滥用药物已成为世界公害，是当今世界严重的社会问题之一，其中毒品特别是海洛因、 吗啡等物质的危害很大，它严重威胁着人类的健康和安全。据统计，至1997年底，全 世界有1000万人因卷入吸毒而丧失劳动能力。因而世界范围内的公安部门，正在把严 厉打击贩毒作为一项重要工作来做。为配合这种工作，一种快速、简便、灵敏、准确，适 于大规模普查和易于野外操作的检测方法的建立就显得尤其必要。
目前国内外对尿中海洛因排泄物吗啡的检测，一般采用薄层色谱、色质联用、高压液 相色谱、酶联免疫吸附分析等方法。这些方法有的费时费力，有的依赖仪器，而在实际使 用时，都存在明显的缺点。尽管新近有一种较方便的吗啡免疫层析试纸上市，但这种试纸 一是只能定性检测，二是一条试纸不能同时检测游离吗啡和总吗啡，因而假阴性的存在是 不可避免的，而且是难以克服的。

本发明的目的在于克服现有吗啡检测方法的缺陷，而提供一种抗吗啡单抗细胞株的建 立和吗啡双面检测试纸的制作方法，且用该方法制备的双面检测试纸是一种半定量同时检 测尿样中游离吗啡和总吗啡的双面免疫层析试纸。
本发明的半定量同时检测尿样中游离吗啡和总吗啡的双面免疫层析试纸的制作方法 包括如下步骤：
①N位、3位和6位吗啡-蛋白质复合物的制备；
②抗吗啡单克隆抗体细胞株的建立及抗吗啡多克隆抗体和单克隆抗体的制备；
③免疫亲和层析固定相的制备；
④免疫亲和纯化多克隆抗体和单克隆抗体，及交叉纯化多克隆抗体；
⑤胶体金标记抗3位吗啡和6位吗啡多克隆抗体和抗N位吗啡单克隆抗体复合物的 制备；
⑥用于免疫层析试纸的层析膜的制备；
⑦组装双面免疫层析试纸，以便半定量同时检测尿样中游离吗啡和总吗啡。
本发明的半定量同时检测尿样中游离吗啡和总吗啡的双面免疫层析试纸的制作方法， 其中：
N位吗啡-蛋白质复合物是这样制备的：将1-10克吗啡，5-10克氯甲酸酯和 1-10克碳酸盐溶于50-100mL溶剂，回流，过滤，蒸馏产物，然后加入1-2 0mL 64％-97％的水合肼，回流2-10小时，冷至室温，过滤得降吗啡，熔点 为272℃-274℃；取0.1-10克降吗啡、0.2-20克溴代胺和0.1-15克 碳酸盐，溶于10-50mL二甲亚砜，加水合肼10mL，回流，纯化收集产品；取该 产品0.1-10克溶于10-50mL水，加入牛血清白蛋白100-900mg，将pH 调到3-7，再加入5-25克碳二亚胺，反应4-24小时，得到N位吗啡-牛血清 白蛋白复合物；
同上法，用鸡卵清白蛋白替代牛血清白蛋白得到N位吗啡-鸡卵清白蛋白复合物；
3位吗啡-蛋白质复合物是这样制备的：1-10克吗啡溶于10-100mL二甲 基亚砜中，加入氢氧化钾5-50克，溴乙酸1-10克，搅拌2小时，倒入冰水，水 溶液用盐酸酸化至pH2-7，收集固体，得3位羧甲基吗啡，重结晶产物的熔点为29 2℃～293℃；
取0.5-10克羧甲基吗啡溶于10-100mL二氧六环中，加入0.2-50m L氯甲酸酯和0.4mL三级胺，搅拌，得溶液A；0.5％牛血清白蛋白50-200 mL与二氧六环混合，调p H至碱性，得溶液B；将溶液A上清缓慢加入到溶液B中，搅 拌2-4小时，浓缩至20～30mL，对生理盐水透析，得到3位吗啡-牛血清白蛋白 复合物；
同上，用鸡卵清白蛋白替代牛血清白蛋白，即可得到3位吗啡-鸡卵清白蛋白复合物；
6位吗啡-蛋白质复合物是这样制备的：1.0-10克吗啡溶于10-100mL 苯中，加入1.0-10克琥珀酸酐，回流1-10小时，冷却到室温，固体溶于10- 200mL水中，调pH1-6，过滤，调pH至7-12，过滤，再调pH至酸性， 得产品；取该产品0.1-5克溶于二氧六环，加入10-50μl氯甲酸酯，10-10 0μl三级胺，搅拌30分钟，得到A液；1％牛血清白蛋白与二氧六环混合，调pH为 8-12，得到B液；然后将A的上清液缓慢加入B液，冷却；浓缩，透析，得到6位吗 啡-牛血清白蛋白复合物；
同上法，用鸡卵清白蛋白代替牛血清白蛋白，得到6位吗啡-鸡卵清白蛋白复合物。
抗吗啡单克隆抗体细胞株及抗吗啡单克隆抗体是这样建立和制备的：(1)分泌抗吗啡 单克隆抗体的细胞株的建立，①动物免疫：取1～10mgN位吗啡-牛血清白蛋白复合抗 原，用生理盐水稀释成0.5mL，再与等量的完全福氏佐剂混合，经腹腔免疫Balb/C 小鼠，2周后再用同量N位吗啡-牛血清白蛋白复合抗原与等量不完全福氏佐剂混合，加 强免疫，2周后再加强免疫一次，第二次加强免疫后2周即可考虑作细胞融合，融合前 3天，直接用1-5mg N位吗啡-牛血清白蛋白复合抗原脾内追加免疫一次，②细胞融 合：细胞融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，培养至对数生长期，融合前一天取饲养 细胞铺96孔细胞培养板，细胞融合当天，收集SP2/0细胞，取脾细胞，用50％聚 乙二醇融合，置于铺有饲养细胞的培养板中培养，第15天取上清筛选杂交瘤，③阳性 