抗-α2整联蛋白抗体及其用途
阅读：378发布：2020-11-20
专利汇可以提供抗-α2整联蛋白抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及针对α2β1整联蛋白的 抗体 及其用途，包括人源化抗-alpha 2(α2)整联蛋白抗体和用抗-α2整联蛋白抗体 治疗 的方法。更具体地，本发明涉及人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和显示改变的效应子功能(effector function)的变体人IgG1重链恒定区。，下面是抗-α2整联蛋白抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区，而所述变体人IgG1重链恒定区相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG1重链恒定区包含至少一个氨基酸修饰，而且所述抗体与亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改变的效应子功能。
2.权利要求1的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区是包含来自人IgG1的CH1、来自人IgG1的铰链和来自人IgG3的Fc区的同型(isotypic)变体。
3.权利要求1的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区是包含来自人IgG3的CH1、来自人IgG1的铰链和来自人IgG3的Fc区的同型变体。
4.权利要求1的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区包含变体人IgG1Fc区，所述变体人IgG1Fc区相对于所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG Fc区包含至少一个氨基酸修饰。
5.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰包含在选自下组的氨基酸位置上的氨基酸取代：269、298和324，其中利用Kabat中提出的编号系统(numbering system)指示所述每个组成员的氨基酸位置。
6.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰包含选自下组的氨基酸取代：E269D、S298A和S324N，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
7.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰包含在选自下组的氨基酸位置上的氨基酸取代的组合：269/298、269/324、298/324和269/298/324，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
8.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰包含选自下组的氨基酸取代的组合：E269D/S298A、E269D/S324N、S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
9.权利要求1-8中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述效应子功能是补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
10.权利要求1-4中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述人源化抗-α2整联蛋白抗体与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
11.权利要求10的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述人源化抗-α2整联蛋白抗体显示与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相等的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
12.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰是选自下组的氨基酸取代：S324N、S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，而所述抗体与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
13.权利要求12的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述人源化抗-α2整联蛋白抗体显示与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相等的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
14.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰是选自下组的氨基酸取代：E269D、S298A、S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，而所述抗体与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
15.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代S298A/S324N或E269D/S298A/S324N，而所述抗体与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)和改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
16.权利要求2的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述人源化抗-α2整联蛋白抗体包含包括SEQ ID NO:35的变体人IgG1重链恒定区。
17.权利要求3的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述人源化抗-α2整联蛋白抗体包含包括SEQ ID NO:36的变体人IgG1重链恒定区。
18.权利要求4的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述人源化抗-α2整联蛋白抗体包含选自下组的变体人IgG1Fc区：SEQ ID NOs:37-43。
19.权利要求1-18中任一项的人源化抗体，其中所述重链可变区包含包括氨基酸序列GFSLTNYGIH(SEQ ID NO:1)的HCDR1、包括氨基酸序列VIWARGFTNYNSALMS(SEQ ID NO:2)的HCDR2和包括氨基酸序列ANDGVYYAMDY(SEQ ID NO:3)的HCDR3。
20.权利要求1-18中任一项的人源化抗体，其中所述轻链可变区包含包括氨基酸序列SAQSSVNYIH(SEQ ID NO:4)的LCDR1、包括氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:5)的LCDR2和包括氨基酸序列QQWTTNPLT(SEQ ID NO:6)的LCDR3。
21.权利要求1-18中任一项的人源化抗体，其中所述重链可变区包含包括氨基酸序列GFSLTNYGIH(SEQ ID NO:1)的HCDR1、包括氨基酸序列VIWARGFTNYNSALMS(SEQ ID NO:2)的HCDR2和包括氨基酸序列ANDGVYYAMDY(SEQ ID NO:3)的HCDR3；和/或
其中所述轻链可变区包含包括氨基酸序列SAQSSVNYIH(SEQ ID NO:4)的LCDR1、包括氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:5)的LCDR2和包括氨基酸序列QQWTTNPLT(SEQ ID NO:6)的LCDR3。
22.权利要求1-18中任一项的人源化抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
23.权利要求22的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7中(a)位置71是Lys，(b)位置73是Asn，(c)位置78是Val，或(d)(a)-(c)的任意组合的氨基酸序列。
24.权利要求1-18中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:8-19。
25.权利要求1-18中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
26.权利要求22-25中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述重链可变区进一步包含包括氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)的FW4区。
27.权利要求1-18中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
28.权利要求27的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:21中(a)位置2是Phe，(b)位置45是Lys，(c)位置48是Tyr，或(d)(a)-(c)的任意组合的氨基酸序列。
29.权利要求1-18中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:22-33。
30.权利要求1-18中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
31.权利要求27-30中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述轻链可变区进一步包含包括氨基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:34)的FW4区。
32.权利要求1的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述抗体包含包括SEQ ID NO:47的重链和包括SEQ ID NO:56的轻链。
33.权利要求1的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述抗体包含包括SEQ ID NO:48的重链和包括SEQ ID NO:56的轻链。
34.权利要求1的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:49-55的重链和包括SEQ ID NO:56的轻链。
35.编码权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2β1整联蛋白抗体的分离的核酸。
36.包含权利要求35的核酸的载体。
37.包含权利要求35的核酸或权利要求36的载体的宿主细胞。
38.一种组合物，其包含权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体和药学可接受的载体。
39.一种治疗受试者中α2β1整联蛋白相关病症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的权利要求1-34中任一项的抗-α2整联蛋白抗体或权利要求38的组合物。
40.权利要求39的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关病症选自炎性疾病、自身免疫性疾病和特征为异常的或增加的血管发生的疾病。
41.权利要求39的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关病症选自炎性肠
病(inflammatory bowel disease)、克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、移植反应(reactions to transplant)、视神经炎(optical neuritis)、脊髓创伤(spinal cord trauma)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)(SLE)、糖尿病(diabetes mellitus)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、雷诺综合征(Reynaud's syndrome)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)、斯耶格伦氏综合症(Sjorgen's syndrome)、硬皮病(scleroderma)、青少年型糖尿病(juvenile onsetdiabetes)、糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、年龄相关的黄斑变性(age related macular degeneration)、心血管疾病(cardiovascular disease)、牛皮癣(psoriasis)、癌症以及诱发炎性应答的感染。
42.权利要求39的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关病症选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、视神经炎和脊髓创伤。
43.权利要求39的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关病症是选自下组的癌症：
鳞状上皮细胞癌(squamous cell cancer)，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜(peritoneum)癌，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝细胞瘤(hepatoma)，乳癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾部癌(kidney or renal cancer)，肝癌，前列腺癌，外阴癌(vulval cancer)，甲状腺癌，肝部癌瘤(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌(head and neck cancer)，以及B细胞淋巴瘤，包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴癌(NHL)(low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL(intermediate grade/follicular NHL)；中度弥漫性NHL(intermediate grade diffuse NHL)；高度成免疫细胞NHL(high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴细胞NHL(high grade lymphoblastic NHL)；高度小无裂细胞NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；大块病NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与母斑病(phakomatoses)关联的异常血管增生，水肿如与脑瘤关联的，梅格斯氏综合征，黑素瘤(melanoma)，间皮瘤(mesothelioma)，多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，纤维肉瘤(fibrosarcoma)，骨肉瘤(osteosarcoma)和表皮样癌瘤(epidermoid carcinoma)。
44.权利要求39的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关病症是选自下组的癌症：非小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、前列腺癌、转移性前列腺癌、间皮瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤和表皮样瘤、转移性结直肠癌、转移性前列腺癌和转移性乳癌。
45.权利要求39的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关病症是选自下组的癌症：胰腺癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、纤维肉瘤、转移性结肠直肠癌、前列腺癌、转移性前列腺癌和转移性乳癌。
46.权利要求39的方法，其中所述方法与下列不相关：(a)血小板活化，(b)血小板聚集，(c)循环血小板计数降低，(d)出血并发症，或(e)(a)到(d)的任意组合。
47.一种用于抑制白细胞与胶原结合的方法，其包括对受试者施用有效抑制白细胞与胶原结合的量的权利要求1-34中任一项的抗-α2β1整联蛋白抗体或权利要求38的组合物。
48.权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体或权利要求38的组合物作为药物的用途。
49.权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体或权利要求38的组合物用于治疗α2β1整联蛋白相关病症的用途。
50.权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体或权利要求38的组合物，其用于治疗α2β1整联蛋白相关病症的方法中。
51.权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体或权利要求38的组合物用于制备用于治疗α2β1整联蛋白相关病症的药物的用途。
52.一种试剂盒，其包含权利要求1-34中任一项的人源化抗-α2整联蛋白抗体或权利要求38的组合物和说明书，其用于治疗α2β1整联蛋白相关病症。
53.一种包含变体人IgG Fc区的抗体，所述变体人IgG Fc区包含在亲本抗体的氨基酸位置324上用天冬酰胺替换丝氨酸的氨基酸取代S324N，而所述抗体与所述亲本抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)和改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
54.权利要求53的抗体，其中所述抗体进一步包含在所述亲本抗体的氨基酸位置269上用天冬氨酸替换谷氨酸的氨基酸取代E269D和在所述亲本抗体的氨基酸位置298上用丙氨酸替换丝氨酸的取代S298A。
55.权利要求53或54的抗体，其中所述抗体选自下组：嵌合抗体、人源化抗体和完全人的抗体。
56.权利要求53或54的抗体，其中所述抗体是人源化抗-α2整联蛋白抗体。
抗-α2整联蛋白抗体及其用途
技术领域
[0001] 本发明一般涉及针对α2β1整联蛋白的抗体及其用途，包括人源化抗-alpha2(α2)整联蛋白抗体和用抗-α2整联蛋白抗体治疗的方法。更具体地，本发明涉及人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和显示改变的效应子功能的变体人IgG1重链恒定区。
