干细胞是具有无限自我更新和分化为多种细胞类型或组织类型的能力 的细胞群体。胚胎干细胞(受精后从大约3至5天)无限增殖并且可以天然地 分化为全部组织类型：因此称它们为全能干细胞(pluripotent stem cell)(见 综述例如Smith，A.G.(2001)Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.17，435-462)。然而， 成体干细胞具有更多组织特异性并且可能具有较差的繁殖能力：因此称它 们为多能干细胞(multipotent stem cell)(见综述例如Paul，G.等(2002)Drug Discov.Today 7，295-302)。胚胎干细胞和成体干细胞的“可塑性”依赖于它 们转分化为与其起源不同且可能跨越胚胎生殖层的组织的能力。
干细胞自我更新的能力对它们作为原始未分化细胞贮存库的功能是关 键性的。相反，由于端粒缩短，大部分体细胞具有有限的自我更新能力(见 综述例如Dice，J.F.(1993)Physiol.Rev.73，149-159)。因此，基于干细胞的 疗法具有用于治疗人和动物多种疾病的潜力。
干细胞以及干/祖细胞可衍生自不同来源。胚胎干细胞和成体干细胞的 “多谱系”潜能已经得到广泛表征。尽管胚胎干细胞的潜能巨大，但是它们 的用途引起许多伦理问题。因此，建议将衍生自骨髓基质、脂肪组织、真 皮和脐带血的非胚胎干细胞作为替代来源。这些细胞尤其可以在体外分化 为软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、星形胶质细胞 和肌腱细胞并在体内(in vivo)发生分化，使这些通常称作间充质干细胞的 干细胞成为用于中胚层缺损修复和疾病治疗的有前景的候选对象。
然而在临床使用中，收获此类间充质干细胞引起一些问题。因为需要 外科方法以便得到细胞，故细胞的收集对病人造成精神和身体负担(例如， 骨髓的收集是用活组织检查针实施的，需要局部甚至全身麻醉的侵入性技 术)。此外，在许多情况下，提取的干细胞数目相当少。更重要的是，这些 细胞不衍生或分化为上皮细胞。这促进了搜寻其它可能来源的干细胞。
已经鉴别脐带血可作为造血干/祖细胞的丰富来源。然而，对间充质干 /祖细胞的存在与否仍有争论。在一个方面，此类细胞不能自足月脐带血中 分离或成功培养(Mareschi，K.等(2001)Haematologica 86，1099-1100)。与此 同时，由Campagnoli，C.等(Blood(2001)98，2396-2402)以及Erices，A.等(Br.J. Haematol.(2000)109，235-242)得到的结果提示，间充质干细胞存在于一些 胎儿器官内，并且在早产胎儿的血液中与造血前体同时循环。因此，国际 专利申请WO 03/070922公开了自脐带血分离并培养扩增间充质干/祖细胞 的方法和使此类细胞分化成为多种间充质组织的方法。据报道，分离效率 约为60％(Bieback，K.等(2004)Stem Cells 22，625-634)。在同一研究中，已 经确定，从收集脐带血至分离细胞的时间段以及所用血液样品的体积均为 实现此产率的重要参数。然而，这些干/祖细胞是否确实源自脐带组织仍存 在争论。
近来，已经自脐带组织，即从脐带基质沃顿胶中成功分离间充质干/ 祖细胞(Mitchell，K.E.等(2003)Stem cells 21，50-60；美国专利5,919,702；美 国专利申请2004/0136967)。已显示这些细胞具有分别分化为例如神经元表 型和软骨组织的能力。此外，还已经自脐带中存在的三根血管(两根动脉、 一根静脉)之一的脐带静脉内皮层和内皮下层分离了间充质干/祖细胞 (Romanov，Y.A.等(2003)Stem cells 21，105-110；Covas，D.T.等(2003)Braz.J. Med.Biol.Res.36，1179-1183)。
然而，迄今所用的这些方法均未获得上皮干/祖细胞的分离或培养，所 述上皮干/祖细胞是作为上皮细胞治疗的来源，例如皮肤整形、肝脏修复、 膀胱组织工程和其它工程化的表面组织。皮肤整形是特别关键且迫切需要 的医学治疗，例如从美国可获得的数目来看，其仍需要大量开发。仅在美 国，每年就有100,000医院治疗的烧伤和600,000例手术皮肤切除。衰老相关 的不愈合性真皮创伤的问题更多，在美国有1100万至1200万受治疗的患者。 对于这些病症，欧洲表现出大致相等的患者数。
皮肤具有三层，表皮、真皮和脂肪层，其都执行特定的任务。表皮主 要由上皮来源的角质形成细胞产生，而真皮是由间充质来源的成纤维细胞 聚集而成。表皮是皮肤的薄的、坚韧的表层。表皮的外部分，角质层，是 防水的，并且当未损伤时，可防止大部分细菌、病毒和其它外来物质进入 机体。表皮还保护内部器官、肌肉、神经和血管免受外伤。表皮还含有胰 岛细胞，其是皮肤免疫系统的一部分。皮肤的下一层——真皮，是纤维和 弹性组织的厚层(大部分由聚合物胶原和肌原纤蛋白构成)，产生皮肤的弹 性和强度。真皮含有神经末梢、腺体、毛囊和血管。
由于机械力如擦伤、与皮肤癌切除相关的手术创伤、或由于烧伤或其 他创伤如慢性静脉溃疡造成的皮肤损失等造成的表皮、真皮或两层(全层创 伤)的损伤，通常要求皮肤替换。根据损伤的程度，由于皮肤的广泛缺失， 用取自机体未受影响的部分的患者自身皮肤(自体移植物)替换，有时是不 够的。因此，存在通过自体细胞或同种异体细胞的帮助，研发受损皮肤的 替代物的需要。
例如，美国专利号6,479,875描述了皮肤替代物，其由支架组成，所述 支架整合了由间充质干细胞组成的真皮-形成细胞。然而，这些从骨髓分离 的间充质干细胞是稀少的，为了获得足够的间充质干细胞，通常必须从患 者获得10-20cc抽吸物。
因此，仍需要用于分离和培养上皮干/祖细胞的方法和可靠来源，其可 用于进一步研发适当的皮肤替代物。此外，仍需要伦理上可接受，且不对 患者造成生物医学负担的，用于分离上皮和间充质干/祖细胞的快速和有效 的方法，以便为再生医学和组织工程的多种应用提供足量此类细胞。
发明概述
本发明提供包含支架的皮肤等价物，所述支架包括自脐带羊膜分离的 干/祖细胞衍生的细胞。
在本发明的一个实施方案中，自干/祖细胞衍生的细胞是间充质干细胞 (UCMC：换言之意指脐带内衬(羊膜)间充质干细胞；也称为CLMC)或上皮 干细胞(UCEC：换言之意指脐带内衬(羊膜)上皮干细胞；也称为CLEC)。
用于本发明的皮肤等价物的细胞可以是自体、异种或同种异体的细胞。
此外，用于本发明的皮肤等价物的细胞可以是哺乳动物来源。在本发 明的一个实施方案中，细胞是人类来源。
在另一个实施方案中，皮肤等价物的骨架还可以包括其它细胞系，例 如但不限于，血管内皮细胞或真皮微血管内皮细胞。在一个实施方案中， 这些血管内皮细胞衍生自脐带。根据供体，内皮细胞可以是哺乳动物或人 类来源的。
在本发明的一个实施方案中，皮肤等价物包含支架，其包含生物可降 解性材料。在另一个实施方案中，该支架包括或由以下材料组成，但不限 于这些材料，例如琼脂糖、聚己内酯、铌包被碳、壳聚糖、胶原、透明质 酸、磷酸钙、淀粉、羟磷灰石、纤维蛋白、藻酸盐、聚乙醇酸、碳纳米纤 维(carbon nano fibres)、多孔性聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚丙交酯 (polylactide)及其混合物。在本发明的一个实例中，支架材料是聚碳酸酯。
本发明还提供支架，该支架可以包括至少一种胞外基质作为自脐带的 羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞的支持物。胞外基质组分可以包括但不限 于一种或多种材料，例如胶原、弹性蛋白、胞间粘附分子、层粘连蛋白、 肝素、纤连蛋白、蛋白聚糖、生腱蛋白、肌原纤蛋白及其混合物。在一个 实施例中，胞外基质组分是胶原。在另一个实施方案中，胞外基质是由干/ 祖细胞自身通过分泌各自的胞外基质组分例如胶原提供的。
在本发明的另一个实施方案中，在本发明的皮肤等价物中包含的 UCMC和/或UCEC能够增殖并分别进一步分化成成纤维细胞和角质形成 细胞。
本发明还提供生产皮肤等价物的方法，其包含：
●提供支架，
●将自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞放置在所述支架内或支 架上，和
●在第一培养基中孵育所述支架，其允许所述细胞增殖和进一步分化。
在一个实施方案中，自干/祖细胞衍生的所述细胞是间充质干细胞 (UCMC)或上皮干细胞(UCEC)。
在本发明的另一个实施方案中，当所述支架包含UCMC和UCEC时， 所述第一培养基分别包含适于成纤维细胞或角质形成细胞培养的培养基。
本发明还提供治疗皮肤疾病的方法，包括用本发明的皮肤等价物接触 所述皮肤疾病。本发明还提供本发明的皮肤等价物或通过本发明的方法获 得的皮肤等价物用于药物组合物的生产的应用，以及药物组合物用于治疗 烧伤的皮肤和溃疡的应用，只举出一些示例性的皮肤疾病的实例。
本发明还提供包含本发明的皮肤等价物或通过本发明的方法获得的皮 肤等价物的细胞库。
本发明还提供用于产生黏蛋白-生产细胞的方法，包括：
●将脐带羊膜内衬膜上皮或间充质干细胞(分别是UCEC和UCMC)放 置在容器中，和
●在适合培养分泌细胞的培养基中孵育所述UCEC或UCMC。此类黏 蛋白-生产细胞可用于治疗例如被烟影响的眼睛表面或呼吸道的细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供了产生胰岛素-生产细胞的方法， 包含
●培养自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞，和
●在合适的培养基中增殖和分化所述细胞成β-胰岛细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过上述本发明的方法获得的胰 岛素-生产细胞，以及治疗与胰岛素水平失衡相关的疾病，包括向哺乳动物 施用通过上述的本发明的方法获得的胰岛素生产细胞。
在本发明的另一个实施方案中，提供治疗骨疾病的方法，包括向患者 施用由间充质干细胞产生的成骨细胞，所述间充质干细胞分离自脐带羊膜 (UCMC)。还提供治疗软骨疾病的方法，包括向患者施用软骨细胞，其是 由自脐带羊膜分离的间充质干细胞(UCMC)生产的。
本发明的另一个实施方案提供产生多巴胺和酪氨酸羟化酶生产细胞的 方法，包括
●培养自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞，优选的UCMC，和
●在合适的培养基中增殖和分化所述细胞成多巴胺和酪氨酸羟化酶生 产细胞。
此外，本发明涉及使用UCMC和UCEC分别生产人类白细胞抗原 G(HLA-G)或肝样细胞的方法。
在本发明的另一个实施方案中，涉及诱导衰老的角质形成细胞增殖的 方法，包括
●在合适的生长培养基中培养衰老的角质形成细胞，并且向衰老的角 质形成细胞中添加脐带羊膜的间充质干细胞(UCMC)，从而诱导衰老角质 形成细胞的增殖。
附图简介
当同时考虑非限制性实例和附图时，参考详细的描述将更好地理解本 发明，在附图中：
图1描绘了通过直接的组织外植体方法，在组织培养第2天(图1A)和第5 天(图1B、C)的来自脐带羊膜的上皮细胞生长晕(40×放大)。在将羊膜放置 于表面之前，用或不用1型胶原/4型胶原混合物(1∶2；贝克顿迪肯森公司 (Becton Dickinson)，New Jersey，USA)包被细胞培养塑料表面。羊膜标本浸 泡在5ml EpiLife培养基或培养基171(两者均来自卡斯卡德生物公司 (Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)中。每2或3天更换培养基，在光学 显微镜下监控外植体的细胞生长晕。如上所述在不同的时间间隔拍摄显微 照片。观察到的多角细胞形态是典型的上皮细胞。
图2描述脐带片段的酶促消化，在第2天(图A、C)和第5天(图B、D)产 生类似的上皮细胞(40×放大)。将脐带羊膜分成0.5cm×0.5cm的小片，在0.1 ％(w/v)1型胶原酶溶液(F.霍夫曼-拉罗切公司(F.Hoffmann-Laroche Ltd.，) Basel，Switzerland)中37℃消化8小时。样品每30分钟涡旋混合3分钟。在 4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于补加50μg/ml胰岛素样 生长因子-1(IGF-1)、50μg/ml血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、5μg/ml 转化生长因子-β(TGF-β1)和5μg/ml胰岛素(均自R&D系统公司(R&D Systems)，Minneapolis，USA获得)的EpiLife培养基或培养基171(两者均来 自Cascade Biologies)中，计数并按1×106个细胞/皿的密度，接种到用1型胶 原/4型胶原混合物(1∶2；贝克顿迪肯森公司(Becton Dickinson)，New Jersey， USA)预包被的10 cm组织培养皿。24小时后，用温暖的磷酸缓冲的盐溶液 (PBS)洗涤附着的细胞，并用EpiLife培养基或培养基171替换培养基(两者 均来自卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)。每2或3 天更换一次培养基，并在光学显微镜下监控细胞生长晕。如上所述在不同 的时间间隔拍摄显微照片。细胞再次显示出典型的上皮细胞多角形态。
图3描述自脐带羊膜外植的生长出来的间充质细胞。使用补加10％胎小 牛血清(FCS)的DMEM作为培养基，在置于组织培养皿后早至48小时观察 到细胞生长晕(40×放大)(图3A、C)。将外植体浸没在5ml补加10％胎牛血 清(美国Hyclone公司(Hyclone)，Utah，USA)的DMEM(英杰生命技术公司 (Invitrogen Corporation)，California，USA)中(DMEM/10％FBS)。培养 基每2天或3天更换一次。在光学显微镜下监控细胞生长晕。在不同的时间 间隔拍摄显微照片。细胞具有纺锤形形态，和在体外容易并快速的迁移和 伸展的特征，非常类似成纤维细胞(图3B、D)。
图4(40×放大)描述通过胶原酶酶促消化，自脐带羊膜分离的间充质细 胞。图4A显示在第2天自脐带羊膜分离的间充质细胞。在第5天观察到细 胞增殖(图4B)。将脐带羊膜分成0.5cm×0.5cm的小片，并且在0.1％(w/v)1 型胶原酶溶液(F.霍夫曼-拉罗切公司(F.Hoffmann-Laroche Ltd.，)Basel， Switzerland)中37℃消化6小时。将样品每15分钟涡旋混合2分钟。通过 4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于DMEM/10％FBS中，计 数并按1×106个细胞/皿的密度接种在10cm组织培养皿中。培养基每2天或 3天更换一次。在光学显微镜下监控细胞生长晕。在不同的时间间隔拍摄显 微照片。细胞再次显示出作为成纤维细胞的间充质细胞典型的纺锤形形态。
图5(40×放大)描述在无血清培养条件(DMEM)和血清培养条件 (DMEM/10％FCS)下根据本发明方法分离的脐带羊膜间充质细胞(UCMC， 图5E、F、G、H)、正常真皮成纤维细胞(NF109细胞，图5A、B)和脂肪来 源的间充质细胞(ADMC，图5C、D)的形态。图5显示相比血清丰富条件 (DMEM/10％FCS)，在血清饥饿条件(仅有DMEM)下培养的NF和ADMC 的细胞形态改变，其表现为更扁平的细胞和较不致密的细胞质，其中细胞 更圆并具有致密的细胞质(图5A、B、C、D)。在相同条件的无血清和血清 丰富培养基下培养的两组UCMC组中，未观察到形态学的改变(图5E、F、 G、H)，表明后面这些间充质细胞在行为和生理学上的差异。
图6(40×放大)描述了根据本发明分离的UCMC，其是在无3T3饲养层 时，在DMEM/10％FCS中培养的第3天和第7天的UCMC。所见细胞为正在 生长的细胞，并且正在形成集落(垂直生长)而未表现放射状扩展。这再一 次表明，这些间充质细胞与其更分化的相应细胞相比在行为上的差异。
图7(40×放大)描述了在3T3饲养层上培养第3和第7天的脐带上皮细胞 (UCEC)的集落形成。这种外观与正常的皮肤衍生的上皮角质形成细胞干细 胞的外观相似。在后者中，3T3饲养层维持细胞的干细胞性(stemness)。
图8(40×放大)描述了在3T3饲养层上培养的第3和第7天，根据本发明 分离的脐带间充质细胞(UCMC)明显的集落形成(图8-1)。3T3饲养层通常 抑制分化的间充质细胞的生长，如人真皮成纤维细胞。这再一次表明这些 间充质细胞与其更分化的相应细胞相比在行为上的差异。图8-2显示了脐带 羊膜细胞的集落形成效率测定。
图9-1至图9-28显示Western印迹分析，通过此分析比较了数种胚胎干 细胞标志物在根据本发明分离的UCEC和UCMC中的表达和在人真皮成纤 维细胞(NF)、骨髓间充质细胞(BMSC)和脂肪来源的间充质细胞(ADMC) 中的表达。图9-29和9-30显示了与骨髓、脂肪衍生的干细胞、人真皮成纤 维细胞和上皮角质形成细胞相比，Western印迹分析检测的白血病抑制因子 的分泌(图9-29)和ELISA测定检测的高分泌的激活蛋白A和促滤泡素抑制 素(图9-30)分别在脐带羊膜和上皮干细胞培养物的上清液中。固定培养皿中 的集落，并用抗Oct-4抗体(图9.1b)染色，证实转录因子的表达(图9.1.b)。
图10显示在脐带上皮干细胞中表达的上皮细胞标志物的间接免疫荧光 分析，例如总的细胞角蛋白(CK)、CK17、CK6、CK10、CK19、CK18、 CK16、CK15(图10-1)；半桥粒成分-整合素α6、整合素β4；桥粒成分(图 10-2)；基底膜成分-层粘连蛋白1、层粘连蛋白5、IV型胶原、VII型胶原(图 10-3)和其它重要胞外基质成分如整合素β1和纤连蛋白(图10-4)。
