技术领域
[0001] 本
发明属于数字全息成像的医学应用领域，涉及针对白细胞与血小板共存全息图的分块重建与分类计数方法。
背景技术
[0002] 血液是人体不可或缺的重要组成部分，血液中各类细胞、内容物含量的正常与否直接关系到人自身身体的健康状况。血液常规检测是医疗中一种常见化验项目。随着目前检测技术的进步，能够用于血常规的检测的方法手段越发丰富：
[0003] ①显微计数法：
[0004] 原理：采用人工镜检(多使用细胞计数板，又称
牛鲍板)，借助
染色剂、
造影剂或
荧光染料，直接由医检人员对各类血细胞观察标记、分类计数。
[0005] 优点：该方法是血常规检测的经典方法，也是目前血液检测的精标准。
[0006] 缺点：人工检测成本高、效率低下，无法满足医疗需求；受限于
显微镜的狭窄
视野，无法对大样本血样同时观察计数；需借助染料染色，对细胞造成不可逆伤害。
[0007] ②库尔特计数法：
[0008] 原理：利用血细胞通过充满
电解液的小孔管时，由于排开了相同体积的电解液而导致小孔管内外两
电极间电
阻变化而产生电位脉冲，通过处理直流阻抗-射频阻抗等信息来检测血细胞直径、表面形貌等信息，进而对通过的血细胞进行分类计数。
[0009] 优点：应用广泛，检测迅速。
[0010] 缺点：设备体积庞大，价格昂贵，不能便携，内部结构复杂不易小型化；对于细胞回流、孔间徘徊、粘连等情况的分辨处理能
力不佳。
[0011] ③流式细胞术
[0012] 原理：利用光散射理论，通过检测细胞的前向散射特征、侧向散射特征以及荧光特征等，对处于快速直线运动中的细胞进行逐个、多参数的快速定性、定量分析及分选。
[0013] 优点：检测速度快，测量指标多，
数据采集量大，分析全面，方法多样等。
[0014] 缺点：价格昂贵，设备维护成本高，仪器内血样流路繁复、光路复杂。
[0016] 原理：将显微镜和
图像处理技术相结合，利用图像处理技术进行自动检测。
[0017] 优点：
算法灵活多样，适用于多种问题的分析处理；目前显微镜设备常带有图像处理模块，省却诸多人工操作。
[0018] 缺点：对样品和图像
质量要求较高，往往需要对样品进行繁琐的预处理；受限于显微镜捕获图像时的视野，包含样品量较低，引入的偶然误差较大。
[0019] 作为一种新兴的成像手段，数字全息成像技术完美继承了图像处理方法灵活的处理方法的同时，还基于自身特点规避了上述方法中诸多
缺陷。数字全息是一种
精度可达微米级别的成像方法，可由CCD等光学元器件直接记录获取样本图像，光路极其精简，易于集成和小型化。同时其具有全视场、非
接触、无损伤、实时性、定量化的优点。加之无需对样本染色即可清晰成像，故特别适合于活体
生物样品的定量
三维重建和快速
跟踪，得以在生物医学应用领域尤其是细胞培养观测中发展迅速。此外由于全息图视野直接对应于光学元器件的尺寸，所以全息图具有得天独厚的大视野成像的优点。在同时能够对微米级别物体准确成像的
基础上，全息图视野下所记录的物体信息远丰富于常规
光学显微镜。因此一次成像可涵盖较大体积的血液样液，计数样本的增大降低了偶然因素引入的误差，有助于使用过量稀释的方法减少细胞粘连、增加散布距离。
[0020] 目前借助数字全息图重建方法对细胞等微观生物体分类、计数、跟踪观察的应用近年来多有见报，但其目标物体种类往往单一，同时物体尺寸往往大至十余甚至数十、上百微米(如大草履虫、血吸虫、
变形虫等)，不契合血常规检测中血细胞的分布特征。
[0021] 以男性正常成年人血样为例，其红细胞、白细胞与血小板浓度与主要尺寸参考值为：
[0022] 红细胞(7-10um) 4.3-5.8×1012/L
[0023] 白细胞(10-20um) 3.5-9.5×109/L
[0024] 血小板(2-4um) 100-300×109/L
[0025] 红细胞分布
密度最大，高出血小板密度1个数量级、白细胞密度3个数量级，故可通过将血样稀释至一个合适的计数浓度(实验验证3000-10000倍稀释为佳)对红细胞单独计数。此时白细胞与血小板的干扰因素相对很弱，并可根据面积、圆形度等特征加以识别剔除。
[0026] 至于白细胞与血小板的计数，可使用红细胞裂解液(主要成分：NH4CL、KHCO3、Na2EDTA)将红细胞裂解后再进行，操作简单易行、实用性好。但问题在于白细胞与血小板的分离很难通过简单的生化反应和操作实现。而对于两者共存的样液，在进行全息图获取的过程中，由于白细胞相对于血小板体积明显偏大，其对光的干涉、衍射作用更为强烈，所形成的衍射环也更为明显，携带的信息强度更大。因此当使用常规重建手段对全息图进行重建后，其中白细胞的形貌信息得到了良好保留，而血小板由于衍射信息相对白细胞微弱许多，重建后物体信息被白细胞掩盖，不易提取。简言之就成像结果而言，对于仅含有血小板衍射信息的全息图块，重建后血小板物体信息较清晰、可辨认、易提取；对于同时含有白细胞及血小板衍射信息的全息图块，重建后白细胞区域灰度极低，物体信息十分明显，而血小板区域灰度较高，与背景灰度近似而难以得到体现。
