本发明涉及新型肽，它们是有用的抗凝血剂和抗血小板剂。

抗凝血剂在例如急性深度静脉血栓形成、肺栓塞、急性末端动脉 栓塞、心肌梗塞形成、中风和播散性血管内凝固的治疗中是有用的治 疗剂。认为抗凝血剂的预防用药能防止风湿性或动脉硬化性心脏病 病人栓塞的复发，防止某些外科血栓栓塞性并发症。抗凝血剂用药 已用于冠状动脉和脑血管疾病的治疗中。动脉血栓形成，特别是给 心肌和脑供血的动脉，是主导死因。

血小板介导的动脉血栓形成是前段中所列疾病的主要致病机 理。因此，血小板凝聚和凝血酶的联合抑制提出一种设计抗血栓剂 的有用途径。血纤维蛋白原通过Arg—Gly—Asp(RGD)序列与活 化的血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体(整合蛋白(integrin)族的一 员)结合，是各种主动肌诱发的血小板凝聚的基本步骤。F.A.Mar- guerie等，J.Biol.Chem.254,5357—5363(1979)；D.Collen等， Thrombolysis in Cardiovascular Disease，D.Julian，等(编)，Marcel Dekker，Inc.，New York(1989)；pp45—67。含直链和环状RGD的合 成肽抑制这种结合。E.F.Plow等，Prog.Hemostas.Thromb.9，117 —156(1989)；E.F.Plow等，Proe.Natl.Acad.Sci.，USA82，8057— 8061(1985)。

近期研究表明，在单杂交肽中结合凝血酶抑制和血小板糖蛋白 (GP)IIb/IIIa(结合)受体阻断导致抗凝血剂和抗血小板的活性。F. C.Church等，J.Biol.Chem.266，11975—11979(1991)。另外，近期 报道了结合催化和阴离子外部结合序列抑制剂成分的肽凝血酶抑制 剂。J.M.Maraganore等，Biochemistry，29，7095—710l(1990)和J. DiMaio等，J.Biol Chem.，265，21698—21703(1990)。确定这些肽的 活性的关键特征是通过适宜长度的间隔区结合到凝血酶活性部位和 外部的两组分的分离。这些研究表明，在催化部位抑制剂和阴离子 外部结合序列间含有最少4个氨基酸残基的肽是最大凝血酶抑制所 必需的。这些报道支持交联研究所得出的结果，交联研究表明，结 合到凝血酶上阴离子外部结合部位的水蛭素类似物的NH2末端和 凝血酶催化袋中Ser—195的羟基之间的距离约为18—20。B.Fu- rie等，J，Biol.Chem.，257，3875—3882(1982)和W.Bode等，EM- BO J.，8，3467—3475(1989)。

1992年6月25日公开的专利合作条约申请公开号WO92/ 10575特别公开了血小板活化和凝血酶的三功能抑制剂。这些抑制 剂包括糖蛋白IIb/IIIa抑制部分和凝血酶抑制部分，凝血酶抑制部 分包括结合到并抑制凝血酶活性部位的指向催化部位的部分。指向 催化部位的部分通过带有计算长度约在18和42之间的主链的 连接基团结合到阴离子外部结合部位缔合部分。

申请人已发现，当凝血酶催化部位抑制剂(例如，(D)Phe—Pro —Arg，或其类似物)通过环状Arg—Gly—Asp—X“桥接”序列与阴 离子外部结合部位缔合部分(水蛭素55-65类似物)结合时，得到结合 了凝血酶的催化和阴离子外部结合部位抑制以及血小板糖蛋白 (GP)IIb/IIIa受体抑制的三功能肽。另外当提供连接凝血酶催化部 位抑制剂和水蛭素55-65类似物的二硫键的半胱氨酸残基是(D)构型 时，发现肽的抑制血小板凝聚和抗凝血剂活性显著提高。当正亮氨 酸代替了环状Arg—Gly—Asp—X“桥接”序列中的苯丙氨酸时，活 性还可提高。这种新型化合物由于双重作用方式和能力提高，将提 供有效的辅助治疗。

下式化合物

                X—A—B—C—Y(1)

式中，X是一种氨基端残基，选自氢、一种或两种1至6个碳原 子的烷基、一种或两种2至10的碳原子的酰基、羰苄氧基、 H2NC(＝NH)—或叔丁氧基羰基；

A是一种下式肽类似物

                A1—A2—A3(2)

式中，

A1是(D)Phe，(D)phg，(D)1—Tiq，(D)3—Tiq，N—Me—(D) Phe，(D)Cha，(D)Chg，(D)Nag，或(D)Thg；

A2是Pro，Pip或Azt；

A3是Arg，Lys，Orn，或hArg；

B是下式肽类似物 或

式中，

B1是Gly，Ala，(D)Ala，Val，(D)Val，或Gly—Gly；

B2是Gly，Gly—Gly，Gly—Gly—Gly，Gly—Gly—Gly—Gly或任 何(D)氨基酸；

B2′是Arg—Ile—Pro或Lys—Ile—Pro；

B3是Arg，hArg，N—Me—Arg或Lys；

B4是Nle，Phe，Met或Cha；

C是下式肽类似物

Asp—C1—C2—C3—C4—C5—C6—C7—C8—C9    (5)

式中，

C1是Phe，pClPhe，pNO2Phe，Tha，Npa，Tyr或Trp；

C2是Glu或Asp；

C3是任何氨基酸；

C4是Ile，Val，Leu或Phe；

C5是Pro，Hyp，Sar，NMePgl或D—Ala

C6是任何氨基酸；

C7是任何氨基酸；

C8是Tyr，Glu，Pro，Ala—Cha，Tur—Cha，Tur—Leu和Ala— Tyr；

C9是一种键或是Glu，(D)Glu，Gln，Pro，Leu—Gln，Asp— Glu，或Leu—Pro；以及

Y是羧基端残基，选自OH，C1—C6烷氧基、氨基、单或双(C1— C4)烷基取代的氨基，或苄氨基； 或其药学上可接受的盐是有用的抗凝血剂。本发明还涉及将上述化 合物用于血管成形术后的急性闭塞、体外循环诱发的血细胞减少症、 进行性心肌梗塞形成和血纤维蛋白溶解疗法后的闭塞。

图1以条线图形式表明在鼠中肽2对FeCl3动脉闭塞时间的影 响。用没画阴影的条线表示对照，用画阴影的条线表示肽2。图中，p 表示概率，n表示被测试动物的数量。

图2以条线图形式表示在鼠中肽2d(不属于本发明对FeCl3动 脉闭塞的影响。用没画阴影的条线表示对照，用画阴影的条线表示 肽2。图中，p表示概率，n表示被测试动物的数量。

图3表示肽1对凝血酶增强的全血凝聚的影响。(▲)代表人血 样，(+)代表鼠血样。

图4表示在麻醉的狗中，肽1输注对凝血酶时间的影响。(▲) 代表5nmol/Kg/nin的速率，(+)代表1nmol/Kg/min的速率， ( )代表输注期。

图5表示在麻醉的狗中，肽1对aPTT的影响。(▲)代表5n- mol/Kg/min的速度，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，( )代表输 注期。

图6表示在狗中肽1输注对凝血酶—血小板凝聚的影响。(▲) 代表5nmol/Kg/min速率，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，( ) 代表输注期。

图7表示在麻醉的狗中肽1对出血时间的影响。(▲)代表 5nmol/Kg/min的速率，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，( )代表 输注期。

图8表示在麻醉的狗中肽1输注对血小板计数的影响。(▲)代 表5nmol/Kg/min的速率，(+)1nmol/Kg/min的速率，( )代表输 注期。

图9表示在麻醉的狗中肽1对平均血压的影响。(▲)代表 5nmol/Kg/min的速率，(+)1nmol/Kg/min的速率，( )代表输注 期。

图10表示在麻醉的狗中，肽1输注对心率的影响。(▲)代表 5nmol/Kg/min的速率，(+)1nmol/Kg/min的速率，( )代表输注 期。

图11以条线图形式表示在鼠中肽1对FeCl3动脉闭塞时间的 影响。用没画阴影的条线代表对照，用画阴影的条线代表肽1，图 中，p代表概率，n表示被测试动物的数量。

本说明书全文中，使用如下氨基酸以及氨基和羧基末端基团的 常用缩写：

Gly(或G)——甘氨酸

Ala(或A)——丙氨酸

Val(或V)——缬氨酸

Leu(或L)——亮氨酸

Ile(或I)——异亮氨酸

Pro(或P)——脯氨酸

Phe(或F)——苯丙氨酸

Trp(或W)——色氨酸

Ser(或S)——丝氨酸

Met(或M)——蛋氨酸

Thr(或T)——苏氨酸

Cys(或C)——半胱氨酸

Tyr(或Y)——酪氨酸

Gln(或Q)——谷氨酰胺

Asn(或N)——天冬酰胺

Asp(或D)——天冬氨酸

Glu(或E)——谷氨酸

Lys(或K)——赖氨酸

Arg(或R)——精氨酸

His(或H)——组氨酸

Nle——正亮氨酸

Chg——环己基甘氨酸

Cha——β—环己基丙氨酸

Pip——2—哌啶酸、2—哌啶酸、或2—哌啶羧酸

Azt——2—氮杂环丁烷羧酸

Orn——鸟氨酸

hArg——高精氨酸

N—Me—Arg——N—甲基精氨酸

N—Me—(D)Phe——N—甲基—D—苯丙氨酸

Thg——3—噻吩甘氨酸

Nag——萘基甘氨酸

1—Tiq——1，2，3，4—四氢异喹啉—1—羧酸

3—Tiq——1，2，3，4—四氢异喹啉—3—羧酸

Phg——苯甘氨酸

pClPhe——对氯苯丙氨酸

pNO2Phe——对硝基苯丙氨酸

Tha——3—(2—噻吩丙氨酸)

