取代的酰胺、其制备方法及其用于治疗疾病例如癌症的用
途
[0001] 按照35U.S.C.§119(e)，本
申请要求于2007年9月20日提交的美国临时申请号60/973,995以及于2008年5月6日提交的美国临时申请号61/050,777的优先权，它们援引加入本文中。
[0002] 本文提供某些取代的酰胺和相关化合物、包含这些化合物的组合物和它们的使用方法。
[0003] 蛋白激酶是最大的人类酶家族，包括超过500种
蛋白质。Bruton酪
氨酸激酶(Btk)是酪氨酸激酶Tec家族的成员，并且是早期B细胞发育及成熟B细胞活化、
信号转导和存活的调节剂。
[0004] 经B细胞受体(BCR)的B细胞信号转导能产生广泛的
生物学
输出信号(biological output)，而所述信号转而取决于B细胞的发育阶段。BCR信号的强度和持续时间必须被精确地调节。异常的BCR介导的信号转导能造成失调的B细胞活化和/或形成导致多种自身免疫疾病和/或炎性疾病的致病性自身
抗体。人体内Btk的突变导致X连
锁无丙种球蛋白血症(XLA)。这种疾病与B细胞成熟受损、免疫球蛋白产生减少、不依赖T细胞的免疫应答受损和BCR刺激后持续的
钙信号的显著减弱有关。
[0005] Btk在变态
反应性疾病和/或自身免疫疾病和/或炎性疾病中起作用的证据已经在Btk-
缺陷小鼠模型中得到确定。例如，在系统性红斑狼疮(SLE)的标准鼠类临床前模型中，已经表明Btk缺陷引起疾病进展的明显改善。而且，Btk缺陷小鼠还能抵抗形成胶原诱发性关节炎并能对葡萄球菌诱发性关节炎更不易感。
[0006] 大量的证据支持B细胞和体液免疫系统在自身免疫疾病和/或炎性疾病的发病机制中的作用。已开发的为了耗竭B细胞的蛋白质系治疗剂(诸如Rituxan)代表治疗若干自身免疫疾病和/或炎性疾病的方法。由于Btk在B细胞活化中的作用，Btk
抑制剂可以被用作B细胞介导的致病性活动(例如产生自身抗体)的抑制剂。
[0007] Btk也在破骨细胞、肥大细胞和单核细胞中表达，并且显示其对于这些细胞的功能很重要。例如，小鼠Btk缺陷与IgE介导的肥大细胞活化受损(显著减少TNF-α和其它炎性细胞因子的释放)有关，并且人Btk缺陷与激活的单核细胞产生TNF-α大大减少有关。
[0008] 因此，抑制Btk活性可以用于治疗变态反应性疾病和/或自身免疫疾病和/或炎性疾病，例如：SLE、类
风湿性关节炎、多血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、重症肌无
力、变应性鼻炎和哮喘。而且，据报道，Btk在凋亡中起作用；因此，抑制Btk活性可用于癌症以及治疗B细胞淋巴瘤和白血病。而且，考虑到Btk在破骨细胞功能方面的作用，抑制Btk活性可能有助于治疗骨病例如骨质疏松。
[0009] 提供式I的化合物：
[0010]
[0011] 及其药学可接受的盐、
溶剂合物和混合物，其中2
[0012] X选自N和CR ；3’
[0013] Y选自N和CR ；3
[0014] Z选自N和CR ；条件是每次仅X、Y和Z之一是N；
[0015] W选自N和CH；
[0016] V选自CH和N；条件是W和V之一必须是N并且W和V不都是N；1
[0017] R 选自：
[0018]
[0019]
[0020] R2选自H、CH3、F、Cl、CN、OCH3、OH和CF3；
[0021] R2’选自H和F；
[0022] R3选自H、CH3、CF3、F、Cl、CN和OCH3；
[0023] R3’选自H、CH3、F、Cl、CN和OCH3；
[0024] R4是
[0025]
[0026] m选自0和1；
[0027] n选自0和1；
[0028] R5选自H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基，其中所述烷基任选地被选自OH、F和OCH3的一个或多个取代基取代；
[0029] R6选自H和C1-C6烷基；或者，R5和R6任选地与同它们相连的氮
原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-至6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代，并且所述环任选地被OH取代；
[0030] R7选自H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基，其中所述烷基任选地被选自OH和O(C1-C4烷6 7
基)的一个或多个取代基取代；或者，R 和R 任选地通过和它们直接相连的分别的氮原子
5 9 8
与-N(R)C(R)(CH2)nC(＝O)N(R)-基团一起形成6-元环；
[0031] R8选自H和C1-C6烷基，其中所述烷基任选地被选自OH、F和OCH3的一个或多个取7 8
代基取代；或者，R 和R 任选地与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-至6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代，并且所述环任选地被OH取代；
[0032] R9选自H和CH3；
[0033] R10选自OH、H以及任选地被N(R9)2取代的C1-C3烷基；
[0034] R11选自H、CH3和CF3；且
[0035] R12是C1-C3烷基。
[0036] 提供药物组合物，其包含式I-IX中任一式的化合物，以及至少一种选自载体、辅剂和赋形剂的药学可接受的媒介(vehicle)。
[0037] 提供
包装的(packaged)药物组合物，其包含：
[0038] 本文所述的药物组合物；和
[0039] 使用所述组合物来治疗患有应答Btk活性抑制的疾病的患者的
说明书。
[0040] 提供用于治疗患有应答Btk活性抑制的疾病的患者的方法，其包括向所述个体
给药有效量的式I-IX中任一式的化合物。
[0041] 提供用于治疗患有选自癌症、骨病、
自身免疫性疾病、炎性疾病、急性
炎症反应和变态反应性疾病的疾病的患者的方法，其包括向所述患者给药有效量的式I-IX中任一式的化合物。
[0042] 提供用于增强癌细胞对化学疗法敏感性的方法，其包括向正接受用
化学治疗剂进行化学治疗的患者给药足以增强癌细胞对所述化学治疗剂的敏感性的量的式I-IX中任一式的化合物。
[0043] 提供减少施药错误和增强正接受应答Btk活性抑制的疾病的治疗的患者的治疗
顺应性的方法，所述方法包括提供本文所述的包装的药物制剂，其中所述说明书还包括与所述包装的药物组合物有关的禁忌证和不良反应信息。
[0044] 提供用于抑制ATP
水解的方法，所述方法包括使表达Btk的细胞与足以可检测地降低体外ATP水解的水平的量的式I-IX中任一式的化合物
接触。
[0045] 提供用于确定样品中存在Btk的方法，其包括：在允许检测Btk活性的条件下使所述样品与式I-IX中任一式的化合物接触，检测所述样品中Btk活性的水平，并由此确定样品中存在或不存在Btk。
[0046] 提供用于抑制B细胞活性的方法，其包括使表达Btk的细胞与足以可检测地降低体外B细胞活性的量的式I-IX中任一式的化合物接触。
[0047] 如在本说明书中使用的，以下词语和短语一般意在具有如下所述的含义，除了使用它们的上下文另外指示的范围。在全文中以下缩写和术语具有所指示的含义。
[0048] 如本文中使用的，当任何变量在化学式中出现多于一次时，其每次出现时的定义独立于其在每次其它出现时的定义。根据
专利中英文单词“a”和“the”的一般意义，例如提及“a”激酶或化合物或者“the”激酶或化合物包括一种或多种激酶或化合物。断裂的键指示连接的点。
[0049] 如本文中使用的，“烷基”包括具有所指示的
碳原子数的直链的和支链的
烃链。例如C1-C6烷基包括1-6个碳原子的直链和支链。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基等。当命名具有特定碳原子数的烷基基团时，意在包括所有具有该碳原子数的几何异构体；因此，例如，“丁基”指包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。
[0050] 如本文使用的，“调节”指相对于本文所述的化合物不存在时的激酶活性，作为直接或间接地应答所述化合物的存在的所述激酶的活性的变化。这种变化可以是活性增加或活性减少，并且可以归因于所述化合物与所述激酶的直接相互作用，或归因于所述化合物与一种或多种转而影响激酶活性的其它因素的相互作用。例如，所述化合物的出现可能通过直接与所述激酶结合、通过(直接地或间接地)使另一因素增加或减少所述激酶的活性、或通过(直接地或间接地)增加或减少存在于细胞或生物体中的激酶的量来增加或减少激酶活性。
[0051] 式I-IX中任一式的化合物包括但不限于式I-IX的光学异构体、外消旋物和它们的其它混合物。在这些情况中，单一对映体或非对映体，即旋光形式可以通过不对称合成或通过外消旋物的拆分来获得。外消旋物的拆分可以例如通过常规方法，例如在拆分
试剂的存在下结晶、或使
用例如
手性高压液相色谱(HPLC)柱的层析来实施。而且，化合物包括Z-和E-形式(或顺式-和反式-形式)的具有碳-碳双键的化合物。在化合物以各种互变异构的形式存在的情况下，本
发明的化学实体包括该化合物的所有互变异构形式。化合物还包括晶体形式，包括多晶型物和包合物。
[0052] 本发明包括但不限于式I-IX的化合物及其所有药学可接受的形式。本文所述化合物的药学可接受的形式包括其药学可接受的盐、溶剂合物、前药及混合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物是药学可接受的盐的形式。即使当本发明的化合物是以
螯合物或非共价复合物的方式与其他化学实体的化学结合的形式时，它们仍是本发明的部分。术语“化合物”和“化学实体”在本文中可互换使用。
[0053] “药学可接受的盐”包括但不限于
无机酸盐，例如
盐酸盐、
磷酸盐、二磷酸盐、
氢溴酸盐、
硫酸盐、亚磺酸盐、
硝酸盐等盐；以及
有机酸盐，例如苹果酸盐、
马来酸盐、富马酸盐、
酒石酸盐、
琥珀酸盐、
柠檬酸盐、
醋酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、
对甲苯磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、苯
甲酸盐、水杨酸盐、
硬脂酸盐、和链烷酸盐，例如醋酸盐、其中n是0-4的HOOC-(CH2)n-COOH等盐。同样地，药学可接受的阳离子包括但不限于钠、
钾、钙、
铝、锂和铵。
[0054] 而且，如果得到的所述化合物为
酸加成盐，那么可以通过
碱化所述酸式盐的溶液来获得游离碱。相反地，如果产物是游离碱，那么加成盐、特别是药学可接受的加成盐可以根据用于从碱化合物制备酸加成盐的常规方法通过使所述游离碱溶解在合适的
有机溶剂中并用酸处理所述溶液来制备。本领域的技术人员理解各种可用于制备无毒的药学可接受的加成盐的合成方法。
[0055] 如上所述，前药也落入本发明的范围，例如式I-IX中任一式的化合物的酯或酰胺衍生物。术语“前药”包括当向患者给药时，例如在所述前药的代谢过程之后变成式I-IX中任一式的化合物的任何化合物。前药的例子包括但不限于式I-IX中任一式的化合物中的官能团(例如醇或胺基)的乙酸酯、甲酸酯和
苯甲酸酯等衍生物。
[0056] 术语“溶剂合物”指通过溶剂和化合物的相互作用而形成的化学实体。合适的溶剂合物是药学可接受的溶剂合物，例如水合物，包括一水合物和半水合物。
[0057] 术语“螯合物”指通过化合物与
金属离子在两个(或多个)点的配位作用而形成++ ++的化学实体。这样的金属离子包括Ca 和Mg 。
[0058] 术语“非共价复合物”指通过化合物和其它分子的相互作用(其中所述化合物和所述分子之间不形成共价键)而形成的化学实体。例如，络合可以经范德华相互作用、氢键和静电相互作用(也称为离子键)发生。
[0059] 术语“氢键”指负电性原子(也称为氢键受体)和与另一个相对负电性原子(也称为氢键供体)连接的氢原子之间的缔合形式。合适的氢键供体和受体在药物化学中是充分理解的(G.C.Pimentel和A.L.McClellan，TheHydrogen Bond，Freeman，San Francisco，1960；R.Taylor和O.Kennard，″Hydrogen Bond Geometry in Organic Crystals″，Accounts of ChemicalResearch，17，pp.320-326(1984))。
[0060] 术语“活性剂”用于指示具有生物活性的化学实体。在某些实施方案中，“活性剂”是具有药物效用的化合物。例如活性剂可以是抗癌治疗剂。
[0061] 术语“
治疗有效量的”本发明的化合物指，当向人或非人类患者给药时能有效地提供治疗益处(例如改善症状、延缓疾病进展或防止疾病)的量，例如，治疗有效量可以是足以减少应答抑制Btk活性的疾病的症状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以减少癌症症状、骨病症状、变态反应性疾病的症状、自身免疫和/或炎性疾病的症状、或急性炎症反应的症状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以减少生物体中可检测的癌细胞的数量、可检测地延缓或阻止癌性
肿瘤生长的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以使癌性肿瘤缩小的量。在某些情况下，患癌症的患者可能不表现受累的症状。在一些实施方案中，化合物/化学实体的治疗有效量是足以防止明显增加或明显减少患者血液、血清或组织中的癌细胞或癌标记物的可检测水平的量。在本文所述的用于治疗变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应的方法中，治疗有效量还可以是当向患者给药时足以可检测地延缓疾病的进展、或防止被给予所述化合物/化学实体的所述患者表现所述变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应的症状的量。在某些本文所述的用于治疗变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应的方法中，治疗有效量还可以是足以产生所述患者血液或血清中标记蛋白或细胞类型的量的可测定的减少的量。例如，在一些实施方案中治疗有效量是足以明显减少B细胞活性的本文所述的化合物/化学实体的量。在另一个例子中，在一些实施方案中治疗有效量是足以明显减少B细胞数量的式I-IX中任一式的化合物的量。在另一个例子中，在一些实施方案中治疗有效量是足以明显减少具有重症肌无力疾病的患者的血液中抗乙酰胆碱受体抗体的水平的式I-IX中任一式的化合物的量。
[0062] 术语“抑制”指生物活性或过程的基线活性明显减少。“抑制Btk活性”指相对于不存在式I-IX中任一式的化合物时的Btk活性，作为直接或间接应答这样的化合物的存在的Btk活性的减少。活性降低可能是由于所述化合物与Btk的直接相互作用、或由于这样的化合物与转而影响Btk活性的一种或多种其它因素的相互作用。例如，所述化合物的存在可以通过直接与Btk结合、通过(直接地或间接地)使另一因素减少Btk的活性、或通过(直接地或间接地)减少存在于细胞或生物体中的Btk的量来减少Btk活性。
[0063] 抑制Btk活性还指在针对Btk活性的标准生物测定例如下述的ATP水解测定中可观察地抑制Btk活性。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于1微摩尔的IC50值。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于小于25纳摩尔的IC50值。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于5纳摩尔的IC50值。
[0064] “抑制B细胞活性”指相对于不存在式I-IX中任一式的化合物时的B细胞活性，作为直接或间接应答这样的化合物的存在的B细胞活性的减少。活性降低可能是由于所述化合物与Btk或与转而影响B细胞活性的一种或多种其它因素的直接相互作用。
[0065] 抑制B细胞活性还指在标准测定例如下述的测定中可观察地抑制CD86的表达。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于10微摩尔的IC50值。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于小于0.5微摩尔的IC50值。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于100纳摩尔的IC50值。
[0066] “B细胞活性”还包括一种或多种B细胞膜受体例如CD40、CD86和Toll-样受体TLR(特别是TLR4)、或膜结合免疫球蛋白例如IgM、IgG和IgD的激活、重分配、重组或帽化。大多数B细胞还具有以
抗原-抗体复合物或聚集的IgG形式的IgG Fc部分的膜受体。B细胞载有补体的激活成分、例如C3b、C3d、C4和Clq的膜受体。这些不同的膜受体和膜结合免疫球蛋白具有膜流动性并且可以进行可启动信号转导的重分配和帽化。
[0067] B细胞活性还包括合成或产生抗体或免疫球蛋白。免疫球蛋白由B细胞系合成并且具有共同的结构特征和结构单位。五种免疫球蛋白类型，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE根据它们的重链的结构差异，包括氨基酸序列和多肽链的长度来识别。给定抗原的抗体可以在所有或几类免疫球蛋白中检测到或可能限于单一类或亚类免疫球蛋白。同样地，自身抗体或自身免疫抗体可能属于一类或几类免疫球蛋白。例如，类风湿因子(IgG的抗体)最经常地识别为IgM免疫球蛋白，但也可以识别为IgG或IgA。
[0068] 而且，B细胞活性还意在包括一系列事件，所述事件导致B细胞由前体B淋巴细胞的克隆扩充(增殖)和分化为合成抗体的浆细胞，这与抗原结合以及与来自其它细胞的细胞因子信号结合起来发生。
[0069] “抑制B
细胞增殖”指抑制异常B细胞、例如癌性B细胞如淋巴瘤B细胞的增殖和/或抑制正常的非患病的B细胞的增殖。术语“抑制B细胞增殖”指无论在体外或体内不增加或任何明显地减少B细胞的数量。因此，体外抑制B细胞增殖和不与式I-IX中任一式的化合物接触的匹配样本相比，与这样的化合物接触的体外样品中的B细胞数量的任何显著性降低。
[0070] 抑制B细胞增殖还指，在针对B细胞增殖的标准胸腺嘧啶核苷掺入法(thymidine incorporation assay)例如本文所述的测定中可观察地抑制B细胞增殖。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于10微摩尔的IC50值。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于小于500纳摩尔的IC50值。在一些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物具有小于或等于50纳摩尔的IC50值。
[0071] “变态反应”或“变态反应性疾病”指对物质(变应原)的获得性超敏反应。变态反应性病症包括湿疹、变应性鼻炎或鼻炎、花粉症、支气管哮喘、荨麻疹(寻麻疹)和食物过敏和其它特应性病症。
[0072] “哮喘”指以炎症、气道变窄和气道对吸入剂的反应性增加为特征的呼吸系统病症。哮喘是频繁地，但不是唯一地与特应性或变应性症状有关。
[0073] 用“显著性的”指在统计显著性的标准参数检验例如t检验中(其中p＜0.05)在统计学上显著性的任何可检测的变化
[0074] “应答Btk活性抑制的疾病”是这样的疾病，其中抑制Btk激酶提供治疗益处，例如改善症状、减少疾病进展、
预防或延缓疾病发作、或抑制某些细胞类型(单核细胞、破骨细胞、B细胞、肥大细胞、髓系细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞)的异常活性。
[0075] “治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指对患者的疾病的任何处理，包括：
[0076] a)抑制所述疾病；
[0077] b)延缓或阻止临床症状的产生；和/或
[0078] c)减轻所述疾病，即，使临床症状消退。
[0079] “预防”疾病意指使所述疾病的临床症状不出现。
[0080] “患者”指已经或将要成为治疗、观察或实验的对象的动物，例如
哺乳动物。本发明的方法可以用于人类治疗和兽医应用。在一些实施方案中，所述患者是哺乳动物；在一些实施方案中，所述患者是人；在一些实施方案中，所述患者选自猫和狗。
[0081] 提供式I的化合物：
[0082]
[0083] 及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物，其中2
[0084] X选自N和CR ；3
[0085] Y选自N和CR ；3
[0086] Z选自N和CR ；条件是每次仅X、Y和Z之一是N；
[0087] W选自N和CH；
[0088] V选自CH和N；条件是W和V之一必须是N并且W和V不都是N；
[0089] R1选自：
[0090]
[0091]
[0092] R2选自H、CH3、F、Cl、CN、OCH3、OH和CF3；
[0093] R2’选自H和F；
[0094] R3选自H、CH3、CF3、F、Cl、CN和OCH3；
[0095] R3’选自H、CH3、F、Cl、CN和OCH3；
[0096] R4是
[0097]
[0098] m选自0和1；
[0099] n选自0和1；
[0100] R5选自H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基，其中所述烷基任选地被选自OH、F和OCH3的一个或多个取代基取代；
