技术领域
[0001] 本
发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种群勃龙残留快速检测试纸卡及其制备方法。
背景技术
[0002] 群勃龙（Trenbolone，TRE），俗称追宝龙，化学名称为去甲雄三烯醇
酮（17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate），是一种人工合成的促蛋白同化
激素。群勃龙在临床上可用于
治疗严重的营养缺乏、骨质疏松症及重度烧伤等
疾病，由于具有合成代谢和雄激素的功效，用其喂养畜禽时可使营养成分由脂肪组织向肌肉组织转移，从而促进肌肉生长和提高食欲。它还可以增加
蛋白质合成，促进肌肉发达和红细胞生成，增强体
力和耐力，因此在运动会和动物竞技比赛中被用作兴奋剂，这严重违背了体育竞赛的公平精神。
[0003] 群勃龙残留的危害包括对动物本身产生的危害和由于群勃龙在动物源食品中的残留对人体产生的危害，其
副作用包括
皮肤痤疮、性功能减退以及睾丸萎缩，女性使用者则是体毛增长、胸部变小及经期不规律等。长期食用时会严重干扰人体的自然激素平衡，导致内分泌失调、生育能力下降，并具有潜在的致癌性和发育毒性。
[0004] 由于这些有害的毒副作用，TRE的使用在许多国家得到了严格的监管。国际食品法典委员会(CAC)、美国、日本等组织和国家对动物食品中蛋白同化类激素的残留都有严格的要求。FAO / WHO
食品添加剂联合专家委员会（JECFA）在文件“TRS788-JECFA34/40”中规定：TRE在动物肌肉和肝脏中的最大残留限量（MRLs）分别为2 ng/g和10 ng/g。2004年欧盟对我国畜禽产品提出了18个种类的兽药残留、抗生素检测监控要求，其中明确指出，动物源性食品药物残留中，群勃龙不得检出。我国农业部2002年4月发布的第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》也明确表示，性激素类
原料药及其单方、复方制剂产品不准以抗应激、提高
饲料报酬、促进动物生长为目的在所有食源动物的饲养过程中使用。因此，迫切需要建立方便、快捷、灵敏的检测方法，来监控TRE在动物饲料和组织的残留。
[0005] TRE残留常用的检测方法有高效液相色谱法（HPLC），气相色谱－质谱法（GC-MS）和液相色谱－质谱法（LC-MS）等。这些方法灵敏度高，定性准确，可以确定化合物的分子量、分子式，甚至官能团，适合定量检测TRE含量。但这些方法成本高，需要专业的技术人员，昂贵的实验仪器及长时间的前期准备工作。而免疫学检测方法建立在
抗体对
抗原的分子识别上，其主要优点是抗原抗体的亲合力高、检测快速、经济实用，能够实现对
生物液体的小体积、大通量检测，是最灵敏的方法之一。
[0006] 胶体金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测。与ELISA相比，具有样品前处理简单，显色时间短（3-5 min），且所有
试剂包含在一根试纸条上，无需使用仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。因此，研制快速、灵敏、高效的群勃龙残留快速检测试纸卡对于保障动物性
食品安全具有十分重要的意义。本项目也得到2012年度国家自然科学基金项目 （U1204310）资金支持。
发明内容
[0007] 本发明解决的技术问题是提供了一种操作简便、快速准确、灵敏度高、特异性强、成本低廉、
稳定性好且可进行批量检测的群勃龙残留快速检测试纸卡。
[0008] 本发明解决的另一个技术问题是提供了一种群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法。
[0009] 本发明的技术方案是：一种群勃龙残留快速检测试纸卡，其特征在于：所述的群勃龙残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为
支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、
硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的
位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸
纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙－鸡卵清
白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的金标抗体结合垫上灌注有胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体。