Npa——β—(2—萘基)丙氨酸

Hyp——羟脯氨酸

Sar——肌氨酸(N—甲基甘氨酸)

N—Me—Phg——N—甲基—苯甘氨酸

Pen——青霉胺

Cys′——

当两个或多个氨基酸结合形成肽时，水单元被除去，每种氨基 酸的残余部分在本申请中被称作残基。因此，“残基”是缺少末端氨 基的氢原子，和/或缺少末端羧基的羟基的氨基酸。用接受的术语， 氨基酸或氨基酸衍生物的三字母代码之前(指缺少氢)和/或之后(指 缺少羟基)的破折号(—)是指残基。

Cys′残基用式(5)表示，它表示在R基侧链上不带硫基的半胱 氨酸。如式(3)和(4)所示，(D)Cys′残基通过二硫键连接。如式(6) 所示，二硫基通过(D)Cys′的亚甲基结合到(D)Cys′上：

注意，式(5)和(6)可表示D—或L—残基。

本说明书全文中，使用如下的各种保护性基团的常用缩写：

Boc＝叔丁氧羰基

Bzl＝苄基

Mbz＝对甲苄基

Chx＝环己基

Tos或Tosyl＝对甲苯磺酰

Cbz＝苄氧羰基

Brz＝溴苄氧羰基

Suc＝琥珀酰

Ac＝乙酰

PAM＝苯基乙酰氨基甲基

烷基和烷氧基的烷基部分包括直链、支链或环烷基，例如，甲 基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、 环戊基、己基、异己基、环己基和环戊甲基。2至10个碳原子的酰基 包括直链、支链、环状、饱和和不饱和酰基，每个酰基含有1或2个 羰基，例如，乙酰基、苯甲琥珀酰、马来酰和戊二酰。卤代基是氟、 氯、溴或碘基。

此处所用术语“任何氨基酸”包括自然发生的氨基酸以及肽化学 领域技术人员制备自然发生的肽的类似物时常用的“非蛋白质”α— 氨基酸。自然发生的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、 脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟 氨酸和赖氨酸。“非蛋白质”α—氨基酸的例子是正亮氨酸、正缬氨酸、 别异亮氨酸、高精氨酸、硫脯氨酸、脱氢脯氨酸、羟脯氨酸(Hyp)、高 丝氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、α—氨基正丁酸(Aba)、环己基丙氨酸 (Cha)、氨基苯丁酸(Pba)，下面—种或两种基团在苯的邻位、间位或 对位取代的苯丙氨酸，(C1—C4)烷基、(C1—C4)烷氧基、卤基、或硝 基，或被亚甲二氧基取代的苯丙氨酸，β-2—和3—噻吩丙氨酸，β—2 —和3—呋喃丙氨酸，β—2—，3—，和4—吡啶丙氨酸，β—(苯并噻 吩—2—和3—基)丙氨酸，β—(1—和2—萘基)丙氨酸，丝氨酸，苏 氨酸或酪氨酸的O—烷基化衍生物，S—烷基化半胱氨酸，酪氨酸的 S—硫酸酯，3，5—二碘酪氨酸和自然发生氨基酸的D异构体。

除甘氨酸以外的天然氨基酸含有手性碳原子。除另有明确说明 外，此处所指旋光活性的氨基酸是L—构型的。带R取代基的碳原 子在立体化学上或是D—构型或是L—构型。为本公开的目的，D— 构型的氨基酸表示为D—氨基酸，(D)氨基酸，或在采用一字母命 名系统时用小写字母表示，例如表示苯丙氨酸时D—Phe，(D)Phe 或f都是可接受的表示形式。按习惯，这里的肽结构是这样写出的， 氨基末端写在链的左侧，羧基末端写在链的右侧。

式1多肽可与任何无毒的有机或无机酸形成药学上可接受的酸 加成盐。形成合适的酸加成盐的无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、磺 酸和磷酸以及金属酸盐如磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的 有机酸的例子包括单、双和三羧酸。这些酸的例子有，例如，乙酸、 三氟乙酸、二醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹 果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基 苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2—苯氧基苯甲酸以及磺酸如甲磺 酸和二羟基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任何合适的无 机或有机碱形成的无毒羧酸盐。这些盐包括与碱金属如钠和钾；碱 土金属如钙和镁；包括铝的IIIA族轻金属；以及有机伯胺、仲胺和 叔胺，例如三烷基胺(包括三乙胺、普鲁卡因、二苄胺、1—乙烯胺， N，N′—二苄乙烯二胺、二氢枞胺、N—(低级)烷基哌啶和其它合适的 胺)形成的盐。

式1化合物是新型肽，它们结合了凝血酶抑制和单杂交肽中血 小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体的拮抗作用。本发明的每种肽含有通 过含有连接“桥”和作为血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物的连接部分 (即B区)结合到凝血酶阴离子外部结合抑制剂(即C区)上的凝血 酶催化部位抑制剂(即A区)。

A区描述针对凝血酶催化部位的抑制剂。这种针对催化部位的 基团结合到凝血酶的活性部位并抑制或阻碍凝血酶的活性。C区描 述凝血酶抑制剂，其特征是作为阴离子外部结合部位缔合基团。既 然C区的互换在结构上类似于水蛭素的羧基末端部分，可以推断， C区容易结合到凝血酶上的阴离子外部结合部位上。

B区含有两个功能区——催化部位抑制剂(A区)与阴离子外部 结合部位抑制剂(C区)间的连接“桥”和环状RGD—X糖蛋白IIb/ IIIa抑制基团。催化部位抑制剂(A区)与阴离子外部结合部位抑制 剂(C区)间的连接“桥”是环状RGD—X序列的基础。认为这种含有 B1基团的残基、Pro、(D)Cys′和连接B区两(D)Cys′残基的二硫键的 桥充当催化部位抑制序列和阴离子外部结合识别序列间的适宜间隔 区。由于以比其它氨基酸残基的酰胺键低得多的速率切割A3和Pro 间天然发生的酰亚胺键，这种连接“桥”在B1和A3基团间含有脯氨 酸残基。理论上认为(尽管本发明不受此理论约束)酰亚胺键的存在 是针对催化部位的基团的抑制作用的原因。当然，可以设想，其它 酰胺键取代的氨基酸也能起功能等效物的作用，例如，还原的酰 胺、酯、酮和硫醚。

B区的环状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑制基团，即B区两D— Cys残基间的那些氨基酸残基，抑制血纤维蛋白原和其受体(糖蛋 白IIb/IIIa)间的相互作用。B区的环状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑 制基团可含有式(3)和(4)所示的6至11个氨基酸。优选B区的环 状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑制基团是式(3)并含有式(3)所示的6 至11个氨基酸。

为本发明之目的，应该理解，A1结合到氨基末端基团(X)上， 而A3结合到基团B的N末端或左侧的Pro残基上。基团C的N末 端或左侧的Asp残基结合到基团B的C末端或右侧的B1残基上。

正如任何化合物基团一样，某些基团是优选的。发明人优选那 些式(1)肽衍生物，其中，X是氢，乙酰基，琥珀酰、或叔丁氧基羰 基；A1是(D)Phe，(D)Chg，(D)Cha，(D)Phg，(D)1—Tiq，(D)Tiq， 或N—Me—(D)Phe；