抗吗啡单克隆抗体的筛选：包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将N位吗 啡-鸡卵清白蛋白复合物稀释至1～10μg/mL，包被96孔酶标板，100μL/ 孔，4℃过夜，然后弃去孔内的液体，用生理盐水-吐温洗涤缓冲液洗3次，拍干，加样： 将有克隆生长的培养上清按顺序加入，100μL/孔，37℃温育1小时，洗涤3次， 甩干，加二抗：用吐温洗涤液稀释辣根酶标羊抗鼠，100μL/孔，置37℃温育一小 时；洗涤、拍干，显色：加新配制的底物工作液100μL/孔，37℃温育10～30 分钟，终止反应：每孔加2M H2SO4终止液50μL，结果判断：阴性对照孔无色，阳 性对照孔明确显色，测定OD值，以空白对照孔调零，OD值大于或等于阴性对照2.1倍即 为阳性，对其中阳性的上清再作游离吗啡的阻断实验，筛选出特异阳性细胞，及时扩大、 冻存、转种并进行有限稀释法纯化，即可获得抗吗啡单克隆抗体的杂交瘤细胞株，(2)接种 杂交瘤细胞：在接种杂交瘤细胞前1周，先给Balb/C小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡； 将抗吗啡单克隆抗体杂交瘤细胞数调至1×106-2×106/mL，每只小鼠经腹腔 注射0.5mL；(3)采集腹水：接种杂交瘤细胞后第10天，用注射器抽取腹水，300 g离心15分钟，收集上清，即得抗吗啡单克隆抗体；
抗3位吗啡多克隆抗体是这样制备的：将6个月左右，体重2.5kg的健康家兔，每 足注射0.1-1mL 3位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏完全佐剂乳化的抗原，两周 后加强免疫，用同剂量3位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏不完全佐剂乳化进行第二、 三、四次加强免疫，每次加强免疫后的第5天耳静脉取血，用琼脂双扩散法检测免疫应答 效果，当滴度达到1∶64以上时，颈动脉放血，离心，收集血清；
抗6位吗啡多克隆抗体是这样制备的：将6个月左右，体重2.5kg的健康家兔，每足 注射0.1-1mL 6位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏完全佐剂乳化的抗原，两周后 加强免疫，用同剂量6位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏不完全佐剂乳化进行第二、三、 四次加强免疫，每次加强免疫后的第5天耳静脉取血，用琼脂双扩散法检测免疫应答效果， 当滴度达到1∶64以上时，颈动脉放血，离心，收集血清。
免疫亲和层析固定相是这样制备的：
N位吗啡-S epharose 4B的制备：取活化的S epharose 4B 20-50mL，加入由 权利要求2中制备的吗啡蛋白质复合物50-100mg，用碳酸盐调pH＝8.0-1 2.0，搅拌3小时，然后取0.2-1.0克硼氢化钾溶于20-40mL水，搅拌下加入 反应体系中，反应5小时，即得N位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相；
3位吗啡-S epharose 4B和6位吗啡-S epharose 4B的制备：取活化的S epharo se 4B 40-80mL，调pH8.0-12.0，搅拌3小时，然后取0.5-2.0克硼 氢化钾溶于40mL水，搅拌下加入反应体系，pH维持在6.0～8.0，反应5小时， 用蒸馏水洗涤后，平分为两份，一份加入权利要求2中制备的3-羧甲基吗啡50-10 0mg，另一份加入权利要求2中制备的6-琥珀酰吗啡60-100mg，调pH至3-7， 再分别加入碳二亚胺50-200mg，室温反应3小时，即分别得到3位吗啡-S epharos e 4B免疫亲和层析固定相和6位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相；
以上得到三种吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相，分别是N位吗啡-S ephar ose 4B、3位吗啡-S epharose 4B和6位吗啡-S epharose 4B。
免疫亲和纯化多克隆抗体和单克隆抗体，及交叉纯化多克隆抗体是这样进行的：
①抗N位吗啡单克隆抗体和抗3位吗啡和6位吗啡多克隆抗体的预处理：将1- 10mL血清或腹水用磷酸缓冲液稀释一倍，经0.22μm微孔膜过滤，4℃、1000 0g离心；
