抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒
阅读：2发布：2021-09-09
专利汇可以提供抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种具有高效价及灵敏度的高特异性抗喹 乙醇 单克隆 抗体 ，并公开了能够生产抗喹乙醇单克隆抗体的具有保藏号为CGMCCNo.6260的杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测 饲料 中喹乙醇的 试剂 盒 。本发明的有益效果为：本发明提供的抗喹乙醇单克隆抗体具有较高特异性和灵敏度，并且线性范围大，能够用于建立快速检测饲料中喹乙醇非法添加的免疫学方法，其应用方法为间接竞争ELISA酶联免疫试剂盒与胶体金 试纸 条，该方法对仪器设备和人员操作的要求较低，检测成本低，能够满足对大批量饲料样品检测的需要。，下面是抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒专利的具体信息内容。
1.具有保藏号为CGMCC N0.6260的小鼠脾细胞-骨髓瘤杂交瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的具有保藏号为CGMCC N0.6260的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔嘁血蓝蛋白；所述喹乙醇衍生物为结构式为式(I )的化合物
2)动物免疫:以步骤I)制备的喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测血清中抗喹乙醇的效价，选取效价最高的免疫小鼠； 3)细胞融合:取步骤2)得到的血清中抗喹乙醇的效价最高的免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合后培养； 4)杂交瘤细胞株的筛选:检测步骤3)得到的融合后细胞上清液的效价，筛选阳性细胞，经多次克隆后阳性率为100%的细胞即为喹乙醇特异性淋巴杂交瘤细胞株(1Η9)。
3.具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体，其特征在于，是由保藏号为CGMCC N0.6260的杂交瘤细胞株产生的。
4.根据权利要求3所述的具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: а)腹水的制备:取成年BALB/C雌性小鼠按0.5ml/只腹腔注射液体石蜡，10天后腹腔注入权利要求1所述杂交瘤细胞株，注入量为I〜5 X IO6个/只，注射10〜14天后进行无菌操作采集腹水，将采集到的腹水以转速1000 rpm离心10 min，收集中间层澄清液体，SP得到腹水型单克隆抗体； b)抗体纯化:将步骤a)得到的离心后的腹水上清用饱和硫酸铵沉淀，获得抗喹乙醇单克隆抗体粗品j^Sephacryl S-200层析柱进行纯化分离，收集阳性管的腹水蛋白，得到抗喹乙醇单克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体在定性和定量检测饲料中喹乙醇中的应用。
6.一种利用具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体检测饲料中喹乙醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成: 1)用含有喹乙醇衍生物一卵清白蛋白偶联物的包被缓冲液包被的酶标板； 2)最佳工作浓度的抗喹乙醇单克隆抗体溶液； 3)最佳工作浓度的山羊抗小鼠IgG-HRP ； 4)底物A液:含体积百分含量 为0.1%H202的pH为5.0的磷酸钠柠檬酸溶液； 5)底物B液:2mg/mL的3，3、5，5'-四甲基联苯胺无水乙醇溶液； б)终止液:2M的硫酸； 7)喹乙醇标准品溶液:分别为0、l、3、9、27、81、243ng/mL ；8) 2倍浓缩样本工作溶剂:含体积百分含量O〜50%甲醇，pH为7.4的PBS溶液； 9) 20倍浓缩洗液:浓度为0.2M，pH为7.4的PBST溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒在检测喹乙醇中的应用，其特征在于，试剂盒的使用方法为: 1)样本的前处理:称取1.0 g饲料样品，研碎，加入IOmL去离子水，摇匀后，放入80°C水浴40min ；4000r/min离心lOmin，吸出上清液，滤纸过滤；用样本工作溶剂10倍或400倍稀释上清液，混合均匀，取50μί进行分析； 2)操作方法:将喹乙醇标准品溶液和待测饲料样本对应微孔编号、记录；每孔加入喹乙醇标准品溶液或待测样本各50μί，再加入喹乙醇单克隆抗体50μΐ7孔，37°C反应30min ；揭开盖板膜，甩干孔内液体，PBST洗涤4〜5次；加入酶标二抗IOOPL/孔，37°C反应30min，PBST洗涤4〜5次；加入底物A液、底物B液各50μΐ7孔，37°C反应10〜15min ;加入终止液50μΐ7孔，用酶标仪测定0D45Qnm。
抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及小分子免疫化学分析与检测技术领域，具体涉及喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒。
背景技术
[0002] 喹乙醇(o-laquindox，OLA)又称喹酰胺醇，化学名称为2_羟乙基氨基甲酰_3_甲基-喹喔啉-1，4- 二氧化物，具有良好的广谱抗菌效果，对大肠杆菌、沙门氏杆菌等革兰氏阴性致病菌所致的消化道疾病具有良好的疗效，并且能够促进畜禽对饲料的消化利用，提高生长速度，在动物性食品生产中发挥了一定的作用。