A2是Pro；

A3是Arg或Lys；

B是式(3)或式(4)；

B1是Gly，Ala或Gly—Gly；

B2是Gly，Gly—Gly或任何(D)氨基酸(当B为式(3)时)；

B′2是Arg—Ile—Pro或Lys—Ile—Pro(B为式(4)时)；

B3是Arg或N—Me—Arg；

B4是Nle，Phe，Cha，Met；

C1是Phe，Npa或Tyr；

C2是Glu或Asp；

C3是任何氨基酸；

C4是Ile或Val；

C5是Pro，Hyp，或(D)Ala；

C6是任何氨基酸；

C7是Glu，Asp或Ala；

C8是Tyr，Glu，Tyr—Leu，Tyr—Cha或Ala—Cha；

C9是一种键，(D)Glu，Glu，Gln，Leu—Gln或Leu—Pro；以及

Y是OH，C1—C6烷氧基，或者单或双—(C1—C4)烷基取代的 氨基。

那些式(1)化合物也是优选的，其中，

X是氢，乙酰基或正丁氧基羰基；

A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)3—Tiq或N—Me—(D)Phe；

A2是Pro；

A3是Arg；

B是式(3)或式(4)；

B1是Gly；

B2是Gly，(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro(当B是式(3) 时)；

B′2是Arg—Ile—Pro(当B是式(4)时)；

B3是Arg或N—Me—Arg；

B4是Nle或Phe，但当B2是(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro 时B4是Nle；

C1是Phe或Tyr；

C2是Glu；

C3是Glu或Pro；

C4是Ile；

C5是Pro或(D)Ala；

C6是Glu或Ala；

C7是Glu；

C8是Tyr，Tyr—Leu，Tyr—Cha或Ala—Cha；

C9是一种键或(D)Glu；以及

Y是OH，C1—C6烷氧基，或者单或双(C1—C4)烷基取代的氨 基。

特别优选的是那些式(1)肽衍生物，

其中，X是氢，乙酰基或丁氧基羰基；

A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)3—Tiq或N—Me—(D)Phe；

A2是Pro；

A3是Arg；

B是式(3)；

B1是Gly；

B2是Gly，(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro；

B3是Arg；

B4是Nle或Phe，但当B2是(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro 时，B4是Nle；

C1是Phe；

C2是Glu；

C3是Pro；

C4是Ile；

C5是Pro；

C6是Glu或Ala；

C7是Glu；

C8是Tyr，Tyr—Cha或Ala—Cha；

C9是一种键或(D)Glu；以及

Y是OH，C1—C6烷氧基

可通过本领域熟练技术人员已知的各种程序制备本发明的肽。 这些程序包括(但不局限于)固相顺序程序，它是运用已建立的自动 方法例如借助自动肽合成仪进行的。此程序中，α—氨基保护的氨基 酸结合到树脂载体上。所用树脂载体可以是多肽固相制备技术中常 用的任何适宜的树脂，优选与0.5％到约3％二乙烯基苯交联的聚 苯乙烯，它或是氯甲基化的或是羟甲基化的，提供与初始加入的α —氨基保护的氨基酸形成酯的位点。

羟甲基树脂的一个例子如Bodanszky在Chem，Ind.(London) 38，1597—98(1966)中所述。氯甲基化树脂可从Bio Rad Laborato- ries，Richmond，California购得，Stewart等描述了这种树脂的制备， “Solid Phase Peptide Synthesis”(Freeman & Co.，San Francisco 1969)，Chapter 1，PP.1—6。被保护的氨基酸可通过Gisin，Helv. Chem Aeta.56，1476(1973)所述程序结合到树脂上。例如，为制备 多肽(其中，羧基末端是(D)Glu残基)，在约50℃下Boc—D—Glu (Bzl)偶联到氯甲基化聚苯乙烯上，作为其钯盐。

α—氨基酸偶联到树脂载体上之后，用任何适宜程序除去保护 性基团，例如采用亚甲基氯中的三氟乙酸，单独使用三氟乙酸，或 者二氧六环中的HCl。在0℃和室温间的温度下进行去保护。可使用 用于除去特定α—氨基保护性基团的其它标准切割试剂和条件。除 去α氨基保护性基团后，其它α—氨基保护的氨基酸按所需顺序逐 步偶联。与树脂支持的氨基酸序列偶联之前，可选用溶液方法偶联 多个氨基酸基团。

引入多肽序列的每种氨基酸所用α—氨基保护性基团可以是本 技术中已知的任何保护性基团。α—氨基保护性基团中，可考虑的类 型有(1)酰基类保护性基团，例如，甲酰，三氟乙酰，邻苯二甲酰， 甲苯磺酰，苯磺酰，硝基苯硫基，三苯甲游基硫基，邻硝基苯氧基 乙酰和α—氯丁酰；(2)芳尿烷类保护性基团，如苯氧基羰基和取代 的苯氧基羰基，如对氯苄氧基羰基，对硝基苄氧基羰基，对溴苄氧 基羰基，对甲氧基苄氧基，1—(对二苄基)—1—甲基乙氧基羰基， α，α—二甲基—3，5—二甲氧基苄氧基羰基和二苯甲氧基羰基；(3) 脂族尿烷保护性基团，如叔丁氧基羰基(Boc)，二异丙基甲氧基羰 基，异丙氧基羰基，乙氧基羰基和烯丙氧基羰基；(4)环烷基尿烷类 保护性基团，例如环戊氧基羰基，金刚烷氧基羰基和环己氧基羰 基；(5)硫代尿烷类保护性基团，例如，苯硫代羰基；(6)烷基保护性 基团，例如，三苯甲基和苄基；以及(7)三烷基硅烷基，例如，三甲 基硅和苄基；以及(7)三烷基硅烷基，例如，三甲基硅烷基。优选的 α—氨基保护性基团是叔丁氧基羰基。

合适的偶联剂的选择属于本领域的技术。要加入的氨基酸是 Glu，Asn或Arg时，特别合适的偶联剂是N，N′—二异丙基碳化二 亚胺和1—羟基苯并三唑。这些试剂的使用防止了腈和内酰胺的形 成。其它偶联剂有(1)碳化二亚胺(例如，N，N′—二环己基碳化二亚 胺和N—乙基—N′—(Y—二甲基氨基丙基碳化二亚胺)；(2)氨腈 (例如，N，N—二苄基氨腈)；(3)烯酮亚胺；(4)异噁唑鎓盐(例如， N，N′—乙基—5—苯基—异噁唑鎓—3′—磺酸盐)；(5)单环的含氮 芳香杂环酰胺，环上含有1至4个氮，例如咪唑化物，吡唑化物和 1，2，4—三吡咯化物。有用的特殊杂环酰胺包括N，N′—羰基二咪唑 和N，N′—羰基—二—1，2，4—三吡咯；(6)烷氧化乙炔(例如乙氧基 乙炔)；(7)与氨基酸的羧基(例如，氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯)或 要偶联的氨基酸(例如，Boc—Ala—O—Ala—Boc)形成混合酐或对 称酐的试剂以及(8)一个环上氮带羟基的含氮杂环化合物(例如，N —羟基苯邻二甲酰亚胺，N—羟基琥珀酰亚胺和1—羟基苯并三唑。 Kapoor在J.Pharm.Sci.，59，PP.1—27(1970)中描述了其它活化剂 及其在肽的偶联中的应用。对除Arg，Asn和Gln外的所有氨基酸， 申请人优选对称酐作为偶联剂。

将过量约2倍至约4倍的每种被保护的氨基酸或氨基酸序列加 入固相反应器。在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)或只有二甲基甲 酰胺或只有二氯甲烷的基质中进行偶联。在发生不完全偶联的情形 中，在固相反应器中偶联下一个氨基酸之前，要在除去α—氨基保 护性基团前重复进行偶联程序。如E.Kaiser等在Analyt.Biochem. 34.595(1970)中所述，用茚三酮反应监测每一合成步骤中偶联反应 的完成。

得到所需氨基酸序列后，在本技术中已知的条件下将肽从树脂 上除去。例如，用无水氢氟酸中的5％茴香醚溶液处理结合到树脂上 的多肽可完成此步骤。

如固相肽合成技术中所知的那样，许多氨基酸具有链制备过程 中需要保护的功能。合适的保护性基团的使用和选择是技术熟练人 员能力所及的，它决取于要保护的氨基酸以及肽上其它被保护的氨 基酸残基的存在。选择这种侧链保护性基团的关键是，它必须是一 种在切割α—氨基的保护性基团过程中不被切掉的基团。例如，天冬 氨酸和谷氨酸的羧羟基可用苄基或环己基保护。优选的保护性基团 是苄基。

可用本技术中已知方法除去这些基团。通常，保护性基团的除 去是在肽链合成完成之后进行的。例如，伴随着用无水氢氟酸中的 5％茴香醚溶液从树脂上除去肽进行肽，的去保护。也可以在其它合 适的时间除去保护性基团。

本发明肽类似物的抗凝血剂和抗血小板剂量是0.2mg/Kg至 250mg/Kg病人体重/天，这取决于病人、要治疗的血栓形成疾病的 严重性以及所选用的肽类似物。可以很容易地确定对一特定病人的 合适剂量。优选每天服用1至4次，通常每次剂量含5mg至100mg 活性化合物。