图11显示与人骨髓间充质干细胞相比由脐带间充质干细胞(UCMC)分 泌的细胞因子和生长因子的细胞因子阵列分析。
图12显示与人表皮角质形成细胞相比由脐带上皮干细胞(UCEC)分泌 的细胞因子和生长因子的细胞因子阵列分析。
图13显示在补加10％胎小牛血清(FCS)的DMEM(图13-1)、在无血清 培养基PTT-1(图13-2)、在无血清培养基PTT-2(图13-3、图13-4)和在无血 清培养基PTT-3(图13-5)中培养的UCMC细胞。图13还显示在无血清培养 基PTT-3中脂肪来源基质细胞(图13-6)和骨髓来源基质细胞(图13-7)的生 长。
图14显示了通过DNA微阵列分析的脐带上皮干细胞和间充质干细胞 的全面基因表达。UCEC表达总共28055个基因并且UCMC表达总共34407 个基因。在两种细胞类型中表达27308个重叠的基因。表达的747个基因对 UCEC是独特的，并且表达的7099个基因对UCMC是独特的。在本图中列 出所选择的目的基因。两种类型的干细胞均表达140个与胚胎干细胞和胚胎 发育有关的基因。
图15显示使用脐带内衬膜组织的重复外植体扩充脐带上皮干细胞和间 充质干细胞的示意图。
图16描述脐带的横截面，显示脐带羊膜内衬膜(LM)、包含的沃顿胶 (WJ)以及沃顿胶内支撑的两根脐动脉(UA)和一根脐静脉(UV)。
图17描述自脐带羊膜分离的上皮细胞(UCEC)直接分化为皮肤上皮角 质形成细胞(图17A)，和自脐带羊膜分离的间充质细胞(UCMC)在体外分化 成成骨细胞(图17B)和脂肪细胞(图17C)。
图18描述了自脐带羊膜内衬膜分离的上皮细胞(UCEC)体外分化为皮 肤上皮角质形成细胞(图18a；在细胞培养7天后拍摄的照片)，和自脐带羊 膜内衬膜分离的间充质细胞(UCMC)在体外分化成成纤维细胞(图18b；在 细胞培养7天后拍摄的照片)。
图19(200×放大)描述了通过本发明的方法获得的全面发育的皮肤等伤 物。上皮层由角质形成细胞构成，所述角质形成细胞是通过UCEC在本发 明方法具体限定的培养基中孵育和分化产生的。真皮层是通过UCMC在本 发明方法具体限定的培养基中孵育和分化产生的角质形成细胞构成的，也 生长在胞外胶原基质中，并且包括在本发明的皮肤等价物之内。
图20a(1200×放大)描述了根据实施例12描述的方法产生的皮肤等价物 (CSE-1)的角质形成细胞表面外观。图20b(2000×放大)描述了UCMC衍生的 成纤维细胞在胶原支架(格子)中的外观，所述细胞是根据实施例12描述的 方法获得的。
图21a(2000×放大)描述了根据实施例13描述的方法产生的皮肤等价物 (CSE-2)的角质形成细胞表面外观。图21b(3000×放大)描述了UCMC衍生的 成纤维细胞在胶原格子中的外观，所述细胞是根据实施例13描述的方法获 得的。
图22描述了本发明的黏蛋白-生产细胞。图22a显示了在PTT-6中培养3、 7和10天后黏蛋白-生产细胞的发育。图22b显示了通过在SDS-PAGE中其分 子量来检测的在PTT-6中培养的UCEC(指UCEC-17的沉淀1、2、3、6(P1、 P2等))产生的黏蛋白。其它细节参见实施例16。
图23描述了孵育在PTT-10和烟酰胺中的UCEC。如从照片中可见，与 烟酰胺孵育的UCEC分化成β-胰岛细胞(图23b)，而在只有PTT-10中生长的 UCEC则没有(图23a)。
图24描述了为了软骨发育，UCMC软骨形成分化为软骨细胞。基于用 修饰的PTT-5诱导，从UCMC发育的软骨细胞已经用阿辛蓝(Alcian Blue) 染色。在图24B中观察到软骨细胞的阳性染色。未分化的UCMC细胞观察 到阴性染色(图24A)。
图25显示了在多个UCEC样品中的胰岛素表达，所述UCEC处于实施 例15中描述的ES Cult培养基(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies Inc.)，Vancouver，Canada)或BBRC06培养基的诱导下。该实验显示，UCEC 具有分化成胰岛素-生产细胞的潜能，其可用于治疗糖尿病。
图26A和图26B展示了酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺通过分化的UCMC 细胞的分泌和表达，更详细的描述在实施例18中。多巴胺用于治疗帕金森 综合征患者。图26C显示阴性对照。
图27A和图27B展示了实施例19中描述的HLA-G通过分化的UCMC和 UCEC细胞的分泌和表达。
图28A、28B和28C显示UCMC诱导衰老的皮肤角质形成细胞(asK)和人 真皮成纤维细胞的增殖的实验的结果。该实验使用自50或60岁患者获得的 皮肤细胞。该实验展示了UCMC的增殖效果，其因此也可用于创伤愈合、 组织修复、再生、复壮(rejenuvation)、化妆品和皮肤护理应用。
图29A显示了UCMC和UCEC在胶原格子中的器官型共培养。在这些 间充质组织等价物(MTE)构建体中观察到了上皮。图29B显示培养的皮肤 等价物的皮肤类似结构。UCMC细胞增殖的胶原格子支持人角质形成细胞 干细胞的完全分化。这些附图显示UCMC和UCEC可用于构建体外器官样 组织，用于组织修复和再生和药物发现。
图30A和30B展示了UCMC细胞能够生长在TissueFleeceE(奥地利百 特公司(Baxter AG)，Austria)和BoneSave(美国史赛克公司(Stryker Inc.)， MI，USA)的胶原和骨支架之内和之上。附图显示被染色的、生长在实施 例2描述的支架上的活UCMC。
图31指实施例22描述的实验，展示了植入小鼠的UCMC聚集 (populated)的胶原支架的生血管性质。图31B和C显示21天后观察的宏观和 微观的维管形成。图31A显示植入前在生长培养基中的UCMC聚集的支架。
图32A至C展示UCMC用于治疗全层烧伤(3度)的临床应用。图32A显示 在53岁老年女性患者的全层烧伤上的创面床准备。将UCMC细胞接种到 Biobrane创伤敷料(陶氏伊可药物公司(Dow Hickam Pharmaceuticals)， Texas，USA)上。按实施例23中的描述将UCMC-Biobrane构建体转移到创 伤上(图32B)。在没有皮肤移植的第7天观察到完全愈合，并在随访3个月内 稳定(图32C)。
图33展示了UCMC用于治疗实施例24中描述的2岁男性患者的部分皮 肤层创伤(2度)的临床应用。在第3天观察到创伤的完全愈合。
图34展示了UCMC用于治疗2岁男性患者的全层烧伤(3度)的临床应 用。将UCMC与SoloSite胶(施乐辉公司(Smith&Nephew)，Hull，UK)混合， 按实施例23中描述的糊在创伤上。用该方法在第5天观察到创伤的完全愈 合。
图35展示了UCMC用于治疗患有血管瘤的1岁儿童的非愈合性辐射创 伤的临床应用。用常规的创伤治疗，原始创伤在90天的时期没有愈合。 UCMC在Tegaderm创伤敷料上培养并如实施例25中描述的转移到创伤 上。经过为期20天的UCMC细胞疗法，辐射创伤完全愈合了。
图36和图37A和B展示了UCMC用于治疗非愈合性糖尿病创伤(图36)、 非愈合性糖尿病食品创伤(图37B)和失败的皮瓣供区创伤(图37A)的临床应 用。后两者经过超过6年的常规治疗不能愈合。按实施例26中的描述培养 UCMC并与SoloSite胶(施乐辉公司(Smith&Nephew)，Hull，UK)混合。
图38显示在BBRC06H培养基(BBRC06H培养基是BBRC06的修饰版， 如实施例15中描述的，不添加烟酰胺并添加50μg/ml的制瘤素-M)的诱导下 UCEC的清蛋白表达。该实验显示UCEC具有分化为肝细胞的潜力，其可 用于治疗肝脏疾病或用于测试新药细胞毒性的体外模型。
详细说明
本发明基于令人惊讶的发现，即可以使用脐带羊膜作为来源形成皮肤 等价物，从所述来源中可以在体外条件下成功的分离和扩增干/祖细胞，例 如间充质干/祖细胞和上皮干/祖细胞。使用这些细胞，发明提供皮肤等价物， 其包含或基本由支架组成，所述支架包括来自自脐带羊膜衍生的干/祖细胞 的细胞。更惊讶的发现这些干/祖细胞表现胚胎干细胞样特征。最近，羊膜 (也被称为羊膜内衬膜)，即包裹胎盘并发育哺乳动物胚胎的最内层膜囊， 已经作为眼表面重构的天然底物和扩增角膜缘上皮干细胞的生物底物使用 (参考例如Anderson，D.F.等(2001)Br. J.Ophthalmol.85，567-575 Grüterich，M.等(2003)Surv.Ophthalmol.48，631-646)。然而，迄今还没有 描述用于自羊膜分离干/祖细胞的方法，至少对于人类，也没有报道将覆盖 脐带的羊膜作为干细胞来源，所述干细胞用于生产本发明的皮肤等价物。
支架被用作本发明的皮肤等价物的基底。组织工程领域已经广泛的使 用支架构建可移植修复机体中的缺陷部位的新组织，或在生物人工装置中 作为细胞容器。支架形成三维基质，作为细胞增殖和最终组织形成的模板。 在支架中培养细胞通常涉及在整个支架种植细胞，并允许细胞在支架内增 殖预定量的时间。
因此，本发明提供皮肤等价物和获得它的方法，其中在一个实施方案 中，支架包括或由生物可降解的材料制成。支架使用生物可降解的材料是 有利的，例如，对于组织工程，其中含有细胞的支架被用于修复活组织如 皮肤中的缺陷部位。本发明中使用的支架的一个有效方面是它们对于细胞 培养基的透入性，这对于将营养物和代谢物运到和运离在所述支架中包括 的细胞是必须的。在本发明中，支架还包括或由以下材料制成，例如琼脂 糖、聚己内酯(Endres.M等人，Tissue Engineering，2003，第9卷第4期，第 689-702页)、铌包被碳、壳聚糖、羟磷灰石-磷酸三钙(Harris，C.T.和 Cooper，L.F.，Comparison of matrices for hMSC delivery，2004，第747-755 页)、胶原、透明质酸、磷酸钙、淀粉、羟磷灰石、纤维蛋白、藻酸盐、聚 乙醇酸、碳纳米纤维、聚四氟乙烯、聚乳酸(Moran，J等人，Tissue Engineering，2003，第9卷第1期，第63-70页)及其混合物。本发明中还可以 使用在美国专利6,231,879中描述的泡沫支架，其基于热塑弹性体，例如聚 酰胺、聚酯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚氨基甲酸乙酯(polyethyurethane)或 聚硅氧烷。在一个实施方案中，使用多孔性聚碳酸酯作为支架材料。
其中包裹了细胞种的支架可以具有任何规则或不规则的(外部)形状。 如果支架是例如用于皮肤组织工程，则支架的形状将适合支架将用于的缺 陷部位的形状。在本发明中使用的支架一般是约1μm至约5μm厚，在一些 实施方案中可以具有表面积约0.5cm2至约20cm2。
为了获得用于本发明的皮肤等价物的细胞，在本文中描述了用于自脐 带羊膜分离干/祖细胞的方法。方法包括：
(a)在体外将羊膜与脐带的其它成分分离；
(b)在允许细胞增殖的条件下培养在步骤(a)中获得的羊膜组织；和
(c)分离干/祖细胞。
为了自脐带分离细胞，通常在(对于人类的情况，婴儿)出生后立即收 集脐带或其一部分，并且为了运输到实验室，在适合操作哺乳动物组织的 培养基中转移。此类培养基的实例包括但不限于Leibovitz培养基，其可自 供应商如西格玛-阿尔德里克公司(Sigma Aldrich)，Saint Louis，Missouri USA或美国Hyclone公司(Hyclone)，Logan，Utah，USA商购。然后，通常 在无菌条件下处理脐带。脐带的处理通常包括，通过用合适的缓冲液如磷 酸缓冲的盐溶液洗涤，去除残留在表面或在脐带血管内的血液。然后，通 常将脐带分成更小的片，如通过切割，并在分离羊膜和其它成分前再次洗 涤。在这一点上，注意不是必须在出生后立即处理哺乳动物供体的脐带， 而是可能收集脐带并任选的在无菌条件下洗涤并分成更小片后，通过深低 温-保藏保存脐带或其部分，并将如此获得的样品储存在例如液氮中，用于 以后从脐带分离细胞。
术语“深低温-保藏”在本文中使用的是其常规含义，描述这样的处理， 其中通过冷却到低的零下温度，例如(通常)-80℃或-196℃(液氮的沸点)，保 存细胞或整个组织。可以根据本领域技术人员已知的进行深低温-保藏，并 可以包括使用冷冻-保护剂例如二甲亚砜(DMSO)或甘油，其减慢脐带细胞 内冰晶的形成。
在本文中使用的术语“干/祖细胞”指从脐带衍生的任何细胞，其具有无 限自我更新和分化成多种细胞或组织类型(例如内皮细胞、上皮细胞、成纤 维细胞、肌细胞或神经元)的能力。并不是需要皮肤等价物的每个受试者都 可以提供脐带作为自体干/祖细胞的来源(即，从与稍后使用本发明的皮肤 等价物的个体相同的个体的脐带羊膜获得的细胞)。因此，本文也包括异种 的(即，在本发明的情况下，从人类以外的物种的脐带羊膜分离干/祖细胞) 或同种异体的(即，在本发明的情况下，从他人的脐带羊膜分离干/祖细胞) 干/祖细胞的用途。此外，用于皮肤等价物的细胞，和根据本发明的其生产 方法，可以来自任何哺乳动物物种，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、 狗、猫、绵羊、猴子或人，在一个实施方案中人来源的细胞是优选的。
术语“胚胎干细胞样特性”指脐带衍生的细胞的能力，即它们可以—— 与胚胎干细胞几乎或完全一样的——自发分化为所有的组织类型，意味着 它们是全能干细胞。
本文中使用的术语“羊膜”指包裹发育中的哺乳动物胚胎的最内层膜 囊。在妊娠期间，胎儿由称作羊水的液体包围并缓冲。这种液体连同胚胎 和胎盘被包裹在称作羊膜的囊中，该囊还覆盖脐带。由于如下原因羊水至 关重要。羊水缓冲并保护胚胎，允许胚胎自由移动。羊水还允许脐带漂浮， 防止其受到挤压并防止切断来源于胎盘血管内循环血液的氧气和营养素对 胚胎的供应。羊膜包含维持稳态环境的羊水，保护胚胎环境不受外部环境 影响。这种屏障还保护胚胎不受可能沿阴道上行并可能引起感染的生物(如 细菌或病毒)的影响。
用于组织培养的培养基和试剂在本领域内众所周知(参考例如，Pollard， J.W.和Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，NJ；Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第四版， Wiley-Liss，Hoboken，NJ)。用于培育/转运脐带组织样品的合适培养基实例 包括但不限于Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI培养基、CMRL 1066、Hanks′平衡盐溶液(HBSS)、磷酸缓冲的盐溶液(PBS)和L-15培养基。 用于培养本发明的干/祖细胞的适宜培养基实例包括但不限于Dulbecco′s改 良Eagle培养基(DMEM)、DMEM-F12、RPMI培养基、CMRL 1066、 EpiLife培养基和培养基171。培养基可以补加胎小牛血清(FCS)或胎牛血 清(FBS)以及抗生素、生长因子、氨基酸、抑制物等，这些完全为技术人员 的常识范围内。
分离干/祖细胞的方法，还包括：
(a″)在培养前，通过酶促消化和/或直接的组织外植体技术，自羊膜组 织中分离这些干/祖细胞。本文中使用的术语“酶促消化技术”意指加入酶以 将细胞从主要组织块(这里指脐带羊膜)释放出。随后收集分离的细胞。本 文中使用的术语“直接的组织外植体技术”意指首先将组织置于无酶培养基 内。随后，在精心条件下细胞自行从主要组织块分离，随后收获细胞用于 收集。
通过酶处理或直接的组织外植体法分离特定组织或器官的细胞的方法 是本领域普遍已知的(参考例如Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，NJ；Freshney， R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，NJ)。可以 将催化组织解离的任意酶用于实施该方法。在一个实例中，为此目的使用 胶原酶。使用作为粗制品或纯化形式的酶。所述酶可以自任意原核生物或 真核生物(最优选溶组织梭菌(Clostridium histolyticum))纯化或通过基因技 术重组产生。可以应用任意类型胶原酶，即I型、II型、III型、IV型或其任 意组合。在一些实例中，优选使用I型胶原酶。
在一个实例中，本发明提供用于分离具有胚胎干细胞样特性的干/祖细 胞的方法。这些细胞在形态上最终可分化为，但不限于，上皮干细胞或间 充质干细胞。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供皮肤等价物，其中自干/祖细 胞衍生的细胞是间充质干细胞(UCMC)或上皮干细胞(UCEC)。这些细胞 (UCMC和UCEC)是以分离上皮和/或间充质干/祖细胞的方法获得的，其中 与上述公开一致，这些细胞可以具有胚胎干细胞样特性。
上皮干/祖细胞(UCEC)包括显示上皮细胞样形态(即多角形状)的任意 细胞，其可以分化为任意类型上皮细胞例如(但不限于)皮肤上皮细胞、毛 囊细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、视网膜上皮细胞、肝上皮细胞、 肾上皮细胞、胰腺上皮细胞、食管上皮细胞、小肠上皮细胞、大肠上皮细 胞、肺和呼吸道上皮细胞、膀胱上皮细胞或子宫上皮细胞。
间充质干/祖细胞(UCMC)包括显示间充质细胞样形态(即纺锤样形状) 的任意细胞，其可以分化为任意类型的间充质细胞例如(但不限于)皮肤成 纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌腱细胞、韧带成纤维细胞、心肌细胞、 平滑肌细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、衍生自内分泌腺的细胞以及神经外 胚层细胞的全部变体和衍生细胞。