背景技术
[0002] 整 联 蛋 白 α2β1( 很 晚 期 抗 原 2(Very late antigen 2)；VLA-2) 在多种细胞类型中表达，包括血小板、血管上皮细胞、上皮细胞、活化的单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、白细胞、淋巴细胞、活化的嗜中性粒细胞和肥大细胞。(Hemler,Annu Rev Immunol 8:365:365-400(1999);Wu 和 Santoro,Dev.Dyn.206:169-171(1994);Edelson 等，Blood.103(6):2214-20(2004);Dickeson 等，Cell Adhesion and Communication.5:273-281(1998))。α2β1的最典型配体包括胶原和层粘连蛋白(laminin)，这两者都发现于细胞外基质(extracellular matrix)中。通常α2整联蛋白的I-结构域以二价阳离子依赖的方式与胶原结合，而同一结构域通过二价阳离子依赖和非依赖性两种机制与层粘连蛋白结合。(Dickeson等，Cell Adhesion and Communication.5:273-281(1998))。α2β1整联蛋白的特异性随着细胞类型而变，且对于特定细胞类型充当胶原和/或层粘连蛋白的受体，例如已知α2β1整联蛋白作为血小板的胶原受体和上皮细胞的层粘连蛋白受体。(Dickeson等，J Biol.Chem.272:7661-7668(1997))。埃可病毒-1(Echovirus-1)、核心蛋白多糖(decorin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶I(matrix metalloproteinase I)(MMP-I)、endorepellin和多种胶原凝集素(collectins)和C1q补体蛋白也是α2β1整联蛋白的配体。(Edelson等,Blood107(1):143-50(2006))。数种生物和病理过程中也牵涉到α2β1整联蛋白，所述过程包括胶原诱导的血小板聚集、胶原上的细胞迁移、细胞依赖的胶原纤维重组以及引起细胞因子表达和增殖增加的胶原依赖的细胞应答，(Gendron,J.Biol.Chem.278:48633-48643(2003);Andreasen 等 ,J.Immunol.171:2804-2811(2003);Rao等,J.Immunol.165(9):4935-40(2000))，T细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞的功能方 面 (Chan 等，J.Immunol.147:398-404(1991);Dustin 和 de Fougerolles,Curr Opin Immunol 13:286-290(2001),Edelson 等，Blood.103(6):2214-20(2004),Werr等,Blood 95:1804-1809(2000)，迟发型超敏接触性超敏反应和胶原诱导的关节炎 方 面 (de Fougerolles 等，J.Clin.Invest.105:721-720(2000);Kriegelstein 等 ,J.Clin.Invest.110(12):1773-82(2002))，乳 腺 导 管 形 态 发 生 (mammary gland ductal morphogenesis)(Keely 等，J.Cell Sci.108:595-607(1995);Zutter等 ,Am.J.Pathol.155(3):927-940(1995))，表 皮 创 伤 愈 合 (Pilcher 等，J.Biol.Chem.272:181457-54(1997))和与VEGF诱导的血管发生关联的过程(Senger等,Am.J.Pathol.160(1):195-204(2002))。
[0003] 整联蛋白/配体相互作用能促进白细胞外渗入发炎的组织中(Jackson等,J.Med.Chem.40:3359-3368(1997);Gadek 等 ,Science 295(5557):1086-9(2002),Sircar等,Bioorg.Med.Chem.10:2051-2066(2002))，且在白细胞响应炎性刺激从循环进入组织的起始外渗后的下游事件中发挥作用，所述下游事件包括在炎症位点促炎症反应细胞的迁移、募集和活化(Eble J.A.,Curr.Phar.Des.11(7):867-880(2005))。已报告了一些阻断α2β1整联蛋白的抗体对迟发型超敏应答产生影响，并在类风湿性关节炎的鼠模型和炎性肠病的模型中显示效能(Kriegelstein等,J.Clin.Invest.110(12):1773-82(2002);de Fougerolles等，J.Clin.Invest.105:721-720(2000)，且已报告该抗体在体外减弱上皮细胞的增殖和迁移(Senger等,Am.J.Pathol.160(1):195-204(2002)，表明α2β1整联蛋白的阻断可能预防/抑制异常的或高于正常的血管发生，如在各种癌症中观察到的。
[0004] 预期与α2β1整联蛋白包括血小板上的α2β1整联蛋白结合的治疗抗体可导致出血并发症。例如，已将靶向其它血小板受体的抗体如GPIb(Vanhoorelbeke等 ,Curr.Drug Targets Cardiovasc.Haematol.Disord.3(2):125-40(2003) 或 GP IIb/IIIa(Schell 等 ,Ann.Hematol.81:76-79(2002),Nieswandt 和 Watson,Blood102(2):449-461(2003),Merlini等,Circulation 109:2203-2206(2004))与血小板减少症(thrombocytopenia)关联，尽管还没有很好地理解这背后的机制。已假设抗体与血小板受体的结合能改变其三维结构，且使正常不暴露的表位(epitopes)暴露，其随后引起血小板消除(Merlini等,Circulation109:2203-2206(2004)。的确，与口服剂量的GP IIa/IIIb拮抗物(antagonists)关联的出血并发症已被描述为此类复合物的“阴暗面(dark side)”(Bhatt和Topol,Nat.Rev.Drug Discov.2(1):15-28(2003))。如果α2β1整联蛋白在白细胞经过炎性组织的移动中发挥重要作用，将期望开发出能靶向α2β1的治疗剂用于包括癌症、炎性疾病和自身免疫性疾病的α2β1整联蛋白相关病症和/或与该病症关联的细胞过程，如果这类试剂不活化血小板的话。在WO2007/056858中描述了能靶向α2β1整联蛋白如白细胞上的α2β1整联蛋白的人源化抗体，该抗体与不利的出血并发症不相关联。该处描述的人源化抗-α2整联蛋白抗体代表了抗-α2抗体的一种新亚型(subgroup)，其特征在于意外的缺少体内出血并发症和/或缺少血小板α2β1整联蛋白的活化。但是WO2007/056858中公开的IgG4抗体不携带效应子功能如ADCC和/或CDC，其在一定情况下是期望的，如对于α2β1整联蛋白相关病症如癌症的治疗，其中这种功能性引起增加的治疗效能。因此，会期望开发出以较高程度显示这些效应子功能的抗-α2β1整联蛋白抗体。
附图说明
附图说明
[0005] 图1显示选择的抗-VLA2抗体变体基于细胞的CDC测定法：(1)抗-VLA2IgG4;(2)抗 -VLA2 IgG1;(3) 抗 -VLA2 IgG2;(4) 抗 -VLA2 IgG3;(5) 抗 -VLA2 IgG1133;(6)抗 -VLA2 IgG3133;(7) 抗 -VLA2 IgG1-S324N;(8) 抗 -VLA2 IgG1-S298A,(9) 抗 -VLA2 IgG1-E269D;(10) 抗 -VLA2IgG1-E269D/S298A/S324N;(11) 抗 -VLA2 IgG1-S298A/S324N;(12)IgG1对照;(13)阴性对照-无抗体。
[0006] 图2显示选择的抗-VLA2抗体变体在0.1μg/ml的终浓度基于细胞的ADCC测定法。(1)抗-VLA2 IgG4;(2)抗-VLA2 IgG1;(3)抗-VLA2 IgG2;(4)抗-VLA2 IgG3;(5)抗 -VLA2 IgG1133;(6) 抗 -VLA2 IgG3133;(7) 抗 -VLA2IgG1-S324N;(8) 抗 -VLA2 IgG1-S298A,(9) 抗 -VLA2 IgG1-E269D;(10) 抗 -VLA2 IgG1-E269D/S298A/S324N;(11)抗-VLA2 IgG1-S298A/S324N;(12)IgG1对照;(13)阴性对照-无抗体。
[0007] 图3显示选择的抗-VLA2抗体变体在0.01μg/ml的终浓度基于细胞的ADCC测定法。(1)抗-VLA2 IgG4;(2)抗-VLA2 IgG1;(3)抗-VLA2 IgG2;(4)抗-VLA2 IgG3;(5)抗 -VLA2 IgG1133;(6) 抗 -VLA2 IgG3133;(7) 抗 -VLA2IgG1-S324N;(8) 抗 -VLA2 IgG1-S298A,(9) 抗 -VLA2 IgG1-E269D;(10) 抗 -VLA2 IgG1-E269D/S298A/S324N;(11)抗-VLA2 IgG1-S298A/S324N;(12)IgG1对照;(13)阴性对照–无抗体。
发明内容
[0008] 本发明提供了包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定结构域的人源化抗-α2整联蛋白抗体，而所述变体人IgG1重链恒定区相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG1重链恒定区包含至少一个氨基酸修饰，而且所述抗体与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改变的效应子功能。
[0009] 本发明进一步提供编码上述人源化抗-α2β1整联蛋白抗体的分离的核酸。
[0010] 本发明进一步提供包含上述核酸的载体。
[0011] 本发明进一步提供包含上述核酸或上述载体的宿主细胞。
[0012] 本发明进一步提供包含上述人源化抗-α2整联蛋白抗体和药学可接受的载体的组合物。
[0014] 本发明进一步提供一种在受试者中治疗α2β1整联蛋白相关病症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的上述抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物。
[0015] 本发明进一步提供一种抑制白细胞与胶原结合的方法，所述方法包括对受试者施用有效抑制白细胞与胶原结合的量的上述抗-α2β1整联蛋白抗体或上述组合物。
[0016] 本发明进一步提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物作为药物的用途。
[0017] 本发明进一步提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物用于治疗α2β1整联蛋白相关病症的用途。
[0018] 本发明进一步提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物，其用于治疗α2β1整联蛋白相关病症的方法中的使用。
[0019] 本发明进一步提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗α2β1整联蛋白相关病症。
[0020] 本发明进一步提供一种包含变体人IgG Fc区的抗体，所述变体人IgG Fc区包含在亲本抗体的氨基酸位置324上用天冬酰胺替换丝氨酸的氨基酸取代S324N，而所述抗体与所述亲本抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)和改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0021] 发明详述
[0022] 本发明涉及人源化抗-α2整联蛋白抗体，其与亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改变的效应子功能。
[0023] α2β1整联蛋白是由来自alpha整联蛋白家族的α2整联蛋白亚基和来自beta整联蛋白家族的β1整联蛋白亚基组成的分子，且可能来自任何包括哺乳动物在内的受试者，但优选是来自人的。可以从任何天然来源纯化或合成产生(如通过使用重组DNA技术)所述α2β1整联蛋白。在Takada和Hemler J.Cell Biol.109(1):397-407(1989;GenBank提 交 X17033；随 后 更 新 为 条 目 NM002203) 和 Argraves,W.S,J.Cell.Biol.Sep105(3):1183-90(1987;Genbank提交X07979.1和代表备选剪接变体的相关序列)中分别描述了α2整联蛋白和β1整联蛋白的核酸编码序列。
[0024] α2β1整联蛋白分子的‘I’结构域指该α2β1整联蛋白分子的α2亚基中的一个区域，且由如Kamata等,J Biol.Chem.269:9659-9663(1994);Emsley等,J.Biol.Chem.272:28512(1997)和Cell 101:47(2000)中描述。α2整联蛋白的I结构域含有MIDAS类型的配体结合位点(金属离子依赖性粘附位点(Metal Ion Dependent Adhesion Site))，其对指定的二价阳离子具有一定的要求和一定的特异性以帮助配体结合。
[0025] α2整联蛋白相关病症包括牵涉在靶组织中介导异常细胞反应的α2整联蛋白依赖性过程/功能(如结合、活性)的病症、疾病或状况。α2整联蛋白相关病症指牵涉在靶组织中介导异常细胞反应的α2整联蛋白依赖性过程/功能(如结合、活性)的病症、疾病、症状或状况。疾病中牵涉的α2整联蛋白依赖性过程的实例包括胶原依赖性细胞应答，例如那些牵涉到细胞因子表达和增殖提高、T细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞功能的方面、炎性病症、乳腺导管形态发生、表皮创伤愈合和血管发生的。α2整联蛋白相关病症的实例包括但不限于，炎性疾病或病症，其包括但不限于炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)，移植反应(包括移植排斥)，视神经炎，脊髓创伤，类风湿性关节炎，多发性硬化症(包括与其关联的神经后遗症(neurological sequelae)以及特征为复发的多发性硬化症的治疗)，自身免疫性疾病或病症(包括系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、雷诺综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦氏综合症、硬皮病)，青少年型糖尿病，以及与异常或高于正常的血管发生关联的病症(如糖尿病性视网膜病、年龄相关的黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、类风湿性关节炎和癌症)，以及诱发炎性应答的感染。
[0026] α2β1整联蛋白相关病症的治疗包括本文描述的抗-α2整联蛋白抗体的治疗性用途和防护或预防性的用途两者。那些需要治疗的包括已经诊断患有所述病症的那些以及要预防或延迟病症起始的那些。
[0027] 术语“抗-α2整联蛋白抗体”或“与α2结合的抗体”或“与α2整联蛋白亚基结合的抗体”或“抗-VLA-2抗体”在本文中同义使用，且包括与人α2整联蛋白结合的抗体，优选人源化IgG抗体，例如与固定的α2β1以50nM或更小的亲和力(affinity(Kd))结合的，优选10nM或更小，更优选1nM或更小，特别是0.5nM或更小。
[0028] 本文同义使用的术语“亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体”或“亲本抗-α2整联蛋白抗体”或“亲本抗-VLA-2抗体”的意思是与人α2整联蛋白结合的抗体，例如人源化IgG1抗-α2整联蛋白抗体，其可被修饰以包含变体人IgG1重链恒定区。除了人IgG1重链恒定区中的氨基酸修饰之外，亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体等同于包含变体人IgG1重链恒定区的抗体，且通常是具有天然(native)的人IgG1重链恒定区的抗体。所述氨基酸修饰优选不是同位素的。
[0029] 术语“抗体”或“免疫球蛋白”以最广的意义使用，且涵盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多重特异性抗体，只要它们显示期望的生物学活性。术语抗体或免疫球蛋白包含具有抗原结合特性即与α2整联蛋白结合的全长抗体及其片段。术语“抗体”包括包含由二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CHI,CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区(本文中简写为CL)组成。轻链恒定区由一个结构域组成。VH和VL区域可进一步细分为高可变的区域，称为互补决定区(CDR)，穿插着更保守的、称为框架区(FR或FW)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以如下顺序从氨基末端安排到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应子细胞)和经典补体系统的第一个成分(C1q)。
[0030] 术语“全长抗体”用于本文包括构成抗体天然生物形式的结构，其包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物包括人和鼠中，IgG类的全长抗体是四聚体且由两个相同的两条免疫球蛋白链的对组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，且每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、CH1(C[gamma]1)、CH2(C[gamma]2)和CH3(C[gamma]3)。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼(llamas)中，IgG抗体可仅由两条重链组成，每条重链包含附着于Fc区的可变结构域。
[0031] 术语“嵌合抗体”用于本文包括其中可变区序列从一个物种得到而恒定区序列从另一个物种得到的抗体，例如，一种抗体，其中可变区序列从小鼠抗体得到而恒定区序列从人抗体得到。
[0032] 术语“人源化抗体”用于本文包括其中已将从另一个哺乳动物种如小鼠的种系(germline)得到的CDR序列接枝到人的框架序列上的抗体。可在人框架序列以及从另一哺乳动物种的种系获得的CDR序列中进行另外的框架区修饰。
[0033] 术语“人抗体”用于本文包括具有可变区的抗体，所述可变区中框架和CDR区都从人种系的免疫球蛋白序列得到。此外，如果所述抗体含有恒定区，该恒定区也是从人种系的免疫球蛋白序列得到的。本发明的人抗体可包括不由人种系的免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引起的突变)。但是，用于本文的术语“人抗体”不意图包括其中已将从另一个哺乳动物物种如小鼠的种系得到的CDR序列接枝到人框架序列上的抗体。
