粒体功能，减少活性氧的产生，使被粒细胞或巨噬细胞吞噬的寄 生虫、细菌或病毒等能在细胞内发育与增殖，+此为病原体的一种免疫逃避机制。 血液中ADRB3粒细胞通过黏附淋巴细胞或释放ADRB3入血等方式诱导淋巴细 胞高表达ADRB3，引起淋巴细胞发生去分化，导致特异免疫缺陷。
[0101] 正常人的中性粒细胞表面足突少，ADRB3含量明显少于癌症病人的粒细胞。 癌症病人的粒细胞足突增加，ADRB3调控微管和微丝来促进粒细胞的足突形成。 ADRB3促进粒细胞的足突粘附、捕获淋巴细胞，诱导淋巴细胞丧失抗癌活性。 肿瘤病人血液中有大量中性粒细胞的胞外诱捕网(NETs)，用来粘附、捕获淋巴细 胞和肿瘤细胞。ADRB3是NETs主要组成成分，NETs中的肿瘤细胞利用ADRB3 来抑制淋巴细胞，NETs是肿瘤和淋巴细胞间的中介环境。ADRB3抗体抑制NETs 的形成。
[0102] 在动脉粥样硬化斑块形成过程中，ADRB3促进粒细胞粘附到血管内皮细胞， 并移行进入内皮下，形成NETs，用来粘附淋巴细胞和巨噬细胞，分泌细胞因子 IL-6，扩大免疫细胞在粥样硬化灶的聚集，引起慢性炎症反应，形成脂纹脂斑。 ADRB3促进粒细胞与斑块中的泡沫细胞发生融合，泡沫细胞获得了增殖和迁移 能力，表现为斑块沿血管壁延伸。ADRB3激活中性粒细胞和泡沫细胞中的弹性 蛋白酶(Elastase)，释放到血管壁组织中，弹性蛋白酶消化血管壁中层的弹性 蛋白和胶原蛋白。血管弹性是维持血管正常生理功能的重要特性，血管的弹性主 要由弹性蛋白纤维提供，ADRB3促进弹性蛋白的降解而降低血管弹性，使动脉 管壁增厚、变硬，管腔狭小，引起动脉硬化、肺动脉高压、高血压。肺、心脏等 富有弹性的组织含有丰富的弹性蛋白，肺、心脏弹性蛋白酶的主要来源是中性粒 细胞和巨噬细胞，ADRB3促进中性粒细胞和巨噬细胞中的弹性蛋白酶释放，导 致肺、心脏的弹性降低，破坏组织结构，引起肺气肿、支气管扩张、哮喘、肺纤 维化、扩张型心肌病、心室肥厚等。本发明公开了ADRB3抗体作为弹性蛋白酶 抑制剂，能够抑制粒细胞弹性蛋白酶的活性和释放，用于治疗弹性蛋白酶亢进而 导致的疾病，包括但不限于：胰腺炎、肺气肿、肺动脉高压、哮喘、心肌病、心 室肥厚、肝硬化、脑缺血、脑出血、脑外伤。
[0103] ADRB3引起中性粒细胞的活化、聚集、浸润，是炎症反应发生、发展的关 键步骤。在脑、肝、肺、肠、肾、心脏等多种器官缺血/再灌注损伤过程中，ADRB3 促进中性粒细胞黏附在缺血区组织微血管内皮细胞表面，阻塞毛细血管，形成无 复流现象，减少组织的血液供应。中性粒细胞在微血管内聚集，同时释放炎症介 质与蛋白水解酶，炎症介质可吸引更多的中性粒细胞聚集，使炎症反应过程形成 一个自我增生的恶性循环；蛋白水解酶降解几乎所有的白细胞外基质成分，袭击 完整的细胞，导致内皮细胞脱落，增加微血管的通透性，血液与组织间的屏障由 此遭受严重的破坏，导致肺水肿、脑水肿等，加重组织损伤，引起缺血性坏死。 ADRB3抗体减弱中性粒细胞的活性，缩小缺血再灌注后坏死组织的范围，增强 缺血区微血管功能的恢复。本发明公开了ADRB3抗体治疗脑、肝、肺、肠、肾、 心脏缺血/再灌注损伤。
[0104] 组织中的中性粒细胞吞噬衰老细胞后，发生崩解、脱颗粒，释放胞内的 ADRB3。ADRB3成为可溶性受体被G0期组织细胞内吞，迁移入核仁，上调核 仁功能，促进核糖体大、小亚基的合成。ADRB3增加合成各种G1期所必需的 RNA(如U3snRNA)和蛋白质(如细胞周期素、周期素激酶等)，激活G0期 细胞进入G1期。G0期是细胞发生分化的时期，ADRB3促进G0期细胞进入增 殖期，意味着细胞失去分化能力。组织中的ADRB3浓度过高，持续刺激细胞增 殖，抑制新生细胞的分化，诱导肿瘤发生。粒细胞藉糖酵解获得能量，ADRB3 是维持中性粒细胞糖酵解的关键蛋白。肿瘤细胞高表达ADRB3，细胞的代谢模 式被改变成以糖酵解为主。
本发明公开了ADRB3抗体能够抑制肿瘤细胞的糖酵 解。
本发明公开了ADRB3抗体能够抑制肿瘤细胞的糖酵 解。
[0105] 浸润在肿瘤组织中的中性粒细胞糖酵解产生大量乳酸，通过ADRB3激活单 羧酸(MCT)转运蛋白而外排乳酸，使肿瘤周围环境中含有大量乳酸。ADRB3 结合SLC16A3基因的启动子，增加MCT4表达，促进乳酸的跨膜转运。高浓度 的乳酸是肿瘤的能源，但乳酸抑制细胞毒性T细胞和NK细胞的活性，导致肿瘤 细胞发生免疫逃逸。肿瘤细胞外酸性的环境促进细胞外基质的降解和重塑，有利 于癌细胞的侵袭和转移。ADRB抗体干扰乳酸外排，中和肿瘤细胞外的酸性微环 境。在脓毒症等炎症状态下，儿茶酚胺通过激动中性粒细胞和淋巴细胞中的 ADRB3而增加血液中的乳酸，导致患者预后不良。本发明公开了ADRB抗体抑 制+MDSC、中性粒细胞和淋巴细胞外排乳酸，治疗高乳酸血症和乳酸酸中毒。 ADRB抗体抑制H /K+-ATP酶，阻断胃酸分泌。用于治疗十二指肠溃疡、胃溃 疡、反流性食管炎、幽门螺杆菌感染。
[0106] 老化细胞、肿瘤细胞、内毒素、细菌、病毒等增加粒细胞和淋巴细胞中的 ADRB3基因表达，增加血液中ADRB3+粒细胞、ADRB3+淋巴细胞数量和可溶性 ADRB3的浓度。在脓毒症病人，血管内皮细胞、中性粒细胞和淋巴细胞产生并 释放ADRB3入血，而血液中的ADRB3又能激活中性粒细胞，爆发性分泌细胞 因子，引起失控的炎症反应，导致多器官功能障碍综合征。在肿瘤病人，ADRB3+淋巴细胞和可溶性ADRB3促进肿瘤远处转移。在老年人，ADRB3限制组织再 生，阻碍新生细胞的分化，新生的细胞不能发育为有功能的细胞，这种不完全的 再生加速机体衰老或诱发肿瘤。
[0107] 生理状态下，ADRB3促进中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞清除衰老死亡 的细胞，同时刺激组织器官中原本处于G0期的细胞进入增殖期，通过有丝分裂 而产生子代细胞，新生细胞的ADRB3表达水平较低，重新进入G0期并分化为 有功能的细胞，用以补充死亡细胞，这个过程是“完全性再生”。新生细胞必须分 化成熟，才能维持正常的组织器官功能，机体不会发生衰老。如果有丝分裂后新 生的细胞内ADRB3活性亢进，导致新生细胞不能进入G0期，抑制细胞分化而 不能发育成熟，这个过程是“不完全性再生”，是引起衰老和肿瘤的原因。本发明 人发现老年人血液、脑脊液中可溶性ADRB3含量和活性均较年轻人增高，过度 活化的ADRB3导致“不完全性再生”，不能修复老化的组织器官。ADRB3抗体 抑制不完全性再生，恢复完全性再生，具有抗衰老作用。
[0108] 血中ADRB3浓度呈现了以日、月、年为周期的波动，调控细胞的应激、代 谢、增殖或分化，有利于机体的再生。维持血中ADRB3浓度的周期性波动，是 调控再生的关键。如果血液中的ADRB3浓度波动曲线消失，应根据ADRB3的 浓度来予以调整。当ADRB3的产生和释放过多时(如肿瘤或炎症)，给予ADRB3 抗体来降低ADRB3的活性，使其恢复到正常水平。当ADRB3浓度过低时，给 予ADRB3激动剂来上调ADRB3的活性。通过激活或过表达ADRB3来促进细 胞的有丝分裂，启动组织的再生；通过阻滞ADRB3来维持新生细胞的分化，使 新生细胞转变成有功能的成熟细胞，恢复组织器官的功能。ADRB3抗体调控心 脏、肝脏、骨髓、胰腺、大脑、外周神经、肾脏、肺和肌肉等组织的再生。恢复 ADRB3功能低下的血液、脑脊液和组织中ADRB3的浓度和活性，可以促使细 胞增殖，起到抗衰老作用。
[0109] 本发明公开了ADRB3抗体用于促进组织再生，治疗由于再生功能障碍而导 致的疾病，包括以下但不限于：白细胞减少症、中性粒细胞减少症、淋巴细胞减 少症、再生障碍性贫血、慢性肉芽肿病、白细胞粘附缺陷、B细胞缺陷性疾病、 性联低丙种球蛋白血症、T细胞缺陷性疾病、严重联合免疫缺陷病、补体缺陷病、 烧伤、伤口不愈合、少肌症、老年性肌肉萎缩症、骨质疏松、老年黄斑变性、老 年耳聋和其他衰老性疾病等。
[0110] 炎症是机体免疫反应中至关重要的部分，慢性炎症导致癌症、阿尔茨海默病 和其他痴呆症、心血管疾病、骨关节炎、抑郁症等疾病，超过90％的非传染性老 龄化疾病都与慢性炎症有关。炎症的最初阶段是由中性粒细胞引起的，ADRB3 信号通路在中性粒细胞活化过程中起到了关键作用。敲除ADRB3基因的小鼠能 够抵抗大剂量的内毒素而延缓发生脓毒症，减少脓毒症导致的死亡，表明脓毒症 与ADRB3信号通路活化有关。激活的ADRB3是各种炎症介质产生的“闸门”， 通过“扳机样”作用触发炎症介质的级联反应。作为炎症因子的ADRB3能够促进 中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核-巨噬细胞释放MPO、Elastase、IL-1、 IL-6、VEGF等炎性因子。而炎症因子的增多反过来进一步刺激ADRB3的活化， 起着放大炎症的作用。
[0111] ADRB3促进嗜酸性、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞产生并释放组织胺、白三烯、 血小板活化因子等，引起平滑肌收缩，毛细血管扩大和通透性增强，腺体分泌物 增多，引起局部或全身过敏反应。本发明公开了ADRB3抗体具有稳定肥大细胞 膜和阻止脱颗粒，抑制淋巴细胞转化及白介素2产生，降低表皮郎格罕细胞数， 抑制血小板聚集，增强红细胞变形能力，抑制细胞的分裂和增殖作用。ADRB3 抗体用以治疗过敏性疾病、变应性接触性皮炎。
[0112] 本发明公开了可溶性ADRB3是血清学肿瘤标志物，监测血液或其他体液中 可溶性ADRB3的浓度，对于恶性肿瘤的早期诊断、预后判断、治疗反应和复发 监测有重要价值。本发明人发现血液、脑脊液、胸水、腹水等体液中存在ADRB3， 其包含细胞膜外所有的结构域，具有与配体结合的能力，命名为可溶性ADRB3 (soluble ADRB3,sB3)。肿瘤细胞能够产生并释放ADRB3入血，增加血液中 ADRB3的含量。肿瘤患者血中的sB3含量高于正常人，肿瘤复发患者血液中的 sB3高于治疗缓解者，高水平sB3肿瘤患者的生存率低于低水平者。sB3可结合 到NK细胞、T细胞和单核细胞上，抑制免疫，使肿瘤逃避免疫监视。sB3有利 于增加循环肿瘤细胞的活性，ADRB3抗体能通过ADCC效应清除循环肿瘤细胞。
[0113] 除了治疗用途外，抗人ADRB3单克隆抗体还用于研制人ADRB3ELISA检 测试剂、可溶性ADRB3酶联检测试剂、胶体金检测试剂等。检测血液、唾液、 尿液、脑脊液、胸水和腹水等体液中的sB3的含量，可以用于脓毒症、心血管病、 阿尔兹海默病、肿瘤、自身免疫疾病的诊断和疗效评价。血清中sB3可作为脓毒 症、心肌梗塞、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等疾病的诊断指标以及病情监测标志 物。检测血液和其他体液中sB3的含量可以预测寿命和5年内的死亡率，sB3浓 度越高，死亡风险越大。减少血液中的sB3的含量，可以延缓衰老。
[0114] 补体系统在对抗病原微生物感染中处于一线防御地位，补体的活化可以中和 病毒，裂解细菌，调理吞噬细胞功能，有利于机体清除病原微生物。ADRB3下 调补体激活的经典途径和替代途径，使细菌、病毒、肿瘤逃逸宿主的免疫反应。 ADRB3减少补体C3、C5、C8、C9表达，阻碍膜攻击复合物(Membrane Attack Complex,MAC)的形成，使肿瘤细胞逃避补体攻击。通过组成性和诱导性表达 ADRB3，肿瘤和病毒感染细胞可限制MAC组装来保护自身避免补体造成的有害 性破坏。本发明公开了ADRB3抗体能够激活补体系统，升高补体C3、C5、C8、 C9表达量，促进MAC的组装，启动肿瘤细胞溶解，清除病原微生物和溶解感 染的细胞，用于治疗恶性肿瘤，病毒感染，淋球菌感染等。
[0115] 本发明公开了ADRB3是炎症标志物，ADRB3水平的变化反映局部和全身 炎症。可溶性ADRB3(sB3)是细胞表面的ADRB3经蛋白裂解后脱落下来的可 溶性细胞外成分，循环中sB3的水平和中性粒细胞的ADRB3的变化是平行的， 故检测血清中的sB3可作为中性粒细胞功能监测的指标。ADRB3抗体起着限制 炎症的作用，用于治疗不同病原微生物如真菌、细菌、病毒、支原体、衣原体、 螺旋体、原虫与寄生虫感染引起的疾病。炎症是肿瘤的危险因素，ADRB3引起 的炎症可以使感染或自身免疫性疾病进展为肿瘤，肿瘤细胞进一步大量分泌 ADRB3和其他促炎因子，加重炎症反应，促进远处转移，加速患者死亡。肿瘤 微环境中的免疫细胞如中性粒细胞、Treg和巨噬细胞等促进肿瘤发展。肿瘤细 胞分泌的ADRB3，增加血液和肿瘤局部组织中的ADRB3含量，趋化粒细胞、 淋巴细胞和巨噬细胞等炎性细胞向肿瘤组织迁移、浸润。炎症和肿瘤细胞均可激 活ADRB3，而ADRB3在维持慢性炎症、促进肿瘤进展、抑制针对肿瘤的免疫 监视中起关键作用。ADRB3是炎症和肿瘤间发生联系的关键环节，使炎症与肿 瘤之间形成正反馈环路，导致炎症和肿瘤相互促进。ADRB3抗体阻断炎症和肿 瘤的恶性循环链，抑制炎性细胞向肿瘤部位的募集，减轻肿瘤微环境中的炎症反 应，发挥抗炎和抗癌的双重作用。
[0116] 肿瘤释放ADRB3入血来激活中性粒细胞，削弱T细胞介导的特异性免疫反 应，引起恶病质。癌细胞中的ADRB3诱导免疫抑制细胞如MDSC和Treg增殖， 抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)的抗肿瘤免疫反应，使癌 细胞逃脱免疫杀伤，促进肿瘤增殖和转移。肿瘤中的ADRB3招募正常的内皮祖 细胞到达肿瘤组织，促进新生血管形成。ADRB3抗体抑制肿瘤微环境中免疫抑 制细胞和肿瘤细胞的ADRB3的表达和活性，既能减轻肿瘤的炎性环境而起到增 强肿瘤免疫的作用，也能直接抑制肿瘤细胞的增殖，适用于治疗恶性肿瘤和恶病 质。
[0117] 根据ADRB3抗体的轻重链测序结果，本发明公开了抗ADRB3嵌合抗原受 体修饰后的T细胞不仅能够清除表达ADRB3的肿瘤细胞，还能清除肿瘤微环境 中的促癌炎性细胞，增加其他嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)的治疗效 果，用于CAR-T治疗失败的肿瘤病人。癌细胞、粒细胞、T细胞和巨噬细胞诱 导CAR-T细胞的去分化，使CAR-T细胞丧失抗癌活性。ADRB3抗体能维持 CAR-T细胞的分化状态，增加CAR-T对癌细胞的杀伤能力。该嵌合抗原受体由 小鼠抗人ADRB3的单链抗体、CD8铰链区和跨膜区、CD137(又名4-1BB)的胞 内信号区、CD3ζ的胞内信号结构串联构成。抗ADRB3CAR-T细胞能够消灭肿 瘤细胞和肿瘤内环境中的促癌炎性细胞(中性粒细胞、Treg和巨噬细胞)，即 使肿瘤细胞不表达ADRB3，抗ADRB3CAR-T细胞仍然能够通过抑制肿瘤环境 细胞而起到抗癌作用，是通用型CAR-T细胞，用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性 疾病、动脉粥样硬化、炎症、病毒感染、神经退行性疾病如阿尔茨海默病和衰老 性疾病。
[0118] 本发明公开了抗ADRB3嵌合抗原受体修饰后的巨噬细胞、树突状细胞、NK 细胞和粒细胞，能够清除肿瘤细胞和老化细胞，用于过继免疫治疗恶性肿瘤、自 身免疫性疾病、动脉粥样硬化、炎症、病毒感染、神经退行性疾病和衰老性疾病。
[0119] 本发明公开了基于ADRB3的基因治疗，利用CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN 技术来删除、添加、激活或抑制ADRB3基因。用于抗衰老和治疗恶性肿瘤、自 身免疫性疾病、动脉粥样硬化、炎症、病毒感染、阿尔茨海默病和衰老性疾病。 基于ADRB3靶点的基因治疗的适应症与ADRB3抗体的适应症相同。
[0120] 本发明公开了ADRB3是一种新的单核细胞表面分子，ADRB3调控单核-巨 噬细胞分化和增殖，促进单核细胞向M1型巨噬细胞分化，特别是调控肿瘤相关 巨噬细胞的活性。
[0121] 本发明公开了一类新的巨噬细胞，这类细胞大量产生和分泌ADRB3分子， 命名为ADRB3+巨噬细胞，该型细胞抑制机体的天然免疫。
[0122] 本发明公开了ADRB3是一种新的红细胞表面分子。
[0123] 本发明公开了ADRB3是一种新的NK细胞表面分子。
[0124] 本发明公开了ADRB3是一种新的树突状细胞表面分子。
[0125] 本发明公开了ADRB3基因是与细胞增殖相关的原癌基因(proto-oncogene)， ADRB3在大多数癌症中是一种关键的驱动因子。在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结 直肠癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴瘤和白血病等恶性肿瘤细胞中，ADRB3异常高 表达。ADRB3基因主要通过扩增和染色体易位重排方式激活。ADRB3基因的融 合、过表达和突变均会导致ADRB3蛋白的失调，异常的ADRB3蛋白将激活下 游多条致癌信号途径，包括PI3K/AKT/mTOR、RAS/MAPK、Jak/Stat、 TGF-/Smad、ErbB/HER、Wnt/Hedgehog/Notch等。
[0126] 本发明公开了ADRB3促进肿瘤转移，ADRB3抗体阻滞肿瘤的转移，可用 于治疗发生远处转移的晚期癌症患者。ADRB3增加肿瘤细胞的迁移能力而促使 其进入血液，增强肿瘤细胞和中性粒细胞之间的相互作用来促进肿瘤的转移。循 环肿瘤细胞大量表达ADRB3，肿瘤细胞借助ADRB3而与粒细胞、巨噬细胞发 生黏附，被粒细胞、巨噬细胞携带至其他位置而发生转移。肿瘤转移不仅依赖于 肿瘤自身的侵袭能力，还与肿瘤转移前微环境(pre-metastatic niche)的形成密切 相关。转移前微环境的构建决定了侵袭至循环系统的肿瘤细胞能否在远方转移灶 部位附着、生存、增殖并最终形成转移癌。血液中的粒细胞和巨噬细胞进入组织 后，会释放ADRB3因子，营建适合肿瘤细胞生存的微环境。循环肿瘤细胞分泌 的可溶性ADRB3蛋白能够诱导骨髓前体细胞，动员并植入远处特定的器官组织 形成转移前微环境，招募循环肿瘤细胞至特定的位点形成转移灶。
[0127] 肿瘤细胞中ADRB3的水平增高与包括转移速度增加、复发和死亡率在内的 不良临床结果相关。检测肿瘤组织中ADRB3的含量可以用于恶性肿瘤的诊断、 预后和疗效评价。血液中的可溶性ADRB3浓度升高，提示肿瘤进展加速或复发， 患者预后不良。