发明内容
[0027] 有鉴于此，本发明的目的在于提供针对白细胞与血小板共存全息图的分块重建与分类计数方法，首先对同时含有白细胞与血小板的全息图进行分块，并加以逐块的卷积重建。然后基于白细胞对血小板光学衍射强度的掩盖效果，利用两者在血样中分布浓度的明显差异，借助全息技术能够进行大视野成像进而可以对血样过量稀释的优点，对不同图像块中是否含有白细胞进行判断分类，进而用于不同物体的计数。具体地，使用重建图像块平均灰度和重建图像块中显著区域数量作为分类策略的双重判据。最终结合血样稀释倍数以及用于成像的样品体积换算出血样中白细胞与血小板分布浓度。
[0028] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0029] 针对白细胞与血小板共存全息图的分块重建与分类计数方法，包括以下步骤：
[0030] S1：获取记录有物体衍射信息的全息图以及仅反应记录光场的背景图，并对两者进行预处理；
[0031] S2：设置分块尺寸，将全息图与背景图进行分块处理；
[0032] S3：对全息图块卷积重建，对所得复矩阵取模转为实矩阵，经过灰度拉伸和归一化得到用于显示的全息重建图；
[0033] S4：统计各重建图像块Is中显著区域，即白细胞或血小板的个数N、图像块
像素平均灰度AVR和图像块像素标准差STD，对图像块所用于的计数类型进行分类；
[0034] S5：记录各图像块重建后目标物体计数值；
[0035] S6：整合Type与Num矩阵记录数据，结合稀释倍数与成像用腔室中转载样液的体积，推算出
全血样本中白细胞、血小板的分布浓度，完成检测。
[0036] 进一步，所述步骤S1具体为：
[0037] 将全息图与背景图从RGB彩色空间映射为灰度图像，对应
像素映射关系：
[0038] Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
[0039] 其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为红、绿、蓝三原色通道信息。
[0040] 进一步，所述步骤S2具体为：
[0041] S21：设图像块分块边长为L；边长建议选取256；
[0042] 整幅图像行列值为M和N，单位为像素pixel；对应整除取其行、列所能排布图像块的个数Row和Col：
[0043] Row＝M|L
[0044] Col＝N|L
[0045] S22：取整幅图像中间Row×L行与Col×L列区域为有效区域，完成图像裁剪；
[0046] S23：将全息图与背景图有效区域分割为Row×Col个边长为L的图像块；由于对每一图像块的处理步骤相同，以H代指某一
全息图像块，BG代指与H同一对应区域的背景图像块；
[0047] S24：构建两个等大空矩阵Type和Num，具有Row行、Col列元素，分别用以记录对应图像块所用于计数的目标类型及目标，即白细胞或血小板的数量。
[0048] 进一步，所述步骤S3具体为：
[0049] S31：对于某一分割后全息图像块H在记录距离、记录
波长下进行卷积重建，得到能够反应白细胞清晰形态的重建复矩阵U；
[0050] U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
[0051] 其中R与O分别为复矩阵的
实部矩阵与
虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的
位置分布；
[0052] S32：将重建所得复数矩阵U取模，得实数矩阵I；实数矩阵I数值分布范围分布在[0，1]区间；
[0053]
[0054] S33：对实数矩阵进行归一化和取整处理，得元素数值为整数且拉伸分布在整个图像灰度级[0,level]区间的实整矩阵Is，其中level表示图像显示设备用于显示的灰度级数目；
[0055]
[0056] 其中max和min分别代表矩阵I中的最大、最小元素数值，level取255。
[0057] 进一步，所述步骤S4具体为：
[0058] S41：统计重建图块中显著区域个数N；
[0059] 统计重建图Is灰度分布直方图，记录在一维数组Data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合，其概率密度分布函数如下：
[0060]
[0061] 其中x为灰度记录情况，对应于Data；μ为对数正态分布期望，σ为方差，两者均需经过非线性拟合后确定；拟合函数各点数值：F(x)，x＝1,2,…,levely；levely表示拟合后灰度级数目，无特别
声明一般与level保持一致；计算拟合函数各点对应
曲率，取第一个曲率极大值处对应下标作为灰度
阈值THR；无论是白细胞或是血小板，其用于表征物体成像的像素点数量均为极少数，且灰度值低
[0062] 一阶导数：