分离干/祖细胞的方法还可以包含：
(d)在允许细胞发生克隆扩充的条件下培养干/祖细胞。
术语“克隆扩充”(有时也称作“有丝分裂性克隆扩充”)涉及细胞分化程 序中早期发生的过程，通过该过程使干/祖细胞变成特定谱系并且随后发生 终末分化。本领域众所周知诱导祖细胞克隆扩充的条件在不同细胞类型间 变化明显。不限于特定的方法，诱导克隆扩充通常通过在已经优化用于细 胞增殖的生长培养基中培育干/祖细胞而实现。此类培养基可从众多供应商 处得到。此类培养基的非限制性实例是KGM-角质形成细胞培养基(康伯 司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)，MEGM-乳房上皮细胞 培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、EpiLife培养基(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)Oregon，USA)、Green’s 培养基、CMRL 1066(米德技术公司(Mediatech，Inc.)，Virginia，USA)或培 养基171(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)。通常， 这些培养基需要补加诱导细胞增殖的试剂如生长因子。此类试剂可以混合 于单一溶液中，如人角质形成细胞生长补充试剂盒(卡斯卡德生物公司 (Caseade Biologies.)，Oregon，USA)(仅举例)，或者可以单独地补加。此类 试剂包括但不限于生长因子(例如表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、血 小板衍生生长因子-BB、转化生长因子-β、角质形成细胞生长因子(KGF； 也称为HBGF-7或FGF-7)、TGF-α、双调蛋白)、激素(如牛垂体提取物)、 氢化可的松、转铁蛋白和其它任何合适组合等以诱导特定细胞类型的克隆 扩充。术语“克隆扩充”还包括体内细胞培养，例如通过将细胞注射至哺乳 动物如人、小鼠、大鼠、猴、猿中。
本发明提供皮肤等价物，其模拟了皮肤的天然组成，具有表皮层和真 皮层或具有这两层皮肤层中的任一层。出于该目的，本发明的细胞例如 UCMC和UCEC可分别分化成成纤维细胞和角质形成细胞。因此，本发明 在一个实施方案中提供了生产皮肤等价物的方法，包括：
●提供支架，
●将自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞放置在所述支架内或支 架上，和
●在第一培养基中孵育所述支架，其允许所述细胞增殖和进一步分化。
如上所述，由于本发明的自脐带羊膜分离的干/祖细胞具有分化成 UCMC和UCEC的潜能，在一些实施方案中，在生产皮肤等价物的方法中， 优选的使用自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的UCMC和UCEC。
在本发明的一个实施方案中，按实施例20中描述获得的UCMC提取物 可用于诱导从细胞系的细胞生长，所述细胞系由于它们的实足年龄，在普 通生长条件下完全不增殖或不太增殖。例如在本文中描述的UCMC提取物 可用于诱导从60岁患者获得的衰老角质形成细胞(asK)的生长。通过使用 UCMC提取物可以诱导生长的其它细胞系是真皮成纤维细胞(NF)，如实施 例20中描述的。
因此，本发明涉及诱导衰老角质形成细胞增殖的方法，包括在合适的 生长培养基中培养衰老的角质形成细胞，并向衰老的角质形成细胞添加脐 带羊膜的间充质干细胞(UCMC)，以诱导衰老的角质形成细胞增殖。方法 还包括增殖的衰老角质形成细胞的分离，和将它们应用于支架内或支架上。 在一个实施方案中，可以自30岁或以上、35岁或以上、40岁或以上、50岁 或以上、60岁或以上、70岁或以上甚至80岁以上的受试者中分离衰老的角 质形成细胞。然而，还可以从比30岁更年轻的受试者中分离衰老的角质形 成细胞。
根据影响皮肤的创伤或疾病的严重程度，可能只置换一层就足够，即 只提供表皮层，或者只提供真皮层，在所述真皮层上放置已经培养好的或 已经从其他来源获得的形成表皮的角质形成细胞。为了获得表皮层，UCEC 可以分化为角质形成细胞，为了获得真皮层，UCMC可以分化成成纤维细 胞。
因此，在本发明的方法中，当所述支架包含UCEC时，第一培养基包 括适于角质形成细胞培养的培养基，从而增殖和分化所述UCEC成角质形 成细胞。
在该情况下，该第一培养基包括角质形成细胞生长培养基、生长因子、 胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸。
生长因子可以是，例如表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1、血 小板衍生生长因子-BB(PDGFb)、转化生长因子-β、角质形成细胞生长因子 (KGF)、TGF-α或双调蛋白。
角质形成细胞生长培养基可以是例如KGM-角质形成细胞培养基(康 伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、MEGM-乳房上皮 细胞培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、 EpiLife培养基(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon， USA)、Green’s培养基、CMRL1066(米德技术公司(Mediatech，Inc)， Virginia，USA)、M171(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon， USA)、L-15培养基、Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)、DMEM-F12 和RPMI培养基。
在一个实施方案中，当所述支架包含UCEC时，为了增殖和分化所述 UCEC为角质形成细胞，适于角质形成细胞培养的第一培养基包括角质形 成细胞生长培养基、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸。 在另一个实施方案中，该第一培养基包括EpiLife培养基(卡斯卡德生物公 司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、 转铁蛋白和亚硒酸。在另一个实施方案中，该第一培养基包含约98.8至约 99.4％(v/v)EpiLife培养基(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)， Oregon，USA)、约0.2至约0.4％(v/v)胰岛素、约0.2至约0.4％(v/v)转铁蛋白、 约0.2至约0.4％(v/v)亚硒酸和10ng/ml表皮生长因子(EGF)。可以在图18a中 看到通过使用本发明的方法获得的角质形成细胞的实例。
在本发明方法的另一个实施方案中，当所述支架包含UCMC时，为了 增殖和分化所述UCMC为成纤维细胞，所述第一培养基包括适于成纤维细 胞培养的培养基。在此情况下，第一培养基同时包括成纤维细胞生长培养 基与胎小牛血清(FCS)或胎牛血清(FBS)，从而增殖和分化所述UCMC为成 纤维细胞。成纤维细胞生长培养基可以是KGM-角质形成细胞培养基(康 伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、MEGM-乳房上皮 细胞培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、 EpiLife培养基(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon， USA)、Green’s培养基、CMRL1066(Mediatech公司，Virginia，USA)、 M171(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)、L-15 培养基、Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)、DMEM-F12和RPMI培养 基。在一个实施方案中，当所述支架包含UCMC时，为了增殖和分化所述 UCMC为成纤维细胞，用于成纤维细胞培养的第一培养基包括约90至约 95％(v/v)成纤维细胞生长培养基和约5至约10％胎牛或胎小牛血清(FCS)。 在另一个实施方案中，第一培养基包含约90至约95％(v/v)CMRL1066(米德 技术公司(Mediatech.Inc)，Virginia，USA)和约5至约10％胎小牛血清 (FCS)。可以在图18b中看到通过使用本发明的方法获得的成纤维细胞的实 例。
一旦UCMC或UCEC分别完全分化成成纤维细胞和角质形成细胞，则 可以用于哺乳动物或人类机体的受影响的部分。但是，有时不仅真皮层或 表皮层要求置换，而是两层皮肤层都要求置换。这可以是以下情况，例如 当皮肤的表皮层和真皮层由于烧伤(全层创伤)破坏时。出于该目的及其它 目的，本发明提供方法，其包括
●提供支架，
●将UCMC放置在所述支架内或支架上，
●在适于成纤维细胞培养的第一培养基中孵育所述支架，其允许所述 UCMC增殖和进一步分化，
●将UCEC放置在所述支架内或支架上，和
●在第二培养基中孵育所述支架，其允许所述UCEC增殖和进一步分 化成角质形成细胞。
使用适于成纤维细胞培养的第一培养基(其包括上述对用于UCMC分 化成成纤维细胞的第一培养基相同的组分)，使本领域技术人员能够在支架 内或在支架上生长包含成纤维细胞的真皮层。之后，可以在已包括该真皮 层支架内或支架上应用UCEC。使用第二培养基(其包括上述对用于UCEC 分化成角质形成细胞的第一培养基相同的组分)，这能够在第一真皮层上生 长表皮皮肤层。因此，本发明的皮肤等价物能够提供真实的、形态发生的、 多层皮肤等价物，其包括UCMC-衍生的成纤维细胞和UCEC-衍生的角质 形成细胞。在附图19中可以看到这些皮肤等价物提供全层真皮再生，产生 加快愈合并减少伤痕。
从分化为成纤维细胞的UCMC发育功能性的真皮层需要约4至7天的 时间，而一旦发育出真皮层并且UCEC掺入到支架内，还需要另外8至10天 直到从UCEC衍生的角质形成细胞形成表皮层。对于根据本领域现状生产 的自体培养的皮肤等价物，根据活组织检查的尺寸，需要至少21至35天， 然而使用本发明的方法，只需要12至18天。除了其它理由，这还是由于以 下事实，即使用本发明的方法可以加速过程，因为本发明的细胞库或现有 的细胞培养已经提供了用于本发明皮肤等价物的细胞(异种或同种异体)。 用于UCMC和UCEC的初始浓度在示例性实施方案中是在约1×105至约 1×106细胞/ml范围内。在一个实施方案中，用于接种UCMC到支架中的浓 度是约5×105UCMC/ml，用于接种UCEC的是1×106UCEC/ml。
如在背景部分描述的，天然皮肤的真皮不仅含有成纤维细胞还含有神 经末梢、腺体、毛囊和血管。为了进一步改善皮肤等价物的功能，本发明 方法的一个实施方案因此还包括将一个或多个细胞系的细胞放置在支架内 或支架上，该细胞系能够分化为血管或腺体。一些腺体对热反应产生汗(汗 腺)，而其它腺体产生油(皮脂腺)从而保持皮肤湿润柔软。该油还作为抵抗 外来物质的屏障。真皮的血管为皮肤提供营养物，并帮助调节机体温度。 由于这些额外的细胞完成皮肤内的重要功能，本发明的一个实施方案还提 供了方法，仅举出几例，其中支架还包括血管内皮细胞或真皮微血管内皮 细胞。在一个实施方案中，血管内皮细胞来自哺乳动物的脐带，在一个实 施方案中，来自人类的脐带。可用于本发明方法的不同细胞系的非限制性 实例是，例如，仅举出几例，人类脐血管内皮细胞(HUVEC)或真皮微血管 内皮细胞(DMEC，又称为DMVEC)。
此外，研究已经显示，细胞胞外基质(ECM)对细胞的功能影响很大。 作为支架，胞外基质形成三维模式，其支持细胞生长并改善它们的功能。 与上述支架不同，胞外基质由细胞自身生产的天然材料构成，然而，上述 支架还可以包括或由人工材料组成，例如但不限于多孔性聚碳酸酯。因此， 由于基质对细胞生长的重要性，再造ECM结构(其更好的模拟体内围绕细 胞的该基质，特别是模拟体内组织的基质)是组织工程的主要目标。Wei Tan， M.S.和T.A.Desai已经展示了(Tissue Engineering，2003，第9卷第2期，第 255-267页)天然的胶原、胶原与壳聚糖的混合物或胶原、壳聚糖和纤连蛋 白的混合物可用于产生用于在其中嵌入人类肺成纤维细胞和人类脐静脉内 皮细胞的基质。
因此，本发明还提供方法，其中在所述支架内或支架上放置至少一种 胞外基质组分。该胞外基质组分应该模拟通过细胞自身常规产生的ECM基 质。因此，ECM组分由还可以在自然中发现的、由细胞自身产生的材料组 成。优选的，将该至少一种胞外基质组分与自上述干/祖细胞衍生的细胞一 起放置在支架内或支架上。如果用于本发明皮肤等价物的和生产它们的方 法的细胞能够自身产生ECM组分，则不需要人工掺入胞外基质组分。在一 个实施方案中，用抗坏血酸刺激后，UCMC自我沉积胶原作为ECM材料。 如果除了本发明使用的细胞外还添加ECM组分，胞外基质组分可以选自材 料例如胶原、弹性蛋白、胞间粘附分子、层粘连蛋白、肝素、纤连蛋白、 蛋白聚糖、生腱蛋白、肌原纤蛋白及其混合物。如果使用胶原，在一些实 施方案中目前优选的只使用I型胶原或联合使用I型和III型胶原。在本发明 的一个实施方案中，使用I型胶原。
还描述了方法，其进一步包括在它们用于本发明的皮肤等价物之前， 保藏分离的干/祖细胞或分化的干/祖细胞(例如，UCMC和UCEC)。
用于保存和贮藏真核细胞尤其是哺乳动物细胞的方法和方案在本领域。 内众所周知(参考例如Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，NJ；Freshney， R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，NJ)。用于 维持分离的干/组细胞例如上皮干/祖细胞或间充质干/祖细胞生物学活性的 任意方法可以与本发明共同使用。在一个实例中，干/祖细胞通过使用深低 温保藏法维持和贮藏。
因此，还描述了通过以上方法自脐带羊膜衍生的祖/干细胞，以及分化 自祖/干细胞的细胞。此外，也描述了细胞库，其包含一种或多种已经如上 所述分离的祖/干细胞或由其组成。例如，这种祖/干细胞的细胞库可以是对 个体自体性的或是汇集性的(例如，后者用于随后的同种异体移植)，并且 随后可以通过进一步分化应用于例如再生医学、组织修复和再生。
与以上一致，通过上述方法从脐带羊膜分离的干/祖细胞也可以包含在 药物组合物中。药物组合物还可以包括自干/祖细胞分化的细胞。药物组合 物可以是任何类型，通常包含干/祖细胞，其分化的细胞或其细胞分泌物或 细胞提取物，同时具有合适的可药用载体和赋形剂。在细胞分泌的情况下， 可以以上清液的形式使用需要的化合物，其中所述化合物被分泌到所述上 清液中。在另一个实例中，可以处理上清液，例如在被包括到药物组合物 中之前纯化或浓缩。在一些实例中，药物组合物适于全身应用或局部应用。
适于局部应用的药物组合物可以是液体或黏稠形式。其实例包括软膏 剂、乳膏剂和洗剂等。适于全身使用的药物组合物的实例是液体组合物， 其中干/祖细胞或细胞提取物溶解于例如可注射或输注用缓冲液中。这类药 物组合物的制备是本领域技术人员的知识范围，并描述在例如Gennaro， A.L.和Gennaro，A.R.(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA中。
因此，描述了治疗患有疾病的受试者的方法。该方法包含向受试者施 用有效量的如上所述分离的干/祖细胞或自此细胞衍生的细胞提取物。
原则上，可以用细胞或细胞提取物治疗任何适于通过干细胞/祖细胞方 法治疗的病症或疾病。还可以将细胞分化为需要的细胞类型，例如但不限 于，皮肤细胞、骨或软骨细胞、肝细胞、抗原-生产细胞、激素生产细胞例 如β胰岛胰岛素生产细胞，并治疗性的使用分化的细胞。
因此，本发明还涉及产生胰岛素-生产细胞的方法，包含
●培养自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞，和
●在合适的培养基中增殖和分化所述细胞成β-胰岛细胞。
在一个实施方案中，自干/祖细胞衍生的细胞是间充质干细胞(UCMC) 或上皮干细胞(UCEC)，通过在细胞培养基中包括烟酰胺，其可以进一步分 化为分泌胰岛素的β-胰岛细胞。
除了烟酰胺，培养基还可以包括用于β-胰岛细胞培养的生长培养基。 培养基还可以包括生长因子或胎血清。胎血清可以是例如小牛或牛来源的。 在一个实施方案中，培养基还可以包括胰岛素，转铁蛋白和亚硒酸。生长 因子可以是例如但不限于表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1、血小 板衍生生长因子-BB(PDGFb)、转化生长因子-β、角质形成细胞生长因子 (KGF)、TGF-α或双调蛋白。用于β-胰岛细胞培养的生长培养基可以是例 如但不限于KGM-角质形成细胞培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、MEGM-乳房上皮细胞培养基(康伯司 公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、EpiLife培养基(卡斯卡 德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)、Green’s培养基、 CMRL1066(米德技术公司(Mediatech.Inc)，Virginia，USA)、M171(卡斯 卡德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)、L-15培养基、 Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)、DMEM-F12和RPMI培养基。