抗凝血剂疗法用于各种血栓疾病，特别是冠状动脉和脑血管疾 病的治疗和预防，还用于例如通过溶解存在的血块治疗冠状动脉闭 塞。抗血小板疗法用于预防心肌血栓形成和中风的复发。那些本领 域熟练人员很容易意识到需要抗凝血剂和抗血小板疗法的情况。认 为，本发明的肽在血管成形术后的冠状动脉血栓形成的预防中、在 体外循环中血小板减少症的预防中，在血纤维蛋白溶解疗法后的闭 塞的预防中，阻止或推延进行性心肌梗塞形成中有独特优点。

此处所用术语“病人”是指哺乳动物，例如，灵长目，包括人、 羊、马、牛、猪、狗、猫、鼠或小鼠。

尽管口服后肽衍生物中有一些经过肠道能存留下来，但发明人 优选非口服用药，例如，皮下、静脉内、肌内或腹膜内给药；通过积 存注射给药；通过植入制剂；或通过粘膜，如鼻粘膜、喉粘膜和支气 管粘膜，例如，在气雾剂中含有喷雾剂或干粉末形式的本发明的肽 衍生物。

对非肠道给药，可以化合物在含有药物载体的生理上可接受的 稀释剂中的溶液或悬浮液的注射剂量用药。该载体可以是灭菌的液 体如水和油，可以加入或不加入表面活性剂和其它药学上可接受的 佐剂。可用于这些制品的油的例子是那些来源于石油、动物、植物或 合成来源的油，例如花生油，豆油和矿物油。一般说来，水、盐水， 含水右旋糖和有关的糖溶液，乙醇或乙二醇如丙二醇或聚乙二醇是 优选的液态载体，对注射液而言尤为如此。

                     实施例

实施例l—12表示式1肽的典型的合成。这些实施例仅作为例 子，而不以任何形式限制本发明。对本技术熟练人员而言，实施例1 —12的试剂和原材料都是容易得到的。实施例1—12中所用下列术 语的意义是指“DCM”指二氯甲烷，“DIEA”指二异丙基乙胺， “MeOH”指甲醇，“DCC”指N，N′—二环己基碳化二亚胺，“DMF”指 N，N′—二甲基甲酰胺，“HOBt”指1—羟基苯并三唑，“TFA”指三 氟乙酸，“eq”指当量，“meq”指毫克当量，“g”指克、“mg”指毫克， “mmol”指毫摩尔，“ml”指毫升，“℃”指摄氏度，“TLC”指薄层色 谱，“Rf”指保留因子，“μl”指微升，“μg”指微克，“μM”指微摩尔浓 度，“mmHg”指毫米汞柱，“δ”指四甲基硅烷低场百万分数。

                  实施例1

                     (SEQ ID NO：1)

的制备。

根据下表，用Dupont250半自动肽合成仪通过后面的Boc—氨 基酸的逐步去保护和偶联，使Boc—(D)Glu(Bzl)—Pam—树脂 (Peninsula Laboratories，Belmont，California)延长。 试剂/溶剂                  时间(秒)          # 重复 DCM                           30                1 MeOH                          30                2 DCM                           30                3 TFA∶茴香醚∶DCM(48∶2∶50)   60                1 TFA∶茴香醚∶DCM(48∶2∶50)   1200              1 DCM                           30                3 DIEA∶DCM(10∶90)             60                3 DCM                           30                2 Boc-氨基酸                1800                1 DMF                       30                  1 DCM                       30                  1 DIEA∶DCM(10∶90)         30                  1 DCM                       30                  2

所有Boc—氨基酸以它们过量2倍预先形成的对称酐形式被偶 联(Arg除外，它以过量4倍，其HOBt酯的形成被偶联)。以如下方 法制备对称酐。

将Boc—氨基酸(4eq)溶解于DCM，再加入0.5M DCC/DCM (eq)。搅拌，反应5分钟，对称酐的形成导致二环乙基脲的沉淀，沉 淀经过滤除去。向肽树脂加入滤液，用等体积DMF稀释偶联混合 物。

类似地形成Arg的HOBt酯，将Boc—Arg(Tos)(4eq)溶解于 DCM中。加入0.5M HOBt/DMF(4eq)和0.5M DCC/DCM(4eq)。 用过滤除去二环己基脲，向肽树脂加入滤液，用等体积DMF稀释 偶联混合物。

每次偶联后，用本技术中已知的Kaiser茚三酮法检验任何游离 胺的存在。如果需要，氨基酸被再次偶联。

经上述步骤之后，Boc—D—Glu(Bzl)—Pam—树脂(8.06g，0. 31meq/gm，2.5mmol，购自Peninsula Laboratories，Belmont，Cali- fornia)的延长得到肽—树脂(D)Phe′—Pro—Arg(Tos)—Pro—Gly5 —(D)Cys(Nbz)—Gly—Arg(Tos)—Gly—Asp(Chx)10—Nle—Pro— (D)Cys(Mbz)—Gly—Asp(Chx)15—Tyr(Brz)—Glu(Bzl)—Pro—Ile —Pro20—Glu(Bzl)—Glu(Bzl)—Ala—Cha—(D)Glu(Bzl)—Pam—树 脂(19.4g肽树脂)。下列氨基酸需用其1摩尔当量的对称酐进行第 二次偶联：Boc—Cha24，Boc—Glu(Bzl)21，Boc—Tyr(BrZ)16，Boc— Asp(Chx)15，Boc—(D)Cys(Mbz)6，Boc—Pro4，Boc—Pro2和Boc— (D)Phe1。Boc—Arg(Tos)2的偶联用其过量两倍的HOBt酯重复进 行两次，随后用乙酸酐∶DIEA∶DCM(10∶5∶85)加帽。

将上面制备的肽树脂，(D)Phe1—Pro—Arg(Tos)—Pro—Gly5 —(D)Cys(Mbz)—Gly—Arg(Tos)—Gly—Asp(Chx)10—Nle—Pro— (D)Cys(Mbz)—Gly—Asp(Chx)15—Tyr(Brz)—Glu(Bzl)—Pro—Ile —Pro20—Glu(Bzl)—Glu(Bzl)—Ala—Cha—(D)Glu(Bzl)—Pam—树 脂分成五份。在下述条件下，对每份树脂进行切割、去保护和环化 处理。茴香醚(5％)存在下，将肽—树脂(3.88g)悬浮于无水氢氟酸 (20ml)中。约0℃下搅拌反应物约30分钟。然后，在真空下除去氢 氟酸，用50％乙酸(2×10ml)、乙酸(2×5ml)和水(3×10ml)提取残 留物。用水将合并的提取物稀释至1升，用氢氧化铵调节pH至8. 5。加入K3Fe(CN)6(1.0M，约55ml)15分钟以上直至保持黄色，并 于室温下搅拌30分钟。用乙酸调节pH至4.0。加入阴离子交换树 脂(AG3×4A，Bio—Rad)并搅拌，直至黄色消失。经过滤收集树脂， 将滤液冷冻干燥，得到粗肽。

将粗肽溶解于50％乙酸中，加到Sephadex G—10柱(2.5× 70cm)上。用50％乙酸在约10.5ml/h下洗脱。约70—150ml时洗脱 出肽。用水稀释洗脱液，冷炼干燥，得到6.17g总产物。通过反相制 备HPLC(Dynamax C18，21.4×250mm，Rainin)，在约40ml/min 下，以0.1％含水TFA/乙腈的梯度，用Beckman Prep350系统进 —步纯化脱盐原料，得到纯品(1.3g)。

                  (SEQ ID No：1) 可用相同或类似方法制备下面实施例的肽。 实施例2

                  (SEQ ID NO：2)

实施例3

(SEQ ID NO：20)

实施例4

(SEQ ID NO：11)

实施例5

(SEQ ID NO：12)

实施例6

(SEQ ID NO：15)

实施例7

(SEQ ID NO：16)

实施例8

(SEQ ID NO：18)

实施例9

(SEQ ID NO：19)

实施例10

(SEQ ID NO：21)

实施例11

(SEQ ID NO：22)

实施例12

(SEQ ID NO：l0)

                  生物学

如上所述，本发明的化合物具有显示显著的凝血酶抑制的性 质，表明这些化合物是有效的抗凝血剂，可用于预防静脉和动脉血 栓形成疾病以及不稳定的心绞痛，预防冠状动脉血管成形术后的血 管突然闭合，血栓形成的辅助治疗和整形外科手术后的深度静脉血 栓形成。由于本发明的化合物还含有位于B区连接基团中的环状 RGD—X序列，它们还能充当血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物。 实施例2的肽的抗凝血和抗血栓形成效果

