技术领域
[0001] 本实用新型属于豇豆胰蛋白酶抑制剂的检测领域，具体涉及一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的胶体金免疫层析速测卡。
背景技术
[0002] 豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)属丝
氨酸蛋白酶抑制剂。
[0003] 昆虫摄入蛋白酶抑制剂后，与昆虫肠道的蛋白酶形成稳定的复合物，从而使昆虫的蛋白消化酶活性受到抑制；同时，蛋白酶和蛋白酶抑制剂的复合物还可能作为一个
负反馈信号抑制昆虫的进食。上述双重效应将降低
害虫对食物蛋白的有效利用率，同时，也减少了食物的摄取，最终导致昆虫由于缺乏必需的营养(
蛋白质)停止发育，扰乱了昆虫的正常代谢，最终导致昆虫发育迟缓甚至死亡。
[0004] Hilder(1987)首先报道了将CpTI基因导入
烟草，获得了对烟草夜蛾有显著抗性的转基因植株。在国内，刘春明(1993)首先分离克隆了CpTI基因，并获得了转基因烟草、
水稻、
棉花。随后，郝贵霞(1999)、张七仙(2001)、郭三堆(1999)等获得了转CpTI基因毛白杨、甘蓝、烟草、玉米、小麦、甜椒、花椰菜。
[0005] 目前，对于转基因
植物中豇豆胰蛋白酶抑制剂，基于免疫学原理建立的特异性检测方法有3种：酶联
免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)、侧向流动型免疫
试纸条方法(Lateral Flow strips)和Western杂交检测法。
[0006] ELISA法直接检测外源基因蛋白，可定量检测，所需样品少，操作标准，检测灵敏，可对大量样品检测。但是，ELISA检测方法的适用范围有限，需要专业的技术人员和复杂的仪器设备，耗时比较长，还需从样品中完全提取杀虫蛋白，适合于实验室环境下的检测工作，不适合用于田间筛查和现场检测。
[0007] Western杂交检测法是利用
抗体与
抗原在
硝酸纤维素膜上特异性结合的原理，对外源蛋白进行检测。该方法首先通过PAGE
电泳，将蛋白转移到硝酸
纤维素膜上，再进行印迹免疫，最后通过标记的二抗进行检测。Western检测的灵敏度很高，
检测限一般为纳克级别。但是，Western检测步骤比较繁琐，需要进行蛋白提取，PAGE电泳和免疫反应等过程，技术和设备要求高，不适用于常规大量样品的检测。
[0008] 胶体金免疫层析检测法(Immune colloidal gold technique)，也是基于抗原抗体的特异性结合的三明治夹心式技术原理，标记的抗原-抗体复合物侧向移动，直至与固定在表面上的另一种抗体结合显色，与ELISA法不同之处是，以硝酸纤维素膜代替聚苯乙烯反应板为固相载体。在整个检测设备中只包括所需的
试剂，没有仪器的要求，整个操作过程相对简单。与核酸和ELISA检测方法相比，该方法对样品的处理比较简单。待检目的蛋白一般是对抗体高度特异的
水溶性蛋白，因此，样品不需要复杂的纯化操作，就能进行检测。
[0009] 胶体金免疫层析检测方法是一种快速、简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，5-10min就可得出结果，检测过程无需专
门仪器和熟练技能，经济便捷，特别适用于田间和现场样品的检测。
[0010] 目前，将现有的免疫胶体金技术应用到检测转基因产品的外源蛋白中，仍然存在许多问题，例如，特异性差，灵敏度不高，成本高，因此，亟需对现有免疫胶体金技术进行改进，研制特异性强，灵敏度高、
稳定性好、重复性好的检测转基因产品外源蛋白的新方法。
[0011] 目前，国内外尚未研制出针对转CpTI基因抗虫植物的可以检测CpTI的胶体金免疫层析的快速检测方法。实用新型内容
[0012] 本实用新型的目的在于提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的胶体金免疫层析速测卡，用该速测卡检测豇豆胰蛋白酶抑制剂，特异性强，灵敏度高，并且，操作快速、简便，检测过程无需专门仪器和熟练技能，适用于转基因产品中CpTI的现场快速检测以及安全性评价。
[0013] 为了达到上述目的，本实用新型提供如下技术方案：
[0014] 一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的胶体金免疫层析速测卡，其包括，胶板、粘着在胶板上依次相连的样品垫、金标结合垫、反应膜和吸水垫；
[0015] 所述金标结合垫中固定有由CpTI蛋白制备的多克隆抗体-胶体金复合物；
[0016] 所述反应膜上设有检测线和质控线，在反应膜一端包被有能与抗原CpTI结合的特异抗体，作为检测线，所述特异抗体为由CpTI蛋白制备的多克隆抗体；在反应膜的另一端包被二抗抗体羊抗兔IgG，作为质控线。
[0017] 进一步，所述速测卡还包括套设在胶板外的
外壳；所述外壳的壳体上开有加样孔和观察窗，所述加样孔设于对应所述样品垫上方的壳体处，所述观察窗设于对应所述反应膜上方的壳体处。
[0018] 进一步，所述检测线和质控线间隔1.0-1.5cm。
[0019] 又，所述样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫之间设有1-2mm的重叠区。
[0020] 优选地所述多克隆抗体由含有80或88个氨基酸的CpTI蛋白制备获得。
[0021] 优选地，所述多克隆抗体-胶体金复合物的标金量是10μg/mL。
[0022] 优选地，所述胶板为聚氯乙烯胶板。