[0128] 本发明公开了ADRB3是细胞核仁内的关键结构蛋白，对于维持核仁的功能 具有重要作用。ADRB3聚集在G0期细胞的核仁中，促进核糖体大、小亚基的 合成，参与基因沉默、细胞衰老、细胞周期调控。ADRB3促进Ki-67基因的表 达和蛋白合成，激活休眠的G0细胞进入增殖期。ADRB3抗体抑制肿瘤细胞核 仁的功能和结构。ADRB3位于G0、G1、S和G2期细胞的核仁中，促进休眠期 (G0)和增殖期间的转换，促进有丝分裂。ADRB3调控G0期和增殖期细胞核 仁的功能及结构，但G0期和增殖期细胞核仁中的ADRB3的构型不同，暴露的 抗原表位也不同，因此需用不同的ADRB3抗体来检测不同细胞周期核仁中的 ADRB3。本发明采用不同的ADRB3多肽片段来制作ADRB3抗体，ADRB3蛋 白的N端片段(第1-155氨基酸残基)免疫产生的抗体能够检测到增殖期细胞核 仁中的ADRB3；ADRB3蛋白的中间结构域片段(第100-300氨基酸残基)免疫 产生的抗体能够检测到休眠期细胞核仁中的ADRB3。在免疫组化、免疫荧光和 流式细胞术等检测中，抗原表位是ADRB3的N端多肽的单克隆抗体适用于检测 增殖期细胞，抗原表位是ADRB3的中间结构域的单克隆抗体适用于检测G0期 细胞。
[0129] 本发明公开了ADRB3是G0期细胞的标志物，只有表达ADRB3的G0期细 胞才能重新进入细胞周期。化疗药物不能杀伤G0期癌细胞，G0期癌细胞是癌 症复发的根源。循环肿瘤细胞和播散的肿瘤细胞因为缺乏原始的生长微环境而被 诱导成休眠状态。ADRB3抗体特异杀灭G0期癌细胞，防止G0期癌细胞进入增 殖期(例如G1期)，用于治疗复发和耐药的恶性肿瘤患者。ADRB3抗体清除 G0期循环肿瘤细胞，用于预防癌细胞的转移。
[0130] ADRB3在细胞核中的分布状态与细胞周期的不同阶段有密切关联。G0期与 增殖期细胞核仁中ADRB3的分布不同，核仁中出现ADRB3的大量蓄积是G0 期细胞进入增殖期的标志性事件。ADRB3蓄积在Ki-67阴性细胞的核仁，预示 该细胞将由G0期进入G1期。本发明公开了用ADRB3抗体做免疫荧光实验， 检测核仁中的ADRB3亮斑，可以鉴定出具有增殖能力的G0期细胞(图1，右 上细胞是具有增殖能力的G0期细胞)，鉴定标准如下：(1)、细胞核仁中的 ADRB3聚集成团，形成2～6个亮斑，亮斑所在的部位DAPI染色阴性，ADRB3 亮斑的外围是异染色质或高度压缩的染色质(DAPI染色强阳性)；(2)、细胞 核中无Ki-67表达。
[0131] 当ADRB3弥散分布在细胞核时，表明细胞已经离开G0期并进入增殖期(细 胞周期中的G1、S或G2期)，此时的ADRB3作为核受体和转录因子，调控基 因表达。本发明公开了ADRB3具有乙酰化酶活性，调控核小体中组蛋白的乙酰 化，特别是增加H3组蛋白中第9、14、18、27、56赖氨酸的乙酰化。乙酰基转 移酶Tip60可被ADRB3招募到染色体上，引起组蛋白H4K5、H4K12等赖氨酸 位点的乙酰化。本发明公开了ADRB3抗体作为乙酰化酶的抑制剂，用于治疗与 乙酰化修饰有关的疾病。
[0132] 核仁结构和功能的完整性对于癌细胞的活力是至关重要的，ADRB3维持G0 期肿瘤细胞核仁的功能和结构，增强应激能力，有利于肿瘤细胞度过不利的环境。 在合适的环境中，ADRB3刺激休眠的G0期细胞进入G1期，使细胞发生去分化， 加重肿瘤的恶性程度。ADRB3抗体破坏核仁功能，减弱G0期肿瘤细胞的能量 代谢，抑制G0期肿瘤细胞进入细胞周期，诱导G0期细胞发生老化、凋亡。
[0133] 除了存在于G0期细胞的核仁外，ADRB3也少量存在于G1、S和G2期细 胞的核仁中。当细胞进入有丝分裂期时，核仁破裂，ADRB3位于中心体的位置， 促进纺锤体的形成。由于ADRB3广泛分布于不同的细胞周期，对有丝分裂起到 关键的调控作用。ADRB3抗体也适用于杀伤增殖期癌细胞。
[0134] 核仁是多种病毒复制、转录的场所。ADRB3抗体抑制核仁功能，阻断病毒 复制，用于治疗病毒感染性疾病。
[0135] ADRB3位于有丝分裂期细胞的纺锤体两极或中心体，调控微管发生，增强 动粒功能，促进姐妹染色体分离。本发明公开了ADRB3是微管结合蛋白 (microtubule associated protein)，促进形成分裂期细胞中的纺锤体，ADRB3抗 体抑制肿瘤细胞的微管而起到抗癌作用。ADRB3具有分子马达(molecular motor) 的功能，调控细胞内的物资如自噬体、脂褐素等的运输。ADRB3抗体阻滞肿瘤 细胞的物资运输，导致自噬体和脂褐素不能被清除而蓄积在细胞内，加速肿瘤细 胞老化。
[0136] ADRB3定位于肿瘤细胞线粒体外膜，维持线粒体膜电位的正常，促进线粒 体融合。本发明公开了ADRB3抗体削弱肿瘤细胞的糖酵解和氧化磷酸化，抑制 ATP产生。ADRB3抗体破坏线粒体跨膜电位，促进线粒体产生活性氧，增加脂 褐素等过氧化物，导致细胞凋亡。
ADRB3抗体抑制肿瘤细胞溶酶体的成熟，阻 碍受损线粒体和其他代谢废物如脂褐素的清除。
ADRB3抗体抑制肿瘤细胞溶酶体的成熟，阻 碍受损线粒体和其他代谢废物如脂褐素的清除。
[0137] 本发明公开了ADRB3促进线粒体自噬，促进自噬体与溶酶体的膜融合而形 成自噬溶酶体，加快自噬小体的清除。ADRB3定位于自噬前体膜上，促进自噬 体膜的延长而形成完整的自噬体。ADRB3促进自噬小体的双层膜间隙形成氢离 子池，驱动V-ATPase生产ATP，这是G0期细胞的主要产能方式，使细胞不需 氧气，维持低代谢的休眠状态。ADRB3抗体或ADRB3抑制剂如SR59230A，能 够阻断自噬，抑制线粒体自噬体的清除，使自噬体、受损线粒体和脂褐素等代谢 废物蓄积在细胞内，加速细胞老化或凋亡。除了阻断自噬外，ADRB3抗体还能 增加衰老相关基因p16INK4/p53/p63表达，减少SIRT1，促进癌细胞老化。
[0138] 正常情况下，细胞内自噬小体的降解速度较快，不易检测到自噬小体。 ADRB3抗体或ADRB3抑制剂可以作为自噬诱导剂，延缓自噬小体的降解，用 作自噬研究的工具药。
[0139] 本发明公开了ADRB3抗体阻滞磷酸戊糖途径，抑制癌细胞的DNA复制。
[0140] 本发明公开了ADRB3抗体阻滞细胞中核糖体合成，降低肿瘤细胞合成蛋白 的能力。
[0141] 本发明公开了ADRB3抗体阻滞癌细胞的应激反应，防止癌细胞对放、化疗 产生耐受。ADRB3抗体削弱癌细胞的氧化应激能力，使肿瘤细胞无法清除过氧 化氢和活性氧。
[0142] ADRB3通过以下机制促进癌细胞的增殖和转移：(1)、促进P53蛋白降解， 抑制凋亡。(2)、促进线粒体自噬、糖酵解和氧化磷酸化，调控线粒体外膜上 的电压依赖性阴离子通道(VDAC)，激活己糖激酶2(HK2)、GAPDH和 H+-ATPase。(3)、增强G0期的核仁功能，促进核糖体合成。(4)、激活溶 酶体外膜上的H+-ATPase和VDAC，维持溶酶体内水解酶的活性。(5)、上调 Cyclin D1/CDK3/CDK4表达，增加Rb磷酸化。(6)、促进纺锤体形成，增加 磷酸化CENP-A。(7)、调控微管的聚合与解聚，影响细胞内物质运输。(8)、 激活AMPK、SIRT1和mTOR介导的应激通路，增加癌细胞的应激能力。(9)、 促进中性粒细胞和MDSC的增殖，增加调节性树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞 的活性。促进粒细胞和淋巴细胞融合，抑制T细胞的抗癌功能。(10)、上调 CD4+T细胞FOXP3的表达，增加Treg细胞。(11)、促进中性粒细胞、淋巴细 胞和肿瘤细胞合成IL-6、VEGF和TGFβ等炎性因子。(12)、趋化内皮细胞、 成纤维细胞、淋巴细胞、粒细胞等向肿瘤组织浸润，促进新生血管的形成。(13)、 促进循环肿瘤细胞粘附血管内皮细胞，穿透内皮而进入组织间隙，形成转移灶。 (14)、上调P-糖蛋白的活性，使癌细胞产生耐药性。(15)、激活磷酸戊糖 途径，提供肿瘤细胞增殖所需核苷酸。(16)、下调补体激活的经典途径和替代 途径，抑制补体对肿细胞的杀伤功能。(17)、与ras、myc、sis、fos、fas、abl、 等癌基因形成融合基因，协同致癌。
[0143] ADRB3存在于免疫细胞(中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞)和肿瘤细 胞中，兼具促炎促癌双重功能。ADRB3增加免疫细胞的促癌作用，上调癌细胞 的促炎作用，使炎症和肿瘤相互促进，形成恶性循环。ADRB3抗体靶向免疫细 胞和肿瘤细胞中共同的关键信号分子，既能干预肿瘤环境中的免疫抑制细胞，又 能抑制肿瘤细胞，高效阻断炎症和肿瘤的进展。
[0144] 本发明公开了抗人ADRB3单克隆抗体是一种广谱抗癌药，癌细胞、淋巴细 胞或中性粒细胞有ADRB3高度过表达(免疫组化ADRB3阳性)或基因扩增(荧光 原位杂交检测证实)的肿瘤应用ADRB3单抗临床疗效最好。治疗恶性肿瘤包括以 下但不局限于：恶性淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、急性白血病、 慢性白血病、髓淋混合系白血病、恶性组织细胞病、多发性骨髓瘤、头颈部鳞癌、 甲状腺癌、鼻咽癌、口咽癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆 管癌、结直肠癌、皮肤癌、湿疹样癌(Paget病)、基底细胞癌、鳞状细胞癌、 黑素瘤、神经胶质瘤、星形细胞癌、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细 胞瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、骨肉瘤、平滑 肌肉瘤、胃肠道间质瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉 瘤、血管肉瘤、恶性胸腺瘤、副肿瘤综合征以及恶病质。
[0145] ADRB3单克隆抗体治疗免疫检查点抑制剂产生的免疫相关不良事件，包括 以下但不局限于：免疫介导的肺炎、免疫介导的结肠炎、免疫介导的肝炎、免疫 介导的垂体炎、肾衰和免疫介导的肾炎、免疫介导的甲状腺功能亢进和甲状腺功 能减退症。
[0146] 本发明涉及的抗体可作为载体分别与细胞毒性药物(甲氨蝶呤、阿霉素、长 春新131 125 111
碱等)、放射性同位素(I ，I ，In 等)或生物毒素(白喉毒素、蓖麻毒 素等)交联进行恶性肿瘤的导向治疗。本发明涉及的抗体也可以作为化疗药物的 增敏剂，提高化疗的疗效，治疗对化疗药物产生耐药的患者。本发明中的抗人 ADRB3单克隆抗体的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制 法制成注射剂、外用剂、吸入剂、口服常释剂型、胶囊、颗粒剂、缓释剂、喷雾 剂、气雾剂等各种剂型。
碱等)、放射性同位素(I ，I ，In 等)或生物毒素(白喉毒素、蓖麻毒 素等)交联进行恶性肿瘤的导向治疗。本发明涉及的抗体也可以作为化疗药物的 增敏剂，提高化疗的疗效，治疗对化疗药物产生耐药的患者。本发明中的抗人 ADRB3单克隆抗体的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制 法制成注射剂、外用剂、吸入剂、口服常释剂型、胶囊、颗粒剂、缓释剂、喷雾 剂、气雾剂等各种剂型。
[0147] ADRB3活化血小板和中性粒细胞，导致血液高凝、高炎性状态。本发明公 开了抗人ADRB3单克隆抗体抑制血小板和中性粒细胞的活性，对抗血小板聚集， 防止血栓形成，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，包括以下但不局限于：深部静 脉血栓、周围血管栓塞、肺栓塞、脑栓塞、视网膜动脉阻塞、急性亚急性周围动 脉血栓、中央视网膜动静脉栓塞、血透分流术中形成的凝血、手术过程中出现的 血栓形成、心脏导管检查、溶血性和创伤性休克及并发弥漫性血管内凝血(DIC) 的败血症休克。
[0148] 本发明公开了ADRB3单克隆抗体作为止血药物，用于需减少流血或止血的 各种医疗情况下，如：外科、内科、妇产科、眼科、耳鼻喉科、口腔科等临床科 室的出血及出血性疾病。用于血友病、血小板减少症、紫癜、鼻衄、齿龈出血 等症。
[0149] 动脉粥样硬化(AS)与慢性炎症密切相关，过度活跃的巨噬细胞、中性粒 细胞和淋巴细胞所引起的炎症是导致AS斑块不稳定的关键因素。ADRB3促进 动脉粥样硬化的发生和已形成斑块的不稳定。ADRB3趋化巨噬细胞、中性粒细 胞、淋巴细胞与血管内皮细胞黏附并进入斑块，导致斑块发生炎症而破裂，加重 心肌缺血甚至坏死，临床上表现为不稳定型心绞痛和急性心肌梗死的发生。富含 ADRB3的巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞是引起急性冠脉综合征(ACS)的“罪犯” 细胞。ADRB3促进APC递呈抗原给动脉壁中的T细胞，造成局部T细胞活化 和炎性细胞因子的生产，通过慢性炎症、诱导泡沫细胞的形成来促进动脉粥样硬 化。ADRB3是动脉粥样硬化的独立预测因子，外周血可溶性ADRB3水平与冠 状动脉粥样硬化严重程度呈正相关。ADRB3通过以下机制引起ACS:1、促进炎 性细胞粘附血管内皮，损伤内皮，有利于低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)沉积到 内皮下，形成斑块。2、活化血小板、巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞，导致血 液高凝、高炎性状态。3、促进斑块内血管新生。4、促进粒细胞、T细胞浸润斑 块，导致斑块炎症。5、激活MMP，降解斑块纤维帽。6、ADRB3增加粒细胞、 巨噬细胞和内皮细胞的LDLR、清道夫受体，刺激细胞吞噬LDL-C和乳糜微粒 而变成泡沫细胞。7、ADRB3激活巨噬细胞的磷酸戊糖途径，产生大量戊糖与强 还原剂NAPDH，前者用于合成核苷酸，促进巨噬细胞增殖；后者则会参与胆固 醇的合成，增加LDL-C浓度，有利于巨噬细胞吞噬LDL-C。8、溶质载体(solute carrier，SLC)超家族是胆固醇转运的关键蛋白，ADRB3增加巨噬细胞的 SLC16A3表达，促进巨噬细胞摄取LDL-C。9、ADRB3增加肝细胞核糖体功能， 促进肝脏合成C反应蛋白、凝血因子、极低密度脂蛋白(VLDL)，加重血管炎 症反应。
[0150] 本发明公开了抗人ADRB3单克隆抗体治疗心脑血管疾病，包括以下但不局 限于：冠状动脉粥样硬化性心脏病、急性冠脉综合征、心肌梗塞、动脉粥样硬化、 冠状动脉支架内再狭窄、主动脉夹层、慢性肺源性心脏病、原发性高血压、高脂 血症、心功能衰竭、心肌纤维化、心肌炎、病毒性心肌炎、原发性心肌病、扩张 型心肌病、肥厚性心肌病、缩窄型心肌病、风湿性心脏病、风湿性心脏瓣膜病变、 感染性心内膜炎、先天性心脏病、心律失常、心房颤动、室性心动过速、心室扑 动、心室颤动、阿-斯综合征、心脏及肾脏再灌注损伤、短暂性脑缺血发作(TIA)、 脑卒中、癫痫、痴呆、脑出血、蛛网膜下腔出血、脑梗死、脑动脉瘤、脑动静脉 畸形。
[0151] 本发明人发现雷帕霉素增加血管内皮细胞和平滑肌细胞中的ADRB3表达 量，导致雷帕霉素药物洗脱支架术后再狭窄。本发明公开了ADRB3抗体治疗冠 状动脉介入术后再狭窄和支架内再狭窄。ADRB3抗体作为涂层药物，用于生产 新型的药物洗脱支架和洗脱球囊。
[0152] 本发明公开了可溶性ADRB3作为一种诊断急性冠脉综合征和预测心血管病 预后的新指标。可溶性ADRB3的测定可作为冠心病早期诊断的分子标志，可溶 性ADRB3水平升高是冠心病的一项危险因素，随着血液中ADRB3水平升高， ACS发病风险明显升高，心血管病预后变差。急性冠脉综合征患者外周血中的 可溶性ADRB3水平高于稳定型心绞痛患者，血液中可溶性ADRB3水平是诊断 ACS的重要指标，ACS患者血液中的ADRB3+粒细胞和ADRB3+淋巴细胞数量 均会增加。
[0153] 本发明公开了抗人ADRB3单克隆抗体是一种广谱抗炎药和免疫抑制剂，能 够减轻全身炎症反应及组织损伤，用于治疗炎症性疾病、过敏性疾病和自身免疫 性疾病，包括但不局限于：上呼吸道感染、支气管炎、肺炎、肺气肿、哮喘、糖 皮质激素抵抗型哮喘、嗜酸性粒细胞增多症、特发性嗜酸粒细胞增多综合征、过 敏性鼻炎、间质性肺炎、肺间质纤维化、慢性阻塞性肺病、原发性肺动脉高压、 结缔组织病相关性肺动脉高压、肺纤维化、特发性肺纤维化和囊性纤维化、肺结 节病、矽肺、肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、胸膜炎、结核病、内毒 素血症、感染性休克、中毒性休克症候群、败血症、脓毒症、脓毒性休克、内毒 素性休克、过敏性休克、多器官功能障碍综合征、弥散性血管内凝血、烧伤、急 性重型肝炎、急性肝衰竭、慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、肝性脑病、原发性 硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、胆囊炎、胰腺炎、慢性 胃炎、消化性溃疡、消化道应激性溃疡、应激性消化道出血、糖尿病、湿疹、接 触性皮肤炎、神经性皮炎、脑炎、脑膜炎、脊髓炎、格林-巴利综合征、多发性 硬化、青光眼、感染性多发性神经根神经炎、视神经炎、视神经乳头炎、糖尿病 性视网膜病变、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、视网膜静脉阻塞、视神 经脊髓炎、脱髓鞘疾病、结膜炎、角膜炎、巩膜炎、干眼症、白内障、黄斑变性、 老年性黄斑变性、破伤风、尖锐湿疣、淋病、生殖器疱疹、梅毒、银屑病、单纯 糠疹、玫瑰糠疹、白癜风、雀斑、着色性干皮病、太田痣、黄褐斑、神经性皮炎、 带状疱疹、体股癣、手足癣、湿疹、过敏性皮炎、痤疮、脂溢性皮炎、脱发、脂 溢性脱发、精神性脱发、斑秃、神经性脱发、早老性白发病、类风湿性关节炎、 骨关节炎、骨质疏松症、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、结节病、强直性脊柱 炎、痢疾、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、干燥综合征、 痛风、混合性结缔组织病、重症肌无力、内脏利什曼病、恰加斯病、阿米巴肝脓 肿、小儿皮肤黏膜淋巴结综合征、血管炎、系统性血管炎、原发性小血管炎、肉 芽肿性血管炎、血栓闭塞性脉管炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、巨细胞动脉炎、 毛细血管内增生性肾炎、系膜毛细血管性肾炎、狼疮性肾炎、肾小球肾炎、肾小 管萎缩以及间质纤维化、肾盂肾炎、肾炎肾病综合征、肾功能衰竭、多囊肾、尿 路感染、盆腔炎、输卵管炎、前列腺炎、多发性硬化症、白塞病、天疱疮、类天 疱疮、皮肌炎、蜂窝织炎、急性化脓性脑膜炎、疟疾、阿尔茨海默病、路易体痴 呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、 川崎病、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液性水肿、甲状腺功能亢进症、 移植物抗宿主病、同种异体移植排斥、肌病、肌肉退化、肌营养不良、共济失调 毛细血管扩张症、慢性肉芽肿病、淋巴结炎、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血 性贫血、过敏性紫癜、血小板减少性紫癜、骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、 白细胞粘附缺陷、B细胞缺陷性疾病、性联低丙种球蛋白血症、T细胞缺陷性疾 病、严重联合免疫缺陷病、补体缺陷病、低补体血症、溶酶体贮积症、黏多糖贮 积症、黏脂质贮积症、幽门螺旋杆菌感染、布氏杆菌病、梅毒、钩端螺旋体病、 布氏杆菌病、弓形虫病、包虫病、血吸虫病、伤寒、黑热病、丝虫病。