[0034] 单克隆抗体包括从实质上一群同质的抗体中获得的抗体，例如，组成所述群的单个抗体除了可能天然产生的可以以少量存在的突变之外，是完全相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对一个单一的抗原位点。此外，与通常包括针对抗原上不同决定簇(如表位)的不同抗体的常规的(如多克隆的)抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的至少一个单一的决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从实质上同质的抗体群中获得的，且不应理解为需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过首先由Kohler等,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法(hybridoma method)或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制成。也可以从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体，例如，使用在Clackson等,Nature 352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术。还可以使用在U.S.专利号6,025,155和6,077,677以及U.S.专利申请公布号2002/0160970和2003/0083293(另参见，如Lindenbaum等,Nucleic Acids Research 32(21):0177(2004))中描述的技术分离单克隆抗体。
[0035] 高变区包括抗体的负责与抗原结合的氨基酸残基。所述高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基(如轻链可变结构域中的残基24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自高变环的那些残基(如轻链可变结构域中的残基26-32(L1),50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
框架或FR残基是除了高变区残基之外的那些可变结构域残基。对于本文描述的抗体，基于Kabat编号系统鉴别CDR和框架区，除重链的CDR1由Oxford Molecular's AbM definition定义为跨越残基(spanning residues)26到35。Oxford Molecular's AbM抗体建模软件(http://people.cryst.cck.ac.uk/~ubc07s/)(Martin等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989);Martin等,Methods Enzymol.,203,121-153(1991);Pedersen等,Immunomethods,1,126(1992);和Rees等,In Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141-172.(1996)) 组 合 了Kabat CDR和Chothia高变区编号系统来定义CDR。
框架或FR残基是除了高变区残基之外的那些可变结构域残基。对于本文描述的抗体，基于Kabat编号系统鉴别CDR和框架区，除重链的CDR1由Oxford Molecular's AbM definition定义为跨越残基(spanning residues)26到35。Oxford Molecular's AbM抗体建模软件(http://people.cryst.cck.ac.uk/~ubc07s/)(Martin等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989);Martin等,Methods Enzymol.,203,121-153(1991);Pedersen等,Immunomethods,1,126(1992);和Rees等,In Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141-172.(1996)) 组 合 了Kabat CDR和Chothia高变区编号系统来定义CDR。
[0036] 本文的术语“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文通过“氨基酸取代”或“取代”意指在亲本多肽序列中将某一特定位置的氨基酸用另一个氨基酸替换。例如，取代R94K指一种变体多肽，在此情况下为一个重链可变框架区变体，其中位置94的精氨酸被替换为赖氨酸。对于前述实例，94K指示在位置94上用赖氨酸的取代。就本文而言，多个取代通常由斜杠分开。例如，R94K/L78V指包含R94K和L78V取代的双重变体。“氨基酸插入”或“插入”用于本文意指在亲本多肽序列中的特定位置上氨基酸的添加。例如，插入-94命名了一个在位置94上的插入。“氨基酸缺失”或“缺失”用于本文意指在亲本多肽序列中的特定位置除去一个氨基酸。例如R94-命名了在位置94的精氨酸的缺失。
[0037] 对于本发明讨论的所有免疫球蛋白重链恒定区的位置，依据如Kabat中的 EU 索 引 编 号 (Kabat 等 ,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda，其通过提述全部并入)。免疫球蛋白重链恒定区位置的编号在本文中称为“Kabat中提出的编号系统”或“如Kabat中的EU索引”，二者在本文中等同使用且依据如Kabat中的EU索引指定编号。“如Kabat中的EU索引”指人IgGl EU抗体的残基编号，如Edelman等,1969,PNAS 63:78-85中描述的。
[0038] 抗体被分为类，也称为同型，如由恒定区遗传上确定的。将人恒定轻链分类为kappa(CK)和lambda(C[lambda])轻链。将重链分类为mu,delta,gamma,alpha或epsilon，且将抗体的同型分别定义为IgM,IgD,IgG，IgA和IgE。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类包含IgG1,IgG2,IgG3和IgG4亚类。在小鼠中，该类包含IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3亚类。IgM有亚类，其包括但不限于，IgM1和IgM2。IgA有数个亚类，其包括但不限于IgA1和IgA2。因此，“同型”用于本文的意思是由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类或亚类。已知的人免疫球蛋白同型为IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgM1,IgM2,IgD和IgE。
[0039] 术语“Fc”或“Fc区”用于本文包括包含除第一个恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因此Fc指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域以及IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及在这些结构域N-末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(C[gamma]2和C[gamma]3)以及Cgammal(C[gamma]l)和Cgamma2(C[gamma]2)之间的铰链。虽然Fc区的边界可变，通常将人IgG重链Fc区定义为在其羧基末端包含残基C226或P230，其中依据EU索引如Kabat中编号。Fc可指孤立的该区域，或在Fc多肽背景中的该区域，如抗体。
[0040] “变体人IgG1重链恒定区”用于本文意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本人IgG1重链恒定区不同的人IgG1重链恒定区。“Fc变体”或“变体Fc”或“变体人IgG1 Fc区”用于本文意指由于至少一种氨基酸修饰而与亲本Fc序列不同的Fc序列。变体人IgG1重链恒定区或Fc变体包含相对于亲本Fc多肽的一个或多个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰提供一个或多个优化的特性。本发明的变体人IgG1重链恒定区或Fc变体由于至少一个氨基酸修饰而与其亲本IgG1在氨基酸序列上不同。因此，本发明的变体人IgG1重链恒定区或Fc变体与亲本相比，具有至少一个氨基酸修饰。或者，本发明的变体人IgG1重链恒定区与亲本相比，可具有多于一个氨基酸修饰，例如可包含完整的恒定区免疫球蛋白结构域的转变(conversion)，或优选地，某一同型的Fc区到不同的同型的转变，例如人IgG1重链恒定区的Fc区到人IgG3 Fc区的转变产生一种同型变体，其包含人IgG1的CH1、人IgG1的铰链和人IgG3的Fc区。可使用分子生物学在遗传上进行修饰，或者进行酶法或化学修饰。
[0041] 本发明的Fc变体可以基本上由任何同种异型(allotype)或isoallotype的任何免疫球蛋白基因编码。在一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体用于抗体或Fc融合物，其包含分类为G1m(1)、G1m(2)、G1m(3)、G1m(17)、nG1m(1)、nG1m(2),和/或nG1m(17)的IgG1序列。因此在IgGI同型的上下文中，本发明的Fc变体可包含位置214上的Lys(G1m(17))或Arg(G1m(3))，Asp356/Leu358(G1m(1))或Glu356/Met358(nG1m(1)),和/或位置431上的Gly(G1m(2))或Ala(nG1m(2))。
[0042] 术语“同型变体”用于本文包括一种氨基酸修饰，其将一个同型的至少一个氨基酸，优选一个同型的重链恒定区的至少一个氨基酸，转变为不同的、对其的(aligned)同型中的相应的氨基酸。所述氨基酸修饰可包含完整的恒定区免疫球蛋白结构域的转变，或优选地，一个同型的Fc区到不同的同型的转变，例如，人IgG1重链恒定区的Fc区到人IgG3的Fc区的转变产生一种同型变体，其包含人IgG1的CH1、人IgG1的铰链和人IgG3的Fc区。
[0043] “铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”用于本文意指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上，IgG CH1结构域在EU位置220终止，而IgG CH2结构域在EU位置237的残基起始。因此对于IgG，该抗体的铰链在本文中定义为包括位置221(IgGI中D221)到231(IgGI中A231)，其中依据EU索引如Kabat中编号。
[0044] 术语“效应子功能”用于本文包括起因于抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用的生物化学事件(biochemical event)。术语“效应子功能”用于本文包括吞噬作用(phagocytosis)、调理作用(opsonization)、细胞结合、复位(resetting)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、C1q结合、抗体对Fc[gamma]受体的结合亲和力或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。优选效应子功能是补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。通过标准的体外测定法测量效应子功能，这是本领域已知的且商业可获得的。通常通过如本申请的实施例2描述的乳酸脱氢酶(LDH)-释放测定法测量ADCC，且通过本应用的实施例1描述的基于细胞的测定法测量CDC。
[0045] 术语“改变效应子功能”或“显示改变的效应子功能”用于本文包括改善的抗体效应子功能的显示，例如一种人源化抗-α2整联蛋白抗体，其与亲本抗体相比包含变体人IgG1重链恒定区，即包含变体人IgG1重链恒定区的抗体的效应子功能比亲本抗体的效应子功能高超过10%，优选超过20%，更优选超过30%，最优选超过50%，特别的超过60%，最特别的超过70%。
[0046] 术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”用于本文包括细胞介导的反应，其中表达Fc[gamma]Rs的非特异的细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，且随后引起靶细胞的裂解。在各个方面，增强的ADCC效应子功能可意味着增强的效力(potency)或增强的效能。“效力”用于实验性上下文意指在观察到特定的治疗效果时抗体的浓度，EC50(半最大效应浓度)。“效能”用于实验性上下文意指在饱和的抗体水平上最大可能的效应子功能。
[0047] 术语“CDC”或“补体依赖性细胞毒性”用于本文包括其中一个或多个补体蛋白组分识别靶细胞上结合的抗体，且随后引起靶细胞的裂解的反应。
[0049] 细胞毒性剂包括抑制或预防细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。所述物质可131 125 90 186
包括放射性同位素(如 I, I, Y和 Re)、化疗剂和毒素例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段。非细胞毒性剂指不抑制或预防细胞功能和/或不导致细胞破坏的物质。非细胞毒性剂可包括可被活化以变为细胞毒性的试剂。非细胞毒性剂可包括珠(bead)、脂质体(liposome)、基质或颗粒(参见，例如U.S.专利公布2003/0028071和
2003/0032995，其通过提述并入本文)。可以如本文描述的，将这类试剂与抗-α2β1整联蛋白抗体轭合(conjugated)、偶联、连接或关联。
包括放射性同位素(如 I, I, Y和 Re)、化疗剂和毒素例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段。非细胞毒性剂指不抑制或预防细胞功能和/或不导致细胞破坏的物质。非细胞毒性剂可包括可被活化以变为细胞毒性的试剂。非细胞毒性剂可包括珠(bead)、脂质体(liposome)、基质或颗粒(参见，例如U.S.专利公布2003/0028071和
2003/0032995，其通过提述并入本文)。可以如本文描述的，将这类试剂与抗-α2β1整联蛋白抗体轭合(conjugated)、偶联、连接或关联。
[0050] 化疗剂指在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的实例包括但不限于，阿霉素(Adriamycin)、多柔比星(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、阿糖胞苷(Cytosine arabinoside)("Ara-C")、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、噻替派(Thiotepa)、泰索帝(Taxotere)(多西紫杉醇(docetaxel))、白消安(Busulfan)、Cytoxin、泰素(Taxol)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、顺铂(Cisplatin)、美法仑(Melphalan)、长春碱(Vinblastine)、博来霉素(Bleomycin)、依托泊苷(Etoposide)、异磷酰胺(Ifosfamide)、丝裂霉素C(Mitomycin C)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、长春新碱(Vincreistine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、卡铂(Carboplatin)、替尼泊苷(Teniposide)、道诺霉素(Daunomycin)、卡米诺霉素(Carminomycin)、氨蝶呤(Aminopterin)、更生霉素(Dactinomycin)、丝裂霉素(Mitomycins)、埃斯波霉素(Esperamicins)(参见U.S.专利号4,675,187)、美法仑和其它相关的氮芥(nitrogen mustards)。
[0051] 分离的核酸分子指鉴别的并与来源中至少一个通常与其关联的污染核酸分子分离的核酸分子，所述来源例如，抗体核酸的天然来源中。分离的核酸分子与自然中发现其所处的形式或背景(setting)不同。因此将分离的核酸分子与存在于天然细胞的核酸分子区别开来。然而，分离的核酸分子包括通常表达所述抗体的细胞中含有的核酸分子，例如，其中所述核酸分子位于与天然细胞中不同的染色体位置上。
[0052] 经常交互使用细胞、细胞系和细胞培养物，且所有这样的命名包括子代。转化体和转化的细胞(如由核酸、载体、病毒等的转染、转化或转导获得的)包括原代受试者细胞(primary subject cell)和由此得到的与转移次数无关的培养物。还要理解的是，由于有意或不慎的突变，可能并非所有子代在DNA内容上精确等同。包括在最初转化的细胞中筛选的具有同样功能或生物学活性的突变子代。在意图不同名称的情况下，从上下文看会是清楚的。
[0053] 包含变体人IgG1重链恒定结构域的人源化抗-α2整联蛋白抗体
[0054] 本发明提供一种人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区，而变体人IgG1重链恒定区包含相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG1重链恒定区至少一个氨基酸修饰，而且所述抗体与所述亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改变的效应子功能。
[0055] 在一个方面，本公开提供一种人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区，其中变体人IgG1重链恒定区是一个同型变体，其包含来自人IgG1的CH1、来自人IgG1的铰链和来自人IgG3的Fc区。
[0056] 在一个实施方案中，所述同型变体人IgG重链恒定区包含SEQ ID NO:35。
[0057] 在一个方面，本公开提供一种包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区是一种同型变体，其包含人IgG3的CH1、来自人IgG1的铰链和来自人IgG3的Fc区。
[0058] 在一个实施方案中，所述同型变体人IgG重链恒定区包含SEQ ID NO:36。
[0059] 在一个方面，本公开提供一种包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区包含变体人IgG1Fc区，其相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG Fc区包含至少一个氨基酸修饰。
[0060] 在一个实施方案中，所述氨基酸修饰包含在选自下组的氨基酸位置上的氨基酸取代：269、298和324，优选在氨基酸位置298和/或324上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
[0061] 在另一个实施方案中，所述氨基酸修饰包含选自下组的氨基酸取代：E269D、S298A和S324N，优选氨基酸取代S298A和/或S324N，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