②辛酸-硫酸铵法纯化：向1-10毫升预处理的抗血清或腹水中加入2-10毫升 0.06M pH4.0的乙酸缓冲液，调pH至4.8，于搅拌下30分钟内缓慢加入辛酸3 3-300μL，4℃静置2小时，15000g、4℃离心30分钟，弃沉淀，上清加 入1/10体积的0.1M pH7.4磷酸缓冲液，调pH至7.4，30分钟内加入饱 和硫酸铵，使成45％饱和度，静置1小时，4℃下10000g离心30分钟，沉淀溶 于1/2量pH7.4磷酸盐缓冲液中，对上述缓冲液透析，4℃下10000g离心30 分钟，-20℃保存；
③免疫亲和层析纯化单克隆抗体和多克隆抗体及交叉纯化多克隆抗体：将经辛酸-硫 酸铵纯化的抗体用上述制备的与之对应的N位、3位及6位吗啡-S epharose 4B免疫亲和 色谱固定相25cm*2cm作免疫亲和层析纯化，色谱柱均先用0.5M氯化钾-0.01 M pH7.4的磷酸缓冲液平衡，上样后，用0.5M氯化钾-0.01M pH7.4磷酸缓 冲液洗脱杂蛋白，再用0.5M氯化钾-0.1M pH0.5的甲酸洗脱液洗脱抗体峰，得纯 化抗体，用于标记，其中抗N位吗啡单克隆抗体纯化用N位吗啡-S epharose 4B免疫亲和 色谱固定相纯化；抗3位吗啡多克隆抗体纯化先用3位吗啡-S epharose 4B免疫亲和色谱 固定相纯化，收集的抗体峰再用6位吗啡-S epharose 4B免疫亲和色谱固定相进行交叉纯 化，收集既能识别3位衍生吗啡又能识别6位衍生吗啡的抗体；而抗6位吗啡多克隆抗体 则先用6位吗啡-S epharose 4B免疫亲和色谱固定相纯化，收集的抗体峰再用3位吗啡- S epharose 4B免疫亲和色谱固定相进行交叉纯化，收集既能识别6位衍生吗啡又能识别 3位衍生吗啡的抗体。
胶体金标记抗3位吗啡和6位吗啡多克隆抗体和抗N位吗啡单克隆抗体复合物是这 样制备的：
取0.01％四氯金酸水溶液200mL，加热至沸腾，加入8mL 1％柠檬酸三钠 水溶液，煮沸5分钟，出现橙红色，胶体金颗粒直径由电镜测定为20nm；
各取50mL胶体金三份，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将三份金溶 胶分别与免疫亲和纯化的抗3位吗啡多克隆抗体和抗6位吗啡多克隆抗体及抗N位吗啡 单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇20M水溶液，使最终浓度为0.05％；
将粗制品6000g离心45分钟，离心后，沉淀物用生理盐水混悬至1.5mL，4 ℃保存；
将按上述方法制备的胶体金标记的以1∶5混合的两类多克隆抗体及单克隆抗体分别 分散在厚度1mm的三张玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
免疫层析试纸的层析膜是这样制备的：
将硝酸纤维素膜按25×100mm的尺寸剪裁A、B两块。将经生理盐水缓冲液充分 透析、浓度调整为0.02mg/mL N位吗啡-鸡卵清白蛋白溶液在A膜上每隔2mm等距离 喷涂5条带；再将按1∶5混合的0.05mg/mL的3位、6位吗啡-鸡卵清白蛋白经生 理盐水缓冲液充分透析后在B膜上每2mm等距离喷涂5条带，然后再在A、B膜的末端各 喷涂一条羊抗鼠和羊抗兔的混合带，室温干燥30分钟，将膜置于含1％牛血清白蛋白的 生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分，于37℃孵育30分钟，置室温下干燥处密封 贮藏。
双面免疫层析试纸的组装是这样进行的：
取一块尺寸为80mm×100mm，厚度约0.8mm的硬质塑料底板，分别在其正反两面 粘贴25mm×100mmA膜和B膜及5mm×100mm冻干金标单抗和混合多抗，再在两面 的两端顺次粘贴250mm×100mm吸水纸，其中在A膜的下游紧邻贴上的是冻干的胶体 金标记的单克隆抗体而在B膜的下游紧邻贴上的是冻干的胶体金标记的多克隆抗体，再按 纵向切成宽度4mm的条状，最后用铝泊袋干燥封装。
本发明所述的制作方法的优点在于：用其制作的免疫层析试纸是一种半定量同时检测 尿样中游离吗啡和总吗啡的免疫层析试纸。使用这种试纸可快速、简便地得出准确的检测 结果，并能最大限度地避免假阴性。
本发明使用的生物材料“已于2000年4月26日交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)保藏；其地址为北京中关村，保藏偏号为CGMCCNO.0448，分类命名为I C4单克隆抗体杂交瘤。

下面对本发明所述制作方法的每一步骤作详细说明
本发明所述制作方法的第1步，其中：
N位吗啡-蛋白质复合物是这样制备的：将1克吗啡，5.5克氯甲酸甲酯和4.2克碳 酸氢钠溶于50mL氯仿中，回流20小时，过滤，氯仿洗净，合并滤液，用无水硫酸钠 干燥，减压蒸馏得1.47克中间产物，然后加入1mL 97％的肼，再加入2mL 97 ％的肼，再加入4mL 64％的肼，回流63小时，冷至室温，过滤，依次用水、丙酮和 氯仿洗涤，得到0.5克降吗啡，其熔点为272℃-274℃。取0.5克降吗啡、0. 8克4-溴丁基邻苯二甲酰亚胺和0.3克无水碳酸钠，溶于12mL二甲基甲酰胺中， 回流2小时，然后减压、滤除固体碳酸钠，蒸除溶剂后，加入90％水合肼10mL，1 mL烯丙醇，回流1小时，然后过硅胶柱纯化收集4-氨基丁基吗啡0.4克；取4-氨 基丁基吗啡100mg溶于10mL水，加入牛血清白蛋白100mg，将pH调到5.5， 再加入100-500mg碳二亚胺，反应4小时，然后透析，冷冻干燥，得到N位吗啡- 牛血清白蛋白复合物。