[0063] dy(x)＝F(x+1)-F(x)
[0064] 二阶导数：
[0065] d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
[0066] 曲率：
[0067]
[0068] 根据所得灰度阈值将重建图Is二值化，得二值图IBW：
[0069]
[0070] 根据8连通的连通域计数方法对图像块内真值区域个数加以统计；根据白细胞与血小板的生理特征尺寸，认为其单个成像区域面积不应多于120个像素点；对于面积超过该数值的连通域不予计数；当前图像块中有效连通域数量记为N；
[0071] S42：统计重建图块像素平均灰度AVR
[0072]
[0073] S43：统计重建图块像素标准差STD
[0074]
[0075] S44：根据上述指标设置图像块分类判据：
[0076] ①根据实际稀释样液中白细胞的分布密度，对含有白细胞的图像块重建后白细胞数量不多于5个，即显著区域不多于5个认为倾向于是
白细胞计数图块，否则为血小板计数图块；
[0077] ②白细胞计数图块中白细胞区域灰度极低，占绝大部分面积的背景区域
亮度高，图像整体灰度偏亮；血小板计数图块中血小板区域灰度提升，占绝大部分面积的背景区域亮度下降，图像整体灰度偏暗；当图像块像素平均灰度AVR达到0.85level时倾向认为是白细胞计数图像块，否则为血小板计数图块；
[0078] ③白细胞计数图块中，白细胞衍射信息强烈，重建并归一化后背景亮度变化平缓；血小板计数图块中血小板衍射信息微弱，重建后周边无关干扰得以体现，归一化后背景灰度变化丰富；当图像块像素标准差不高于50时，倾向认为是白细胞计数图像块，否则为血小板计数图块；
[0079] 当上述三条判据中，满足两条或两条以上者，认为是对应图像块的计数类型；
[0080] 若判断为白细胞计数图块，图像块对应的Type矩阵元素赋值为1，若判断为血小板计数图块，图像块对应的Type矩阵元素赋值为2。
[0081] 进一步，所述步骤S5具体为：
[0082] S51：对于S4中判断为白细胞计数区域的图像块，将8连通的连通域计数结果N计入对应的Num矩阵元素位置处；
[0083] S52：对于S4中判断为血小板计数区域的图像块，计数前进行如下处理：
[0084] ①由于血小板衍射强度较弱，易受背景及周围无关干扰，将原全息图块与对应背景图块做差取绝对值，作为新的待重建图H*，提高重建质量，
[0085] H*＝|H-BG|
[0086] ②调整重建距离，由于单个白细胞体积明显大于血小板体积，厚度更厚；在沉降后，白细胞最佳重建焦面高于血小板最佳重建焦面，将S3重建距离dis减少10um，对H*进行卷积重建；
[0087] ③重复S41，得到该血小板计数图块显著区域计数值N；但区域面积筛选条件从120个像素点减少至50个像素点；
[0088] 将8连通的额连通域计数结果N计入对应的Num矩阵元素位置处。
[0089] 进一步，所述步骤S6具体为：
[0090] 统计Type中白细胞计数块数量B1，血小板计数块数量B2；
[0091] Num中白细胞计数总数N1，血小板计数总数N2；
[0092] 则整幅图像所含白细胞总数：
[0093] NW＝N1
[0094] 所含血小板总数：
[0095]
[0096] S0：特别的，对于S3和S5中提及的全息图重建方法，均采用卷积重建法加以实现，具体计算流程如下：
[0097] 卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
[0098]
[0099] 其中，
[0100]
[0101]
[0102] ima在此表示虚数单位，λ为重建光波长；
[0103] H(x,y)为图像
传感器所记录的全息图光强分布，也是所采集记录得到的全息图；
[0104] C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
[0105] R(x,y)＝exp[-imak(x sinα+y sinβ)]
[0106] 式中α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹
角；
[0107] 而根据线性系统理论，再现像复振幅表示为如下卷积形式：
[0108]
[0109] 其中，k＝2π/λ，k表示
波数，g为自由空间脉冲响应；
[0110]
[0111] 再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即所使用的重建图：
[0112] U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]。
[0113] 本发明的有益效果在于：本发明基于大体积物体(白细胞)对小体积物体(血小板)光学衍射强度的掩盖效果，利用两者在血样中分布浓度的明显差异，借助全息技术能够进行大视野成像进而可以对血样过量稀释的优点，对不同图像块中是否含有白细胞进行判断分类，进而用于不同物体的计数。具体地，使用重建图像块平均灰度和重建图像块中显著区域数量作为分类策略的双重判据。最终结合血样稀释倍数以及用于成像的样品体积换算出血样中白细胞与血小板分布浓度。