[0010] 本发明所述的支撑层为PVC板。本发明所述的吸收垫是以
植物长纤维为原材料制成的纯白
滤纸。本发明所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维
棉制作而成的。本发明所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 mm，吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 mm。本发明所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方
覆盖有胶膜保护层。本发明所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。
[0011] 本发明所述的胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体是由群勃龙－
牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来的。
[0012] 一种群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于：首先将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按照由左到右的顺序附着于支撑层上，所述的硝酸纤维素膜上有群勃龙－鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，然后用切割机制成试纸条，再将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的塑料盒体内，这样就制得了群勃龙残留快速检测试纸卡。
[0013] 本发明所述的样品垫的制备方法为：将玻璃
纤维棉用含有
质量浓度为2% 的BSA、质量浓度为1%的
蔗糖、质量浓度为0.5% 的
硼酸钠和质量浓度为0.1%的 NaN3的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫。
[0014] 本发明所述的金标抗体结合垫的制备方法为：将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含有质量浓度为5% 的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8% 的NaCl和质量浓度为0.05% 的NaN3的PBS缓冲液中20 min，37 ℃恒温烘干，然后将金标抗体灌注于已处理好的玻璃纤维棉上，
真空冻干4 h，即为金标抗体结合垫。
[0015] 本发明所述的硝酸纤维素膜的制备方法为：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30 min，37 ℃烘干后，加入干燥剂，4 ℃密封保存。
[0016] 本发明所述的群勃龙－鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法为：准确称取TRE 100 mg和
琥珀酸酐180 mg，溶于10 ml无
水吡啶，50 ℃避光搅拌反应24 h，反应产物用氮吹仪浓缩，获得淡黄色膏状物；用质量浓度为5% 的NaHCO3溶液溶解后，乙醚萃取，H2SO4
酸化，离心后弃上清，残余物用无水
硫酸钠干燥，重结晶得TRE琥珀酸酯；混合酸酐法将37.2 mg TRE琥珀酸酯溶解在2 ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，置4℃
冰箱中预冷10 min，然后于冰浴磁力搅拌下，加入10 μl三乙胺，4 ℃冰浴条件下反应1 h，然后加入30 μl氯
甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌反应1 h；将40 mg的OVA溶于2 ml
碳酸盐缓冲溶液中（CBS，0.05 mol/L, pH 9.6），冰浴、搅拌条件下将上述反应产物逐滴加入OVA溶液中，加完后在4 ℃下振荡反应6 h。反应产物充分
透析，即得TRE-OVA检测抗原溶液，将其
冷冻干燥保存备用。
[0017] 本发明所述的吸收垫的制备方法为：将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4 mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用，即为吸收垫。