同上法，用鸡卵清白蛋白替代牛血清白蛋白得到N位吗啡-鸡卵清白蛋白复合物。
3位吗啡-蛋白质复合物是这样制备的：将1克吗啡溶于10mL二甲基亚砜中，加 入氢氧化钾5克，搅拌5分钟，再加入溴乙酸1克，继续搅拌2小时，然后倒入100 mL的冰水中，过滤除去不溶物，其水溶液用2M盐酸酸化至pH≈5左右，收集固体， 洗涤，干燥得到3位羧甲基吗啡0.8克，经无水乙醇重结晶，得到0.5克产物，其熔点 为292℃～293℃。
取0.5克羧甲基吗啡溶于50mL二氧六环中，加入0.2mL氯甲酸异丁酯和0.4 mL三丁胺，混合搅拌30分钟，得溶液A；称取牛血清白蛋白0.5克，溶于100m L水中，加100mL二氧六环，用氢氧化钠调节pH至8.5，冰水浴至5℃左右，得 溶液B。将溶液A上清缓慢加入到溶液B中，然后补加二氧六环50mL，在5℃下搅拌 4小时，减压浓缩至20～30mL，装入透析袋对生理盐水透析48小时，其间换水3～ 5次。然后冰冻干燥，得到3位吗啡-牛血清白蛋白复合物。
同上，用鸡卵清白蛋白替代牛血清白蛋白，即可得到3位吗啡·鸡卵清白蛋白复合物。
6位吗啡-蛋白质复合物是这样制备的：将1.3克吗啡溶于20mL苯中，加入1. 3克琥珀酸酐，加热回流2小时，再补加1.3克琥珀酸酐，继续回流1小时，反应结束 后冷却到室温，弃上清，固体剩余物溶于10mL水中，用2M盐酸调pH等于2，过 滤，滤液用2.5M氢氧化钠调pH等于9，过滤，滤液再调pH等于5，过滤，收集固 体，干燥，得到琥珀酰吗啡1.0克；取0.129克琥珀酰吗啡溶于8.5mL二氧六环中， 加入33μl氯甲酸异丁酯，66μl三丁胺，在室温下搅拌30分钟，得到A液，同时 称取0.17克牛血清白蛋白液溶于35mL水中，缓慢加入35mL二氧六环，加完后 调pH为8.5，冷却至4℃，得到B液。然后将A清液，缓慢加到B液中，再加入8.5 mL水，放入冰箱过夜；减压40℃蒸馏浓缩上述溶液至17mL，透析，换液3次，冷 冻，干燥得到6位吗啡-牛血清白蛋白复合物。
同上法，用鸡卵清白蛋白代替牛清白蛋白，得到6位吗啡-鸡卵清白蛋白复合物。
本发明所述制作方法的第2步，其中：
抗吗啡单克隆抗体细胞株和抗吗啡单克隆抗体是这样建立和制备的：(1)分泌抗吗 啡单克隆抗体的细胞株的建立，①动物免疫：取10mgN位吗啡-牛血清白蛋白复合抗原， 用生理盐水稀释成0.5mL，再与等量的完全福氏佐剂混合，充分乳化，经腹腔初次免 疫8周龄雌性Balb/C小鼠，2周后再用10mgN位吗啡-牛血清白蛋白复合抗原以生理 盐水稀释成0.5mL，与等量的不完全福氏佐剂混合，充分乳化，加强免疫，2周后再 加强一次。第二次加强免疫后2周即可考虑作细胞融合，融合前3天，直接用5mgN位吗 啡-牛血清白蛋白复合抗原脾内追加免疫一次。②细胞融合：细胞融合前一周复苏SP 2/0骨髓瘤细胞，培养至对数生长期，供融合用。融合前一天取饲养细胞铺96孔细胞 培养板。细胞融合当天，收集SP2/0细胞，取脾细胞，用50％聚乙二醇融合，置于 铺有饲养细胞的培养板中培养，第15天取上清筛选杂交瘤。③阳性抗吗啡单克隆抗体 的筛选：包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化的用于筛选的N位吗 啡-鸡卵清白蛋白复合物稀释至10μg/mL包被96孔酶标板，100μL/孔，4 ℃过夜，然后弃去孔内的液体，同时用的生理盐水-吐温洗涤缓冲液洗3次，拍干。加样： 将有克隆生长的培养上清按顺序加入，100μL/孔，每块板应同时设空白对照、阴性 对照和阳性对照各二孔。37℃温浴1小时，洗涤3次，每次5分钟，甩干。加二抗：先 用生理盐水洗涤缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠酶标二抗，再100μL/孔， 置37℃温浴一小时；然后洗涤、拍干。显色：加新配制的底物工作液100μL/孔， 37℃温浴10～30分钟。终止反应：每孔加2M H2SO4终止液50μL。结果判断： 阴性对照孔无色，阳性对照孔明确显色，于白色背景直接用肉眼观察结果，根据颜色深浅， 以“+”、“-”标明结果。测定OD值，以空白对照孔调零，OD值大于或等于阴性对照2. 1倍即为阳性。对其中阳性的上清再作游离吗啡的阻断实验，挑出特异阳性细胞，及时扩 大、冻存、转种并进行有限稀释法纯化，即可获得抗吗啡单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(2) 接种杂交瘤细胞：在接种杂交瘤细胞前1周，先给Balb/C小鼠腹腔注射0.5mL液体 石蜡；将抗吗啡单克隆抗体杂交瘤细胞数调至1～2×106/mL，每只小鼠经腹腔注 射0.5mL；(3)采集腹水：接种杂交瘤细胞后第10天，用注射器抽取腹水，300g 离心15分钟，收集上清，即得抗吗啡单克隆抗体。