[0101] R6选自H和C1-C6烷基；或者，R5和R6任选地与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-至6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代，并且所述环任选地被OH取代；
[0102] R7选自H、C1-C6烷基和C3-C6环烷基，其中所述烷基任选地被选自OH和O(C1-C4烷6 7
基)的一个或多个取代基取代；或者，R 和R 任选地通过和它们直接相连的分别的氮原子
5 9 8
与-N(R)C(R)(CH2)nC(＝O)N(R)-基团一起形成6-元环；
[0103] R8选自H和C1-C6烷基，其中所述烷基任选地被选自OH、F和OCH3的一个或多个取7 8
代基取代；或者，R 和R 任选地与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-至6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代，并且所述环任选地被OH取代；
[0104] R9选自H和CH3；
[0105] R10选自OH、H以及任选地被N(R9)2取代的C1-C3烷基；
[0106] R11选自H、CH3和CF3；且
[0107] R12是C1-C3烷基。
[0108] 在某些实施方案中，R11是CH3。在某些实施方案中，R11是H。
[0109] 在某些实施方案中，R12是C1-C2烷基。
[0110] 在某些实施方案中，W是N且V是CH(式I-a，其中R1、R2’、R4、R10、X、Y和Z如式I中的定义)。
[0111]1 2’ 4 10
[0112] 在某些实施方案中，W是CH且V是N(式I-b，其中R、R 、R、R 、X、Y和Z如式I中的定义)。
[0113]
[0114] 在某些实施方案中，X是CR2。
[0115] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式II的化合物，其中R1、R2、R2’、R4、R10、Y和Z如式I中的定义。
[0116]
[0117] 在某些实施方案中，X是N。
[0118] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式III的化合物，其中R1、R2’、R3、R3’、R4和R10如式I中的定义。
[0119]
[0120] 在某些实施方案中，Y是CR3’。
[0121] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式IV的化合物，其中R1、R2’、R3’、R4、R10、X和Z如式I中的定义。
[0122]
[0123] 在某些实施方案中，Y是N。1 2 2’ 3 4 10
[0124] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式V的化合物，其中R、R、R 、R、R 和R如式I中的定义。
[0125]
[0126] 在某些实施方案中，Z是CR3。
[0127] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式VI的化合物，其中R1、R2’、R3、R4、R10、X和Y如式I中的定义。
[0128]
[0129] 在某些实施方案中，Z是N。
[0130] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式VII的化合物，其中R1、R2、R2’、R3’、R4、R10和Z如式I中的定义。
[0131]1 2 2’ 3 3’ 4
[0132] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式VIII的化合物，其中R、R、R 、R、R 、R10
和R 如式I中的定义。
[0133]
[0134] 在某些实施方案中，R2’是H。
[0135] 在某些实施方案中，R2’是F。
[0136] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式IX的化合物，其中：
[0137]
[0138] R1选自：
[0139]
[0140] R2选自H、CH3、F和Cl；
[0141] R3选自H、CH3、F和Cl；
[0142] R3’选自H、CH3、F和Cl；
[0143] R4是
[0144]
[0145] m选自0和1；
[0146] n选自0和1；5
[0147] R 选自H和C1-C6烷基；6 5 6
[0148] R 选自H和C1-C6烷基；或者，R 和R 任选地与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代；
7
[0149] R 选自H和C1-C6烷基，其中所述烷基任选地被选自OH和O(C1-C4烷基)的一个或6 7 5 9
多个取代基取代；或者，R 和R 任选地通过和它们直接相连的分别的氮原子与-N(R)C(R)
8
(CH2)nC(＝O)N(R)-基团一起形成6-元环；
8 7 8
[0150] R 选自H和C1-C6烷基；或者，R 和R 任选地与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-至6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代；
[0151] R9选自H和CH3；且
[0152] R10选自H和C1-C3烷基。
[0153] 在某些实施方案中，m是0。在某些实施方案中，n是0。
[0154] 在某些实施方案中，R1选自：
[0155]
[0156] 在某些实施方案中，R1选自：
[0157]
[0158] 在某些实施方案中，R2选自CH3、F、Cl和H。
[0159] 在某些实施方案中，R2选自CH3、F、Cl和CN。在某些实施方案中，R2选自CH3、F和2
Cl。在某些实施方案中，R 是CH3。
[0160] 在某些实施方案中，R3选自H、CH3、F和Cl。在某些实施方案中，R3是H。在某些3 3
实施方案中，R 选自F和Cl。在某些实施方案中，R 选自CH3和OCH3。
[0161] 在某些实施方案中，R3’选自H、CH3、F和Cl。在某些实施方案中，R3’选自H、CH3、F、3’ 3’
Cl和CN。在某些实施方案中，R 是H。在某些实施方案中，R 选自CH3和F。在某些实施
3’
方案中，R 选自Cl和CN。
[0162] 在某些实施方案中，R5选自H以及任选地被OH取代的C1-C3烷基。在某些实施方5 5
案中，R 选自H和C1-C6烷基。在某些实施方案中，R 选自H和C1-C3烷基。在某些实施方
5 5
案中，R 选自H、甲基、乙基和-(CH2)2OH。在某些实施方案中，R 选自H、甲基和乙基。
[0163] 在某些实施方案中，R6选自H和C1-C3烷基。在某些实施方案中，R6选自H、甲基、6
乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，R 选自H、甲基和乙基。
[0164] 在某些实施方案中，R5和R6与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-元环或6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代。在5 6
某些实施方案中，R 和R 与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的
5
6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代。在某些实施方案中，R
6
和R 与同它们相连的氮原子一起形成氮杂环
丁烷基、N-甲基哌嗪基、N-乙基哌嗪基或吗啉
5 6
基。在某些实施方案中，R 和R 与同它们相连的氮原子一起形成N-甲基哌嗪基或N-乙基哌嗪基。
[0165] 在某些实施方案中，R7选自H、甲基、乙基、-(CH2)2OH和-(CH2)2OCH3。在某些实施7 6 7
方案中，R 选自H、甲基、-(CH2)2OH和-(CH2)2OCH3。在某些实施方案中，R 和R 通过同它们
5 9 8
直接相连的分别的氮原子与-N(R)C(R)(CH2)nC(＝O)N(R)-基团一起形成6-元环(例如)。
8 8
[0166] 在某些实施方案中，R 选自H和C1-C3烷基。在某些实施方案中，R 选自H、甲基和7 8
乙基。在某些实施方案中，R 和R 与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N、S或O的4-至6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被C1-C3烷基取代。在某些实
7 8
施方案中，R 和R 与同它们相连的氮原子一起形成具有0-1个额外的N或O的4-元环或
6-元环，其中所述任选的额外的环氮原子任选地被甲基或乙基取代，并且所述环任选地被
7 8
OH取代。在某些实施方案中，R 和R 与同它们相连的氮原子一起形成任选地被OH取代的
7 8
N-甲基哌嗪基、N-乙基哌嗪基、吗啉基或氮杂环丁烷基。在某些实施方案中，R 和R 与同它们相连的氮原子一起形成吗啉基或氮杂环丁烷基。
9 9
[0167] 在某些实施方案中，R 是H。在某些实施方案中，R 是甲基。10 10
[0168] 在某些实施方案中，R 选自H和CH3。在某些实施方案中，R 是H。在某些实施方10 10
案中，R 是-(CH2)3N(CH3)2。在某些实施方案中，R 是OH。
5 8 10
[0169] 在R-R 和R 中，其中任选地被取代的烷基或环是被取代的，在某些实施方案中，5 8 10
存在1-3个取代基并且这些取代基可以代替任何H原子。在R-R 和R 中，在某些实施方案中，环是饱和的。
1
[0170] 在某些实施方案中，R 包含与如本文所示的5-元环、6-元环、7-元环或8-元环稠1
合的噻吩环。在某些实施方案中，R 包含如本文所示的亚苯基或苯并环。如本文所示的，在
5 6 7 8 5 6 7 8
某些实施方案中，R、R、R 和/或R 形成环，而在某些实施方案中，R、R、R 和/或R 是非环的。
[0171] 在某些实施方案中，式I的化合物选自：
[0172] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-
氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0173] N-(3-(6-(4-(1-(乙基(异丙基)氨基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0174] N-(3-(6-(4-(1，2-双(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0175] N-(3-(6-(4-(1，2-双(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0176] N-(3-(6-(4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0177] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0178] (S)-N-(3-(6-(4-(3-(二甲基氨基)-2-(异丙基(甲基)氨基)-3-氧代丙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0179] N-(3-(6-(4-(3-(二甲基氨基)-1-(异丙基(甲基)氨基)-3-氧代丙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0180] N-(3-(6-(4-(1-氨基-2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4-叔丁基苯甲酰胺；
[0181] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0182] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0183] N-(3-(6-(4-(2-氨基-1-(异丙基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0184] N-(2-甲基-3-(4-甲基-6-(4-(1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0185] N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(异丙基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0186] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(异丙基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0187] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，5-二氟苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0188] (S)-4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0189] (R)-4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0190] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4-(乙基(甲基)氨基)苯甲酰胺；
[0191] (R)-N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(异丙基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0192] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4-(1-乙基环丙基)苯甲酰胺；
[0193] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0194] N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0195] N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0196] N-(3-(6-(4-(1，2-双(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4-叔丁基苯甲酰胺；
[0197] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0198] N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0199] N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0200] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0201] N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0202] N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0203] N-(3-(6-(4-(1-异丙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0204] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0205] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0206] N-(2-氯-3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0207] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4-(乙基(甲基)氨基)苯甲酰胺；
[0208] N-(3-(6-(4-(1-(乙基(异丙基)氨基)-2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0209] N-(3-(6-(4-(1-(乙基(异丙基)氨基)-2-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0210] N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(乙基(异丙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0211] N-{3-[6-({4-[2-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(吗啉-4-基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0212] N-{2-甲基-3-[4-甲基-6-({4-[(甲基氨基甲酰基)(吗啉-4-基)甲基]苯基}氨基)-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0213] N-{3-[6-({4-[2-(氮杂环丁烷-1-基)-1-[乙基(丙-2-基)氨基]-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0214] N-{3-[6-({4-[(二甲基氨基甲酰基)[乙基(丙-2-基)氨基]甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0215] N-{3-[6-({4-[1-(氮杂环丁烷-1-基)-2-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0216] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0217] N-{3-[6-({4-[氮杂环丁烷-1-基(二甲基氨基甲酰基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0218] N-[2-甲基-3-(4-甲基-5-氧代-6-{[4-(1，2，4-三甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0219] N-[5-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0220] N-{3-[6-({4-[氮杂环丁烷-1-基(二甲基氨基甲酰基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4-叔丁基苯甲酰胺；
[0221] N-{3-[6-({4-[氮杂环丁烷-1-基(二甲基氨基甲酰基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0222] N-(3-{6-[(4-{氮杂环丁烷-1-基[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基]甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0223] N-{2-甲基-3-[4-甲基-6-({4-[4-甲基-3-氧代-1-(丙-2-基)哌嗪-2-基]苯基}氨基)-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0224] N-{3-[6-({4-[(4-乙基哌嗪-1-基)[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基]甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，
8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0225] N-{3-[6-({4-[(二乙基氨基甲酰基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0226] 4-叔丁基-N-(3-{6-[(4-{[乙基(甲基)氨基甲酰基](4-乙基哌嗪-1-基)甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0227] 4-叔丁基-N-{3-[6-({4-[(二乙基氨基甲酰基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}苯甲酰胺；
[0228] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-N-甲基-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0229] 4-叔丁基-N-(2-甲基-3-{4-甲基-6-[(4-{1-[甲基(丙-2-基)氨基]-2-(吗啉-4-基)-2-氧代乙基}苯基)氨基]-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}苯基)苯甲酰胺；