[0154] 本发明公开了ADRB3抗体对淋菌的耐药性有逆转作用，用以治疗耐药性淋 病。
[0155] 本发明公开了可溶性ADRB3作为一种预测上述炎症性疾病预后的新指标， 随着血液中ADRB3水平升高，预后变差。
[0156] ADRB3促进人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、埃博拉病毒、腺病毒、流感病 毒、乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒以及狂犬病毒的复制。ADRB3抗体 抑制病毒复制，促进病毒的清除。HIV感染细胞后，诱导原本分布在胞浆的 ADRB3蓄积在膜上，趋化CD4+T细胞，并使T细胞粘附在ADRB3富集区域。 借助ADRB3形成的突触，HIV迁移到宿主细胞-CD4+T细胞中。
[0157] 本发明公开了抗人ADRB3单克隆抗体是一种广谱抗病毒药，用于治疗病毒 感染性疾病，包括以下但不局限于：重症急性呼吸综合征、传染性非典型肺炎、 获得性免疫缺陷综合征、乙型和丙型病毒性肝炎、流行性感冒、麻疹、寻常疣、 生殖器疣(尖锐湿疣)、人T细胞白血病病毒感染、单纯疱疹病毒感染导致的新 生儿疱疹、生殖器疱疹、病毒性脑膜炎、慢病毒脑炎和脑病、人类朊蛋白病、克 雅病、Kuru病、亚急性硬化性全脑炎、病毒性心肌炎、手足口病、EB病毒感染、 传染性单核细胞增多症、病毒性出血热、流行性出血热、登革出血热、埃博拉出 血热、带状疱疹、特发性血小板减少性紫癜以及狂犬病。ADRB3抗体用于治疗 艾滋病患者抗逆转录病毒治疗(HAART)导致的高乳酸血症。
[0158] 基于ADRB3单克隆抗体的抗病毒作用，本发明公开了利用ADRB3基因来 制备预防性抗病毒疫苗，利用ADRB3全长蛋白和多肽片段来制备治疗性抗病毒 疫苗，诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，以达到清除或控制病毒的目 的。
[0159] 本发明公开了ADRB3抗体活化抗原提呈细胞，激发T细胞免疫应答，增强 疫苗的免疫效果。在疫苗接种前后，给予ADRB3抗体，能够增加抗原提呈细胞 数量，从而有效地捕获、加工和提呈抗原给T细胞。本抗体作为免疫佐剂，增强 抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答，提高基因工程疫苗免疫原性， 用于研制新型的乙型肝炎、流感病毒、HIV基因工程疫苗。本抗体还可以用来生 产和研制抗毒血清，包括但不局限于：蛇、乙脑、破伤风、狂犬病抗毒血清。
[0160] 本发明公开了ADRB3抗体抑制移植器官后免疫系统出现的各种排斥反应， 用来预防和治疗器官移植后的排斥反应。
[0161] 根据ADRB3信号通路中的蛋白，本发明公开了ADRB3抗体用于治疗与 P62，HK2，GAPDH，VEGF，Cyclin D1，CDK3，CDK4，Rb，Ki-67，mTOR， Rictor，AKT，Tubulin，TRAF6，PD-L1，P53，P63，IL-2，IL-6，IL-10，TGFβ 和TNFα信号通路相关的疾病。
[0162] 本发明公开了ADRB3抗体抑制原始和早、中幼粒细胞的增殖，促进CD4+T 细胞、Treg和髓源性抑制细胞的凋亡，减少组织中的粒细胞、巨噬细胞和淋巴 细胞的浸润，减轻炎症反应所造成的组织损伤，这种组织损伤是衰老、器官功能 衰竭和恶性肿瘤发生的基础。
[0163] 本发明公开了ADRB3抗体能提高机体对细菌内毒素的耐受性，有良好的退 热和缓解毒血症的作用。用于治疗严重创伤、脓毒症性、内毒素血症、感染性休 克、多器官功能障碍综合征。ADRB3抗体治疗急性化脓性感染如脓肿、肺炎、 阑尾炎、丹毒、菌血症、内脏穿孔、猩红热等。
[0164] 基于ADRB3参与调控溶质载体超家族和ATP结合盒超家族基因表达，影 响药物和有毒物质的吸收、分布和清除等过程。本发明公开了ADRB3抗体治疗 中毒如酸中毒、高乳酸血症、尿毒症、有机磷中毒、酒精中毒、巴比妥类中毒、 重金属(铅、汞、砷、铊等)中毒、细菌毒素(破伤风毒素、白喉毒素、肉毒杆 菌毒素等)中毒等。可溶性ADRB3作为一种预测上述中毒性疾病预后的新指标， 血液中ADRB3水平升高，预后变差。
[0165] 本发明公开了ADRB3抗体抑制mTOR信号，特别是抑制 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)的活性，用于治疗衰老相关 性疾病和抗衰老。下丘脑中的mTORC1蛋白是血压控制的关键因子，mTORC1 过度激活导致血压升高，ADRB3抗体抑制mTORC1而起到降血压作用。
[0166] 突触(synapse)是两个神经元之间或神经元与效应器细胞之间相互接触、 并借以传递信息的部位。突触功能抑制和突触丧失与认知能力下降强相关。在阿 尔茨海默氏症的早期阶段，ADRB3抑制突触间的信号转导，表现为近期记忆力 减退。本发明人发现，阿尔茨海默氏症患者的脑脊髓液中，可溶性ADRB3的浓 度要高于正常水平，引起神经的炎症，导致患者记忆力退化。ADRB3抗体能够 逆转阿尔茨海默氏症中所见的记忆丧失。
[0167] 小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统中的免疫细胞，清除中枢神经系统中 的损坏的神经，斑块及感染性物质。ADRB3在小胶质细胞中表达，正常活性的 ADRB3信号通路促进小胶质细胞的增殖，维持小胶质细胞的功能，增加神经生 长因子，促进神经组织再生。病理情况下，活跃的ADRB3信号通路会过多激活 小胶质细胞，导致小胶质细胞去分化而丧失其功能，引起神经毒性，削弱神经元 突触可塑性，在神经退化类疾病的发病机理中起到重要的作用。本发明公开了抗 人ADRB3单克隆抗体能增加学习和记忆能力，促进神经再生，治疗神经疾病， 包括但不局限于：阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬 化症、癫痫、共济失调毛细血管扩张症、格林-巴利综合征、牛海绵状脑病、克 雅氏病、亨廷顿氏舞蹈症、肝豆状核变性、秽语抽动综合征、脆性X染色体综 合征、Lambert Eaton肌无力综合征、获得性神经肌强直、边缘性脑炎、自身免 疫性脑炎、抗NMDA受体脑炎、视神经脊髓炎、桥本脑病、狼疮脑病、病毒性 脑炎、锥体外系疾病、急性出血性白质脑炎、弥漫性硬化、脱髓鞘疾病、小脑萎 缩症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、截瘫、脊髓损伤、脊髓空洞症、脊髓 炎等。
[0168] 本发明公开了ADRB3抗体抑制神经系统的炎症反应，缓解压力状态下引起 的焦虑或抑郁。ADRB3抗体用于治疗精神疾病，包括但不局限于：精神分裂症、 分裂情感性障碍、偏执性精神病、癫痫所致精神障碍、双相情感性精神障碍、抑 郁症、自闭症、强迫症、神经性厌食、神经性贪食、惊恐障碍、边缘性人格障碍、 感染性精神病、躯体疾病所致精神病、中毒性精神病(一氧化碳中毒、农药中毒)、 老年性痴呆、酒精中毒性精神病、脑外伤性精神病、神经症、慢性疲劳综合征等。
[0169] 本发明公开了ADRB3抗体用于治疗酒精和毒品(如海洛因、甲基苯丙胺、 吗啡、大麻和可卡因等)导致的成瘾。
[0170] ADRB3在骨重塑过程中起关键作用，ADRB3在破骨细胞中表达，调控骨吸 收。ADRB3基因敲除可增加小鼠骨质。本发明公开了ADRB3抗体能够抑制破 骨细胞，促进骨形成，用于治疗骨退行性变相关的疾病，所述骨退行性变包括 骨质疏松症、骨性关节炎、退行性关节炎、骨折延缓愈合或不愈合、股骨头坏死、 股骨头骨骺滑脱、股骨颈异常、多发性骨骺发育不良、陈旧性骨折、化脓性关节 炎、骨髓炎、痛风、软骨钙质沉着症等。
[0171] 本发明中的不同杂交瘤细胞株产生的抗人ADRB3单克隆抗体的功能是不同 的，部分杂交瘤细胞株如5B8、5D1产生的抗体能阻滞ADRB3，降低ADRB3 活性。还有部分杂交瘤细胞株如4G7、4F7等产生的抗体能激活ADRB3，增加 ADRB3活性。具有激活ADRB3作用的ADRB3抗体和激动剂如BRL37344可以 维持干细胞的未分化状态，添加到培养基中用来培养干细胞、胚胎干细胞、造血 干细胞。还可以用来生产和培养诱导性多能干细胞。
[0172] ADRB3抗体可以用来包被细胞培养板，用于淋巴细胞培养。本抗体可以用 于制作免疫磁珠细胞分选试剂、酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂、荧光偶联抗 体、HRP偶联抗体或其他标签蛋白偶联抗体。
[0173] 除了细胞膜以外，ADRB3蛋白还存在于胞浆和细胞核。肿瘤细胞内的 ADRB3大部分位于细胞核，中性粒细胞内的ADRB3主要位于胞浆，不同定位 的ADRB3暴露的抗原表位不同，同样的抗体与不同定位的ADRB3的亲和力不 同。本发明公开了采用ADRB3蛋白的N端和中部片段多肽免疫动物而产生的抗 体易于与肿瘤细胞的ADRB3的结合，该抗体可用于标记肿瘤细胞。ADRB3蛋 白的C端多肽片段免疫产生的抗体易于结合粒细胞胞浆中的ADRB3，该抗体可 用于标记粒细胞。
[0174] 本发明公开了利用ADRB3基因来制备预防性肿瘤疫苗，利用ADRB3全长 蛋白和多肽片段来制备治疗性肿瘤疫苗，诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫 反应，以达到清除或控制肿瘤的目的。本发明公开了ADRB3抗体增加浆细胞产 生抗体的能力。
[0175] 本发明公开了制备ADRB3单克隆抗体与其他肿瘤或病毒特异性抗原的重组 融合蛋白，诱导抗肿瘤和抗病毒免疫应答。其他肿瘤或病毒特异性抗原包括以不 局限于：人前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、甲胎蛋白、 癌胚抗原、突变的ras基因编码蛋白、c-myc基因产物、糖蛋白抗原(CA)50、 CA1523、CA7224、CA549、细胞角蛋白19、鳞状细胞相关抗原(SCC)、C反应 蛋白、PD-1、PD-L1、HIV蛋白、乙型和丙型肝炎病毒蛋白等。
[0176] 本发明公开了利用ADRB3单克隆抗体，结合血浆分离、血液透析、腹膜透 析等技术来减少血液、腹水或其他体液中过度活化的ADRB3，治疗炎症、脓毒 症、肿瘤、心衰和恶病质。减少老年人血液中的ADRB3，可以延缓衰老。利用 ADRB3抗体来吸附患者血液、胸水、腹水或其他体液中的中性粒细胞、淋巴细 胞、MDSC、Treg和M2型单核细胞，进行免疫吸附治疗，治疗适应症等同于 ADRB3单克隆抗体的适应症。
[0177] 基于正常活性的ADRB3促进再生的生理功能，在ADRB3活性低下的情况 下，通过适当增加血液、脑脊液、心脏、脑、外周神经、脊髓、肝脏、胰腺、肾 脏、肌肉等组织中的ADRB3含量和活性的方式来促进组织再生，用于治疗衰老 相关性疾病和外伤导致的损伤如截瘫。但在ADRB3活性亢进的情况下，应采用 降低ADRB3活性的抗体来促进再生。
[0178] 生殖道炎症与不孕不育相关，精浆ADRB3检测是男性生殖道炎症的特异性 指标。本发明人发现老年ADRB3基因敲除小鼠生育能力强于正常老年小鼠，给 予ADRB3抗体的母鼠每窝产仔数量多于正常母鼠。ADRB3抗体减少雄鼠精浆 弹性硬蛋白酶水平，提示ADRB3抗体抑制生殖道炎症。ChIP-chip的结果提示 ADRB3调控大量与卵子、精子活力有关的基因如IZUMO1，TSSK3，TSSK6， TSKS等表达。ADRB3抗体能够增强卵子、精子活力，可用于治疗不孕不育。
[0179] 基于ADRB3增加弹性蛋白酶活性，本发明公开了ADRB3抗体用于制备护 肤类化妆品，具有延缓皮肤衰老、恢复皮肤弹性、减少皱纹、减少色素沉着的功 效。
[0180] 本发明涉及到的ADRB3抗体还有兔单克隆抗体、鼠源性、嵌合性、全人源 性抗体、单域抗体(single domain antibody)、单链抗体(scFv)、双特异性抗 体、Fab抗体片段、合成抗体(Synbody)等，这些抗体的共同点是能特异性结 合ADRB3。生产抗体所用的细胞包括CHO、SP2/0、BHK-21、Vero细胞等。
[0181] 本发明公开了与本抗体相关的ADRB3表位，包括但不限于以下抗原表位： S212，S239，S349，C110，C189，T65，T140，S191，Y336，Y346，K151，R152， C153，P343，P350，P368，P369，P371，P377，P381，P391，P394，H190，H288， N8，N26，T150，T108，T114，G41，G106，G146，G271，G295，G383，G402， C275，C363，Y145，Y204，Y214，Y236，Y346。本发明中的抗体结合但不限 于上述表位而起到调控ADRB3功能的作用。(S：丝氨酸，C：半胱氨酸，T：苏 氨酸，Y：酪氨酸，K：赖氨酸，R：精氨酸，C：半胱氨酸，P：脯氨酸，H：组 氨酸，N：天冬酰胺)。
[0182] 本发明公开了制作ADRB3抗体所需要的多肽片段，包括但不限于以下多肽：
[0183] 人ADRB3全长蛋白(1-408氨基酸残基)；ADRB3蛋白的N端片段(1-155 氨基酸残基)；ADRB3蛋白的C端片段(156-408氨基酸残基)；ADRB3蛋白 中的亮氨酸拉链片段(296-317aa)；核定位序列(NLS)(351-369aa)；E1(ADRB3 第1-36氨基酸残基)；E2(ADRB3第101-
111氨基酸残基)；I2(ADRB3第134-155 氨基酸残基)；E4(ADRB3第315-326氨基酸残基)；I4(ADRB3第348-408氨基酸 残基)；ITIM1(143LRYGAL 148或143LRYGTL 148或
140LRYRAV146)； ITIM2(202IPYALL 207或202MPYVLL 207或199VPYALL 204)；ITIM3(212 SFYLPL 217)；344LIYCRS 349等。
111氨基酸残基)；I2(ADRB3第134-155 氨基酸残基)；E4(ADRB3第315-326氨基酸残基)；I4(ADRB3第348-408氨基酸 残基)；ITIM1(143LRYGAL 148或143LRYGTL 148或
140LRYRAV146)； ITIM2(202IPYALL 207或202MPYVLL 207或199VPYALL 204)；ITIM3(212 SFYLPL 217)；344LIYCRS 349等。
[0184] 抗人ADRB3单克隆抗体，其轻链和重链的氨基酸序列：
[0185] 一种特异性结合ADRB3的抗体，其包含：
[0186] a)包含下列的重链互补决定区(CDR)：
[0187] i)含有与SEQ ID NO：1、4、7、10具有至少70％的序列同一性的氨基酸 序列的第一CDR；
[0188] ii)含有与SEQ ID NO：2、5、8、11具有至少80％的序列同一性的氨基 酸序列的第二CDR；
[0189] iii)含有与SEQ ID NO：3、6、9、12具有至少80％的序列同一性的氨基 酸序列的第三CDR；和
[0190] b)包含下列的轻链CDR：
[0191] i)含有与SEQ ID NO：13、16、19、22具有至少80％的序列同一性的氨 基酸序列的第一CDR；
[0192] ii)含有与SEQ ID NO：14、17、20、23具有至少80％的序列同一性的氨 基酸序列的第二CDR；和
[0193] iii)含有与SEQ ID NO：15、18、21、24具有至少80％的序列同一性 的氨基酸序列的第三CDR。
[0194] 如本领域技术人员将认可的，本文中所公开的CDR可包括变体，例如将本 文中所公开的CDR回复突变为不同的框架区。通常，个体变体CDR与本文所述 序列的氨基酸同一性为至少70％或80％，更典型地具有优选至少75％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的渐增的 同一性。
[0195] c)人源化抗体的重链可变区(variable region,V区)包含与SEQ ID NO:25 具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列；和/或
[0196] d)人源化抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO:26具有至少70％的序列 同一性的氨基酸序列。
[0198]
[0199]