抗3位吗啡多克隆抗体是这样制备的：取6个月左右，体重2.5kg的健康家兔。初 次免疫时每足注射0.5mL3位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏完全佐剂乳化的抗 原，两周后进行第一次加强免疫，用0.5mL3位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏不 完全佐剂乳化的抗原注射于四肢肘窝处，同剂量于背部、肩关节和髋关节等部位进行第二、 三、四次加强免疫。每次加强免疫后的第5天耳静脉取血用琼脂双扩散法检测免疫应答效 果决定放血的时间，当滴度达到1∶64以上时，颈动脉放血，离心，收集血清。
抗6位吗啡多克隆抗体是这样制备的：取6个月左右，体重2.5kg的健康家兔。初次 免疫时每足注射0.5mL 6位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏完全佐剂乳化的抗原， 两周后进行第一次加强免疫，用0.5mL 6位吗啡-牛血清白蛋白复合物与福氏不完全 佐剂乳化的抗原注射于四肢肘窝处，同剂量于背部、肩关节和髋关节等部位进行第二、三、 四次加强免疫。每次加强免疫后的第5天耳静脉取血用琼脂双扩散法检测免疫应答效果决 定放血的时间，当滴度达到1∶64以上时，颈动脉放血，离心，收集血清。
本发明所述制作方法的第3步，其中所述免疫亲和层析固定相是这样制备的：
N位吗啡-S epharose 4B的制备：取活化的S epharose 4B 20mL，加入由权利要 求2中制备的4-氨基丁基吗啡50mg，用5％碳酸钾调pH≈8.0，缓慢搅拌3小时， 然后取0.27克硼氢化钾溶于20mL水，缓慢搅拌下加入到上述反应体系中，反应5 小时，然后用蒸馏水反复洗涤5次，即为N位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相。
3位吗啡-S epharose 4B和6位吗啡-S epharose 4B的制备：取活化的S epharo se 4B 40mL，加入3mL乙二胺，调pH8.0，搅拌3小时，然后取0.54克硼 氢化钾溶于20mL水，缓慢搅拌下加入到上述的反应体系中，反应5小时，pH维持 在6.5～7.5之间，用蒸馏水反复洗涤5次，然后平分为两份，一份加入权利要求2中 制备的3-羧甲基吗啡50mg，另一份加入权利要求2中制备的6-琥珀酰吗啡60mg， 均轻搅混匀，调pH至5.5，再分别加入碳二亚胺100-500mg，室温反应3小时， 再用蒸馏水反复洗涤5次，即分别得到3位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相和6 位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相。
以上得到三种吗啡S epharose 4B免疫亲和层析固定相，分别是N位吗啡-S ephar ose 4B、3位吗啡-S epharose 4B和6位吗啡-S epharose 4B。
本发明所述制作方法的第4步，其中所述免疫亲和纯化单克隆抗体和多克隆抗体及多 克隆抗体的交叉纯化是这样进行的：
①对上述抗N位吗啡单克隆抗体和抗3位吗啡和6位吗啡多克隆抗体进行预处理： 将1.5mL血清或1mL腹水用生理盐水稀释一倍后，用0.22μm孔径的微孔膜过滤， 再4℃、10000g，15分钟除去细胞残渣以及小颗粒物质；
②辛酸-硫酸铵法纯化：向一份预处理的抗腹水或血清中加入2份0.06M pH4. 0的乙酸缓冲液，用0.1M的盐酸调pH至4.8，于室温搅拌下在30分钟内逐滴缓慢 加入辛酸，每毫升抗血清或腹水加33μL，4℃静置2小时，15000g、4℃离心 30分钟，弃沉淀。上清加入生理盐水，用1M的氢氧化钠调pH至7.4，在4℃下于 30分钟内加入饱和的硫酸铵，使成45％饱和度，静置1小时，4℃下10000g离 心30分钟，弃上清，沉淀溶于1/2量pH7.4含137mM氯化钠、2.6mM氯化钾 的生理盐水中，对100倍的上述生理盐水于4℃透析过夜。4℃下10000g离心3 0分钟，除去不溶性沉渣，分装，-20℃保存；
