技术领域
[0001] 本
发明涉及一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法。
背景技术
[0002] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源于中胚层和外胚层的多潜能干细胞，属于成体干细胞。间充质干细胞具有自我更新的能
力，并具有多向分化潜能，在特定诱导条件下能分化为骨骼、软骨、脂肪、神经、心肌等多种组织细胞。间充质干细胞存在于多种组织中，目前已经从骨髓、脂肪、肌肉等组织中成功获得了间充质干细胞。来源于成体组织中的间充质干细胞由于数量有限，且受患者年龄、
疾病等因素的影响，限制了其在临床上的应用。脐带以及脐带血以其非侵入式的获得方式，对捐献者不会造成任何损害而成为一种理想的间充质干细胞来源。而与脐带血相比，脐带来源的间充质干细胞更易5 3
于获得和培养。每条脐带的间充质干细胞的数目为4×10 个，
密度为10-15×10 个/cm，
3 6
而每份脐带血中的数目为1-5×10 骨髓中的数目为每10 个单个核细胞含有1-10个间充质干细胞。
[0003] 脐带的结构从外到内依次为脐带上皮、羊膜下基质、裂隙、血管间基质（华通胶）、血管周围基质、血管（两动脉一静脉）。目前从脐带的不同组织部位都获得了间充质干细胞，而其主要来源是血管间的华通胶基质。脐带组织包含丰富的间充质干细胞，脐带间充质干细胞具有以下特点：（1）增殖能力强：体外培养第7代后可扩增300倍，且无明显衰老迹象。（2）免疫原性低：脐带间充质干细胞可剂量依赖性的抑制激活T淋巴
细胞增殖，同时可维持和促进调节性T淋巴细胞扩增。脐带间充质干细胞抑制免疫细胞的增殖，不会引起同种异源或异种免疫细胞的增殖，具有免疫调节作用和较低的免疫原性。（3）致
肿瘤风险低：脐带间充质干细胞具有稳定的端粒酶活性，培养多代也不会丧失锚定依赖性和血清依赖性，在维持其增殖性的同时不具有致肿瘤性。
发明内容
[0004] 技术问题：本发明要解决的技术问题是提供一种能长期维持人脐带间充质干细胞活性的提取和培养方法。使用本发明提取和培养的人脐带间充质干细胞在传至10代后仍能维持干细胞的活性，保持干细胞的增殖和多项分化潜能。
[0005] 技术方案：为解决上述技术问题，本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，该方法包括如下步骤：
[0006] 步骤1：取健康
胎儿脐带切去动脉和静脉，剪碎；
[0007] 步骤2：用I型胶原酶消化脐带；
[0009] 步骤4：组织块移入培养瓶中，加入培养基；
[0010] 步骤5：培养瓶放入
培养箱中持续传代培养。
[0011] 优选的，步骤1中，脐带去除两天脐动脉和一条脐静脉，并剪碎至0.5mm3-2mm3。
[0012] 优选的，步骤2中，脐带使用I型胶原酶消化，I型胶原酶的
质量体积比为0.2%-1%，每克脐带组织使用0.5-2毫升I型胶原酶消化，消化时间为1-3小时。
[0013] 优选的，步骤4中使用的培养基成分包括胎
牛血清，人成
纤维生长因子，人上皮细胞生长因子，细胞转录因子，胆固醇。
[0014] 优选的，培养基的成分配比为胎牛血清5%-10%，人成纤维生长因子5-10ng/ml，人上皮细胞生长因子5-10ng/ml，细胞转录因子1-5ng/ml，胆固醇10-20ng/ml。
[0015] 优选的，培养基使用低糖DMEM培养基，并且加入了质量体积比0.5%-2%的青霉素和
链霉素。
[0016] 有益效果：本发明提供的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法能快速获得大量脐带间充质干细胞，并且能长时间维持脐带间充质干细胞的增殖和分化能力，在传代至第10代后获得的细胞仍然具有干细胞活性。
附图说明
[0017] 图1a为第1代人脐带间充质干细胞形态；
[0018] 图1b为第5代人脐带间充质干细胞形态；
[0019] 图1c为第7代人脐带间充质干细胞形态；
[0020] 图1d为第10代人脐带间充质干细胞形态；
[0021] 图2为第3代、第7代、第10代的人脐带间充质干细胞生长曲线；
[0022] 图3a为人脐带间充质干细胞表面
抗原CD29表达；
[0023] 图3b为人脐带间充质干细胞表面抗原CD44表达；
[0024] 图3c为人脐带间充质干细胞表面抗原CD105表达；
[0025] 图3d为人脐带间充质干细胞表面抗原CD34表达；
[0026] 图3e为人脐带间充质干细胞表面抗原CD45表达；
[0027] 图3f为人脐带间充质干细胞表面抗原HLA-DR表达。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图，对本发明做进一步说明。
[0029] 本发明提供的人脐带间充质干细胞的提取和培养方法，该方法包括如下步骤：
[0030] 步骤1：取健康胎儿脐带切去动脉和静脉，剪碎；
[0031] 步骤2：用I型胶原酶消化脐带；
[0032] 步骤3：磷酸盐缓冲液清洗组织块；
[0033] 步骤4：组织块移入培养瓶中，加入培养基；
[0034] 步骤5：培养瓶放入培养箱中持续传代培养。
[0035] 步骤1中，脐带去除两天脐动脉和一条脐静脉，并剪碎至0.5mm3-2mm3。
[0036] 步骤2中，脐带使用I型胶原酶消化，I型胶原酶的质量体积比为0.2%-1%，每克脐带组织使用0.5-2毫升I型胶原酶消化，消化时间为1-3小时。
[0037] 步骤4中使用的培养基成分包括胎牛血清，人成纤维生长因子，人上皮细胞生长因子，细胞转录因子，胆固醇。