[0200] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0201] 本发明明确了ADRB3是神经-内分泌-免疫调节网络中的关键受体，ADRB3 介导多种信号通路，介导的信号通路调控中性粒细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞等的 增殖和分化。正常情况下，ADRB3维持机体的非特异免疫和特异免疫能力，清 除外源病原微生物和老化的机体组织而起到保护机体和抗衰老的作用。病理情况 下，该信号通路的过度活化将导致系统慢性炎症，破坏免疫稳态。针对ADRB3 的单克隆抗体能够特异结合并调控(阻滞或激动)ADRB3的活性，可用于治疗 炎症、恶性肿瘤、病毒感染、心脑血管疾病(如动脉粥样硬化)、糖尿病、神 经退行性疾病(如阿尔茨海默病)、自身免疫性疾病、衰老性疾病、脓毒症、 哮喘、内毒素血症、感染性休克、多器官功能障碍综合征、急性化脓性感染、 再生功能障碍导致的疾病、淋球菌感染、贫血、严重创伤、过敏性疾病、恶病 质疾病、中毒性疾病、器官移植免疫排斥、恶病质疾病、肺动脉高压、急性冠 脉综合征、骨退行性变、肥厚型心肌病、MDSC相关性疾病和精神疾病等多种 疾病，具有重要的医药价值和应用前景。附图说明
[0202] 图1：ADRB3(B3AR)蛋白在G0期(Ki-67阴性)人乳腺癌MCF7细胞的 核仁中高表达；在增殖期细胞(Ki-67阳性)的细胞核中也有ADRB3，但很少位 于核仁。
[0203] 图2：ADRB3蛋白在G0期(Nucleolin阴性)MCF7细胞的核仁中高表达。
[0204] 图3：ADRB3蛋白在MCF7细胞的核仁中(Fibrillarin阳性)高表达。
[0205] 图4：ADRB3蛋白蓄积在G0期MCF7细胞(H3K9AC阴性)的核仁。
[0206] 图5：在Brdu阴性(非S期)的MCF7细胞核中，有大量ADRB3蛋白。
[0207] 图6：A.ADRB3蓄积在MCF7细胞核和核仁中；B.ADRB3在融合细胞的 多个细胞核中。
[0208] 图7：ADRB3在G0期(Ki-67阴性)人肺癌A549细胞的核仁中高表达， 在增殖期细胞(Ki-67阳性)核中的表达量较低。
[0209] 图8：ADRB3在G0期(Nucleolin阴性)人胰腺癌CFPAC1细胞的核仁中 高表达，在增殖期细胞(Nucleolin阳性)的核仁中表达量较低。
[0210] 图9：ADRB3在人黑色素瘤A375细胞的核仁中(Fibrillarin阳性)高表达。
[0211] 图10：ADRB3定位在人胰腺癌PANC1细胞线粒体外膜。
[0212] 图11：ADRB3定位在MCF7细胞纺锤体两极的中心体。
[0213] 图12：ADRB3定位在A549细胞纺锤体两极和赤道。
[0214] 图13：A.ADRB3定位在人肝癌HepG2细胞的微管上；B.ADRB3定位在人 胰腺癌PANC1细胞的微管、细胞核和线粒体上。
[0215] 图14：A.ADRB3定位在人胶质瘤A172细胞纺锤体两极；B.ADRB3定位 在MCF7多倍体细胞的中心体位置。
[0216] 图15：ADRB3定位在MCF7细胞的溶酶体上。
[0217] 图16：A.ADRB3增加G0期细胞膜上的蛋白发生酪氨酸磷酸化，可能会促 进HER2/EGFR/药泵等膜蛋白的酪氨酸磷酸化而活化膜蛋白；B.ADRB3大量蓄 积在G2末期MCF7细胞核中，此时DNA复制完成，已经形成染色体，核仁和 核膜消失。
[0218] 图17：A.ADRB3在G2末期MCF7细胞的中心体，促进微管发生中心的形 成；B.ADRB3在MCF7细胞的液泡外膜，促进液泡的形成。
[0219] 图18：乳腺癌组织和癌旁组织中ADRB3表达示意图；ADRB3在病理分级 3级的乳腺癌组织中高表达；每一竖列为一个患者所取标本，上方两个样品为癌 组织，下方两个是癌旁组织。
[0220] 图19：142例乳腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线，纵坐标是累计生存率，横 坐标是生存时间(月)；癌组织ADRB3阴性患者(negative)的生存率明显高 于阳性者(positive)，P＝0.025。
[0221] 图20：肺癌组织和癌旁组织中ADRB3表达示意图；右1和右2个是一个 肺鳞癌病人(g15)的癌旁和癌组织；右3和右4是一个肺腺癌病人(f15)的癌 旁和癌组织。
[0222] 图21：112例肺癌患者Kaplan-Meier生存曲线，纵坐标是累计生存率，横 坐标是生存时间(月)；癌组织ADRB3弱阳性患者的生存率明显高于强阳性患 者，P＝0.038。1代表弱阳，2代表强阳。
[0223] 图22：胰腺癌组织和癌旁组织中ADRB3表达示意图。
[0224] 图23：129例胰腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线，纵坐标是累计生存率， 横坐标是生存时间(月)；癌组织ADRB3阴性患者(0)的生存率明显高于阳 性者(1)，P＝0.019。
[0225] 图24：90例结肠癌组织和癌旁组织中ADRB3的表达示意图，左图为癌组 织。
[0226] 图25：90例结肠癌组织和癌旁组织中ADRB3的表达情况，癌组织中的 ADRB3表达明显高于正常结肠组织(P＝0.0001)。
[0227] 图26：左图为50岁以上的肝癌患者癌组织中的ADRB3表达量显著高于癌 旁组织，P＝0.04；右图为162例肝细胞肝癌患者Kaplan-Meier生存曲线，纵坐标 是累计生存率，横坐标是生存时间(月)；癌组织ADRB3阴性患者(0)的生 存率明显高于阳性者(1)，P＝0.038。
[0228] 图27：A.正常人骨髓涂片ADRB3和MPO染色，ADRB3在中性粒细胞 (MPO阳性)高表达；B.中性粒细胞内ADRB3呈圆锥形结构嵌入细胞核；C.圆 锥型的ADRB3复合物始于细胞膜，贯穿胞浆，延伸到细胞核，形成一条通道。
[0229] 图28：注射格拉诺赛特(重组人粒细胞集落刺激因子)后的正常人骨髓涂片 ADRB3和MPO染色；淋巴细胞诱导性表达ADRB3。
[0230] 图29：同一个急性B淋巴细胞白血病患者治疗前和治疗后缓解(CR)骨髓 涂片的ADRB3和Ki-67染色，上图为治疗前。同治疗前相比，治疗后缓解的粒 细胞和白血病细胞中的ADRB3表达降低。
[0231] 图30：A.急性B淋巴细胞白血病治疗后复发患者骨髓涂片的ADRB3和 MPO染色；ADRB3在粒细胞和白血病细胞中高表达，提示ADRB3诱导B淋巴 细胞癌变；B.ADRB3聚集在粒细胞和淋巴细胞相互接触的部位，有利于细胞间 粘附复合物稳定，促进形成抑制性免疫突触；C.淋巴细胞胞浆和细胞核的 ADRB3形成锥形结构。
[0232] 图31：急性B淋巴细胞白血病治疗后复发患者骨髓涂片的ADRB3和Ki-67 染色；粒细胞中高表达ADRB3和Ki-67，这种粒细胞是MDSC，加重病情进展。
[0233] 图32：急性单核细胞白血病(M5)患者治疗后缓解的骨髓涂片ADRB3和 MPO染色。
[0234] 图33：急性髓细胞性白血病患者治疗后缓解的骨髓涂片ADRB3和Ki-67 染色；ADRB3在增殖期粒细胞(Ki-67阳性)中高表达。
[0235] 图34：A.免疫小鼠所采用的不同ADRB3多肽；B.western blot检测抗体 的特异性。
[0236] 图35：抗体轻链的核酸和蛋白序列。
[0237] 图36：抗体重链的核酸和蛋白序列。
[0238] 图37：ADRB3基因敲除小鼠和正常小鼠腹腔注射LPS 30mg/kg，各组小鼠 的生存曲-/-线；ADRB3 小鼠脓毒症死亡率降低。
[0239] 图38：ADRB3抗体在体外和体内均能杀伤MCF7细胞；A.ADRB3单克隆 抗体减少MCF7乳腺癌细胞活力；B.ADRB3抗体抑制裸鼠MCF7乳腺癌细胞移 植瘤增殖，纵坐标是移植瘤体积(立方毫米)，横坐标是接种细胞后的天数， B3Ab为抗体组；C.ADRB3抗体增加MCF7移植瘤裸鼠的脾脏指数；D.ADRB3 抗体减少裸鼠MCF7移植瘤cyclin D1、磷酸化Rb、CDK3和IL-6的表达，降低CDK3活力。
[0240] 图39：不同骨髓杂交瘤细胞株产生的ADRB3抗体处理后，SW1990胰腺癌 细胞的活性减少率；抗体采用的浓度是250ng/ml；横坐标是杂交瘤细胞株编号。
[0241] 图40：不同骨髓杂交瘤细胞株产生的ADRB3抗体处理后，CFPAC1细胞 的活性减少率；抗体采用的浓度是250ng/ml；横坐标是杂交瘤细胞株编号。
[0242] 图41：ADRB3抗体减小裸鼠CFPAC1细胞移植瘤体积。
[0243] 图42：接种到裸鼠的人CFPAC1胰腺癌细胞移植瘤生长曲线，Ab为抗体 处理组；ADRB3单克隆抗体抑制CFPAC1细胞移植瘤增殖。
[0244] 图43：裸鼠CFPAC1胰腺癌细胞移植瘤重量柱形图；ADRB3单克隆抗体 减轻CFPAC1细胞移植瘤的重量。
[0245] 图44：CFPAC1移植瘤裸鼠体重柱形图；ADRB3抗体不影响CFPAC1移 植瘤裸鼠的体重。
[0246] 图45：裸鼠ASPC1胰腺癌细胞移植瘤；ADRB3抗体减小ASPC1细胞移植 瘤的体积。
[0247] 图46：接种到裸鼠的人ASPC1胰腺癌细胞移植瘤生长曲线，Ab为ADRB3 抗体处理组；ADRB3单克隆抗体抑制ASPC1细胞移植瘤增殖。
[0248] 图47：裸鼠ASPC1胰腺癌细胞移植瘤重量柱形图；ADRB3单克隆抗体减 轻ASPC1细胞移植瘤的重量。
[0249] 图48：ASPC1胰腺癌细胞移植瘤裸鼠体重柱形图；ADRB3单克隆抗体不 影响ASPC1移植瘤裸鼠的体重。
[0250] 图49：ADRB3单克隆抗体治疗SW1990移植瘤裸鼠；A.接种到裸鼠的人 SW1990胰腺癌细胞移植瘤生长曲线，ADRB3单克隆抗体抑制SW1990细胞移 植瘤增殖；B.ADRB3单克隆抗体增加SW1990细胞凋亡率；C.ADRB3抗体减 少SW1990荷瘤小鼠中性粒细胞和NLR，与对照组相比，*P<0.05。
[0251] 图50：接种到裸鼠的人A375黑色素瘤细胞移植瘤生长曲线；ADRB3单克 隆抗体抑制A375细胞移植瘤增殖；*p＝0.032,#p＝0.005；Ab为ADRB3抗体处理 组。
[0252] 图51：ADRB3单克隆抗体治疗A375移植瘤裸鼠；A.A375移植瘤裸鼠外 周血中的MSDC流式细胞检测；B.ADRB3抗体减少A375移植瘤裸鼠外周血中 的MSDC数量；C.荷瘤小鼠血清ELISA检测；ADRB3抗体增加IL-10，减少IL-6、VEGF和MPO浓度，与对照组比，*p<0.05。
[0253] 图52：A.接种到裸鼠的人A549肺癌细胞移植瘤生长曲线；ADRB3单克 隆抗体抑制A549细胞移植瘤增殖，与对照组相比，*p<0.05；B.ADRB3抗体抑 制小鼠4T1乳腺癌细胞肝转移。
[0254] 图53：ADRB3单克隆抗体剂量依赖性降低人肺癌H1299细胞活力。
[0255] 图54：ADRB3单克隆抗体剂量依赖性降低人肝癌HepG2细胞活力。
[0256] 图55：ADRB3单克隆抗体剂量依赖性降低人结肠癌HCT116细胞活力。
[0257] 图56：ADRB3单克隆抗体剂量依赖性降低人早幼粒白血病HL-60细胞活 力。
[0258] 图57：ADRB3单克隆抗体剂量依赖性降低人胶质瘤U251细胞活力。
[0259] 图58：ADRB3特异性嵌合抗原受体修饰后的T淋巴细胞能够杀伤SW1990 细胞(左图中的A1是SW1990)和H1299细胞(右图C3)。
[0260] 图59：ADRB3基因敲除小鼠外周血中的白细胞总量、中性粒细胞和单核细 胞均降低；WBC:白细胞，ne#：中性粒细胞，ly#：淋巴细胞，mo#：单核细胞。
[0261] 图60：ADRB3基因敲除小鼠淋巴细胞百分比增加，中性粒细胞百分比降低， NLR降低；ly％：淋巴细胞百分比，ne％：中性粒细胞百分比，mo％：单核细胞 百分比。
[0262] 图61：ADRB3基因敲除小鼠的肌肉量增加。
[0263] 图62：ADRB3基因敲除小鼠的骨密度和骨矿含量均增加。
[0264] 图63：A.ADRB3基因敲除小鼠血清细胞因子检测，Relative Fluorescence Units:相对荧光单位；与对照组比，*P<0.05；B.ADRB3-/-小鼠血清ELISA检测； ADRB3-/-小鼠血清IL-10增加，IL-6、VEGF和MPO减少。
[0265] 图64：ADRB3基因敲除小鼠脾脏CD4+T细胞、Treg细胞流式检测。
[0266] 图65：ADRB3基因敲除小鼠心肌Cyclin D1免疫组化；FVB小鼠是正常对 照。
[0267] 图66：ADRB3基因敲除小鼠的心脏B超检查；敲除ADRB3后，心功能良 好；FVB小鼠是正常对照。
[0268] 图67：4T1小鼠乳腺癌细胞不能在ADRB3基因敲除小鼠的皮下生长；FVB 小鼠是正常对照。
[0269] 图68：ADRB3抗体减少CDK4、nucleolin、HER2和p-Rb(Ser780)，增 加p16表达。
[0270] 图69：ADRB3抗体减少mTOR,p-mTOR(Ser2481),HK2和P62；Rapa为雷 帕霉素，CQ为氯喹。
[0271] 图70：5D1抗体减少ADRB3,p-Rb(Ser780)和GAPDH；4G7增加ADRB3， 增加p-Rb(Ser780)；两种抗体都能降低GAPDH和CDK4；SR为ADRB3抑 制剂SR59230A。
[0272] 图71：5D1抗体减少PD-L1、CDK3和GAPDH的表达。
[0273] 图72：用siRNA抑制p62后，减少ADRB3和Rab7的表达；雷帕霉素增 加ADRB3表达；沉默p62后，ADRB3不能上调mTOR、Rictor、SIRT1和ADRB3 的表达。
[0274] 图73：ADRB3抗体减少裸鼠MCF7移植瘤中的mTOR、Rictor、p-AKT(Ser 473)、p-4EBP1(T37/46)、HK2、P62、Rab7、SIRT1、ADRB3、VDAC、Rheb 的表达，增加p53表达。
[0275] 图74：ADRB3抗体减少裸鼠MCF7移植瘤中的HK2、P62、p-mTOR(S2481)、 Rictor、IL-6；A.对照组，B.抗体组。
[0276] 图75：ADRB3激动后，增加下游信号通路中的mTOR、Rictor、4EBP1、 CENPA、P62、Drp1、AKT和AMPK等蛋白的磷酸化。
[0277] 图76：ADRB3抗体抑制MCF7细胞线粒体自噬小体的清除。
[0278] 图77：A.ADRB3抗体降低线粒体膜电位，表现为JC1染色为绿色；B. ADRB3抗体增加MCF7细胞内活性氧。
[0279] 图78：A.ADRB3抗体增加细胞内脂褐素；B.ADRB3抗体增加MCF7细胞 内的5-CFDA含量。
[0280] 图79：A.ADRB3抗体增加MCF7细胞内的罗丹明123含量；B.ADRB3 抗体增加细胞内SA-β-Gal(衰老相关β半乳糖苷酶)。
[0281] 图80：ADRB3抗体减少裸鼠MCF7细胞移植瘤组织摄取18F-FDG；(A) 18F-FDG PET扫描图；(B)重建图像上靶组织(T)与邻近正常组织(非靶组织N) 的灰度比值柱形图；(C)对照组:移植瘤出现放射性浓聚影，肿瘤FDG摄取与 肝脏相似，没有中心坏死，白色箭头所示为移植瘤；(D)ADRB3抗体组：移 植瘤中间出现放射性稀疏缺损，肿瘤摄入FDG比肝脏少，出现中心液化坏死； (E)ADRB3抗体减少肿瘤组织ATP产量；(F)ADRB3抗体降低肿瘤组织HK 活性。
[0282] 图81：ADRB3抗体组MCF7细胞移植瘤组织透射电镜图，ADRB3抗体导 致线粒体嵴减少和体积膨胀。
[0283] 图82：ADRB3抗体组裸鼠MCF7细胞移植瘤细胞中，线粒体自噬体蓄积 在胞浆中，没有被清除，黑色箭头所示为线粒体自噬体，白色箭头所示是脂滴。
[0284] 图83：ADRB3被抑制后，腺病毒无法感染A549肺癌细胞，ADRB3抗体 通过抑制mTOR第2448位点的丝氨酸磷酸化而起到抑制腺病毒感染的作用；A. 上排图为腺病毒感染的细胞，p-mTOR(Ser2448)明显增加并蓄积在细胞膜下，下 排图为用ADRB3抗体预处理的细胞，不发生腺病毒感染；B.ADRB3抗体抑制 p-mTOR(Ser2448)，减少mTOR下游底物4EBP1的磷酸化。
[0285] 图84：ADRB3和腺病毒都定位于核仁，ADRB3是病毒复制所需的关键蛋 白。
[0286] 图85：乙型肝炎患者肝细胞胞浆ADRB3增加，ADRB3抗体抑制HBV感 染HepG2细胞。
[0287] 图86：肺癌胸水细胞涂片MPO、ADRB3免疫荧光；A.肺癌患者胸水中存 在大量可溶性ADRB3(soluble B3,sB3)，提示粒细胞通过脱颗粒方式释放sB3 到血液和组织间隙；B.粒细胞胞浆中有大量ADRB3；C/D.胸水中高表达 ADRB3的粒细胞(MPO+)易于粘附肺癌细胞；E.胸水中脱落肺癌细胞高表达 ADRB3。
[0288] 图87：ChIP-Chip实验芯片扫描图。
[0289] 图88：A.携带绿色荧光蛋白(GFP)ADRB3可以杀死胰腺癌SW1990细 胞；B.ADRB3质粒图。
[0290] 图89：A.携带Flag标签蛋白的ADRB3不能进入MCF7细胞核；B.ADRB3 定位在MCF7细胞的微管、细胞核和线粒体上。
[0291] 图90：ADRB3/ApoE双敲除和ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化斑块检测；A. ADRB3和ApoE双敲除小鼠的主动脉明显比ApoE-/-小鼠增粗；B.主动脉油红O 染色；C.血清炎性因子ELISA检测。
[0292] 图91：免疫荧光检测正常人外周血涂片细胞中ADRB3的表达；A.ADRB3 在正常人的中性粒细胞中表达，淋巴细胞有微量表达；B.ADRB3在幼稚或原始 型T淋巴细胞(胞质含有大量CD4或CD8的淋巴细胞)中大量表达；C.G2晚 期和有丝分裂早期的细胞中高表达ADRB3，此时期的细胞核膜已经破裂，染色 体复制完成，但尚未形成纺锤体。
[0293] 图92：A.乳腺癌病人外周血涂片ADRB3免疫荧光，粒细胞和异型淋巴细 胞有大量ADRB3，右上方是异型淋巴细胞，ADRB3大量表达，细胞核发生粒细 胞样改变；B.乳腺癌病人的粒细胞出现大量足突，ADRB3附着在足突上。
[0294] 图93：乳腺癌病人外周血涂片ADRB3免疫荧光；上方为淋巴细胞，高表 达ADRB3，微量表达MPO；下方为粒细胞，ADRB3大量蓄积在粒细胞与淋巴 细胞的接触位置，起到了黏附因子样作用，促进形成免疫突触。粒细胞诱导淋巴 细胞向髓系细胞分化。
[0295] 图94：乳腺癌病人外周血涂片ADRB3免疫荧光；A.乳腺癌患者血液中大 量形成中性粒细胞胞外网络(NET)，淋巴细胞(MPO阴性)黏附在NET中； B.黄色方框中的淋巴细胞表现为MPOdimADRB3bright，可能是淋巴系祖细胞或原 始型淋巴细胞。