[0230] N-{3-[6-({4-[2-(氮杂环丁烷-1-基)-1-[甲基(丙-2-基)氨基]-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4-叔丁基苯甲酰胺；
[0231] N-{3-[6-({4-[1-(氮杂环丁烷-1-基)-2-(吗啉-4-基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0232] N-(3-{6-[(4-{氮杂环丁烷-1-基[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基]甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0233] 4-叔丁基-N-(2-甲基-3-{4-甲基-6-[(4-{1-[甲基(丙-2-基)氨基]-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基}苯基)氨基]-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}苯基)苯甲酰胺；
[0234] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4-(1-甲基环丙基)苯甲酰胺；
[0235] N-(3-(6-(4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0236] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1-异丙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺；
[0237] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0238] (S)-N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0239] (R)-N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；和[0240] (S)-(+)-N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(异丙基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0241] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-N-甲基-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0242] N-(3-{6-[(4-{1-[乙基(甲基)氨基]-2-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0243] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-6-[乙基(甲基)氨基]吡啶-3-甲酰胺；
[0244] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟-5-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0245] N-{3-[6-({4-[2-(氮杂环丁烷-1-基)-1-[甲基(丙-2-基)氨基]-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0246] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0247] N-[3-(6-{[4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0248] N-[3-(6-{[4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0249] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，5-二甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0250] N-[5-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0251] N-{3-[6-({4-[(二甲基氨基甲酰基)(吗啉-4-基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0252] N-{3-[6-({4-[(二乙基氨基甲酰基)(吗啉-4-基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0253] N-(3-{6-[(4-{[乙基(甲基)氨基甲酰基](吗啉-4-基)甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0254] N-(3-{6-[(4-{[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基](吗啉-4-基)甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0255] N-{3-[6-({4-[2-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-1-(吗啉-4-基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0256] N-{3-[6-({4-[(二甲基氨基甲酰基)(吗啉-4-基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0257] N-{3-[6-({4-[(二乙基氨基甲酰基)(吗啉-4-基)甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0258] N-{3-[6-({4-[2-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(吗啉-4-基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0259] N-{2-甲基-3-[4-甲基-6-({4-[(甲基氨基甲酰基)(吗啉-4-基)甲基]苯基}氨基)-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0260] N-(3-{6-[(4-{[乙基(甲基)氨基甲酰基](吗啉-4-基)甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0261] N-(3-{6-[(4-{[(2-羟基乙基)(甲基)氨基甲酰基](吗啉-4-基)甲基}苯基)氨基]-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基}-2-甲基苯基)-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0262] N-{3-[6-({4-[2-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-1-(吗啉-4-基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}-4H，5H，6H，7H，8H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺；
[0263] 4-叔丁基-N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-2-甲氧基苯甲酰胺；
[0264] N-[2-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-5-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0265] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，6-二甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0266] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-5-甲氧基-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0267] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，6-二氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0268] N-[5-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0269] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0270] N-[2，6-二氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0271] N-[6-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0272] N-[2-氯-5-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0273] N-[2-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0274] N-[2-氰基-5-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0275] N-[4-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0276] 4-叔丁基-N-{3-[6-({4-[(S)-(二甲基氨基甲酰基)[甲基(丙-2-基)氨基]甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}苯甲酰胺；
[0277] 4-叔丁基-N-{3-[6-({4-[(R)-(二甲基氨基甲酰基)[甲基(丙-2-基)氨基]甲基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-甲基苯基}苯甲酰胺；
[0278] 4-叔丁基-N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-N-[3-(二甲基氨基)丙基]苯甲酰胺；
[0279] N-[6-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0280] N-[5-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)吡啶-3-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0281] N-[6-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0282] N-[2-氯-3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0283] N-[6-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-3-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0284] N-[6-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-5-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0285] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-7-氧代-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0286] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-7-羟基-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0287] 4-叔丁基-N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-2-甲基苯甲酰胺；
[0288] N-[3-(6-{[4-(1-乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0289] N-[3-(6-{[4-(1-乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，6-二氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0290] N-[3-(6-{[4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，6-二氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0291] N-[5-(6-{[4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0292] 4-叔丁基-N-[6-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺；
[0293] N-[5-(6-{[4-(1-乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0294] N-[5-(6-{[4-(1，4-二乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0295] N-[3-(6-{[4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，6-二氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0296] N-[5-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-7，7-二氟-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0297] N-[5-(6-{[4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0298] N-[6-(6-{[4-(1-乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-3-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0299] N-[6-(6-{[4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-3-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0300] N-[6-(6-{[4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-3-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0301] N-[6-(6-{[4-(1，4-二乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-3-氟吡啶-2-基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0302] N-[3-(6-{[4-(1，4-二乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0303] N-[3-(6-{[4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0304] N-{5-[6-({4-[(2R)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-氟苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0305] N-[3-(6-{[4-(1，4-二乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2，6-二氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0306] N-{5-[6-({4-[(2S)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-氟苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0307] N-{6-[6-({4-[(2S)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-3-氟吡啶-2-基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0308] N-{6-[6-({4-[(2R)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-3-氟吡啶-2-基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0309] N-[2-氟-5-(4-甲基-6-{[4-(4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0310] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟-6-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0311] N-[3-(6-{[4-(1-乙基-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0312] N-[5-(6-{[4-(2，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0313] N-{5-[6-({4-[2-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(二甲基氨基)-2-氧代乙基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]-2-氟苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0314] N-{2-氟-5-[6-({4-[1-(2-羟基乙基)-4-甲基-3-氧代哌嗪-2-基]苯基}氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基]苯基}-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0315] N-[5-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-氟苯基]-4，4-二氟-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0316] N-[3-(6-{[4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基]氨基}-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基]-4-羟基-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；
[0317] N-[3-(5-{[5-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)吡啶-2-基]氨基}-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺；以及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物。
[0318] 本文所述的本发明的化合物是Btk的有效抑制剂。虽然不受任何理论的约束，但是某些化合物具有更高效力(通过例如抑制在
全血中的Btk以及抑制小鼠中的B细胞活化测得)的形式的改善的性质。
[0319] 用于获得本文所述的新型化合物的方法对本领域的普通技术人员会是显而易见的，适当的方法描述于例如以下的反应路线和
实施例中以及本文引用的参考文献中。也参见于2006年3月9日提交的美国申请11/371,180号(US2006/0229337)，其全部援引加入本文中。
[0320] 反应路线1
[0321]
[0322]
[0323] 参考反应路线1，步骤1，向式201的化合物、双(戊酰)二
