一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及其应用
阅读：1037发布：2020-12-19
专利汇可以提供一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了提供一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆 抗体 的制备方法及其应用，由此制备抗白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体，用于检测白色念珠菌烯醇化酶蛋白。 配对 的单克隆抗体可特异性的与白色念珠菌烯醇化酶蛋白反应，与其它主要的念珠菌病原烯醇化酶无交叉反应，因此可以应用于白色念珠菌的鉴定。配对的单克隆抗体可以扩展应用至其他基于 抗原 抗体反应的免疫学检测技术，包括 免疫层析 胶体金、 化学发光 定量检测等，与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有 稳定性 好、易于标准化的优点，更适合用来建立商品化的标准检测方法。，下面是一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于：以白色念珠菌烯醇化酶蛋白免疫BALb/C小鼠制备并筛选杂交瘤细胞株，制备腹水并纯化单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
1)切胶法制备白色念珠菌免疫原；
2)动物免疫；
3)ELISA法测定免疫动物血清效价；
4)免疫脾细胞的制备；
5)细胞融合；
6)杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)及腹水制备；
7)高分泌特异性的阳性克隆细胞筛选。
3.根据权利要求2所述的抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1)为，以液氮研磨法制备白色念珠菌全菌蛋白，制备得到的白色念珠菌全株蛋白采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PADE)后切取分子量大小约为48kD的胶条，胶条中的蛋白经电洗脱后以二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。
4.根据权利要求2所述的抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤2)为，首次基础免疫采用切胶法制备的白色念珠菌免疫原蛋白(主要为烯醇化酶)0.4ml(1mg/ml)与等量弗氏完全佐剂充分混合乳化，采用腹腔注射免疫BALb/C小鼠两只，每只小鼠0.2ml(蛋白量200ug)；两周后，用弗氏不完全佐剂0.2ml与等量免疫原蛋白充分混合乳化，腹腔注射两只小鼠进行第二次免疫，每只小鼠0.1ml(蛋白量100ug)；免疫5天后，以间接ELISA法分别测定两只小鼠抗体效价；第三次免疫(加强免疫)不用佐剂，采用
0.1ml免疫原蛋白(100ug)脾内注射免疫抗体效价较高的小鼠；免疫三次以后测定小鼠血清效价，效价达1:100000以上时供融合使用，如效价达不到上述指标，则增加一次加强免疫。
5.根据权利要求2所述的抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤7)为，首先，依据抗体分泌情况筛选出抗体分泌高的孔，将孔中细胞用有限稀释法克隆化；其次，用ELISA法检测抗体与抗原反应的特异性(此时包被抗原采用重组烯醇化酶抗原)，并以蛋白印记法(western-blot法)验证，分泌的抗体可特异性结合重组烯醇化酶蛋白，与白色念珠菌全菌蛋白有且只有一条48kD左右的反应条带，以此筛选出高分泌特异性的阳性克隆细胞扩大培养或液氮保存。
6.权利要求1中制备得到的单克隆抗体在检测白色念珠菌烯醇化酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体在检测白色念珠菌烯醇化酶中的应用，其特征在于：该检测过程采用双抗体一步法ELISA检测白色念珠菌烯醇化酶。
8.根据权利要求6所述的单克隆抗体在检测白色念珠菌烯醇化酶中的应用，其特征在于：该检测过程采用双抗体夹心化学发光法检测白色念珠菌烯醇化酶。
9.权利要求1中制备得到的单克隆抗体在鉴定白色念珠菌中的应用。
一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及
其应用
技术领域
背景技术