[0003] 大量的国内外研究报告表明:残留于动物组织中的喹乙醇是一种基因毒剂和生殖腺诱变剂，不但能使动物发生中毒或死亡，并且残留在畜产品中对人体也有较大的危害。因此，2001年农业部发布的《饲料药物添加剂使用规范》规定，禁止喹乙醇用于家禽及水产养殖，并且只能用于低于35 kg体重的猪饲料，使用量为50 g/t饲料。近几年来，一些饲料生产企业和养殖户受经济利益驱动，违规大剂量、长期使用喹乙醇的现象仍很严重，为了确保人类安全与健康，开展饲料及饲料添加剂中喹乙醇含量检测的工作有重要意义。
[0004] 饲料中喹乙醇的检测方法主要是高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，但此方法不仅需要昂贵的仪器设备、专业操作人员，而且操作步骤繁琐、费时。由于酶联免疫吸附方法具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，在兽药残留分析领域应用越来越多。目前国内用于检测OLA的间接竞争ELISA试剂盒多采用进口抗喹乙醇单克隆抗体，检测费用很高；国内文献和专利中也有报道选用抗OLA多克隆抗体和抗OLA单克隆抗体用于喹乙醇残留检测，但都不是十分理想，主要是由于抗体的特异性不强、线性范围小、专属性不够等问题。例如杨曙明、于洪侠关于一种检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒的发明专利(CN1888903)选用的是喹乙醇多克隆抗体；2009年宋春梅硕士毕业论文一喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立中抗体特异性不强、线性范围小，并且该方法主要是针对动物性食品中喹乙醇的残留检测。
发明内容
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:具有保藏号为CGMCC N0.6260的杂交瘤细胞株。
[0007] 上述杂交瘤细胞株，其保藏号为:CGMCC N0.6260，分类命名为小鼠脾细胞-骨髓瘤杂交瘤细胞；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2012年7月4日。
[0008] 本发明的第二个目的是提供了上述具有保藏号为CGMCC N0.6260的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤:1)制备喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔嘁血蓝蛋白；所述喹乙醇衍生物为结构式为式(I )的化合物；
2)动物免疫:以步骤I)制备的喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测血清中抗喹乙醇的效价，选取效价最高的免疫小鼠；
3)细胞融合:取步骤2)得到的血清中抗喹乙醇的效价最高的免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合后培养；
4)杂交瘤细胞株的筛选:检测步骤3)得到的融合后细胞上清液的效价，筛选阳性细胞，经多次克隆后阳性率为100%的细胞即为喹乙醇特异性淋巴杂交瘤细胞株(1H9)。
2)动物免疫:以步骤I)制备的喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测血清中抗喹乙醇的效价，选取效价最高的免疫小鼠；
3)细胞融合:取步骤2)得到的血清中抗喹乙醇的效价最高的免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合后培养；
4)杂交瘤细胞株的筛选:检测步骤3)得到的融合后细胞上清液的效价，筛选阳性细胞，经多次克隆后阳性率为100%的细胞即为喹乙醇特异性淋巴杂交瘤细胞株(1H9)。
[0009] 本发明的第三个目的是提供了具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC N0.6260的杂交瘤细胞株产生的。
[0010] 本发明的第四个目的是提供了上述具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤:а)腹水的制备:取成年BALB/C雌性小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL, 10天后腹腔注入2 X IO6个上述杂交瘤细胞株，注射10〜14天后进行无菌操作采集腹水，将采集到的腹水以转速1000 rpm离心10 min，收集中间层澄清液体，即得到腹水型单克隆抗体。
[0011] b)抗体纯化:将步骤a)得到的离心后的腹水上清用饱和硫酸铵沉淀，获得抗喹乙醇单克隆抗体粗品；经Sephacryl S-200层析柱进行纯化分离，收集阳性管的腹水蛋白，得到抗喹乙醇单克隆抗体。
[0012] 本发明的第五个目的是提供了上述具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体在定性和定量检测饲料中喹乙醇中的应用。
[0013] 本发明的第六个目的是提供了上述具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体检测饲料中喹乙醇的试剂盒，所述试剂盒包括以下组成:1)用含有喹乙醇衍生物一卵清白蛋白偶联物的包被缓冲液包被的酶标板；
2)最佳工作浓度的抗喹乙醇单克隆抗体溶液；
3)最佳工作浓度的山羊抗小鼠IgG-HRP ；