[0296] 图95：乳腺癌患者血液中的淋巴细胞(黄色方框内)高表达ADRB3和Ki-67， 处于增殖期，发生去分化，是幼稚或原始型淋巴细胞；说明患者淋巴细胞功能减 退，发生特异免疫缺陷。
[0297] 图96：乳腺癌患者部分淋巴细胞高表达ADRB3，少量表达Ki-67和MPO， 是幼稚或原始型淋巴细胞。
[0298] 图97：乳腺癌患者血液中有大量DNA碎片，ADRB3附着在DNA碎片上。
[0299] 图98：正常人外周血涂片细胞中ADRB3的免疫荧光检测——原始浆细胞 的细胞核大于T细胞，胞质内有大量ADRB3；
[0300] 图99：正常人外周血涂片细胞中ADRB3的免疫荧光检测——成熟浆细胞 的特征为胞浆没有CD4或CD8，但含有大量ADRB3；
[0301] 图100：正常人外周血涂片细胞中ADRB3的免疫荧光检测——CD19+B细 胞膜上表达ADRB3。
[0302] 图101：ADRB3抗体促进补体激活；A.ADRB3抗体增加补体C8和C5R1； LPS为内毒素，作为诱导补体的阳性对照；B.免疫荧光检测C8和B3AR。
具体实施方式
[0304] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材 料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0305] 实施例1免疫荧光检测肿瘤细胞中ADRB3的定位
[0306] 1、实验方法
[0307] 乳腺癌MCF7细胞、肺癌A549细胞、黑色素瘤A375、胰腺癌CFPAC1 细胞、肝癌HepG2细胞、胶质瘤A172细胞以105/孔接种于6孔板，内置无菌 盖玻片，孵育至细胞贴片后，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3遍。0.1％ TritonX-100通透10分钟，3％BSA封闭1h，滴加 Ki-67/ADRB3/Nucleolin/Fibrillarin/H3K9AC/Brdu/α-tubulin/Flag等的抗体 (1∶100)，线粒体染料采用Mitotracker，溶酶体染料采用Lysotracker，细胞固 定前给予Brdu，lipofectin 3000转染pcDNA3-flag-B3质粒到细胞。湿盒密闭， 4℃冰箱孵育过夜。PBS漂洗，5min×3，滴加FITC标记的二抗(anti-rabbit, 1∶800)和PE标记的二抗(anti-mouse,1∶800)，室温孵育
1h，DAPI 0.5μg/ml， 3min，PBS漂洗5min×3，50％甘油/PBS封片，激光共聚焦显微镜下观察，随 机观察5～7个视野并拍片，Fluorchem 8900软件测量细胞平均红色荧光强度 和平均绿色荧光强度。
1h，DAPI 0.5μg/ml， 3min，PBS漂洗5min×3，50％甘油/PBS封片，激光共聚焦显微镜下观察，随 机观察5～7个视野并拍片，Fluorchem 8900软件测量细胞平均红色荧光强度 和平均绿色荧光强度。
[0308] 2、实验结果
[0309] 如附图1～17所示，可得出如下结果：
[0310] (1)通过Ki67/nucleolin/Brdu染色，发现G0期细胞中存在大量的核仁， 但G0期核仁的组成蛋白不同于G1期细胞，不能用G1期核仁的蛋白标志物 来标记G0期细胞的核仁。ADRB3在G0期(Ki-67和Nucleolin为阴性)人 乳腺癌MCF7细胞的核仁中高表达。图1中，右上细胞是具有增殖能力的G0 期细胞。
[0311] (2)ADRB3在G0期(Ki-67阴性)人肺癌A549细胞的核仁中高表达。
[0312] (3)ADRB3在G0期(Nucleolin阴性)人胰腺癌CFPAC1细胞的核仁 中高表达。
[0313] (4)ADRB3在人黑色素瘤A375细胞的核仁中(Fibrillarin阳性)高表 达。
[0314] (5)ADRB3定位在人胰腺癌PANC1细胞线粒体外膜。
[0315] (6)ADRB3定位在A549细胞纺锤体两极的中心体和纺锤体赤道。ADRB3在融合细胞的多个细胞核中。
[0316] (7)ADRB3定位在人肝癌HepG2细胞的微管上。
[0317] (8)ADRB3定位在人胶质瘤A172细胞纺锤体两极的中心体。ADRB3 定位在多倍体细胞的中心体位置。
[0318] (9)ADRB3定位在MCF7细胞的溶酶体上。ADRB3增加G0期细胞膜 上的蛋白发生酪氨酸磷酸化，促进HER2/EGFR/药泵等膜蛋白的酪氨酸磷酸化 而活化膜蛋白。
[0319] (10)ADRB3定位在G2末期MCF7细胞的中心体，促进微管发生中心 的形成。
[0320] (11)ADRB3在MCF7细胞的液泡外膜，促进液泡的形成。ATP6V0D1 是液泡型ATP酶D亚基，位于液泡膜。ADRB3与ATP6V0D1共定位，说明 ADRB3位于液泡膜。
[0321] 实施例2组织芯片免疫组化方法检测肿瘤组织中ADRB3的表达情况
[0322] 1、本研究采用11种不同组织来源的肿瘤组织芯片，共1479例病人：(1) 42例非小细胞肺癌组织；(2)150例有生存期资料的肺腺癌；(3)150例生 存期肺鳞癌；(4)180例生存期肝癌；(5)170例生存期乳腺癌和82例无生 存期乳腺癌；(6)170例生存期胰腺癌；(7)62例甲状腺乳头状癌；(8) 90例生存期结肠癌；(9)90例生存期肾癌；(10)93例生存期食管癌；(11) 90例生存期胃癌；(12)90例生存期直肠癌；(13)20例白血病。
[0323] 2、实验步骤：(1)石蜡切片：厚度4μm；(2)烤片：65℃，3h；(3) 脱蜡至水：二甲苯10min×3缸，100％-100％-95％-95％-90％-80％-70％酒精各 5min，水化5-10min；(4)抗原修复：PH8.0TRIS-EDTA修复液高压修复， 从排气阀开始排气算起3min，自然冷却；(5)3％过氧化氢孵育10min；(6) PBS浸洗5min×3次；(7)10％山羊血清封闭10min；(8)配制一抗(1：100)； (9)弃血清加一抗，4℃过夜；(10)孵育完后，PBS浸洗5min×3次；(11) 加二抗，室温孵育30min；(12)PBS浸洗5min×3次；(13)DAB显色(A 液与B液比例为1：50)，在显微镜下观察，表达适当，背景清晰，即可终止； (14)苏木素复染1min，温水返蓝15min；(15)过梯度酒精脱水： 70％-80％-90％-95％-95％-100％-100％，各3秒；(16)二甲苯透明5min×2缸； (17)中性树胶封片。
[0324] 3、染色强度判定：
[0325] 每个组织点随机观察6～8个高倍视野，阳性细胞数超过5％时即确定为染 色阳性病例。弱阳性为淡黄色(+或1)、中阳性为棕黄色(++或2)、强阳 性为棕褐色(+++或3)。
[0326] 染色阳性率判定：每个组织点随机观察6～8个高倍视野，阳性细胞数超 过5％时即确定为染色阳性病例。弱阳性为淡黄色(+或1)、中阳性为棕黄色 (++或2)、强阳性为棕褐色(+++或3)。染色阳性率判定：选取3个染色 强度不同的视野在高倍镜下进行判读，每个视野中随机记100个细胞，记100 个细胞中阳性细胞占的百分率X1％，同样原理看另外2个视野的阳性细胞占 的百分率后X2％、X3％，最终该组织点染色阳性率取X1％、X2％及X3％的平 均数。
[0327] 对组织芯片中各点评分，根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分 之和来判断。首先将染色强度评分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄 色，3分为棕褐色。再将阳性细胞所占的百分比评分：0分为阴性，<25％为1 分，25％～50％为2分，>50％为3分。两种积分相加为该点得分。
[0328] Kaplan-Meier法对癌组织中ADRB3阴性和阳性的患者作生存分析，获得 两组生存曲线。统计学检验采用Log Rank法，比较各组生存曲线分布是否相 同。
[0329] 4、实验结果
[0330] 结果如附图18～26和表2～4所示。由表2可知，乳腺癌组织中的ADRB3 表达明显高于正常乳腺组织(P＜0.01)。由表3可知，肺癌组织中的ADRB3表达 明显高于正常肺组织(P＜0.01)。由表4可知，胰腺癌组织中的ADRB3表达明显 高于正常胰腺组织(P＜0.01)。
[0331] 表2：ADRB3在228例乳腺癌组织和89例癌旁组织的表达情况
[0332]
[0333]
[0334] 表3：ADRB3在150例肺癌患者癌组织和癌旁组织的表达情况
[0335]B3AR 例数 - + ++ +++
癌 150 8 63 45 34
5.3％ 42.0％ 30.0％ 22.7％
总阳性率 94.7％
癌旁 150 139 10 1 0
92.7％ 6.7％ 0.7％ 0.0％
总阳性率 7.3％
癌 150 8 63 45 34
5.3％ 42.0％ 30.0％ 22.7％
总阳性率 94.7％
癌旁 150 139 10 1 0
92.7％ 6.7％ 0.7％ 0.0％
总阳性率 7.3％
[0336] 表4：165例胰腺癌组织和癌旁组织的ADRB3表达情况
[0337]B3AR 例数 - + ++ +++
癌 165 26 84 51 4
15.8％ 50.9％ 30.9％ 2.4％
总阳性率 84.2％
癌旁 165 115 46 4 0
69.7％ 27.9％ 2.4％ 0.0％
总阳性率 30.3％
癌 165 26 84 51 4
15.8％ 50.9％ 30.9％ 2.4％
总阳性率 84.2％
癌旁 165 115 46 4 0
69.7％ 27.9％ 2.4％ 0.0％
总阳性率 30.3％
[0338] 由图18～26和表2～4所示可得出如下实验结果：
[0339] (1)ADRB3蛋白的阳性表达主要定位于细胞核中，少数位于胞浆和胞膜。 ADRB3在乳腺癌组织中的阳性率为90.9％(210/228)，其中57.3％是中、强阳 性。癌旁乳腺组织中，ADRB3的阳性率为31.5％(28/89)，中阳性占3.6％(1/28)， 无强阳性。乳腺癌组织中的ADRB3表达明显高于正常乳腺组织(P＜0.01)。 ADRB3表达量与乳腺癌的恶性程度呈正相关，随细胞恶性程度增加，ADRB3 逐渐上升。在病理分级I级乳腺癌组织中的阳性率为73.7％(28/38)，III级乳 腺癌组织中的阳性率为97.6％(40/41)，ADRB3在病理分级III级的乳腺癌组织 中高表达，明显高于I级的乳腺癌组织(P＜0.01)。ADRB3表达量与乳腺癌的 分期(AJCC第六版临床分期)相关，病程越晚的肿瘤，ADRB3的表达越强。 1期乳腺癌组织中，ADRB3阳性率为65.0％(13/20)。3期乳腺癌组织中，阳 性率为100％(67/67)。ADRB3减少乳腺癌患者的生存率，乳腺癌患者ADRB3 阳性表达者无病生存期和总生存期均明显短于阴性者。142例乳腺癌患者 Kaplan-Meier生存曲线分析，癌组织ADRB3阴性患者的生存率明显高于阳性 者，P＝0.025。两组的平均生存时间(mean survival)分别是154个月和126 个月。
从生存率曲线图中可见，随时间的延长，ADRB3阳性患者生存率逐渐 下降，接近170个月时，生存率约为60％。而ADRB3阴性患者的生存率下降 较阳性者缓慢，在170月时，生存率仍在
90％以上。风险量曲线图的趋势也 十分明显，即随时间的延长，ADRB3阳性患者在生存上所经历的死亡风险愈 来愈大，到170个月时，大约是起初(0个月)的5倍。而ADRB3阴性患者 的死亡风险较阳性者小，在170月时，死亡风险尚未到起初的1倍。癌组织 ADRB3与Ki67的相关系数为0.296(P＝0.02)，有显著性的线性正相关关系。
从生存率曲线图中可见，随时间的延长，ADRB3阳性患者生存率逐渐 下降，接近170个月时，生存率约为60％。而ADRB3阴性患者的生存率下降 较阳性者缓慢，在170月时，生存率仍在
90％以上。风险量曲线图的趋势也 十分明显，即随时间的延长，ADRB3阳性患者在生存上所经历的死亡风险愈 来愈大，到170个月时，大约是起初(0个月)的5倍。而ADRB3阴性患者 的死亡风险较阳性者小，在170月时，死亡风险尚未到起初的1倍。癌组织 ADRB3与Ki67的相关系数为0.296(P＝0.02)，有显著性的线性正相关关系。
[0340] (2)肺癌组织中的ADRB3表达明显高于正常肺组织(P＜0.01)。ADRB3 表达越多，生存期越短。Kaplan-Meier生存分析，肺癌组织ADRB3弱阳性患 者的生存率明显高于强阳性患者，P＝0.038。ADRB3弱阳性患者的中位生存时 间为81个月，强阳性患者的中位生存时间为50个月。癌组织ADRB3水平和 肺癌的快速恶化及较差预后直接相关。ADRB3抗体减少ADRB3在癌症中的 表达，可以治疗肺癌转移的患者。
[0341] (3)胰腺癌组织中的ADRB3表达明显高于癌旁组织(P＜0.01)，癌组织 ADRB3阴性患者(0)的生存率明显高于阳性者(1)，P＝0.019。阴性患者的 平均生存时间是43.6个月，阳性患者是29.4个月。
[0342] (4)结肠癌组织中的ADRB3表达明显高于正常结肠组织(P＝0.0001)。
[0343] (5)肝细胞肝癌组织中的ADRB3表达量与年龄和病理分级正相关，年 龄越大、恶性程度越高，ADRB3蛋白越多。50岁以上的肝癌患者癌组织中的 ADRB3表达量显著高于癌旁组织，P＝0.04。162例肝细胞肝癌患者 Kaplan-Meier生存分析结果示：癌组织ADRB3阴性患者的生存率明显高于阳 性者，P＝0.038。ADRB3阴性患者的中位生存时间是37个月，阳性者的中位 生存时间是25个月。
[0344] (6)在急性淋巴细胞白血病复发患者中，骨髓粒细胞的胞质内含大量密 集的粗面内质网，ADRB3和Ki-67附着在内质网上，ADRB3和Ki-67含量明 显增加，显著高于治疗缓解者。
[0345] (7)肾癌、甲状腺癌、直肠癌、食管癌与胃癌的癌组织中的ADRB3表 达均高于癌旁组织。
[0346] 实施例3免疫荧光检测不同类型白血病患者骨髓涂片细胞中ADRB3的表达
[0347] 1、实验方法同实施例1。
[0348] 2、结果如附图27～33所示：
[0349] (1)髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是中性粒细胞的标志蛋白， ADRB3在正常人的中性粒细胞中表达，在淋巴细胞中不表达。中性粒细胞胞 浆内的ADRB3形成锥形结构直达细胞核，ADRB3形成的通道有助于胞外的 物资(如病毒)进入细胞核，阻滞ADRB3，会抑制病毒进入细胞核。在B淋 巴细胞白血病人中，ADRB3在白血病细胞和中性粒细胞均有表达，提示 ADRB3诱导B淋巴细胞癌变。白血病细胞中的ADRB3也形成直达细胞核的 通道[0350] (2)注射格拉诺赛特(注射用重组人粒细胞集落刺激因子)后的正常人骨 髓涂片ADRB3和MPO染色。粒细胞集落刺激因子刺激粒细胞增殖，粒细胞 大都处于增殖期，ADRB3在增殖期的不成熟粒细胞中高表达，提示ADRB3 刺激粒细胞增殖而抑制其分化成熟。在粒细胞集落刺激因子的作用下，淋巴细 胞(MPO阴性)表达ADRB3，提示ADRB3是诱导性表达，ADRB3具有调 控淋巴细胞增殖和分化的作用。
[0351] (3)急性B淋巴细胞白血病治疗后复发患者骨髓涂片的ADRB3和MPO 染色。在白血病治疗后复发患者的粒细胞和白血病细胞中，ADRB3均高表达， 含有大量ADRB3的粒细胞是导致B淋巴细胞白血病复发的关键因素， ADRB3+粒细胞会促进G0期的白血病细胞进入增殖期，导致复发。同治疗前 相比，急性B淋巴细胞白血病患者治疗后的粒细胞和白血病细胞中的ADRB3 表达降低。ADRB3聚集在粒细胞(抗原提呈细胞)和淋巴细胞相互接触的部 位，有利于细胞间粘附复合物稳定，促进形成抑制性免疫突触。ADRB3诱导 粒细胞与白血病细胞融合，改变癌细胞的表型，增加癌细胞的恶性程度，使癌 细胞耐药。淋巴细胞内ADRB3呈锥形结构直达细胞核，ADRB3影响淋巴细 胞的表观遗传学修饰和基因表达谱，促进增殖。
[0352] (4)急性B淋巴细胞白血病治疗后复发患者骨髓涂片的ADRB3和Ki-67 染色。粒细胞中高表达ADRB3和Ki-67，两个蛋白共定位在胞浆中，提示粒 细胞核糖体功能旺盛，合成大量细胞生长因子。通过释放生长因子，刺激G0 期的淋巴细胞和肿瘤细胞进入增殖期。MDSC是ADRB3和Ki-67双阳性的粒 细胞，能够抑制T细胞、NK细胞等免疫细胞清除白血病细胞和其他肿瘤细胞。 白血病治疗后复发的患者骨髓和外周血中，ADRB3+Ki-67+粒细胞明显增加， 提示该类粒细胞是导致白血病复发的关键。
[0353] (5)急性单核细胞白血病(M5)患者治疗缓解后骨髓涂片的粒细胞和白血 病细胞均表达ADRB3。
[0354] (6)ADRB3在急性髓细胞性白血病患者的增殖期粒细胞(Ki-67阳性) 中高表达。
[0355] 实施例4杂交瘤细胞株的制备、ADRB3抗体的纯化、抗体测序和人源化
[0356] 1、用人ADRB3蛋白片段(包括全长)免疫小鼠，采用的部分抗原表位如 图34A所示，包括但不限于以下抗原表位：人ADRB3全长蛋白(1-408氨基酸残 基)、ADRB3蛋白的N端片段(1-155氨基酸残基)、ADRB3蛋白的C端片段 (156-408氨基酸残基)、ADRB3蛋白中的亮氨酸拉链片段(296-317aa)、核 定位序列(NLS)(351-369aa)、E1(ADRB3第1-36氨基酸残基)、E2(ADRB3 第101-111氨基酸残基)、I2(ADRB3第134-155氨基酸残基)、E4(ADRB3第 315-326氨基酸残基)、I4(ADRB3第348-408氨基酸残基)等。加入弗氏完全佐 剂给BALB/c小鼠皮下注射，初次免疫后21天，从尾静脉加强免疫。4天后制 备脾细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，HAT选择杂交瘤细胞，杂交 瘤克隆化，最终每个ADRB3蛋白片段都获得了若干个杂交瘤细胞株，共筛选出 30余个能产生ADRB3抗体的杂交瘤细胞株。酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋 白免疫印迹(图34B)和免疫荧光试验检测抗体的特异性、亲和性。Trizol裂解 杂交瘤细胞后，提RNA，做抗体的轻重链测序。构建人源化抗体的轻链质粒(核 酸和蛋白序列如图35所示，但不限于图35)和重链质粒(核酸和蛋白序列如图 36所示，但不限于图36)。使用BPfectin Transfection Reagent，H:L＝1:1,转染 试剂与质粒比为3:1，转染HEK293，在生物反应器中培养，大量生产抗体。
