技术领域
[0001] 本
发明属于胶体金技术领域，特别是涉及一种检测周期短、流程简单、结果准确的检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 耳聋是最常见的致残
疾病和临床遗传病之一，已报道的新生儿发病率达1～3‰，研究发现，约60％的新生儿耳聋与遗传因素有关，即遗传性耳聋。遗传性聋分为非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)和综合征性耳聋(syndromic hearing impairment，SHI)。其中70％左右以常
染色体隐性方式遗传。遗传性耳聋由单一基因突变或不同基因的复合突变引起。至今发现的耳聋相关基因已达120余个，具有较高的基因和位点遗传异质性。
[0003] 遗传性耳聋在临床上多表现为重度的感音神经性聋，缺乏有效的临床
治疗办法，由于耳聋基因在正常人群中也有较高的携带率，因此耳聋基因筛查和产前诊断可以产生巨大的经济效益和社会效益，从而真正达到提高人口
质量，优生优育的目的。因此早期诊断、早期
预防是主要的遗传性耳聋防治办法。
[0004] 随着分子
生物学技术在临床检验领域的应用，产前诊断结合基因检测是一种有效的解决遗传性耳聋发病的技术手段。然而基于PCR技术和DNA探针杂交以及生物芯片技术检测遗传性耳聋，至少需要几个小时才能得到检测结果，而且对人员，技术，场地，仪器都有严格的要求，不适合普通大众自测使用。因此需要一种更简捷的方法来检测遗传性耳聋。
[0005] 金标
免疫层析技术是一种简便、快速、廉价并且具有一定灵敏度的免疫分析技术，很适合在
基层应用。几分钟内可以检测出结果，大大缩短了检测时间；另外对人员或场地几乎没有什么要求，可以随时随地进行自测。市场上目前尚未采用金标免疫层析技术进行遗传性耳聋的检测。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种检测周期短、流程简单、适合自测、结果准确的检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡及其制备方法和应用。
[0007] 本发明第一方面提供了一种检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡，包括
底板及依次粘贴在底板上的上样垫、胶体金结合垫、层析膜、吸样垫，所述胶体金结合垫为包被胶体金标记SLC26A4
抗体、GJB2抗体的玻璃
纤维膜或聚酯膜，所述层析膜为包被SLC26A4抗体、GJB2抗体的
硝酸纤维素膜。
[0008] 本发明第二方面提供了上述检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡的制备方法，其步骤包括：
[0009] (1)胶体金溶液制备：向HauCl4中加入
柠檬酸三钠，煮沸后用枸橼酸三钠、鞣酸为还原剂得到直径为10-20nm的胶体金溶液；
[0010] (2)胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.5-8.5后加入SLC26A4抗体、GJB2抗体和封闭剂，标记结束后将沉淀复溶至含有BSA、
蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；
[0011] (3)层析垫制备：将SLC26A4抗体、GJB2抗体用PBS稀释后分别在硝酸纤维素膜上划线包被后干燥；
[0012] (4)试纸卡组装：将上样垫、胶体金结合垫、层析膜、吸样垫依次粘贴至底板上。
[0013] 本发明第三方面提供了一种遗传性耳聋检测胶体金
试剂盒，所述试剂盒包括上述检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡。
[0014] 本发明的有益效果是：(1)本发明提供的检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡，采用金标免疫层析技术同时对SLC26A4、GJB2抗体进行检测，检测中不需要昂贵的仪器和繁琐的操作过程，简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比基因分析方法缩短了许多。
[0015] (2)整个检测过程中，样本无需转入其它分析装置，直接滴加实现简易操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。血清、
全血、尿液、组化定性试验的
组织切片、细胞涂片等样品均可作为检测样品。
[0016] (3)较
基因芯片方法和传统的测序方法成本低、操作简便、无污染安全，可以在几分钟内得出实验结果且结果准确，可供群众自检自测，且可确认患者的待测样本中是否存在基因突变，进而为临床诊断和治疗提供参考，在大规模孕前预防、孕期干预、产后筛查及用药指导中可得到广泛应用，提供了一种检测人类遗传性耳聋的新思路。
附图说明
[0017] 图1是本发明提供的检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡的结构示意图。
具体实施方式
[0018] 本发明第一方面提供了一种检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡，包括底板及依次粘贴在底板上的上样垫、胶体金结合垫、层析膜、吸样垫，所述胶体金结合垫为包被有胶体金标记SLC26A4抗体、GJB2抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜为同时包被SLC26A4抗体、GJB2抗体的硝酸纤维素膜。