硼(bis(pinacolato)diboron)和碱如乙酸钾的悬浮液加入约0.03当量的[1，1’-双(二苯基膦基)二茂
铁]二氯化钯(II)二氯甲烷复合物(1∶1)。在约85℃加热反应约20h。分离并任选地纯化产物式203的化合物。
[0324] 参考反应路线1，步骤2，将10％碳载钯加入到式203的化合物在极性质子溶剂如甲醇中的混合物中。向混合物加入氢气。在室温下在氢囊压下搅拌反应约13h。分离并任选地纯化产物式205的化合物。
[0325] 参考反应路线1，步骤3，将约1当量的式206的化合物在惰性溶剂如二氯甲烷中的溶液分批地加入式205的化合物和碱如三乙胺在惰性溶剂如二氯甲烷中的溶液中。在室温下搅拌混合物约16h。分离并任选地纯化产物式207的化合物。
[0326] 反应路线2
[0327]
[0328]
[0329] 参考反应路线2，步骤1，将式301的化合物、过量(如约1.2当量)的双(新戊基乙二醇)二硼(bis(neopentyl glycolato)diboron)和约0.3当量的[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷1∶1复合物以及碱如乙酸钾在惰性溶剂如二氧六环中的混合物加热回流约3h。分离并任选地纯化产物式303的化合物。
[0330] 参考反应路线2，步骤2，在室温下，将式303的化合物和10％碳载钯在惰性溶剂如乙酸乙酯甲醇中的混合物用40psi的氢处理约2h。分离并任选地纯化产物式305的化合物。
[0331] 参考反应路线2，步骤3，将式305的化合物和碱如三乙胺在惰性溶剂如THF中的溶液用约1当量的式306的酰氯滴加处理，并在室温下搅拌混合物约15min。分离并任选地纯化产物式307的化合物。
[0332] 反应路线3
[0333]
[0334] 参考反应路线3，步骤1，将式501的化合物、约1当量的NH2-R13的化合物和惰性碱如1-甲基-2-吡咯烷
酮的混合物在约130℃下加热约1hr。分离并任选地纯化产物式503的化合物，其中R13是
[0335] 参考反应路线3，步骤2，在密封的
压力容器中，将式503的化合物、过量(如约1.2当量)的式107的化合物、约0.05当量的四(三苯基膦)钯和碱如1N碳酸钠在惰性溶剂如1，2-二甲氧基乙烷中的混合物，在约100℃加热约16hr。分离并任选地纯化产物式505的化合物。
[0336] 在一些实施方案中，式I-IX中的任一式的化合物作为药物组合物或制剂给药。因此，本发明提供药物制剂，其包含式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物，以及至少一种选自载体、辅剂和赋形剂的药学可接受的媒介。
[0337] 药学可接受的媒介纯度必须足够高并且毒性必须足够低以便使它们适合给予被治疗的动物。所述媒介可以是惰性的或者它可以具有药用益处。与所述化合物结合使用的媒介的量足够提供实际数量的用于给药每单位剂量的所述化合物的物质。
[0338] 示例性的药学可接受的载体或其组分是糖类，例如乳糖，
葡萄糖和
蔗糖；
淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；
纤维素及其衍生物，如羧甲基
纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；固体
润滑剂，例如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；合成油；
植物油，例如
花生油，
棉籽油，芝麻油，
橄榄油和玉米油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；藻酸；磷酸盐缓冲溶液；乳化剂，例如吐温类；润湿剂，例如十二烷基硫酸钠；
着色剂；
调味剂；压片剂；稳定剂；抗
氧化剂；
防腐剂；无热
原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲溶液。
[0339] 任选的基本上不会干扰本发明的化合物的活性的活性剂可以被包含在药物组合物中。
[0340] 有效浓度的式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物、和混合物与合适的药学可接受的媒介混合。在所述化合物显示不足的
溶解度情况下，可以使用使化合物溶解的方法。这些方法是本领域的技术人员已知的，包括但不限于使用共溶剂例如二甲基亚砜(DMSO)，使用
表面活性剂例如吐温，或在
碳酸氢钠水溶液中溶解。
[0341] 混合或加入式I-IX中任一式的化合物后，所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等。所得混合物的形式取决于几个因素，包括预期的给药方式和所述化合物在所选的媒介中的溶解度。足够改善被治疗的疾病的症状的有效浓度可以凭经验确定。
[0342] 式I-IX中的任一式的化合物可以口服、局部、肠胃外、静脉内、通过肌内注射、通过吸入或喷雾、舌下、经皮、经含服给药、经直肠、作为眼用溶液剂或通过其它方法在剂量单位制剂中给药。
[0343] 适合口服使用的剂量制剂包括例如片剂、含片、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散的散剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。预期口服使用的组合物可以根据任何本领域已知的用于生产药物组合物的方法来制备，并且所述组合物可以含有一种或多种试剂，例如
甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上美观、可口的制剂。在一些实施方案中，口服制剂含有0.1-99％的式I-IX中任一式的化合物。在一些实施方案中，口服制剂含有至少5％(重量％)的式I的化合物。一些实施方案含有25％-50％或5％-75％的式I-IX中任一式的化合物。
[0344] 口服给药的组合物还包括液态溶液剂、乳剂、混悬剂、散剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、糖浆剂等。适合用于制备所述组合物的药学可接受的载体是本领域中众所周知的。口服制剂可以含有防腐剂、调味剂、甜味剂例如蔗糖或糖精、
味道掩蔽剂和着色剂。
[0345] 用于糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂的载体的一般组分包括
乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨醇和水。糖浆剂和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖来配制。所述制剂还可以含有缓和剂。
[0346] 式I-IX中的任一式的化合物可以掺入口服液态制剂，例如水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂。而且，含有这些化学实体的制剂可以作为用于在使用前与水或其它合适的媒介物进行构建的干燥产品提供。所述液态药剂可以含有常规添加剂，例如助悬剂(例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖、糖浆、明胶、羟乙基纤维素、
羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶以及氢化食用脂)、乳化剂(例如卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸酯或阿拉伯胶)、可以包括食用油(例如
杏仁油、
分馏椰子油、甲
硅烷基酯(silylester)、丙二醇和乙醇)的非水性运载体、和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸)。
[0347] 对于混悬剂，一般的助悬剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、AVICELRC-591、西黄蓍胶和藻酸钠；一般的润湿剂包括卵磷脂和聚山梨酯80；一般的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠
[0348] 水性混悬剂含有与适于生产水性混悬剂的赋形剂混和的活性物质。所述赋形剂包括助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂；天然存在的磷脂，例如卵磷脂、或烯烃氧化物与
脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如十七乙烯氧基十六醇、或环氧乙烷与得自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇代替物、或环氧乙烷与得自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐代替物。水性混悬剂还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯。
[0349] 油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮在
植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、或矿物油(例如液体
石蜡)中来配制。所述油性混悬剂可以含有
增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以加入甜味剂(例如上述的那些)和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂例如
抗坏血酸来保存。
[0350] 本发明的药物组合物还可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油、或者矿物油例如液体石蜡、或者这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的胶例如阿拉伯树胶或西黄蓍胶、天然存在的磷脂例如大豆卵磷脂、和得自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如山梨糖醇酐单油酸酯、和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。
[0351] 适合通过加入水来制备水性混悬剂的可分散散剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成份。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂的例子是以上已经例举的那些。
[0352] 片剂通常包含常规的药学可接受的辅剂作为惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；
粘合剂，例如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，例如淀粉、藻酸和交联羧甲纤维素；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。助流剂例如
二氧化硅能用于改善粉末混合物的流动性。为外观可以加入着色剂，例如FD&C染料。甜味剂和调味剂，例如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷油和水果香料可以是用于咀嚼片的有用辅剂。胶囊剂(包括延时释放(time release)和缓释制剂)通常包含一种或多种以上公开的固体稀释剂。载体组份的选择经常取决于次要的因素，像味道、成本和贮存
稳定性。
[0353] 所述组合物还可以通过常规方法进行包衣(通常用pH或时间依赖性包衣)，使得所述化合物在胃肠道中在期望的局部施用处附近释放，或在不同的时间释放以延长期望的作用。这些剂型通常包含但不局限于邻苯二甲酸醋酸纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙基纤维素、
丙烯酸树脂包衣、蜡和虫胶中的一种或多种。
[0354] 用于口服使用的制剂还可以作为其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或
高岭土混合的硬明胶胶囊剂提供，或作为其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊剂提供。
[0355] 药物组合物可以是无菌可注射水性或油性混悬剂的形式。该混悬剂可以根据已知的技术使用适合的上述分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的媒介物中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液剂。可使用的所述可接受的媒介物包括水、林格液和等渗
氯化钠溶液。而且，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。而且，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射制剂。
[0356] 式I-IX中的任一式的化合物可以在无菌介质中
肠胃外给药。肠胃外给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、鞘内注射或输液技术。式I-IX中的任一式的化合物根据所述媒介和所用的浓度，可以悬浮或溶解在所述媒介物中。有利地，可以将辅剂例如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂溶解在所述媒介物中。在许多用于肠胃外给药的组合物中，载体包含至少90重量％的总组合物。在一些实施方案中，用于肠胃外给药的载体选自丙二醇、油酸乙酯、吡咯烷酮、乙醇和芝麻油。
[0357] 式I-IX中的任一式的化合物还可以栓剂的形式给药以用于药物的直肠给药。这些组合物可以通过使药物与合适的无刺激性赋形剂(其在常温下是固态但在直肠
温度下是液态)混合来制备，并且因此在直肠中
熔化以释放药物。这些材料包括可可酯和聚乙二醇。
[0358] 式I-IX中的任一式的化合物可以配制成凝胶剂、乳膏剂和洗剂的形式用于局部(local)或局部(topical)施用(例如局部施用于
皮肤和例如眼睛的粘膜)而施用于眼睛。
局部组合物可以是任何形式的，包括例如溶液剂、乳膏剂、
软膏剂、凝胶剂、洗剂、乳剂(milk)、清洁剂、
保湿剂、喷雾剂、
皮肤贴片等。
[0359] 所述溶液剂可以用合适的盐配制成0.01％-10％pH 5-7的等渗溶液。式I-IX中的任一式的化合物还可以配制成
透皮贴剂用于
经皮给药。
[0360] 包含式I-IX中任一式的化合物的局部组合物可以与本领域公知的各种载体材料例如水、醇类、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、丙二醇、PPG-2豆蔻基丙酸酯等混合。
[0361] 适合用于局部载体的其它材料包括例如
软化剂、溶剂、保湿剂、增稠剂和粉末。可以单独地或作为一种或多种材料的混合物使用的这些类
型材料各自的例子如下：
[0362] 代表性的软化剂包括硬脂醇、单蓖麻醇酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、貂油、十六醇、异硬脂酸异丙酯、硬脂酸、棕榈酸异丁酯、硬脂酸异鲸蜡酯、油醇、月桂酸异丙酯、月桂酸己酯、油酸癸酯、十八烷-2-醇、异十六烷醇、鲸蜡醇十六酸酯、二甲基聚硅氧烷、癸二酸二正丁酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、聚乙二醇、三甘醇、羊毛脂、芝麻油、椰子油、花生油、
蓖麻油、乙酰化羊毛酯醇、石油、矿物油、肉豆蔻酸丁酯、异硬脂酸、棕榈酸、亚油酸异丙酯、乳酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、和肉豆蔻酸肉豆蔻酯；抛射剂，例如丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚、二氧化碳和氧化亚氮；
溶剂，例如乙醇、二氯甲烷、异丙醇、蓖麻油、乙二醇单乙醚、二甘醇一丁基醚、二甘醇单乙醚、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃；保湿剂，例如甘油、山梨醇、2-吡咯烷酮-5-
羧酸钠、可溶性
胶原蛋白、邻苯二甲酸二丁酯和明胶；和粉末，例如天然碳酸钙(chalk)、滑石、漂白土、高岭土、淀粉、树胶、胶体二氧化硅、聚丙烯酸钠、四烷基铵蒙脱石、三烷基芳基铵蒙脱石、化学改性的
硅酸镁铝、有机改性的蒙脱土、水合硅酸铝、
热解法二氧化硅、羧基乙烯基
聚合物、羧甲基纤维素钠和乙二醇单硬脂酸酯。
[0363] 式I-IX中的任一式的化合物还可以脂质体递药系统例如小
单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式局部给药。脂质体可以由各种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺和磷脂酰胆碱形成。
[0364] 用于实现所述化合物的全身递送的其它组合物包括舌下、含服和鼻腔剂型。所述组合物通常包含一种或多种可溶性填充物质，例如蔗糖、山梨醇和甘露醇，和粘合剂，例如阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。还可以包含上述的助流剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、抗氧化剂和调味剂。
[0365] 用于吸入的组合物通常可以能够作为干粉给药的溶液剂、混悬剂或乳剂的形式或以使用常规抛射剂(例如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷)的气雾剂的形式来提供。
[0366] 本发明的组合物还可以任选地包含活性增强剂。所述活性增强剂可以选自多种分子，所述分子以不同方式起作用以提高或不依赖本发明化合物的疗效。活性增强剂的具体类型包括
皮肤渗透促进剂和吸收促进剂。
[0367] 本发明的药物组合物还可以含有可选自多种分子的其它活性剂，所述分子能够以不同方式起作用以提高式I-IX中任一式的化合物的疗效。这些任选的其它活性剂(当存在时)通常以0.01％-15％的水平用于本发明的组合物中。一些实施方案含有0.1重量％-10重量％的所述组合物。其它实施方案含有0.5重量％-5重量％的所述组合物。
[0368] 本发明包括包装的药物制剂。这种包装的制剂包含：包含式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物的药物组合物，和使用所述组合物治疗哺乳动物(一般为人类患者)的说明书。在一些实施方案中，所述说明书用于使用所述药物组合物治疗患有应答Btk活性抑制和/或B细胞和/或髓样细胞活性抑制的疾病的患者。本发明可以包括向例如患者或保健提供者或者作为包装的药物制剂中的标签来提供
处方信息。处方信息可以包括例如关于所述药物制剂的功效、剂量和用法、禁忌证和不良反应信息。
[0369] 在所有上述内容中，式I-IX中的任一式的化合物可以单独地、作为混合物、或与其它活性剂联合给药。
[0370] 因此，本发明包括治疗患有应答Btk活性抑制的疾病的患者例如哺乳动物如人的方法，其包括向具有这种疾病的患者给药有效量的式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物。
[0371] 在Btk与疾病有关的范围内，疾病和疾病症状的减轻、预防法和预防性治疗都在本发明的范围内。在一些实施方案中，式I-IX中的任一式的化合物还可以抑制其它激酶，以使与这些激酶有关的病症的疾病和疾病症状的减轻、预防法和病症的预防性治疗也都在本发明的范围内。
[0372] 治疗方法还包括通过给药有效浓度的式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物，通过体内抑制ATP结合或Btk的水解或通过某种其它机制来抑制患有应答Btk活性抑制的疾病的患者的Btk活性和/或抑制B细胞和/或髓样细胞活性。有效浓度的例子是足够抑制体内Btk活性的浓度。有效浓度可以用实验例如通过测定所述化合物的血液浓度、或理论上通过计算生物利用度来确定。
[0373] 在一些实施方案中，应答Btk活性和/或B细胞和/或髓样细胞活性抑制的病症是癌症、骨病、变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应。
[0374] 本发明包括治疗患有癌症、骨病、变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应的患者的方法，其通过给药有效量的式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物。
[0375] 在一些实施方案中，使用式I-IX中的任一式的化合物可以影响的病症和疾病包括但不限于：
[0376] 变态反应性疾病，包括但不限于湿疹、变应性鼻炎或鼻炎、花粉症、支气管哮喘、荨麻疹(寻麻疹)和食物过敏和其它特应性病症；
[0377] 自身免疫和/或炎性疾病，包括但不限于
银屑病、克罗恩病、肠易激综合症、干燥综合征、组织移植排斥反应、以及移植器官的超急性排斥反应、哮喘、系统性红斑狼疮(和相关的肾小球肾炎)、皮肌炎、多发性硬化、硬皮病、血管炎(ANCA相关和其它血管炎)、自身免疫溶血性疾病及血小板减少性状态、
肺出血肾炎综合征(和相关的肾小球肾炎和肺出血)、动脉粥样硬化、类风湿关节炎、骨关节炎、慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)、
艾迪生病、
帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病(1型)、感染性休克、重症肌无力、溃疡性结肠炎、再生障碍性贫血、Coeliac病、韦格纳肉芽肿、和其中细胞和抗体由个体的自身组织引起并直接对抗个体的自身组织的其它疾病；
[0378] 急性炎症反应，包括但不限于皮肤晒伤、盆腔炎症性疾病、炎性肠病、尿道炎、葡萄膜炎、鼻窦炎、肺炎、脑炎、脑膜炎、心肌炎、肾炎、骨髓炎、肌炎、
肝炎、胃炎、肠炎、皮炎、龈炎、阑尾炎、胰腺炎和胆囊炎；
[0379] 癌症，包括但不限于恶性血液病如B细胞淋巴瘤、和急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性和急性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、和其他以血液或淋巴系统的癌症为特征的疾病；和[0380] 骨病，包括但不限于骨质疏松。
[0381] Btk是已知的淋巴瘤B细胞凋亡的抑制剂。缺陷凋亡有助于人白血病和淋巴瘤的发病和抗药性。因此，还提供促进或诱导表达Btk的细胞凋亡的方法，其包括使所述细胞与式I-IX中任一式的化合物、其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物接触。
[0382] 本发明提供治疗方法，其中式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物、或者组合物(如其药物组合物)是给予患者的唯一的活性剂，并且本发明还包括治疗方法，其中将式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物、或者组合物(如其药物组合物)与一种或多种其它活性剂联合给予患者。可以依次地或连续地给予患者所述其他活性剂与本发明的化合物或组合物。
[0383] 本发明提供治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和/或哮喘的方法，其中式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物是给予患者的唯一活性剂，并且还包括治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和/或哮喘的方法，其中将式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物与一种或多种其他活性剂联合给予患者。
[0384] 因此，在一个实施方案中，本发明提供治疗癌症、骨病、变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应的方法，其包括向有此需要的患者给药有效量的式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物，以及能够用于治疗癌症、骨病、变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病和/或急性炎症反应的另一种活性剂。例如，所述另一种药剂的例子可以是抗炎剂。用所述另一种活性剂的治疗可以在用式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物治疗之前、同时、或之后进行。在某些实施方案中，式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物与另一种活性剂混合在单剂型中。合适的可以与式I-IX中任一式的化合物联合使用的
抗肿瘤剂包括但不限于化学治疗剂，例如丝裂霉素C、卡铂、紫杉酚、
顺铂、紫杉醇、依托泊苷、阿霉素或包含至少一种上述化学治疗剂的组合。
放射治疗抗肿瘤剂也可以单独地或与化学治疗剂联合使用。
[0385] 式I-IX 中 的 任 一 式 的 化 合 物 可 用 作 化 学 疗 法 敏 感 化 剂(chemosensitizingagent)，因此可与其它化学治疗剂特别是诱导凋亡的药物联合使用。
[0386] 本文还提供增强癌细胞对化学疗法的敏感性的方法，其包括向正接受化学治疗的患者给药化学治疗剂和足以增强癌细胞对所述化学治疗剂的敏感性的量的式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物。
[0387] 可与本发明的化合物联合使用的其它化学治疗药的例子包括拓扑异构酶I抑制剂(喜树碱或托泊替康)、拓扑异构酶II抑制剂(例如柔红霉素和依托泊苷)、烷化剂(例如环磷酰胺、美法仑和BCNU)、微管蛋白定向剂(例如紫杉酚和长春碱)、生物制剂(例如，抗体如抗CD20抗体、IDEC 8、免疫毒素和细胞因子)、酪氨酸激酶抑制剂(例如Gleevac)等。可以与本发明的化合物联合使用的其他化学治疗药的这样的实例还包括：R-CHOP(环磷酰胺(也称为Cytoxan/Neosar)、多柔比星(或阿霉素)、长春新碱(Oncovin)和泼尼松龙)、ICE(异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、顺铂和阿糖胞苷)、ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、阿糖胞苷和顺铂)、吉西他滨、Rituxan 、Treanda 、苯丁酸氮芥、
氟达拉滨、阿仑珠单抗等。
[0388] 本文包括治疗方法，例如用于治疗自身免疫和/或炎性疾病的方法，其中式I-IX中任一式的化合物及其药学可接受的盐、溶剂合物和混合物与抗炎剂联合给药。抗炎剂包括但不限于NSAID、非特异性的和COX-2特异性的环加氧酶酶抑制剂、金化合物、皮质类固醇、甲氨蝶呤、肿瘤
坏死因子(TNF)受体拮抗剂、免疫抑制剂和甲氨蝶呤。
[0389] NSAID的例子包括但不限于布洛芬、氟比洛芬、
萘普生和萘普生钠、双氯芬酸、双氯芬酸钠和米索前列醇的组合、舒林酸、奥沙普秦、二氟尼柳、吡罗昔康、吲哚美辛、依托度酸、非诺洛芬钙、酮洛芬、萘丁美酮钠、柳氮磺吡啶、托美丁钠和羟氯喹。NSAID的例子还包括COX-2特异性抑制剂(即抑制COX-2、IC50至少低于COX-1的IC5050倍的化合物)，例如塞来昔布、伐地考昔、芦米考昔、依托考昔和/或罗非昔布。
[0390] 在另一个实施方案中，所述抗炎剂是水杨酸盐。水杨酸盐包括但不限于乙酰水杨酸或阿司匹林、水杨酸钠、和水杨酸胆碱和水杨酸镁。
[0391] 所述抗炎剂还可以是皮质类固醇。例如，所述皮质类固醇可以选自可的松、地塞米松、甲泼尼龙、泼尼松龙、强的松龙磷酸钠和泼尼松。
[0392] 在其它实施方案中，所述抗炎治疗剂是金化合物，例如硫代苹果酸金钠或金诺芬。
[0393] 本发明还包括其中所述抗炎剂是代谢抑制剂(例如二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨蝶呤，或二氢
乳清酸脱氢酶抑制剂如来氟米特)的实施方案。可以与本发明的任一种或多种化合物联合使用的另二种抗炎剂包括用于治疗类风湿性关节炎的生物制剂或口服药剂。
[0394] 本发明的其它实施方案涉及联合，其中至少一种抗炎化合物是抗C5单克隆抗体(例如艾库组单抗(eculizumab)或培克珠单抗(pexelizumab))、TNF拮抗剂，例如依那西普(entanercept)、英利昔单抗和阿达木单抗(Humira )，它们是抗TNFα单克隆抗体。
[0395] 本发明的其它实施方案涉及联合，其中至少一种活性剂是免疫抑制剂化合物，例如甲氨蝶呤、来氟米特、环孢菌素、他克莫司、硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯。
[0396] 本发明的又一些其他方案涉及与Rituxan (利妥昔单抗)或通过选择性地减少CD20+B细胞来发挥作用的其他药剂的联合。
[0397] 例如约0.1mg-140mg/千克体重/天的量级的剂量水平可用于治疗以上所指的病症(0.5mg-7g/患者/天)。可以与媒介物混合以产生单剂型的活性成份的量可以根据被治疗的主体和给药的具体方式而变化。剂量单位形式通常会含有1mg-500mg的活性成份。
[0398] 剂量的
频率也可以根据所用的化合物和具体治疗的疾病而变化。在一些实施方案中，例如为了治疗变态反应性疾病和/或自身免疫和/或炎性疾病，使用每天4次或更少的剂量方案。在一些实施方案中，使用每天1或2次的剂量方案。然而，应该理解，对于任何具体患者的具体剂量水平会取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、联合用药和接受治疗的患者的具体疾病的严重性。
[0399] 本发明的化合物的标记形式可以用作
诊断剂，其用于
鉴别和/或获得具有调节本文所述的激酶的活性的作用的化合物。本发明的化合物还可以用于确认、优化和标准化生物测定。
[0400] 本文用“标记的”是指，化合物直接地或间接地用提供可检测信号的标记物(例如
放射性同位素、
荧光标记、酶、抗体、颗粒例如
磁性颗粒、
化学发光标记或特异性结合分子等)标记。特异性结合分子包括对，例如生物素和抗生蛋白链菌素、地高辛和抗地高辛药等。对于特异性结合元件，互补元件一般根据已知的方法用如上概述的提供检测的分子标记。所述标记物可以直接地或间接地提供可检测信号。
[0401] 通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
[0402] 实施例1
[0403] 路线1a
[0404]
[0405] 路线1b
[0406]
[0407] 2-(4-硝基苯基)乙酸甲酯(1)。
[0408]
[0409] 向装配有磁搅拌器和回流冷凝管的1-L单颈圆底烧瓶加入4-硝基苯基乙酸(14.1g，77.5mmol)、无水甲醇(130mL)和浓硫酸(12.0mL，216mmol)，然后加热反应混合物回流16h。此后，在减压下浓缩此反应至干。在水(500mL)和乙醚(200mL)之间分配所得剩余物，然后分离各层。用乙醚(100mL)萃取水相。用饱和碳酸钠水溶液洗涤合并的有机相，用
硫酸镁干燥，然后通过过滤除去干燥剂。在减压下浓缩滤液，然后在
真空下干燥至恒重，1
得到1(14.6g)，收率96％，为白色固体：mp 45-46℃；HNMR(500MHz，CDCl3) 8.19(d，2H，J＝8.5Hz)，7.46(d，2H，J＝8.5Hz)，3.75(s，2H)，3.73(s，3H)。文献：Tetrahedron 2002，58，
10113。
[0410] 2-溴-2-(4-硝基苯基)乙酸甲酯(2)。
[0411]
[0412] 向装备有磁搅拌器和回流冷凝管的1-L单颈圆底烧瓶加入1(10.6g，54.1mmol)、四氯化碳(120mL)、N-溴代琥珀酰亚胺(10.7g，59.9mmol)和偶氮二异丁腈(275mg，1.67mmol)，然后加热此反应混合物回流18h。此后，将反应冷却至室温，然后倾入庚烷(120mL)中。过滤所得悬浮液，然后用庚烷(40mL)洗涤
滤饼。在减压下浓缩滤液，然后所得
1
剩余物经快速色谱法得到2，收率72％(10.7g)，为澄清油：HNMR(500MHz，CDCl3) 8.23(d，
2H，J＝9Hz)，7.74(d，2H，J＝9.0Hz)，5.40(s，1H)，3.82(s，3H)；MS(ESI-)m/z 272(M-H)。
文献：Tetrahedron 2002，58，10113。
[0413] 1，4-二甲基-3-(4-硝基苯基)哌嗪-2-酮(3)。
[0414]1 2
[0415] 用氮气吹扫装备有磁搅拌器的100-mL单颈圆底烧瓶，加入N，N-二甲基乙烷-1，2-二胺(1.61g，18.2mmol)、乙醇(5mL)和2(500mg，1.82mmol)，然后在室温下搅拌此反应
1h。此后，在减压下
蒸发此反应混合物，然后经快速柱色谱纯化所得剩余物，得到3，收率
1
89％(404mg)，为黄色油：HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.18(d，2H，J＝8.5Hz)，7.60(d，2H，J＝
8.5Hz)，3.87(s，1H)，3.61(td，1H，J＝12.0，4.0Hz)，3.26(ddd，1H，J＝12.0，4.0，2.5Hz)，
3.02(ddd，1H，J＝12.0，4.0，2.5Hz)，2.84(s，3H)，2.64(td，1H，J＝12.0，4.0Hz)，2.06(s，
3H)。
[0416] 3-(4-氨基苯基)-1，4-二甲基哌嗪-2-酮(4)。
[0417]
[0418] 用氮气吹扫装备有磁搅拌器的50-mL单颈圆底烧瓶，然后加入3(200mg，0.80mmol)、乙醇(5mL)和10％炭载钯(50％湿重，4mg干重)。用氢气吹扫反应烧瓶，然后在氢囊压下搅拌此反应混合物2h。此后，用氮气吹扫此烧瓶。通过
硅藻土(Celite)521垫过滤除去催化剂，然后用乙醇(10mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液得到4(166mg)，收率
94％，为无色油：1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ6.89(d，2H，J＝8.5Hz)，6.47(d，2H，J＝8.5Hz)，
4.94(s，2H)，3.53(td，1H，J＝12.0，4.0Hz)，3.44(m，1H)，3.21(dt，1H，J＝12.0，4.0Hz)，
2.92(dt，1H，J＝12.0，4.0Hz)，2.82(s，3H)，2.02(s，3H)；MS(ESI+)m/z220(M+H)。
[0419] 5-溴-3-羟基-1-甲基-1H-吡嗪-2-酮氢溴酸盐(5)。
[0420]
[0421] 用氮气吹扫装备有机械搅拌器和回流冷凝管的500-mL三颈圆底烧瓶，然后加入2-(甲基氨基)乙腈(23.4g，220mmol)和二氯甲烷(200mL)。用草酰溴(50.0g，231mmol)处理此悬浮液，然后加热反应至回流。2.5天后，将所得混合物冷却至0℃，然后过滤。用二氯甲烷(2×30mL)洗涤滤饼，然后在真空下干燥至恒重，得到5(49.4g)，收率79％，为橙色固
1
体：mp 161-162℃分解；HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ12.00(s，1H)，5.11(s，1H)，2.95(s，3H)；
MS(ESI+)m/z 205(M-Br)。
[0422] 4，4，5，5-四 甲 基 -2-(2- 甲 基-3- 硝 基 苯 基 )-[1，3，2]二 氧 硼 戊 环(dioxaborolane)(6)。
[0423]
[0424] 用氮气吹扫装备有机械搅拌器和
调温器的1-L三颈圆底烧瓶，然后加入2-溴-6-硝基甲苯(60.2g；278mmol)、双(戊酰)二硼(85.2g；336mmol)、乙酸钾(82.4g；
840mmol)和DMSO(320mL)。使氮气流通过所得悬浮液30min，然后加入[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷(1∶1)复合物(7.60g；9.30mmol)，然后在85℃加热反应20h。此后，将混合物冷却至
环境温度，倾入到水(1300mL)和MtBE(500mL)的混合物中，然后用Cellpure P65(150cc)处理。通过在多孔玻璃漏斗(ID 185mm)上填充的Cellpure P65(200cc)垫过滤所得悬浮液。用MtBE(3×180mL)洗涤滤饼，分出滤液的有机层，用水(3×1L)洗涤，然后用硫酸钠干燥。滤除硫酸钠后，浓缩滤液，然后通过快速色谱纯化，得到4，4，5，5-四甲基-2-(2-甲基-3-硝基苯基)-[1，3，2]二氧硼戊环(6)，为浅黄色固体的：mp 52-53℃；MS(APCI+)m/z264(M+H)。
[0425] 2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)-苯胺(7)。
[0426]
[0427] 向装备有磁搅拌器的500-mL圆底烧瓶加入4，4，5，5-四甲基-2-(2-甲基-3-硝基苯基)-[1，3，2]二氧硼戊环(6)(8.44g；32.1mmol)和甲醇(150mL)。将反应烧瓶抽空并反充入氩气两次。然后将10％炭载钯(50％湿重，425mg干重)加入到溶液中，将反应烧瓶抽空并反充入氢气三次。然后在氢囊压下在室温下搅拌反应13h。此后，将此烧瓶抽空并反充入氩气两次，然后通过Celite521垫过滤，接着在真空中浓缩滤液。在高真空下干燥所得剩余物1d，得到定量收率(8.16g)的2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)苯胺(7)，为白色固体：mp 110-112℃；MS(ESI+)m/z 234(M+H)。
[0428] 4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-碳酰氯(8)。
[0429]
[0430] 在氮气下，将4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-羧酸(1.0g，5.50mmol)溶于包含5滴N，N-二甲基甲酰胺[DMF]的二氯甲烷[DCM](25mL)中，并冷却至0℃。通过
注射器加入草酰氯(13.7mL，2.0M在DCM中的溶液)，并在1小时内使其温热至RT。然后在减压下除去所有溶剂，并将所得油从甲苯(3x20mL)中稀释(reduced)，以除去残余的草酰氯。然后将剩余物溶于乙酸乙酯，并用饱和碳酸氢钠(1x100mL)洗涤，然后用饱和氯化钠(1x100mL)洗涤，并用硫酸钠干燥。然后过滤溶液，在减压下浓缩，得到4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-碳酰氯(8)(1.03g)，为灰白色固体。
[0431] 4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-羧酸[2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)苯基]酰胺(9)。
[0432]
[0433] 在氮气氛下，在0℃将2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)苯胺(7)(1.20g，5.16mmol，1.0equiv)和吡啶(0.42mL，25.8mmol)溶于DCM(40mL)。然后在5min内分批地加入4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-碳酰氯(8)(1.03g，5.16mmol)，使其反应并在60min内温热至RT。然后在减压下除去所有溶剂，之后将所得油从甲苯(3x20mL)中稀释，以除去残余的吡啶。然后将剩余物溶于乙酸乙酯并用氢氧化钠(1N，1x100mL)洗涤，然后用饱和氯化钠(1x100mL)洗涤，并用硫酸钠干燥。然后过滤溶液，在减压下浓缩得到4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-羧酸[2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)苯基]酰胺(9)(1.87g)，为灰白色固体。
[0434] 4-甲基-6-(2-甲基-3-(4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰氨基)苯基)-3-氧代-3，4-二氢吡嗪-2-醇钠(10)。
[0435]
[0436] 向装配有机械搅拌器、回流冷凝管和氮气进口的250-mL三颈圆底烧瓶加入1，4-二氧六环(100mL)和2.0M碳酸钠水溶液(15mL，29.5mmol)。向所得溶液通入氮气15分钟后，加入5(8.44g，29.5mmol)、9(12.9g，32.5mmol)和四(三苯基膦)钯(2.38g，2.06mmol)，然后加热反应混合物回流20h。此后，使反应冷却至室温，然后通过Celite 521垫过滤。用甲醇/二氯甲烷的1∶1溶液(350mL)洗涤滤饼，然后弃去滤饼。静置时，在滤液中形成沉淀，过滤此固体。用乙酸乙酯(50mL)使滤饼成粉末，过滤，然后在真空下干燥。使所得固体悬浮于水(75mL)中，过滤，然后用水(25mL)洗涤滤饼。将滤饼干燥至恒重，得到10，收率
1
53％(6.57g)，为浅黄色固体：mp 225-230℃分解，HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.73(s，1H)，
7.66(s，1H)，7.21(m，1H)，7.16(m，2H)，6.37(s，1H)，2.75(m，2H)，2.61(m，2H)，2.20(s，3H)，
1.77(m，4H)；MS(ESI+)m/z 418(M+H)。
[0437] N-(3-(6-溴-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(11)。
[0438]
[0439] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器和回流冷凝管的250-mL单颈圆底烧瓶，然后加入10(6.55g，15.7mmol)和无水二氯甲烷(60mL)。向所得的悬浮液加入三溴氧化磷(9.95g，
34.3mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(190mg，2.60mmol)，然后将反应加热回流4h。此后，将反应混合物倾入10％碳酸钾水溶液(100mL)，并加入二氯甲烷(75mL)。通过Celite 521过滤所得悬浮液，然后分离各层。用二氯甲烷(2×100mL)萃取水层，用硫酸钠干燥合并的有机层，过滤，然后在减压下浓缩。用乙酸乙酯/己烷的2∶1溶液(10mL)使所得剩余物成粉末，然后过滤。用2∶1乙酸乙酯/己烷溶液(20mL)洗涤滤饼，然后在真空下干燥至恒重，得