[0018] 本发明的群勃龙残留快速检测试纸卡具有如下优点：（1）灵敏度高、特异性强。群勃龙残留快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的抗群勃龙特异性单克隆抗体制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子通过异性电荷间范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小。因此，快速检测试纸卡灵敏度高、特异性强，其
检测限可达2 ng/ml；
（2）操作简单、方便快捷。使用快速检测试纸卡时无需特殊试剂，只要将处理后的样品溶液用滴管滴入试纸卡加样孔内3~4滴，3~5 min即可观察结果；
（3）检测结果形象、直观。试纸卡以红色印迹线“｜”或“‖”作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上质控线（C线）显示一条红色“｜”印迹时，表示被检测样品溶液呈阳性；若硝酸纤维素膜上质控线（C线）和检测线（T线）同时出现两条红色“‖”印迹时，表示样品溶液呈阴性。结果形象直观，简单准确，不容易出现误判；
（4）胶膜的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与偶联垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合；
（5）成本低、投资少。使用本发明试纸卡，不需要另配复杂的仪器设备和昂贵的试剂，现场检测一步到位，成本低廉，见效快；
（6）易于大范围推广应用。本试纸卡操作简单，适合不同类别的人员使用，如实验室检测、海关检疫、卫生监督、规模养殖及个体生产等，具有广阔的市场前景和较大的经济效益和社会效益。
附图说明
[0019] 图1为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡的结构示意图；图2为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡中试纸条的侧视图；图3为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡中试纸条的俯视图。
[0020] 图面说明：1、塑料盒体、2、试纸条、3、支撑层、4、样品垫、5、金标抗体结合垫、6、硝酸纤维素膜（NC膜）、7、吸收垫、8、加样孔、9、观察窗、10、质控线（C线）、11、检测线（T线）、12、胶膜、13、标记线。
具体实施方式
[0021] 结合附图详细描述
实施例。一种群勃龙残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体1和封装于塑料盒体1内的试纸条2，所述的试纸条2的底层为支撑层3，该支撑层3上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫4、金标抗体结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，所述的塑料盒体1上开有加样孔8和观察窗9，该加样孔8的位置与试纸条2上的样品垫4位置相对应，观察窗9与试纸条2上的硝酸纤维素膜6位置相对应，所述的硝酸纤维素膜6上有群勃龙－鸡卵清白蛋白（TRE－OVA）偶联物溶液印制的检测线（T线）11和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线（C线）10，两者间距5 mm，其中群勃龙－鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线（T线）11位于靠近样品垫4的一侧，所述的金标抗体结合垫5上灌注有胶体金标记的抗群勃龙特异性单克隆抗体。
[0022] 本发明所述的支撑层3是由聚氯乙烯
树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本发明所述的吸收垫7是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本发明所述的样品垫4和金标抗体结合垫5是由玻璃纤维棉制作而成的。本发明所述的样品垫4和金标抗体结合垫5的叠压宽度为2 mm，吸收垫7与硝酸纤维素膜6的叠压宽度为2 mm。本发明所述的样品垫4、金标抗体结合垫5和吸收垫7上方覆盖有胶膜保护层12。本发明所述的硝酸纤维素膜6两端分界处有标记线13。
[0023] 一、本发明群勃龙残留快速检测试纸卡的制备方法：1、所述的抗群勃龙特异性单克隆抗体由群勃龙－牛血清白蛋白（TRE－BSA）偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来，由以下步骤实现：