附图说明
[0114] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
具体实施方式
[0116] 下面将结合附图，对本发明的优选
实施例进行详细的描述。
[0117] 如图1所示，该处理方法包含以下步骤：
[0118] S1：获取记录有物体衍射信息的全息图以及仅反应记录光场的背景图，并对两者进行预处理。
[0119] 具体包括：
[0120] 将全息图与背景图从RGB彩色空间映射为灰度图像，对应像素映射关系：
[0121] Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
[0122] 其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为三原色(红、绿、蓝)通道信息。
[0123] S2：设置分块尺寸，将全息图与背景图进行分块处理。
[0124] 具体包括：
[0125] S21：设图像块分块边长为L。
[0126] 鉴于重建算法使用的是卷积重建法，运算主要涉及傅里叶变换，而长度为2的整数次幂的
信号最宜进行快速傅里叶变换。实验验证能够良好成像的重建边长取256或512，但考虑到过大的分块在稀释倍数不足的情况下有可能导致所有图像块中均包含白细胞的情况，故边长建议选取256。
[0127] 整幅图像行列值为M和N，单位为像素(pixel)。对应整除取其行、列所能排布图像块的个数Row和Col：
[0128] Row＝M|L
[0129] Col＝N|L
[0130] S22：取整幅图像中间Row×L行与Col×L列区域为有效区域，完成图像裁剪。
[0131] S23：将全息图与背景图有效区域分割为Row×Col个边长为L的图像块。由于对每一图像块的处理步骤相同，故在之后叙述中，以H代指某一全息图像块，BG代指与H同一对应区域的背景图像块。
[0132] S24：构建两个等大空矩阵Type和Num，具有Row行、Col列元素，分别用以记录对应图像块所用于计数的目标类型及目标(白细胞或血小板)数量。
[0133] S3：对全息图块卷积重建，对所得复矩阵取模转为实矩阵，经过灰度拉伸和归一化得到用于显示的全息重建图。
[0134] 具体包括：
[0135] S31：对于某一分割后全息图像块H在记录距离、记录波长下进行卷积重建，得到能够反应白细胞清晰形态的重建复矩阵U。
[0136] U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
[0137] 其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布。
[0138] S32：将重建所得复数矩阵U取模，得实数矩阵I。实数矩阵I数值分布范围分布在[0，1]区间。
[0139]
[0140] S33：对实数矩阵进行归一化和取整处理，得元素数值为整数且拉伸分布在整个图像灰度级[0,level]区间的实整矩阵Is，其中level表示图像显示设备用于显示的灰度级数目；
[0141]
[0142] 其中max和min分别代表矩阵I中的最大、最小元素数值。level通常为255。
[0143] S4：统计各重建图像块Is中显著区域(白细胞或血小板)个数N、图像块像素平均灰度AVR和图像块像素标准差STD。据此对图像块所用于的计数类型进行分类。
[0144] 具体包括：
[0145] S41：统计重建图块中显著区域个数N
[0146] 统计重建图Is灰度分布直方图，记录在一维数组Data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线。由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合。其概率密度分布函数如下：
[0147]
[0148] 其中x为灰度记录情况，对应于Data；μ为对数正态分布期望，σ为方差，两者均需经过非线性拟合后确定；拟合函数各点数值：F(x)，x＝1,2,…,levely；levely表示拟合后灰度级数目，无特别声明一般与level保持一致；计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标(灰度)作为灰度阈值THR。依据在于，无论是白细胞或是血小板，其用于表征物体成像的像素点数量均为极少数，且灰度值低
[0149] 一阶导数：
[0150] dy(x)＝F(x+1)-F(x)
[0151] 二阶导数：
[0152] d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
[0153] 曲率：