4)底物A液:含0.1%H202的pH为5.0的磷酸钠柠檬酸溶液；
5)底物B液:2mg/mL的TMB无水乙醇溶液；
б)终止液:2M的硫酸；
7)喹乙醇标准品溶液:分别为0、l、3、9、27、81、243ng/mL ；8) 2倍浓缩样本工作溶剂:含O〜50%甲醇，pH为7.4的PBS溶液；
9) 20倍浓缩洗液:浓度为0.2M，pH为7.4的PBST溶液。
2)最佳工作浓度的抗喹乙醇单克隆抗体溶液；
3)最佳工作浓度的山羊抗小鼠IgG-HRP ；
4)底物A液:含0.1%H202的pH为5.0的磷酸钠柠檬酸溶液；
5)底物B液:2mg/mL的TMB无水乙醇溶液；
б)终止液:2M的硫酸；
7)喹乙醇标准品溶液:分别为0、l、3、9、27、81、243ng/mL ；8) 2倍浓缩样本工作溶剂:含O〜50%甲醇，pH为7.4的PBS溶液；
9) 20倍浓缩洗液:浓度为0.2M，pH为7.4的PBST溶液。
[0014] 本发明的第七个目的是提供了上述具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体检测饲料中喹乙醇的试剂盒的使用方法:称取1.0 g饲料样品，研碎，加入IOmL去离子水，摇匀后，放入80°C水浴40min ;4000r/min离心lOmin，吸出上清液，滤纸过滤；用样本工作溶剂10倍或400倍(猪饲料)稀释上清液，混合均匀；每孔加入喹乙醇标准品溶液或待测样本各50 ^，再加入喹乙醇单克隆抗体50 p.L /孔，37°C反应30min ;揭开盖板膜，甩干孔内液体，PBST洗涤4〜5次；加入酶标二抗100 μΐ /孔，37°C反应30min，PBST洗涤4〜5次；加入底物A液、底物B液各50 μΐ / ?L 37V反应10〜15min ;加入终止液50 /孔，用酶标仪测定
0^450™。
0^450™。
[0015] 结果分析:以B/B#为纵坐标，以喹乙醇标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，根据回归方程和样本稀释倍数，计算饲料样本中喹乙醇的添加浓度。以Β/ΒΟ%为纵坐标，以喹乙醇标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，计算喹乙醇浓度。
[0016] 本发明的第八个目的是提供了一种使用上述喹乙醇检测试剂盒大量、快速筛选饲料中违规添加喹乙醇的阴、阳性样本的判定依据:(I)对于猪饲料中喹乙醇的检测，当样本的抑制率(Β/ΒΟ) >88.17 %时，样本为阴性；当抑制率50.74〈 (Β/ΒΟ)〈88.17%时，样本中含有喹乙醇，但符合限量要求；当抑制率(Β/Β0Χ50.74%时，样本中喹乙醇含量超标；(2)对于其它饲料中喹乙醇的检测，当样本的当样本的抑制率(Β/ΒΟ) >91.88%时，样本为阴性；当抑制率(Β/ΒΟ) <79.79%时，样本中含有喹乙醇，样本为阳性。
[0017] 本发明的有益效果为:本发明提供的抗喹乙醇单克隆抗体具有较高特异性和灵敏度，并且线性范围大，能够用于建立快速检测饲料中喹乙醇非法添加的免疫学方法，其应用方法为间接竞争ELISA酶联免疫试剂盒与胶体金试纸条，该方法对仪器设备和人员操作的要求较低，检测成本低，能够满足对大批量饲料样品检测的需要。附图说明
[0018] 图1是免疫用全抗原OLA-HS-BSA的紫外检测图，可用于免疫全抗原合成的评价。
[0019] 图2是包被用全抗原OLA-HS-OVA的紫外检测图。可用于包被全抗原合成的评价。
[0020] 图3是单克隆抗体1Η9亚型鉴定图，可用于杂交瘤细胞株建株的定性评价。
[0021] 图4是单克隆抗体1Η9的聚丙烯凝胶电泳图，其中I为mark，2、3、4为10微升的纯化后抗体，5、6、7为5微升的纯化后抗体，8、9为20微升的未纯化腹水，可用于评价抗体纯化效果及生产单克隆抗体的质量。
[0022] 图5是单克隆抗体1H9腹水和纯化蛋白的效价评价图，可用于评价单克隆抗体的质量。
[0023] 图6是喹乙醇抑制曲线图，可用于喹乙醇ELISA检测试剂盒的质量评价。
具体实施方式
[0024] 实施例1:一、抗喹乙醇单克隆抗体的制备:1、喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物的制备
(1)喹乙醇衍生物的合成过程如下所示:
具体过程为:
a.按摩尔比为1:2称取喹乙醇和琥珀酸酐，置于圆底烧瓶中，90°C加热回流反应8h;
b.减压蒸馏除去有机溶剂，加100〜200mL蒸馏水静置过夜；
c.次日用乙酸乙酯萃取3次，用碳酸氢钠水溶液提取有机相，重复三次，收集水相，再用浓盐酸调pH值为I〜2，析出黄褐色糖浆状物；
d.弃酸层，用蒸馏水洗5次后，经真空干燥得黄褐色固体，即半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)的粗品；
e.以柱层析用硅胶(140目)干法装柱，柱填充高度为30cm，上样量20mg喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)的粗品(溶于2ml流动相)，TLC监控，收集洗脱液，挥干后得到的黄褐色粉末，即为纯化后的半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)；
(2)喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物(免疫抗原)的制备:
a.称取10〜20mg喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)溶于ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入24mg NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)和31mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，25°C避光反应 24 h ;
b.次日称取6〜12mg BSA (牛血清白蛋白)溶解于2mL 0.01 mol/L的PBS溶液中，获得载体蛋白溶液；
c.将步骤a中反应溶液逐滴加入步骤b的载体蛋白溶液中，37°C振荡过夜；
d.将步骤c得到的反应液放入超滤离心管(30000Dal)，用pH 7.4,0.1 mol/L的PBS缓冲液，4°C，3000r/min, IOmin充分洗去未反应完全的小分子物质，重复3〜5次；
e.用pH 7.4 PBS反应缓冲液稀释抗原至初体积，-20°C保存。
(1)喹乙醇衍生物的合成过程如下所示:
具体过程为:
a.按摩尔比为1:2称取喹乙醇和琥珀酸酐，置于圆底烧瓶中，90°C加热回流反应8h;
b.减压蒸馏除去有机溶剂，加100〜200mL蒸馏水静置过夜；
c.次日用乙酸乙酯萃取3次，用碳酸氢钠水溶液提取有机相，重复三次，收集水相，再用浓盐酸调pH值为I〜2，析出黄褐色糖浆状物；
d.弃酸层，用蒸馏水洗5次后，经真空干燥得黄褐色固体，即半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)的粗品；
e.以柱层析用硅胶(140目)干法装柱，柱填充高度为30cm，上样量20mg喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)的粗品(溶于2ml流动相)，TLC监控，收集洗脱液，挥干后得到的黄褐色粉末，即为纯化后的半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)；
(2)喹乙醇衍生物一载体蛋白偶联物(免疫抗原)的制备:
a.称取10〜20mg喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)溶于ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入24mg NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)和31mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，25°C避光反应 24 h ;
b.次日称取6〜12mg BSA (牛血清白蛋白)溶解于2mL 0.01 mol/L的PBS溶液中，获得载体蛋白溶液；
c.将步骤a中反应溶液逐滴加入步骤b的载体蛋白溶液中，37°C振荡过夜；
d.将步骤c得到的反应液放入超滤离心管(30000Dal)，用pH 7.4,0.1 mol/L的PBS缓冲液，4°C，3000r/min, IOmin充分洗去未反应完全的小分子物质，重复3〜5次；
e.用pH 7.4 PBS反应缓冲液稀释抗原至初体积，-20°C保存。
[0025] 载体蛋白可以为牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)或相关蛋白，如图1、2所示为全抗原OLA-HS-BSA、OLA-HS-OVA的紫外检测图，用于全抗原的鉴定。
[0026] 2、动物免疫:用上述喹乙醇半琥珀酸酯-牛血清白蛋白加等量弗氏完全佐剂制成油包水的乳化剂，首次免疫按0.2 mL/只加等量弗氏完全佐剂，腹腔、颈背部皮下多点注射；2周后，按剂量为
0.1 mL/只加等量弗氏不完全佐剂，腹腔、颈背部皮下多点注射；重复免疫两次，每次间隔2周；末次免疫为腹腔注射用生理盐水稀释的免疫抗原；用间接ELISA法测定血清效价，选取血清效价最高的小鼠用于细胞融合。
0.1 mL/只加等量弗氏不完全佐剂，腹腔、颈背部皮下多点注射；重复免疫两次，每次间隔2周；末次免疫为腹腔注射用生理盐水稀释的免疫抗原；用间接ELISA法测定血清效价，选取血清效价最高的小鼠用于细胞融合。
[0027] 3、制备杂交瘤细胞:(I)饲养细胞的制备:
融合前I天，取健康的BALB/C小鼠，眶下窦放血，颈椎脱臼处死，浸入75%酒精中消毒5 min，无菌剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器抽取5 mL预冷的HAT (组蛋白乙酰转移酶)打入小鼠腹腔，轻轻挤压腹部后重新抽出液体，1000 r/min离心5 min，弃上清，用HAT培养基(sigma公司，H0262)调整细胞至2X IO5个/mL，加入6块96孔细胞培养板中，每孔100μ L，置于37°C、5% CO2培养箱中培养；
(2)融合:
a.选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞株，收集小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，1000 r/min离心10 min，弃上清，用5 mLDMEM基础培养基重悬后用0.4%台盼蓝拒染法，计数，大于90%时可进行细胞融合；
b.取血清效价最高的小鼠，冲刺免疫4天后，眶下窦采血，分离阳性血清，-20°C冻存备用，颈椎脱曰处死，浸入75%酒精中消毒5 min，无菌取出脾脏，剥除脂肪和结缔组织，置于200目筛上剪碎，轻轻研磨后，用15 Ml DMEM基础培养基冲洗，转入50 mL离心管中，1000r/min离心10 min，弃上清 ，用5 mL DMEM基础培养基重悬，0.4%台盼蓝溶液染色，计数；