1
到11，收率50％(3.59g)，为浅黄色固体：mp 240-241℃，HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.86(s，
1H)，7.98(s，1H)，7.67(s，1H)，7.28(m，3H)，3.57(s，3H)，2.76(t，2H，J ＝ 5.5Hz)，2.61(t，
2H，J＝5.5Hz)，2.18(s，3H)，1.76(m，4H)；MS(ESI+)m/z 458(M+H)。
[0440] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(12)。
[0441]
[0442] 向装配有磁搅拌器和回流冷凝管的25-mL单颈圆底烧瓶加入4(160mg，0.73mmol)、11(304mg，0.66mmol)、碳酸铯(475mg，1.46mmol)和1，4-二氧六环(10mL)。向所得溶液通入氮气30分钟后，加入Xantphos(32mg，0.056mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(30mg，0.033mmol)，然后加热反应混合物回流16h。此后，使反应冷却至室温，然后在减压下浓缩。使所得剩余物
吸附在硅胶上，然后通过快速色谱纯化，得到剩余物，其经制备型反相HPLC进一步纯化，得到12，收率30％(143mg)，为黄色固体：mp 155-156℃；
1
HNMR(500MHz，DMSO-d6) 9.82(s，1H)，9.43(s，1H)，8.08(d，2H，J＝7.5Hz)，7.68(s，1H)，
7.32(d，2H，J ＝ 7.5Hz)，7.27-7.32(m，3H)，7.24(s，1H)，4.88(bs，1H)，3.42-3.75(m，4H)，
3.59(s，3H)，2.95(s，3H)，2.76(m，2H)，2.61(m，5H)，2.28(s，3H)，1.78(m，4H)；MS(ESI+)m/z
597(M+H)。
[0443] 实施例2
[0444] 路线2
[0445]
[0446]
[0447] 3，5-二溴-1-甲基-2(1H)吡嗪酮(13)。
[0448]
[0449] (J.Heterocycl.Chem.1983，20，919)
[0450] 向装配有磁搅拌器和回流冷凝管的250-mL三颈圆底烧瓶加入1，2-二氯苯(100mL)和草酰溴(60.6g；281mmol)。向此溶液加入甲氨基乙腈(7.01g；65.8mmol)，然后在氮气下将反应加热至80℃。18h后，使所得混合物冷却至室温，在减压下蒸发，然后通过快速色谱纯化所得剩余物，得到3，5-二溴-1-甲基-2(1H)吡嗪酮(13)(2.87g，16％)，为灰白色固体：mp 94-95℃；MS(ESI+)m/z 267(M+H)。
[0451] 5-溴-3-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-1-甲基吡嗪-2(1H)-酮(14)。
[0452]
[0453] 向装配有机械搅拌器和回流冷凝管的100-mL三颈圆底烧瓶加入(4)(780mg，3.56mmol)、13(998mg，3.73mmol)、碳酸铯(2.36g，7.26mmol)和1，4-二氧六环(40mL)。向所得溶液通入氮气30分钟后，加入Xantphos(.162g，0.281mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(.15g，.165mmol)，然后将反应混合物加热回流16h。此后，将反应冷却至室温，然后在减压下浓缩。将所得剩余物吸附在硅胶上，然后通过快速色谱纯化，得到14，收率
1
57％(818mg)，为橙色固体：mp 206-207℃；HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.27(bs，1H)，7.72(dd，
1H，J＝2.0，8.5Hz)，7.36(dd，2H，J＝2.0，8.5Hz)，6.73(s，1H)，3.71(m，1H)，3.69(s，1H)，
3.52(s，3H)，3.21(m，1H)，3.01(m，1H)，2.97(s，3H)，2.67(m，1H)，2.19(s，3H)；MS(ESI+)m/z
406(M+H)。
[0454] 5-(3-氨基-2-甲基苯基)-3-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-1-甲基吡嗪-2(1H)-酮(15)。
[0455]
[0456] 向装配有磁搅拌器、回流冷凝管和氮气进口的250-mL三颈圆底烧瓶加入14(2.50g，6.16mmol)、7(1.79g，7.70mmol)、1，4-二 氧六 环(70mL)和 碳 酸钠 (1.96g，
18.5mmol)在水(14mL)中的溶液。向所得混合物通入氮气30min后，加入四(三苯基膦)钯(711mg，0.62mmol)，然后将反应混合物加热回流11h。此后，使反应冷却至室温，加入
2N盐酸(70mL)，然后加入乙酸乙酯(70mL)。搅拌混合物0.5h，然后通过Celite 521垫过滤。分出滤液的有机层，然后用2N盐酸(2×30mL)萃取。合并酸萃取液，然后用乙酸乙酯(4×50mL)洗涤。然后充分搅拌水溶液和乙酸乙酯(100mL)，同时分批地加入固体碳酸钾直至达到pH 12。分出水层，然后用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。用盐水(70mL)洗涤合并的有机层，然后用硫酸镁干燥。通过过滤除去干燥剂，然后在减压下浓缩滤液，在49℃真空烘箱中
1
干燥24h，得到15，收率86％(2.32g)，为琥珀色
泡沫：mp 133-134℃；HNMR(500MHz，CDCl3)
8.29(s，1H)，7.80(d，1H，J ＝ 8.5Hz)，7.29(d，2H，J ＝ 8.5Hz)，7.05(t，1H，J ＝ 8.0Hz)，
6.79(d，1H，J ＝ 7.5Hz)，6.73(d，1H，J ＝ 7.5Hz)，6.68(s，1H)，3.72(s，3H)，3.64(m，1H)，
3.20(m，1H)，3.01(m，1H)，2.99(s，3H)，2.66(m，1H)，2.24(s，3H)，2.17(s，3H)；MS(ESI+)m/z
433.3(M+H)。
[0457] 7-氧代-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-羧酸(16)。
[0458]
[0459] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的25-mL单颈圆底烧瓶，然后加入4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-羧酸(3.00g，16.5mmol)、乙酸(40mL)和水(40mL)。逐滴加入硝酸铈(IV)铵(36.1g，65.9mmol)在乙酸(40mL)中的溶液，然后在室温下搅拌反应1h。此后，将反应混合物倾入水(200mL)中，然后用二氯甲烷(3×200mL)萃取。合并有机萃取液，用硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下除去溶剂，得到16，收率72％(2.35g)，为黄色固体：mp 174-175℃；1
HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.60(bs，1H)，7.68(s，1H)，2.86(t，2H，J＝6.0Hz)，2.59(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(五重峰，2H，J＝6.0Hz)。
[0460] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7-氧代-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(17)。
[0461]
[0462] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的50-mL单颈圆底烧瓶，然后加入15(249mg，1.27mmol)、16(500mg，1.16mmol)、N，N-二异丙基乙胺(600mg，4.64mmol)和无水DMF(5mL)。
加入苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP，616mg，1.39mmol)，并搅拌此反应4h。此后，用水(10mL)稀释反应，然后过滤所得悬浮液。将滤饼溶于二氯甲烷(20mL)，用10％柠檬酸水溶液(10mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)和水(10mL)洗涤此溶液，然后用硫酸钠干燥。经过滤除去干燥剂，然后在减压下蒸发溶剂。通过快速色谱纯
1
化所得剩余物，得到17(370mg)，收率52％，为白色固体：mp 154-155℃；HNMR(500MHz，CD2Cl2)δ8.31(s，1H)，7.81(dd，1H，J ＝ 7.5，1.5Hz)，7.76-7.72(m，3H)，7.50(s，1H)，
7.28-7.23(m，4H)，6.73(s，1H)，3.64(td，1H，J ＝ 11.5，4.5Hz)，3.57(s，1H)，3.55(s，3H)，
3.14(dt，1H，J＝11.5，3.5Hz)，2.93(m，1H)，2.88-2.86(m，5H)，2.62-2.57(m，3H)，2.36(s，
3H)，2.17(m，2H)，2.09(s，3H)；MS(ESI+)m/z 611.2(M+H)。
[0463] N-(3-(6-(4-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-7-羟基-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(18)。
[0464]
[0465] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的50-mL单颈圆底烧瓶，然后加入17(250mg，0.409mmol)和甲醇(10mL)。将所得溶液冷却至0℃，然后加入硼氢化钠(31mg，0.819mmol)。
在室温下搅拌反应2h后，在减压下蒸发溶剂。经快速色谱纯化所得剩余物，得到18，收率88％(220mg)，为白色固体：mp 165-166℃；1HNMR(500MHz，CD2Cl2)δ8.38(s，1H)，
7.90(d，1H，J＝7.5Hz)，7.81(d，2H，J＝8.5Hz)，7.71(s，1H)，7.39(s，1H)，7.34-7.27(m，
4H)，6.80(s，1H)，4.94(m，1H)，3.72(td，1H，J ＝ 11.5，4.5Hz)，3.65(s，1H)，3.62(s，3H)，
3.21(m，1H)，3.01(m，1H)，2.95(s，3H)，2.76-2.62(m，3H)，2.43(s，3H)，2.22-2.13(m，5H)，
2.02(m，1H)，1.83(m，2H)；MS(ESI+)m/z 595.2(M+H)。
[0466] 实施例3A和3B
[0467] N-(3-(6-(4-((2R)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(19)。
[0468]
[0469] N-(3-(6-(4-((2S)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(20)。
[0470]
[0471] 外消旋混合物(12)在Chiralcel-AD-H上(60％异丙醇在庚烷中，含有0.1％25
三氟乙酸)经手性分离得到单独的对映体：在4.6分钟得到(20)((-)异构体)([α]D＝-37.8°(c＝3.75，CHCl3)，mp＝181-183℃)，在9.2分钟得到(19)((+)异构体)([α]
25
D ＝+38.8°(c＝3.57，CHCl3)，mp＝180-182℃)。或者，外消旋混合物(12)在Chiralpak AD上(75％异丙醇在庚烷中，1mL/min)经手性分离，收集单独的对映体：从17-27分钟得到(20)((-)异构体)，从27-60分钟得到(19)((+)异构体)。
[0472] 或者，外消旋混合物(4)在Chiralpak AD上(30％异丙醇/庚烷，0.1％三氟乙酸)分离在5.4分钟(S-异构体)和14.9分钟(R-异构体)得到单独的对映体。然后使用实施例1或实施例2中所述的一般合成路线制备单独的异构体19和20。
[0473] 5-溴-3-(4-((S)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-1-甲基吡嗪-2(1H)-酮((S)-14)。
[0474]
[0475] 向装配有磁搅拌器和回流冷凝管的单颈的250mL圆底烧瓶加入(-)-1，4-二甲基-3-(4-氨基苯基)哌嗪-2-酮(8.2g，37.3mmol)、3，5-二溴-1-甲基吡嗪-2(1H)-酮(10.0g，37.3mmol)和i-PrOH(100mL)。然后加入三乙胺(5.72mL，41mmol，1.1eq)，在80℃加热所得悬浮液16hr。第二天，观察到浓稠的浆状物。将反应冷却至室温，然后在真空中浓缩至～20mL的总体积。此时，加入20mL的2M Na2CO3溶液，然后加入100mL水。然后在室温下使混合物成浆2hr。然后在多孔玻璃漏斗上收集灰白色固体，使其风干～1hr。将固体放回反应烧瓶中，加入100mL的乙醚/己烷(1∶1)，然后在室温下使悬浮液粉末化1hr。然后在多孔玻璃漏斗上收集白色固体，真空下在滤器上干燥1hr，然后转移至圆底烧瓶中，并真空干燥过夜。得到白色固体12.88g(85％)。
[0476] 5-溴-3-(4-((R)-1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-1-甲基吡嗪-2(1H)-酮((R)-14)。
[0477]
[0478] 使用相同的方法，从1，4-二甲基-3-(4-氨基苯基)哌嗪-2-酮的(+)-异构体可以制备化合物14的(R)-异构体。
[0479] 实施例4
[0480] 路线4
[0481]
[0482] 4-((1S，2S)-2，3-二羟基-1-异丙基(甲基)氨基)丙基)苯基氨基甲酸叔丁酯(21)。
[0483]
[0484] 向装配有磁搅拌器的50-mL单颈圆底烧瓶加入D-(+)甘油
醛(90％纯度，1.62g，16.2mmol)、乙醇(16mL)、N，N-甲基异丙基胺(1.19g，16.3mmol)和4-(叔丁氧羰基氨基)苯基硼酸(3.85g，16.2mmol)。用特氟隆塞密封烧瓶，然后搅拌反应混合物3d。此后，在减压下蒸发混合物至干。将剩余物溶于10mL的2M硫酸氢钠水溶液(20.0mmol)。用甲基叔丁基醚(2×150mL)萃取所得溶液，然后通过加入碳酸钾(2.76g，20.0mmol)使水层碱化。用乙醚(2×50mL)萃取悬浮液，然后合并有机萃取液，并用硫酸钠干燥。经过滤除去干燥剂后，
1
在减压下蒸发溶液，得到21，收率69％(3.79g)，为白色固体：mp 61-80℃；HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.23(br s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.16(d，2H，J＝8.5Hz)，4.58(t，1H，J＝5.3Hz)，4.22(d，1H，J＝4.7Hz)，3.96(五重峰，1H，J＝5.4Hz)，3.49(d，1H，J＝6.2Hz)，
3.30(m，1H)，3.15(m，1H)，2.83(七重峰，1H，J＝6.5Hz)，2.06(s，3H)，1.47(s，9H)，0.85(d，
3H，J＝6.6Hz)，0.79(d，3H，J＝6.5Hz)；MS(ESI+)m/z 339(M+H)。
[0485] (S)-2-(4-(叔丁氧羰基氨基)苯基)-2-(异丙基(甲基)氨基)乙酸(22)。
[0486]
[0487] 向装配有磁搅拌器的100-mL单颈圆底烧瓶加入21(1.01g，3.00mmol)、乙腈(6mL)、四氯化碳(6mL)、水(9mL)和氯化钌(III)一水合物(39mg，0.17mmol)；然后搅拌所得混合物10min。使反应冷却至-9℃，然后加入高碘酸钠(2.56g，12.0mmol)。在1.5h内将混合物缓慢地温热至0℃，然后在0℃搅拌1h，过滤。用
冰冷的水(2×5mL)洗涤滤饼，然后用额外的水(20mL)稀释滤液。分出水层，将其酸度调至pH 5.8，然后将其蒸发至干。用水(10mL)使剩余物成粉末，然后过滤所得悬浮液。用水(2×1mL)和甲基叔丁基醚(2×5mL)1
洗涤滤饼，然后在减压下干燥过夜，得到22(121mg)，收率13％，为白色固体：HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.40(s，1H)，7.41(d，2H，J ＝ 8.8Hz)，7.36(d，2H，J ＝ 8.8Hz)，4.19(s，1H)，
3.27(七重峰，1H，J＝6.6Hz)，2.21(s，3H)，1.47(s，9H)，1.13(d，3H，J＝6.6Hz)，1.09(d，
3H，J＝6.6Hz)；MS(ESI+)m/z 323(M+H)。
[0488] (S)-2-(4-氨基苯基)-2-(异丙基(甲基)氨基)-N，N-二甲基乙酰胺(23)。
[0489]
[0490] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的25-mL单颈圆底烧瓶，然后加入22(116mg，0.36mmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(50mg，0.37mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(208mg，1.08mmol)和DMF(2mL)，然后使混合物冷却至0℃。加入2M的二甲基胺在THF(0.3mL，0.6mmol)中的溶液，然后将反应缓慢地温热至室温过夜。加入碳酸钾(2.00g)在水(10mL)中的溶液，然后用己烷(3×30mL)萃取混合物。合并己烷萃取液，用硫酸钠干燥，过滤，然后蒸发至干。使所得粗产物与二氯甲烷(1mL)和4M氯化氢在二氧六环(10mL)中的溶液混合。在室温下充分搅拌所得乳状液1h。此后，在减压下蒸发溶剂，用水(2mL)之后用碳酸钾(1.0g)处理所得剩余物，然后用MtBE(10mL)萃取。蒸发萃取液，然后
1
在硅胶上经快速色谱纯化剩余物，得到23，收率58％(53mg)，为浅黄色油：HNMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)δ7.20(d，2H，J＝8.5Hz)，6.69(d，2H，J＝8.5Hz)，4.56(s，1H)，3.02(s，3H)，
2.97(m，1H)，2.91(s，3H)，2.11(s，3H)，1.03(d，3H，J＝6.7Hz)，1.00(d，3H，J＝6.6Hz)。
[0491] (S)-(+)-N-(3-(6-(4-(2-(二甲基氨基)-1-(异丙基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(24)。
[0492]
[0493] 向装配有磁搅拌器、氮气进口和回流冷凝管的15-mL三颈圆底烧瓶加入23(53mg，0.212mmol)、11(98mg，0.212mmol)、碳酸铯(152mg，0.468mmol)和1，4-二氧六环(3mL)。
向所得溶液通入氮气30分钟后，加入Xantphos(10.4mg，0.018mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(9.70mg，0.010mmol)，然后将反应混合物加热回流3h。此后，将反应冷却至室温，过滤，然后用二氯甲烷(2×25mL)洗涤滤饼。然后在减压下浓缩滤液，经柱色谱纯
1
化剩余物，得到24(68mg，52％)，为黄色固体：mp 133-134℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6)
9.79(br s，1H)，9.19(br s，1H)，7.93(d，2H，J＝8.5Hz)，7.68(s，1H)，7.30(m，5H)，7.20(s，
1H)，4.56(s，1H)，3.55(s，3H)，3.01(s，3H)，2.84(m，1H)，2.76(m，5H)，2.63(t，2H，J ＝
5.5Hz)，2.28(s，3H)，2.02(s，3H)，1.79(m，4H)，0.91(m，6H)；MS(ESI+)m/z 627.5(M+H)；
D
[α]25+24.0°(c0.25，氯仿)。
[0494] 实施例5
[0495] 路线5
[0496]
[0497]
[0498] 2-[4-(叔丁氧羰基氨基)苯基]-2-[异丙基(甲基)氨基]乙酸(25)。
[0499]
[0500] 向装配有磁搅拌器的50-mL单颈圆底烧瓶加入
乙醛酸(618mg，6.72mmol)、甲苯(20mL)、N，N-异丙基甲基胺(486mg，6.60mmol)和4-(叔丁氧羰基氨基)苯基硼酸(1.58g，6.66mmol)。在氮气压下用塑料盖密封反应，然后在室温下搅拌7d。此后，在减压下浓缩反应。所得剩余物经快速色谱，得到25，收率62％(1.34g)，为浅棕色固体：mp 320℃分解，
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.42(s，1H)，7.42(d，2H，J＝8.7Hz)，7.37(d，2H，J＝ 8.7Hz)，