[0154]
[0155] 根据所得灰度阈值将重建图Is二值化，得二值图IBW：
[0156]
[0157] 根据8连通的连通域计数方法对图像块内真值区域个数加以统计。根据白细胞与血小板的生理特征尺寸，认为其单个成像区域面积不应多于120个像素点。对于面积超过该数值的连通域不予计数。当前图像块中有效连通域数量记为N。
[0158] S42：统计重建图块像素平均灰度AVR
[0159]
[0160] S43：统计重建图块像素标准差STD
[0161]
[0162] S44：根据上述指标设置图像块分类判据
[0163] ①、根据实际稀释样液中白细胞的分布密度，一般对含有白细胞的图像块重建后白细胞数量一般不多于3个，具体地将该数值放宽为5，即显著区域不多于5个认为倾向于是白细胞计数图块，否则为血小板计数图块；
[0164] ②、白细胞计数图块中白细胞区域灰度极低，占绝大部分面积的背景区域亮度高，图像整体灰度偏亮；血小板计数图块中血小板区域灰度提升，占绝大部分面积的背景区域亮度下降，图像整体灰度偏暗。具体的，当图像块像素平均灰度AVR达到0.85level时倾向认为是白细胞计数图像块，否则为血小板计数图块。
[0165] ③、白细胞计数图块中，白细胞衍射信息强烈，重建并归一化后背景亮度变化平缓；血小板计数图块中血小板衍射信息微弱，重建后周边无关干扰得以体现，归一化后背景灰度变化丰富。具体的，当图像块像素标准差不高于50时，倾向认为是白细胞计数图像块，否则为血小板计数图块
[0166] 当上述三条判据中，满足两条或两条以上者，认为即是对应图像块的计数类型。
[0167] 若判断为白细胞计数图块，图像块对应的Type矩阵元素赋值为1，若判断为血小板计数图块，图像块对应的Type矩阵元素赋值为2。
[0168] S5：记录各图像块重建后目标物体计数值
[0169] 具体包括：
[0170] S51：对于S4中判断为白细胞计数区域的图像块，将8连通的连通域计数结果N计入对应的Num矩阵元素位置处。
[0171] S52：对于S4中判断为血小板计数区域的图像块，计数前需进行如下后续处理。
[0172] ①由于血小板衍射强度较弱，易受背景及周围无关干扰，故将原全息图块与对应背景图块做差取绝对值，作为新的待重建图H*，提高重建质量。
[0173] H*＝|H-BG|
[0174] ②调整重建距离，由于单个白细胞体积明显大于血小板体积，厚度更厚。在沉降后，白细胞最佳重建焦面高于血小板最佳重建焦面，将S3重建距离dis减少10um，对H*进行卷积重建。
[0175] ③重复S41，得到该血小板计数图块显著区域计数值N。但区域面积筛选条件从120个像素点减少至50个像素点。
[0176] 将8连通的额连通域计数结果N计入对应的Num矩阵元素位置处。
[0177] S6：整合Type与Num矩阵记录数据，结合稀释倍数与成像用腔室中转载样液的体积，推算出全血样本中白细胞、血小板的分布浓度，完成检测。
[0178] 具体包括：
[0179] 统计Type中白细胞计数块数量B1，血小板计数块数量B2；
[0180] Num中白细胞计数总数N1，血小板计数总数N2。
[0181] 则整幅图像所含白细胞总数：
[0182] NW＝N1
[0183] 所含血小板总数：
[0184]
[0185] S0：特别的，对于S3和S5中提及的全息图重建方法，均采用卷积重建法加以实现，具体计算流程如下：
[0186] 卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布。由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
[0187]
[0188] 其中，
[0189]
[0190]
[0191] ima在此表示虚数单位，λ为重建光波长。
[0192] H(x,y)为图像传感器所记录的全息图光强分布，也即是所采集记录得到的全息图。
[0193] C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
[0194] R(x,y)＝exp[-imak(xsinα+ysinβ)]
[0195] 式中α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角。
[0196] 而根据线性系统理论，再现像复振幅可以表示为如下卷积形式：
[0197]
[0198] 其中，k＝2π/λ，k表示波数，g为自由空间脉冲响应。
[0199]
[0200] 再由卷积理论，可使用傅里叶变换计算得到再现像，也即是本发明所使用的重建图：
[0201] U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]
[0202] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明
权利要求书所限定的范围。