[0002] 念珠菌为条件致病性真菌，正常情况下可定植于宿主的皮肤、口腔、上呼吸道、阴道和肠道等部位，不引起疾病。当某些因素如广谱抗生素大量使用、放疗与化疗、免疫抑制剂使用等破坏了宿主免疫系统与念珠菌之间的平衡，念珠菌可侵入组织、血液并生长繁殖，导致宿主的组织损害、器官功能障碍和炎症反应等病理改变，此类感染为侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)，致病菌多为白色念珠菌。
[0003] 临床实验对白色念珠菌的鉴定主要依赖于传统的微生物培养，该方法阳性率低且耗时较长，已不适应现代医学发展的需要。(1,3)-β-D葡聚糖实验又称G实验，目前已在临床上逐渐得到应用，该方法利用真菌细胞壁组分(1,3)-β-D葡聚糖可以激活鲎变形细胞溶解产物G因子的原理诊断真菌感染，其检测效能已经得到多数实验室的肯定。然而，G实验仍有较明显的缺陷，如较高的假阳性率，不能明确真菌的种属，检测极易受致热原的影响等等。
[0004] 烯醇化酶(enolase，eno1)又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸转化，是白色念珠菌糖酵解过程的限速酶。一直以来认为该酶是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白，然而随着分子生物学对有免疫原性蛋白的研究日趋发展，发现该酶是白色念珠菌血清学检测最重要的靶标分子，例如，侵袭性念珠菌感染患者可以观测到烯醇化酶血症。目前，据国内胡毓安等报道，利用抗烯醇化酶单克隆抗体与羊抗烯醇化酶多克隆抗体匹配，建立ELISA方法可检测白色念珠菌培养上清中的烯醇化酶蛋白，该方法与近平滑念珠菌有微弱的交叉反应，与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。
[0005] 上述检测过程采用单克隆-多克隆抗体匹配检测烯醇化酶，根据发明人所进行的资料检索，国内外尚无采用一对单克隆抗体进行白色念珠菌烯醇化酶蛋白的报道。
发明内容
[0006] 为了探讨单克隆抗体检测白色念珠菌烯醇化酶蛋白在白色念珠菌的鉴定中的敏感性和特异性，本发明做了大量临床试验。结果表明，烯醇化酶可以作为白色念珠菌的检测指标，用于鉴定白色念珠菌。
[0007] 本发明的目的在于，提供一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，主要包括如下步骤：
[0008] 1)切胶法制备白色念珠菌免疫原
[0009] 以液氮研磨法制备白色念珠菌全菌蛋白，制备得到的白色念珠菌全株蛋白采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PADE)后切取分子量大小约为48kD的胶条，胶条中的蛋白经电洗脱后以二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度；
[0010] 2)动物免疫
[0011] 取上述制备得到的蛋白溶液注射免疫小鼠，首次基础免疫取步骤1)制备的蛋白液(主要为烯醇化酶)0.4ml(1mg/ml)与等量弗氏完全佐剂充分混合乳化，采用腹腔注射免疫BALb/C小鼠两只，每只小鼠0.2ml(蛋白量200μg)；两周后，用弗氏不完全佐剂0.2ml与等量蛋白液充分混合乳化，腹腔注射两只小鼠进行第二次免疫，每只小鼠0.1ml(蛋白量100μg)；免疫5天后，以间接ELISA法分别测定两只小鼠抗体效价；第三次免疫(加强免疫)不用佐剂，采用0.1ml蛋白液(100μg)脾内注射免疫抗体效价较高的小鼠；免疫三次以后测定小鼠血清效价，效价达1:100000以上时供融合使用，如效价达不到上述指标，则增加一次加强免疫；
[0012] 3)ELISA法测定免疫动物血清效价
[0013] 以白色念珠菌全菌蛋白包被ELISA板孔，小鼠血清稀释1000倍后倍比稀释与包被的白色念珠菌全珠蛋白反应，免疫前的小鼠血清为阴性对照，酶标仪450nm/630nm波长测定OD值，阳性判定标准为：(检测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)≥2.1；
[0014] 4)免疫脾细胞的制备
[0015] 免疫小鼠血清效价达到1:100000以上后，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取出小鼠脾脏，置于细胞筛网中轻轻碾磨，将研磨获得的细胞悬液以筛网过滤；1500r/min离心10min，弃上清，加入2ml红细胞裂解液(0.83％NH4Cl，w/v，pH＝7.2)室温静置15min裂解红细胞；用RPMI-1640培养液1000r/min离心10min洗涤细胞3次；将上述收集到的脾细胞置于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱培养2h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即为脾淋巴细胞；台盼蓝染色计数，确认活细胞数大于95％。