[0062] 在另一个实施方案中，所述氨基酸修饰包含在选自下组的氨基酸位置上的氨基酸取代的组合：269/298、269/324、298/324和269/298/324，优选298/324或269/298/324，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
[0063] 在另一个实施方案中，所述氨基酸修饰包含选自下组的氨基酸取代的组合：E269D/S298A,E269D/S324N,S298A/S324N和 E269D/S298A/S324N，优 选 S298A/S324N或E269D/S298A/S324N，其中利用Kabat中提出的编号系统指示所述每个组成员的氨基酸位置。
[0064] 在一个实施方案中，所述变体人IgG1 Fc区包含选自下组的序列：SEQ ID NOs:37-43。
[0065] 所述改变的效应子功能通常是补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或C1q结合和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体对于Fc[gamma]受体的结合亲和力，优选补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。通过标准的体外测定法测量CDC、C1q结合、ADCC和抗体对于Fc[gamma]受体的结合亲和力，这是本领域已知的且商业可获的。ADCC通常由如本申请的实施例2描述的乳酸脱氢酶(LDH)-释放测定法测量，而CDC由本申请的实施例1描述的基于细胞的测定法测量。
[0066] 优选本公开的包含变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体与亲本人源化抗体相比，在上述体外测定中显示改善的CDC。“改善的CDC的显示”或“显示改善的CDC”用于本文包括a)与亲本抗体相比，显示增强的CDC，即亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体已显示CDC，而该CDC通过人IgG1重链恒定区的氨基酸修饰增强，和b)与亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，新的CDC的显示，即亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体不显示CDC，因此通过人IgG1重链恒定区的氨基酸修饰新引入CDC。
[0067] 因此在一个进一步的方面，本公开提供包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体，而变体人IgG1重链恒定区相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG1重链恒定区包含至少一个氨基酸修饰，而且所述抗体与亲本人源化抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。优选的与亲本人源化抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)的人源化抗-α2整联蛋白抗体的变体人IgG1重链恒定区包含变体人IgG1 Fc区，该区包含选自下组的氨基酸取代：S324N,S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，更优选地，变体人IgG1 Fc区包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO:39、42和43。
[0068] 在一个实施方案中，包含变体人IgG1重链恒定区，与亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)的人源化抗-α2整联蛋白抗体，显示与亲本人源化抗体等同的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。与亲本人源化抗体等同的ADCC的显示包括亲本人源化抗体的ADCC±50%的ADCC，优选±40％，更优选±30%，最优选±20%，特别是±10％。已知IgG1抗体，例如人源化IgG1抗-α2整联蛋白抗体作为亲本抗体显示ADCC。但不可预测的是，提供IgG1重链恒定区改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)的修饰，如氨基酸取代，是否确实对ADCC产生影响。因此，本发明的包含显示改善的CDC的变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体，出乎意料的显示与亲本人源化抗体等同的ADCC。
[0069] 在一个进一步的方面，本公开提供包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区包含变体人IgG1 Fc区，所述变体人IgG1 Fc区相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG1 Fc区包含至少一个氨基酸修饰，而且所述抗体与亲本人源化抗体相比，显示改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。优选的与亲本人源化抗体相比，显示改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG1重链恒定区包含变体人IgG1 Fc区，其包含选自下组的氨基酸取代：E269D,S298A,S298A/S324N和E269D/S298A/S324N，更优选地，所述变体人IgG1 Fc区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:37、38、42和43。
[0070] 在一个进一步的方面，本公开提供包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和变体人IgG1重链恒定区的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区包含变体人IgG1 Fc区，该区相对于亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体的人IgG Fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代S298A/S324N或E269D/S298A/S324N，而所述抗体与亲本人源化抗-α2整联蛋白抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)和改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0071] 本发明的抗体已被构建为包含来自鼠单克隆抗体克隆BHA2.1(Hangan等,Cancer Res.56:3142-3149(1996))的重链可变区和轻链可变区的CDR。优选用于构建抗体的起始材料是抗-α2整联蛋白抗体，例如那些由BHA2.1杂交瘤(例如，TMC-2206)分泌的针对人α2整联蛋白的功能阻断抗体，且其结合和活性依赖于靶向α2整联蛋白中完整I-结构域的存在。优选为具有TMC-2206(或BHA2.1)的表位特异性的人源化抗体，包括与α2整联蛋白分子的非活性构象结合的抗体和/或不作为配体模拟物(ligand mimetics)发挥功能的抗体。优选为具有TMC-2206(或BHA2.1)的表位特异性的人源化抗体，虽然它们与白细胞和血小板上存在的α2β1整联蛋白相互作用，其在施用的浓度包括体内治疗剂量上不引起血小板活化，损害胶原上活化的血小板的聚集，对出血具有最小影响或无影响和/或，与出血并发症无关联。
[0072] 因此还提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区，该区包含包括氨基酸序列GFSLTNYGIH(SEQ ID NO:1)的HCDR1、包括氨基酸序列VIWARGFTNYNSALMS(SEQ ID NO:2)的HCDR2和包括氨基酸序列ANDGVYYAMDY(SEQ ID NO:3)的HCDR3。
[0073] 还提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含轻链可变区，该区包含包括氨基酸序列SAQSSVNYIH(SEQ ID NO:4)的LCDR1、包括氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:5)的LCDR2和包括氨基酸序列QQWTTNPLT(SEQ ID NO:6)的LCDR3。
[0074] 还提供上述人源化抗-α2整联蛋白抗体，其包含重链可变区，该区包含包括氨基酸序列GFSLTNYGIH(SEQ ID NO:1)的HCDR1、包括氨基酸序列VIWARGFTNYNSALMS(SEQ ID NO:2)的HCDR2和包括氨基酸序列ANDGVYYAMDY(SEQ ID NO:3)的HCDR3；和/或轻链可变区，该区包含包括氨基酸序列SAQSSVNYIH(SEQ ID NO:4)的LCDR1、包括氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:5)的LCDR2和包括氨基酸序列QQWTTNPLT(SEQ ID NO:6)的LCDR3。
[0075] 在一个实施方案中，上述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
[0076] 在一个实施方案中，上述重链可变区包含SEQ ID NO:7中(a)位置71是Lys，(b)位置73是Asn，(c)位置78是Val，或(d)(a)-(c)的任意组合的氨基酸序列。
[0077] 在一个实施方案中，上述重链可变区包含选自SEQ ID NOs:8-19的氨基酸序列。
[0078] 在一个实施方案中，上述重链可变区包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
[0079] 在一个实施方案中，上述重链可变区进一步包含包括氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)的FW4区。
[0080] 在一个实施方案中，上述轻链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
[0081] 在一个实施方案中，上述轻链可变区包含SEQ ID NO:21中(a)位置2是Phe，(b)位置45是Lys，(c)位置48是Tyr，或(d)(a)-(c)的任意组合的氨基酸序列。
[0082] 在一个实施方案中，上述轻链可变区包含选自SEQ ID NOs:22-33的氨基酸序列。
[0083] 在一个实施方案中，上述轻链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
[0084] 在一个实施方案中，上述轻链可变区进一步包含包括氨基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:34)的FW4区。
[0085] 进一步提供包含上述变体人IgG1重链恒定区、上述重链和轻链可变区及人轻链恒定区的上述人源化抗-α2整联蛋白抗体。
[0086] 因此在一个进一步的实施方案中，所述抗-α2整联蛋白抗体包含包括SEQ ID NO:47的重链和包括SEQ ID NO:56的轻链。
[0087] 在一个进一步的实施方案中，所述抗-α2整联蛋白抗体包含包括SEQ ID NO:48的重链和包括SEQ ID NO:56的轻链。
[0088] 在一个进一步的实施方案中，所述抗-α2整联蛋白抗体包含选自SEQ ID NO:49-55的重链和包括SEQ ID NO:56的轻链。
[0089] 进一步提供包含变体人IgG Fc区的抗体，该区包含在亲本抗体的氨基酸位置324上用天冬酰胺替换丝氨酸的氨基酸取代S324N，而所述抗体显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
[0090] 进一步提供包含变体人IgG Fc区的抗体，该区包含在亲本抗体的氨基酸位置324上用天冬酰胺替换丝氨酸的氨基酸取代S324N，而所述抗体与亲本抗体相比，显示改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)和改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。所述抗体可进一步包含在亲本抗体的氨基酸位置269上用天冬氨酸替换谷氨酸的氨基酸取代E269D和/或在亲本抗体的氨基酸位置298上用丙氨酸替换丝氨酸的取代S298A。所述抗体可选自下组：嵌合抗体、人源化抗体和完全人的抗体。所述抗体优选为人源化抗体，更优选为人源化抗-α2整联蛋白抗体。
[0091] 在一个实施方案中，上述人源化抗-α2整联蛋白抗体识别人α2整联蛋白的I结构域。
[0092] 在一个实施方案中，上述人源化抗-α2整联蛋白抗体结合α2β1整联蛋白。
[0093] 在一个实施方案中，上述人源化抗-α2整联蛋白抗体抑制α2或α2β1整联蛋白与α2β1整联蛋白配体的结合。通常α2β1整联蛋白配体选自胶原、层粘连蛋白、埃可病毒-1、核心蛋白多糖、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶I(MMP-I)、endorepellin、胶原凝集素和C1q补体蛋白，且优选为胶原。
[0094] 还提供编码上述人源化抗-α2整联蛋白抗体的分离的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
[0095] 还提供包含上述人源化抗-α2整联蛋白抗体和药学可接受的载体的组合物。
[0096] 还提供在受试者中治疗α2β1整联蛋白相关病症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物。所述α2β1整联蛋白相关病症包括炎性疾病、自身免疫性疾病和特征为异常的或增加的血管发生的疾病，特别是炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化症、雷诺综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦氏综合症、硬皮病、青少年型糖尿病、糖尿病性视网膜病、年龄相关的黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、癌症以及诱发炎性应答的感染，更特别地，多发性硬化症、类风湿性关节炎、视神经炎和脊髓创伤。
[0097] 可由上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物治疗的癌症选自下组：鳞状上皮细胞癌，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胃癌，包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾或肾部癌，肝癌，前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌瘤和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤，包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴癌(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度成免疫细胞性NHL；高度成淋巴细胞NHL；高度小无裂细胞NHL；大块病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与母斑病关联的异常血管增生，水肿如与脑瘤关联的，梅格斯氏综合征，黑素瘤，间皮瘤，多发性骨髓瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤和表皮样癌瘤。优选使用本文描述的抗-α2整联蛋白抗体治疗的癌症选自下组：乳癌、结肠直肠癌、直肠癌(rectal cancer)、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤(soft-tissue sarcoma)、卡波济肉瘤(kaposi's sarcoma)、类癌瘤(carcinoid carcinoma)、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。本发明的治疗可改善的癌症状况包括转移性癌。因此甚至更优选的是选自下组的癌症：乳癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、转移性前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波济肉瘤、类癌瘤、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、转移性结肠直肠癌和转移性乳癌。特别优选的是选自下组的癌症：非小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、前列腺癌、转移性前列腺癌、间皮瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、表皮样癌瘤、转移性结肠直肠癌、转移性前列腺癌和转移性乳癌。更特别优选的是选自下组的癌症：非小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、肝癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、前列腺癌、间皮瘤、纤维肉瘤、转移性结肠直肠癌、转移性前列腺癌和转移性乳癌。甚至更特别优选的是选自下组的癌症：胰腺癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、纤维肉瘤、转移性结直肠癌、前列腺癌、转移性前列腺癌和转移性乳癌。
最特别优选的是选自下组的癌症：胰腺癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和纤维肉瘤。最优选的是胰腺癌、乳癌或转移性乳癌，特别优选胰腺癌。相等地最特别优选的是前列腺癌或转移性前列腺癌。本文所指“乳癌”包括乳腺癌(mammary adenocarcinoma)。本发明的方法特别适用于血管化(vascularized)肿瘤的治疗。
最特别优选的是选自下组的癌症：胰腺癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和纤维肉瘤。最优选的是胰腺癌、乳癌或转移性乳癌，特别优选胰腺癌。相等地最特别优选的是前列腺癌或转移性前列腺癌。本文所指“乳癌”包括乳腺癌(mammary adenocarcinoma)。本发明的方法特别适用于血管化(vascularized)肿瘤的治疗。
[0098] 优选地，本方法与如下不关联：(a)血小板活化，(b)血小板聚集，(c)循环血小板计数的降低，(d)出血并发症，或(e)(a)到(d)的任意组合。
[0099] 还提供用于抑制白细胞与胶原结合的方法，所述方法包括对受试者施用有效抑制白细胞结合到胶原的量的上述人源化抗-α2整联蛋白抗体。
[0100] 还提供一种试剂盒，其包含用于α2β1整联蛋白相关病症治疗的上述人源化抗-α2整联蛋白抗体或上述组合物和说明书。
[0101] 人源化抗-α2整联蛋白抗体和轭合物(conjugates)的构建