4.23(s，1H)，3.28(m，1H)，3.17(s，1H)，2.23(s，3H)，1.47(s，9H)，1.15(d，3H，J ＝ 6.6Hz)，
1.11(d，3H，J＝6.6Hz)；MS(ESI+)m/z 323(M+H)。
[0501] 2-[4-(叔丁氧羰基氨基)苯基]-2-[异丙基(甲基)氨基]乙酸乙酯(26)。
[0502]
[0503] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的250-mL单颈圆底烧瓶，然后加入25(1.50g，4.66mmol)、THF(45mL)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(1.27g，9.32mmol)和1-乙基-3-[3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(1.79g，9.32mmol)，然后搅拌反应混合物15min。加入乙醇(429mg，9.32mmol)和4-二甲基氨基吡啶(57mg，0.47mmol)，然后在室温下再搅拌反应混合物16h。此后，在水(40mL)和二氯甲烷(50mL)之间分配此反应物。分离各层，然后用二氯甲烷(2×30mL)萃取水相。合并有机萃取液，然后用硫酸钠干燥。经过滤除去干燥剂，然后在减压下蒸发溶剂。在真空下干燥所得剩余物至恒重，得到26，收率73％(1.20g)，
1
为白色固体：mp 87-88℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.35(s，1H)，7.40(d，2H，J＝7.5Hz)，
7.28(d，2H，J＝7.5Hz)，4.16(s，1H)，4.05(m，2H)，2.80(七重峰，1H，J＝6.5Hz)，2.02(s，
3H)，1.47(s，9H)，1.11(t，3H，J＝7.0Hz)，0.94(d，3H，J＝6.5Hz)，0.88(d，3H，J＝6.5Hz)；
MS(ESI+)m/z 351(M+H)。
[0504] 2-(4-氨基苯基)-2-[异丙基(甲基)氨基]乙酸乙酯(27)。
[0505]
[0506] 向装配有磁搅拌器的100-mL单颈圆底烧瓶加入26(1.19g，3.40mmol)和4M氯化氢在1，4-二氧六环中的溶液(15.0mL，60mmol)，然后在室温下搅拌混合物4h。此后，在减压下浓缩反应混合物，然后所得剩余物在10％碳酸钾水溶液(100mL)和二氯甲烷(75mL)之间分配。分离各层，然后用二氯甲烷(2×75mL)萃取水相。用硫酸钠干燥合并的有机萃取液，过滤，然后在减压下浓缩，得到27，收率81％(878mg)，为橙色固体：mp 70-71℃；1
HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ7.02(d，2H，J＝7.5Hz)，6.49(d，2H，J＝7.5Hz)，5.07(bs，2H)，
4.07-3.97(m，3H)，2.81(七重峰，1H，J＝6.5Hz)，1.99(s，3H)，1.11(t，3H，J＝7.0Hz)，
0.92(d，3H，J＝6.5Hz)，0.85(d，3H，J＝6.5Hz)；MS(ESI+)m/z 251(M+H)。
[0507] 2-(4-{6-[3-(4-叔丁基苯甲酰氨基)-2-甲基苯基]-4-甲基-3-氧代-3，4-二氢吡嗪-2-基氨基}苯基)-2-[异丙基(甲基)氨基]乙酸乙酯(28)。
[0508]
[0509] 向装配有磁搅拌器、氮气进口和回流冷凝管的50-mL单颈圆底烧瓶加入27(435mg，1.74mmol)、4-叔丁基-N-{2-甲基-3-(4，4，5，5，-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)苯基)苯甲酰胺(717mg，1.58mmol)、碳酸铯(1.13g，3.48mmol)和1，4-二氧六环(15mL)。向所得溶液通入氮气20分钟后，加入Xantphos(78mg，0.134mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(72mg，0.079mmol)，然后将反应混合物加入回流16h。此后，使反应冷却至室温，过滤，然后在减压下浓缩。经快速色谱纯化所得剩余物，得到28，收率43％
1
(430mg)，为黄色固体：mp 119-120℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.88(s，1H)，9.24(s，1H)，
7.97(d，2H，J＝8.5Hz)，7.95(d，2H，J＝8.5Hz)，7.55(d，2H，J＝8.5Hz)，7.37(dd，1H，J＝
6.5，3.5Hz)，7.31(d，2H，J ＝ 8.5Hz)，7.28(m，2H)，7.22(s，1H)，4.18(s，1H)，4.04(m，2H)，
3.56(s，3H)，2.81(七重峰，1H，J＝6.5Hz)，2.29(s，3H)，2.02(s，3H)，1.33(s，9H)，1.11(t，
3H，J＝7.0Hz)，0.94(d，3H，J＝6.5Hz)，0.88(d，3H，J＝6.5Hz)；MS(ESI+)m/z 624(M+H)。
[0510] 2-(4-{6-[3-(4-叔丁基苯甲酰氨基)-2-甲基苯基]-4-甲基-3-氧代-3，4-二氢吡嗪-2-基氨基}苯基)-2-[异丙基(甲基)氨基]乙酸(29)。
[0511]
[0512] 向装配有磁搅拌器和回流冷凝管的100-mL单颈圆底烧瓶加入28(400mg，0.642mmol)、THF(5mL)和乙醇(5mL)。加入氢氧化锂(124mg，10.2mmol)在水(5mL)中的溶液，然后在60℃加热混合物48h。此后，使反应冷却至室温，然后用10％柠檬酸水溶液缓慢地将混合物
酸化至pH 4.0。过滤所得沉淀，用水(20mL)洗涤滤饼，然后用二氯甲烷/乙酸乙酯的1∶10混合物(20mL)使其成粉末。在45℃，在真空下将所得剩余物干燥至恒重，得
1
到29，收率55％(210mg)，为灰白色固体：mp 197-198℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.91(s，
1H)，9.29(s，1H)，7.99(d，2H，J＝8.5Hz)，7.95(d，2H，J＝8.5Hz)，7.55(d，2H，J＝8.5Hz)，
7.39(d，2H，J ＝ 8.5Hz)，7.35(dd，1H，J ＝ 7.0，1.5Hz)，7.32-7.28(m，2H)，7.24(s，1H)，
4.23(s，1H)，3.56(s，3H)，3.30(m，1H)，2.30(s，3H)，2.23(s，3H)，1.33(s，9H)，1.13(d，3H，J＝6.5Hz)，1.10(d，3H，J＝6.5Hz)；MS(ESI+)m/z 596(M+H)。
[0513] 4-叔丁基-N-(3-(6-(4-(1-(异丙基(甲基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺(30)。
[0514]
[0515] 向装配有磁搅拌器的密封管加入29(100mg，0.168mmol)、1-甲基哌嗪(14.6mg，0.168mmol)、DMF(3mL)、Hunig碱(65.1mg，0.503mmol)和BOP(74.3mg，0.168mmol)。在室温下搅拌反应混合物26hr。通过
旋转蒸发除去大部分溶剂，然后将所得剩余物溶于乙酸乙酯(100mL)。用水(15mL X 3)洗涤溶液，用MgSO4干燥，过滤，然后在真空中除去溶剂。经硅胶柱色谱法(MeOH∶CH2Cl2＝5∶95)得到为浅黄色固体的30，25mg(22％)。1HNMR(300MHz，CDCl3) 8.45(s，1H)，8.09(s，1H)，7.95(s，1H)，7.92(s，1H)，7.85(m，2H)，7.75(m，1H)，
7.54(s，1H)，7.51(s，1H)，7.40(m，2H)，7.19-7.23(m，2H)，，6.79(s，1H)，5.19(s，1H)，
3.62(s，3H)，3.40(宽 s，2H)，3.21(宽 s，2H)，2.26-2.50(m，9H)，2.18(s，3H)，1.92(宽 s，
2H)，1.34(s，9H)，1.25-1.31(m，6H)ppm；MS(ESI+)m/z 678.19(M+H)。
[0516] 实施例6
[0517] 3-(4-硝基苯基)-5，6-二氢吡嗪-2(1H)-酮(31)。
[0518]
[0519] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的50-mL单颈圆底烧瓶，加入4-硝基苯基丙
酮酸乙酯(223mg，1.00mmol)、3颗分子筛(4-8目，3A)和无水甲醇(10mL)。用冰浴将所得溶液冷却至0℃，然后滴加入1，2-乙二胺(63mg，1.05mmol)。滴加完成后，在室温下搅拌反应1h。此后，过滤所得悬浮液，然后用冷甲醇(2×5mL)洗涤滤饼。在真空下，在烘箱中，在50℃干燥滤
1
饼过夜，得到31，收率89％(196mg)，为白色固体：mp 191-192℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6)
8.63(bs，1H)，8.26(d，2H，J＝8.0Hz)，8.09(d，2H，J＝8.0Hz)，3.88(t，2H，J＝6.5Hz)，
3.37(m，2H)；MS(ESI+)m/z 220(M+H)。
[0520] 4-乙基-3-(4-硝基苯基)哌嗪-2-酮(32)。
[0521]
[0522] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的10-mL单颈圆底烧瓶，加入31(2.78g，12.7mmol)、乙醛(727mg，16.5mmol)和无水甲醇(40mL)。加入氰基硼氢化钠(2.4g，38mmol)和无水氯化锌(2.6g，19.1mmol)在无水甲醇(40mL)中的溶液，然后在室温下搅拌反应1h。此后，加入1N氢氧化钠水溶液(25mL)，然后在减压下蒸发甲醇。用乙酸乙酯(3×100mL)萃取剩下的水溶液。合并有机层，用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥。经过滤除去干燥
1
剂，然后在减压下浓缩滤液，得到32，收率98％(3.20g)，为黄色油：HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.18(d，2H，J＝8.5Hz)，8.02(d，1H，J＝4.0Hz)，7.66(d，2H，J＝8.5Hz)，4.06(s，1H)，
3.39(td，1H，J＝12.0，4.0Hz)，3.22(m，1H)，3.07(dt，1H，J＝12.0，3.0Hz)，2.50(m，1H)，
2.37(m，1H)，2.21(m，1H)，0.91(t，3H，J＝8.5Hz)；MS(ESI+)m/z 250(M+H)。
[0523] 3-(4-氨基苯基)-4-乙基哌嗪-2-酮(33)。
[0524]
[0525] 用氮气吹扫装配有回流冷凝管和磁搅拌器的25-mL单颈圆底烧瓶，然后加入32(210mg，0.89mmol)、乙醇(6mL)、铁粉(-325目，491mg，8.93mmol)和2N盐酸(0.70mL，
1.40mmol)，然后将混合物加热回流30min。此后，使反应冷却至室温，然后加入粉末状的碳酸钾(3.03g，22.0mmol)。过滤所得悬浮液，然后用乙醇(4×10mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到33，收率100％(185mg)，为白色固体：mp 153-154℃；1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.74(d，1H，J＝2.7Hz)，6.90(d，2H，J＝8.4Hz)，6.47(d，2H，J＝8.4Hz)，4.95(bs，2H)，
3.45(m，1H)，3.42(s，1H)，3.14(m，1H)，2.89(m，1H)，2.44(m，1H)，2.02(s，3H)；MS(ESI+)m/z
206(M+H)。
[0526] 5-溴-3-(4-(1-乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基]-1-甲基吡嗪-2(1H)-酮(34)。
[0527]
[0528] 向装配有磁搅拌器和回流冷凝管的100-mL单颈圆底烧瓶加入33(450mg，2.05mmol)、异丙醇(5mL)、13(603mg，2.26mmol)和DL-10-樟脑磺酸(813mg，3.50mmol)，然后在回流下搅拌反应混合物16h。此后，使反应混合物冷却至室温，过滤，然后用异丙醇(10mL)洗涤滤饼。将所得固体溶于二氯甲烷/甲醇(3∶1)，然后吸附在硅胶上，经快速色
1
谱纯化，得到34，收率79％(654mg)，为橙色固体：mp 152-153℃；HNMR(500MHz，CDCl3)
8.28(bs，1H7.73(d，2H，J ＝ 8.5Hz)，7.43(d，2H，J ＝ 8.5Hz)，6.74(s，1H)，5.90(d，1H，J＝ 3.5Hz)，4.12(s，1H)，3.60(m，1H)，3.52(s，3H)，3.36(m，1H)，3.12(m，1H)，2.60(m，2H)，
2.28(m，1H)，1.00(t，3H，J＝7.0Hz)；MS(ESI+)m/z 406.0(M+H)。
[0529] N-(3-(6-(4-(1-乙基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-6-氟-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(35)。
[0530]
[0531] 向装配有磁搅拌器、回流冷凝管和氮气进口的100-mL单颈圆底烧瓶加入1，4-二氧六环(13mL)、水(3mL)和碳酸钠(417mg，3.93mmol)。向所得混合物通入氮气15min后，加入34(150mg，0.370mmol)、N-(6-氟-2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(192mg，0.460mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(75mg，0.065mmol)，然后将反应混合物加热回流5h。此后，使反应混合物冷却至室温，过滤，然后用乙醚(10mL)洗涤滤饼。将所得固体溶于二氯甲烷/甲醇(10∶1)，然后吸附在硅胶上，经快速色谱纯化，得到35，收率41％(93mg)，为黄色固体：mp 179-180℃；1
HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.31(bs，1H)，7.79(d，2H，J ＝ 8.5Hz)，7.39(m，3H)，7.33(m，1H)，
7.22(s，1H)，7.04(t，1H，J ＝ 8.0Hz)，6.68(s，1H)，5.80(d，1H，J ＝ 3.5Hz)，3.99(s，1H)，
3.65(s，3H)，3.64(m，1H)，3.36(m，1H)，3.11(m，1H)，2.82(t，2H，J ＝ 6.0Hz)，2.66(t，2H，J＝ 6.0Hz)，2.59(m，2H)，2.36(s，3H)，2.27(m，1H)，1.85(m，4H)，0.99(t，3H，J＝ 7.0Hz)；
MS(ESI+)m/z 615.3(M+H)。
[0532] 实施例7
[0533] 路线7
[0534]
[0535] 四氟硼酸2，6-二溴吡啶-3-重氮盐(36)。
[0536]
[0537] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器、氮气进口和加料漏斗的500-mL三颈圆底烧瓶，然后加入2，6-二溴-3-氨基吡啶(25.0g，99.2mmol)和1，2-二甲氧基乙烷(70mL)，用冰/丙酮浴将溶液冷却至-10℃。按保持内部反应温度低于-5℃的速度，加入三氟化硼-乙醚配合物(21.1g，148mmol)在70mL的1，2-二甲氧基乙烷中的溶液。添加完成后，滴加入亚硝酸叔丁酯(12.2g，118mmol)在70mL的1，2-二甲氧基乙烷中的溶液，并且保持内部反应温度低于-5℃。在-10℃，再搅拌反应1h。此后，过滤反应，然后用己烷(3×75mL)洗涤滤饼，随后1
在室温下风干24h，得到36，收率98％(34.1g)，为白色固体：mp 130-131℃；HNMR(300MHz，DMSO-d6) 7.72(d，1H，J＝9.6Hz)，5.66(d，1H，J＝9.6Hz)。
[0538] 2，6-二溴-3-氟吡啶(37)。
[0539]
[0540] 向装配有开放至大气的冷凝管的1-L单颈圆底烧瓶加入36(4.00g，11.4mmol)，其均匀分布于烧瓶底部，然后将烧瓶置于室温下的油浴中。在20min内将油浴加热至80℃，然后在30min内使油浴温度逐渐地升至130℃，直至在130℃的油浴温度发生分解。当全部的粉末已明显地分解时(固体转变成粘性物并且停止释放气体)，将反应冷却至室温，然后用乙醚(3×75mL)萃取所得剩余物，倾析醚萃取液。合并有机萃取液，用包含碳酸氢钠水溶液洗涤(200mL)，然后用硫酸钠干燥。经过滤除去干燥剂，然后在室温下在减压下浓缩滤液，得1
到37，收率100％(3.00g)，为黄色固体：mp 47-48℃；HNMR(300MHz，CDCl3) 7.44(dd，1H，J＝3.3，8.4Hz)，7.31(m，1H)。
[0541] N-(6-溴-3-氟吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(38)。
[0542]
[0543] 向装配有机械搅拌器、回流冷凝管和氮气进口的1-L三颈圆底烧瓶加入1，4-二氧六环(56mL)、37(3.00g，11.7mmol)、4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(1.29g，7.12mmol)和碳酸铯(5.09g，15.6mmol)。向所得溶液通入氮气30min后，加入Xantphos(350mg，0.605mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(326mg，0.365mmol)，然后将反应混合物加热回流2h。此后，将反应冷却至室温，然后通过Celite 521垫过滤。用二氯甲烷(50mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，然后使用500cc的二氧化硅并用5％EtOAc/己烷洗脱，通过柱色谱纯化所得剩余物，得到38(940mg)，收率37％，为白色固体：Rf＝
0.55(20％乙酸乙酯在己烷中)；1HNMR(500MHz，CDCl3) 7.80(bs，1H)，7.38(m，1H)，7.37(s，
1H)，7.32(dd，1H，J ＝ 3.0，8.0Hz)，2.81(t，2H，J ＝ 6.5Hz)，2.64(t，2H，J ＝ 6.0Hz)，
1.85(m，4H)；MS(ESI+)m/z 355.1(M+H)，并且得到N-(6-溴-5-氟吡啶-2-基)-4，5，6，
7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺，收率34％，为白色固体：Rf＝0.85(20％乙酸乙酯在己
1
烷中)；HNMR(500MHz，CDCl3) 8.29(dd，1H，J＝3.5，9.0Hz)，8.24(bs，1H)，7.47(dd，1H，m)，7.33(s，1H)，2.81(t，2H，J＝6.5Hz)，2.64(t，2H，J＝6.0Hz)，1.85(m，4H)；MS(ESI+)m/z 355.1(M+H)。
[0544] 3-(4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-1-甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)吡嗪-2(1H)-酮(39)。
[0545]
[0546] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器和调温器的25mL单颈圆底烧瓶，然后加入5-溴-3-(4-(4-乙基-1-甲基-3-氧 代哌嗪-2-基)苯 基氨基)-1-甲基 吡
嗪-2(1H)-酮 (225mg，0.536mmol)、双 (4，4，5，5-四 甲 基 戊 酰) 二 硼 (bis(4，4，5，
5-tetramethylpinacolato)diboron)(170mg，0.671mmol)、乙酸钾(210mg，2.06mmol)和1，
4-二氧六环(10mL)。向所得悬浮液通入氮气流30min。然后加入Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(15mg，
0.016mmol)，并在回流下搅拌反应3h。此后，使混合物冷却至环境温度，在水(40mL)和乙酸乙酯(60mL)之间分配，然后通过Celite 521塞过滤。分出有机相，用硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下浓缩。用乙醚(5mL)使剩余物成粉末，然后过滤悬浮液。在室温下在真空下干燥滤饼，得到粗品39，将其直接用于下步反应：MS(ESI+)m/z 468.2(M+H)。
[0547] N-(6-(6-(4-(4-乙基-1-甲基-3-氧代哌嗪-2-基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(40)。
[0548]