c.将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞按1:8的比例混合于50 mL离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，轻击管底打散细胞团，将其置于37°C水浴锅中，用I mL吸管将预温的50% PEG (聚乙二醇，v/v)溶液缓慢加入融合管中，边加边轻轻转动融合管,2 min内加完，在水浴中静置I min，立即缓慢滴加37°C预温的基础培养基15 mL，加入步骤为:lmL/min,静置 I min 后，2mL/min, 3 mL/ min, 9 mL/ min, 1000 r/min 离心 8 min,弃上清,加入60 mL HAT培养基悬浮细胞，混匀后加入到含饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100 μ L，置于37°C、5% CO2培养箱中培养；
(3)杂交瘤细胞的阳性筛选:
细胞融合后，待生长迅速的杂交瘤细胞已长至覆盖96孔板底面积的1/2左右时，采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，具体步骤如下:
a.吸取待测孔上清100 μ L对应加入包被好的检测板中，37°C孵育0.5 h后洗涤；
b.加入1:10000的山羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100 μ L，37°C孵育0.5 h后洗涤；
c.加入TMB (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)底物显色液，每孔100 μ L，37°C避光显色15
min ；
d.加入2 mol/L硫酸终止液，每孔50 μ L，测定0D450nm值；
e.以融合小鼠的阳性血清为阳性对照；以无杂交瘤生长孔的细胞上清为阴性对照，以细胞培养基为空白对照。
融合前I天，取健康的BALB/C小鼠，眶下窦放血，颈椎脱臼处死，浸入75%酒精中消毒5 min，无菌剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器抽取5 mL预冷的HAT (组蛋白乙酰转移酶)打入小鼠腹腔，轻轻挤压腹部后重新抽出液体，1000 r/min离心5 min，弃上清，用HAT培养基(sigma公司，H0262)调整细胞至2X IO5个/mL，加入6块96孔细胞培养板中，每孔100μ L，置于37°C、5% CO2培养箱中培养；
(2)融合:
a.选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞株，收集小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，1000 r/min离心10 min，弃上清，用5 mLDMEM基础培养基重悬后用0.4%台盼蓝拒染法，计数，大于90%时可进行细胞融合；
b.取血清效价最高的小鼠，冲刺免疫4天后，眶下窦采血，分离阳性血清，-20°C冻存备用，颈椎脱曰处死，浸入75%酒精中消毒5 min，无菌取出脾脏，剥除脂肪和结缔组织，置于200目筛上剪碎，轻轻研磨后，用15 Ml DMEM基础培养基冲洗，转入50 mL离心管中，1000r/min离心10 min，弃上清 ，用5 mL DMEM基础培养基重悬，0.4%台盼蓝溶液染色，计数；
c.将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞按1:8的比例混合于50 mL离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，轻击管底打散细胞团，将其置于37°C水浴锅中，用I mL吸管将预温的50% PEG (聚乙二醇，v/v)溶液缓慢加入融合管中，边加边轻轻转动融合管,2 min内加完，在水浴中静置I min，立即缓慢滴加37°C预温的基础培养基15 mL，加入步骤为:lmL/min,静置 I min 后，2mL/min, 3 mL/ min, 9 mL/ min, 1000 r/min 离心 8 min,弃上清,加入60 mL HAT培养基悬浮细胞，混匀后加入到含饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100 μ L，置于37°C、5% CO2培养箱中培养；
(3)杂交瘤细胞的阳性筛选:
细胞融合后，待生长迅速的杂交瘤细胞已长至覆盖96孔板底面积的1/2左右时，采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，具体步骤如下:
a.吸取待测孔上清100 μ L对应加入包被好的检测板中，37°C孵育0.5 h后洗涤；
b.加入1:10000的山羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100 μ L，37°C孵育0.5 h后洗涤；
c.加入TMB (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)底物显色液，每孔100 μ L，37°C避光显色15
min ；
d.加入2 mol/L硫酸终止液，每孔50 μ L，测定0D450nm值；
e.以融合小鼠的阳性血清为阳性对照；以无杂交瘤生长孔的细胞上清为阴性对照，以细胞培养基为空白对照。
[0028] (4)杂交瘤细胞的克隆、建株:对连续两次筛选均为阳性的细胞孔，采用有限稀释法进行克隆，并根据检测的0D450nm值和对应的细胞克隆数进行评价。优选0D450nm值高、细胞克隆数少的孔，后经数次克隆至连续3次克隆阳性率均达100%，得到杂交瘤细胞株2株。分别将2株杂交瘤细胞扩大培养，经多次传代、冻存和复苏后ELISA检测细胞上清。选择效价高、特异性强，稳定性好的一株保藏。