[0102] 可以构建抗体，其中基于潜在的受体分子可变区和鼠抗体的轻链可变区之间的同源性考虑选择轻链可变区的人受体分子。种系候选的人受体分子优选减少潜在的免疫原性(immunogenicity)。种系数据库由通读过(read through)重链FW3区末端和部分读入CDR3序列的抗体序列组成。对于FW4区的选择，优选搜索已从选择的种系分子得到的成熟抗体序列的数据库，而且还优选选择相当同源(reasonably homologous)的FW4区用于重组抗体分子。人受体分子优选从与鼠供体分子相同的轻链类选择，且具有与鼠供体分子可变区相同的规范结构类(canonical structural class)。对于轻链可变区的人受体分子的选择的第二层的考虑包括鼠供体分子和人受体分子之间在CDR长度上的同源性。优选通过对V-BASE数据库的同源性搜索选择人受体抗体分子，也可使用其它数据库如Kabat和公用NCBI数据库。对于具有与TMC-2206相同或类似的表位特异性和/或功能特性的人源化抗-α2整联蛋白抗体，优选的轻链人受体分子是对FW1-3区的种系抗体序列A14和对FW4的序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:34)，其代表成熟kappa 1轻链的通常FW-4(如轻链序列AAB24132(NCBI条目gi/259596/gb/AAB24132))。
[0103] 可以构建抗体，其中基于潜在的受体分子可变区和鼠抗体重链可变区之间的同源性考虑来选择重链可变区的人受体分子。种系候选的人受体分子优选减少潜在的抗原性(antigenicity)。种系数据库由通读过重链FW3区末端和部分读入CDR3序列的抗体序列组成。对于FW4区的选择，优选搜索已从选择的种系分子得到的成熟抗体序列的数据库，而且还优选选择相当同源的FW4区以用于重组抗体分子。人受体分子优选选自和鼠供体分子相同的重链类，且具有与鼠供体分子的可变区相同的规范结构类。对于重链可变区的人受体分子的选择的第二层的考虑包括鼠供体分子和人受体分子之间在CDR长度上的同源性。优选通过对V-BASE数据库的同源性搜索选择人受体抗体分子，尽管也可使用其它数据库如Kabat和公用NCBI数据库。对于具有和TMC-2206相同或类似的抗原特异性和/或功能特性的抗-α2整联蛋白抗体，优选的重链受体分子是对FW 1-3区的种系抗体序列4-59和对FW 4区(SEQ ID NO:20)的从4-59种系序列得到的成熟抗体CAA48104.1(NCBI条目gi/33583/emb/CAA48104.1)。
[0104] 可以使用由Kohler等,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，或可以通过重组DNA方法制备(如美国专利号6,204,023)。还可以使用美国专利号6,025,155和6,077,677以及美国专利申请公布号2002/0160970和2003/0083293(另参见，如Lindenbaum,等,Nucleic Acids Research 32(21):0177(2004))中描述的技术制备单克隆抗体。
[0105] 通过向人源化抗-α2β1整联蛋白抗体DNA中引入合适的核苷酸变化，或通过多肽合成来制备人源化抗-α2β1整联蛋白抗体的氨基酸序列变体。这类变体包括，例如，在本发明的抗-α2整联蛋白抗体所示的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行氨基酸缺失、插入和取代的任意组合以取得最终的构建体，只要最终的构建体具有期望的属性。所述氨基酸变化还可改变人源化抗-α2整联蛋白抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
[0106] 存在多种用于使抗体成为人的或类人的(如“人源化”)方法。人源化抗体的方法在这些年已有所变化。一种方法是产生与人恒定区融合的鼠可变区，所谓的鼠-人Fc嵌合体(参见，例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984);美国专利号5,807,715)。另一种方法利用了如下事实，即CDR区可以基于其高变性质(Kabat等，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)),Kabat,Adv.Protein Chem.32:1-75(1978))和 规 范 结 构 (Chothia和 Lesk，J.Mol.Biol.196(4):901-17(1987);Lazakani等 ,J.Mol.Biol.272:929(1997))而被容易地鉴别，且仅通过将非人的CDR区(称为供体CDR)接枝到人框架(称为受体框架)上而人源化，例如由Jones等,Nature321(6069):522-5(1986);(参见，例如，美国专利号5,225,539;美国专利号6,548,640)所示的。六个CDR环可以以簇(cluster)呈现，且基于晶体学分析，可容易地鉴别所谓的CDR两侧或在重链-轻链接口处的“Vernier”带(zone)中的关键的框架残基(参见， 例 如，Chothia 和 Lesk,J.Mol.Biol.196(4):901-17(1987);Chothia 等 ,J.Mol.Biol.186(3):651-63(1985);Chothia等,Nature 342(6252):877-83(1989))。可以将这些残基回复突变为鼠残基以重建六个CDR的正确的相对定向(relative orientation)(参 见，例 如，Verhoyen等 ,Science 239(4847):1534-6(1988);Reichman等 ,Nature
332(6162):323-7(1988);Tempest 等 ,Biotechnology(NY)9(3):266-71(1991))。 由于可以在具有在小鼠和人之间相对高的同源性的家族中将可变区分类(在综述如Pascual和Capra Adv.Immunol.49:1-74(1991)中)，这些早期研究还指示，可以通过将对目标鼠抗体具有最高同源性的人种系序列选择用作人受体分子来使接枝的抗体中亲和力丧失的可能最小化(参见，例如，美国专利号5,225,539;Verhoyen等,Science
239(4847):1534-6(1988))。
332(6162):323-7(1988);Tempest 等 ,Biotechnology(NY)9(3):266-71(1991))。 由于可以在具有在小鼠和人之间相对高的同源性的家族中将可变区分类(在综述如Pascual和Capra Adv.Immunol.49:1-74(1991)中)，这些早期研究还指示，可以通过将对目标鼠抗体具有最高同源性的人种系序列选择用作人受体分子来使接枝的抗体中亲和力丧失的可能最小化(参见，例如，美国专利号5,225,539;Verhoyen等,Science
239(4847):1534-6(1988))。
[0107] 在如WO2007/056858中描述了人源化非人的α2整联蛋白抗体的方法。为了人源化抗-α2整联蛋白抗体，获得该非人抗体的起始材料，包括通过免疫制备或通过购买商业可获的抗体。用于人源化本发明中使用的抗体如人源化TMC-2206的示例性技术在WO2007/056858中描述。
[0108] 通过选择在维持如下的效果上显著不同的取代来完成抗体生物特性的实质性(substantial)修饰：(a)取代区域的多肽骨架的结构，例如，作为层(sheet)或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链大小。基于通常的侧链特性将天然存在的残基分为下组：(1)疏水的：正亮氨酸(norleucine),met,ala,val,leu,ile;(2)中性亲水的：cys,ser,thr;(3)酸性的：asp,glu;(4)碱性的：asn,gln,his,lys,arg;(5)影响链方位的残基：gly，pro;和(6)芳香族的：trp,tyr，phe。还可以取代任何不牵涉到维护人源化抗-α2整联蛋白抗体的正常构象(confirmation)的残基，一般用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性(oxidative stability)并预防异常的交联。相反地，可以向抗体加入半胱氨酸(cysteine)键以改善其稳定性(特别在所述抗体是抗体片段如Fv片段时)。
[0109] 抗体的另一氨基酸变体类型改变该抗体的原始糖基化模式。改变的意思是使抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块(carbohydrate moieties)缺失和/或加入一个或多个抗体中不存在的糖基化位点。
[0110] 抗体的糖基化通常不是N-连接就是O-连接。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(threonine)，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于碳水化合物模块酶附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列的任何一个在多肽中的存在创造了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺(aceylgalactosamine)、半乳糖或木糖附着于羟氨基酸上，最通常为丝氨酸或苏氨酸，虽然也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
[0111] 通过改变氨基酸序列以使其含有或缺少一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)来方便地实现抗体上糖基化位点的添加或缺失。还可通过原始抗体序列中一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、取代或缺失来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。通过本领域中多种已知方法制备编码人源化抗-α2整联蛋白抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于，从天然来源的分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或通过对人源化抗-α2整联蛋白抗体之前制备的变体或非变体形式的由寡核苷酸介导(或定点)的诱变、PCR诱变或盒诱变制备。
[0112] 正常地，人源化抗-α2整联蛋白抗体的氨基酸序列变体会具有与原始的人源化抗体的重链或轻链的氨基酸序列(例如，分别如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:30中的可变区序列)具有至少75%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，且最优选至少95%，包括例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%。关于该序列的同一性或同源性在本文中定义为在将序列比对且在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代(如上述)考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中与人源化抗-α2整联蛋白残基相同的氨基酸残基的百分比。不应将抗体序列中N-末端、C-末端或内部的延伸、缺失或插入中的任何一个理解为影响序列的同一性或同源性。因此可由通常用于比较两个多肽的氨基酸位置上相似性的标准方法确定序列同一性。使用计算机程序如BLAST或FASTA，将两个多肽比对以最佳匹配各自的氨基酸(或者沿着一个或两个序列的全长，或沿着一个或两个序列的预先确定的部分)。该程序提供缺省打开罚分(opening penalty)和缺省缺口罚分(gap penalty)，且可将打分矩阵如PAM250(标准打分矩阵；参见Dayhoff等,in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol 5,supp.3(1978))与该计算机程序结合使用。例如，可如下计算百分比同一性：将相同匹配的总数乘以100，在除以匹配跨度中较长序列的长度加上为了比对两序列而引入的缺口数的总和。
[0113] 在一些实施方案中，可期望生成多重特异(如双特异(bispecific))的人源化抗-α2整联蛋白抗体，其具有对至少两个不同表位的结合特异性。示例性的双特异抗体(如具有两个不同的结合臂)可结合到α2β1整联蛋白的两个不同的表位上。或者，可将一个抗-α2整联蛋白的臂和与白细胞上的触发分子如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)如FcγR1(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂组合，以在表面上结合有α2β1整联蛋白的细胞上聚集(focus)细胞防卫机制。双特异抗体可用于将细胞毒性剂定位于表面结合有α2β1整联蛋白的细胞。这些抗体具有α2β1整联蛋白结合臂和与细胞毒性剂(如白树毒素(gelonin)、皂草素(saporin)、抗-alpha干扰素、长春花生物碱(vinca alkaloid)、篦麻毒素A链或放射性同位素半抗原(radioisotope hapten))结合的臂。
[0114] 依据用于制备双特异抗体的另一种方法，可工程化(engineer)一对抗体分子之间的接口以使重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的接口至少包含抗体恒定结构域的CH3结构域的一部分。在该方法中，用更大的侧链(如酪氨酸(tyrosine)或色氨酸(tryptophan))替换一个或多个小的氨基酸侧链。通过用更小的(如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二个抗体的接口上创建与大侧链具有等同大小或更小的补偿间隙(compensatory cavities)。这提供了提高异二聚体相对于其它不需要的终产物如同二聚体的产量的机制(参见，例如，WO96/27011)。
[0115] 双特异抗体包括交联的(cross-linked)或异轭合物(heteroconjugate)的抗体。例如，异轭合物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白(avidin)偶联，另一个与生物素偶联。
可以使用任何方便的交联方法制备异轭合物。本领域中熟知合适的交联试剂，并且在例如美国专利号4,676,980中和许多交联技术一起公开。
可以使用任何方便的交联方法制备异轭合物。本领域中熟知合适的交联试剂，并且在例如美国专利号4,676,980中和许多交联技术一起公开。
[0116] 还考虑具有高于二效价(valencies)的抗体。例如，可以制备三特异的抗体(参见，例如，Tutt等,J.Immunol.147:60(1991))。
[0117] 免疫轭合物包含与下列轭合的人源化抗-α2整联蛋白抗体：一种模块，如一种分子、组合物、复合物；或试剂，例如一种细胞毒性剂如化疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)，或放射性同位素(如放射性轭合物)；以用于将该试剂靶向表达抗-α2整联蛋白的细胞、组织或器官。可在将模块或试剂靶向到特定活动位点的方法中使用这类免疫轭合物，所述特定活动位点的特征在于存在α2或α2β1整联蛋白。
[0118] 已在上面描述过在这类免疫轭合物的生成中有用的化疗剂。可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链(diphtheria A chain)、白喉毒素的非结合的活性片段、外毒素A链(exotoxin A chain)(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素(modeccin)A链、alpha-八叠球菌(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI,PAPII,和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)或单端孢霉烯(trichothecenes)。可以获得多种用于产生放射性轭合的212 131 90 186
抗-alpha 2整联蛋白抗体的放射性核素。实例包括 Bi, In, Y或 Re。
抗-alpha 2整联蛋白抗体的放射性核素。实例包括 Bi, In, Y或 Re。
[0119] 使用多种双功能蛋白偶联试剂制备抗体和细胞毒性剂的轭合物，所述双功能蛋白偶联试剂如N-琥珀酰亚胺基-3-2-二硫代吡啶-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate)(SPDP)、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯(imidoesters)的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(active esters)(如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(disuccinimidyl suberate))、醛(aldehydes)(如戊二醛(gluteraldehyde))、二叠氮基化合物(bis-azido compounds)(如二(p-叠氮苯)己二胺)、二重氮基衍生物(bis-diazonium derivatives)(如二-(p-重氮苯)-乙二胺)、二异氰酸盐(diisocyanates)(如甲苯基2,6-二异氰酸盐)或二重活性氟化合物(bis-active fluorine compounds)(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中描述的制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸苯甲基(isothiocyanatobenzyl)-3-甲基二乙烯基三胺五乙酸(methyldiethylene triaminepentaacetic acid)(MX-DTPA)是用于将放射性核素轭合到抗体的示例性螯合剂(参见，例如，WO94/11026)。
[0120] 在另一个实施方案中，所述抗体可与受体轭合(如抗生蛋白链菌素(streptavidin))以用于预靶向表达α2整联蛋白的细胞、组织或器官，其中对患者施用抗体-受体轭合物，接着使用澄清剂(clearing agent)从循环中除去未结合的轭合物，且随后施用与试剂如细胞毒性剂(如放射性核素)轭合的配体(如抗生物素蛋白)。
[0121] 本文公开的抗-α2整联蛋白抗体还可配制为免疫脂质体(immunoliposomes)。由本领域已知方法制备含有抗体的脂质体，如在Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82:3688(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);和 美 国 专 利 号
4,485,045和4,544,545中描述的。在美国专利号5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。
82:3688(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);和 美 国 专 利 号
4,485,045和4,544,545中描述的。在美国专利号5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。
[0122] 人源化抗-α2整联蛋白抗体还可以通过将所述抗体轭合到将前体药物(如肽基化疗剂,参见，例如，WO81/01145)转化为活性药物的前体药物活化酶上，而用于抗体导向的酶前体药物疗法(Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy)(ADEPT)(参见，例如，WO88/07378和美国专利号4,975,278)。