（1）半抗原衍生化：准确称取TRE 100 mg溶于10 ml无水吡啶，然后加入180 mg的琥珀酸酐，50 ℃避光搅拌反应24 h。反应产物用氮吹仪浓缩，获得淡黄色膏状物，用5% NaHCO3溶解后，乙醚萃取，H2SO4酸化。离心后弃上清，残余物用无水硫酸钠干燥，重结晶得TRE琥珀酸酯。
[0024] （2）免疫原的合成：采用碳化二亚胺法（EDC）法合成TRE免疫原：37.2 mg TRE琥珀酸酯用2 ml N,N–二甲基甲酰胺（DMF）搅拌溶解后，加入12 mg NHS 和 38 mg EDC，37 ℃条件下避光，摇床振荡反应24 h。离心后取上清逐滴加入到3 ml含66 mg BSA的
磷酸盐缓冲溶液中（PBS，0.01 mol/L, pH 7.4），37 ℃条件下避光振荡反应4 h。反应完成后先用蒸馏水透析2 d，再用PBS透析3 d。紫外扫描
透析液无小分子吸收峰时分装于安瓿瓶中，–2 0 ℃保存。
[0025] （3）小鼠免疫：用TRE-BSA免疫8~10周龄雌性Balb/C小鼠5只，剂量为60 μg/只，体积为0.2 ml。首免用PBS稀释的免疫原与等体积FCA完全乳化，以后每隔3 w加强免疫一次，换用FIA乳化。免疫5次后断尾
采血分离血清，用间接ELISA和间接竞争ELISA（ciELISA）筛选效价高，抑制效果好的小鼠作为融合备用鼠。融合前3 d超免小鼠，尾静脉和
腹腔各注射60 μg免疫原。
[0026] （4）细胞融合：融合前4~5 d用含有8-氮
鸟嘌呤的完全培养基（含15%FBS的RPMI-1640）传代培养NS0细胞；前1 d用HAT培养滋养细胞；融合时眶下窦采血，脱颈致死小鼠。无菌取脾脏制备脾细胞，在PEG-1500作用下与NS0细胞融合（细胞数量比约为10：1），将融合后的细胞悬液加入到已铺有滋养细胞的96孔细胞板中，HAT培养。
[0027] （5）单克隆细胞株的筛选：融合后10~14 d用间接ELISA和ciELISA筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株，用有限稀释法进行3次亚克隆。然后用蛋白同化激素标准品溶液筛选灵敏度高、特异性强的单克隆源细胞株，共取得6株。其中，T3D6细胞株灵敏度最高，特异性最强，其抗体特异性结果见表一。
[0028] 表一 T3D6细胞株抗体特异性蛋白同化激素 灵敏度IC50(ng/ml) 交叉反应率CR(%)
群勃龙 0.12 100
19-去甲睾酮 1.96 6.1
睾酮 15.8 0.8
甲睾酮 ＞120 ＜0.1
雌二醇 ＞120 ＜0.1
雌酮 ＞120 ＜0.1
氯睾酮 ＞120 ＜0.1
甲羟孕酮 ＞120 ＜0.1
丙酸睾酮酯 ＞120 ＜0.1
己烯雌酚 ＞120 ＜0.1
（6）单克隆抗体的制备：将T3D6细胞株转移到24孔细胞板及50 ml细胞瓶中扩大培
7
养。筛选的杂交瘤细胞浓度达到约10/ml时，向10 d前经液体
石蜡处理过的经产母鼠腹
8
腔内注射单克隆细胞10/只。10~12 d后
抽取腹水，饱和硫酸胺法纯化抗TRE特异性单克隆抗体，进行胶体金标记。
[0029] 2、所述的胶体金标记TRE特异性单克隆抗体（TRE mAb），由以下步骤实现：（1）胶体金溶液的制备：取超纯水溶解的0.01%氯金
酸溶液100 ml，置电炉加热至
沸腾，3 min后边搅拌，边迅速加入1%的
柠檬酸三钠溶液2 ml。继续加热，溶液
颜色由无色转为浅黄色，最后变为橙红色时停止加热。冷却后用超纯水恢复至原体积，进行透射电镜扫描，鉴定胶体金质量及颗粒大小。胶体金悬液中加入最终质量浓度为0.05%的叠氮钠（NaN3），4 ℃冰箱中保存备用。
[0030] （2）抗体预处理：高浓度的抗体长时间冷冻保存会发生不同程度的聚集，这些聚集物会影响标记的稳定性。因此标记前，将抗TRE特异性单克隆抗体10000 r/min，4 ℃条件下离心30 min，弃沉淀，上清液用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml。
[0031] （3）待标mAb实际用量的确定：酶标板用每孔50 μl双蒸水铺底，纵排加入倍比稀释的TRE mAb，每孔50 μl，设空白对照（BC）。用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金溶液至pH9.0，加入到酶标板中，每孔50 μl混匀。室温孵育15 min后，加入10% NaCl溶液100 μl，混匀，静置。对照孔与mAb量不足以稳定金溶胶的各孔呈现由红变蓝的聚沉现象，而mAb量达到或超过最低稳定量的各孔仍保持红色不变。选择不聚沉时mAb的最低量，在此
基础上增加20%，即为待标TRE mAb的实际用量。