[0029] 其中杂交瘤株的上清效价为1:6.92 X IO4 ;经小鼠单克隆抗体同型快速ELISA检测试剂盒检测，确定1H9单抗属于为IgG2a/K (见图3);命名为抗喹乙醇特异性淋巴杂交瘤细胞株1H9。该细胞株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2012年7月4日，保藏号CGMCC N0.6260。
[0030] 4、单克隆抗体的制备与纯化:(I)腹水型单克隆抗体的制备:取成年BALB/C雌性小鼠按0.5ml/只腹腔注射液体石蜡，10 d后腹腔注入杂交瘤细胞，I〜5X106个/只，注射7〜10 d后可见小鼠腹部明显膨大且行动迟缓时，10〜14 d后进行无菌操作采集腹水，1000 rpm离心10 min，收集中间层澄清液体，即为腹水型单克隆抗体，并测定效价，_20°C保存。结果见图5，纯化后抗体效价为1:3.2Χ107。
[0031] (2)单克隆抗体的预处理:取腹水型单克隆抗体5 mL,分别加入3倍体积生理盐水和4倍体积的饱和(NH4)2SO4溶液，混匀；4°C沉淀a后，溶液中有大量的白色絮状沉淀，4000rpm离心30 min ;弃去上清液，沉淀溶解在5 mL的生理盐水中，加入占总体积45%的饱和(NH4)2SO4溶液，4°C沉淀2 h后，4000 rpm离心30 min ;弃去上清液,沉淀溶于5 mL的生理盐水中；
(3)单克隆抗体的纯化:
选取S印hacry S-200作柱材(GE医疗集团，17-0584-10)，装柱，平衡后取饱和硫酸铵沉淀的腹水型单克隆抗体进行上样，流动相为0.2M PBS,流速0.8mL/min,直至显示的UV吸光值开始上升时，测定抗体蛋白效价，收集阳性管的腹水蛋白，_20°C保存；
(4)单克隆抗体的评价:
采用SDS — PAGE电泳鉴定抗喹乙醇单克隆抗体，结果见图4，纯化后抗体的重链、轻链条带清晰，杂带较少，； 采用BCA试剂盒测定小鼠腹水、硫酸铵处理后、纯化后抗体的蛋白浓度分别为抗体的蛋白浓度50.14,28.59,3.24mg/mL，测得纯化后喹乙醇单克隆抗体的效价为64000 (P/Ν>2.0)。
(3)单克隆抗体的纯化:
选取S印hacry S-200作柱材(GE医疗集团，17-0584-10)，装柱，平衡后取饱和硫酸铵沉淀的腹水型单克隆抗体进行上样，流动相为0.2M PBS,流速0.8mL/min,直至显示的UV吸光值开始上升时，测定抗体蛋白效价，收集阳性管的腹水蛋白，_20°C保存；
(4)单克隆抗体的评价:
采用SDS — PAGE电泳鉴定抗喹乙醇单克隆抗体，结果见图4，纯化后抗体的重链、轻链条带清晰，杂带较少，； 采用BCA试剂盒测定小鼠腹水、硫酸铵处理后、纯化后抗体的蛋白浓度分别为抗体的蛋白浓度50.14,28.59,3.24mg/mL，测得纯化后喹乙醇单克隆抗体的效价为64000 (P/Ν>2.0)。
[0032] 使用Pierce公司的小鼠单克隆抗体同型快速ELISA检测试剂盒，检测杂交瘤细胞培养上清液，结果表明该抗喹乙醇单克隆抗体亚类为IgG2a/K。
[0033] 实施例2:间接竞争ELISA检测方法的建立:
1.间接竞争ELISA法
(1)包被:将检测抗原OLA-OVA用包被缓冲液稀释后，每孔100 μ L，加入96孔酶标板中，4°C过夜，PBST洗涤5次；
(2)封闭:每孔加200 μ L封闭液，37°C孵育I h，PBST洗涤5次；
(3)加待检样品:加入待检样品，每孔50 μ L，同时设置不同浓度的喹乙醇标准对照和空白对照，再加入工作浓度的喹乙醇单抗，每孔50 μ L，混匀，37°C孵育0.5 h，PBST洗涤5次；
(4)加山羊抗小鼠IgG-HRP:加入工作浓度的山羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100 μ L，37°C孵育0.5 h, PBST洗涤5次；
(5)加显色液:加入新鲜配制的TMB显色液，每孔100 yL，37°C避光显色15 min ；
(6)加终止液:加入2 mol/L H2S04终止液，每孔50 μ L，终止反应，用酶标仪读0D450nm 值；
(J)结果判定:以空白对照孔调零，以不同浓度喹乙醇标准品以10为底的对数值和测得的0D450nm值做标准曲线。
1.间接竞争ELISA法
(1)包被:将检测抗原OLA-OVA用包被缓冲液稀释后，每孔100 μ L，加入96孔酶标板中，4°C过夜，PBST洗涤5次；
(2)封闭:每孔加200 μ L封闭液，37°C孵育I h，PBST洗涤5次；
(3)加待检样品:加入待检样品，每孔50 μ L，同时设置不同浓度的喹乙醇标准对照和空白对照，再加入工作浓度的喹乙醇单抗，每孔50 μ L，混匀，37°C孵育0.5 h，PBST洗涤5次；
(4)加山羊抗小鼠IgG-HRP:加入工作浓度的山羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100 μ L，37°C孵育0.5 h, PBST洗涤5次；
(5)加显色液:加入新鲜配制的TMB显色液，每孔100 yL，37°C避光显色15 min ；
(6)加终止液:加入2 mol/L H2S04终止液，每孔50 μ L，终止反应，用酶标仪读0D450nm 值；
(J)结果判定:以空白对照孔调零，以不同浓度喹乙醇标准品以10为底的对数值和测得的0D450nm值做标准曲线。
[0034] 2.包被抗原和喹乙醇单抗最佳工作浓度的确定:采用方阵滴定法，通过间接ELISA法的检测结果见表1，从表中可看出，当OLA mAb的稀释倍数为4000，OLA-HS-OVA稀释20000倍时，0D450nm为1.022，结合试剂盒中单抗添加量，考虑到在OLA-Kit操作中抗体浓度会减半，因此确定OLA mAb与OLA-HS-OVA工作浓度分别为 1:2000 和 1:20000。