[0038] 培养基的成分配比为胎牛血清5%-10%，人成纤维生长因子5-10ng/ml，人上皮细胞生长因子5-10ng/ml，细胞转录因子1-5ng/ml，胆固醇10-20ng/ml。
[0039] 培养基使用低糖DMEM培养基，并且加入了质量体积比0.5%-2%的青霉素和链霉素。
[0041] 人脐带间充质干细胞培养基配制：在500ml低糖培养基中加入25ml胎牛血清、2.5μg人成纤维生长因子、2.5μg上皮细胞生长因子、0.5μg细胞转录因子、5μg胆固醇、
5ml抗生素，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。
[0042] 人脐带间充质干细胞提取与培养
[0043] 1、取健康、自然顺产的胎儿脐带首先剪为3cm的
片段，然后用PBS清洗数次洗掉残3
留血液，去除两条动脉和一条静脉，剪碎至1mm 左右的小块。
[0044] 2、加入PBS清洗，800rmp离心5分钟去除上清，重复清洗两遍。
[0045] 3、加入20ml I型胶原酶消化2h，消化过程中间断混匀组织块以促进消化。
[0046] 4、消化完成后800rmp离心5min去除上清，加入PBS清洗，800rmp离心5min清洗两遍。
[0047] 5、消化后的组织块移到3瓶含5ml培养基的25ml培养瓶中放入培养箱37℃,5%CO2条件下培养。
[0048] 6、培养瓶前3天不要移动以使组织块贴壁，第4天半量换液，第7天全量换液，第12天传代，一瓶传3瓶。
[0049] 实施例2：
[0050] 人脐带间充质干细胞培养基配制：在500ml低糖培养基中加入50ml胎牛血清、5μg人成纤维生长因子、5μg上皮细胞生长因子、1μg细胞转录因子、10μg胆固醇、5ml抗生素，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。
[0051] 人脐带间充质干细胞提取与培养
[0052] 1、取健康、自然顺产的胎儿脐带9cm首先剪为3节各3cm的片段，然后用PBS清洗3
数次洗掉残留血液，去除两条动脉和一条静脉，剪碎至1mm 左右的小块。
[0053] 2、加入PBS清洗，800rmp离心5分钟去除上清，重复清洗两遍。
[0054] 3、加入20ml I型胶原酶消化2h，消化过程中间断混匀组织块以促进消化。
[0055] 4、消化完成后800rmp离心5min去除上清，加入PBS清洗，800rmp离心5min清洗两遍。
[0056] 5、消化后的组织块移到3瓶含5ml培养基的25ml培养瓶中放入培养箱37℃,5%CO2条件下培养。
[0057] 6、培养瓶前3天不要移动以使组织块贴壁，第4天半量换液，第7天全量换液，第12天传代，一瓶传3瓶。（图1）
[0058] 实施例3：
[0059] 细胞增殖能力检测：
[0060] 1、取第3代、第7代和第10代培养的人脐带间充质干细胞，各加入1ml 0.25%的胰酶消化细胞。
[0061] 2、用血球计数板对细胞计数，稀释细胞悬液至1×105个/ml。
[0062] 3、用3块12孔细胞培养板，在第一块培养板的第一排四个孔接种第3代细胞5 5 5
1×10 个/ml，第二排接种第7代细胞1×10 个/ml，第三排接种第10代细胞1×10 个/ml，每孔加入2ml细胞悬液，其它2块培养板使用相同操作。
[0063] 4、24h后，取出第1块培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
[0064] 5、36h后取出第2块培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
[0065] 6、72h后，取出第3块培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
[0066] 图2结果显示人脐带间充质干细胞在培养至第10代后增殖能力没有明显变化，5 5 5
72h后细胞数达到8.5×10 个/ml,与第3代（9.1×10 个/ml）和第7代（7.9×10 个/ml）没有明显差异，仍然维持较高的增殖能力。
[0067] 实施例4：
[0068] 免疫表型检测：
[0069] 1、取第3代和第10代细胞分别用胰酶消化后移入1.5ml离心管，1500rmp离心5min去除上清。
[0070] 2、每管加入1ml PBS重悬，1500rmp离心5min去除上清。
[0071] 3、加入PBS重悬细胞，计数，调整细胞数为1×106个/ml。
[0072] 4、将细胞悬液分为每管500μl。
[0073] 5、加入流式
抗体，4℃避光孵育30min。
[0074] 6、1500rmp离心5min去除上清。
[0075] 7、加入1ml PBS重悬，1500rmp离心5min去除上清。
[0076] 8、加入500μl PBS重悬细胞。
[0077] 9、流式细胞仪检测样品。
[0078] 图3经流式细胞术检测，使用本发明方法培养的人脐带间充质干细胞均高表达CD29、CD44、CD73，而CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，表明经培养第10代后细胞仍表达间充质干细胞标志抗原，细胞仍保持干细胞特征。
[0079] 由以上实施例得，使用本发明提取和培养的人脐带间充质干细胞内长期维持干细胞活性，对传至10代的间充质干细胞进行增殖能力检测和免疫表型分析均无明显变化。这一发明能有效用于人脐带间充质干细胞的科学研究和进一步临床应用。
[0080] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入
权利要求书中记载的保护范围内。