[0023] 又，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
[0024] 优选地，所述硝酸纤维素膜的孔径为0.1-0.22微米，所述样品垫和吸水垫由孔径为30-50微米的
滤纸制成。
[0025]
现有技术中，均是由80个氨基酸组成的CpTI蛋白进行研究，
发明人利用UniProt
数据库，分析得到了88个氨基酸CpTI的结构基因和19个氨基酸的前导序列，基于纯化的88个氨基酸的CpTI蛋白制备多克隆抗体，本实用新型制备了一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的胶体金免疫层析速测卡，此速测卡更加适合测定来源于不同豇豆品种中的CpTI蛋白和目前普遍存在的对CpTI基因进行人工遗传修饰而表达的蛋白。
[0026] 本实用新型的速测卡分为4功能区域：加样区、标记物结合区、对比检测区以及吸水区，当待测样品加入加样区后，在吸水垫的毛细作用下，样品往前层析，与金标抗体结合；到达检测线时又会与检测抗体结合，形成双抗夹心截留的现象，大量的胶体金颗粒在此处堆积形成一条红色的检测线，多余的金标抗体继续向前到达质控线时又与二抗抗体结合，同样截留形成一条红色的质控线。
[0027] 本实用新型胶体金速测卡的使用：
[0028] 1)将植物的
叶片、茎干、
种子等样品进行
研磨，加10ml的提取液(其中含0.1mol/L Tris-HCl，0.2％
抗坏血酸，0.1％半胱氨酸，1mmol/L
乙二胺四乙酸(EDTA)，1％聚乙烯吡咯烷
酮(PVP)，pH7.0)摇匀静置,取上清液进行检测。
[0029] 2)检测：将所吸取样品加入速测卡的加样区内，室温下作用10min，然后观察结果。
[0030] 3)结果判定：
[0031] 阳性：质控线和检测线
位置均出现红色条带，说明样品中有CpTI存在。
[0032] 阴性：检测线位置未出现红色条带，质控线位置出现红色条带，说明样本中无CpTI存在。
[0033] 失效：如果检测线、质控线位置均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明试速测卡失效。
[0034] 与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：
[0035] 本实用新型特异性强，灵敏度高，稳定性和重复性好，对CpTI蛋白的特异性的检出限为lμg/mL，在室温下放置30天后仍能特异性的检出CpTI蛋白；抗体的最佳标金量低，可以显著降低速测卡制作成本。
[0036] 本实用新型中，检测线和质控线的间隔增大，避免出现交叉反应和污染，更好的进行CpTI蛋白测定和速测卡本身性能测试。
[0037] 本实用新型操作方法简便、快速，检测时间短，无需专门仪器和熟练技能，经济便捷，将待测样品滴入加样区内，5-10分钟内即可从观察区观察到结果，特别适用于田间和现场样品的检测。
附图说明
[0038] 图1为本实用新型一
实施例速测卡的结构示意图。
[0039] 图2本实用新型一实施例卡壳结构示意图。
[0040] 图3为本实用新型一实施例的检测结果示意图其中，A为检测结果阴性性示意图；B为检测结果阳性示意图；C为检测结果无效示意图。
具体实施方式
[0041] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0042] 实施例
[0043] 如图1，本实用新型的一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的胶体金免疫层析速测卡，包括胶板1、粘着在胶板1上依次相连的样品垫2、金标结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；所述金标结合垫3中固定由88个氨基酸的CpTI蛋白制备的多克隆抗体-胶体金复合物；所述依次相连的样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5之间设有1.0-2.0mm的重叠区。
[0044] 所述硝酸纤维素膜4孔径为0.1-0.22微米，设有检测线41和质控线42，检测线41包被能与检测抗原CpTI结合的特异抗体，所述特异抗体为由具有88个氨基酸的CpTI蛋白制备的多克隆抗体；质控线42包被二抗抗体羊抗兔IgG，所述检测线41和质控线42间隔1.0-1.5cm。
[0045] 进一步，参见图2，所述速测卡的胶板外还设有外壳7，外壳7上设有加样孔71和观察窗72，所述加样孔71位于对应所述样品垫上方，所述观察窗72位于硝酸纤维素膜上方。
[0046] 又，所述样品垫和吸水垫由孔径为30-50微米的滤纸制成。
[0047] 本实施例胶体金免疫层析速测卡的使用：
[0048] 待测样品前处理：将植物的叶片、茎干、种子等样品进行研磨，加10ml的提取液(其中含0.1mol/L Tris-HCl,0.2％抗坏血酸,0.1％半胱氨酸，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP),pH7.0)摇匀静置，取上清液进行检测。
[0049] 检测：将所取样品滴入加样区内，室温下作用5-10min，然后从观察区观察结果。
[0050] 检测结果分析：
[0051] 阴性：检测线未出现红色条带，质控线出红色条带，说明样本中无CpTI存在，如图3中A所示。
[0052] 阳性：检测线、质控线均出现红色条带，说明样品中有CpTI存在，如图3中B所示。
[0053] 失效：如果仅有检测线出现红色条带或检测线，质控线均未出线红色条带，说明速测卡无效，如图3中C所示。