由通过环状的血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物(RGD—X)偶联 到水蛭素55-65类似物上的催化部位凝血酶抑制剂(fPR)组成的实施 例2的肽(肽2)(SEQ ID NO：2)与其自身成份的肽作对比。注意， 下述实验设备只是推荐使用的，但不以任何形式约束或限制本发 明。 实验动物

可从Sprague Dawley，Inc.(Indianapolis，IN46229)购买雄性 Sprague—Dawley鼠，并将其用于研究。 采血

可将血样抽入含有3.8％柠檬酸三钠(1∶10)的塑料注射器中。 通过2,000g—力下离心10分钟制备血浆。从健康、未用药、男性志 愿者采集用于体外研究的静脉血。 凝血分析

用Dade Diagnostics，Inc.(Aguada，Puerto Rico00602)的试剂 和方法进行激活部分促凝血酶原激酶的时间(aPTT)的测定。通过 0.1ml鼠血浆与0.1ml 0.1M Tris缓冲液(pH7.5)于37℃下保温30 秒，测定凝血酶凝血时间。用0.1ml牛凝血酶(Sigma Diagnostics， St.Louis，MO63178)溶液(12NIH单位/ml)开始凝血。用MLA— Electra 750自动凝血计时器MLA，Inc(Pleasantville，NY10570)半 自动地测定全部凝血时间。用简单的线性回归计算加倍凝血时间 (ID2)所需的浓度。 体外血小板凝聚

通过于室温下200g—力下离心10分钟，制备人血小板富集血 浆(PRP)。通过2,000g—力下离心10分钟，制备血小板缺乏的血浆 (PPP)。PRP仅暴露于塑料实验器具。所有实验在采血3小时内完 成。用双路集合度计(Chrono—log Corp.，Haverstown，PAl9083)测 定血小板凝聚。用自身PPP定义百分之百的透光率。加入ADP (1μM)或凝血酶后，从PRP测定透光率百分数的最大变化。凝血酶 (0.2—2.0单位/ml)引起的血小板凝聚依赖于浓度，最大浓度的一 半用于抑制研究。加入ADP或凝血酶之前，肽2(SEQ ID NO：2)与 PRP(0.45ml)保温30秒。测定0.5ml总体积中的凝聚。当与对照值 相比时，用抑制百分数表示抑制反应。用简单的线性回归计算造成 50％凝聚抑制的浓度(IC50)。 鼠中FeCl3动脉血栓形成模型(体内)

肽2(SEQ ID NO：2)在鼠中的体内抗血栓形成效果同样用于评 价。例如，在根据R.J.Broersma等，Thromb.Res.64，405—412 (1991)的依赖于血小板的凝血酶介导FeCl3引发的鼠颈动脉血栓形 成模型中，肽2(SEQ ID NO：2)用于评价抗血栓形成的活性。如果提 出的话，该文献结合入本文，作为参考。 结果

本研究的结果表明，在血浆凝血和血小板凝聚分析中，肽2 (SEQ ID NO：2)是比其自身成分更有力的抗凝血剂和抗凝血酶。

关于表，除一些被修饰的氨基酸和/或保护性基团可用三字母 命名系统命名并置于括号中之外，用一字母命名系统命名肽序列中 的氨基酸序列。同样，通过在两个(D)Cys′残基和在B区环部分中的 所有残基下面划线表示连接(D)Cys′残基的二硫键。

表I    肽2在人血浆中的抗凝血活性(与其成分相比)     肽             肽序列          ID2μm     aPTT 凝血酶时 间     2  fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA(Cha)e     0.060 0.024     2a           cGRGDFPc     - ＞1,000     2b      (Suc)YEPIPEEA(Cha)e     4 0.564     2c             fPRPG     ＞1000 510     2d            (CH3)fPR     2 0.587 ID2值是使对照的凝血时间加倍所需浓度(测定三次)。aPTT， 激活部分促凝血酶原激酶的时间。

参考表I，在正常人血浆中的激活部分促凝血酶原激酶的时间 (aPTT)和凝血酶时间的分析中，将肽2(SEQ ID NO：2)的抗凝血活 性与其成份——肽2a(SEQ ID NO：3)，肽2b(SEQ ID NO：4)，肽2c (SEQ ID NO：5)和肽2d(SEQ ID NO：6)——作对比。肽2a—2d(SEQ ID NOS：3—6)不属于本发明。肽2(SEQ ID NO：2)分别于约60和 24nM下使aPTT和凝血酶时间加倍(ID2)。肽2(SEQ ID NO：2)活 性至少比2b(SEQID NO：4)或2d(SEQ ID NO：6)(稳定的催化部位 抑制剂Me—fPR)高20倍，而2c(SEQ ID NO：5)(fPRPG五肽)只 在高得多的浓度下才有抗凝血活性。肽2a(SEQ ID NO：3)(环状的 RGD—X肽)没有作为抗凝血剂的活性。

表II    肽2对鼠和人凝血和血小板分析的影响 鼠            人        ID2，nM     抗凝血活性     aPTT 181±43        60±18     凝血酶时间 116±12        24±7        IC50，μM     血小板凝聚的抑制     ADP 65±2          19±5     凝血酶 0.014±002     0.060±.026 ID2值是使对照的凝血时间加倍所需浓度(测定三次)。aPTT， 激活部分促凝血酶原激酶的时间。

参照表II，在鼠血浆中进行肽2(SEQ ID NO：2)的抗凝血研究。 对aPTT和凝血酶时间的ID2分别约为181和116nM。因此，与在人 血浆中的情况相比，肽2(SEQ ID NO：2)在鼠血浆中作为抗凝血剂 的活性要低3—5倍。

             表III    人血小板凝聚的抑制     肽             肽序列         ID50μm  ADP     凝血酶     2  fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA(Cha)e  19     0.060     2a           cGRGDFPc  20     13     2b      (Suc)YEPIPEEA(Cha)e  895     3     2d            CH3fPR  ＞1,000     0.2 ID50值是使PRP中的血小板凝聚抑制到对照凝聚的50％所需浓度 (测定三次)。

如表III中所示，由ADP和凝血酶引起的人血小板凝聚受肽2 (SEQ ID NO：2)的抑制。将ADP引起的血小板凝聚抑制50％的浓 度(IC50)约为19μM。这与环状RGD—X肽(IC50＝20μM)，肽2a (SEQ ID NO：3)相似。抗凝血酶肽2b(SEQ ID NO：4)和2d(SEQ ID NO：6)基本不具有作为ADP引起的血小板凝聚的抑制剂的活性 (IC50分别＝895和＞1,000μM)。肽2(SEQ ID NO：2)抑制凝血酶引 起的血小板凝聚，IC50值为60nM，比其成分——肽2b(SEQ ID NO： 4)(IC50＝2μM)，肽2d(SEQ ID NO：6)(IC50＝200nM)和肽2a(SEQ ID NO：3)(IC50＝13μM)——活性更高。

与此对比，由ADP和凝血酶引起的鼠血小板凝聚受肽2(SEQ ID NO：2)的抑制，分别为IC50＝65μM和14nM(参见表II)。因此， 与在人血小板富集的血浆中相比，肽2(SEQ ID NO：2)在鼠血浆中 的活性要低3—4倍。

                表  IV  肽2对鼠中动脉血栓形成的影响     肽2 (nmol/kg/min)a    n                 闭塞时间(min)  n动物，闭塞  的/治疗的     对照     治疗     10    6     15.2±2.0     26.3±5.4*     5/6     25    5     16.9±1.1     50.8±5.4**     2/5     50    5     16.8±1.8     55.5±10.8*b     1/5 a   输注60min，自FeCl3损伤前15min开始。 b   闭塞时间＞90min(n＝4)；*与对照比较，

P＜0.05；**与对照比较，P＜0.01

评价了肽2(SEQ ID NO：2)在FeCl3引起的鼠颈动脉血栓形成 模型中的抗血栓形成的活性。通过在动脉注入FeCl3前15分钟开始 的、以10，25和50nmol/kg/min速率连续1小时的静脉注入肽2 (SEQ ID NO：2)，血栓闭塞依赖于剂量而降低(参见图1)。在 50nmol/kg/min的剂量下，4/5的鼠防止了闭塞。在25和10nmol/ kg/min速率下，分别有3/5和1/6的鼠防止了闭塞。在50，100和 200nmol/kg/min的注入速率下，催化部位抗凝血酶(肽2d)(SEQ ID NO：6)按剂量延长闭塞时间(参见图2)。

表V    肽2和其成分对鼠中动脉血栓形成的影响     肽   剂量a   n             闭塞时间(min) n动物，闭塞 的/治疗的        对照     治疗     2     A   5     16.8±1.8  55.5±10.8*     1/5     2a     B   4     18.5±1.2  19.1±2.0     4/4     2b     C   6     16.9±1.9  22.4±7.1     5/6     2d     D   5     19.3±1.5  44.1±1.0**     1/5 a  输注60min，自FeCl3损伤前15min开始。 b  与对照相比，P＜0.05；**与对照相比，P＜0.01 A--50nmol/kg/min，i.v. B--100nmol/kg/min，i.v. C--500nmol/kg/min，i.v. D--200nmol/kg/min，i.v.