[0123] 通过本领域中熟知技术可将酶共价结合到抗-α2整联蛋白抗体上，所述技术包括上面讨论的异双功能交联试剂的使用。或者，可以使用本领域中熟知的重组DNA技术构建融合蛋白，该蛋白包含连接于酶的至少功能活性部分的抗-α2整联蛋白抗体的至少抗原结合区域(参见，例如，Neuberger等,Nature312:604-608(1984))。
[0124] 可以进行人源化抗-α2整联蛋白抗体的共价修饰，例如，通过化学合成或抗体的酶或化学切割。通过使抗体的靶向氨基酸残基和能与选择的侧链或N-或C-末端残基起反应的有机衍生化试剂(derivatizing agent)起反应，将抗体的其它类型的共价修饰引入该分子中。例如，半胱氨酰残基最通常与α-卤素醋酸(haloacetate)(和相应的胺)如氯醋酸或氯乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰残基还通过与溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴-β-(5-咪唑)丙酸、氯乙酰磷酸(chloroacetyl phosphate)、N-烷基马来酰亚胺(alkylmaleimides)、3-硝基-2-吡啶二硫化物(pyridyl disulfide)、甲基2-吡啶二硫化物、p-氯汞基苯甲酸盐(chloromercuribenzoate)、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯-2-噁-1,3-二唑的反应衍生。例如，组氨酰(Histidyl)残基通过与焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)在pH 5.5-7.0的反应衍生，因为该试剂对于组氨酰侧链是相对特异的。对溴苯酰甲基溴(Para-bromophenacyl bromide)也是有用的；该反应优选在pH 6.0的0.1M的二甲胂酸钠(sodium cacodylate)中实施。例如，赖氨酰(Lysinyl)和氨基末端残基与琥珀或其它的羧酸酐(anhydride)反应。用这些试剂的衍生化具有反转赖氨酰残基电荷的效果。其它适用于衍生含α-氨基的残基的试剂包括亚氨酸酯如methyl picolinimidate、吡哆醛磷酸盐(pyridoxal phosphate)、吡哆醛、氯硼氢化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)、O-甲基异脲(methylisourea)、2,4-戊二酮(pentanedione)和用乙醛酸的转氨酶催化反应。例如，精氨酰残基通过与一个或数个常规试剂的反应修饰，所述常规试剂中有苯甲酰乙二醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二酮(butanedione)、1,2-环己二酮(cyclohexanedione)和水合茚三酮(ninhydrin)。由于胍功能团的高pKa，精氨酸残基的衍生化需要该反应在碱性条件下实施。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸epsilon-氨基基团反应。例如，酪氨酰残基通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷(tetranitromethane)的反应被特异性修饰，而特别感兴趣地在酪氨酰残基中引入光谱标记。最通常地，使用N-乙酰咪唑(acetylimidazole)和四硝基甲烷(tetranitromethane)分别形成O-乙酰基酪氨酰物质(acetyl tyrosyl125 131
species)和3-硝基衍生物。使用 I或 I碘化酪胺酰残基以制备用于放射性免疫测定(radioimmunoassay)的标记蛋白。羧基侧基，例如天冬氨酰基或谷氨酰基，通过与碳化二亚胺(R-N=C=N-R')反应选择性地被修饰，其中R和R'是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰基和谷氨酰基转化为天冬酰胺酰基(asparaginyl)和谷氨酰胺酰基残基。时常分别将谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱去酰胺基为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。
这些残基的脱去酰胺基的形式在本发明的范围之内。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰(seryl)或苏氨酰基(threonyl)残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure和Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基基团的酰胺化。
species)和3-硝基衍生物。使用 I或 I碘化酪胺酰残基以制备用于放射性免疫测定(radioimmunoassay)的标记蛋白。羧基侧基，例如天冬氨酰基或谷氨酰基，通过与碳化二亚胺(R-N=C=N-R')反应选择性地被修饰，其中R和R'是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰基和谷氨酰基转化为天冬酰胺酰基(asparaginyl)和谷氨酰胺酰基残基。时常分别将谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱去酰胺基为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。
这些残基的脱去酰胺基的形式在本发明的范围之内。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰(seryl)或苏氨酰基(threonyl)残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure和Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基基团的酰胺化。
[0125] 另一类型的共价修饰牵涉到将糖苷化学地或酶法偶联到抗体上。这些操作是有利的，因为它们不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生所述抗体。根据使用的偶联模式，糖可以附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离的羧基基团，(c)游离的巯基基团如半胱氨酸的那些，(d)游离的羟基基团如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基基团(参见，例如，WO87/05330;Aplin和Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981))。
[0126] 可以实现抗体上存在的任何碳水化合物模块的移除，例如，化学地或酶法地。化学去糖基化需要将所述抗体暴露于化合物三氟甲磺酸(trifluoromethanesulfonic acid)或同等化合物中。该处理引起除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖的切割，而保留完整的抗体(参见，例如，Hakimuddin,等,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987);Edge等,Anal.Biochem.,118:131(1981))。抗体上碳水化合物模块的酶切割可以通过使用多种内切和外切糖苷酶完成(参见，例如，Thotakura等,Meth.Enzymol.138:350(1987))。
[0127] 抗体的另一类型的共价修饰包含将所述抗体连接到多种非蛋白性聚合物之一如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧乙烯上(参见，例如，美国专利号4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337)。
[0128] 本文描述了分离的编码人源化抗-α2整联蛋白抗体的核酸，以及包含该核酸的载体和宿主细胞，和用于该抗体生产的重组技术。对于抗体的重组生产，分离编码该抗体的核酸并将其插入到可复制的载体中以用于进一步的克隆(DNA扩增)或表达。使用常规的操作容易地分离编码该抗体的DNA并对其测序(如通过使用能与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可获的。载体的组件一般包括但不限于下列一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0129] 可以重组产生抗-α2整联蛋白抗体，包括具有异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异切割位点的其它多肽。选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和加工的(如由信号肽酶切割)。对于不识别和加工真核信号序列(如免疫球蛋白信号序列)的原核宿主细胞，将信号序列用原核信号序列取代，所述原核信号序列如果胶裂解酶(pectate lysase)(如pelB)、碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的肠毒素(enterotoxin)II前导序列。对于酵母分泌，可以利用酵母信号序列，包括例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物的细胞表达中，哺乳动物的信号序列以及病毒分泌前导序列如单纯疱疹(herpes simplex)gD信号是可获的且可以利用的。将这类前体区域的DNA(如信号序列)符合读码框地(in reading frame)连接到编码抗-α2整联蛋白抗体的DNA上。
[0130] 表达和克隆载体两者都含有能使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。一般地，在克隆载体中，该序列是能使载体独立于宿主染色体DNA复制的，且包括复制起点或自主复制序列。这类序列对于多种细菌、酵母和病毒是熟知的。例如，来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适用于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)对于哺乳动物细胞中载体的克隆是有用的。一般地，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(如通常使用SV40起点仅因为其含有早期启动子)。
[0131] 表达和克隆载体可含有选择基因，也称为可选择的标记。典型的选择基因编码某种蛋白，该蛋白(a)能给予对抗生素或其它毒素如氨卡青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)补助营养缺陷(auxotrophic deficiencies)，或(c)供给不能从复合培养基中获得的关键营养素(如编码杆菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因)。
[0132] 一个选择方案的实例利用一种药物停止宿主细胞的生长。这些被异源基因成功转化的细胞产生给予药物抗性的蛋白，并因此从选择方案(regimen)中生存下来。这类显性选择的实例使用如下药物：氨甲喋呤、新霉素、组氨醇、嘌呤霉素(puromycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
[0133] 用于哺乳动物细胞的另一合适的可选标记的实例是能鉴别有能力吸收(take up)抗-α2整联蛋白抗体核酸的细胞的那些，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
[0134] 例如，通过将所有转化体在含有氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中培养以首先鉴别出由DHFR选择基因转化的细胞。在使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)(CHO)细胞系。
[0135] 或者，可以通过在含有针对选择标记的选择试剂，包括氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的细胞生长来选择宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)，所述宿主细胞由编码抗-α2整联蛋白抗体、野生型DHFR蛋白和另一选择标记如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化(参见，如美国专利号4,965,199)。
[0136] 一个适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979))。所述trp1基因提供了用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(参见，例如，Jones,Genetics,85:12(1977))。酵母宿主细胞基因组中trp1损害的存在随后提供了一种通过色氨酸缺失下的生长检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷的酵母菌株(ATCC
20,622或38,626)由已知的具有Leu2基因的质粒补充。
20,622或38,626)由已知的具有Leu2基因的质粒补充。
[0137] 此外，从1.6μ环状质粒pKD1衍生的载体可用于克鲁维酵母的转化。或者，由Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)报告了一种乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的用于重组小牛凝乳酶(chymosin)的大规模生产的表达系统。还已经公开了通过克鲁维酵母工业菌株的用于成熟重组人血清白蛋白分泌的稳定的多拷贝表达载体(参见，例如，Fleer等,Bio/Technology,9:968-975(1991))。
[0138] 表达和克隆载体通常含有由宿主生物识别的启动子，且其可操作地与抗-α2整联蛋白抗体核酸连接。适用于原核宿主的启动子包括阿拉伯糖启动子(如araB)、phoA启动子、β-内酰胺酶(lactamase)和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。但是，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还含有可操作地连接于编码抗-α2整联蛋白抗体的DNA的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
[0139] 对于真核生物，启动子序列是已知的。大多数真核基因具有位于转录起始位点上游约25-30个碱基的AT富集区。发现的另一种位于许多基因的转录起点上游约70-80个碱基的是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在许多真核基因的3'端是AATAAA序列，其可以是向编码序列3’端添加poly A尾巴的信号。将这类序列合适地插入真核表达载体中。
[0140] 适用于酵母宿主的启动子序列的实例包括但不限于如下酶的启动子：3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。其它酵母启动子，即具有转录受生长条件控制的额外优点的诱导型启动子，是如下酶的启动子区域：醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酯酶、与氮代谢关联的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中进一步描述了适用于酵母表达的载体和启动子。酵母增强子也和酵母启动子一起有利地使用。
[0141] 在哺乳动物宿主细胞中，载体的抗-α2整联蛋白抗体转录受到如下启动子的调控，例如，从病毒基因组获得的启动子，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒(avian sarcoma virus)、细胞巨化病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒或猿病毒40(SV40)；从异源哺乳动物启动子获得的启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；从热激启动子获得的启动子，只要这样的启动子和宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段方便地获得。人细胞巨化病毒的立即早期启动子(immediate early promoter)以HindIII E限制片段方便地获得。在美国专利号4,419,446中公开了一个使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统，且在美国专利号4,601,978中描述了该系统的一种修饰(另参见Reyes等,Nature 297:598-601(1982)on expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of a thymidine kinase promoter from herpes simplex virus)。或者，可使用劳斯氏肉瘤病毒的长末端重复作为启动子。
[0142] 高等真核生物的编码抗-α2整联蛋白抗体的DNA的转录经常通过在载体中插入增强子序列提高。现在已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白(globin)、弹性蛋白酶(elastase)、白蛋白(albumin)、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但是，经常使用真核生物细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点更晚侧(late side)的SV40增强子(bp100-270)、细胞巨化病毒早期启动子增强子、位于复制起点更晚侧的多瘤增强子，以及腺病毒增强子(另参见，如Yaniv,Nature 297:17-18(1982)，关于用于活化真核启动子的增强元件)。增强子可以剪接到载体上抗-α2整联蛋白抗体编码序列5’或3’的位置上，但优选位于启动子5'的位点。可使用其它本领域中熟知的基因调节系统(例如诱导系统，如四TM
环素诱导系统和GeneSwitch )控制编码抗-α2整联蛋白的DNA的转录。
环素诱导系统和GeneSwitch )控制编码抗-α2整联蛋白的DNA的转录。
[0143] 用于真核生物(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其它多细胞生物的有核细胞)宿主细胞的表达载体还含有转录终止和稳定mRNA必需的序列。这类序列通常可从真核生物或病毒的DNA或cDNA的5’端和有时候3’端的非翻译区获得。这些区域含有转录为编码抗-α2整联蛋白抗体的mRNA的非翻译部分的聚腺苷酸化片段的核苷酸段。一个有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区域(参见，例如，WO94/11026和其中公开的表达载体)。