在本发明的一个实施方案中，使用在实施例15中描述的培养基分化 UCMC或UCEC成β-胰岛细胞。
在另一个实施方案中，方法包括分离β-胰岛细胞生产的胰岛素，其可 以然后用于治疗例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，如在哺乳动物中。哺乳 动物可以是例如人类、猫、狗、羊、马或猪。可以根据例如但不限于Jones P.M.和Saermark，T等人(Anal Biochem.1987Oct；166(1)：142-9)描述的方 法进行胰岛素的分离。
因此，本发明还涉及根据本发明产生胰岛素生产细胞的方法获得的胰 岛素-生产细胞。本发明还涉及治疗与胰岛素水平失衡相关的疾病的方法， 包括向哺乳动物施用通过本发明方法获得的胰岛素-生产细胞。哺乳动物可 以例如是人、猫、狗、羊、马或猪。此类疾病的实例是胰岛素依赖性糖尿 病(IDDM)。
在本发明的另一个实施方案中，提供产生多巴胺和酪氨酸羟化酶生产 细胞的方法，包括培养自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞，优选的 UCMC，和在合适的培养基中将所述细胞增殖和分化成多巴胺和酪氨酸羟 化酶(TH)生产细胞。多巴胺作为神经递质发挥作用，激活多巴胺受体。多 巴胺还是下丘脑释放的神经激素。它作为激素的主要功能是抑制垂体前叶 释放催乳素。多巴胺可以作为药物提供，作用于交感神经系统，产生例如 心率加快和血压升高的效果。酪氨酸羟化酶是在机体用于肾上腺素合成过 程中负责催化氨基酸-L-酪氨酸转化为多巴胺前体——二羟基苯丙氨酸 (DOPA)的酶。因此，在另一个实施方案中，方法还包括分离自UCMC衍生 的多巴胺和酪氨酸羟化酶生产细胞产生的多巴胺和/或酪氨酸羟化酶。
本发明还提供产生人白细胞抗原G(HLA-G)的方法。人白细胞抗原 (HLA)-G是主要组织相容性复合体I类抗原，其被称为非经典的，因为其在 胎盘中展示了组织限制性的分布、减少的胞质域、有限的多态性和一些同 种型。认为HLA-G在妊娠期间起到了重要作用，通过保护半同种异体的胎 儿不被母体免疫细胞识别和破坏。多种免疫介导的疾病和病症中涉及 HLA-G，如器官-、细胞移植和自身免疫病。此类自身免疫病的实例是多 发性硬化、风湿性关节炎、I型糖尿病、牛皮癣、甲状腺疾病、系统性红斑 狼疮、硬皮病或乳糜泻。因此，本发明提供产生人白细胞抗原G(HLA-G) 生产细胞的方法，包括培养自脐带羊膜分离的干/祖细胞衍生的细胞，和在 合适的培养基中增殖和分化所述细胞成HLA-G生产细胞。可以自UCMC或 UCEC产生HLA-G生产细胞。用本发明的方法，第一次显示幼稚 UCEC(UCEC)表达和生产HLA-G。令人惊讶的，对于该方法，特定 的诱导UCEC生产HLA-G不是必须的(参见实施例19)。
其它可以用本文中描述的干/祖细胞治疗的疾病，选自肿瘤病、加速型 皮肤衰老和皮肤疾病、组织障碍、内脏内分泌缺陷(visceral endocrine deficiency)和神经障碍。
待治疗的组织障碍可以是先天性或获得性组织缺陷。可以用干/祖细胞 或自其衍生的细胞治疗的内脏内分泌缺陷的实例包括但不限于，睾酮缺陷、 贫血、低血糖症、高血糖症、胰腺缺陷、肾上腺缺陷和甲状腺缺陷。
可以治疗的神经障碍的实例包括但不限于，阿兹海默氏病、帕金森病、 Jacob Kreutzfeld’s病、Lou Gehrig’s症、亨廷顿病和神经肿瘤病症。
本发明还涉及自脐带羊膜分离的间充质干细胞(UCMC)的用途，其用 于生产成骨细胞(参见实施例10)(用于骨损伤的治疗)，或生产软骨细胞(参 见实施例17)(用于软骨损伤的治疗)。
此外，本发明还提供产生肝细胞的方法，包括培养自脐带羊膜分离的 干/祖细胞衍生的细胞，优选的UCEC，和在合适的培养基中增殖和分化所 述细胞成肝细胞。合适的培养基包含制瘤素-M，其用于诱导分化为肝细胞。 制瘤素-M(OSM)是多向性细胞嘧啶(pleitropic cytocine)，属于细胞因子的 白介素-6组。在这些细胞因子中，它与白血病抑制因子在结构和功能上都 最相似。然而，它尚且未被准确定义且被证明在肝脏发育、血生成、炎症 中以及可能在CNS发育中是重要的。
与上述讨论一致，本发明还涉及治疗创伤或皮肤疾病的方法，包括对 创伤或皮肤疾病应用本发明的皮肤等价物。因此，通过本发明的方法获得 的本发明的皮肤等价物可用于药物组合物的生产。本发明还涉及因此获得 的治疗烧伤皮肤、溃疡、辐射和糖尿病创伤的药物组合物。本发明还涉及 包含本发明的皮肤等价物的细胞库。
皮肤病的实例是部分皮肤的创伤或破损部分，例如，阳光灼伤的皮肤。 在本文中，皮肤的衰老也被认为是皮肤病。干/祖细胞或其细胞提取物的局 部或类似的递送，例如，作为洗剂或乳膏剂或任何其它合适载体中的组分， 可以因此用于修复阳光损伤的皮肤，此外还可以减慢皮肤衰老的过程(抗衰 老性质)，这是通过补充从而强化缺乏的生长因子和相关的肽元素(缺少它 们将加快皮肤衰老)。因此可以使用本发明的皮肤等价物。干/祖细胞还可 以迁移到机体的受损区域例如表面创伤，形成局部修复过程必须的细胞元 素(参见The Journal of Immunology，2001，166：7556-7562；或International Journal of Biochemical and Cell Biology 2004；36：598-606)。
肿瘤疾病可以是癌，特别由于最近研究已证实干细胞可以选择性地靶 向肿瘤瘤组织(Journal of the National Cancer Institute 2004；96(21)： 1593-1603)，允许将抗瘤剂如干扰素定向送递至致瘤灶。癌可以是任何类 型的癌，包括能够形成实体瘤的那些癌，范围从皮肤癌至内脏癌。待治疗 的癌的实例包括鳞状细胞癌、乳腺导管和小叶癌、肝细胞癌、鼻咽癌、肺 癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子 宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、睾丸癌、子宫癌、 输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金 淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上 腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿 童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂 癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴 肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌或此类癌的任 意组合，包括其散布(转移)形式。在治疗肿瘤疾病时，本文中所描述的脐 带羊膜衍生的干细胞和/或它们的细胞提取物既可以作为直接治疗和/或作 为携带载体全身性施用。在抗肿瘤治疗时，细胞包含抗肿瘤药剂。
在另一药学用途中，干/祖细胞可以用于基因治疗。为此目的，可以将 细胞用编码在细胞中待产生的蛋白质的核酸转化。可以使用技术人员众所 周知的多种方法中的任意方法将核酸导入本发明的细胞，例如使用病毒载 体和/或含脂类的转染组合物如IBAfect(IBA GmbH，，德国)、 Fugene(F.霍夫曼-拉罗切公司(F. Hoffmann-LaRoche Ltd.)，Basel，瑞士)、 Gene Porter(基因疗法系统公司(Gene Therapy Systems))、 Lipofectamine(英杰生命技术公司(Invitrogen Corporation)，California， USA)、Superfect(快而精公司(Qiagen)，Hilden，德国)、Metafecten(博奥塔 克公司(Biontex，Munich，德国)或者在PCT申请WO 01/015755)中描述的 那些转染组合物。在相关的实施方案中，干/祖细胞和衍生自其的细胞在用 编码所选择多肽的核酸转化后，可以用于重组产生该多肽。
如以上提及，干细胞提取物富含与正常组织生理有关的多种生长因子 和肽。此类生长因子和/或肽可能在机体暴露的部分中缺乏，如作为所有人 的表层保护机体不受外界因素影响以维持内部稳态的皮肤中。因此，干/ 祖细胞或其细胞提取物适合用于治疗和/或维持内部稳态。
此外并且与如上公开相一致，可以将干/祖细胞或衍生自其的细胞用于 产生任意生物分子。生物分子可以是例如在细胞内天然产生的任意分子或 其编码核酸已经通过重组DNA技术导入细胞的分子。可以由细胞产生的分 子实例包括但不限于蛋白质如细胞因子、生长因子如胰岛素样生长因子 (IGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGFβ)、激活蛋白A、骨形 态发生蛋白(BMP)、PDGF或者激素如胰岛素或促红细胞生成素或转运蛋 白如转铁蛋白、肽如生长因子或激素(例如黄体激素(LSH)、促卵泡激素 (FSH))、有机小分子如类固醇激素、寡糖或多糖例如肝素或硫酸乙酰肝素 (对于此方面实施例参考WO 96/23003或WO 96/02259)、蛋白聚糖、糖蛋白 如胶原或层粘连蛋白或者脂等。
黏蛋白，其是糖蛋白，是可以在大多数上皮层的粘性分泌物(例如唾液、 胃液、乳糜、支气管液)中发现的复杂分子。黏蛋白执行润滑和保护功能(例 如，chime的运输、缓冲过量的胃酸、关节滑液的润滑功能)。由于它的复 杂结构和它的高摩尔质量(约1百万-5千万道尔顿)，通常难以分离天然形态 的黏蛋白分子。
因此，本发明还提供产生黏蛋白-生产细胞的方法，包括：
●将脐带羊膜上皮干细胞(UCEC)放置在容器(例如，培养瓶、培养皿) 中，和
●在适合分泌细胞培养的培养基中孵育所述UCEC。
这些黏蛋白-生产细胞不仅可以用于从细胞培养基中分离黏蛋白，而且 还可以在本发明的方法中使用这些细胞，包括使包含被烟影响的细胞的组 织接触通过本发明方法产生的黏蛋白-生产细胞。这些被影响的细胞可以是 呼吸道例如肺，或眼表面的细胞。
此外，通过本发明方法获得的黏蛋白-生产细胞可用于治疗滑膜细胞肉 瘤、烟吸入损伤或眼表面损伤。通过本发明方法获得的黏蛋白-生产细胞还 可用于食道和气道组织工程，用于化妆品应用或作为基因/蛋白质递送系 统。
为了分化本文描述的UCEC成黏蛋白-生产细胞，发明还提供了培养 基，其中所述培养基包括用于黏蛋白-生产细胞培养的生长培养基、胰岛素、 转铁蛋白、亚硒酸和生长因子。
生长因子可以是，例如但不限于表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长 因子-1、血小板衍生生长因子-BB(PDGFb)、转化生长因子-β、角质形成细 胞生长因子(KGF)、TGF-α或双调蛋白。
用于黏蛋白-生产细胞培养的生长培养基可以是，例如但不限于 KGM-角质形成细胞培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、MEGM-乳房上皮细胞培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、EpiLife培养基(卡斯卡德生物公司 (Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)、Green’s培养基、CMRL1066(米 德技术公司(Mediatech.Inc)，Virginia，USA)、M171(卡斯卡德生物公司 (Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)、L-15培养基、Dulbecco’s改良Eaglo 培养基(DMEM)、DMEM-F12和RPMI培养基。
在一个实施方案中，适合黏蛋白-生产细胞培养的培养基包括用于黏蛋 白-生产细胞培养的生长培养基、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白 和亚硒酸。
在另一个实施方案中，适合黏蛋白-生产细胞培养的培养基包含约98.8 至约99.4％(v/v)用于黏蛋白-生产细胞培养的生长培养基、约0.2至约 0.4％(v/v)胰岛素、约0.2至约0.4％(v/v)转铁蛋白、约0.2至约0.4％(v/v)亚硒 酸和约10ng/ml表皮生长因子(EGF)。
在另一个实施方案中，适合黏蛋白-生产细胞培养的培养基包含约98.8 至约99.4％(v/v)CMRL1066(米德技术公司(Mediatech.Inc)，Virginia，USA) 或M171(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)、约0.2 至约0.4％(v/v)胰岛素、约0.2至约0.4％(v/v)转铁蛋白、约0.2至约0.4％(v/v) 亚硒酸和约10ng/ml表皮生长因子(EGF)。
可以用黏蛋白凝块测试(参见实施例16)定义通过本发明的方法产生的 黏蛋白-生产细胞。该测试还描述在Corfield A.P.，Glycoprotein method and protocols：The Mucins，第29-65页.Humana Press 2000；Gatter R.A.和 Schumacher R.H.，A practical handbook of join fluid analysis，第59-63页， Lea&Febiger，1991中，其完整内容引入本文作为参考。该测试是对通过 在上述定义的细胞培养基中培养的UCEC生产的黏蛋白的质量和数量的评 估。简而言之，在该细胞培养物的测试培养基中注入7N冰醋酸，在所述培 养基中UCEC细胞已经根据本发明的方法孵育。醋酸导致黏蛋白形成凝块。 含有黏蛋白的培养基将表现为具有紧密、粘稠凝块的清澈液体。因此，在 一个实施方案中，本文中使用的黏蛋白生产细胞指，当用实施例16中描述 的测试和条件检测时产生阳性结果的细胞。
与最近方法一致(见例如Amit，M等，Human Feeder Layers for human embryonic stell Cells，Biol Reprod 2003；68：2150-2156)，本文中描述的干/ 祖细胞可用作培养其它胚胎干细胞，特别是人胚胎干细胞的饲养层。在这 些实施方案之一中，细胞优选的是人来源，因为使用人细胞作为饲养层使 得动物来源成分，例如动物病原体或免疫原，污染细胞培养物的风险最小 化。在该方面，还应当注意，可以在无血清条件下培养干/祖细胞和从其衍 生的细胞，因此，使用细胞作为饲养层并且在无血清培养基下培养细胞培 养物，所述培养基例如在本文以下描述的或在Draper等人中(Culture and characterization of human embryonic stem cell lines，Stem Cells Dev 2004， 13：325-336)或在国际专利申请WO 98/30679中描述的。
在此上下文中，应当说明的是具有最小比例衰老细胞的大量低代次细 胞(即大比例的高质量细胞)在移植外科和基于细胞的疗法中是至关重要的 并且需要在细胞扩充期间的可能的最短时间内衍生。例如，来自骨髓和脐 带血的间充质干细胞量少并且因此需要较长时间经过众多传代的扩充以达 到细胞移植所需要的足够细胞数目。然而，高代次细胞往往质量退化并且 可能导致细胞衰老或癌性转化。本文中已经发现，可以使用重复性外植体 技术以较少传代次数得到大量的干/祖细胞。因此描述了培养干/祖细胞的方 法，其中该方法包括：
自脐带羊膜得到组织外植体；
在合适培养基内和培养条件下将该组织外植体在合适时间阶段内培 养，
任选地使组织外植体接触新鲜培养基并且在合适条件下连续培养合适 时间阶段(参考图15)。
培养可以按照需要的循环(传代)次数实施并且一旦获得所需要细胞数 目即停止。通过从用于细胞生长的容器中移去用过的细胞培养基并且将新 鲜培养基加入该容器使组织外植体接触新鲜培养基。除了对替换所用容器 中培养基之外，可以通过将组织外植体转移至充满培养基的新容器实现接 触新鲜培养基。用于细胞培养和/或增殖的组织外植体可以通过适合方法得 到，例如通过如上所述的“直接的组织外植体技术”(在其中首先将组织置于 无酶培养基内，随后在精心条件下细胞自行从主要组织块分离并且随后将 收获细胞用于收集)。
组织外植体的培养可以在适用于培养哺乳动物细胞的任意培养基内实 施。就培养或克隆扩充干/祖细胞和衍生自其的细胞而言，培养基实例包括 如上所列常规的和商业可得到的培养基，例如不限于KGM-角质形成细胞 培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、MEGM- 乳房上皮细胞培养基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey， USA)、EpiLife培养基(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)， Oregon，USA)、培养基171(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)， Oregon，USA)、DMEM、DMEM-F12或RPMI培养基。培养通常在正常 用于培养衍生该细胞的种属细胞的条件(温度、气体)下实施，例如于37℃、 5％CO2的空气内。在一个实施方案中，使用无血清、特别是无牛血清培养 基实施培养。通常，持续培养(在一代中)至细胞生长所需要的任意合适时 间，但是决不限于持续大约1至数天例如大约7天或大约8天。