③免疫亲和纯化单克隆抗体和多克隆抗体及多克隆抗体的交叉纯化：将经辛酸-硫酸 铵纯化的抗体采用上述制备的与之对应的N位、3位及6位吗啡-S epharose 4B免疫亲和 层析固定相25cm×2cm作免疫亲和层析纯化，层析柱均先用0.5M氯化钾-0.01M pH7.0的生理盐水缓冲液平衡，基线平直后，上待纯化的抗体样品，然后0.5M氯化 钾-0.01M pH7.0的生理盐水缓冲液洗脱除去杂蛋白，再用0.5M氯化钾-0.1M pH0.5的甲酸洗脱液洗脱，收集抗体峰，得纯化的抗体，用于标记。其中抗N位吗啡 单克隆抗体纯化用N位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相；抗3位吗啡多克隆抗体 纯化先用3位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相，收集的抗体峰再用6位吗啡-Se pharose 4B免疫亲和层析固定相进行交叉纯化收集既能识别3位衍生吗啡又能识别6位 衍生吗啡的抗体；而抗6位吗啡多克隆抗体纯化则先用6位吗啡-S epharose 4B免疫亲和 层析固定相，收集的抗体峰再用3位吗啡-S epharose 4B免疫亲和层析固定相进行交叉纯 化收集既能识别6位衍生吗啡又能识别3位衍生吗啡的抗体。
本发明所述制作方法的第5步，其中所述胶体金标记吗啡多克隆抗体和单克隆抗体复 合物是这样制备的：
取0.01％四氯金酸水溶液200mL，加热至沸腾，加入8mL 1％柠檬酸三钠 水溶液，煮沸约5分钟后出现橙红色。胶体金颗粒直径由电镜测定，颗粒直径为20nm；
各取50mL胶体金三份，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将三份金溶 胶分别与免疫亲和纯化抗3位吗啡多克隆抗体和抗6位吗啡多克隆抗体及抗N位吗啡单 克隆抗体混合，再加入聚乙二醇20,000水溶液，使最终浓度为0.05％；
将粗制品先4℃6000g高速离心45分钟，除去游离的未结合的蛋白及未充分稳 定的金颗粒和凝集物，离心后，小心吸出上清液，沉淀物用生理盐水混悬，反复离心2次， 再用生理盐水混悬至1.5mL，4℃保存；
将按上述方法制备的胶体金标记的以1∶5混合的两类多克隆抗体及单克隆抗体分别 分散在厚度1mm的三张玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
本发明所述的制作方法第6步，其中所述用于免疫层析试纸的层析膜是这样制备的：
将硝酸纤维素膜按25mm×100mm的尺寸剪裁A、B两块。将经生理盐水缓冲液充 分透析、浓度调整为0.02mg/mL N位吗啡-鸡卵清白蛋白溶液在A膜上每隔2mm等距 离喷涂5条带；，再将按1∶5混合的0.05mg/mL的3位、6位吗啡-鸡卵清白蛋白经 生理盐水缓冲液充分透析后在B膜上每2mm等距离喷涂5条带，然后再在A、B膜的末端 各喷涂一条羊抗鼠和羊抗兔的混合带，室温干燥30分钟，再将膜置于含1％牛血清白蛋 白的生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分于37℃蒸发，置室温下密封干燥处贮藏。
本发明所述制作方法的第7步，其中所述双面免疫层析试纸的组装是这样进行的：
取一块尺寸为80mm×100mm厚度约0.8mm的硬质塑料底板，分别在其正反两面粘 贴25mm×100mmA膜和B膜及在A膜所在面粘贴5mm×100mm冻干金标单抗和在B 膜所在面粘贴5mm×100mm混合多抗，再在两面的两端顺次粘贴250mm×100mm吸 水纸，其中在A膜的下游紧邻贴上的是冻干的胶体金标记的单克隆抗体而在B膜的下游紧 邻贴上的是冻干的胶体金标记的多克隆抗体，再按纵向切成宽度4mm的条状，最后用铝泊 袋干燥封装。
下面说明用本试纸条检测用健康人的尿稀释的标准吗啡的情形：
将用本发明所述的制作方法第7步组装的半定量同时检测尿样中游离吗啡和总吗啡 的双面免疫层析试纸从铝泊袋中取出，垂直插入用健康人尿稀释的300ng/mL，500 ng/mL，1μg/mL，3μg/mL，10μg/mL标准吗啡溶液中，插入深度不得超过吸 水纸上沿，10秒钟后从尿液中取出，垂直放置，5分钟后用检查试纸条的正反两面的条 带数目。当尿液中游离吗啡浓度为0ng/mL或小于300ng/mL时，除A、B两面均出 现质控线外，还各出5条红色的检测线。当尿液中游离吗啡浓度为大于300ng/mL而小 于500ng/mL时，除出现质控线外，还均出现4条检测线；当尿液中游离吗啡浓度为大 于500ng/mL而小于1μg/mL时，除出现质控线外，还出现3条检测线；当尿液中游 离吗啡浓度为大于1μg/mL而小于3μg/mL时，除出现质控线外，还出现2条检测线； 当尿液中游离吗啡浓度大于3μg/mL而小于10μg/mL时，除出现质控线外，还出 现1条检测线；当尿液中游离吗啡浓度大于10μg/mL时，只出现质控线，而不出现 检测线。
游离吗啡浓度(M游离)          A、B两面检测线数目    A、B两面质控线数目
          M游离＜300ng/ml    5×2                  2(均有)