[0144] 适用于克隆或表达本文载体中DNA的宿主细胞是如上述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适用于该目的的原核生物包括真细菌，真细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希杆菌属(Escherichia)，如大肠杆菌，肠细菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。合适的大肠杆菌克隆宿主包括大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)。
[0145] 除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗-alpha 2整联蛋白抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母(common baker's yeast)是低等真核宿主微生物中最通常使用的。但是，许多其它属、种和菌株是通常可获的且有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主包括乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC
24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、K.thermotolerans，或马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；Trichoderma reesia(EP
244,234)；粗 糙 脉 孢 菌 (Neurospora crassa)；Schwanniomyces 如 Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌包括脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)，或曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、K.thermotolerans，或马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；Trichoderma reesia(EP
244,234)；粗 糙 脉 孢 菌 (Neurospora crassa)；Schwanniomyces 如 Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌包括脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)，或曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
[0146] 从多细胞生物得到适用于糖基化的抗-α2整联蛋白抗体表达的宿主细胞。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经从宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫),埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊),白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊),黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)，和家蚕(Bombyx mori)鉴定出了许多杆状病毒(baculoviral)菌株和变体及相应的受纳昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒菌株是公开可获的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，且可使用这类病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
[0147] 还可利用棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花(petunia)、番茄的植物细胞培养物作为宿主。
[0148] 然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，且脊椎动物细胞包括多种哺乳动物细胞的增殖已成为常规操作。有用的哺乳动物宿主细胞的实例包括：由SV40转化的猴肾CV1系(如COS-7,ATCC CRL 1651)；亚克隆以生长于悬浮培养中的人胚胎肾系293或293细胞(参见，如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(如BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括缺乏DHFR的CHO细胞(参见，例如，DHFR Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(sertoli cells)(如TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)；猴肾细胞(如CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(如VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(如HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(如MDCK,ATCC CCL 34)；大鼠肝细胞(如BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(如W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(如Hep G2,HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(如MMT 060562,ATCC CCL51)；
TRI细胞(参见，例如，Mather等,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；
FS4细胞；或人肝癌系(如Hep G2)。
TRI细胞(参见，例如，Mather等,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；
FS4细胞；或人肝癌系(如Hep G2)。
[0149] 将宿主细胞用上述的表达或克隆载体转化以供抗-α2整联蛋白抗体产生，并在修饰以适合诱导启动子、选择转化体和/或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。
[0150] 可以在多种培养基中培养用于产生抗-α2整联蛋白抗体的宿主细胞。商业可获的培养基如Ham's F10(Sigma),Minimal Essential Medium((MEM),(Sigma),RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM),Sigma)是 适 合 用于培养宿主细胞的。此外，可以使用Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90103430;WO 87/00195;或美国再版专利号30,985中描述的任何一种培养基作为宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种都可以视需要用下列补充：激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、TM
缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以终浓度在微摩范围内存在的无机化合物)，和葡萄糖或同等能量来源。还可以以本领域技术人员已知的合适的浓度纳入任何其它必需的补充物。培养条件如温度、pH等，由本领域技术人员选择，包括那些之前和选择的用于表达的宿主细胞使用的培养条件。
缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以终浓度在微摩范围内存在的无机化合物)，和葡萄糖或同等能量来源。还可以以本领域技术人员已知的合适的浓度纳入任何其它必需的补充物。培养条件如温度、pH等，由本领域技术人员选择，包括那些之前和选择的用于表达的宿主细胞使用的培养条件。
[0151] 可以从细胞包括微生物或哺乳动物细胞纯化抗-α2整联蛋白抗体，使用如蛋白A层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、渗析和/或亲和层析。蛋白A作为亲和配体的合适性依赖于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同型。可以使用蛋白A纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见，例如，Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G对于小鼠同型和人γ3是有用的(参见，例如，Guss等，EMBO J.5:1516-1517(1986))。亲和配体附着的基质最经常为琼脂糖，但其它基质是可获的。机械稳定的基质如受控多孔玻璃(controlled pore glass)或聚(苯乙烯二乙烯)苯((styrenedivinyl)benzene)允许比琼脂糖可达到的更快的流速和更短的处理时间。在抗TM体包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABX (J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)对纯化有用。蛋白纯化可包括一个或多个如下技术，如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅TM
上层析(chromatography on silica)、肝素SEPHAROSE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂上的层析(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和/或疏水相互作用层析。例如，在任何纯化步骤之后将包含目标抗体和污染物的混合物经过低pH疏水相互作用层析，使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度下实施(如从约0-0.25M的盐)。
上层析(chromatography on silica)、肝素SEPHAROSE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂上的层析(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和/或疏水相互作用层析。例如，在任何纯化步骤之后将包含目标抗体和污染物的混合物经过低pH疏水相互作用层析，使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度下实施(如从约0-0.25M的盐)。
[0152] 抗-α2整联蛋白抗体的配制剂，包括那些用于治疗施用的，通过将具有期望纯度的抗体与可选的生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))制备以用于储存，以冻干配制剂或水溶液的形式。可接受的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对于受试者是无毒的，且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯己双铵(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、氯化苄乙氧铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁基或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯(parabens)如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇(cyclohexanol)；3-戊醇和m-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖或其它碳水化合物包括葡萄糖、麦芽糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡例子如钠；金属复合物(如Zn蛋白复合物)；和/或TM TM
非离子型表面活性剂如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。对于治疗上的用途，本发TM
明的抗-α2整联蛋白抗体可在如含有0.03% Tween-80 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制。
非离子型表面活性剂如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。对于治疗上的用途，本发TM
明的抗-α2整联蛋白抗体可在如含有0.03% Tween-80 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制。
[0153] 抗体配制剂对治疗的特定适应症(indication)还可含有多于一种活性化合物，优选不具有相互之间不利影响的互补活性的那些。除了一种或多种目前使用以预防或治疗所述病症的试剂之外，还可期望使用抗-α2整联蛋白抗体。此外，还可期望进一步提供免疫抑制剂。这类分子以对意图目的有效的量合适地组合存在。
[0154] 还可以将活性成分俘获于(entrap)制备的微型胶囊中，例如，通过凝聚(coacervation)技术或界面聚合法(interfacial polymerization)，如分别的羟甲纤维素或明胶微型胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate)微型胶囊，在胶体给药系统(如脂质体、白蛋白微球(albumin microspheres)、微乳(microemulsions)、纳米颗粒或纳米胶囊)中，或在大型乳剂(macroemulsion)中。在如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中公开了这类技术。
[0155] 将在体内施用中使用的配制剂优选是无菌的。这是容易实现的，例如，通过经由无菌过滤膜的过滤。
[0156] 可以制备缓释制剂(Sustained-release preparations)。合适的缓释制剂的实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质以成形制品(shaped articles)的形式，如薄膜(films)或微型胶囊。缓释基质的实例包括聚酯(polyesters)、水凝胶(hydrogels)(如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚乙烯醇(poly(vinylalcohol))、聚乳酸化合物(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(ethylene-vinyl acetate)、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物如Lupron TMDepot (由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸使分子能释放超过100天，某些水凝胶以更短的时间段释放蛋白质。当包裹的抗体长时间保留在体内时，它们可能由于在37°C暴露于水分而变性或聚集，引起生物学活性的丧失和可能的免疫原性的改变。依据牵涉的机制可以设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制为经过硫-二硫互换的分子间S-S键的形成，可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂及开发特定的聚合物基质组分实现稳定。
[0157] 人源化抗-α2整联蛋白抗体的治疗用途
[0158] 可使用抗-α2整联蛋白抗体治疗各种如本文所述的α2β1整联蛋白关联的病症。通过任何合适的方法施用抗-α2整联蛋白抗体，包括胃肠外的、皮下的、腹膜内的、肺内的或鼻内的。如果期望局部的免疫抑制治疗，进行抗体的病变内给药(intralesional administration)(包括移植前用抗体预灌注或者接触移植物)。胃肠外给药包括肌内的、静脉的、动脉内的、腹膜内的或皮下的给药。此外，可以通过脉动输注将抗-α2整联蛋白抗体合适地给药，例如，用逐渐下降剂量的抗体。优选通过注射给药(dosing)，最优选静脉内或皮下输注。这可部分依赖于给药是简短的还是长期的。更优选地，将如本文所述的抗-α2整联蛋白抗体或组合物在本发明的方法中通过静脉输注、静脉推注(intravenous bolus)、皮下给药、皮下输注或皮下推注给药，而最优选是静脉输注或静脉推注。术语“静脉输注”指将药物在大于约5分钟的时间段内引入动物或人患者的静脉中，优选在约30-90分钟之间，尽管依据本发明，静脉输注给药或者为10小时或更短。术语“静脉推注”或“静脉推压”指如此向动物或人的静脉给药以致躯体在约15分钟或更短的时间内接受药物，优选5分钟或更短。术语“皮下给药”指通过从药容器的相对缓慢持续的输送将药物引入动物或人患者的皮下，优选在皮肤和皮下组织之间的袋(pocket)内。可以通过挤捏或将皮肤拉起和从皮下组织上拉开来创建袋。术语“皮下输注”指通过从药容器的相对缓慢持续的输送一段时间在动物或人患者的皮肤下引入药物，优选在皮肤和皮下组织之间的袋内，所述时间包括但不限于，30分钟或更短，或90分钟或更短。术语“皮下推注”指在动物或人患者的皮下给药，其中药物推注输送优选少于约15分钟，更优选少于5分钟，且最优选少于60秒。给药优选在皮肤和皮下组织之间的袋内，其中通过例如挤捏或将皮肤拉起和从皮下组织上拉开来创建所述袋。可选地，可以通过在动物或人患者的皮下植入输药泵进行输注，其中所述泵以预定的时间段输送预定量的药物，例如30分钟、90分钟或跨越治疗方案时长的时间段。间断或周期的给药是在一定时间段内连续给药且有常规的优选由大于一天分隔的时间间隔。
[0159] 本文同义使用的“治疗有效量”或“有效量”指本文描述的抗-α2整联蛋白抗体有效改善或预防症状或延长治疗的受试者存活的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，特别是按照本文提供的详细的公开。本文描述的抗-α2整联蛋白抗体的术语“治疗有效量”特别指延迟或抑制癌症如肿瘤生长需要的量。
[0160] 对于α2β1整联蛋白相关病症的预防或治疗，抗体的合适剂量将依赖于待治疗的疾病类型，如上定义的，疾病的严重程度和病程，所述抗-α2整联蛋白抗体给药用于预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医师的判断。对患者以一次治疗或一系列治疗合适地施用抗体。