[0016] 5)细胞融合
[0017] 分别吸取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0，骨髓瘤细胞由河北省科学院生物研究所细胞室提供)细胞悬液按1:2混合，置于离心管内充分混匀后离心，弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀流动；取50％聚乙二醇(PEG3000)溶液0.8ml，加入混合细胞液中促进融合，控制作用时间2-3min内，立即加入1640液稀释，使PEG终止作用；400g离心1min收集细胞沉淀，加100ml含有HAT的完全1640液；往已于前一日种有饲养细胞的96孔细胞培养板中滴加融合的细胞液，每孔2滴(约100μL)，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育；第3、6日换入含HAT的完全1640培养液；在每次换液前用倒置显微镜观察，观察细胞生长情况，观察到杂交瘤细胞克隆占显微镜低倍视野(100X)1/2以上时，即可吸取上清液，以间接ELIS法筛选阳性克隆孔，对阳性克隆孔，以有限稀释法进行亚克隆；
[0018] 6)杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)及腹水制备
[0019] 将需要克隆的细胞从培养孔中吸出并作细胞计数，用HT培养液稀释至细胞浓度为50-60/mL；于96孔细胞培养板中加入细胞悬液0.1mL，接种两排，剩余的细胞悬液用HT培养液做倍比稀释，再接种两排，以此类推，直至最后每个细胞培养孔含0.5-1个细胞；培养7-10天后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆，如此重复3-5次，直至达100％阳性孔率，确保抗体由单个克隆产生；细胞培养至覆盖约20％孔底时，吸取培养上清液用ELISA法检测其抗体含量；
[0020] 7)高分泌特异性的阳性克隆细胞筛选
[0021] 首先，依据抗体分泌情况筛选出抗体分泌高的孔，将孔中细胞用有限稀释法克隆化；其次，用ELISA法检测抗体与抗原反应的特异性(此时包被抗原采用重组烯醇化酶抗原)，并以蛋白印记法(western-blot法)验证，分泌的抗体可特异性结合重组烯醇化酶蛋白，与白色念珠菌全菌蛋白有且只有一条48kD左右的反应条带，以此筛选出高分泌特异性的阳性克隆细胞扩大培养或液氮保存。
[0022] 本发明的另一目的在于，提供利用上述抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体检测白色念珠菌烯醇化酶的方法。
[0023] 具体的，本发明筛选到1对配对较好的单克隆抗体。
[0024] 且，本发明公开了上述1对单克隆抗体1)一步法ELISA检测白色念珠菌烯醇化酶方面的应用；2)双抗夹心化学发光法检测白色念珠菌烯醇化酶方面的应用。
[0025] 其中，双单抗一步法检测白色念珠菌烯醇化酶，为用两株针对白色念珠菌烯醇化酶不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测白色念珠菌烯醇化酶，通过标准品制备的标准曲线确定白色念珠菌烯醇化酶的含量。
[0026] 采用双抗夹心化学发光法检测白色念珠菌烯醇化酶，为用两株针对白色念珠菌烯醇化酶不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物发光检测白色念珠菌烯醇化酶，通过标准品制备的标准曲线确定白色念珠菌烯醇化酶的含量。
[0027] 本发明的另一目在于，提供利用上述抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体检测白色念珠菌烯醇化酶的方法鉴定白色念珠菌的方法。
[0028] 与现有技术相比，本发明产生的有益效果是：
[0029] 1)本发明涉及一对单克隆抗体的制备，建立双位点一步法ELISA，用于检测白色念珠菌烯醇化酶蛋白，配对的单克隆抗体可以扩展应用至其他基于抗原抗体反应的免疫学检测技术，包括免疫层析胶体金、化学发光定量检测等。
[0030] 2)本发明通过利用两个单克隆抗体特异性的识别抗原分子中两个不同的抗原决定位点，并与之结合，以确定一个蛋白，与特异性识别一个抗原位点的方法相比较，可以进一步提高检测的特异性和敏感性，同时，不需要考虑抗体结合位点彼此覆盖的问题，建立的双位点一步法ELISA，极大地提高了检测效率，简化了检测流程。