300ng/ml≤M游离＜500ng/ml    4×2                  2(均有)
500ng/ml≤M游离＜1μg/ml     3×2                  2(均有)
1μg/ml≤M游离＜3μg/ml      2×2                  2(均有)
3μg/ml≤M游离＜10μg/ml     1×2                  2(均有)
10μg/ml≤M游离              0                     2(均有)
下面说明如何使用GC-MS确定尿样中吗啡总浓度：
将检测尿样分成各10mL，同时取正常尿80mL分成八等份，一份作空白对照， 其他的添加1μl、2μl、4μl、8μl、16μl和32μl、64μl的1mg/mL吗啡， 降吗啡作内标，均加入浓盐酸1mL，封口，用15磅蒸气水解1小时，冷却后，加入6 mL氯仿提取，弃去氯仿，水中加入12M氢氧化钠溶液1mL，用碳酸钠溶液调pH至 9.0，加氯仿-异丙醇(9∶1)10mL提取，离心分离，有机物于55℃水浴中氮 气流下吹干，残渣加入醋酐和吡啶各0.2mL，加盖，50℃水浴反应30分钟，氮气 流吹干，残渣加入30μl氯仿溶解，取1μl溶液进样，每个样重复三次。
GC-MS条件为：仪器为HP5890A气带色谱仪和HP质量选择检测器，HP -1毛细管柱(25m×0.2mm)，载气为氦气，柱头压为5psi，柱温为270度，进 样温度为250度。
同上重复3次实验，推算尿样中总吗啡浓度，取浓度最高尿样作为总吗啡标样，并经 氮气浓缩再用正常人尿稀释成10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、 0.3μg/mL等5个梯度供调整和检测用。
下面说明用本试纸条检测用健康人的尿稀释的总吗啡的情形：
按如下方法检测阳性人尿配制的总吗啡：将组装的半定量同时检测尿样中游离吗啡和 总吗啡的双面免疫层析试纸从铝泊袋中取出，垂直插入用已知浓度的阳性人尿配制的总吗 啡溶液中，插入深度不超过吸水线上方的标线，5秒钟后从尿液中取出，垂直穿挂起来， 5分钟后肉眼观察试条的正反两面的条带数目，质控线均出现。当尿液中总吗啡浓度小于 300mg/mL时，A、B两面均各出现5条带。当尿液中总吗啡浓度大于300ng/mL， 小于500ng/mL时，A面仍出现5条带，B面出现4条带。当尿液中总吗啡浓度大于5 00ng/mL，小于1μg/mL时，A面仍出现5条带，B面出现3条带。当尿液中总吗 啡浓度大于1μg/mL，小于3μg/mL时，A面出现5条带，B面出现2条带。当尿液 中总吗啡浓度大于3μg/mL而小于10μg/mL时，A面出现3条带，B面出现1带。 当尿液中总吗啡浓度大于10μg/mL时，A面出现2条带，B面只有质控线，不出现检测 带。
总吗啡浓度(M总)            A面检测线数     B面检测线数      质控线
          M总≤300ng/ml    5               5                2(均有)
300ng/ml≤M总＜1μg/ml     4               3                2(均有)
1μg/ml≤M总＜3μg/ml     4        2        2(均有)
3μg/ml≤M总＜10μg/ml    3        1        2(均有)
10μg/ml≤M总202(均有)
下面说明通过检测健康人尿配制的各种药物，如何判定交叉反应性：
将各种药物用健康人尿配制成10mg/mL的标准液，然后用本发明制作方法第6步中 所述的操作方法观察结果如下表：
标准品名称    浓度       A面检测带数      B面检测带数      质控线
海洛因        10mg/ml    5                0                2
类似物M1     10mg/ml    5                0                2
类似物M2     10mg/ml    5                0                2
盐酸罂粟碱    10mg/ml    5                5                2
那可丁        10mg/ml    5                5                2
磷酸可待因    10mg/ml    5                0                2
盐酸可卡因    10mg/ml    5                5                2
硫酸安非他明  10mg/ml    5                5                2