在本文举例说明的本发明可以在缺乏本文明确公开的任意部分、限制 下实施。因此术语“包含”、“包括”、“含有”等应当作广泛性和非限制地理 解。此外，将本文中所用术语和表述作为描述性并且非限制性术语使用， 并且在使用这类术语和表述时没有排除所展示和描述特性或其部分的等效 物的意图，但是确认多种调整仍可能在本发明所要求保护的权利要求的范 围内。因此，应当理解的是，虽然本发明通过优选的实施方案和任选的特 性具体进行公开，对本公开所体现的本发明的调整和改动对本领域技术人 员而言是显而易见的，并且将此类调整和改动视为在本发明范围内。
已经在本文中将本发明广泛并一般地进行了描述。处于类属性公开范 围内的较窄种属和亚类属组也形成了本发明的部分。这包括本发明的具有 自此属中除去任意主题的附带条件或否定性限制的本发明类属性描述，无 论所排除的材料在本文中是否特别地引用。
其它实施方案处于如下权利要求和非限制性实施例范围内。此外，本 发明的特征和方面以马库什组术语描述时，本领域技术人员将认识到，本 发明因此还根据该马库什组的任意个体成员或亚族成员描述。
实施例
实施例1：脐带组织收集
婴儿出生后立即收集脐带组织。将标本淋洗干净并且在转运至实验室 前立即转移至含有培养物转运培养基(补加50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉 素、250μg/ml两性霉素、50μg/ml庆大霉素的L-15培养基；所有试剂均购 自Invitrogen)的500ml无菌玻璃瓶内。在实验室内，于无菌条件下在层流净 化柜中提取干细胞。首先将标本转移至无菌不锈钢托盘。使用补加5IU/ml 肝素(来自西格玛-阿尔德里克公司(Sigma-Aldrich)，Missouri，USA)的温暖 的磷酸缓冲的盐溶液(PBS)多次注射洗涤除去脐带血管内所有残留血液。在 最后一次洗涤中使用无肝素的普通PBS。随后将脐带组织标本切割为长2 cm的小片并且转移至直径10cm的细胞培养皿内，在其中用70％乙醇进一 步洗涤和消毒，随后使用含有抗生素混合物(50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉 素、250μg/ml两性霉素、50μg/ml庆大霉素；均购自英杰生命技术公司 (Invitrogen Corporation)，California，USA)的PBS多次洗涤直至溶液变清。
实施例2：细胞分离/培养
首先截断脐带组织以便将脐带羊膜与沃顿胶(即脐带基质)和其它内部 成分分开。随后将分离的羊膜切割成(0.5cm×0.5cm)小片用于细胞分离。 将脐带羊膜片放置在用于分离上皮干细胞或间充质干细胞的不同细胞培养 条件下的组织培养皿上实施外植。
对于间充质细胞分离/培养，将外植体浸没于5ml补加10％胎牛血清 (美国Hyclone公司(Hyclone)，Utah，USA)的DMEM(英杰生命技术公司 (Invitrogen Corporation)，California，USA)(DMEM/10％FBS)内并且在 CO2细胞培养箱内于37℃培养。培养基每2天或3天更换一次。细胞生长晕 在光学显微镜下检查。长出的细胞通过胰蛋白酶消化(0.125％胰蛋白酶 /0.05％EDTA)收获用于进一步扩充并且使用培养基DMEM/10％FBS深低 温保藏。
对于上皮细胞分离/培养，在将组织样品放置于表面前用1型胶原/4型胶 原混合物(1∶2)包被细胞培养皿塑料表面。将组织样品浸没于5ml EpiLife 培养基或培养基171内(两者均来自卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)Oregon，USA)。培养基每2天或3天更换一次。在光学显微镜下检查来 自组织培养外植体的细胞生长。长出的细胞通过胰蛋白酶消化(0.125％胰蛋 白酶/0.05％EDTA)使用EpiLife培养基或培养基171收获。
对于细胞的酶提取方法，将脐带羊膜分成0.5cm×0.5cm的小片并且在 0.1％(w/v)I型胶原酶溶液(L.霍夫曼-拉罗切公司(L.Hoffmann-La Roche Ltd.)Basel，瑞士)中37℃消化6小时。将样品每15分钟涡旋混合2分钟。4000 转/分离心30分钟收集细胞。采用两种不同方法以便分离上皮干细胞或间充 质干细胞。
对于上皮干细胞的分离，将细胞沉淀重悬于补加50μg/ml胰岛素样生 长因子-1(IGF-1)、50μg/ml血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、5μg/ml转 化生长因子-β(TGF-β1)和5μg/ml胰岛素(均自R&D系统公司(R&D Systems)，Minneapolis，USA获得)的EpiLife培养基或培养基171(两者均来 自卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)中，计数并在 预先用1型胶原/4型胶原混合物(1∶2；贝克顿迪肯森公司(Becton Dickinson)， New Jersey，USA)包被的10cm组织培养皿中以1×106个细胞/皿的密度接 种。24小时后，附着的细胞用温暖的PBS洗涤并且用添加补充物的EpiLife 培养基或培养基171替换原培养基。培养基每2天或3天更换一次。细胞生长 和扩充的克隆形成在光学显微镜下检查。在大约70％汇合时，将细胞通过 胰蛋白酶消化(0.125％胰蛋白酶/0.05％EDTA)次培养用于进一步扩充和深 低温保藏。
对于间充质干细胞的分离，将细胞沉淀重悬于PTT-4培养基中、计数 并在10cm组织培养皿中以1×106个细胞/皿的密度接种。培养基每2天或3 天更换一次。细胞生长和扩充在光学显微镜下检查。在大约90％汇合时， 将细胞如上所述次培养。
对于在饲养层上培养上皮干细胞和间充质干细胞，将脐带内衬膜通过 胶原酶处理消化、计数并且接种于经致死性照射或丝裂霉素C处理的3T3 成纤维细胞(饲养层)包被的10cm组织培养皿内的Green′s培养基中。培养 基每2天或3天更换一次。集落形成在光学显微镜下检查并照相。
实施例3：干/祖细胞鉴定
上皮细胞：图1显示自使用组织外植体方法制备的脐带羊膜长出的上 皮细胞图象(40×放大)。图象在组织培养第2天(图1A)和第5天(图1B，C)拍 摄。细胞形态学分析显示多角形状的上皮样细胞。通过脐带片段的酶消化 在第2天(图A、C)和第5天(图B、D)产生相似(图2)上皮细胞(40×放大)。图7 显示来自使用Green′s方法在饲养层上培养的脐带羊膜的上皮干细胞集落 形成图象(40×放大)。多角形状的上皮样细胞集落从第3至第7天迅速扩大。
间充质细胞：在使用补加10％胎小牛血清(FCS)的CMRL-1066(或 PTT-4培养基)作为培养基的组织培养皿中放置后早至48小时观察到自脐带 羊膜移出的生长出来的间充质细胞生长晕(图3A、C)(40×放大)。细胞的特 征在于它们呈纺锤体形态并且在体外既容易又迅速地迁移和扩展，与成纤 维细胞非常类似(图3B、D)(40×放大)。在由胶原酶酶消化分离的细胞组中 显示类似的观察结果(图4)。图4A显示在第二天自脐带羊膜分离的间充质细 胞。在第5天观察到细胞增殖(图4B)(40×放大)。图6和8显示在无饲养层(图 6)和有饲养层条件下(图8-1，使用3T3饲养层)在PTT-4培养基中培养的来自 脐带羊膜的间充质干细胞的集落形成图象(40×放大)。伸长形状的成纤维细 胞样细胞的集落从第3至第7天迅速扩大。注意到在此方面中，3T3饲养层 通常抑制间充质细胞的生长，与人皮肤成纤维细胞一样。再一次地，这表 明了本发明的间充质细胞的行为与更多分化的对应体相比的不同。
在其它实验中研究了发明的间充质细胞(UCMC)的克隆形成能力。对 于克隆形成效率测定，在无饲养层的100mm组织培养皿或T75瓶中种植 100-200个单细胞。细胞在DMEM/10％FCS中维持12天。在倒置光学显微 镜下监控单克隆形成(实验一式两份进行，在图8-2中UCMC-16和UCMC-17 的实验)。连续拍摄显微照片。在第12天，固定集落并用罗丹明染色。观察 到UCMC集落形成单位(图8-2)。观察到的多个大型集落表示CLSC在体外 的自我更新(图8-2)。
Western印迹分析(图9)显示根据本发明分离的来自脐带羊膜的间充质 干细胞(UCMC)和脐带上皮细胞(UCEC)表达编码胚胎干细胞特异性标志 物，转录因子八重体-4(Oct-4)的POU5f1基因(参考Niwa，H.，Miyazaki，J. 和Smith，A.G.(2000).Nat.Genet.24，372-376)(图9-1)。图9.1a和9.1b中显示 的其它结果证实Oct-4在UCMC细胞中的表达。简而言之，在获得图9.1a和 9.1b中示例结果的实验中，UCMC以50个细胞/培养皿的密度种植在100mm 组织培养皿中。然后，将细胞在PTT-4(PTT-4的组成参见实施例12)中维持 10天，直到一些克隆可见。然后，固定克隆并用抗Oct-4抗体孵育(ES细胞 标志物样品试剂盒(货号SCR002)；凯米肯公司(Chemicon)，Temacula，CA)。 一个培养皿(图9-1a中的No.5)作为阴性对照，只用二抗染色。图9.1b显示在 上述PTT-4培养基中生长的染色的UCMC细胞的形态。因此，该分析显示 了这些干细胞的胚胎样特性。这些间充质和上皮细胞还表达成体干细胞自 我更新需要的标志物Bmi-1(参见Park等人，J.Clin.Invest.113，175-179(2004) (图9-27)，和被认为维持干细胞和胚细胞多能性的白血病抑制因子(LIF)(图 9-28)，因此，其被用于分离和扩增人神经干细胞。这些细胞还高度表达其 它生长因子如结缔组织生长因子(CTGF)(图9-6、9-7)、血管内皮生长因子 (VEGF)(图9-10、9-11)、胎盘样生长因子PLGF(图9-4、9-5)、STAT3(图9-2、 9-3)、干细胞因子(SCF)(图9-16)、肝癌衍生生长因子(HDGF)(图9-14、9-15)、 成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)(图9-12、9-13)、血小板衍生生长因子(PDGF) (图9-8、9-9)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(图9-17)、纤连蛋白(图9-18、9-19)、 饰胶蛋白聚糖(图9-20)、黏结蛋白聚糖-1，2，3，4(图9-21至9-26)。在图9中，将 这些基因的表达与人真皮成纤维细胞、骨髓间充质细胞(BMSC)和脂肪衍生 的间充质细胞(ADMC)比较。图9-29显示UCEC和UCMC分泌白血病抑制因 子(LIF)的Western印迹数据。图9-30显示，与骨髓、脂肪衍生的干细胞、 人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞相比，在脐带间充质干细胞和上皮 干细胞培养物的上清液中，通过ELISA测定(图9-30)检测的高度分泌性激活 蛋白A和促滤泡素抑制素(众所周知，这两种蛋白质均促进组织修复和再生、 增强血管发生和维持胚胎干细胞培养，因此各基因的表达是胚胎样特性和 细胞分化能力的标识)。这些结果还表明，本发明的细胞是这些细胞领域治 疗应用的有前景的候选对象，所述细胞领域如再生医学、衰老医学、组织 修复和组织工程。此外，图9-29和9-30显示细胞向培养基中分泌表达产物 的能力。
通过与人骨髓间充质干细胞比较分析分泌的细胞因子和生长因子进一 步表征间充质细胞。将脐带上皮干细胞(UCEC)与人表皮角质形成细胞比较 分析。如下进行该分析：简而言之，将UCMC、UCEC、真皮成纤维细胞、 骨髓间充质细胞、表皮角质形成细胞培养于生长培养基内直至100％汇合 (37℃，5％CO2)，随后在饥饿培养基(无血清DMEM)内同步化48小时。次 日，将培养基再次换成新鲜的无血清DMEM，随后将细胞再培养48小时。 将条件培养基收集、浓缩并使用细胞因子阵列(雷氏生物技术公司 (RayBiotech，Inc)，GA，USA)分析。
该分析结果表明，UCMC分泌白细胞介素-6(IL-6)；(MCP1)；肝细胞 生长因子(HGF)；白细胞介素-8(IL8)；sTNFR1；GRO；TIMP1；TIMP2； TRAILR3；uPAR；ICAM1；IGFBP3；IGFBP6(图11)，而UCEC分泌 IGFBP-4；PARC；EGF；IGFBP-2；IL-6；血管生成素；GCP-2；IL1Rα； MCP-1；RANTES；SCF；TNFβ；HGF；IL8；sTNFR；GRO；GRO-α； 双调蛋白；IL-1R4/ST2；TIMP1；TIMP2；uPAR；VEGF(图12)。
因此，这表明两种细胞类型均分泌在发育生物学、组织稳态、组织修 复和再生以及血管发生中具有重要功能的大量细胞因子和生长因子。这进 一步证实本发明细胞在各个治疗性应用中的多功能性。
此外，使用小鼠畸胎瘤形成测定作为指示进一步检查本发明的细胞的 安全性。在这些实验中使用六只SCID小鼠。将超过2百万个UCMC的悬浮 液以25G无菌针注射至每只SCID小鼠的大腿肌肉内。饲养动物6个月并且 评估肿瘤形成。在这些小鼠中未见肿瘤形成(数据未显示)。这表明本发明 的细胞是安全的并且不具有任何形成良性或其它性质肿瘤的能力。
还分析了UCMC表达人白细胞抗原(HLA)分子的能力。当检测主要组 织相容性复合体(MHC)I型分子时，该分析显示HLA-A分子大量存在(任意 单位的检测结果：3201)，意味着细胞是HLA-A阳性的，而HLA-B分子的 表达不显著(任意单位的检测结果：35)，意味着细胞是HLA-B阴性的。这 些细胞还表达HLA-G(参见实施例19)。由于HLA-B主要对移植的排斥反应 起作用，该结果表示，本发明的细胞不仅适合自体移植，而且适合同种异 体移植。细胞对II型MHC分子HLA-DR52检测阳性，对II型MHC分子 HLA-DRB4检测阴性。还发现存在HLA-DRB1(0301/05/20/22)。
实施例4：在无血清培养基中培养干/祖细胞
在含有10％FCS的DMEM和在无血清培养基PTT-1、PTT-2和PTT-3 中培养UCMC细胞。三种培养基PTT-1、PTT-2和PTT-3由本发明人之一 Phan博士制备。简而言之，这3种培养基不含胎牛血清或人血清，但是含 有不同的细胞因子和生长因子，如IGF、EGF、TGF-β、激活蛋白A、BMP、 PDGF、转铁蛋白和胰岛素。生长因子成分在培养基间是不同的，以便评 估不同生长特征。培养如下进行：在基础培养基内添加不同比例的生长因 子和细胞因子。将UCMC解冻并在这些培养基内培养10天。在光学显微镜 下监控细胞增殖。PTT-2培养基是黑素细胞培养基M154和EpiLife(卡斯卡 德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)按3∶1比例的混合物。 培养基154是无菌的、液体组织培养基，用200μM氯化钙制备，用于普通人 上皮角质形成细胞的生长。培养基154是含有必需和非必需氨基酸、维生素、 其它有机化合物、微量矿物质和无机盐的基础培养基。它不含抗生素、抗 真菌剂、激素、生长因子或蛋白质。它是HEPES和重碳酸盐缓冲的，并在 具有5％CO2/95％空气的大气的培养箱内使用。
图13显示在4种不同培养基组内UCMC良好生长(图13-1至图13-5)，其 中UCMC细胞的形态根据各培养基内存在的细胞因子或生长因子比率或 比例的不同而不同。相反，骨髓和脂肪衍生的间充质细胞在这些无血清培 养基中生长不良(图13-6和图13-7)。因此，UCMC的良好生长显示了本发 明细胞的强壮性和它们的高存活性，表明它们的生长特性优于常规来源的 间充质干细胞如骨髓衍生和脂肪衍生的间充质细胞。就此方面而言，值得 指出的是，在这些实验中使用了无(牛)血清培养基并且大部分人间充质细 胞在无血清培养基中生长不良。由于降低了使用胎牛血清进行细胞培养和 扩充的风险，因此在细胞疗法中使用本发明细胞以及所描述的无血清培养 基技术明显有利(虽然牛血清的使用已经长时间进行并且通常优化了细胞 生长，但因人畜共患病如牛海绵状脑病(疯牛病)的传播对使用它的担心已 经增加)。
实施例5：脐带上皮干细胞和间充质干细胞基因表达谱的特征。
使用DNA微阵列分析脐带(羊膜)上皮干细胞和间充质干细胞的基因表 达谱。为此目的，将UCMC和UCEC在生长培养基中于37℃、5％CO2下 培养直至100％汇合。细胞在基础培养基内同步化48小时，随后用新鲜基础 培养基替换再培养48小时。收获总RNA并传送至Silicon Genetics Microarray Service。使用GeneSpring 7.2进行数据分析。图14汇总了全基 因表达。UCEC表达总共28055个基因并且UCMC表达总共34407个基因。 两种细胞类型中存在27308个重叠的基因表达。表达的747个基因对UCEC 是独特的，并且表达的7099个基因对UCMC是独特的。所选择的目的基因 在图14中列出。