[0031] 3)与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有稳定性好、易于标准化的优点，更适合用来建立商品化的标准检测方法。
具体实施方式
[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步说明：
[0033] 实施例1：一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法
[0034] 1)切胶法制备白色念珠菌免疫原
[0035] 以液氮研磨法制备白色念珠菌全菌蛋白，制备得到的白色念珠菌全株蛋白采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PADE)后切取分子量大小约为48kD的胶条，胶条中的蛋白经电洗脱后以二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度；
[0036] 2)动物免疫
[0037] 取上述制备得到的蛋白溶液注射免疫小鼠，首次基础免疫取蛋白液0.4ml(1mg/ml)与等量弗氏完全佐剂充分混合乳化，采用腹腔注射免疫BALb/C小鼠两只，每只小鼠0.2ml(蛋白量200μg)；两周后，用弗氏不完全佐剂0.2ml与等量蛋白液充分混合乳化，腹腔注射两只小鼠进行第二次免疫，每只小鼠0.1ml(蛋白量100μg)；免疫5天后，以间接ELISA法分别测定两只小鼠抗体效价；第三次免疫(加强免疫)不用佐剂，采用0.1ml蛋白液(100μg)脾内注射免疫抗体效价较高的小鼠；免疫三次以后测定小鼠血清效价，效价达1:100000以上时供融合使用，如效价达不到上述指标，则增加一次加强免疫；
[0038] 3)ELISA法测定免疫动物血清效价
[0039] 以白色念珠菌全菌蛋白包被ELISA板孔，小鼠血清稀释1000倍后倍比稀释与包被的白色念珠菌全珠蛋白反应，免疫前的小鼠血清为阴性对照，酶标仪450nm/630nm波长测定OD值，阳性判定标准为：(检测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)≥2.1；
[0040] 4)免疫脾细胞的制备
[0041] 免疫小鼠血清效价达到1:100000以上后，处死小鼠，分离脾淋巴细胞，分离过程如下：颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取出小鼠脾脏，并将其浸泡于75％乙醇中；培养皿中加入适量无菌PBS，将小鼠脾脏置于100目细胞筛网中轻轻碾磨，将研磨获得的细胞悬液以300目筛网过滤；将得到的细胞悬液置于离心管中，1500r/min离心10min，离心后弃上清，加入2ml红细胞裂解液(0.83％NH4Cl，w/v，pH＝7.2)室温静置15min以裂解红细胞；用RPMI-
1640培养液1000r/min离心10min洗涤细胞3次；将上述收集到的脾细胞置于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱培养2h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即为脾淋巴细胞；台盼蓝染色计数，确认活细胞数大于95％。
1640培养液1000r/min离心10min洗涤细胞3次；将上述收集到的脾细胞置于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱培养2h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即为脾淋巴细胞；台盼蓝染色计数，确认活细胞数大于95％。
[0042] 5)细胞融合
[0043] 分别吸取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0，骨髓瘤细胞由河北省科学院生物研究所细胞室提供)细胞悬液按1:2混合，在PEG3000介导下进行细胞融合，融合过程如下：在50ml沉淀管中混合108脾细胞和2X108小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml无血清1640液，离心洗涤3次，收集沉淀；轻敲管底部，使沉淀流动，将沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度；将加预热至40℃的50％PEG3000溶液(w/v)0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加至沉淀管内，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程约持续2min；加1ml 1640液，边加边摇动，持续1min，重复两次；加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min，重复两次；加1640液15ml，室温，400g离心