[0357] 小鼠腹水收集抗体：10～11周龄Balb/c小鼠，腹腔注射完全免疫佐剂，0.1ml/ 只，6天后腹腔注射杂交瘤细胞5*106，细胞接种后8天开始抽腹水，隔天抽一 次。3000rmp，
10min，腹水上清-80℃保存。硫酸铵浓缩后，使用Protein G亲和 层析柱纯化，按照抗体纯化标准做法来进行纯化洗脱，SDS-PAGE进行纯度鉴定。 定量采用UV定量。
10min，腹水上清-80℃保存。硫酸铵浓缩后，使用Protein G亲和 层析柱纯化，按照抗体纯化标准做法来进行纯化洗脱，SDS-PAGE进行纯度鉴定。 定量采用UV定量。
[0358] 实施例5内毒素致死实验
[0359] 1、实验方法
[0360] LPS按30mg/kg腹腔注射小鼠(正常FVB小鼠和ADRB3基因敲除小鼠 各10只)。注射用水溶解LPS，配成1mg/ml。小鼠称重(g)，重量*0.03， 得出注射用量(ml)，观察小鼠的死亡并记录死亡时间，绘制各组小鼠的生 存曲线。HE染色观察肝、肺组织炎性坏死和粒细胞浸润情况。腹腔分泌物细 胞涂片做免疫荧光，检测中性粒细胞。免疫组化检测肝、肺组织IL-6、MPO、 Elastase蛋白的表达。
[0361] 2、实验结果
[0362] 注射内毒素后，小鼠活力明显减弱，体温降低，部分小鼠眼睛流出脓液， 出现脓毒症表现。注射LPS后的16小时内，10只FVB小鼠全部死亡，2只 ADRB3-/-小鼠死亡，8只ADRB3-/-小鼠存活。与正常小鼠相比，ADRB3-/-小鼠 脓毒症死亡率明显降低(图37)，肝、肺组织发生炎性坏死的面积明显减轻。 两组小鼠的腹部均出现大量脓液，小鼠发生腹膜炎伴脓毒症。在ADRB3基因 敲除后的腹膜炎小鼠体内，被招募至腹膜病灶处的中性粒细胞数量明显减少。 ADRB3-/-小鼠肝、肺组织中的IL-6、Elastase蛋白的表达均明显降低，说明肝、 肺组织的炎症反应和中性粒细胞浸润被抑制。
[0363] 实施例6 MTT实验检测ADRB3单克隆抗体抗癌效果
[0364] 1、实验步骤：
[0365] (1)选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血 清的RPMI l640培养基配成5000个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中， 每孔接种200μl，37℃，5％CO2培养24h。(2)实验组换新的含不同浓度ADRB3 单克隆抗体的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设3～5平行 孔，37℃，5％CO2培养4～5d。(3)弃去上清液，每孔加入200μl新鲜配 制的含0.5mg/ml MTT的无血清培养基。37℃继续培养4h。小心弃上清， 并加入200μl DMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为 570nm，参比波长为
450nm测定光密度值。
450nm测定光密度值。
[0366] 2、实验结果如图38A～40和图53～57所示：
[0367] ADRB3单克隆抗体剂量依赖性降低人MCF7乳腺癌细胞、SW1990和CFPAC1胰腺癌细胞、A549肺癌细胞、H1299肺癌细胞、HepG2肝癌细胞、 HCT116结肠癌细胞、HL-60早幼粒白血病细胞、U251胶质瘤细胞活力。与 对照组比，*P<0.05,#P<0.01。
[0368] 实施例7 ADRB3单克隆抗体抑制裸鼠移植瘤增殖
[0369] 1、实验方法
[0370] 5周龄雌性裸鼠，在靠近乳腺的位置，皮下注射人肿瘤细胞或小鼠4T1乳 腺癌细胞，每只注射5*106细胞。人肿瘤细胞包括MCF7、CFPAC1、ASPC1、 SW1990、A375、A549细胞。83
～10天后，移植瘤约100mm ，随机分为抗体 组和对照组，每组8只。抗体组腹腔注射ADRB3抗体，每隔3天，剂量范围 1～10mg/kg，测量肿瘤的长宽高。对照组腹腔注射小鼠IgG。当对照组肿瘤体 积达到动物伦理委员会所允许的最大体积时，眼眶取血，脱颈椎处死裸鼠，剥 离移植瘤和脾脏，称瘤重、脾脏重量和体重。计算脾脏指数＝脾脏重量(mg)/ 小鼠体重(g)。
～10天后，移植瘤约100mm ，随机分为抗体 组和对照组，每组8只。抗体组腹腔注射ADRB3抗体，每隔3天，剂量范围 1～10mg/kg，测量肿瘤的长宽高。对照组腹腔注射小鼠IgG。当对照组肿瘤体 积达到动物伦理委员会所允许的最大体积时，眼眶取血，脱颈椎处死裸鼠，剥 离移植瘤和脾脏，称瘤重、脾脏重量和体重。计算脾脏指数＝脾脏重量(mg)/ 小鼠体重(g)。
[0371] 2、实验结果如图38，图41～52所示：
[0372] (1)ADRB3单克隆抗体抑制裸鼠MCF7乳腺癌细胞移植瘤增殖，与对 照组比，*P<0.05,#P<0.01。ADRB3抗体组的小鼠脾脏明显大于对照组动物， ADRB3抗体增加脾脏指数，具有帮助免疫器官发育成熟的功能。移植瘤HE 染色表明ADRB3抗体减少移植瘤中性粒细胞浸润。脾脏组织HE染色，对照 组脾脏内结构分界不清，看不到白髓和红髓明显的分界线，其中可见大量中性 粒细胞。ADRB3抗体增大脾小体和生发中心，减少脾脏中的中性粒细胞数量。 免疫组化示，ADRB3抗体减少移植瘤中肿瘤细胞和浸润性中性粒细胞 ADRB3、P62、Cyclin D1、MPO、Neutrophil Elastase、p-Rb(S780)、CDK3 和IL-6的表达，降低CDK3的活力。
[0373] (2)ADRB3抗体减小裸鼠CFPAC1胰腺癌细胞移植瘤的生长，与对照 组比，*p<0.05。ADRB3抗体减轻CFPAC1细胞移植瘤的重量，不影响CFPAC1 移植瘤裸鼠的体重，ADRB3抗体增加脾脏指数。HE染色表明ADRB3抗体减 少移植瘤中性粒细胞浸润。免疫组化示，ADRB3抗体减少移植瘤中肿瘤细胞 和浸润性中性粒细胞ADRB3、Cyclin D1、Neutrophil Elastase、p-Rb(S780)、 p-mTOR(S2481)、Rictor、HK2、CDK3和IL-6的表达。
[0374] (3)ADRB3抗体减小裸鼠ASPC1胰腺癌细胞移植瘤的生长，与对照组 比，*P<0.05。ADRB3抗体减轻ASPC1细胞移植瘤的重量，不影响ASPC1移 植瘤裸鼠的体重。
[0375] (4)ADRB3抗体抑制SW1990胰腺癌细胞移植瘤增殖，增加SW1990 细胞凋亡率，与对照组比，*P<0.05。ADRB3抗体减少荷瘤小鼠中性粒细胞数 量和中性粒细胞-淋巴细胞比率(NLR)，与对照组相比，*P<0.05。ADRB3抗体 增加脾脏指数。
[0376] (5)ADRB3抗体抑制A375黑色素瘤细胞移植瘤增殖。与对照组比， *P＝0.032,#P＝0.005。ADRB3抗体减少A375移植瘤裸鼠外周血MSDC数量。 HE染色和免疫组化示，对照组A375移植瘤中有大量中性粒细胞浸润，而且 中性粒细胞中高表达PD-L1，ADRB3抗体减少A375移植瘤中性粒细胞浸润。 免疫组化示，ADRB3抗体抑制A375移植瘤细胞和浸润的中性粒细胞ADRB3、 IL-6、MPO、Neutrophil Elastase、PD-L1、p-Rb(Ser 780)、p-mTOR(Ser
2481)、 Rictor、HK2和CDK4的表达。抗体治疗后，移植瘤浸润的中性粒细胞无PD-L1 表达。
ELISA检测血清中的炎症因子，ADRB3抗体增加小鼠血清中IL-10浓 度，减少IL-6、VEGF和MPO浓度。ADRB3抗体通过特异性抑制ADRB3的 表达和活性，从而抑制中性粒细胞介导的炎症反应，改变肿瘤微环境，起到抗 癌作用。
2481)、 Rictor、HK2和CDK4的表达。抗体治疗后，移植瘤浸润的中性粒细胞无PD-L1 表达。
ELISA检测血清中的炎症因子，ADRB3抗体增加小鼠血清中IL-10浓 度，减少IL-6、VEGF和MPO浓度。ADRB3抗体通过特异性抑制ADRB3的 表达和活性，从而抑制中性粒细胞介导的炎症反应，改变肿瘤微环境，起到抗 癌作用。
[0377] (6)ADRB3抗体增加脾脏指数，抑制人肺癌A549细胞移植瘤增殖,与 对照组相比，*P<0.05。HE染色表明ADRB3抗体减少移植瘤中性粒细胞浸润。 免疫组化示，ADRB3抗体减少移植瘤细胞和浸润性中性粒细胞ADRB3、cyclin D1、Neutrophil Elastase、p-Rb(Ser 780)、p-mTOR(Ser 2481)、Rictor、HK2、 CDK3和IL-6的表达。
[0378] (7)ADRB3抗体减少小鼠4T1乳腺癌细胞移植瘤的增殖，抑制4T1细 胞肝脏转移，对照组8只小鼠全部发生严重的肝转移，抗体组的肝脏转移灶明 显少于对照组。ADRB3促进4T1细胞肝转移，阻滞ADRB3能抑制肝脏转移。 ADRB3抗体增加脾脏指数，减少血液中性粒细胞的数量，增加淋巴细胞占 WBC的比率，降低NLR。NLR是全身炎症反应的指标，NLR增高是肿瘤患 者预后不良的独立危险因素。ADRB3抗体降低NLR，表明本抗体能抑制炎症， 改善患者预后。
[0379] 实施例8 ADRB3特异性嵌合抗原受体修饰后的T淋巴细胞能够杀伤SW1990细胞(A1)和H1299细胞(C3)
[0380] 1、实验方法
[0381] ADRB3嵌合抗原受体由抗人ADRB3的单链抗体、CD8铰链区和跨膜区、 CD137(又名4-1BB)的胞内信号区、CD3ζ的胞内信号结构串联构成。根据 ADRB3单克隆抗体的测序结果，构建嵌合抗原受体慢病毒表达载体，包装慢 病毒。分离原代T细胞，并使用上述慢病毒构建重组CAR-T细胞。将靶细胞 SW1990细胞(A1)和H1299细胞(C3)按50000个/孔的浓度接种至
96孔板中过 夜培养；然后按照图示效靶比(E/T)加入CAR-T细胞，共培养6小时，离心后 取上清，使用LDH试剂盒检测。以未加CAR-T的靶细胞孔经裂解后作为 Maximal lysis，未经裂解的孔作为minimal lysis。
96孔板中过 夜培养；然后按照图示效靶比(E/T)加入CAR-T细胞，共培养6小时，离心后 取上清，使用LDH试剂盒检测。以未加CAR-T的靶细胞孔经裂解后作为 Maximal lysis，未经裂解的孔作为minimal lysis。
[0382] 2、实验结果
[0383] H1299细胞的半数有效E/T是2:1，SW1990细胞的半数有效E/T是2.5:1(图 58)。ADRB3嵌合抗原受体修饰后的T淋巴细胞能够杀死ADRB3阳性肿瘤， 用于治疗肺癌和胰腺癌。抗ADRB3CAR-T细胞针对肿瘤细胞和肿瘤内环境中 的炎性细胞(中性粒细胞、Treg和巨噬细胞)，即使肿瘤细胞中不表达ADRB3， 本CAR-T细胞仍然能够通过抑制肿瘤环境细胞而起到抗癌作用，是通用型 CAR-T细胞，适用于所有恶性肿瘤和炎性疾病的治疗。
[0384] 实施例9 ADRB3基因敲除小鼠实验
[0385] 1、实验方法
[0386] 16周龄的ADRB3基因敲除小鼠和正常FVB小鼠各15只，雄性，取外周 血做血常规、血生化。小鼠TH17细胞因子抗体芯片(QAM-TH17-1， Array Glass Chip)检测血清细胞因子，激光扫描仪Axon GenePix 扫描信号。检测骨密度、脂肪和肌肉含量。10、30、
70周龄ADRB3基因敲除 小鼠各8只，心脏B3超检测心功能。外周血细胞和脾细胞做流式检测不同亚 型T细胞和巨噬细胞的数量及比例。免疫组化检测心脏CDK3、cyclinD1、 p-mTOR(Ser2448)、p-mTOR(Ser2481)、p-4EBP1(T37/46)。水迷宫实验研究小 鼠的学习记忆能力。
70周龄ADRB3基因敲除 小鼠各8只，心脏B3超检测心功能。外周血细胞和脾细胞做流式检测不同亚 型T细胞和巨噬细胞的数量及比例。免疫组化检测心脏CDK3、cyclinD1、 p-mTOR(Ser2448)、p-mTOR(Ser2481)、p-4EBP1(T37/46)。水迷宫实验研究小 鼠的学习记忆能力。
[0387] 12周龄ADRB3基因敲除小鼠和正常FVB小鼠各10只，均为雌性，皮下 接种106小鼠乳腺癌细胞4T1，形成移植瘤后，每隔3天，测量肿瘤的长宽高。 携带鼠乳腺肿瘤病毒的MMTV-PyVT小鼠敲除ADRB3基因后，观察雌性小 鼠乳腺肿瘤的发生情况。
[0388] 2、实验结果如图59～67所示：敲除小鼠的ADRB3基因，检测外源肿瘤 细胞的成瘤情况，发现小鼠机体的免疫系统得到改善，能够摧毁癌细胞。4T1 乳腺癌细胞在正常FVB小鼠体内成瘤，但不能在ADRB3-/-鼠中成瘤。老年 ADRB3-/-鼠自发性肿瘤的发病率明显减少。MMTV-PyVT小鼠剔除ADRB3基 因后，雌性小鼠乳腺肿瘤发生率明显减少。ADRB3基因敲除小鼠寿命延长， 不发生自身免疫病和癌症。
[0389] (1)ADRB3-/-小鼠外周血中性粒细胞明显降低，淋巴细胞百分比降低， NLR降低，红细胞平均体积偏低。ADRB3增加中性粒细胞和单核细胞的数量， 不影响淋巴细胞的数量，由于增加中性粒细胞数量而下调NLR，上调白细胞 总量。ADRB3增加中性粒细胞和单核细胞的百分比，减少淋巴细胞的百分比。
[0390] (2)ADRB3-/-小鼠肌肉量增加。ADRB3敲除小鼠骨密度和骨矿含量均增 加。
[0391] (3)ADRB3-/-小鼠血清中炎症细胞因子如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17F、 IL-21、-/-IL-22、TGF-β、MIP-3α等降低，IL-10增加。ELISA检测血清中炎症 因子，ADRB3 小鼠血清IL-10浓度升高，IL-6、VEGF和MPO浓度降低。
[0392] (4)ADRB3-/-小鼠脾脏CD4+T细胞和Treg细胞均明显降低。
[0393] (5)ADRB3-/-小鼠心脏B超检查。老年ADRB3-/-小鼠心功能强于对 ADRB3野生型老年小鼠，ADRB3-/-小鼠心功能没有随着年龄的增加而出现明 显降低。与对照组相比，ADRB3-/-小鼠心肌CDK3、cyclinD1表达增加， mTORC2/4EBP1通路被激活，心肌细胞的核糖体增加。
[0394] (6)肿瘤细胞和粒细胞产生并释放ADRB3入血来抑制T淋巴细胞，摧 毁机体特异免疫，促进癌细胞生长。敲除ADRB3所产生的抗癌疗效，是由于 增强了免疫系统的抗癌活性。-/- +
ADRB3 小鼠中性粒细胞和Treg细胞均减少、 CD8 T细胞增加，增强了机体免疫监视、防御功能。
ADRB3 小鼠中性粒细胞和Treg细胞均减少、 CD8 T细胞增加，增强了机体免疫监视、防御功能。
[0395] (7)ADRB3-/-小鼠的学习记忆能力强于ADRB3野生型小鼠。
[0396] 实施例10不同浓度的ADRB3抗体处理MCF-7/A549/SW1990细胞
[0397] 1、实验方法
[0398] 不同浓度的ADRB3抗体处理MCF-7/A549/SW1990细胞，对照组用小鼠 IgG。24h后裂解细胞，提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，取10ug蛋白，10％SDS PAGE分离后将蛋白转至PVDF膜上，4％脱脂牛奶封闭1h，孵育 一抗，4℃过夜，二抗孵育1h，ECL显色，实验重复3次。Fluorchem 8900 软件分析蛋白质条带的灰度值，计算目的条带与内参条带(GAPDH或actin) 的比值。裸鼠移植瘤组织做免疫组化检测ADRB3信号通路中的相关蛋白 mTOR、Rictor、p-AKT(S473)、p-4EBP1(T37/46)、HK2、P62、Rab7、SIRT1、 ADRB3、VDAC、Rheb表达。
[0399] 2、实验结果如图68～75所示：
[0400] (1)ADRB3抗体减少MCF-7/A549/SW1990细胞CDK4，nucleolin，HER2 和pRb的表达；增加P16表达。
[0401] (2)ADRB3抗体剂量依赖性减少MCF-7/A549/SW1990细胞Rheb,mTOR, p-mTOR(S2481),HK2和P62。
[0402] (3)ADRB3抗体(5D1)减少MCF-7/A549/SW1990细胞ADRB3,p-Rb (S780)和GAPDH。4G7增加ADRB3，增加p-Rb(S780)。两种抗体都能 降低GAPDH和CDK4。
[0403] (4)ADRB3抗体减少MCF-7/A549/SW1990细胞PD-L1、CDK3的表达。
[0404] (5)设计siRNA沉默P62后，减少MCF-7/A549/SW1990细胞ADRB3 和Rab7的表达。雷帕霉素增加ADRB3表达。沉默P62表达后，ADRB3不能 上调mTOR、Rictor、SIRT1和ADRB3的表达。
[0405] (6)ADRB3抗体减少裸鼠MCF-7移植瘤中的mTOR、Rictor、p-AKT (S473)、p-4EBP1(T37/46)、HK2、P62、Rab7、SIRT1、ADRB3、VDAC、 Rheb，增加P53。
[0406] (6)ADRB3抗体减少裸鼠MCF-7移植瘤中的HK2、P62、p-mTOR(S2481)、 Rictor、IL-6。
[0407] (8)ADRB3激动后，增加MCF-7/A549/SW1990细胞下游信号通路中的 mTOR、Rictor、4EBP1、CENPA、P62、Drp1、AKT和AMPK等蛋白的磷酸 化。
[0408] 实施例11线粒体自噬检测
[0409] 1、实验方法
[0410] 终浓度20ng/ml的ADRB3抗体处理MCF-7细胞，2h或8h后固定细胞， Mitotracker染线粒体，免疫荧光检测LC3II表达，激光共聚焦显微镜观察。JC-1(10ug/ml)染色15min，活细胞状态下在共聚焦显微镜下观察，激发光波长 510nm和580nm。ROS染料H2DCFDA 10uM，染色15min，共聚焦显微镜下 观察。488nm波长荧光，观察细胞内脂褐素。P-糖蛋白(P-
glycoprotein,P-gP) 底物5-CFDA-AM，10uM标记细胞，激发光波长510nm，共聚焦显微镜观察。 罗丹明123(Rhodamine 123)细胞染色，流式细胞仪检测。β-半乳糖苷酶原位 染色，检测MCF7细胞中β-半乳糖苷酶的表达。