在50nmol/kg/min的剂量下，有4/5的鼠防止了闭塞。在此模 型中，无论是500nmol/kg/nin的水蛭素类似物(肽2b)(SEQ ID NO：4)，还是100nmol/kg/min的环状RGD—X(肽2a)(SEQ ID NO：3)，都没有防止对这些鼠的闭塞。

              表    VI

        静脉内的肽2对凝血分析a的影响     肽2  nmol/kg/min                 多个对照     aPttb 凝血酶时间     10  2.9±0.7(5) 3.9±0.5(5)     25  3.6±1.2(4) 5.8±1.8(4)     50  3.7±0.7(2) 4.2±0.4(2) a  在鼠中FeCl3引起的动脉闭塞研究结    束时采集血样 b  aPTT，激活部分促凝血酶原激酶的时间    (n＝鼠) 实施例1的肽的抗凝血和抭血栓形成的效果

类似于肽2(SEQ ID NO：2)的实施例1的肽(肽1)(SEQ ID NO：1)，是由通过环状的血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物(RGD—X) 偶联到水蛭素55-65类似物上的催化部位凝血酶抑制剂(fPR)组成的， 它与其自身成分的肽作对比。然而，肽1(SEQ ID NO：1)是肽2 (SEQ ID NO：2)的类似物，其中，肽2(SEQ ID NO：2)的环状RGD —X序列中苯丙氨酸(Phe)被正亮氨酸(Nle)取代。本研究中，将肽1 (SEQ ID NO：1)与肽2(SEQ ID NO：2)，肽3(SEQ ID NO：7)(肽1 的类似物，其中，阴离子外部结合缔合基团(C区)被切掉)和肽4 (SEQ ID NO：8)(肽1的类似物，其只含天然L—氨基酸)作对比。 另外，为阐明RGD—X环的取向作用对本发明的肽的活性的影响， 将肽5(SEQ ID NO：9)(肽1(SEQ ID NO：1)的类似物，具有l0个 氨基酸的RGD—X环，仅含天然L—氨基酸)与肽6(实施例12的 肽)(SEQ ID NO：10)(肽1的类似物，具有10个氨基酸的RGD—X 环)作对比。肽1，2和6(SEQ ID NOS：1，2和10)属于本发明，而肽 3—5(SED ID NOS：7—9)不属于本发明。注意，仅推荐使用下述实 验设备，但不以任何形式约束或限制本发明。 实验动物

可从Sprague Dawley，Inc.(Indianapolis，IN46229)购买雄性 Sprague—Dawley鼠(300—400gm)，这些研究中使用两种性别的杂 交猎狗(6—11kg)。

用戊基巴比妥钠(30mg/kh，iv)麻醉狗。分开股动脉和两股静 脉，插管以记录血压(Gould P23ID，Gould Inc.，Medical Products Division，Oxnard，CA93030)，采血和给药。将肢体导联置于皮下， 以监测导联IIECG。记录血压和ECG测定(Gould 440 recorder， Gould INc.，Instrument Systems Division，Cleveland，OH441l4)。 采血

血样被抽入含有3.8％柠檬酸三钠(1∶10)的塑料注射器。通过 2,000g—力下离心10分钟，制备血浆。从健康、未用药、男性志愿者 采集用于体外研究的静脉血。 凝血分析、样本出血时间和血液学

用Dade Diagnostics，Inc.(Aguada，Puerto Rico00602)的试剂 和方法进行激活部分促凝血酶原激酶的时间(aPTT)的测定。通过 0.1ml鼠血浆与0.1ml 0.1M Tris缓冲液(pH7.5)于37℃下保温30 秒，测定凝血酶凝血时间。用0.1ml牛凝血酶(Sigma Diagnostics， St.Louis，MO63178)溶液(12NIH单位/ml)开始凝血。用MLA— Electra750自动凝血计时器MLA，Inc(Pleasantville，NY10570)半 自动地测定全部凝血时间。用简单的线性回归计算加倍凝血时间 (ID2)所需的浓度。t1/2的确定是用于计算1和5nmol/kg/min速率注 入肽1(SEQ ID NO：1)后的抗凝血酶活性(凝血酶时间)。用反应数 据对时间的线性回归估计t1/2。

除去毛发后(Nair，Carter—Wallace，Inc.，New York，NY 10105)，用Surgicutt出血时间设备(International Technidyne Corp.，Edison，NJ08820)在左腿中部皮肤上进行样品出血时间的测 定。给药前60和30分钟，给药后15，30，60，120，180和240分钟测 定样本出血时间。

用血液分析仪(Technicon H1，Miles Technicon，Tarrytown NY 10591)对用EDTA阻凝的140μL血样进行全血细胞计数和血红蛋 白含量分析。给药前60和30分钟，给药后15，30，60，120，180和 240分钟取样。 血小板凝聚试验

通过于室温下200g—力下离心10分钟，制备人血小板富集血 浆(PRP)。通过2,000g—力下离心10分钟，制备血小板缺乏的血浆 (PPP)。PRP仅暴露于塑料实验器具。所有实验在采血3小时内完 成。用Chrono—log双路集合度计(Chrono—log Corp.，Haverstown， PAl9083)测定血小板凝聚。用自身PPP定义百分之百的透光率。加 入ADP(1μM)或凝血酶后，从PRP测定透光率百分数的最大变化。 凝血酶(0.2—2.0单位/ml)引起的血小板凝聚依赖于浓度，最大浓 度的一半用于抑制研究。加入ADP或凝血酶之前，肽2(SEQ ID NO：2)与PRP(0.45ml)保温30秒。测定0.5ml总体积中的凝聚。当 与对照值相比时，用抑制百分数表示抑制反应。用简单的线性回归 计算造成50％凝聚抑制的浓度(IC50)。

用全血集合度计(Chrono—log，model540—VS)进行柠檬酸盐 稀释(1∶2)的血中的血小板凝聚。稀释的等分血样置于塑料小杯中， 于37℃下保温15分钟。用加入ADP(2μM)或凝血酶(0.4U/ml)来 引起凝聚，电阻的变化记录在条带记录器上。在1.0ml总血体积中 测定凝聚。当与对照值相比时，用抑制百分数表示抑制反应。用简单 线性回归计算造成50％凝聚抑制的浓度(IC50)。 鼠中FeCl3动脉血栓形成模型(体内)

肽1(SEQ ID NO：1)在鼠中的体内抗血栓形成效果同样用于评 价。例如，在根据R.J.Broersma等，Thromb.Res.64，405—412 (1991)的依赖于血小板的凝血酶介导FeCl3引发的鼠颈动脉血栓形 成模型中，肽1(SEQ ID NO：1)用于评价抗血栓形成的活性。如果提 出的话，该文献结合入本文，作为参考。 结果

本研究的结果表明，作为凝血酶引发的血小板凝聚的抑制剂， 肽l(SEQ ID NO：1)出乎意利地比肽3(SEQ ID NO：7)，肽4(SEQ ID NO：8)甚至肽2(SEQ ID NO：2)更具潜力。

                       表    VII

         与肽2、3和4相比，肽1在人血浆中的抗凝血活性     肽     肽序列            ID2，nMa  aPTT 凝血酶时间     3  fPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPE  998±108    141±52     4  fPRPGCGRGD(Nle)PCGDYEPIP          EEAYD  115±24    14±3     2  fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA          (Cha)e  60±18    24±7     1  fPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPE          EA(Cha)e  12±0.2    5±1 a  ID2值(平均值±标准偏差)是使对照的凝血时间(以秒计)    加倍所需浓度(测定三次)。 a  PTT，激活部分促凝血酶原激酶的时间。

参考表VII，肽1(SEQ ID NO：1)是肽2(SEQ ID NO：2)的类似 物，其中，用正亮氨酸(Nle)代替了肽2(SEQ ID NO：2)的环状RGD —X序列中的苯丙氨酸(Phe)。肽3(SEQ ID NO：7)是肽2(SEQ ID NO：2)的类似物，其中，阴离子外部结合缔合基团(C区)被切掉。肽 4(SEQ ID NO：8)是肽4(SEQ ID NO：4)的类似物，其只含有天然L —氨基酸。虽然肽1(SEQ ID NO：1)和2(SEQ ID NO：2)属于本发 明，但肽3(SEQ ID NO：7)和4(SEQ ID NO：8)不属于本发明。

肽1(SEQ ID NO：1)分别以12和5nM浓度使aPTT和凝血酶 时间加倍(ID2)。与肽2(SEQ ID NO：2)相比，这相当于使抗凝血活 性的值提高5倍。表VII表明，肽3(SEQ ID NO：7)和4(SEQ ID NO： 8)比肽2的抗凝血活性低。