1min收集细胞沉淀，加100ml含有HAT的完全1640液；往已于前一日种有饲养细胞的96孔细胞培养板中滴加融合的细胞液，每孔2滴(约100μL)，轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育；第3、6日换入含HAT的完全1640培养液；在每次换液前用倒置显微镜观察细胞生长情况。当杂交瘤细胞克隆占显微镜低倍视野(100X)1/2以上时，吸取上清液，以间接ELISA法筛选阳性克隆孔，对阳性克隆孔，以有限稀释法进行亚克隆；
1min收集细胞沉淀，加100ml含有HAT的完全1640液；往已于前一日种有饲养细胞的96孔细胞培养板中滴加融合的细胞液，每孔2滴(约100μL)，轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育；第3、6日换入含HAT的完全1640培养液；在每次换液前用倒置显微镜观察细胞生长情况。当杂交瘤细胞克隆占显微镜低倍视野(100X)1/2以上时，吸取上清液，以间接ELISA法筛选阳性克隆孔，对阳性克隆孔，以有限稀释法进行亚克隆；
[0044] 6)杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)及腹水制备
[0045] 将需要克隆的细胞从培养孔中吸出并作细胞计数，用HT培养液稀释至细胞浓度为50-60/mL；于96孔细胞培养板中加入细胞悬液0.1mL，接种两排，剩余的细胞悬液用HT培养液做倍比稀释，再接种两排，以此类推，直至最后每个细胞培养孔含0.5-1个细胞；培养7-10天后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆，如此重复3-5次，直至达100％阳性孔率，确保抗体由单个克隆产生；细胞培养至覆盖约20％孔底时，吸取培养上清液用ELISA法检测其抗体含量；
[0046] 7)高分泌特异性的阳性克隆细胞筛选
[0047] 首先，依据抗体分泌情况筛选出抗体分泌高的孔，将孔中细胞用有限稀释法克隆化；其次，用ELISA法检测抗体与抗原反应的特异性(此时包被抗原采用重组烯醇化酶抗原)，并以蛋白印记法(western-blot法)验证，分泌的抗体可特异性结合重组烯醇化酶蛋白，与白色念珠菌全菌蛋白有且只有一条48kD左右的反应条带，以此筛选出高分泌特异性的阳性克隆细胞扩大培养或液氮保存。
[0048] 本发明共获得抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体56株，ELISA结果显示，抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体对抗原具有高度敏感性。以此56株抗体包被空白ELISA板孔，分别两两配对检测重组烯醇化酶，筛选出反应性最好的一对单克隆抗体，分别是9H8和10H8。
[0049] 8)HRP标记的10H8的制备
[0050] 称取5mg HRP溶解于0.5mL蒸馏水中，加入0.5mL新配的0.06mol/L NaIO4溶液，室温避光搅拌20min后置4℃半小时；加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL，混匀后室温放置30分钟；加入1mL 10H8抗体溶液(5mg/mL)，混匀后装入透析袋中，在0.05M，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；在透析过的溶液中加入0.2mL 5mg/mL的NaBH4溶液，4℃静置2小时；加入等体积饱和硫酸铵，4℃静置30分钟后10 000rpm离心10分钟，去除上清后用少许0.02M，pH＝
7.4的PBS缓冲液重新溶解沉淀并对之4℃透析过夜；离心去除不溶物所得即为HRP-10H8溶液，加入0.02M，pH＝7.4的PBS定容至5mL；
7.4的PBS缓冲液重新溶解沉淀并对之4℃透析过夜；离心去除不溶物所得即为HRP-10H8溶液，加入0.02M，pH＝7.4的PBS定容至5mL；
[0051] 9)特异性验证