[0035]表 I
[0036] 3.山羊抗小鼠IgG-HRP最佳工作浓度的确定:用确定的OLA-OVA的包被浓度制备检测板，用工作浓度的喹乙醇单抗为阳性对照，用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0制备的腹水(1:1000)为阴性对照；用酶稀释液将山羊抗小鼠IgG-HRP分别稀释5000、10000、15000、20000倍，通过间接ELISA法测定，最后根据各组阳性孔和阴性孔的OD450nm值及其比值(P/N值)，最大值对应的山羊抗小鼠IgG-HRP稀释度即为山羊抗小鼠IgG-HRP的最佳工作浓度，如表2所示，表2中的结果表明，酶工作浓度在1:10000 时 P/N 最高。
[0037]表 2
[0038] 实施例3:间接ELISA方法检测抗体灵敏度、线性范围、特异性:
1、间接ELISA方法检测抗体灵敏度、线性范围:
用PBS液配制喹乙醇标准品溶液，浓度分别为0、1、3、9、27、81、243 ng/mL，采用间接竞争ELISA法进行检测。如表3所示，以喹乙醇浓度以10为底的对数值为横坐标，以抑制率Β/Β0为纵坐标(B是OLA不同标准浓度对应的0D450nm值，BO是OLA浓度为O时对应的0D450nm值)，绘制标准抑制曲线(见图6)，进行相关回归分析，计算单抗对喹乙醇的IC50。结果见表3，确定抗体的IC50为15.30 + 6.99，线性范围为0〜243 ng/mL。[0039]表 3
1、间接ELISA方法检测抗体灵敏度、线性范围:
用PBS液配制喹乙醇标准品溶液，浓度分别为0、1、3、9、27、81、243 ng/mL，采用间接竞争ELISA法进行检测。如表3所示，以喹乙醇浓度以10为底的对数值为横坐标，以抑制率Β/Β0为纵坐标(B是OLA不同标准浓度对应的0D450nm值，BO是OLA浓度为O时对应的0D450nm值)，绘制标准抑制曲线(见图6)，进行相关回归分析，计算单抗对喹乙醇的IC50。结果见表3，确定抗体的IC50为15.30 + 6.99，线性范围为0〜243 ng/mL。[0039]表 3
[0040] 2、间接ELISA方法检测抗体特异性:以喹乙醇及其同类物喹烯酮、乙酰甲喹、3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)、喹噁啉-2-羧酸(QCA)和土霉素、氯霉素、氟苯尼考、林可霉素、乳酸诺氟沙星、盐酸克伦特罗作为竞争物，用间接竞争ELISA法测定单抗对各竞争物的IC5(I。根据公式，计算交叉反应率。交叉反应率(CR%) =IC5tl(喹乙醇)/IC5tl(竞争物)X 100%。由表4可知，抗喹乙醇单克隆抗体的特异性高，特别是与其残留标示物无交叉反应性。
[0041]表 4
[0042] 实施例4:喹乙醇检测试剂盒的组成与使用方法:
1.喹乙醇试剂盒的组成
(1)酶标板的制备:将包被如图2所示的抗原0LA-HS-0VA，用pH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释10000倍，每孔100 μί./孔，4°C包被过夜，次日用5%脱脂奶溶液按200
/孔，37°C封闭2h，弃去液体，干燥，封袋；
(2)样本工作溶剂的确定:选取9种不同浓度的甲醇与水、甲醇与PBS溶液作为样本工作溶剂，考察标准曲线和回收率；确定含O〜50%甲醇的PBS溶液作为样本工作溶剂；
(3)蛋白浓度为1.62 Pg/mL的单克隆抗体工作液，溶剂为pH7.4 PBS ；
(4) 10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG ；
(5)底物A液为含0.1%H202的pH 5.0磷酸钠柠檬酸溶液；
(6 )底物B液为2mg/mL的TMB无水乙醇溶液；喹乙醇标准品溶液7瓶，O、1、3、9、27、81、243ng/mL ；(7)终止液为2M的H2SO4 ；
(8) 2倍浓缩样本工作溶剂为含O〜50%甲醇，pH为7.4的PBS溶液；
(9)20倍浓缩洗液为含0.2M，pH为7.4的PBST溶液。
1.喹乙醇试剂盒的组成
(1)酶标板的制备:将包被如图2所示的抗原0LA-HS-0VA，用pH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释10000倍，每孔100 μί./孔，4°C包被过夜，次日用5%脱脂奶溶液按200
/孔，37°C封闭2h，弃去液体，干燥，封袋；
(2)样本工作溶剂的确定:选取9种不同浓度的甲醇与水、甲醇与PBS溶液作为样本工作溶剂，考察标准曲线和回收率；确定含O〜50%甲醇的PBS溶液作为样本工作溶剂；
(3)蛋白浓度为1.62 Pg/mL的单克隆抗体工作液，溶剂为pH7.4 PBS ；
(4) 10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG ；
(5)底物A液为含0.1%H202的pH 5.0磷酸钠柠檬酸溶液；
(6 )底物B液为2mg/mL的TMB无水乙醇溶液；喹乙醇标准品溶液7瓶，O、1、3、9、27、81、243ng/mL ；(7)终止液为2M的H2SO4 ；
(8) 2倍浓缩样本工作溶剂为含O〜50%甲醇，pH为7.4的PBS溶液；
(9)20倍浓缩洗液为含0.2M，pH为7.4的PBST溶液。
[0043] 所有试剂储存于2〜8°C。
[0044] 2.样本前处理:将饲料样品研碎，称1.0±0.05g研碎的饲料样品，加入IOml去离子水，振荡摇匀，放入70°C水浴30min ；4000r/min离心15min，吸出上清液；用样本工作溶剂10倍或4000倍稀释