glycoprotein,P-gP) 底物5-CFDA-AM，10uM标记细胞，激发光波长510nm，共聚焦显微镜观察。 罗丹明123(Rhodamine 123)细胞染色，流式细胞仪检测。β-半乳糖苷酶原位 染色，检测MCF7细胞中β-半乳糖苷酶的表达。
[0411] 2、实验结果如图76～79所示：随着作用时间延长，ADRB3抗体组中的 LC3II表达明显增加。ADRB3抗体抑制线粒体自噬小体的清除而使自噬体蓄 积在细胞中，ADRB3促进自噬体的清除，保障线粒体自噬过程的顺利进行。 ADRB3抗体降低线粒体膜电位，表现为JC1染色为绿色。ADRB3抗体增加 细胞内活性氧、脂褐素和β-半乳糖苷酶。ADRB3抗体阻断自噬，使自噬体、 受损线粒体和脂褐素等代谢废物蓄积在细胞内从而降低细胞活性，加速细胞老 化或凋亡。5-CFDA染色发现细胞生长出大量丝状突触，也说明细胞老化。 ADRB3抗体增加MCF-7细胞内的5-CFDA和罗丹明123的含量，说明ADRB3 抗体逆转MCF-7细胞多药耐药。
[0412] 实施例12 ADRB3抗体减少肿瘤组织的糖代谢
[0413] 1、实验方法
[0414] ADRB3抗体处理5周后，MCF-7荷瘤鼠尾静脉注射18F-FDG，每只1毫 居(mCi)，50分钟后，3％异氟烷与氧气(1L/min)混合气体麻醉，仰卧位， 进行PET/CT扫描，动态采集图像，迭代法重建18F-FDG肿瘤代谢显像的图 像，Fluorchem 8900软件分析重建图像上靶组织(T)与邻近正常组织(非靶组 织N)的灰度值，计算T/N值。移植瘤组织放入冰预冷的RIPA裂解液，高速 匀浆，用相应的试剂盒检测组织中ATP含量和己糖激酶(HK)活性。
[0415] 2、实验结果表明(如图80)：对照组移植瘤部位可见放射性浓聚，ADRB3 抗体组移植瘤部位放射性较对照组减少约60％(0.78±0.44vs 1.96±0.94， P<0.01)。ADRB3抗体减少肿瘤组织ATP产量。ADRB3抗体降低肿瘤组织 HK活性。
[0416] 实施例13透射电镜观察移植瘤细胞线粒体和自噬小体
[0417] 1、实验方法
[0418] 移植瘤放入2.5％戊二醛中固定，并切成约1mm3组织块，用于制作电镜 样品。经过脱水、渗透、包埋处理的样品在Reichert超薄切片机中切片，获得 70nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色 15min，FEI(Czech Republic)透射电镜观察。
[0419] 2、实验结果
[0420] ADRB3抗体组MCF-7细胞移植瘤细胞中出现大量缺陷型线粒体，表现为 线粒体嵴减少、消失和体积膨胀(图81)。抗体组移植瘤细胞线粒体自噬体蓄积 在胞浆中，加速细胞的老化。阻滞线粒体外膜的ADRB3，会破坏线粒体膜电 位，损伤线粒体结构和功能，导致胞浆出现大量缺陷型线粒体。如果细胞的自 噬正常，缺陷线粒体将被自噬性清除。ADRB3的阻滞破坏自噬小体与溶酶体 的融合，导致自噬体不能被清除。黑色箭头所示为线粒体自噬体，白色箭头所 示是脂滴(图82)。
[0421] 实施例14 ADRB3抗体抑制腺病毒和乙肝病毒(HBV)感染细胞
[0422] 1、实验方法
[0423] A549细胞爬片，给予ADRB3抗体预处理30min，接种携带GFP的腺病 毒106PFU/ml，置于37℃培养箱内孵育24小时，对照组用小鼠IgG。免疫 荧光检测磷酸化mTOR(S2448)的表达。方法同实施例1。
[0424] 收集慢性乙型肝炎患者肝组织标本，免疫组化检测ADRB3表达，方法同 实施例2。
[0425] HepG2细胞爬片，给予ADRB3抗体预处理30min，接种HBV 1ml，置于 37℃培养箱内孵育24小时，对照组用小鼠IgG。4％多聚甲醛固定，加兔抗-HBC (1∶100)检测HBcAg，置4C过夜，次日加羊抗兔IgG，37℃作用1小时， 洗涤后加入PAP(1∶50)，37℃孵育1小时，洗涤3次后DAB显色，镜检。
[0426] 2、实验结果
[0427] (1)ADRB3被抑制后，腺病毒无法感染A549肺癌细胞。ADRB3抗体 通过抑制mTOR第2448位点的丝氨酸磷酸化而起到抑制腺病毒感染的作用 (图83)，2448位点的丝氨酸磷酸化会激活mTOR，促进细胞自噬，而自噬 促进腺病毒的复制和释放。ADRB3抗体抑制mTOR活化而起到阻滞自噬的作 用，从而抑制腺病毒复制和释放。ADRB3抗体阻滞ADRB3后，可以增加C8 表达，C8能够溶解病毒，防止病毒感染。
[0428] (2)ADRB3和腺病毒都定位于A549肺癌细胞核仁，ADRB3可能是病 毒复制所需的关键蛋白(图84)。腺病毒通过激活核仁中的ADRB3，导致细 胞癌变。
[0429] (3)乙型肝炎患者肝细胞胞浆ADRB3高于正常人，细胞核内几乎没有 ADRB3的表达，胞质中的ADRB3增强核糖体功能，有助于合成HBV复制所 需的蛋白，胞质ADRB3与细胞核ADRB3的比值明显升高，比值越高表明病 毒复制约活跃，该比值可以作为检测乙肝病毒复制的指标。胞质中的ADRB3 介导HBV进入HepG2细胞并促进HBV复制。ADRB3抗体抑制HBV感染 HepG2细胞(图85)，说明本抗体具有治疗乙型肝炎的潜力。
[0430] 实施例15肺癌胸水细胞涂片免疫荧光检测细胞中的MPO/ADRB3表达情况
[0431] 1、实验方法
[0432] 收集20例确诊肺癌病人的胸水，吸取容器底部液体约5ml于离心管内， 2000rpm，10min，弃上清，保留0.5ml的剩余液体和沉淀，用细玻璃棒将沉淀 和液体混匀，用吸管吸出混匀的液体并将其滴在玻片上，每片1～2滴，推片 法制成均匀的涂片，置入95％酒精固定
15min，取出干燥待用。0.1％ TritonX-100通透10min，BSA封闭1h，滴加MPO/ADRB3抗体(1∶
100)，湿 盒密闭，4℃过夜。滴加FITC和PE标记的二抗，室温1h，DAPI 0.5ug/ml， 3min，50％甘油/PBS封片，激光共聚焦显微镜下观察，随机观察5～7个视野 并拍片，Fluorchem 8900软件测量细胞平均红色荧光强度和平均绿色荧光强 度。
15min，取出干燥待用。0.1％ TritonX-100通透10min，BSA封闭1h，滴加MPO/ADRB3抗体(1∶
100)，湿 盒密闭，4℃过夜。滴加FITC和PE标记的二抗，室温1h，DAPI 0.5ug/ml， 3min，50％甘油/PBS封片，激光共聚焦显微镜下观察，随机观察5～7个视野 并拍片，Fluorchem 8900软件测量细胞平均红色荧光强度和平均绿色荧光强 度。
[0433] 2、实验结果(如图86)：
[0434] (1)肺癌患者胸水中存在大量可溶性ADRB3(soluble B3,sB3)。提示 癌细胞和粒细胞通过脱颗粒方式释放sB3到血液和组织间隙。
[0435] (2)胸水中的粒细胞胞浆中有大量ADRB3，富含ADRB3的粒细胞易于 粘附肺癌细胞，通过直接接触来刺激癌细胞的增殖。
[0436] (3)胸水中的脱落肺癌细胞高表达ADRB3。
[0437] 实施例16染色质免疫共沉淀-芯片实验(ChIP-chip)
[0438] 1、实验方法
[0439] 50ng/ml的ADRB3抗体处理24h，对照对照组用小鼠IgG。10cm培养皿 中(MCF7细胞)加入270ul 37％的甲醛，轻轻混匀，室温10分钟。加入1ml 1.25M的苷氨酸，室温5分钟，中和甲醛。将皿中的混合液吸掉，用预冷的PBS/EDTA洗细胞两遍，加入1ml含有protease inhibitor cocktail的PBS，用 细胞刮将皿底的细胞刮下，收集到1.5ml离心管中。2000×g离心5分钟，弃 上清。收集到的样品送公司检测，免疫沉淀采用的抗体是ADRB3抗体和 H3K9AC抗体。在ADRB3不同活性状态下，分析ADRB3在全基因组的结合 位点和启动子中H3K9乙酰化水平。
[0440] 2、实验结果(如图87)
[0441] 利用ADRB3抗体所做的ChIP-chip筛选得到与转录因子ADRB3特异结 合的启动子序列(3000余个基因的启动子)，包括但不限于以下基因：FABP5 (fatty acid-binding protein,epidermal。ADRB3结合在8号染色体的 82191426～82191897碱基),FABP4，FABP3，PTPRA(receptor-type tyrosine-protein phosphatase alpha)，PTPRCAP(protein tyrosine phosphatase receptor type C-associated protein)，PTPN7，PTPRZ1(receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta isoform)，PTPRD(receptor-type tyrosine-protein phosphatase delta isoform)，PTPRR，LILRB2，LILRB4，LILRA4，LILRA3， LILRP2，FES(tyrosine-protein kinase Fes/Fps)，TUMOR NECROSIS FACTOR-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAND RECEPTOR, STAT5B，TCL1(T-cell leukemia/lymphoma protein 1A)，CD8A(T-cell surface glycoprotein CD8alpha chain)，C8G(编码补体C8γ，ADRB3结合在9号染 色体的139838398到139838876碱基)，C5AR1(补体C5a受体，ADRB3结 合在19号染色体的47812870到47813391碱基)，AKT1(ADRB3结合在14 号染色体的105260668到105261174碱基)，LDHAL6B(编码乳酸脱氢酶A 样蛋白6B，ADRB3结合在15号染色体的59497805到59498262碱基)， SLC16A3(该基因编码单羧酸转运蛋白，调控乳酸的跨膜转运。ADRB3结合 在17号染色体的80185203到80186585碱基)，RRP9(ADRB3结合在3号 染色体的51975065到51975538碱基，该基因编码U3small nucleolar RNA-interacting protein 2)，DKC1(ADRB3结合在X染色体的153989742 到153990209碱基，该基因与端粒的稳定性相关)，IZUMO1(izumo sperm-egg fusion protein 1，ADRB3结合在19号染色体的
49250722到49251290碱基)， TSKS(testis-specific serine kinase substrate，ADRB3结合在19号染色体的 50266261到50266930碱基)，TSSK6(testis-specific serine/
threonine-protein kinase 6)，amyloid beta A4protein isoform d，EDA2R，EDAR，PDE10A，PDE12， PDE1C，PDE4A，PDE4B，PDE4C，PDE6，PDE7，PDE9多药耐药相关蛋白 1(MRP1)，PSPN，brain-derived neurotrophic factor，NGDN，insulin-like growth factor II，X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)， vesicle
transport protein SFT2A，poly[ADP-ribose]polymerase 1，GPBP1， MYL3，GJA9-MYCBP，INHBC，SEH1L，TNPO2，NUP50，NUSAP1，GAR1， DKC1，GTPBP4，NOP56，NEXN，ACVR1，TNNT2，KCNQ1，KCNH2， ACTL6A，ATP6V0B，PAX6，DCX，TSKS，regulator of telomere elongation helicase 1，PCSK1，PCSK4，LDLRAD1，SCARF1，S1PR3，SMG6，DKC1， NOP10，BAD，BCL2，CASP12，CFLAR，LAMB3，ITGA2，ITGA7，MMP2， MMP9，RYR3，syntaxin-1B，PACRG，transcription factor Dp-2，transcription factor MafB，transcription factor E2F8，transcription factor E2-alpha isoform E47， hepatocyte nuclear factor 1，mitofusin-1，FGFR2，FGF16，FGF21，HEY1， HEY2，TLE3，TXNIP，RIZ1，IFT140，NPHP3，GATA1，GATAD1，BDNF， PDGF，CDY1，CDY2，APP(Amyloid Beta Precursor Protein)，PNMT，COMT， ZMIZ2，DNMT1，SETDB2，SUV39H1，CEACAM1，CEACAM16，KAZN， CEACAM21，CEACAM5，ENO1，FGF1，FGF4，GREM1，TMC6，TMEM43， STK36，IRF1(interferon regulatory factor 1)，WHSC1，IRF3，IRF7，IRF9， cardiotrophin-like cytokine factor 1，tumor protein 63(ADRB3结合在3号染色 体的
189349333到189349707碱基)，TPRG1，FKBP5，PRR5(ADRB3结合 在22号染色体的45063166到
45063715碱基)，SETD1B，p16，myb-related protein B(ADRB3结合在第20号染色体的
42294360到42294625碱基)， RPL18A，optineurin，bone morphogenetic protein receptor type-1B，prostacyclin receptor(PTGIR)，pentraxin-4,CTBP1，FES，ZAP70，IGSF11，IRF7，KLRC1， TARDBP，MRPL19，MRPL2，MRPL41，MRPS17，MRPS26，RPL14，RPL18A， RPL19，RPS6KL1，atypical chemokine receptor 3，CCL3L1，CCR5，EEF1D， DNMT1，PDE4B，FOXP3(ADRB3结合在X染色体的49121975到49122469 碱基)，DCANP1，DCST1，DCST2，leukemia inhibitory factor，IL17RB，TRAF6， p62，hexokinase-2(ADRB3结合在第2号染色体的75059882到75060125碱 基)，TCIRG1，HK1，CAMKK2，GAPDH，G1/S-specific cyclin-D3(ADRB3 结合在第6号染色体的42016706到42017624碱基)，Cyclin D1， cyclin-
dependent kinase 3(CDK3，ADRB3结合在第17号染色体的73995762 到73996227碱基)，CDK4，CDK15，CDK18，cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1，Rb，Ki-67，mTOR，Rictor，AKT，tubulin、Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src)，PD-L1，p53，interleukin 1(IL-1)，interleukin 6 (IL-6)，IL25，IL27，IL17RB，IL16，LEF1，ADRB3，TGFB1I1，TAB2，LTBP2， RAS,ARHGAP21,TGF-β和TNFα。
49250722到49251290碱基)， TSKS(testis-specific serine kinase substrate，ADRB3结合在19号染色体的 50266261到50266930碱基)，TSSK6(testis-specific serine/
threonine-protein kinase 6)，amyloid beta A4protein isoform d，EDA2R，EDAR，PDE10A，PDE12， PDE1C，PDE4A，PDE4B，PDE4C，PDE6，PDE7，PDE9多药耐药相关蛋白 1(MRP1)，PSPN，brain-derived neurotrophic factor，NGDN，insulin-like growth factor II，X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)， vesicle
transport protein SFT2A，poly[ADP-ribose]polymerase 1，GPBP1， MYL3，GJA9-MYCBP，INHBC，SEH1L，TNPO2，NUP50，NUSAP1，GAR1， DKC1，GTPBP4，NOP56，NEXN，ACVR1，TNNT2，KCNQ1，KCNH2， ACTL6A，ATP6V0B，PAX6，DCX，TSKS，regulator of telomere elongation helicase 1，PCSK1，PCSK4，LDLRAD1，SCARF1，S1PR3，SMG6，DKC1， NOP10，BAD，BCL2，CASP12，CFLAR，LAMB3，ITGA2，ITGA7，MMP2， MMP9，RYR3，syntaxin-1B，PACRG，transcription factor Dp-2，transcription factor MafB，transcription factor E2F8，transcription factor E2-alpha isoform E47， hepatocyte nuclear factor 1，mitofusin-1，FGFR2，FGF16，FGF21，HEY1， HEY2，TLE3，TXNIP，RIZ1，IFT140，NPHP3，GATA1，GATAD1，BDNF， PDGF，CDY1，CDY2，APP(Amyloid Beta Precursor Protein)，PNMT，COMT， ZMIZ2，DNMT1，SETDB2，SUV39H1，CEACAM1，CEACAM16，KAZN， CEACAM21，CEACAM5，ENO1，FGF1，FGF4，GREM1，TMC6，TMEM43， STK36，IRF1(interferon regulatory factor 1)，WHSC1，IRF3，IRF7，IRF9， cardiotrophin-like cytokine factor 1，tumor protein 63(ADRB3结合在3号染色 体的