    表 VIII 与肽2、3和4相比，肽1对人血小板凝聚的抑制     肽     肽序列            IC50a     ADP   凝血酶     μM     nM     3  fPRPGcGRGD(Nle)PcGDYEPIPE  29.3±7.8  407±372     4  fPRPGCGRGD(Nle)PCGDYEPIP          EEAYD  35.9±5  408±180     2  fPRPGcGRGDFPcGDYEPIPEEA           (Cha)e  18.7±4.6  60±26     1  fPRPGcGRGD(NIe)PcGDYEPIPEE           A(Cha)e  31.7±2.3  0.4±0.05 a  ID50值(平均值±标准偏差)是使PRP中的血小板    凝聚抑制到对照凝聚的50％所需浓度(测定三次)。 凝血酶引起的血小板凝聚

表VIII表明肽1—4(SEQ ID NOS：1，2，7和8)的依赖于剂量的对 人血小板凝聚的抑制。肽1(SEQ ID NO：1)最有效地抑制凝血酶引 起的血小板凝聚，IC50值为399±76pM，效果比肽2(SEQ ID NO：2) (IC50＝60±26nM)高150倍。

与肽1相比，肽4(SEQ ID NO：8)(全为天然L—氨基酸的类似 物)和肽3(SEQ ID NO：7)(被切掉COOH端的类似物)的活性低约 1,000倍。 ADP引起的血小板凝聚

通过ADP引起的人血小板凝聚的依赖于剂量的抑制确定整合 蛋白分解(disintegrin)活性，并示于图表VIII中。表明，肽1(SEQ ID NO：1)(IC50＝32μM)和肽2(SEQ ID NO：2)(IC50＝l9μM)具有相似 的活性。在整合蛋白分解活性上，肽4(SEQ ID NO：8)(全为天然L —氨基酸的类似物)和肽3(SEQ ID NO：7)(COOH端被切掉的类似 物)大约与肽1相当。 全血血小板凝聚

由ADP(0.5μM)和凝血酶(0.025U/ml)共同引起的人和鼠全血 血小板凝聚被肽1抑制，IC50分别为2.9和42.5nM(参见图3)。因 此，肽1(SEQ ID NO：1)在人血中的活性比在鼠血中高约15倍。而 且，肽1(SEQ ID NO：1)在人血中完全抑制凝聚，而在鼠血中仅有 约50％平稳抑制。 肽1在狗中的静脉给药

在麻醉的狗中注入1小进时，肽1(SEQ ID NO：1)显示出对凝 血酶和血小板凝聚的抑制作用。而且，注入结束后，肽1(SEQ ID NO：1)的作用是短期的。1和5nmol/kg/min的注入速率使凝血酶时 间(图4)和aPTT(图5)按剂量而延长。凝血酶时间比aPTT分析对 注入肽1(SEQ ID NO：1)造成的抑制更敏感。图2中的总结数据表 明，15—30分钟内达到最大抑制。注入停止后(60分钟)，凝血酶活 性恢复，对1和5nmol/kg/min的注入速率而言，药效学t1/2分别为 17±0.1和26±3.2分钟。

血小板凝聚抑制证实了肽1(SEQ ID NO：1)对凝血实验的效 果。肽1(SEQ ID NO：1)的注入在15分钟抑制凝血酶引起的血小板 凝聚(图6)。在2/3的狗中，在1小时注入期内抑制作用得到保持。 1nmol/kg/min注入结来后，血小板活性恢复，药效学t1/2为12.8± 1.1mm。

在每一剂量速率下，在1/3狗中，ADP引起血小板凝聚受到抑 制。在体外，ADP引起的血小板凝聚受到μM级的抑制。据认为(但 本发明不受此理论的束缚)，在全血血小板凝聚中，用盐稀释血(1∶ 2)可降低有效抑制ADP引起的血小板凝聚所需的肽1(SEQ ID NO：1)浓度。在接受肽1(SEQ 1D NO：1)的狗中，出血时间(图7)和 血小板计数(图8)保持稳定。血压(图9)和心率(图10)以依赖于剂 量的形式稍有升高。注入结束后2小时，这些参数回到基准的对照 值。

             表 IX   肽1对鼠中动脉血栓形成的影响     肽1  nmol/kg/mina             闭塞时间 n动物，闭塞的/    治疗的     对照     治疗     5  15.7±1.4  24.1±5.8     6/6     10  17.1±1.3  40.4±5.8**     4/7     25  18.6±1.7  58.1±9.5**     1/5 a  输注60min，自FeCl3损伤前15min开始。    **与对照比较，P＜0.01

评价了肽1(SEQ ID NO：1)在FeCl3引起的鼠颈动脉血栓形成 模型中的抗血栓形成的活性。通过在使用FeCl3前15分钟开始的、 以10，25和50nmol/kg/min速率连续1小时的静脉注入肽2(SEQ ID NO：2)，血栓闭塞依赖于剂量而延长(参见表IX和图11)。在 25nmol/kg/min剂量速率下，注入过程中有4/5的鼠防止了闭塞。 在10和5tmol/kg/min速率下，分别有4/7和0/6的鼠防止了闭 塞。用FeCl3后使闭塞时间加倍所需的肽1(SEQ ID NO：1)剂量速率 为19.3nmol/kg/min，而对前面观察到的肽2(SEQ ID NO：2)而言， 则为33.7mol/kg/min。

                  表    X

   人血小板凝聚的抑制：“(L)CYS环”与“(D)CYS环”比较     肽          肽序列            IC50a     ADP  凝血酶     μM    nM     5     fPRPGCRIPRGD(Nle)PADC        GDYEPIPEEA(Cha)e  1.4±0.3  231±187     6     fPRPGcRIPRGD(Nle)PADC        GDYEPIPEEA(Cha)e  2.1±0.4  21±20 a  IC50值(平均值±标准偏差)是使PRP中的血小板    凝聚抑制到对照凝聚的50％所需浓度(测定三次)。

表X表示两立体异构体间的区别，它们是由于催化部位抑制 剂和阴离子外部结合部位识别序列之间的连接“桥”中的(D)Cys被 (L)Cys残基取代而形成的。肽5(SEQ ID NO：9)和6(SEQ ID NO： 10)代表肽1(SEQ ID NO：1)的类似物，它们在环状RGD中含有其 它残基。肽5(SEQ ID NO：9)还有不同，它在连接“桥”中含有(L) Cys，而不是(D)Cys。给环状RGD序列的不同空间取向作用导致 (D)Cys类似物，肽6(SEQ ID NO：10)对凝血酶引起的人血小板凝 聚的更大抑制。注意到两立体异构体之间在凝血酶活性上有10倍的 差别。然在，在对ADP引起的血小板凝聚的抑制和抗凝血活性上没 有差别。注意，为产生仅含天然L—氨基酸的类似物(肽4(SEQ ID NO：8))而修饰肽1(SEQ ID NO：1)将加大两立体异构体之间的差 别。实际上，肽1(SEQ ID NO：1)具有大约高于肽4(SEQ ID NO： 8)1000倍的对凝血酶引起的血小板凝聚的抑制作用。在对ADP引 起的血小板凝聚的抑制作用上，两立体异构体之间没有差别。然而， 就抗凝血活性而言，含(D)Cys的类似物(肽1(SEQ ID NO：1))比全 为天然氨基酸的类似物(肽4(SEQ ID NO：8))活性高。 肽1类似物对肽1的相对活性

表XI—XIV表示肽1(SEQ ID NO：1)的类似物对已知的IC50血 小板抑制和ID2抗凝血数据的比值。为便于比较，肽1(SEQ ID NO： 1)样品具有下述活性：凝血——ID2(aPTT＝27.9nM；凝血酶时间 ＝15nM)；凝聚——IC50(凝血酶＝5.8nM；ADP＝11.4μM)。表XI— XIV中的肽7—18(SEQ ID NOS：11—22)的aPTT，凝血酶时间，凝 血酶和ADP值仅代表相对值，不用来表示肽的真实浓度，因而不 带单位。例如，肽7(SEQ ID NO：11)的aPTT值为0.99，表示肽7 (SEQ ID NO：11)在正常人血浆中的激活部分促凝血酶原激酶的时 间的分析中，活性为肽1(SEQ ID NO：1)的99％。

                      表 XI  相对活性：B4取代的类似物与肽1比较   肽     肽序列         凝血           凝聚  aPTT     凝血酶     时间    凝血酶     ADP   7  fPRPGcGRGDMPcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.99     0.19     0.10     0.74   8  fPRPGcGRGD(Cha)PcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.60     1.04     0.12     0.43