两种干细胞类型表达了进一步支持本发明细胞具有胚胎干细胞样特性 的140个与胚胎干细胞和胚胎发育有关的基因：Nanog；甲胎蛋白；前B细胞 白血病转录因子3；层粘连蛋白α5；癌胚抗原样1；含自水解酶域2；δ样3(果 蝇(Drosophila))；Muscleblind样(果蝇)；GNAS复合基因座；癌胚抗原相 关性细胞粘附分子3；棕榈酰蛋白硫酯酶2；妊娠特异性β-1-糖蛋白2；癌胚 抗原样1；胚胎外胚层发育；母体胚胎亮氨酸拉链激酶；绒膜生长促乳激素 2；叉头盒D3；基部边缘蛋白同系物(radical fringe homolog)(果蝇)；驱动 蛋白家族成员1B；胚胎骨骼肌肌球蛋白重链多肽3；裂手/足畸形(缺指趾) 型3；TEA域家族成员3；层粘连蛋白α1；绒膜生长促乳激素1；胎盘催乳 激素；促肾上腺皮质激素释放激素受体1；促甲状腺素胚胎因子；芳烃受体 核易位蛋白2；膜卷曲相关蛋白(Membrane frizzled-related protein)；神经 调节蛋白1’XVI型胶原α1；神经调节蛋白1；绒膜生长促乳激素1(胎盘催乳 激素)；CUG三重重复序列RNA结合蛋白1；绒膜生长促乳激素1(胎盘催乳 激素)Bystin样；MyoD家族抑制物；视黄酸诱导蛋白2；GNAS复合基因座； 前B细胞白血病转录因子4；层粘连蛋白α2(先天肌肉萎缩分区蛋白)；SMAD， 母体抗DPP同系物1(果蝇)；具有与蛋白质pir：D28928(人类)D28928妊娠特 异性β-1糖蛋白IB流产性(片段)中等相似度的人类(H.sapiens)转录序列；驱 动蛋白家族成员1B；RNA结合蛋白Bruno样4(果蝇)；胚胎脑特异性蛋白质； 妊娠诱导的生长抑制蛋白；SMAD，母体抗DPP同系物5(果蝇)；绒膜生长 促乳激素2；腺苷酸环化酶活化性多肽1(垂体)；癌胚抗原相关性细胞粘附 分子；层粘连蛋α3；蛋白质O-岩藻糖基转移酶1；Jagged 1(阿拉日耶综合 征)；扭曲原肠胚形成同系物1(果蝇)；ELAV(果蝇异常视觉胚胎致死性)样 3(Hu抗原C)；促甲状腺激素胚胎因子；溶质载体家族43成员3；倒位蛋白 (Inversin)；肾消耗病2(婴儿)；胚胎翻转倒位(inversion of embryonic turning)；人类倒位蛋白(INVS)转录物变体2mRNA；人类转录性序列；同 源异型框D8；胚胎Fyn相关性底物；ELAV(果蝇异常视觉胚胎致死性)-样 1(Hu抗原R)；碱性含螺旋-环-螺旋域B族22；催产素受体；畸胎样瘤衍生生 长因子1；Fms相关酪氨酸激酶1(血管内皮生长因子/血管透性因子受体)； 肾上腺髓质素；核受体共激活因子6-CUG三重重复序列RNA结合蛋白1； 扭曲原肠胚形成同系物1(果蝇)；癌胚抗原相关细胞粘附分子4；受体型蛋 白酪氨酸磷酸酶R；Acrg胚胎致死性(小鼠)最小区域直向同源物；EPH受体 A3；δ样1(果蝇)；鼻胚胎LHRH因子；转录因子CP2样1；裂手/足畸形(缺 指趾)型3；Jagged 2；人类转录性序列；神经调节蛋白1；裂手/足畸形(缺 指趾)型1；溶质载体43家族成员3；羟酰辅酶A脱氢酶/3-酮脂酰辅酶A硫解 酶/烯酰辅酶A水合酶(三功能蛋白)α亚基；岩藻糖基转移酶10(α(1，3)岩藻糖 基转移酶)；Acrg胚胎致死性(小鼠)最小区域直向同源物；癌胚抗原相关细 胞粘附分子7；核磷蛋白/核磷蛋白2；IgG Fc片段，受体，转运蛋白，α；扭曲原 肠胚形成同系物1(果蝇)；人类类似于分选液泡蛋白35；母体胚胎 3(LOC146485)mRNA；含自水解酶域2；短尾同系物T(小鼠)；解联蛋白 和金属蛋白酶域10；核糖体蛋白L29；内皮肽转变酶2；ELAV(果蝇异常视 觉胚胎致死性)样1(Hu抗原R)；滋养蛋白；同源异型框B6；层粘连蛋白α4； 同源异型框B6；假定蛋白FLJ13456；含有亮氨酸丰富重复序列和PYD 5 的NACHT；ELAV(果蝇异常视觉胚胎致死性)样1(Hu抗原R)；未分化胚胎 细胞转录因子1；妊娠相关血浆蛋白A，pappalysin 1；分泌珠蛋白1A家族成 员1(子宫珠蛋白)；甲状旁腺素样激素；癌胚抗原相关细胞粘附分子1(胆汁 糖蛋白)；层粘连蛋白α1。
两种干细胞类型还表达了数千个与发育生物学、细胞生长和分化、细 胞稳态、细胞和组织修复及再生有关的基因。此类生因子及其受体的实例 如下：(G-CSF、FGF、IGF、KGF、NGF、VEGF、PIGF、血管生成素、 CTGF、PDGF、HGF、EGF、HDGF、TGF-β、激活蛋白和抑制素、促滤 泡素抑制素、BMP、SCF/c-Kit、LIF、WNT、SDF、制癌蛋白M、白细胞 介素、趋化因子和其它众多)；MMP、TIMP胞外基质(胶原、层粘连蛋白、 纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、整合素、黏结蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、 纤连蛋白、蛋白聚糖、SPARC/骨连接蛋白、黏蛋白、导蛋白、磷脂酰肌醇 蛋白聚糖、软骨结合蛋白、胞外基质蛋白、乙酰透明质酸、纤蛋白、 ADAMTS、双糖链蛋白聚糖、盘基菌蛋白、桥粒成分、ICAM、钙黏着蛋 白、联蛋白和众多其它)；细胞角蛋白。
有些组基因仅在UCMC中出现。这些基因与如下相关：正常生理过程 (胰岛素样生长因子1(生长调节素C)；胰岛素样4(胎盘)；松弛素1；纤维蛋 白溶酶原；胰岛素样生长因子1(生长调节素C)；胰岛素样5；胰岛素样生长 因子1(生长调节素C)；胰岛素样生长因子2(生长调节素A))、体内稳态(放射 辐头样1；血色素沉着病；趋化因子(C-C基序)配体5；白细胞介素31受体A； 趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1)；核受体3亚家族C组成 员2；血色素沉着病；趋化因子(C-C基序)配体23；趋化因子(C-C基序)配体 23；线粒体铁蛋白；过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1-α；表面活 性剂肺泡相关性蛋白D；趋化因子(C-C基序)配体11；趋化因子(C-C基序) 配体3；EgI九同系物2(线虫(C.elegans))；过氧化物酶体增殖活化受体γ共 激活因子1-β；趋化因子(C-C基序)配体1；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基 质细胞细胞衍生因子1)；Na+/K+转运ATP酶α2(+)多肽；趋化因子(C基序) 配体2；血红素结合蛋白；兰诺定受体3)、形态发生(红细胞α血影蛋白1(椭 圆红细胞增多症2)；同源异型框D3；缺眼同系物1(果蝇)；Ras同系物基因 家族成员J；白细胞特异性转录物1；外胚层发育异常蛋白A2受体；磷脂酰 肌醇蛋白聚糖3；成对盒基因7；丝氨酸蛋白酶Corin；Dishevelled，dsh同 系物1(果蝇)；Ras同系物基因家族成员J；T盒3(尺骨乳房综合征)；软骨素 β1，4N-乙酰半胺转移酶乳糖；软骨素β1，4N-乙酰半胺转移酶乳糖；SRY(性 别决定区域Y)盒10；非肌肉肌球蛋白重链多肽9；黄体生成素/绒毛膜促性 腺激素受体；基部边缘蛋白同系物(果蝇)；分泌的卷曲相关蛋白5；无翼型 MMTV整合位点家族成员11；缺眼同系物2(果蝇)；Muscleblind样(果蝇)； T盒5；Mab-21样1(线虫)；生长停滞特异性2；Sex comb on midleg同系物 1(果蝇)；T盒6；细丝蛋白结合LIM蛋白-1；黑素瘤细胞粘附分子；Twist 同系物1(尖头多指(趾)并指(趾)3；塞-乔综合征)(果蝇)；同源异型框A11； 角膜蛋白聚糖；成纤维细胞生长因子1(酸性)；羧肽酶M；CDC42效应蛋白 (Rho GTP酶结合)4；LIM同源框转录因子1-β；Engrailed同系物1；羧肽 酶M；成纤维细胞生长因子8(雄激素诱导)；成纤维细胞生长因子18；白细 胞特异性转录物1；内皮缩血管肽3；配对样同源域转录因子1)、胚胎发育(妊 娠特异性β-1-糖蛋白3；ELAV(果蝇异常视觉胚胎致死性)样4(Hu抗原D)；G 蛋白偶联受体10；外胚层发育异常蛋白A2受体；ATP结合盒B亚家族 (MDR/TAP)成员4；妊娠特异性β-1-糖蛋白11；鼻胚胎LHRH因子；松弛素 1；Notch同系物4(果蝇)；妊娠特异性β-1-糖蛋白6；pih-2P；人类妊娠诱 导高血压综合征相关蛋白(PIH2)；120kDa输卵管糖蛋白1(黏蛋白9、输卵管 素)；孕激素相关子宫内膜蛋白；碱性肌球蛋白轻链多肽4；atrial，胚胎； 促乳素；Notch同系物4(果蝇)；前B细胞白血病转录因子1；基部边缘蛋白 同系物(果蝇)；促肾上腺皮质激素释放激素；核受体3亚家族C组成员2；神 经调节蛋白2；Muscleblind样(果蝇)；碱性肌球蛋白轻链多肽4；atrial，胚 胎；人类cDNA FLJ27401fis，克隆WMC03071；胚胎外精子发生同源框1 样；胰岛素样4(胎盘)；含有2个可变剪接位点C1和C2的3’非翻译区的外显 子B2C的人类已加工假孕特异性糖蛋白(PSG12)基因；Fms相关酪氨酸激酶 1(血管内皮生长因子/血管通透性因子受体)；前B细胞白血病转录因子1； 妊娠特异性β-1-糖蛋白3；癌胚抗原相关细胞粘附分子1(胆汁糖蛋白)；芳基 硫酸酯酶C类固醇硫酸酯酶(微粒体)同工酶S；同源异型框B6；蛋白质O- 岩藻糖基转移酶1；LIM同源框转录因子1-β；癌胚抗原相关细胞粘附分子 1(胆汁糖蛋白)；促卵泡激素β多肽；血管紧张素原(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋 白酶抑制物A进化枝(α-1抗蛋白酶、抗胰蛋白酶)成员8)；癌胚抗原相关细 胞粘附分子6(非特异性交叉反应抗原)；蛋白激酶C，α结合蛋白；胶原凝素 亚家族成员10(C型凝集素)；层粘连蛋白α1)、细胞外空间(羧酸酯酶1(单核 细胞/巨噬细胞丝氨酸酯酶1)；成纤维细胞生长因子5；Progastricsin(胃蛋白 酶原C)；精子相关抗原11；前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin2型；乙 酰透明质酸结合蛋白2；Sema结构域，免疫球蛋白结构域(Ig)，短碱性结构 域分泌型(脑信号蛋白)3F；白细胞介素2；胰凝乳蛋白酶样；Norrie病(假神 经胶质瘤)；气管支气管/胃黏蛋白5亚型A和C；羧肽酶B2(血浆羧肽酶U)； 基部边缘蛋白同系物(果蝇)；妊娠特异性β-1-糖蛋白11；跨膜肽酶A-α(PABA 肽水解酶)；速激肽前体1(K物质、P物质、神经激肽1、神经激肽2、神经 调节肽L、神经激肽α、神经肽K、神经肽γ)；成纤维细胞生长因子8(雄 激素诱导)；成纤维细胞生长因子13；血红素结合蛋白；乳癌2，早期发生； 成纤维细胞生长因子14；(青少年X连锁性)视网膜劈裂症1；几丁质酶3样 1(软骨糖蛋白-39)；Dystonin；分泌珠蛋白1D家族成员2；成头蛋白；WAP 四个二硫键核心结构域2；CD5抗原样(清除受体半胱氨酸丰富家族)；瘙 痒病响应蛋白1；半胱氨酸结超家族Gremlin 1同系物(爪蟾(Xenopus laevis))；白细胞介素16(淋巴细胞化学引诱物因子)；趋化因子(C-C基序)配 体26；核结合蛋白1；成纤维细胞生长因子18；胰岛素样生长因子结合蛋白 1；表面活性剂肺泡相关性蛋白A1；δ样1同系物(果蝇)；可卡因和苯丙胺调 节的转录物；跨膜肽酶A-β；白细胞介素17F；补体因子H；半胱氨酸丰富 分泌性蛋白2；Dystonin；WAP四-二硫键核心结构域1；促乳素；表面活 性剂肺泡相关性蛋白B；成纤维细胞生长因子5；Dickkopf同系物2(爪蟾)； 精子相关抗原11；趋化因子(C-C基序)配体11；跨膜肽酶A-α(PABA肽水解 酶)；几丁质酶3样2；C-fos诱导的生长因子(血管内皮生长因子D)；趋化因 子(C-C基序)配体4；脊髓灰质炎病毒受体；透明质酸酶1；120kDa输卵管 糖蛋白1(黏蛋白9、输卵管素)；趋化因子(C-X-C基序)配体9；分泌的卷曲 相关蛋白质5；珐琅蛋白(X连锁性釉质生长不全1)；松弛素1；Sparc/骨连 接蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；趋化因子(C-C基 序)配体26；成纤维细胞生长因子1(酸性)；血管生成素样2；Fms相关酪氨 酸激酶1(血管内皮生长因子/血管通透性因子受体)；Dystonin；胰岛素样 4(胎盘)；钴胺传递蛋白II；大红细胞性贫血；趋化因子(C-C基序)配体1； 胰岛素样生长因子结合蛋白的酸不稳定亚基；补体因子H；妊娠特异性β-1- 糖蛋白6；Silver同系物(小鼠)；蛋白聚糖4；成纤维细胞生长因子16；细胞 因子样蛋白质C17；颗粒溶素；血管生成素2；嗜铬粒蛋白B(分泌粒蛋白 1)；Sema结构域，免疫球蛋白结构域(Ig)和GPI膜锚形体(脑信号蛋白)7A； 多效营养因子(肝素结合生长因子8，神经突生长促进因子1)；钙离子活化性 氯离子通道家族成员3；分泌珠蛋白1D家族成员1；纤蛋白1；180kDa磷脂 酶A2受体1)以及细胞外基质(ADAMTS样1；成骨细胞特异性因子Periostin； 磷脂酰肌醇蛋白聚糖5；神经元亮氨酸丰富重复序列3；转谷胺酰胺酶2(C 多肽、蛋白质-谷胺酰胺-γ-谷胺酰转移酶)；具有血小板反应蛋白1型基序的 解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)2；微原纤维相关蛋白质4；磷脂酰 肌醇蛋白聚糖3；V型胶原α3；金属蛋白酶2组织抑制物；角膜蛋白聚糖； 软骨寡聚基质蛋白；腔蛋白聚糖；乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白3；富 酪蛋白Statherin；具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶 (reprolysin型)3；胞外基质蛋白Spondin 1；几丁质酶3样1(软骨糖蛋白-39)； IV型胶原α3(肺出血-肾炎抗原)；无翼型MMTV整合位点家族成员7B；VI 型胶原α2；脂笼蛋白7；乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白4；具有血小板 反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)5(聚集蛋白聚 糖酶-2)；纤连蛋白1；软骨基质蛋白胞外基质蛋白1；假定蛋白FLJ13710； 软骨素β1，4N-乙酰半胺转移酶乳糖；基质金属蛋白酶16(膜插入性)；冯.维 勒布兰德因子；VI型胶原α2；跨膜丝氨酸蛋白酶6；基质金属蛋白酶23B； 基质金属蛋白酶14(膜插入性)；神经元亮氨酸丰富重复序列3；SPARC样 1(mast9，hevin)；Sparc/骨连接蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸 蛋白聚糖)3；皮肤桥蛋白；XIV型胶原α1(粗纤维调节素)；Y连锁的珐琅蛋 白；巢蛋白(内动蛋白)；ADAMTS样2；乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白 2；XV型胶原α1；磷脂酰肌醇蛋白聚糖6；基质金属蛋白酶12(巨噬细胞弹 性蛋白酶)；珐琅蛋白(釉X连锁性质生长不全1)；具有血小板反应蛋白1型 基序的解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)15；跨膜丝氨酸蛋白酶6；具 有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)16； Sparc/骨连接蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)；具有 血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)20；XI型 胶原α1；乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；软骨素β1，4N-乙酰半胺转 移酶乳糖；Asporin(LRR族1)；I型胶原α1(常染色体显性IV型埃-当综合 征)；分泌型磷蛋白1(骨桥蛋白，骨涎蛋白I，早期T-淋巴细胞活化1)；基质 GIa蛋白质；纤蛋白5；XIV型胶原α1(粗纤维调节素)；金属蛋白酶3组织 抑制物(假炎性索斯比眼底营养障碍)；XXV型胶原α1；软骨寡聚基质蛋白； VI型胶原α1；软骨粘附素；XV型胶原α1；具有血小板反应蛋白1型基序的 解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)16；IV型胶原α4；齿质基质酸性磷 蛋白；IV型胶原α1；含血小板反应蛋白重复序列1；基质金属蛋白酶16(膜 插入性)；I型胶原α2；纤蛋白1；覆膜蛋白β；糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂 酶D1；结肠直肠癌基因1中上调)、细胞骨架：(细丝蛋白B，β(肌动蛋白结合 蛋白278)；EF手型蛋白中心粒蛋白1；含FERM结构域3；Bridging integrator 3；Parvin，γ；Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)11；酪氨酸激酶2；Kelch 样蛋白4(果蝇)；红细胞血影蛋白β(包括临床I型球形红细胞增多症)； Arg/Abl相互作用蛋白ArgBP2；Advillin；核膜含血影蛋白重复序列1；联 蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白质)δ1；红细胞膜蛋白质带4.1样蛋白5；联蛋白(钙 黏着蛋白结合性蛋白)α2；趋化因子(C-C基序)配体3；γ-肌聚糖(35kDa肌营 养蛋白结合性糖蛋白)；伴肌动蛋白；成神经细胞瘤细胞内鉴定的β-胸腺素； 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1；维-奥综合征蛋白相互作用蛋白；Dystonin； 亨廷顿蛋白相互作用蛋白1；KIAA0316基因产物；原肌球调节蛋白4(肌 肉)；肝癌中缺失蛋白1；绒毛蛋白样蛋白；肌养蛋白结合蛋白，β1(59kDa 肌养蛋白结合蛋白A1的碱性成分1)；cGMP依赖性I型蛋白激酶；人类类 似于角蛋白8；细胞角蛋白8；细胞骨架II型角蛋白8(LOC345751)，mRNA； 内收蛋白1(α)；神经元内蛋白激酶C和酪蛋白激酶底物3；Dystonin；KeII 