[0019] GJB2、SLC26A4等基因是常见的耳聋相关基因，GJB2上的235delC、299delAT、176del16，以及SLC26A4上的IVS7-2A>G、2168A>G等为热点突变位点，病理性携带率和双等位基因突变率均高。针对上述热点突变进行筛查，可以为40％以上的聋病患者明确病因。由于耳聋基因在正常人群中也有较高的携带率，如GJB2、SLC26A4突变在听
力正常人群中携带率均为3％，线粒体DNA1555和1494突变携带率约为1/300，听力正常的育龄夫妇携带至少一种基因突变的几率为6.3％。因此在有生育要求但无耳聋家族遗传史的听力正常育龄夫妇中进行常见耳聋基因筛查，在此
基础上对携带耳聋基因突变的夫妇提供遗传咨询，这一前瞻性防治策略将阻止较大比例的先天性隐性遗传性耳聋的出生，其意义远远大于对已生育聋儿的正常夫妇进行耳聋遗传咨询和产前诊断，从根本上为预防遗传性耳聋发生提供了理论依据和方法。
[0020] 优选的，所述层析膜上包被的SLC26A4抗体、GJB2抗体的浓度分别为0.4-0.6mg/ml、0.9-1.1mg/ml。
[0021] 进一步优选的，所述层析膜上设置有相互平行的检测线T1、检测线T2、质控线，所述检测线T1通过包被SLC26A4抗体形成，所述检测线T2通过包被GJB2抗体形成，所述质控线通过包被羊抗鼠IgG抗体形成。
[0022] 更进一步优选的，所述检测线T2设置于检测线T1与质控线之间。
[0023] 优选的，所述硝酸纤维素膜孔径为5-12um。
[0024] 优选的，所述层析膜的两端分别搭接有吸样垫、胶体金结合垫，所述胶体金结合垫的另一端搭接有上样垫。
[0025] 进一步优选的，所述上样垫搭接压住胶体金结合垫的1/3，所述胶体金结合垫搭接压住层析垫的1/4，所述吸样垫搭接压住胶体金结合垫的1/10。
[0026] 上述检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡的制备方法，其步骤包括：
[0027] (1)胶体金溶液制备：向HauCl4中加入柠檬酸三钠，煮沸后用枸橼酸三钠、鞣酸为还原剂得到直径为10-20nm的胶体金溶液；
[0028] (2)胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.5-8.5后加入SLC26A4抗体、GJB2抗体和封闭剂，标记结束后将沉淀复溶至含有BSA、蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；
[0029] (3)层析垫制备：将SLC26A4抗体、GJB2抗体用PBS稀释后分别在硝酸纤维素膜上划线包被后干燥；
[0030] (4)试纸卡组装：将上样垫、胶体金结合垫、层析膜、吸样垫依次粘贴至底板上。
[0031] 本发明第三方面提供了一种遗传性耳聋检测胶体金试剂盒，所述试剂盒包括上述检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡。
[0032] 优选的，所述试剂盒还包括比色卡、胶体金定量读数仪中的一种或几种。
[0034] 本实施例提供了一种检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡，并提供了该试纸卡的制备方法。
[0035] 一、主要材料
[0036] SLC26A4，GJB2特异性
配对抗体、羊抗鼠IgG抗体：北京盛齐扬桓科技有限公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：SARTORIUS(德国)，CN140；德国赛多利斯公司产品；
牛血清
白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，
水解
酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
[0037] 二、胶体金的制备方法
[0038] 1、将HauCl4先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。
[0039] 2、搅动下逐滴准确加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液2.00—4.50ml。
[0040] 3、继续加热煮沸30min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成橙红—红色-紫红。全过程约2～3min。
[0041] 4、冷却至室温后用蒸馏水恢复至100ml。
[0042] SLC26A4抗体、GJB2抗体胶体金标记：枸橼酸三钠-鞣酸混合还原剂制备直径为15nm的胶体金溶液，制备完成后取二份胶体金，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg将标记用SLC26A4抗体、GJB2抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为1％的PEG20000和1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按50％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(pH8.0，含BSA、蔗糖，可适当添加
表面活性剂)。
然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于玻璃纤维膜或聚酯膜上，在
温度20～25℃，
相对湿度＜30％的干燥间干燥2～5小时，制成胶体金结合垫。