[0161] 因此，在本发明的方法中，可以对受试者施用抗-α2整联蛋白抗体，优选对人，以范围从约0.1到约100mg/kg的治疗有效量。优选地，对受试者，优选对人，施用范围从约1到约20mg/kg的治疗有效量，更优选地范围从约3到约10mg/kg的治疗有效量。可以对受试者以一个或多个治疗有效剂量施用治疗有效量的人源化抗体或其结合片段。
[0162] 对于α2β1整联蛋白相关病症的预防或治疗，抗体的合适剂量将依赖于待治疗的疾病类型，如上定义的，疾病的严重程度和病程，所述抗-α2整联蛋白抗体给药用于预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医师的判断。对患者以一次治疗或一系列治疗合适地施用抗体。
[0163] 根据α2β1整联蛋白相关病症的类型和严重程度，从约0.1mg/kg到约100mg/kg的抗体是对受试者给药的起始候选剂量，或者是通过如一次或多次单独的给药，或者是通过连续的输注。根据上面提到的因素，对于如人的典型每日剂量可在从0.1mg/k到20mg/kg或更多的范围内。对于经过几天或更长的重复给药，根据条件，持续治疗直到发生期望的疾病症状的抑制。但是，其它剂量方案可以是有用的，例如，每两周一次的剂量方案似乎是优选的。本领域技术人员可容易地监控该治疗的进展。
[0164] 将抗-α2整联蛋白抗体组合物以与优良的医疗实践一致的方式配制、给药和施用。在此背景中要考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定的哺乳动物、个体患者的临床条件、病症的起因、试剂的输送位点、给药方法、给药安排、药理学和毒性研究的结果以及医疗实践者已知的其它因素。由这类考虑确定待施用的抗体的治疗有效量，并且是预防、改善或处理α2β1整联蛋白相关病症需要的最小量。这样的量优选低于对宿主有毒性或使宿主对感染显著更易感的量。
[0165] 抗-α2整联蛋白抗体不需要，但可以可选地作为辅助治疗和一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的试剂一起配制、共给药或使用。例如，在类风湿性关节炎中，可以将抗体和糖皮质类固醇(glucocorticosteroid)、 或任何批准的治疗联合给药用于类风湿性关节炎。对于多发性硬化症，可以将抗体和干扰素β、Avonex、Copaxon或其它批准的疗法联合给药用于治疗多发性硬化症的征兆(sign)和症状。对于移植，可以将抗体与上面定义的免疫抑制剂如环孢霉素A同时或分开地给药，以调节免疫抑制效果。或者，或此外，可以对遭受α2β1整联蛋白相关病症痛苦的哺乳动物施用α2β1整联蛋白拮抗剂。这样的其它试剂的有效量依赖于配制剂中存在的抗-α2整联蛋白抗体的量、病症或治疗的类型以及上面讨论的其它因素。一般以如上文使用的相同剂量和给药途径使用这些，或迄今使用剂量的约从1到99%。
[0166] 下列实施例作为例示而不是作为限制提供。说明书中所有引用的公开通过提述明确地并入本文。实施例
[0167] 实施例1：具有增强的补体介导的效应子功能的人源化抗-ALPHA2整联蛋白抗体变体
[0168] 该处描述的人源化抗-α2整联蛋白抗体代表了抗-α2(抗-VLA2)抗体的新的亚型，其特征在于意外的缺少体内出血并发症和/或缺少血小板α2β1整联蛋白的活化。但是WO2007/056858中公开的IgG4抗体不携带效应子功能如ADCC和/或CDC，其在特定情况下是期望的，例如对于α2β1整联蛋白相关的癌症的治疗，其中该功能性可导致治疗效能的提高。因此，期望开发出高度显示这些效应子功能的抗-α2β1整联蛋白抗体。
[0169] 人IgG的四个同型在效应子功能和其它活性中的效力彼此不同。一般地，效力的排序对ADCC为IgG1≥IgG3>>IgG4≥IgG2而对CDC为IgG3≥IgG1>>IgG2=IgG4(Niwa R.等,J Immunol Methods 2005;306:151–60)。在本研究中，使用WO2007/056858公开的一个抗-VLA-2 IgG4抗体(具有重链SEQ ID NO:57和轻链SEQ ID NO:56)创建由天然产生的人抗体同型变体IgG1、IgG2和IgG3组成的抗-VLA2抗体的新的亚组；工程化的人IgG1同型变体，以及人IgG1和人IgG3同型变体的嵌合体。通过基于重叠PCR组装方法(overlap PCR assembly methods)的诱变技术创建所有变体。
[0170] 为了生成全抗体变体，将每个新创建的重链载体与相同的抗-VLA-2kappa轻链载体转染，所述轻链载体携带编码轻链序列(SEQ ID NO:56)的抗-VLA-2 kappa轻链cDNA且和下述重链载体具有完全相同的表达调节元件。因此，新的抗-VLA2抗体变体的重链定义了一种新的全抗体变体；因此以相同的名字命名重链和相应的全抗体。
[0171] 基于天然产生的人抗体同型的变体
[0172] 为了创建天然产生的同型变体重链，将抗-VLA-2 IgG4抗体的编码SEQ ID NO:57(Kabat残基119(对应于SEQ ID NO:57中的残基121)至其C-末端)的重链铰链和恒定结构域的cDNA用相应的编码人IgG1(NCBI GenBank登录号J00228.1,从残基1至其C-末端的序列)、人IgG2(NCBI GenBank登录号J00230.1从残基1至其C-末端的序列)和人IgG3(NCBI GenBank登录号X03604.1，从残基2至其C-末端的序列)的铰链和恒定结构域的氨基酸的cDNA序列替换。这些天然产生的重链的变体随后定义了新的抗-VLA2抗体，其被分别命名为重链抗-VLA2 IgG1(SEQ ID NO:44)、重链抗-VLA2 IgG2(SEQ ID NO:45)和重链抗-VLA2 IgG3(SEQ ID NO:46)。
[0173] 基于人IgG1/IgG3铰链-Fc结构域改组的变体
[0174] 与人IgG1抗体相比，人IgG3抗体一般具有增强的CDC，这一部分是由于IgG3 Fc具有比IgG1 Fc高的C1q结合亲和力(Schumaker VN等,Biochemistry，1976,15:5175–81.)。采取了人IgG1铰链和恒定结构域与人IgG3铰链和恒定结构域的改组策略以生成具有增强的CDC的抗-VLA-2 IgG4嵌合体。
[0175] 构建了两个嵌合体。基于抗-VLA-2 IgG4的第一个嵌合体被工程化为将来自人IgG1的CH1和铰链融合到人IgG3的Fc部分，且在本文中被称为重链抗-VLA-2 IgG-1133(SEQ ID NO:47)；而基于抗-VLA-2 IgG3的第二个构建体被工程化为将来自人IgG3的铰链用来自人IgG1的铰链取代，后一个嵌合体在本文中被称为重链抗-VLA-2 IgG-3133(SEQ ID NO:48)。
[0176] 为了创建抗-VLA-2 IgG-1133重链cDNA编码序列(SEQ ID NO:47)，将抗-VLA-2 IgG1的表达载体中编码CH2和CH3恒定结构域的抗-VLA-2 IgG1的重链cDNA部分(编码Kabat残基231至其C-末端)替换为人IgG3重链基因的相应的部分(NCBI GenBank登录号X03604.1，残基161至377)。对于抗-VLA-2 IgG-3133重链cDNA编码序列(SEQ ID NO:48)，将抗-VLA-2 IgG3重链的表达载体中编码铰链区的抗-VLA-2 IgG3的重链cDNA部分(来自NCBIGenBank登录号X03604.1的ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP)替换为人IgG1重链基因(NCBI GenBank登录号J00228.1)的相应的部分(EPKSCDKTHTCPPCP)。
[0177] 具有增强的CDC的氨基酸变体抗-VLA2抗体
[0178] 以增强补体依赖性细胞毒性(CDC)为目的设计许多抗-VLA-2 IgG1的变体。与Fc和Fcγ受体的相互作用介导ADCC的方式相同的，Fc和补体成分C1q的相互作用介导CDC。虽然目前不可获得Fc/C1q复合体的3D结构，数个研究已经将人IgG上C1q的结合位点定位到以残基D270,K322,P329和P331为中心的区域(Idusogie等,J Immunol Methods2000,164:4178-4184)。在CH2结构域的D269-K334区域设计氨基酸修饰以探索可以介导抗-VLA-2IgG1抗体的增强的CDC的变体。
[0179] 为了创建这些变体cDNA编码序列，将编码该抗-VLA-2 IgG1重链(SEQ ID NO:44)cDNA的cDNA突变以包括如下取代：S324N(此处称为抗-VLA-2IgG1-S324N;SEQ ID NO:49),E269D(此处称为抗-VLA-2 IgG1-E269D;SEQ ID NO:50)和S298A(此处称为抗-VLA-2 IgG1-S298A;SEQ ID NO:51)。通过将这些点突变组合配对以创建进一步的变体：组合E269D、S298A以生成此处称为抗-VLA-2 IgG1-E269D/S298A(SEQ ID NO:52)的变体；
另一个此处称为抗-VLA-2 IgG1-E269D/S324N(SEQ ID NO:53)的组合由E269D和S324N组成；第三个此处称为抗-VLA-2 IgG1-S298A/S324N(SEQ ID NO:54)的组合将S298A和S324N突变组合。最终加入所有三个突变以创建此处称为抗-VLA-2IgG1-E269D/S298A/S324N(SEQ ID NO:55)的变体。
另一个此处称为抗-VLA-2 IgG1-E269D/S324N(SEQ ID NO:53)的组合由E269D和S324N组成；第三个此处称为抗-VLA-2 IgG1-S298A/S324N(SEQ ID NO:54)的组合将S298A和S324N突变组合。最终加入所有三个突变以创建此处称为抗-VLA-2IgG1-E269D/S298A/S324N(SEQ ID NO:55)的变体。
[0180] 这些变体编码DNA序列被连接到一个基于修饰的pREP4(Invitrogen,CA,USA)载体的载体上，该载体携带CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号。在这个表达载体中，由鼠VJ2C前导肽驱动分泌。
[0181] 抗-VLA2抗体变体的产生
[0182] 对于瞬时表达，将等量的每个载体重链(如上)和抗-VLA-2 kappa轻链载体使用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine)(PEI)共转染到悬浮适应的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中。一般地，将悬浮液中密度为每毫升0.8-1.2百万细胞的100ml细胞用含有50μg编码变体重链的表达载体和50μg表达载体轻链的DNA-PEI混合物转染。在将编码每个工程化的链基因的重组表达载体引入宿主细胞时，通过进一步将细胞培养4到5天的时间产生构建体，以允许分泌到由0.1%普流尼克酸、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素(geneticin)补充的培养基(EX-CELL 293,HEK293无血清培养基，Sigma,Buchs,Switzerland)。然后使用重组Streamline rProtein A培养基(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,Switzerland)从无细胞的上清纯化构建体，并用于进一步的分析。
[0183] 表1列入了这些变体中一些的表达水平。
[0184] 表1：抗-VLA2抗体变体的瞬时表达水平
[0185]抗体 表达(mg/L)
抗-VLA-2 IgG1 30
抗-VLA-2 IgG2 8
抗-VLA-2 IgG3 1
抗-VLA-2 IgG1-S324N 10
抗-VLA-2 IgG-1133 4
抗-VLA-2 IgG-3133 1.4
抗-VLA-2 IgG1 30
抗-VLA-2 IgG2 8
抗-VLA-2 IgG3 1
抗-VLA-2 IgG1-S324N 10
抗-VLA-2 IgG-1133 4
抗-VLA-2 IgG-3133 1.4
[0186]
[0187] HT1080细胞上的补体介导的毒性
[0188] 使用基于细胞的测定法测量变体介导CDC的能力。
[0189] 使 用 乳 酸 脱 氢 酶(LDH) 的 释 放 监 控 通 过 仔 兔 补 体(Harlan Laboratories,C-0099F,AN VENRAY，The Netherlands)的变体调理(variant-opsonized)的HT1080细胞的裂解来测量裂解。将靶细胞(HT1080, No.CCL-121)用完全培养基(用胎牛血清(FBS,Chemie Brunschwig AG，PAA,Basel,Switzerland)和1% Ultraglutamine(Lonza,Verviers,Belgium)补充的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA,Basel,Switzerland))通过离心和重悬洗涤两次。以1μg/ml的终浓度添加变体-抗体。将仔兔血清用完全培养基稀释为7.5%并加入抗体调理的靶细胞中。将平板在37°C温育3小时。
[0190] 使用Cyto Tox 96非 放 射性 细胞 毒性 测 定试 剂盒 测量 细胞 毒 性(Promega,Madison,USA)。
[0191] 图1显示了该测定的典型结果，其具有一式三份实施的数据±标准差。在本测定中，观察到极少的由于IgG1对照(数据点编号12)或亲本抗-VLA-2IgG4抗体(数据点编号1)或抗-VLA-2 IgG2(数据点编号3)抗体产生的特异性裂解。由于从后面的天然产生的同型中期望没有至极低水平的CDC，抗-VLA-2 IgG1(数据点编号2)没有导致任何显著的CDC的提高是令人意外的，因为曾预期IgG1抗体同型具有超过IgG4和IgG2同型的CDC。仅当存在S324N突变时，抗-VLA-2 IgG1-S324N的CDC至少提高6.4倍(数据点编号7)，抗-VLA-2 IgG1-S298A/S324N至少提高6.6倍(数据点编号11)，以及抗-VLA-2 IgG1-E269D/S298A/S324N至少提高9倍(数据点编号10)。对于具有人IgG3抗体同型恒定区的抗体变体，补体诱导的裂解也极大地提高，抗-VLA-2 IgG-1133的CDC至少提高5.6倍(数据点编号
5)，而抗-VLA-2IgG-3133至少提高8.6倍(数据点编号6)。在天然产生的变体抗-VLA-2 IgG3(数据点编号4)观察到最佳的CDC提高，其相对亲本抗-VLA-2 IgG4抗体至少增强9.6倍。最后，这些结果提供了证据，即抗-VLA-2 IgG1抗体背景中的S324N突变能恢复有力的补体诱导的裂解，而抗-VLA-2 IgG3变体是引起CDC的最有力的抗-VLA2抗体变体。
5)，而抗-VLA-2IgG-3133至少提高8.6倍(数据点编号6)。在天然产生的变体抗-VLA-2 IgG3(数据点编号4)观察到最佳的CDC提高，其相对亲本抗-VLA-2 IgG4抗体至少增强9.6倍。最后，这些结果提供了证据，即抗-VLA-2 IgG1抗体背景中的S324N突变能恢复有力的补体诱导的裂解，而抗-VLA-2 IgG3变体是引起CDC的最有力的抗-VLA2抗体变体。
[0192] 实施例2：具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的人源化抗-ALPHA2整联蛋白抗体变体
[0193] 评估实施例1描述的研究中调查的抗-VLA2抗体变体引起ADCC的能力。
[0194] 使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega,Madison,USA)通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法测量抗体的ADCC活性。通过标准的菲科帕克(Ficoll-paque)分离从柠檬酸化的全血中纯化人外周血单核细胞(PBMC)，重悬于完全培养基(用10%胎牛血清(FBS,Chemie Brunschwig AG，PAA,Basel,Switzerland)、2mM超谷氨酰胺(ultraglutamine)1(Lonza,Verviers,Belgium)和1%青霉素/链霉素(Chemie Brunschwig AG，PAA,Basel,Switzerland))和100U/ml人IL-2(Sigma,Missouri,USA)补充的RPMI-1640培养基(Chemie Brunschwig AG，PAA,Basel,Switzerland))并在37°C过夜温育。第二6
天，通过离心收集PBMC，洗涤两次且以8x10 细胞/ml的密度重悬于培养基中。使用细胞系
6
HT1080作为靶细胞。将HT1080细胞洗涤两次并以0.2x10 细胞/ml的密度重悬于完全培养基中。将稀释为1.5μg/ml的50微升抗体，以终浓度为0.1μg/ml(图2)或0.01μg/ml(图3)与50μl的靶细胞混合，并添加到相等体积的PBMC中，加入U型底的96孔板。整个实验中使用1:40的靶效比(target to effector ratio)。在37°C温育4小时后，将细胞离心并收集50μl的无细胞上清样品，将其转移到平底的96孔板并对其测定。裂解百分比如下计算：(样品释放-靶自发释放-效应子自发释放)/(最大释放-靶自发释放)*100；
其中靶自发释放是来自仅含有靶细胞的孔的荧光，效应子自发释放是来自仅含有效应子细胞的孔的荧光，且最大释放是来自含有用裂解缓冲液处理过的靶细胞的孔的荧光。将没有抗体(靶细胞+效应子细胞)时获得的裂解的背景百分比从样品的裂解百分比减去；所示数据是使用同一供体分离的PBMC的三个孔的平均毒性百分比±标准差。
天，通过离心收集PBMC，洗涤两次且以8x10 细胞/ml的密度重悬于培养基中。使用细胞系
6
HT1080作为靶细胞。将HT1080细胞洗涤两次并以0.2x10 细胞/ml的密度重悬于完全培养基中。将稀释为1.5μg/ml的50微升抗体，以终浓度为0.1μg/ml(图2)或0.01μg/ml(图3)与50μl的靶细胞混合，并添加到相等体积的PBMC中，加入U型底的96孔板。整个实验中使用1:40的靶效比(target to effector ratio)。在37°C温育4小时后，将细胞离心并收集50μl的无细胞上清样品，将其转移到平底的96孔板并对其测定。裂解百分比如下计算：(样品释放-靶自发释放-效应子自发释放)/(最大释放-靶自发释放)*100；
其中靶自发释放是来自仅含有靶细胞的孔的荧光，效应子自发释放是来自仅含有效应子细胞的孔的荧光，且最大释放是来自含有用裂解缓冲液处理过的靶细胞的孔的荧光。将没有抗体(靶细胞+效应子细胞)时获得的裂解的背景百分比从样品的裂解百分比减去；所示数据是使用同一供体分离的PBMC的三个孔的平均毒性百分比±标准差。
[0195] 图2显示了由于IgG1对照抗体或亲本抗-VLA-2 IgG4抗体的极少特异性的ADCC(数据点编号分别为1和12)；所示数据证明天然产生的抗-VLA2抗体的人IgG1+同型对于VLA-2 表达细胞具有增强的细胞毒性，且更优选地，抗-VLA2-IgG1抗体点突变体具有如下的效力排序：抗-VLA2-IgG1-S298A/S324N(数据点编号11；提高2倍)>抗-VLA2-IgG1-S298A(数据点编号8;提高1.8倍)>抗-VLA2-IgG1(数据点编号2;
提高1.7倍)或抗-VLA2-IgG1-E269D/S298A/S324N(数据点编号10;提高1.7倍)>抗-VLA2-IgG1-E269D(数据点编号9;提高1.5倍)。
提高1.7倍)或抗-VLA2-IgG1-E269D/S298A/S324N(数据点编号10;提高1.7倍)>抗-VLA2-IgG1-E269D(数据点编号9;提高1.5倍)。
[0196] 图3显示抗-VLA2抗体在抗体稀释10倍时维持类似的ADCC效力排序。
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