上清液，混合均匀，取50 μΐ进行分析。
上清液，混合均匀，取50 μΐ进行分析。
[0045] 3.试剂盒的检测方法:(1)将喹乙醇标准品溶液和待测饲料样本对应微孔按序编号，每个标准品和样本做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；
(2)依次在对应的微孔中加喹乙醇标准品溶液和待测样本50 p.L,再加入单克隆抗体工作液50 /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板后置37°C反应`30min ；
(3)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250 ML /孔，充分洗涤4〜5次，每次洗涤间隔数秒，用吸水纸拍干；
(4)加入酶标二抗100 HL /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板后置37°C反应30min，洗版，与(3)同法；
(5)分别先后加入底物A液、底物B液各50 μ-L /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板后置37°C反应 10 〜15min ；
(6)加入终止液50 μΙ /孔，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定0D45(lnm。
(2)依次在对应的微孔中加喹乙醇标准品溶液和待测样本50 p.L,再加入单克隆抗体工作液50 /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板后置37°C反应`30min ；
(3)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250 ML /孔，充分洗涤4〜5次，每次洗涤间隔数秒，用吸水纸拍干；
(4)加入酶标二抗100 HL /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板后置37°C反应30min，洗版，与(3)同法；
(5)分别先后加入底物A液、底物B液各50 μ-L /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板后置37°C反应 10 〜15min ；
(6)加入终止液50 μΙ /孔，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定0D45(lnm。
[0046] 4.试剂盒的结果分析:(I)半定量判定方法:由于样本颜色或吸光值与喹乙醇的含量呈负相关，所以可以用样本孔的颜色或OD45tlnm与喹乙醇标准孔的颜色或OD45tlnm进行比较，从而判断出样本中喹乙醇的浓度范围。
[0047] (2)定量分析:a.根据公式，计算百分吸光率:
百分吸光度值(％) =B/B0X100% ；
B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；
B0-O ng/mL标准溶液的平均吸光度值。
百分吸光度值(％) =B/B0X100% ；
B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；
B0-O ng/mL标准溶液的平均吸光度值。
[0048] b.绘制标准曲线、计算样本浓度:以喹乙醇标准品的百分吸光率为纵坐标，以喹乙醇标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，根据回归方程和样本稀释倍数，计算饲料样本中喹乙醇的添加浓度。
[0049] 实施例5:检测饲料中喹乙醇的试纸条:
1.喹乙醇胶体金试纸条的制备:
将抗喹乙醇单克隆抗体用胶体金标记后，制备胶体金垫，将山羊抗小鼠IgG-HRP和OLA-HS-OVA分别划线于捕获线和控制线，将测试条与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封贮存；
2.检测样品的制备:
将饲料样品研碎，加入适量去离子水，振荡均勻，放入70°C水浴30min ;4000r/min离心15min,吸出上清液用于检测；
3.使用方法
将试纸条插入待测样品液中，2〜4分钟后观察检测结果，出现一条红色印迹线，判定样品为阳性(+ );出现两条红色印迹线，判定样品为阴性(_);若没有红色印迹线，则表明试纸条失效。
1.喹乙醇胶体金试纸条的制备:
将抗喹乙醇单克隆抗体用胶体金标记后，制备胶体金垫，将山羊抗小鼠IgG-HRP和OLA-HS-OVA分别划线于捕获线和控制线，将测试条与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封贮存；
2.检测样品的制备:
将饲料样品研碎，加入适量去离子水，振荡均勻，放入70°C水浴30min ;4000r/min离心15min,吸出上清液用于检测；
3.使用方法
将试纸条插入待测样品液中，2〜4分钟后观察检测结果，出现一条红色印迹线，判定样品为阳性(+ );出现两条红色印迹线，判定样品为阴性(_);若没有红色印迹线，则表明试纸条失效。
[0050] 最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参 照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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