[0052] 将单克隆抗体9H8用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释至2μg/mL，包被空白酶联板，包被量为100μL/孔，4℃过夜；弃包被液，PBST洗板3次，3min/次；5％BSA(w/v)封闭液，100μl/孔，封板膜封闭，4℃过夜；弃包被液，PBST洗板3次，3min/次；分别加入临床常见的六种念珠菌(白色念珠菌SC5314、光滑念珠菌ATCC15126、近平滑念珠菌ATCC22019、热带念珠菌ATCC1369、克柔念珠菌ATCC6258、季也蒙念珠菌ATCC6260)培养上清，50μl/孔，每种上清做三复孔；每孔加入1：2000稀释的HRP-10H8 50μl，37℃温育45min；弃孔内液体，PBST洗涤液洗板3次，3min/次；每孔加显色剂A、B液各50μl，37℃温育10min后，加终止液50μl，于酶标仪双波长(450nm/630nm)进行测定，读取吸光度(OD)值。
[0053] 结果显示，本发明制备的抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体可特异性的与白色念珠菌培养上清反应，而与其他五种念珠菌无交叉反应，特异性良好。
[0054] 10)敏感性验证
[0055] 本发明涉及一对可特异性的与白色念珠菌烯醇化酶蛋白反应的单克隆抗体，应用于不同的免疫学检测方法，其敏感性亦可能有所不同。以9H8为包被抗体，HRP标记的10H8为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA可稳定检测到浓度低至1ng/ml的重组烯醇化酶蛋白；以这一对单克隆抗体为基础建立的板式化学发光法，可以稳定检测到浓度低至0.015ng/ml的重组烯醇化酶蛋白。
[0056] 实施例2：双抗体一步法ELISA检测白色念珠菌烯醇化酶的应用
[0057] 1)包被：将单克隆抗体9H8以碳酸盐缓冲液(Na2CO3 1.5g/L，NaHCO3 2.9g/L，pH＝9.6)稀释至浓度为3ug/ml,每孔100μl,4℃包被12小时，洗涤除去未结合物；
[0058] 2)配制标准品：用磷酸盐缓冲溶液PBS(KH2PO4 0.27g，Na2HPO4 1.42g，NaCl 8g，KCl 0.2g，pH＝7.4)将重组白色念珠菌烯醇化酶蛋白稀释至最终浓度为0ng/ml，0.5ng/ml，5ng/ml，25ng/ml，100ng/ml；
[0059] 3)加样温育：分别在相应孔中加入待检标本或者标准品50μl，再加入HRP标记单克隆抗体10H8 50μl，37℃温育45min，使待检抗原和固相9H8及HRP-10H8反应形成双抗体夹心复合物，洗涤除去未结合物。
[0060] 4)显色：加入底物37℃避光反应15min；
[0061] 5)测定：每孔加入终止液(2mol/L H2SO4)50μl，震荡混匀，用酶标仪双波长(450nm/600～650nm)检测。
[0062] 检测结果：
[0063] 1)灵敏度：本方法可稳定检测低至1ng的白色念珠菌烯醇化酶蛋白。
[0064] 2)线性范围：0.1-100ng/ml。
[0065] 3)变异系数：采用一定浓度的标准品，连续20此检测后计算CV值为4.1％。
[0066] 4)实验操作可在60～90min左右完成。
[0067] 实施例3：双抗体夹心化学发光法检测白色念珠菌烯醇化酶的应用
[0068] 以白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体9H8包被化学发光微板孔，形成固相抗体，检测时向孔内加入样本品或者标准品，与HRP-10H8反应，形成9H8-白色念珠菌烯醇化酶-HRP-10H8复合物，反应完毕除去未结合的HRP-10H8，加入发光底物，利用HRP催化化学底物发光，检测发光信号强度，发光值强度与样本中白色念珠菌Eno含量成正比。实验使用的酶溶液为HRP标记的10H8，稀释至浓度为0.5ug/mL。标准品为重组白色念珠菌Eno蛋白，分别稀释至
0ng/mL，0.5ng/mL，5ng/mL，25ng/mL，100ng/mL。
0ng/mL，0.5ng/mL，5ng/mL，25ng/mL，100ng/mL。
[0069] 上述反应主要项目参数如表1所示：
[0070] 表1双抗体夹心化学发光法主要项目参数
[0071]
[0072] 检测结果
[0073] 1)灵敏度：数值为0的标准品连续检测16次，检测数值代入标准曲线，求得最低检测限为0.015ng/mL。
[0074] 2)线性范围：将重组白色念珠菌烯醇化酶蛋白作为标准品依次倍比稀释，测得结果在0.01～100ng/mL能成线性。
[0075] 3)变异系数：采用一定浓度的标准品，连续20此检测后计算CV值为2.6％。
[0076] 4)实验操作可在60～90min左右完成。
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