血型；细丝蛋白A相互作用蛋白1；生长停滞特异性2；；染色体1可读框1； Stathmin样蛋白2；红细胞α血影蛋白1(椭圆红细胞增多症2)；FKSG44基因； 驱动蛋白家族成员1C；张力蛋白；Kaptin(肌动蛋白结合蛋白)；神经纤维 瘤蛋白2(双侧听神经瘤)；血小板白细胞C激酶底物同系结构域、Sec7结构 域和卷曲螺旋结构域2(cytohesin-2)；肌动蛋白相关蛋白质T1；维-奥综合征 样蛋白；Kelch样蛋白4(果蝇)；Fascin同系物1，肌动蛋白成束蛋白(紫色海 胆(Strongylocentrotus purpuratus))；双载蛋白(具有128kDa乳癌自体抗原 的僵人综合征)；多囊肾病2样蛋白1；神经元锚蛋白2；CDC42结合蛋白激 酶α(DMPK样)；假定蛋白FLJ36144；Arg/Abl-相互作用蛋白ArgBP2；成 蛋白样3；88kDa β1-联蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白)；肌动蛋白抑制蛋白2； 突触足蛋白2样蛋白；肌养蛋白结合蛋白γ2；磷脂酶D2；吞没和细胞游动 性2(线虫ced-12同系物)；68kDa神经丝轻链多肽；Dystonin；肌动蛋白样7B； 驱动蛋白家族成员1C；PDZ和LIM结构域3；内收蛋白2(β)；obscurin、 细胞骨架钙调蛋白和肌联蛋白相互作用RhoGEF；β多肽旁系同源物微管 蛋白；细丝蛋白A相互作用蛋白1；踝蛋白1；人类类似于[片段1of 2] Piccolo蛋白(Aczonin)(LOC375597)；CDC42效应蛋白(Rho GTP酶结 合)4；黏结蛋白聚糖1；α-细丝蛋白A(肌动蛋白结合蛋白280)；肌动蛋白抑 制蛋白2；含张力蛋白样C1结构域的磷酸酶；假定蛋白MGC33407；Rho 家族GTP酶1；黄蛋白氧化还原酶MICAL2；Ca2+依赖性分泌作用激活蛋白； Rab亲和蛋白3A样(无C2结构域)；肌球蛋白XVA；cGMP依赖性I型蛋白 激酶；肌球蛋白调节性轻链相互作用蛋白；驱动蛋白家族成员13B；肌肉 RAS癌基因同系物；非红细胞性β-血影蛋白1；TAO激酶2；β-细丝蛋白B(肌 动蛋白结合蛋白278)；神经纤维瘤蛋白2(双侧听神经瘤)；联蛋白α3(钙黏着 蛋白相关蛋白质)；obscurin，细胞骨架钙调蛋白和肌联蛋白相互作用 RhoGEF；肌动蛋白结合蛋白冠蛋白1A；红细胞膜蛋白带4.1样1；非红细 胞性β-血影蛋白4；Y连锁的β4-胸腺素；(睾丸)Tektin 2；Ras同系物基因家 族成员J；具有DbI和血小板白细胞C激酶底物同系结构域的丝氨酸/苏氨酸 激酶；β-小肌营养蛋白；肠平滑肌γ2-肌动蛋白；Tara样蛋白；胱天蛋白酶 8，凋亡相关半胱氨酸蛋白酶；含Kelch重复序列和BTB(POZ)结构域10；跨 膜黏蛋白1；微管相关蛋白tau；张力蛋白；(丝足内)Ras同系物基因家族成 员F；内收蛋白1(α)；α4-辅肌动蛋白；红细胞膜蛋白带4.1(RH连锁的椭圆 红细胞增多症1)；双尾D同系物2(果蝇)；朗维耶结锚蛋白3(锚蛋白G)；肌 球蛋白VIIA((严重常染色体隐性)厄舍综合征1B)；α2联蛋白(钙黏着蛋白相 关蛋白)；人类类似于角蛋白8，II型细胞骨架-人(LOC285233)；睾丸肌动蛋 白成束蛋白Fascin同系物3；Ras同系物基因家族成员J；晶蛋白串珠丝状结 构蛋白质2；结蛋白；肌球蛋白X；信号诱导增殖相关基因1；肌切蛋白； Coactosin样1(网柱菌属(Dictyostelium))；吞没和细胞游动性2(线虫ced-12 同系物)；β4-微管蛋白；Ca2+依赖的分泌作用激活蛋白；含FERM结构域 4A；骨骼肌α1-肌动蛋白踝蛋白1；钙调蛋白结合蛋白1；细丝蛋白结合LIM 蛋白-1；微管相关蛋白tau；肌养蛋白结合蛋白α1(59kDa酸性成分肌养蛋白 结合蛋白A1)；内收蛋白2(β)；细丝蛋白A相互作用蛋白1；PDZ和LIM结 构域3；红细胞膜蛋白带4.1样4B；FYN结合蛋白(FYB-120/130)；桥接 整合蛋白3)、细胞外：(具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋 白酶(reprolysin型)20；SPARC样1(mast9、hevin)；丝氨酸(或半胱氨酸)蛋 白酶抑制物进化枝G(C1抑制蛋白)成员1(遗传性血管性水肿)；Urocortin； 胰凝乳蛋白酶样；血小板衍生生长因子β多肽(猴肉瘤病毒(v-sis)癌基因同系 物)；结合BMP的内皮调节物前体蛋白质；补体因子H；绒膜生长促乳激素 样1；(肺泡和活化调节的)趋化因子(C-C基序)配体18；纤连蛋白1；妊娠特 异性β-1-糖蛋白3；具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白 酶(reprolysin型)3；CocoaCrisp；胰岛素样4(胎盘)；无翼型MMTV整合位 点家族成员11；软骨寡聚基质蛋白；跨膜丝氨酸蛋白酶6；C-fos诱导的生 长因子(血管内皮生长因子D)；(附睾)具有12序列相似性的家族成员B；亲 棘蛋白调节性亚基9B蛋白磷酸酶1；钴胺传递蛋白II；大红细胞性贫血；凝 血因子V(前加速因子，易变因子)；磷脂酶A2，MD组；α肿瘤坏死因子诱导 的蛋白质6；XV型胶原α1；乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白3；XIV型胶 原α1(粗纤维调节素)；白细胞介素19；蛋白酶抑制物15；烟碱胆碱能受体β 多肽1(肌肉)；赖氨酰氧化酶样3；胰岛素样生长因子结合蛋白5；生长激素 1；酪蛋白β；NEL样2(鸡)；I因子(补体)；趋化因子(C-C基序)配体23；α2- 干扰素；基质金属蛋白酶16(膜插入性)；基质金属蛋白酶12(巨噬细胞弹性 蛋白酶)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖5；妊娠特异性β-1-糖蛋白3；成纤维细胞生 长因子6；半胱氨酸结超家族Gremlin 1同系物(爪蟾)；蛋白质S(α)；软骨素 β1，4N-乙酰半胺转移酶乳糖；糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1；成纤维 细胞生长因子1(酸性)；胞外基质蛋白Spondin 1；骨形态发生蛋白1；肺泡 表面活性剂相关蛋白B；牙质基质酸性磷蛋白；脂蛋白蛋白质Lp(a)；跨膜 黏蛋白1；甘露聚糖结合性凝集素丝氨酸蛋白酶1(Ra反应性因子的C4/C2 活化成分)；β-跨膜肽酶A；分泌珠蛋白1D家族成员1；Asporin(LRR类1)； 趋化因子(C-C基序)配体25；细胞因子样蛋白质C17；胰岛素样5；α-跨膜肽 酶A(PABA肽水解酶)；瘙痒病反应性蛋白1；成纤维细胞生长因子18；趋 化因子(C-X-C基序)配体9；βB-抑制素(激活蛋白ABβ多肽)；(雄激素诱导的) 成纤维细胞生长因子8；颗粒溶素；可卡因和苯丙胺调节的转录物；I型胶 原α2；趋化因子(C-C基序)配体17；趋化因子(C-C基序)配体23；Sparc/骨 连接蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)3；γ-氨基丁酸 (GABA)A受体β3；皮质稳定素α4-防卫素；神经元亮氨酸丰富重复序列3； 磷脂酰肌醇蛋白聚糖6；丝裂原活化的蛋白激酶激酶2；凝血因子XI(血浆 凝血激酶前质)；趋化因子(C-C基序)配体5；Dystonin；卷曲相关蛋白；凝 血因子XIII-A1多肽；胰岛素样生长因子1(生长调节素C)；假定蛋白 MGC45438；精子相关抗原11；胰岛素样生长因子1(生长调节素C)；成骨 细胞特异性因子Periostin；A-2-巨球蛋白；γ-氨基丁酸(GABA)A受体α5； 丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物分支体A(α-1抗蛋白酶、抗胰蛋白酶)成员 3；Silver同系物(小鼠)；卷曲相关蛋白；软骨粘附素；软骨素β1，4N-乙酰 半胺转移酶乳糖；5-羟色胺(血清素)受体3，家族成员C；VI型胶原α2；Toll 样受体9；Y连锁的珐琅蛋白；血管内皮生长因子B；辐条状头样1(Radial spokehead-like 1)；Fms相关酪氨酸激酶1(血管内皮生长因子/血管通透性因 子受体)；蛋白酶抑制物16；白细胞介素2；簇蛋白(补体裂解抑制因子、 SP-40，40、硫酸化糖蛋白2、睾酮抑制性前列腺信息2、ApoJ)；促卵泡激素 β多肽；具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶 (reprolysin型)16；溶菌酶(肾淀粉样变)；基部边缘蛋白同系物(果蝇)；胰岛 素样生长因子结合蛋白5；Taxilin；载脂蛋白A-V；血小板衍生生长因子C； 趋化因子(C-C基序)配体3样1；成纤维细胞生长因子16；VI型胶原α2；丝氨 酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物分支体C(抗凝血酶)成员1；趋化因子(C-C基 序)配体11；IV型胶原α4；布鲁顿无丙种球蛋白白血症酪氨酸激酶；胰岛素 样生长因子2(生长调节素A)；Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制物结构域1；纤维 蛋白原Aα多肽；趋化因子(C-C基序)配体1；抑制素βE；性激素结合珠蛋 白；IV型胶原α1；卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶；半胱氨酸丰富分泌性蛋白2； 乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1；利尿钠肽前体C；RNA酶A家族核酸 酶k6；成纤维细胞生长因子14；ADAMTS样2；IV型胶原α3(古德帕斯丘抗 原)；血管生成素2；载脂蛋白L-3；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞 细胞衍生因子1)；乙酰透明质酸结合蛋白2；凝血因子VII(血清凝血酶原转 变加速因子)；XIV型胶原α1(粗纤维调节素)；120kDa输卵管糖蛋白1(黏蛋 白9、输卵管素)；软骨基质蛋白胞外基质蛋白1，；气管支持管/胃黏蛋白5 亚型A和C；肿瘤坏死因子受体超家族成员11b(护骨蛋白)；转谷胺酰胺酶 2(C多肽、蛋白质-谷胺酰胺-γ-谷胺酰转移酶)；角膜蛋白聚糖；V型胶原α3； WAP四-二硫键核心结构域2；趋化因子(C-X3-C基序)配体1；丝氨酸(或半 胱氨酸)蛋白酶抑制物分支体D(肝素辅因子)成员1；分泌性蛋白 LOC348174；凝血因子X；白细胞介素16(淋巴细胞化学引诱物因子)；胰脂 酶相关蛋白2；HtrA丝氨酸肽酶3；甘氨酸受体α3；CD5抗原样(清除受 体半胱氨酸丰富家族)；假定蛋白MGC39497；凝血因子VIII，前凝血剂成 分(血友病A)；皮肤桥蛋白；成头蛋白；分泌型含LY6/PLAUR结构域1； ADAMTS样1；A-1-B糖蛋白；染色体20可读框175；无翼型MMTV整 合位点家族成员8B；纤蛋白1；纤蛋白5；组织蛋白酶S；巢蛋白(内动素)； 趋化因子(C-C基序)配体26；内皮细胞特异性分子1；几丁质酶3样1(软骨 糖蛋白-39)；γ-氨基丁酸(GABA)A受体β1；分泌珠蛋白1D家族成员2；甘露 聚糖结合性凝集素丝氨酸蛋白酶1(Ra反应性因子的C4/C2活化成分)； ADAMTS样1；Sema结构域，免疫球蛋白结构域(Ig)和GPI膜锚形体，(脑信 号蛋白)7A；具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶 (reprolysin型)15；2型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin；胰岛素样生长 因子1(生长调节素C)；视网膜劈裂症(青少年X连锁性)1；具有血小板反应 蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin型)16；趋化因子(C基序) 配体2；成纤维细胞生长因子5；精子相关抗原11；微原纤维相关蛋白4； 脊髓灰质炎病毒受体；胞外信号调节性激酶8；跨膜丝氨酸蛋白酶6；蛋白 激酶C，α；几丁质酶3样2；白细胞介素9；载脂蛋白L-6；表面活性剂肺泡 相关性蛋白A1；VI型胶原α1；载脂蛋白L-6；假定蛋白FLJ 13710；羧肽酶 B2(血浆羧肽酶U)；杀菌性/通透性提高蛋白样2；成纤维细胞生长因子5； 分泌型磷蛋白1(骨桥蛋白、骨涎蛋白I、早期T-淋巴细胞活化1)；HtrA丝 氨酸肽酶3；肝癌内缺失1；内皮细胞特异性分子1；冯.维勒布兰德因子； 具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白样和金属蛋白酶(reprolysin 型)5(聚集蛋白聚糖酶-2)；Sema结构域，免疫球蛋白结构域(Ig)，短碱性结 构域分泌型(脑信号蛋白)3A；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞细胞 衍生因子1)；富酪蛋白；胞外信号调节性激酶8；金属蛋白酶3组织抑制物(假 炎性索斯比眼底营养障碍)；血小板因子4(趋化因子(C-X-C基序)配体4)；表 面活性剂肺泡相关性蛋白D；补体因子H；δ样1同系物(果蝇)；WAP四-二 硫键核心结构域1；胰岛素样生长因子结合蛋白，酸不稳定亚基；早期发 生乳癌2；前B淋巴细胞基因1；促肾上腺皮质激素释放激素；假定蛋白 DKFZp434B044；促乳素诱导性蛋白；RAS脒基释放蛋白4； Progastricsin(胃蛋白酶原C)；Sema结构域，免疫球蛋白结构域(Ig)，短碱 性结构域分泌型(脑信号蛋白)3F；结肠直肠癌基因内上调1；蛋白聚糖4； 烟碱胆碱能受体δ多肽；软骨寡聚基质蛋白；ABO血型(转移酶A、α1-3-N- 乙酰半胺转移酶乳糖；转移酶B、α1-3-半乳糖基转移酶)；白细胞介素 12A(天然杀伤细胞刺激性因子1、毒性淋巴细胞成熟因子1、p35)；成纤维 细胞生长因子7(角质形成细胞生长因子)；IRRE样3同胞(果蝇)；(神经元) 烟碱胆碱能受体α多肽2；血小板、肺和鼻上皮癌相关；XV型胶原α1；多效 营养因子(肝素结合性生长因子8、神经突生长促进性因子1)；血管生成素 样2；诺里夫病(假神经胶质瘤)；趋化因子(C-C基序)配体3；几丁质酶3样 1(软骨糖蛋白-39)；α(珠蛋白)间抑制物H3；珐琅蛋白(釉质生长不全1，X连 锁性)；表皮生长因子(β-尿抑胃素)；成纤维细胞生长因子13；无翼型MMTV 整合位点家族成员7B；烟碱胆碱能受体γ多肽；妊娠特异性β-1-糖蛋白6； 基质金属蛋白酶14(膜插入性)；趋化因子(C-C基序)配体26；α6干扰素； 速激肽前体1(K物质、P物质、神经激肽1、神经激肽2、神经调节肽L、 神经激肽α、神经肽K、神经肽γ)；分泌的卷曲相关蛋白质5；乙酰透明质 酸和蛋白聚糖连接蛋白4；补体成分4B；基质金属蛋白酶16(膜插入性)； 成纤维细胞生长因子7(角质形成细胞生长因子)；载脂蛋白C-II；钙活化的 氯离子通道家族成员3；四联蛋白(纤维蛋白溶酶原结合蛋白)；III型胶原 α1(常染色体显性IV型埃-当综合征)；KIAA0556蛋白质；趋化因子(C-C基 序)配体4；血红素结合蛋白；α(珠蛋白)间抑制物H1；松弛素1；基质GIa 蛋白；具有I型血小板反应蛋白基序的解联蛋白样和金属蛋白酶 (reprolysin型)2；干扰素(α、β和ω)受体2；前列腺酸性磷酸酶；鸟嘌呤核苷 酸结合蛋白(G蛋白)γ8；基质金属蛋白酶23B；α-跨膜肽酶A(PABA肽水解 酶)；透明质酸酶1；血管紧张素原(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制物分支 体A(α-1抗蛋白酶、抗胰蛋白酶)成员8)；软骨中间层蛋白核苷酸焦磷酸水 解酶；配体门控型离子通道嘌呤能受体P2X-7；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；覆 膜蛋白β；α5干扰素；脂笼蛋白7；血小板因子4变体1；核结合蛋白1；XI型 胶原α1；肠抑胃肽；含血小板反应蛋白重复序列1；5-羟色胺(血清素)受体3 家族成员D；XXV型胶原α1；生长分化因子9；假定蛋白DKFZp434B044； 内皮缩血管肽3；趋化因子(C基序)配体2；Prokineticin2；肿瘤坏死因子受 体超家族成员11b(护骨蛋白)；组织抑制物of金属蛋白酶2；Dystonin； 嗜铬粒蛋白B(分泌粒蛋白1)；乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白2；神经元 亮氨酸丰富重复序列3；腔蛋白聚糖；胞外基质蛋白1，软骨基质蛋白；磷 脂酶A2IIA组(血小板、滑液)；羧酸酯酶1(单核细胞/巨噬细胞丝氨酸酯酶 1)；Sparc/骨连接蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白聚糖(睾丸蛋白聚糖)； Dickkopf同系物2(爪蟾)；γ-氨基丁酸(GABA)A受体-α3；妊娠特异性β-1- 糖蛋白11；胰岛素样生长因子结合蛋白1；防卫素β106；白细胞介素17F； 配体门控型离子通道亚基；180kDa磷脂酶A2受体1；I因子(补体)； Dystonin；LAG1长寿保障同系物1(酿酒酵母(S.cerevisiae))；促乳素；睾丸 表达型序列264；Sema结构域，免疫球蛋白结构域(Ig)，短碱性结构域分泌 型(脑信号蛋白)3D；分泌的卷曲相关蛋白质2；分泌的卷曲相关蛋白质4)。