表XI表明肽1(SEQ ID NO：1)的两种类似物——肽7(SEQ ID NO：11)和8(SEQ ID NO：12)之间的差别，它们都是本发明的化合 物。肽7(SEQ ID NO：11)是肽1(SEQ ID NO：1)的类似物，其中，B4 基团上的Nle被Met代替；肽8(SEQ ID NO：12)是肽1(SEQ ID NO：1)的类似物，其中，B4基团的Nle被Cha代替。aPTT分析中， 肽8(SEQ ID NO：12)比肽1(SEQ ID NO：1)活性大约低1/3，但肽7 (SEQ ID NO：11)的aPTT值与肽1(SEQ ID NO：1)基本相同。就凝 血酶时间值而言，每种肽的值各不相同——肽7(SEQ ID NO：11)活 性仅为肽1(SEQ ID NO：1)的19％，而肽8(SEQ ID N0：12)实际上 比肽1(SEQ ID NO：1)高。注意到肽1(SEQ ID NO：1)与两种类似物 之间在凝血酶活性上有10倍的差别。至于ADP活性，肽9(SEQ ID NO：12)效果约为肽1(SEQ ID NO：1)的1/2，而肽7(SEQ ID NO： 11)约为肽1(SEQ ID NO：1)的3/4。

             表XII 相对活性：B3取代的青霉胺与肽1的比较     肽       肽序列        凝血       凝聚  aPTT  凝血酶  时间  凝血酶  ADP     9   fPRPGcGRGD(Nle)P(D-   Pen)GDYEPIPEEA(Cha)e  0.11  0.15  0.06  0.13     10   fPRPGcG(Me-R)GD(Nle)P(D-   pen)GDYEPIPEEA(Cha)e  0.52  0.92  0.08  6.0

表XII表示肽1(SEQ ID NO：1)的两种青霉胺类似物——肽9 (SEQ ID NO：13)和10(SEQ ID NO：14)之间的差别，二者都不是本 发明的肽。提供此表是为表明B3基团上的Arg与Me-Arg之间的互 换性。青霉胺的引入大大降低了肽9(SEQ ID NO：13)在各项目上的 活性。至于肽10(SEQ ID NO：14)，注意到其在凝血酶活性上有与肽 9(SEQ ID NO：13)相同的降低。然而，与肽1(SEQ ID NO：1)相比， 凝血酶时间仅略有降低，而ADP活性提高了6倍。

表XIII  相对活性：B2取代的类似物与肽1的比较     肽            肽序列        凝血        凝聚  aPTT  凝血酶  时间 凝血酶  ADP     11  fPRPGcvRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.37  0.86  0.13  0.18     12  fPRPGcvRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.53  1.38  0.14  0.18     13  fPRPGcRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.40  0.27  0.04  0.20     14  fPRPGctRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.75  0.93  0.18  0.22     15  fPRPGcpRGD(Nle)PcGDYEPIPEEA(Cha)e  0.59  1.12  0.36  0.26

表XIII表明B2上Gly残基与各种D-氨基酸残基的互换性。肽 11(SEQ ID NO：15)，12(SEQ ID NO：16)，14(SEQ ID NO：18)和 15(SEQ ID NO：19)是肽1(SEQ ID NO：1)的类似物，其中，B2基团 被各种D-氨基酸取代，这些类似物都是本发明的肽。肽13(SEQ ID NO：17)(不是本发明的肽)是肽1(SEQ ID NO：1)的类似物，其中， B2上的Gly残基缺失。

       表XIV  相对活性：A1取代的类似物与肽1的比较     肽              肽序列         凝血          凝聚  aPTT  凝血酶  时间  凝血酶  ADP     16     (D-Phg)RPGcGRGD(Nle)Pc-         GDYEPIPEEA(Cha)e  0.72  1.03  0.94  0.54     17     (D-3-Tiq)PRPGcGRGD(Nle)Pc-         GDYEPIPEEA(Cha)e  0.62  0.93  0.13  1.27     18     (N-Me-f)PRPGcGRGD(Nle)Pc-         GDYEPIPEEA(Cha)e  1.73  0.77  0.55  0.43

表XIV表明A1基团上(D)Phe残基的互换性。肽16—18(SEQ ID NOS：20-22)都是本发明的肽。肽16(SEQ ID NO：20)显示出与肽 1(SEQ ID NO：1)基本相同的凝血酶活性和凝血酶时间。肽17(SEQ ID NO：21)显示出与肽1(SEQ ID NO：1)基本相同的凝血酶时间值， 具有更高的ADP值，但凝血酶活性值低10倍。对比显示，肽18 (SEQ ID NO：22)比肽1(SEQ ID NO：1)aPTT值显著提高，但凝血 酶时间仅为肽1(SEQ ID NO：1)的77％，而凝血酶活性和ADP值 仅为肽1(SEQ ID NO：1)的一半。

序列一览表

(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

(A)名称：Merrell Dow Pharmaceuticals Inc，

(B)街道：2110E.Galbraith Road，P.O.Box156300

(C)城市：辛辛那提

(D)州：俄亥俄

(E)国家：美国

(F)邮政编码：45215-6300

(G)电话：513/948-6566

(H)电传：513/948-7961或4681

(I)电报：214320

(ⅱ)发明名称：三功能抗凝血酶抗血小板的肽

(ⅲ)序列数目：22

(ⅳ)机器可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)

(ⅵ)在先申请资料：

(A)申请号：US08/076,066

(B)申请日：1993年6月11日 (2)SEQ ID NO：1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/mote＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位1l上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：l

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：2：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Phe Pro Xaa Gly Asp Tyr

l               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位8上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：8

(D)其它信息：/note＝“位8上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位1上的D-Cys上”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：3：

Xaa Gly Arg Gly Asp Phe Pro Xaa

1               5

(2)SEQ ID NO：4：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是琥珀酰基取代的Tyr”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：9

(D)其它信息：/note＝“位9上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：10

(D)其它信息：/note＝“位10上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：4：

Xaa Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

1               5                   10

(2)SEQ ID NO：5：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：5：

Xaa Pro Arg Pro Gly

1               5

(2)SEQ ID NO：6：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：3个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸，由 甲基取代”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：6：

Xaa Pro Arg

1

(2)SEQ ID NO：7：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：21个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”。

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：7：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu

            20

(2)SEQ ID NO：8：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”。

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：8：

Xaa Pro Arg Pro Gly Cys Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Cys Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Tyr Asp

            20                  25

(2)SEQ ID NO：9：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是正亮氨酸”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：28

(D)其它信息：/note＝“位26上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：29

(D)其它信息：/note＝“位29上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：9：

Xaa Pro Arg Pro Gly Cys Arg Ile Pro Arg Gly Asp Xaa Pro Ala Asp

1               5                   10                  15

Cys Gly Asp Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：10：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位17上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：17

(D)其它信息：/note＝“位17上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：28

(D)其它信息：/note＝“位28上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：29

(D)其它信息：/note＝“位29上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：10：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Arg Ile Pro Arg Gly Asp Xaa Pro Ala Asp

1               5                   10                  15

Xaa Gly Asp Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：11：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：11：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Met Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：12：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：12：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：13：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D构型的半胱氨酸”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D构型的青霉胺”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：13：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：14：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D构型的半胱氨酸”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：8

(D)其它信息：/note＝“位8上的Xaa是甲基精氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D构型的青霉胺”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：14：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Xaa Cly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：15：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点、：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：7

(D)其它信息：/note＝“位7上的Xaa是D构型的缬氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：1 5：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：16：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位13上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：7

(D)其它信息：/note＝“位7上的Xaa是D构型的酪氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：16：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：17：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位12上的D-Cys上”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：10

(D)其它信息：/note＝“位l0上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：12

(D)其它信息：/note＝“位12上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到 位6上的D-Cys上”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：23

(D)其它信息：/note＝“位23上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：17：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr Glu

l                5                  10                  15

Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20

(2)SEQ ID NO：18：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13上 的D-Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：7

(D)其它信息：/note＝“位7上的Xaa是D构型的苏氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6上 的D-Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：18：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：19：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D- Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：7

(D)其它信息：/note＝“位7上的Xaa是D构型的脯氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6D- Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：19：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：20：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D- Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6上 的D-Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：20：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：21：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的1，2，3，4-四 氢3-羧酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D- Cys上的D-Cys”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6的 D-Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：21：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25

(2)SEQ ID NO：22：的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：1

(D)其它信息：/note＝“位1上的Xaa是D构型的N-甲基苯丙 氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：6

(D)其它信息：/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D- Cys上的D-Cys”。

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：11

(D)其它信息：/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：13

(D)其它信息：/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6D- Cys上的D-Cys”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：24

(D)其它信息：/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”

(ⅸ)特点：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：25

(D)其它信息：/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ NO：22：

Xaa Pro Arg Pro Gly Xaa Gly Arg Gly Asp Xaa Pro Xaa Gly Asp Tyr

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Xaa Xaa

            20                  25