一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用
专利汇可以提供一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于免疫分析和 生物 传感技术领域，提供了一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫 传感器 的制备方法。采用基于 氨 基化 石墨 烯负载金 纳米棒 为基底，海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4为检测 抗体 溶液构建电化学免疫传感器，实现了对卵巢癌标记物的定量检测，具有特异性强，灵敏度高， 检测限 低等优点。对卵巢 疾病 的检测具有重要的科学意义和应用价值。，下面是一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，其特征包括以下几个步骤：
（1）将直径为3.0 5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超~
声清洗干净；
（2）取6.0 µL、0.5 4.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表~
面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、5.0 15.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃~
冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非~
特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、1 nM 50 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0~
磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、1.0 4.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4抗体~
检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 40 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液~
冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测人附睾蛋白4抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
2.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
（1）制备氧化石墨烯
将4.0 g石墨和1.0 g硝酸钠置于2000 mL烧杯中，在冰水浴环境中磁力搅拌下缓慢加入192 mL浓硫酸，随后缓慢加入24.0 g高锰酸钾并剧烈搅拌，冰水浴下反应1 h，然后向该混合物转移至35 ℃油浴锅中反应2 h，升温至55 ℃，反应1.5 h，然后将160 mL去离子水逐滴加入上述混合液并不停地用玻璃棒搅拌，再加入400 mL去离子水，最后将双氧水（20.0 mL，30%）加入混合液中，反应10 min，静置过夜，取下层沉淀透析一周，经超声波分散（140 W，1.0 h），离心（6000 rpm，10 min）收集上清液并冷冻干燥24 h得到氧化石墨烯；
（2）制备氨基化石墨烯分散液
在超声处理下将100.0 mg氧化石墨烯加入到40.0 mL乙二醇中，超声1 h，将1.0 mL浓氨水加入上述溶液中，得到深棕色溶液，随后把混合溶液转移至高压反应釜中，在180 ℃下进行溶剂热反应10 h，反应后，过滤沉淀物，用蒸馏水重复洗涤至中性，冷冻干燥24 h，得到片状氨基化石墨烯固体，再次分散于5.0 mL去离子水中，得到氨基化石墨烯分散液，保存于
4 ℃为进一步使用。
3.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述金纳米棒分散液及氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液的制备，步骤如下：
（1）制备金纳米棒分散液
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20 mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 min，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在
30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL 500 µL金晶种~
溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入5.0 mL 15.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），~
然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
4.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液的制备，步骤如下：
（1）制备金纳米球分散液
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100 µL，10 mM）和1.0 mL 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏~
血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取3.0 8.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲液~
中，加入1.0 2.0 mL、10.0 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温~ ~
振荡培养箱中振荡孵化8 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 1.5 min，得到下层沉~ ~
淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
5.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法的制备，用于人附睾蛋白4抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.84 8.04的磷酸盐缓~
冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间
400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
6.根据权利要求1、2、3、4和5所述的人附睾蛋白4抗原，其特征在于，所述卵巢癌标志物选自下列之一：人附睾蛋白4抗原HE4、糖链抗原CA125。
一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方
法及应用
技术领域
背景技术
发明内容
（1）将直径为3.0 5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超~
声清洗干净；
（2）取6.0 µL、0.5 4.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表~
面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、5.0 15.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃~
冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非~
特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、1 nM 50 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0~
磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、1.0 4.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4抗体~
检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 40 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液~
冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
将4.0 g石墨和1.0 g硝酸钠置于2000 mL烧杯中，在冰水浴环境中磁力搅拌下缓慢加入192 mL浓硫酸，随后缓慢加入24.0 g高锰酸钾并剧烈搅拌，冰水浴下反应1 h，然后向该混合物转移至35 ℃油浴锅中反应2 h，升温至55 ℃，反应1.5 h，然后将160 mL去离子水逐滴加入上述混合液并不停地用玻璃棒搅拌，再加入400 mL去离子水，最后将双氧水（20.0 mL，30%）加入混合液中，反应10 min，静置过夜，取下层沉淀透析一周，经超声波分散（140 W，1.0 h），离心（6000 rpm，10 min）收集上清液并冷冻干燥24 h得到氧化石墨烯；
（2）制备氨基化石墨烯分散液
在超声处理下将100.0 mg氧化石墨烯加入到40.0 mL乙二醇中，超声1 h，将1.0 mL浓氨水加入上述溶液中，得到深棕色溶液，随后把混合溶液转移至高压反应釜中，在180 ℃下进行溶剂热反应10 h，反应后，过滤沉淀物，用蒸馏水重复洗涤至中性，冷冻干燥24 h，得到片状氨基化石墨烯固体，再次分散于5.0 mL去离子水中，得到氨基化石墨烯分散液，保存于
4 ℃为进一步使用。
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20 mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 min，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在
30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL 500 µL金晶种~
溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入5.0 mL 15.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），~
然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100 µL，10 mM）和1.0 mL 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏~
血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取3.0 8.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲液~
中，加入1.0 2.0 mL、10.0 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温~ ~
振荡培养箱中振荡孵化8 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 1.5 min，得到下层沉~ ~
淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间
400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
具体实施方式
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、1.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、2.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、3.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20 mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 mim，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在
30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL 500 µL金晶种~
溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入5.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20 mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 mim，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在
30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL 500 μL金晶种~
溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入10.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20 mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 mim，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在
30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL 500 µL金晶种~
溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入15.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100 µL，10 mM）和1.0 mL 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏~
血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取3.0 8.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸 盐缓冲液~
中，加入1.0 2.0 mL、10.0 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4抗体检测分散液，置于4 ℃恒温~ ~
振荡培养箱中振荡孵化8 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 1.5 min，得到下层沉~ ~
淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5.0 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100 µL，10 mM）和1.0 mL 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏~
血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4抗体检测分散液
取4.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸 盐缓冲液中，加入1.0 2.0 mL、10.0 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡~ ~
培养箱中振荡孵化8 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 1.5 min，得到下层沉淀，加~ ~
入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH =
7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100 µL，10 mM）和1.0 mL 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏~
血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取6.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲液中，加入
1.0 2.0 mL、10.0 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培~ ~
养箱中振荡孵化8 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 1.5 min，得到下层沉淀，加入~ ~
1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH =
7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间
400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流强度与人附睾蛋白4抗原浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得其线性范围为1 pmol/mL 50 nmol/mL，检测限为0.33 pmol/mL。
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