189349333到189349707碱基)，TPRG1，FKBP5，PRR5(ADRB3结合 在22号染色体的45063166到
45063715碱基)，SETD1B，p16，myb-related protein B(ADRB3结合在第20号染色体的
42294360到42294625碱基)， RPL18A，optineurin，bone morphogenetic protein receptor type-1B，prostacyclin receptor(PTGIR)，pentraxin-4,CTBP1，FES，ZAP70，IGSF11，IRF7，KLRC1， TARDBP，MRPL19，MRPL2，MRPL41，MRPS17，MRPS26，RPL14，RPL18A， RPL19，RPS6KL1，atypical chemokine receptor 3，CCL3L1，CCR5，EEF1D， DNMT1，PDE4B，FOXP3(ADRB3结合在X染色体的49121975到49122469 碱基)，DCANP1，DCST1，DCST2，leukemia inhibitory factor，IL17RB，TRAF6， p62，hexokinase-2(ADRB3结合在第2号染色体的75059882到75060125碱 基)，TCIRG1，HK1，CAMKK2，GAPDH，G1/S-specific cyclin-D3(ADRB3 结合在第6号染色体的42016706到42017624碱基)，Cyclin D1， cyclin-
dependent kinase 3(CDK3，ADRB3结合在第17号染色体的73995762 到73996227碱基)，CDK4，CDK15，CDK18，cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1，Rb，Ki-67，mTOR，Rictor，AKT，tubulin、Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src)，PD-L1，p53，interleukin 1(IL-1)，interleukin 6 (IL-6)，IL25，IL27，IL17RB，IL16，LEF1，ADRB3，TGFB1I1，TAB2，LTBP2， RAS,ARHGAP21,TGF-β和TNFα。
[0442] H3K9AC抗体的CHIP-chip的结果表明：ADRB3所结合的CDK3启动子 区域(第17号染色体的73995762到73996227碱基)内的H3组蛋白的K9 被乙酰化修饰。说明ADRB3是乙酰化酶，把乙酰基转移到H3K9。ADRB3 通过调控靶基因启动子内的H3K9乙酰化水平，来影响靶基因的转录。ADRB3 能结合神经营养因子的启动子上，表明ADRB3调控神经营养因子的表达，提 示ADRB3抗体可以治疗阿尔茨海默氏症、帕金森病等神经退行性疾病。
[0443] 实施例17 ADRB3抗体促进PANC-1胰腺癌细胞凋亡
[0444] 1、实验方法
[0445] 培养PANC-1，给予50ng/ml的ADRB3抗体处理12h，对照组用小鼠IgG。 Annexin V/PI双染色，流式细胞仪检测凋亡率。
[0446] 2、实验结果：与对照组比，ADRB3抗体增加PANC-1细胞凋亡率 (45.3±7.3％vs 9.7±3.4％，P<0.01)。乳腺癌MDA231和肺癌H1299细胞得 到类似结果，均表现为ADRB3抗体促进细胞凋亡。
[0447] 实施例18携带绿色荧光蛋白(GFP)ADRB3质粒杀伤胰腺癌SW1990细胞
[0448] 1、实验方法
[0449] 构建pENTER–ADRB3-GFP载体质粒，pcDNA3/FLAG-ADRB3质粒，转 染胰腺癌SW1990细胞和MCF7细胞，24h后，共聚焦显微镜下观察。
[0450] 2、实验结果：
[0451] 凡是有GFP表达的细胞都发生凋亡，表现为核固缩、细胞碎裂，但细胞 核内没有GFP(图88)。说明携带GFP的外源性ADRB3不能进入细胞核， 蓄积在核膜上，影响细胞核内外物质的交换，导致细胞发生凋亡。携带Flag 标签蛋白的ADRB3也不能进入细胞核，但不影响细胞活性。ADRB3定位在 MCF7细胞的微管、细胞核和线粒体上(图89)。
[0452] 实施例19研究ADRB3缺失的ApoE-/-小鼠(B3-/-ApoE-/-)高胆固醇(HCD) 和低胆固醇喂养(LCD)对动脉粥样硬化斑块的影响
[0453] 1、实验方法
[0454] 研究ADRB3缺失的ApoE-/-小鼠(B3-/-ApoE-/-)高胆固醇(HCD)和低胆 固醇喂养(LCD)对动脉粥样硬化斑块的影响，对照选择HCD喂养的 B3+/+ApoE-/-小鼠。试验小鼠分为：1、B3+/+ApoE-/-小鼠高胆固醇(HCD)喂养 组；2、B3-/-ApoE-/-小鼠HCD组；3、B3-/-ApoE-/-小鼠低胆固醇喂养(LCD)组； 4、B3+/+ApoE-/-小鼠HCD喂养联合ADRB3抗体治疗组。选用8周龄雄性鼠， 各10只，高脂(甘油三酯20％、胆固醇1.25％)和普通饲料饲养。ADRB3 抗体10mg/kg，每
6天腹腔注射给药1次，高脂喂养12周后取主动脉，油红 O染色。比较4组小鼠动脉斑块数量和大小，HE染色检测斑块内炎细胞，免 疫组化检测斑块内炎性因子的表达，ELISA检测血清中的炎症因子IL-6、 VEGF、IL-10、MPO。
6天腹腔注射给药1次，高脂喂养12周后取主动脉，油红 O染色。比较4组小鼠动脉斑块数量和大小，HE染色检测斑块内炎细胞，免 疫组化检测斑块内炎性因子的表达，ELISA检测血清中的炎症因子IL-6、 VEGF、IL-10、MPO。
[0455] 2、实验结果(如图90)
[0456] 高脂饲料饲喂3个月后，ApoE-/-小鼠极度老化，出现驼背、掉毛、皮下肥 胖、运动功能丧失等，B3-/-ApoE-/-小鼠的老化特征不明显。HCD组的B3-/-ApoE-/-小鼠和B3+/+ApoE-/-小鼠ADRB3抗体治疗组主动脉部位的斑块数量和面积都 明显少于B3+/+ApoE-/-小鼠，动脉斑块的面积减少了80％～90％。ADRB3缺失 的ApoE-/-小鼠斑块质地硬，为稳定斑块。B3-/-ApoE-/-小鼠中，虽然HCD组的 血脂浓度远远高于LCD组，但两组间主动脉部位的斑块数量和面积无差异。 与HCD组的B3+/+ApoE-/-小鼠相比，HCD组的B3-/-ApoE-/-小鼠和B3+/+ApoE-/-小鼠ADRB3抗体治疗组主动脉部位的斑块纤维帽增厚、CD4+T细胞和粒细胞 浸润减少、斑块内泡沫细胞MPO、Neutrophil Elastase、IL-6、ADRB3、MIF 降低。B3-/-ApoE-/-小鼠血清中IL-10浓度升高，而IL-6、VEGF和MPO浓度 降低。
[0457] 结论：(1)ADRB3促进动脉粥样硬化斑块形成，导致斑块不稳定，是引 起急性冠脉综合征的因素之一；(2)ADRB3促进衰老。
[0458] 实施例20 ADRB3单克隆抗体降低自发性高血压大鼠的血压
[0459] 1、实验方法
[0460] 选收缩压高于140mmHg的14周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)随机 分为2组，各组8只，每6天腹腔注射给药，连续用药6周。分组如下：①抗 体组：ADRB3抗体10mg/kg；②空白对照组：腹腔注射小鼠IgG。使用RBP-1B 大鼠血压测定仪，在大鼠清醒状态下尾袖法间接测定尾动脉收缩压和心率，用 药前和用药后每周均测尾动脉收缩压、心率及称重，计算降压幅度＝(治疗前 收缩压-治疗后收缩压)/治疗前收缩压。大鼠给药6周后处死，开胸，迅速剪 取心脏，将心脏放入4℃KH液，挤压出心腔内的残余血液，分离升主动脉， 行主动脉逆行插管后悬挂于Langendorff灌流装置上，用95％O2和5％CO2充分氧合的KH液37℃恒温逆行灌流，经左心房将导管球囊插入左心室，导 管连压力换能器，向球囊内注水使其内压升至
40mmHg并保持恒定，预灌 20min，待各项指标稳定后采用Pclab生物信号采集系统记录各项心功能指标： 左室内压(LVP)、左室最大收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、 左室发展压(LVDP)、左室收缩压上升最大速率(+dp/dtmax)、左室舒张压下 降最大速率(-dp/dtmax)、心率(HR)，收集并记录冠脉流量(CF)。停灌后取 下心脏，用滤纸拭干，剪去大动脉，称重，计算心重/体重(HW/BW)；剪去 右心室游离壁和心房，左心室(包括室间隔)称重，左心室肥厚程度用左心室重 与体重比(LVW/BW)表示。采用SPSS19进行统计分析，计量资料以均数± 标准差表示，两组间均数比较采用t检验。
40mmHg并保持恒定，预灌 20min，待各项指标稳定后采用Pclab生物信号采集系统记录各项心功能指标： 左室内压(LVP)、左室最大收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、 左室发展压(LVDP)、左室收缩压上升最大速率(+dp/dtmax)、左室舒张压下 降最大速率(-dp/dtmax)、心率(HR)，收集并记录冠脉流量(CF)。停灌后取 下心脏，用滤纸拭干，剪去大动脉，称重，计算心重/体重(HW/BW)；剪去 右心室游离壁和心房，左心室(包括室间隔)称重，左心室肥厚程度用左心室重 与体重比(LVW/BW)表示。采用SPSS19进行统计分析，计量资料以均数± 标准差表示，两组间均数比较采用t检验。
[0461] 2、实验结果
[0462] ADRB3抗体治疗组血压均降到正常血压范围内(表5)，较治疗前和对 照组明显下降(P<0.01)。ADRB3抗体组降压差值和降压幅度与对照组相比明 显增加，差异有统计学显著意义(P<0.01)。ADRB3抗体对心功能的影响，见 表6，抗体治疗组LVEDP明显低于对照组(P<0.05)，HR较对照组明显减少 (P<0.05)，提示心功能改善。各组大鼠心重/体重、左室重/体重的变化，见表7， 抗体组HW/BW、LVW/BW均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 ADRB3抗体有效降低SHR血压至正常范围，改善SHR心功能，阻断高血压 所致的左心室肥厚。
[0463] 表5自发性高血压大鼠治疗前后收缩压的变化(mmHg)
[0464]
[0465]
[0466] 注：与治疗前比较，*P<0.01；与对照组比较，#P<0.01。
[0467] 表6自发性高血压大鼠心功能
[0468]
[0469] 注：与对照组比较，*P<0.05；LVP、LVSP、LVEDP、LVDP单位是mmHg； CF单位是ml/min。
[0470] 表7自发性高血压大鼠心重/体重、左室重/体重
[0471]组别 HW/BW(mg/g) LVW/BW(mg/g)
对照组 5.6±0.2 2.5±0.3
抗体组 4.1±0.3* 1.5±0.2*
对照组 5.6±0.2 2.5±0.3
抗体组 4.1±0.3* 1.5±0.2*
[0472] 注：与对照组比较，*P<0.05。
[0473] 实施例21免疫荧光检测正常人和乳腺癌患者外周血涂片细胞中ADRB3的表 达[0474] 1、实验方法同实施例1。
[0475] 2、实验结果
[0476] (1)ADRB3在正常人的中性粒细胞和淋巴系祖细胞中表达(图91A)。 在成熟CD4+和CD8+T细胞中有少量表达，在幼稚或原始型T淋巴细胞(胞 质含有大量CD4的淋巴细胞)中大量表达(图91B)。有丝分裂早期的细胞 中高表达ADRB3(图91C)。淋巴细胞中的ADRB3表达量少于粒细胞。在 乳腺癌患者的外周血中，出现大量异型淋巴细胞，细胞核发生粒细胞样改变， 表现为肾形、分叶状、不规则形，在核型发生粒细胞样改变的淋巴细胞中， ADRB3大量表达(图92A)。癌症病人的粒细胞出现大量足突，ADRB3在足 突中大量存在。正常人的粒细胞表面足突少，ADRB3含量明显少于癌症病人 的粒细胞(图92B)。
[0477] (2)乳腺癌患者的中性粒细胞和淋巴细胞大量表达ADRB3和Ki-67，肿 瘤细胞和粒细胞诱导淋巴细胞表达ADRB3，抑制淋巴细胞的活化。部分淋巴 细胞中的ADRB3表达量超过粒细胞。高表达ADRB3和Ki-67的淋巴细胞能 够少量表达髓系细胞的标志蛋白-MPO(图93)，提示该类型细胞向髓系细胞 分化，表明乳腺癌患者的淋巴细胞发生去分化，变成幼稚或原始型淋巴细胞。 ADRB3抑制T细胞的分化。
[0478] (3)乳腺癌患者血液中有大量中性粒细胞胞外网络(NET)，淋巴细胞 粘附在NET中，ADRB3是NET的主要成分(图94)。提示淋巴细胞会接收 到来自附近微环境(niche)中粒细胞的信号，癌细胞和粒细胞ADRB3形成NET, 包绕淋巴细胞，调控淋巴细胞的分化和增殖。NET制造出抑制性的免疫环境， 抑制淋巴细胞的抗癌功能。
[0479] (4)乳腺癌患者的粒细胞通过ADRB3与淋巴细胞发生黏附(图93)。 正常人的外周血较少发生粒细胞与淋巴细胞的黏附，癌症病人的粒细胞和淋巴 细胞的黏附更牢靠和频繁，与癌症病人的粒细胞和淋巴细胞表面的ADRB3黏 附因子样活性增高有密切关系。被粒细胞粘附的淋巴细胞表达MPO，表明粒 细胞的ADRB3诱导淋巴细胞去分化，使其退化成淋巴系祖细胞或髓系细胞。
[0480] (5)癌症病人的淋巴细胞Ki-67表达量与ADRB3表达量正相关，在 ADRB3阳性的淋巴细胞中，有Ki-67表达(图95)。粒细胞和淋巴细胞接触 后，如果淋巴细胞有Ki-67表达，该细胞的ADRB3含量将多于粒细胞。提示 粒细胞或癌细胞增加淋巴细胞中的ADRB3表达，ADRB3诱导淋巴细胞去分 化，变成具有增殖能力的原始细胞或祖细胞。乳腺癌患者部分淋巴细胞高表达 ADRB3，少量表达Ki-67和MPO，是幼稚型淋巴细胞(图96)。
[0481] (6)乳腺癌患者血液中有大量DNA碎片，ADRB3附着在DNA碎片上 (图97)，DNA碎片为癌细胞复制提供核酸原料。血液中DNA/ADRB3复合 物含量越多，癌细胞的增殖能力越强，更易于发生远处转移。
[0482] (7)ADRB3在原始浆细胞的胞浆中高表达，原始浆细胞的特征是细胞质 内含大量密集的粗面内质网，细胞质内有大量ADRB3(图98)，原始浆细胞 核大于T细胞。成熟浆细胞胞质内有大量ADRB3(图99)，成熟浆细胞的特 征为胞浆没有CD4或CD8，但含有大量ADRB3。CD19+B细胞膜上表达ADRB3 (图100)。ADRB3能够促进浆细胞合成抗体。
[0483] 实施例22 ADRB3抗体诱导人外周血单个核细胞(PBMC)向细胞毒性T 细胞分化[0484] 1、实验方法
[0485] 正常人、胰腺癌、肝癌、肺癌和白血病患者各5名，抽外周血3～5ml，Ficoll 密度梯度离心法分离PBMC，5％胎牛血清的DMEM培养，用不同浓度的 ADRB3抗体诱导培养，对照组不用ADRB3抗体。分别于诱导培养0、2、4、 6、8、10天时，留取细胞，流式细胞仪定量分析CD4+、CD8+T细胞和Treg 细胞。裂解诱导后的细胞，离心后取细胞上清，用MTT法验证诱导分化细胞 对靶细胞的杀伤效果。选用SW1990、MCF-7等贴壁肿瘤细胞作为靶细胞，接 种在96孔培养板中。实验组用含不同浓度的细胞裂解上清，对照组含等体积 溶剂的培养基，37℃，5％CO2培养5d。每孔加入200ul新鲜配制的含0.5mg/ml MTT的无血清培养基，继续培养4h。将每孔的液体吸尽，加入200ul DMSO， 震荡10min，酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为450nm测定光密度 值。
[0486] 2、实验结果：
[0487] 在0.5～100ug/ml剂量范围内，ADRB3抗体促进PBMC诱导分化为CD8+T 细胞，同时降低Treg细胞比例。同等浓度的抗体作用6～8天时，诱导后细胞 中的抗癌细胞因子效力较高，最高剂量的细胞裂解液能够杀伤约80％靶细胞。 ADRB3抗体诱导免疫无能的淋巴细胞成为有功能的细胞，发挥抗癌作用。
[0488] 实施例23 ADRB3抗体促进补体激活
[0489] 1、实验方法
[0490] 不同浓度的ADRB3抗体处理MCF-7，A549，SW1990细胞。内毒素(LPS) 作为阳性对照。2天后，收集细胞蛋白，western blot检测补体C3，C8和C5 受体(C5R)。免疫荧光检测C8和B3AR。
[0491] 2、实验结果：
[0492] ADRB3抗体剂量依赖性增加C3，C8和C5R表达(图101A)。ADRB3 抗体处理后，细胞膜上出现大量C8，而B3AR消失，细胞核固缩，发生凋亡 (图101B)。C8是膜攻击复合物(Membrane Attack Complex，MAC)形成 不可或缺的重要物质，ADRB3抗体促进MAC的组装并插入细胞膜，导致细 胞发生破裂、死亡。
[0493] 总结：综上结果，ADRB3是神经-内分泌-免疫调节网络中的关键受体，ADRB3介导的信号通路调控中性粒细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞的增殖和分化。 正常情况下，ADRB3维持机体的非特异免疫和特异免疫能力，清除外源病原 微生物和老化的机体组织而起到保护机体和抗衰老的作用。病理情况下，该信 号通路的过度活化将导致系统慢性炎症，破坏免疫稳态。针对ADRB3的单克 隆抗体能够特异结合并调控(阻滞或激动)ADRB3的活性，用于治疗炎症、 病毒感染、动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行变、自身免疫病、恶性肿瘤和衰 老性疾病。
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