盐酸倍他司丁  10mg/ml    5                5                2
盐酸麻黄碱    10mg/ml    5                5                2
注：类似物M1为O-单乙酰吗啡氨基磺酸盐；类似物M1为O-单乙酰吗啡盐酸盐
对总吗啡测定有交叉反应性的4种类似物作展开试验，以观察这4种类似物的合适浓 度，结果见下表：
类似物的浓度     A面检测带条数    B面检测带条数
0.3μg/ml        5                4
0.5μg/ml        5                3
1.0μg/ml        5                2
3.0μg/ml        5                1
10μg/ml         5                0
0.3μg/ml        5                4
0.5μg/ml        5                3
1.0μg/ml        5                2
3.0μg/ml        5                1
10μg/ml         5                0
0.3μg/ml        5                4
0.5μg/ml        5                3
1.0μg/ml        5                2
3.0μg/ml        5                1
10μg/ml         5                0
0.3μg/ml    5                4
0.5μg/ml    5                3
1.0μg/ml    5                2
3.0μg/ml    5                1
10μg/ml     5                0 注：第一栏为O3-单乙酰吗啡氨基磺酸盐；第二栏为O6-单乙酰吗啡盐酸盐；
第三栏为海洛因；第四栏为磷酸可待因
下面说明本试纸检测结果与GC/MS检测结果一致性：
检测实际尿样，并与GC/MS检测结果进行对照。其中阳性尿样来源于某戒毒所， 阴性尿样来源于自愿正常人，结果如下表：
尿样   GC/MS   试        纸        检         测       结      果
编号   结果    A面带数    吗啡浓度M游     B面带数    总吗啡浓度M总
1      10.30   1+21       ≤M游＜3.0       1+0        10≤M总
2      0.61    1+5        M游＜0.3         1+3        0.5≤M总＜1.0
3      0.25    1+5        M游＜0.3         1+5        M总＜0.3
4      5.12    1+2        1.0≤M游＜3.0    1+1        3.0≤M总＜10
5      3.70    1+3        0.5≤M游＜1.0    1+1        3.0≤M总＜10
6      0.80    1+5        M游＜0.3         1+2        0.5≤M总＜1.0
7      2.53    1+3        0.5≤M游＜1.0    1+2        1.0≤M总＜3.0
8      1.80    1+3        0.5≤M游＜1.0    1+2        1.0≤M总＜3.0
9      2.36    1+3        0.5≤M游＜1.0    1+2        1.0≤M总＜3.0
10     2.90    1+3        0.5≤M游＜1.0    1+2        1.0≤M总＜3.0
11     4.80    1+2        1.0≤M游＜3.0    1+1        3.0≤M总＜10
阴样5个0       1+5        M游＜0.3         1+5        M总＜0.3
通过对照说明试纸检测结果与GC/MS检测结果基本一致。
下面说明本层析试纸试条的贮藏稳定性是如何确定的：
取某批生产的试条300条，置保干器中，室温放置。每隔一段时间取出若干条检查 试纸条的稳定性。检测样品为：5个正常人尿稀释的已知浓度的标准吗啡(0.05、0. 2、0.8、2.4、7.0μg/mL)和5个阳性尿液配制的已知浓度总吗啡(0.05、 0.2、0.8、2.4、7.0μg/mL)及1个阴性，每个样品重复三次，结果发现该试 条在室温干燥保存一年内均稳定。