[0032] （4）金标抗体的制备：将事先确定的最佳标记蛋白量与胶体金偶联，常温搅拌30 min，5000 r/min离心20 min，弃上清后，加入10% BSA硼酸钠溶液，使BSA终浓度为1%作为稳定剂。金标抗体溶液10000 r/min离心30 min，弃上清，用20 mmol/L 的硼酸盐稀释液（含1% BSA和0.1% 叠氮钠）将金标抗体恢复至原体积的1/10，放置在4 ℃冰箱备用。
[0033] 3、所述的群勃龙－鸡卵清白蛋白（TRE－OVA）偶联物由以下方式实现：准确称取TRE 100 mg和琥珀酸酐180 mg，溶于10 ml无水吡啶，50 ℃避光搅拌反应24 h。反应产物用氮吹仪浓缩，获得淡黄色膏状物，用5% NaHCO3溶解后，乙醚萃取，H2SO4酸化。离心后弃上清，残余物用无水硫酸钠干燥，重结晶得TRE琥珀酸酯。混合酸酐法将37.2 mg TRE琥珀酸酯溶解在2 ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，置4℃冰箱中预冷10 min，然后于冰浴磁力搅拌下，加入10 μl三乙胺，4 ℃冰浴条件下反应1 h。然后加入30 μl氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌反应1 h。将40 mg的OVA溶于2 ml 碳酸盐缓冲溶液中（CBS，0.05 mol/L, pH9.6），冰浴、搅拌下将上述反应产物逐滴加入OVA溶液中，加完后在4 ℃下振荡反应6 h。反应产物充分透析，即得TRE-OVA检测抗原溶液，将其冷冻干燥保存备用。
[0034] 4、所述的硝酸纤维素膜（NC膜）的制备方法，其特征在于：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线（T线）和质控线（C线）。室温自然干燥后，将其浸入封闭液（质量浓度为1%的 BSA的PBS缓冲液，pH 7.4）中30 min，37 ℃烘干后，加入干燥剂，4 ℃密封保存。
[0035] 5、所述的结合垫的制备方法，其特征在于：将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含质量浓度为5% 的BSA，质量浓度为2%的蔗糖，质量浓度为0.8% 的NaCl和质量浓度为0.05% 的NaN3的PBS处理液中20 min，37 ℃恒温烘干，然后将金标抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为结合垫。
[0036] 6、所述的样品垫的制备方法，其特征在于：玻璃纤维棉要用含质量浓度为2% 的BSA，质量浓度为1%的蔗糖，质量浓度为0.5% 的硼酸钠和质量浓度为0.1%的 NaN3的PBS处理后，干燥备用，即为样品垫。
[0037] 7、所述的试纸卡的组装，其特征在于：在支持板（PVC板）上，将NC膜、结合垫、样品垫、吸收垫和胶膜等按一定工艺组装在一起，用CM4000切割机制成4 mm宽的试纸条。然后，按一定工艺将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的特制的塑料盒体中，即为本发明群勃龙残留快速检测试纸卡。
[0038] 二、本发明群勃龙残留快速检测试纸卡的检测原理：试纸卡根据抗原抗体竞争性
免疫层析原理设计。滴加样品液后，在吸收垫和NC膜的毛细作用下，样品溶液向上迁移，到达结合垫时，金标抗体将被溶解。当样品中含有TRE药物残留时，它们将和金标抗体结合，并一起向上迁移，到达固定有TRE-OVA的检测线位置时，检测抗原将和TRE蛋白同化激素竞争结
合金标抗体上有限的抗原结合位点。样品中TRE残留含量越高，检测抗原和金标抗体结合数量就越少，T线显色就越弱；当样品中TRE残留含量高于一定数值时，检测抗原就无法和金标抗体结合，T线不显色。无论样品中是否有TRE残留存在，过量的金标抗体或检测抗原与金标抗体的结合物都将和二抗RaMIgG结合，在C线形成红色。
[0039] 三、本发明群勃龙残留快速检测试纸卡样品前处理过程：（1）动物尿样：采集新鲜尿样放于4 ℃冰箱中待检，一般不需特殊处理，可直接用于试纸卡检测；若尿液中有污染和混浊，5000 r/min离心10 min或过滤后检测。
[0040] （2）动物血液：用加有肝素钠（20-30单位/ml血样）的离心管采集
血液样本，5000 r/min离心10 min；取出
血浆2 ml加入干净的玻璃离心管中，再加入2 ml乙腈－0.1 M氢
氧化钠溶液（v/v，40/60），用
振荡器混匀5 min后上样检测。
[0041] （3）动物组织：准确称取10 ± 0.1 g已绞碎的动物组织样品于50 ml具拧盖的塑料离心管中。加入2 ml乙腈－0.1 M氢氧化钠溶液（v/v，40/60），均质5 min，3500 r/min离心10 min，上清液待检。