[0043] NC膜包被：用0.01M pH7.4PBS将包被SLC26A4抗体、GJB2抗体稀释成0.5mg/ml、1mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，检测线T1通过包被SLC26A4抗体形成，所述检测线T2通过包被GJB2抗体形成,包被完成后将NC膜在温度20～25℃，相对湿度＜30％的干燥间干燥2～5小时。
[0044] 试纸卡组装：在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于40％，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金结合垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金结合垫，搭胶体金结合垫的1/4粘贴，在胶体金结合垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金结合垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。
[0045] 所述检测试纸由上样垫、胶体金结合垫、层析膜及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。
[0046] 所述二条检测线T1、T2、质控线相互平行且沿着层析膜的长度方向依次设置。
[0047] 所述二条检测线中靠近胶体金结合垫的检测线T1通过包被人SLC26A4的配对抗体形成，靠近吸样垫的检测线T2通过包被GJB2的配对抗体形成。
[0048] 所述质控线通过包被羊抗鼠IgG抗体形成。
[0049] 所述质控线位于所述层析膜的靠近所述吸样垫的端部。
[0050] 所述层析膜为硝酸纤维素膜且为孔径5～12um的多孔样结构膜。
[0051] 所述上样垫为玻璃纤维膜或聚酯膜，吸样垫为吸水
滤纸。
[0052] 采用以上方法得到的检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡，其结构如图1所示，试纸卡由上样垫1、胶体金结合垫2、层析膜3、吸样垫4依次粘贴在塑料底板5上构成，所述层析膜3的两端分别搭接有吸样垫4、胶体金结合垫2，所述胶体金结合垫2的另一端搭接有上样垫1。胶体金结合垫2为同时标记有SLC26A4，GJB2这二种标记物的抗体的胶体金垫。层析膜3为硝酸纤维素膜，是孔径5～12um的多孔样结构膜，在层析膜3上形成有相互平行的二条检测线T1,T2和质控线C。其中靠近胶体金结合垫2的检测线T1为SLC26A4检测线，通过包被SLC26A4的配对抗体形成；靠近吸样垫4的检测线T2为GJB2检测线，通过包被GJB2的配对抗体形成。
所述SLC26A4的配对抗体、GJB2的配对抗体分别能够与胶体金结合垫2上结合的SLC26A4、GJB2的抗体特异性结合。质控线C通过包被羊抗鼠IgG抗体形成，其位于层析膜3的靠近吸样垫4的端部。
[0053] 本例中，上样垫1为玻璃纤维膜或聚酯膜，吸样垫4为吸水滤纸。
[0054] 将检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡用于检测待测样品。将待测样品滴加于试纸卡上，10min内，根据检测线T1、T2及质控线C的显色情况，判断待测样品中SLC26A4、GJB2抗体的情况。若检测线T1、T2及质控线C均显紫红色，则待测样品中含有SLC26A4、GJB2抗体；若质控线C显紫红色，检测线T1、T2中有一条显色，则待测样品中无不显色的检测线对应的抗体或含量低于检测下限；若质控线C显紫红色，检测线T1、T2均不显色，则待测样品中无或SLC26A4、GJB2抗体含量低于检测下限，若质控线C不显色则检测结果无效，需重新进行检测。
[0055] 将上述检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡用于对耳聋人群样本检测，为耳聋人群做耳聋筛查，结果与直接测序检测方法的检测结果完全一致，说明了本试纸卡的有效性。
[0056] 通过检测遗传性耳聋，确认患者的待测样本中是否存在基因突变，进而为临床诊断和治疗提供参考。该胶体金试纸卡可以应用于孕前预防、孕期干预、产后筛查及用药指导中，不需要昂贵的仪器和繁琐的操作过程，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。该胶体金试纸卡可供群众进行自检自测，可以起到遗传性耳聋基层普查的效果，达到早发现，早治疗的目的。本实施例针对芯片和测序技术存在的问题，提供了一种检测人类遗传性耳聋的新思路。
[0057] 实施例2
[0058] 本实施例提供了一种检测遗传性耳聋的胶体金试剂盒。
[0059] 所述试剂盒包括检测试纸、比色卡或胶体金定量读数仪，以及用于容置检测试纸的塑料卡，将检测试纸装入塑料卡内形成试纸卡，具体的，试剂盒还包括吸滴管、血清加样杯和一次性
注射器。所述检测试纸为实施例1所提供的检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡。所述胶体金定量读数仪是一种已知的光学检测系统。
[0060] 该试剂盒适用的样品与检测遗传性耳聋的胶体金试纸卡所适用的样品相同，可选用血清、全血、尿液等作为检测样品，此外组化定性试验的组织切片、细胞涂片等样品均可作为样品。
[0061] 将上述试剂盒用于对耳聋人群样本检测，为耳聋人群做耳聋筛查，结果与直接测序检测方法的检测结果完全一致，说明了本试剂盒的有效性。
[0062] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