[0549] 向装配有磁搅拌器、回流冷凝管和氮气进口的25-mL三颈圆底烧瓶加入1，4-二氧六环(7mL)、碳酸钠(163mg，2.08mmol)在水(1mL)中的溶液、38(183mg，0.515mmol)和39(0.537mmol，假定定量收率)。向所得混合物通入氮气30min后，加入四(三苯基膦)钯(0)(60mg，0.052mmol)，然后将反应混合物加热回流4h。此后，使反应混合物冷却至室温，然后加入2N盐酸(20mL)，随后加入二氯甲烷(20mL)。分出水层，用二氯甲烷(2×25mL)洗涤，然后用饱和碳酸钾水溶液碱化至pH 9。然后用二氯甲烷(3×25mL)萃取水层，合并有机萃取液，然后用硫酸钠干燥。经真空过滤除去干燥剂，然后在减压下浓缩滤液，得到
1
40，收率30％(83mg)，为黄色固体：mp155-156℃；HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.27(bs，1H)，
7.95(dd，1H，J＝3.5，8.5Hz)，7.84(m，3H)，7.72(s，1H)，7.55(t，1H，J＝9.0Hz)，7.46(m，
3H)，4.01(s，1H)，3.72(m，2H)，3.64(s，3H)，3.49(m，1H)，3.40(m，1H)，3.38(m，1H)，3.24(m，
1H)，2.83(t，2H，J＝6.0Hz)，2.67(m，3H)，1.86(m，4H)，1.16(t，3H，J＝7.5Hz)；MS(ESI+)m/z 616.3(M+H)。
[0550] 实施例8
[0551] 路线8
[0552]
[0553]
[0554] 5-溴-1-甲基-3-硝基吡啶-2-酮(41)。
[0555]
[0556] 用氮气吹扫装配有磁搅拌器的1-L圆底烧瓶，然后加入5-溴-3-硝基-2-羟基吡啶(24.0g，0.11mol)、无水DMF(280mL)和粉末状的碳酸钾(-350目，33.4g，0.24mol)，然后在环境温度下搅拌悬浮液15min。此后，加入碘甲烷(17.1g，0.124mol)，然后在室温下搅拌混合物18h。然后用水(750mL)稀释反应混合物并用乙酸乙酯(3×1.0L)萃取。合并有机萃取液，用盐水(500mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥。经过滤除去干燥剂后，在减压下蒸发滤液至干。在硅胶上经快速色谱纯化所得剩余物，得到41，收率85％(21.7g)，为黄色固体：1
mp 122-123℃；HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.37(d，1H，J＝2.7Hz)，7.26(s，1H)，3.68(s，3H)；
MS(ESI+)m/z 234(M+H)。
[0557] 3-氨基-5-溴-1-甲基吡啶-2-酮(42)。
[0558]
[0559] 用氮气吹扫装配有机械搅拌器和回流冷凝管的1-L三颈圆底烧瓶，然后加入41(21.7g，93.3mmol)、乙醇(305mL)、铁粉(-325目，52.1g，933mmol)和2N盐酸(50mL，
100mmol)，在60℃加热混合物2h。此后，将反应冷却至室温，然后加入碳酸钾至pH 8(经pH纸测定)。过滤所得悬浮液，然后用乙醇(4×100mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到棕色固体。在硅胶上经柱色谱纯化此固体，得到42，收率77％(14.5g)，为灰白色粉末：
1
mp104-105℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ7.15(d，1H，J＝2.5Hz)，6.46(d，1H，J＝2.5Hz)，
5.45(bs，2H)，3.40(s，3H)；MS(ESI+)m/z 203(M+H)。
[0560] N-(3-(5-氨基-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4，5，6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(43)。
[0561]
[0562] 使用与制备10所述相同的一般方法，42(3.67g)产生43，收率28％(2.10g)，为1
黄色固体：mp 210-211℃；HNMR(500MHz，DMSO-d6) 9.78(bs，1H)，7.65(s，1H)，7.25(dd，
1H，J＝1.5，8.0Hz)，7.21(t，1H，J＝7.5Hz)，7.09(dd，1H，J＝1.0，7.0Hz)，6.89(d，1H，J＝2.0Hz)，6.43(d，1H，J＝2.5Hz)，5.19(bs，2H)，3.49(s，3H)，2.75(m，2H)，2.62(m，2H)，
2.12(s，3H)，1.77(m，4H)；MS(ESI+)m/z 394(M+H)。
[0563] N-[3-(5-{[5-(1，4-二甲基-3-氧代哌嗪-2-基)吡啶-2-基]氨基}-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-2-甲酰胺(44)。
[0564]
[0565] 向装配有磁搅拌棒的48-mL密封管，加入在二氧六环(10mL)中的43(0.20g，0.5mmol)、3-(6- 氯 吡 啶 -3- 基 )-1，4- 二 甲 基 哌 嗪 -2- 酮 (0.185g，0.8mmol)、Pd2(dba)3(0.032g，0.035mmol)、9，9-二甲基-4，5-双(二苯基膦基)呫吨(0.030g，
0.05mmol)和Cs2CO3(0.326g，1.0mmol)。将混合物脱气15min后，在95℃加热16h。然后，将反应混合物冷却至室温，然后倾入H2O(10mL)中。向此加入二氯甲烷(10mL)，然后分离各层。用二氯甲烷(3x10mL)萃取水相，然后用H2O(5mL)和盐水(5mL)洗涤合并的有机萃取液，干燥(Na2SO4)，然后浓缩。经柱色谱(梯度：0-10％MeOH在二氯甲烷/乙醚(1/1)中)纯化粗品混合物，得到0.10g(34％)为固体的44；MS(ESI+)m/z 596(M+H)。
[0566] 实施例9
[0567] 路线9
[0568]
[0569] 2-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-(4-(4-甲基-6-(2-甲基-3-(5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰氨基)苯基)-3-氧代-3，4-二氢吡嗪-2-基氨基)苯基)乙酸乙酯(45)。
[0570]
[0571] 使用与制备10所述相同的方法，2-(4-(6-溴-4-甲基-3-氧代-3，4-二氢吡嗪-2-基氨基)苯基)-2-(4-乙基哌嗪-1-基)乙酸乙酯(1.33g)与N-(2-甲基-3-(4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧戊环-2-基)苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻
吩-2-甲酰胺(1.26g)的反应产生45，收率73％(1.39g)，为褐色泡沫：mp168-170℃；
1
HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H)，7.92(d，1H，J ＝ 7.8Hz)，7.80(d，2H，J ＝ 8.7Hz)，
7.54(s，1H)，7.39(d，2H，J＝8.7Hz)，7.39(s，1H)，7.27(t，1H，J＝8.1Hz)，7.18(dd，1H，J＝
7.8，1.2Hz)，6.74(s，1H)，4.14(m，2H)，3.91(s，1H)，3.60(s，3H)，2.87(t，2H，J ＝ 5.7Hz)，
2.76(t，2H，J＝5.7Hz)，2.61(br s，8H)，2.32(s，3H)，1.88(m，2H)，1.77(m，4H)，1.17(t，3H，J＝7.2Hz)，1.05(t，3H，J＝7.2Hz)；MS(ESI+)m/z 683(M+H)。
[0572] 2-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-(4-(4-甲基-6-(2-甲基-3-(5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰氨基)苯基)-3-氧代-3，4-二氢吡嗪-2-基氨基)苯基)乙酸(46)。
[0573]
[0574] 使用与制备29所述相同的方法，
皂化45(1.29g)产生46，收率97％(1.20g)，为灰1
白色固体：mp 168-170℃；HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.79(s，1H)，9.25(s，1H)，7.96(d，2H，J＝ 7.5Hz)，7.70(s，1H)，7.29(m，6H)，3.86(m，1H)，3.71(s，3H)，3.37(q，2H，J＝ 7.2Hz)，
2.81(m，2H)，2.69(m，2H)，2.42(brs，8H)，2.19(s，3H)，1.83(br s，2H)，1.61(br s，4H)，
0.95(t，3H，J＝7.2Hz)；MS(ESI+)m/z 655(M+H)。
[0575] N-(3-(6-(4-(1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)-2-氧代乙基)苯基氨基)-4-甲基-5-氧代-4，5-二氢吡嗪-2-基)-2-甲基苯基)-5，6，7，8-四氢-4H-环庚并[b]噻吩-2-甲酰胺(47)。
[0576]
[0577] 使用与制备30所述相同的方法，46(307mg)与2-(甲基氨基)乙醇(71mg)的反1
应产生47，收率37％(125mg)，为白色固体：mp 163-165℃；HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.33(s，
1H)，7.90(d，1H，J ＝ 8.0Hz)，7.80(d，2H，J ＝ 9.0Hz)，7.62(s，1H)，7.48(m，1H)，7.41(s，
1H)，7.35(d，2H，J＝8.5Hz)，7.27(t，1H，J＝8.0Hz)，7.17(d，1H，J＝7.5Hz)，6.74(s，1H)，
4.15(s，1H)，3.72(m，2H)，3.62(m，1H)，3.61(s，3H)，3.50(m，2H)，3.02(s，3H)，2.87(t，2H，J＝5.5
[0578] Hz)，2.75(t，2H，J＝5.5Hz)，2.56(m，8H)，2.40(s，3H)，1.88(m，2H)，1.74(m，2H)，1.65(m，2H)，1.09(t，3H，J＝7.0Hz)；MS(ESI+)m/z712(M+H)。
[0579] 实施例10
[0580] 使用与实施例1-9中所述的那些方法相似的方法制备了以下化合物。
[0581]
[0582]
[0583]
[0584]
[0585]
[0586]
[0587]
[0588]
[0589]
[0590]
[0591]
[0592]
[0593]
[0594]
[0595]
[0596]
[0597]
[0598]
[0599]
[0600]
[0601]
[0602]
[0603]
[0604]
[0605]
[0606]
[0607]
[0608]
[0609]
[0610]
[0611]
[0612]
[0613]
[0614]
[0615]
[0616]
[0617]
[0618] 实施例11
[0619] Btk生物化学测定
[0620] 可用于测试本申请中公开的化合物的一种Btk激酶生物化学测定的一般方法如下。
[0621] 制备无Btk酶的含有1X Cell Signaling激酶缓冲液(25mM pH 7.5的Tris-HCl、5mM β-磷酸甘油、2mM二硫苏糖醇、0.1mM Na3VO4、10mMMgCl2)、0.5μM Promega PTK Biotinylated肽底物2和0.01％BSA的预混试剂(master mix)。制备加Btk酶的含有1X Cell Signaling激酶缓冲液、0.5μMPTK Biotinylated肽底物2、0.01％BSA和100ng/孔(0.06mU/孔)Btk酶的预混试剂。Btk酶的制备如下：使具有C-末端V5和6x His标记的全长人野生型Btk(登记号NM-000061)亚克隆到pFastBac载体中，用于制备携带该表位标记的Btk的杆状病毒。根据Invitrogen在其出版的实验方案″Bac-toBac Baculovirus Expression Systems″(Cat.Nos.10359-016和10608-016)中详述的使用说明制备杆状病毒。传代3病毒用于感染Sf9细胞以过量表达重组Btk蛋白。然后使用Ni-NTA柱将Btk蛋白纯化至同质。根据敏感的Sypro-Ruby
染色法，最终蛋白制备品的纯度大于95％。在水中制备200μM ATP溶液并且用1N NaOH调节至pH 7.4。将量为1.25μL的化合物的5％DMSO溶液转移至96孔半区Costar聚苯乙烯板。逐一地并用11点剂量反应曲线(起始浓度是10μM；1∶2稀释度)来测试化合物。将量为18.75μL的无酶预混试剂(作为阴性对照)和加酶预混试剂转移至96孔半区costar聚苯乙烯板中的合适孔。将5μL 200μM ATP加入96孔半区Costar聚苯乙烯板中的混合物中，使最终ATP浓度是40μM。使反应物在室温培养1小时。用含有30mM EDTA、20nM SA-APC和1nM PT66Ab的Perkin Elmer 1X检测缓冲液使反应停止。用使用激发滤光片330nm、发射滤光片665nm和第二发射滤光片
615nm的Perkin Elmer Envision，使用时间分辨荧光读板。然后计算IC50值。或者，可以使用Lanthascreen测定，通过定量其磷酸化的肽产物来评价Btk活性。在肽产物上的荧光素和在检测抗体上的铽之间发生的FRET，随着添加降低肽的磷酸化的Btk抑制剂而下降。在25uL的最终反应体积中，使Btk(h)(0.1ng/25ul反应)与50mMHepes pH 7.5、10mM MgCl2、2mM MnCl2、2mM DTT、0.2mM NaVO4、0.01％BSA和0.4uM荧光素poly-GAT一起温育。
通过添加ATP至25uM(ATP的Km)引发反应。在室温下温育60分钟后，通过在室温下添加在
60mM EDTA中终浓度2nM Tb-PY20的检测抗体，持续30分钟，来终止反应。在Perkin Elmer Envision上，使用在340nm激发以及在495nm和520nm发射进行检测。
[0622] 实施例12
[0623] Ramos细胞Btk测定
[0624] 可用于测试本申请中公开的化合物的标准细胞Btk激酶测定的另一种一般方法如下。
[0625] 以0.5×107细胞/ml的
密度在供试化合物存在下在37℃培养Ramos细胞1hr。然后通过用10μg/ml抗人IgM F(ab)2在37℃培养5分钟来刺激细胞。使细胞成丸粒(pelleted)、裂解，并且对澄清裂解液进行蛋白测定。使等蛋白量的各样品进行SDS-PAGE并 且 用 抗 磷 酸Btk(Tyr223)抗 体(CellSignaling Technology #3531；Epitomics，cat.#2207-1)或phosphoBtk(Tyr551)抗体(BD Transduction Labs#558034)进行蛋白质印迹以评估Btk自磷酸化或用抗Btk抗体(BD Transduction Labs #611116)进行蛋白质印迹以控制各裂解液中Btk的总量。
[0626] 实施例13
[0627] B细胞增殖测定
[0628] 可用于测试本申请中公开的化合物的标准细胞B细胞增殖测定的一般方法如下。
[0629] 使用B细胞分离
试剂盒(Miltenyi Biotech，Cat #130-090-862)从8-16周龄5
Balb/c小鼠的脾纯化B细胞。将供试化合物稀释在0.25％DMSO中，与2.5×10 纯化的小鼠脾B细胞培养30分钟，然后加入10μg/ml抗小鼠IgM抗体(Southern Biotechnology
3
Associates Cat#1022-01)，最终体积是100μl。培养24hr后，加入1μCiH-胸苷，将板培
3
养另外36hr，然后使用生产商的关于SPA[H]胸苷吸收测定系统(Amersham Biosciences #RPNQ 0130)的实验方案收集。在microbeta计数器(Wallace Triplex 1450，Perkin Elmer)中计数基于SPA珠的荧光。
[0630] 实施例14
[0631] T细胞增殖测定
[0632] 可用于测试本申请中公开的化合物的标准T细胞增殖测定的一般方法如下。
[0633] 使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech，Cat #130-090-861)从8-16周5
龄Balb/c小鼠的脾纯化T细胞。使供试化合物稀释在0.25％DMSO中并且与2.5×10 纯化的小鼠脾T细胞以100μl最终体积在透明平
底板中一起培养，所述板用各为10μg/ml的抗CD3(BD#553057)和抗CD28(BD#553294)抗体在37℃下预涂90分钟。培养24hr后，
3 3
加入1μCiH-胸苷，将板培养另外36hr，然后使用生产商的关于SPA[H]胸苷吸收测定系统(Amersham Biosciences#RPNQ 0130)的实验方案收集。在microbeta计数器(Wallace Triplex 1450，Perkin Elmer)中计数基于SPA珠的荧光。
[0634] 实施例15
[0635] CD86抑制测定
[0636] 可用于测试本申请中公开的化合物的抑制B细胞活性的标准测定的一般方法如下。
[0637] 通过红细胞裂解(BD Pharmingen#555899)从8-16周龄Balb/c小鼠的脾纯化6
总小鼠脾细胞。使供试化合物稀释在0.5％DMSO中并且与1.25×10 脾细胞在200μl最终体积中在透明平底板(Falcon 353072)中于37℃培养60分钟。然后加入15μg/ml IgM(Jackson ImmunoResearch 115-006-020)来刺激细胞，并且细胞在37℃、5％CO2中培养24hr。培养24hr后，使细胞转移至锥形底透明96孔板并且通过以1200x g x 5min离心使细胞成丸粒。用CD16/CD32(BD Pharmingen#553142)将细胞预封闭(preblock)，随后用CD19-FITC(BD Pharmingen#553785)、CD86-PE(BD Pharmingen#553692)和7AAD(BD Pharmingen#51-68981E)进行三重染色。在BD FACSCalibur上将细胞分类并且对
+ -
CD19/7AAD 群设
门(gated)。测量设门的群上的CD86表面表达的水平对供试化合物的浓度。
[0638] 实施例16
[0639] B-ALL细胞存活测定
[0640] 以下是标准B-ALL细胞存活研究的方法，其使用XTT读数器来测量活细胞的数量。该测定可以用于测试本申请中公开的化合物抑制培养物中B-ALL细胞的存活的能力。可以使用的一种人急性B细胞型淋巴细胞性白血病系是SUP-B15，一种可从ATCC获得的人前B细胞ALL系。
[0641] 以5×105细胞/ml的浓度将SUP-B15前B-ALL细胞接种在多个96孔微量滴定板的100μl Iscove培养基+20％FBS中。然后加入供试化合物，使最终浓度是0.4％DMSO。细胞在37℃伴随5％CO2培养至多3天。三天后，将细胞按1∶3分到含有供试化合物的新鲜96孔板中并允许生长另外3天。每24h的时间段后，向重复96孔板中的一个板中加入
50ul XTT溶液(Roche)，并且按照生产商的指示在2、4和20小时采集吸光度读数。然后采集仅用DMSO处理的细胞的在本测定的线性范围(0.5-1.5)内的OD读数，并且测量化合物处理的孔中的活细胞对仅DMSO处理的细胞的百分率。
[0642] 实施例17
[0643] 在本文所述的Btk生物化学测定(实施例11)中测试了以上实施例中公开的化合物，在上述实施例中公开的所有那些式I的化合物均显示出低于或等于2微摩尔的IC50值，并且那些化合物某些显示小于或等于1微摩尔的IC50值。那些化合物某些显示小于或等于25nM的IC50值。那些化合物某些显示小于或等于5nM的IC50值。
[0644] 在B细胞增殖测定(如实施例13中所述)中测试了以上实施例中公开的一些化合物，它们显示小于或等于10微摩尔的IC50值。那些化合物某些显示小于或等于500nM的IC50值。那些化合物某些在该测定中显示小于或等于50nM的IC50值。
[0645] 本文公开的某些化合物显示抑制T细胞增殖的IC50值比那些化合物抑制B细胞增殖的IC50值大至少3倍、在一些情况下10倍、或甚至100倍。
[0646] 在抑制B细胞活性的测定(在实施例15中所述的条件下)中测试本文公开的一些化合物，它们显示小于或等于10微摩尔的IC50值。那些化合物某些显示小于或等于0.5微摩尔的IC50值。那些化合物某些在该测定中显示小于或等于100nM的IC50值。
[0647] 在B细胞白血病细胞存活测定(在实施例16中所述的条件下)中测试本文公开的一些化合物，它们显示小于或等于10微摩尔的IC50值。
[0648] 一些本文公开的化合物显示生物化学的和基于细胞的活性。例如，本文公开的一些化合物在本文所述的Btk生物化学测定(实施例11)中显示小于或等于1微摩尔的IC50值并且在至少一种本文所述的(实施例12、13、15或16)基于细胞的测定(除了T细胞测定)中显示小于或等于10微摩尔的IC50值。那些化合物某些在本文所述的Btk生物化学测定(实施例11)中显示小于或等于50nM的IC50值并且在至少一种本文所述的(实施例