有些组基因仅在UCEC中出现。这些基因与如下有关：体内稳态(清蛋 白；钙传感受体；Aquaporin 9；乳运铁铁蛋白)、形态发生(同源异型框HB9； 上皮V样抗原1)、胚胎发育(松弛素2；癌胚抗原相关细胞粘附分子8；吲哚 胺-吡咯2，3双加氧酶；EPH受体A3；促甲状腺激素胚胎因子；妊娠特异性β-1- 糖蛋白1；α3-层粘连蛋白，)、细胞外空间(表面活性剂肺泡相关性蛋白A1； 妊娠特异性β-1-糖蛋白1；乳运铁铁蛋白；TGF-α；清蛋白；FGF-23；S100 钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B))、细胞外基质(层粘连蛋白β4；层粘连蛋白α3； 透明带糖蛋白4)、结构分子活性(染色体21可读框29；层粘连蛋白α3；微管 相关蛋白2；层粘连蛋白β4；角蛋白6B；Ladinin 1；角蛋白6A；闭合蛋白； 兜甲蛋白；红细胞膜蛋白带4.1(RH连锁椭圆红细胞增多症1)；晶体蛋白 βA2；眼晶状体结构蛋白；接触蛋白相关蛋白样4；密蛋白19；假定蛋白 LOC144501；角蛋白6E；角蛋白6L；晶状体固有膜蛋白2，19kDa)、细胞 骨架(微管相关蛋白2；红细胞膜蛋白带4.1样5；人类毛透明蛋白(THH)； 角蛋白6B；角蛋白6A；上皮的V样抗原1；Hook同系物1(果蝇)；兜甲蛋 白；红细胞膜蛋白带4.1(RH连锁椭圆红细胞增多症1)；原肌球调节蛋白1； MAP/微管亲和力调节激酶1；角蛋白6E；肌动蛋白结合LIM蛋白质家族 成员2)、细胞粘附分子(2型钙黏着蛋白19；髓性/淋巴性或混合系白血病； 染色体21可读框29；IRRE样2同胞(Kin)；层粘连蛋白α3；唾酸黏附素； CD84抗原(白细胞抗原)；可溶性半乳糖苷结合性凝集素(半凝集素2)；上 皮V样抗原1；CD96抗原；肾小管间质性肾炎抗原；癌胚抗原相关细胞粘 附分子8；IL-18；免疫球蛋白超家族成员1；整合素β8；鸟氨酸氨基甲酰 基Ornithine arbamoyl转移酶；整合素β6；接触蛋白相关蛋白样4；XVII 型胶原α1；钙黏着蛋白样26；黏蛋白和钙黏着蛋白样)、细胞分化蛋白(受 体型蛋白酪氨酸磷酸酶Z多肽1；α3-层粘连蛋白；CD84抗原(白细胞抗原)； EDRF2；人类红细胞系分化相关因子2；肿瘤蛋白p73样；NB4凋亡/分化 相关蛋白；人类PNAS-133；Similar to seven in absentia 2；白细胞介素24； 角蛋白6B；角蛋白6A；脱氢酶/还原酶(SDR家族)成员9；间隙连接蛋白 β5(连接蛋白31.1)；Iroquois同源框蛋白质4；腹前同源框2；趋化因子 (C-X-C基序)配体10；肿瘤坏死因子受体超家族成员17；电压依赖性钙离子 通道β2亚基；帕金森病(青少年常染色体隐性)2帕金蛋白；(角质层胰凝乳蛋 白酶性)激肽释放酶7；神经胶质细胞缺失同系物2；AP-2α；受体型蛋白酪 氨酸磷酸酶Z多肽1；肌钙蛋白T1；Sciellin；葡萄糖胺基(N乙酰基)转移酶 2，1-分支酶；XVII型胶原α1；细胞因子信号阻遏物2；Distal-less同源异型 框1；合子停滞1；白细胞介素20；生长分化因子3；FGF-23；无翼型MMTV 整合位点家族成员8A)、细胞外：(染色体21可读框29；层粘连蛋白α3；层 粘连蛋白β4；白细胞介素24；妊娠特异性β-1-糖蛋白1；趋化因子(C-X-C 基序)配体11；表面活性剂肺泡相关性蛋白A1；Prepronociceptin；5-羟色 胺(血清素)受体3B；癌胚抗原相关细胞粘附分子8；趋化因子(C-X-C基序) 配体10；IL-18(干扰素γ诱导因子)；乳运蛋白；清蛋白；Fas配体(TNF超家 族成员6)；烟碱胆碱能受体β肽4；Cathelicidin抗菌肽；呼吸道胰蛋白酶样 蛋白酶；S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)；TGF-α；激肽释放酶10；Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制物1；WNT1诱导性信号途径蛋白3；松弛素2；κ-干 扰素；防卫素β103A；IL-20；透明带糖蛋白4；生长分化因子3；FGF-23； 无翼型MMTV整合位点家族成员8A；补体因子H相关5)、发育蛋白质(EPH 受体A3；NIMA(有丝分裂基因a中从不存在的)相关激酶2；锌指蛋白282； TANK-结合激酶1；MRE11减数分裂重组11同系物A；E2F转录因子2； 受体型蛋白酪氨酸磷酸酶Z多肽1；从X染色体表达的人类乳腺mRNA克隆 161455；层粘连蛋白，α3；v-myb成髓细胞瘤病毒癌基因同系物(禽)样1； G-蛋白信号调节物11；微管相关蛋白2；跨膜蛋白16A；腺瘤性结肠息肉2； 同源异型框HB9；着丝粒蛋白F，350/400ka(核分裂激素)；CD84抗原(白 细胞抗原)；EDRF2；人类红细胞样分化相关因子2；肿瘤蛋白p73样；NB4 凋亡/分化相关蛋白；人类PNAS-133；叉头盒P2；人类胃相关性差异表达 蛋白YA61P(YA61)；生腱蛋白N；染色体6可读框49；锌指蛋白462；锌指 蛋白71(Cos26)；SRY(性别决定区域Y)盒7；启动髓样细胞表面表达受体样 4；白细胞介素24；妊娠特异性β-1-糖蛋白1；硫酸软骨素蛋白聚糖 5(neuroglycan C)；角蛋白6B；角蛋白6A；脱氢酶/还原酶(SDR家族)成员 9；上皮V样抗原1；β5-间隙连接蛋白(连接蛋白31.1)；G蛋白质偶联受体51； 干扰素调节因子6；神经营养蛋白5(神经营养蛋白4/5)；CD96抗原；Iroquois 同源框蛋白质4；白细胞介素1受体样1；G-2和S期表达1；核受体亚家族2， E组成员3；腹前同源框2；锌指蛋白215；染色体4(独特)234上表达的DNA 片段序列；癌胚抗原相关细胞粘附分子8；趋化因子(C-X-C基序)配体10； IL-18；吲哚胺-吡咯2，3二加氧酶；清蛋白；钙传感受体(低尿钙症高血钙症 1，严重新生期甲状旁腺功能亢进)；Fas配体(TNF超家族成员6)；TNFR超 家族成员17；钙离子通道，电压依赖的，β2亚基；帕金森病(常染色体隐性， 青少年)2，帕金蛋白；(角质层胰凝乳蛋白酶性)激肽释放酶7；神经胶质细 胞缺失同系物2；TGF-α；促甲状腺激素胚胎因子；AP-2α(活化增强子结 合蛋白2α)；激肽释放酶10；G蛋白信号调节物7；受体型蛋白酪氨酸磷酸 酶Z多肽1；Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物1；WNT1诱导性信号途径蛋白3； Zic家族成员3heterotaxy1(odd-成对同系物，果蝇)；TTK蛋白激酶；骨骼 缓慢肌钙蛋白T1；Sciellin；X连锁TGFB诱导因子2样蛋白；激肽释放酶 8(neuropsin/ovasin)；葡萄糖胺基(N乙酰基)转移酶2，I-分支酶；锚蛋白重复 序列结构域30A；松弛素2；XVII型胶原α1；前列腺内差异性表达的基因； 磷酸酶和肌动蛋白调节物3；细胞因子信号阻遏物2；核受体4亚家族A组 成员3；血管紧张素I转化酶(肽酰基-二肽酶A)1；假定蛋白MGC17986； Distal-less同源异型框1；LAG1长寿同系物3(酿酒酵母)；合子停滞1；κ- 干扰素；IL-20；ICEBERG胱天蛋白酶-1抑制物；生长分化因子3；FGF-23； 睾丸表达序列15；无翼型MMTV整合位点家族成员8A；SRY(性别决定区 域Y)盒7；肉碱缺乏相关性室内表达1；Prokineticin 1；CAMP响应元件结 合蛋白3样3；胱天蛋白酶征召结构域家族成员15；FLJ23311蛋白质)。
实施例6：脐带内衬上皮干细胞(UCEC)直接分化为皮肤表皮角质形成 细胞
为了将脐带上皮干细胞UCEC细胞分化为皮肤表皮角质形成细胞，将 UCEC细胞根据用于培养角质形成细胞的标准方案培养。细胞分离技术如 上所述。随后将UCEC在无血清角质形成细胞生长培养基KGMKGM-2(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)、 EpiLife(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)或在 Green′s培养基中在经辐射或丝裂霉素C处理的3T3小鼠胚胎饲养层存在下 于37℃、5％CO2培养。因此，UCEC细胞形态分化成为类似人表皮角质形 成细胞。上皮细胞在光学显微镜下具有相似形态学并且可以使用常规的和 商业可得到的培养基容易地转变为成纤维细胞(参考图2)。
免疫荧光分析显示培养的UCEC还表达表皮角质形成细胞分子标志如 角蛋白、桥粒、半桥粒和基底膜成分(还参见图10，其显示UCEC通过表达 多种的这类上皮细胞标志而大体上是合格的上皮细胞)。因此这些结果表明 可以将本发明的脐带上皮祖细胞/干细胞分化为皮肤细胞如表皮角质形成 细胞，其可以用于伤口愈合并且具有开发成为培养的皮肤等效物的巨大潜 力。
实施例7：使用脐带内衬膜组织的重复组织外植来扩充脐带上皮干细 胞和间充质干细胞
如下使用脐带羊膜组织的重复外植来扩充本发明的脐带上皮干细胞和 间充质干细胞。简而言之，在第一天，将组织外植体于37℃、5％CO2接种 在组织培养皿中的生长培养基内(DMEM/10％FCS、EpiLife，KGMKGM-2或M171)；培养基每2天或3天更换一次。细胞长出开始并且自外 植体连续迁移持续7天。此后，将组织外植体转移至另一个培养皿以允许细 胞进一步生长。这个过程持续进行直至外植体尺寸变小，阻止了进一步外 植。在本文中，应当指出的是外植体尺寸进行性变小直至它们变得太小不 能进一步组织外植，因为在细胞自组织外植体长出并迁出过程期间，细胞 产生了消化和降解组织的蛋白酶。图16示意性说明了使用这种方法得到的 脐带上皮干细胞和间充质干细胞迅速和强烈的扩充过程。因此，本研究证 实可以从此来源得到高产量UCMC和UCEC细胞，这进一步反映了与其它 来源的细胞如骨髓或脂肪衍生的干细胞相比这些细胞的高存活性和促生长 特征。此外，作为实体组织，本文中所用的成功的重复外植技术证实可以 从完整组织而不仅是某个部分中均一地提取本发明的细胞。这可以得到最 大量的细胞，其可以经低传代衍生而不使细胞经过引起细胞退化的多次传 代。
实施例8：脐带间内衬间充质细胞(UCMC)直接分化为皮肤真皮成纤维 细胞
为了将脐带间充质干细胞UCMC细胞分化为皮肤真皮成纤维细胞， 将其根据用于成纤维细胞的标准方案培养。细胞分离技术如上面实施例6 中所述。随后将UCMC在DMEM或商业可得到的成纤维细胞生长培养基 (FGM)中培养。因此，UCMC细胞形态分化成为类似人真皮成纤维细胞。 间充质细胞在光学显微镜下具有相似形态并且可以使用常规的和商业可得 到的培养基轻易地转变成成纤维细胞(参考图3)。
实施例9：UCEC直接分化为皮肤表皮角质形成细胞
在与实施例6相似的方法中，按实施例2中描述的分离脐带羊膜表皮 干/祖细胞(UCEC)。为了将UCEC分化为表皮角质形成细胞，在角质形成 细胞培养基(EpiLife或KGM)中培养细胞直到100％汇合(图17-A显示的 在培养5天后)，然后更换培养基为DMEM/10％FCS持续3天形成表皮细 胞层。如图17-A显示的(其中描述了被称为“UCEC-10”和“UCEC-17”的两 个实验的照片)，在DMEM/10％FCS中培养后，UCEC已经分化为表皮角 质形成细胞，其形成细胞层(图17-A的照片拍摄10天后)。因此这些结果 为本发明的细胞的全能性提供了进一步的证据。
实施例10：UCMC直接分化为成骨细胞
按实施例2中描述的分离脐带羊膜间充质细胞(UCMC)。为了UCMC 分化为成骨细胞，在DMEM/10％FCS中培养细胞直到100％汇合，然后 在无血清的DMEM的饥饿培养基中再培养48小时。在对细胞进行冯科萨 染色(骨细胞染色)前，将UCMC置于骨生成诱导培养基中4周。骨生成诱 导培养基含有DMEM/10％FCS；1％抗生素(链霉素和青霉素)/抗真菌剂(两 性霉素)；0.01μM 1，25-二羟维生素D3、50μM抗坏血酸-2-磷酸盐、10mM β- 甘油磷酸盐、1％抗生素(链霉素和青霉素)/抗真菌剂(两性霉素)。
如图17B中显示的，培养在骨生成诱导培养基中的UCMC细胞的冯 科萨染色表示UCMC中骨节的形成，因此UCMC分化为成骨细胞，而在 未处理UCMC中没有显示此类分化，所述未处理UCMC是作为阴性对照， 培养在其它条件相同但没有诱导的DMEM/10％FCS中的。作为其它的阴 性对照，来自8个月大的供者的真皮成纤维细胞和来自20岁供者的瘢痕疙 瘩成纤维细胞在与诱导的或未诱导的UCMC相同条件下培养。两种细胞 类型使用冯科萨染色都没有产生阳性结果，这是本发明的UCMC的全能 性，以及因此也分化为例如成骨细胞的进一步的证据。
实施例11：UCMC直接分化为脂肪细胞
按实施例2中描述的分离脐带羊膜间充质干/祖细胞(UCMC)。为了 UCMC分化为脂肪细胞，在DMEM/10％FCS中培养细胞直到100％汇合， 然后在无血清的DMEM的饥饿培养基中再培养48小时。在进行油红O染 色前，将UCMC置于脂肪形成诱导培养基中4周。脂肪形成诱导培养基 含有DMEM/10％FCS；1％抗生素(链霉素和青霉素)/抗真菌剂(两性霉素)； 0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松、10μM胰岛素和200μM 吲哚美辛。
如图17C中显示的，培养在脂肪形成诱导培养基中的UCMC细胞的 油红O染色表示UCMC中的脂肪积累，因此UCMC分化为脂肪细胞，而 在未处理UCMC中没有显示此类分化，所述未处理UCMC是作为阴性对 照，培养在其它条件相同但没有诱导的DMEM/10％FCS中的。作为其它 的阴性对照，来自8个月大的供者的真皮成纤维细胞和来自20岁供者的瘢 痕疙瘩成纤维细胞在与诱导的或未诱导的UCMC相同条件下培养。两种 细胞类型在油红O染色中都没有产生阳性结果，这是本发明的UCMC的 全能性，以及也分化为例如脂肪细胞的进一步的证据。
实施例12：使用UCMC和UCEC与胶原作为胞外基质组分一起生产皮 肤等价物的方法
为了生产本发明的示范性皮肤等价物，使用6孔组织培养盘，其含有 由3μm多孔聚碳酸酯膜制成的支架(Transwell，康宁公司(Corning Incorporated)，Massachusetts，USA)。此类盘可以从维塔利斯公司 AG(Vitaris AG)，Baar，Switzerland获得。对于胶原ECM层，使用在0.05％ 醋酸中的无菌大鼠尾部酸-提取的胶原(1.0-1.7mg/ml)。用于无细胞的ECM 培养基和细胞ECM培养基的其它组分是10×极限必需培养基，其具有 Earle氏盐(吉布克BRL公司(Gibco-BRL)，Maryland，USA)、L-谷氨酰胺 (200mM，吉布克BRL公司(Gibco-BRL)，Maryland，USA)、碳酸氢钠 (71.2mg/ml)、DMEM(吉布克BRL公司(Gibco-BRL)，Maryland，USA)、 胎牛血清(FBS，吉布克BRL公司(Gibco-BRL)，Maryland，USA)。对于不 同的细胞培养基PTT-4和PTT-7，使用下列组分：
PTT-4：90％(v/v)CMRL 1066和10％(v/v)胎小牛血清。
PTT-7：99.4％(v/v)EpiLife、0.2％(v/v)胰岛素、0.2％(v/v)转铁蛋白、 0.2％(v/v)亚硒酸和10ng/ml表皮生长因子(EGF)。
按实施例2和7中描述的分离和培养脐带羊膜间充质干细胞和上皮干 细胞(UCMC和UCEC)。图18b显示了在PTT-4中培养UCMC(培养7天 后)，而图18a显示了在PTT-7中培养UCEC(培养7天后)。
所有上述组分都应该保持在冰上。为了产生不含有细胞的胞外基质(无 细胞ECM)，按表1中列举的顺序将无细胞ECM培养基组分混合在一起。 培养基溶液的颜色应该是淡黄色至浅红色，颜色上的任何过度变化可表示 使胶原不成为凝胶的pH。在无细胞ECM培养基混合在一起后，向每个支 架添加1ml该培养基，保证混合物包被支架的整个底部。一旦已经倾倒了 胶原凝胶，就不应该在培养箱中(37℃，5％CO2)干扰。
一旦无细胞ECM聚合(在胶原凝胶已经倒入支架后，其通常需要约0.5 至约12小时)，就可以胰酶消化培养中的UCMC，并将其彻底重悬在PTT-4 细胞培养基中，达终浓度为5×105细胞/ml，准备与胶原溶液混合。
对于细胞ECM培养基(参见表1)，所有组分都应该保持在冰上。为了 产生含有细胞的胞外基质(细胞ECM)，按表1中列举的顺序将细胞ECM 培养基组分混合在一起。应该在最后加入溶解在PTT-4中的UCMC，从 而确保混合已经通过添加胶原而中和化，从而细胞不会被碱性pH破坏。 混匀并添加3ml到支架中，并且允许其在培养箱中(37℃，5％CO2)成凝胶。 当凝胶是粉红色且凝固(2至24小时后)，将它们用3至4ml的PTT-4覆盖 并孵育4至7天，直到凝胶收缩稳定且完全。PTT-4培养基允许细胞分化 为成纤维细胞(图18b)。另一个适合分化UCMC为成纤维细胞的培养基是 在实施例8中描述的。在时间间隔期间，基质的体积减少50倍。应该每2 天更换培养基。
胰酶消化准备好的UCEC，从而可以将50μl PTT-7中高至1×106个细 胞铺板到每个支架中。细胞悬液可以用200μl的自动移液器放置到收缩的 胶原凝胶的中央突起的平顶样部分。
当UCEC在培养箱中贴附到已经形成的成纤维细胞层上时，2至3小 时内不要碰触平板。在该孵育期后，将PTT-7加入到孔(4ml)中UCEC(2ml) 的顶部上，培养达7天。应该每2天更换培养基。UCEC与PTT-7的孵育 允许细胞分化为角质形成细胞(图18a)。另一个适合分化UCEC为角质形 成细胞的培养基是在实施例6中描述的培养基。
在这一点上，在孔中，皮肤等价物(CSE-1)生长在气液界面，使用溶解 在PTT-7培养基(仅1.5-2ml)中的高钙(0.6mM)，并培养达10天。应该每2 天更换培养基。
现在皮肤等价物(CSE-1)已经做好准备供组织学和电子显微镜分析。应 该注意到CSE-1的生长随方法中使用的UCEC和UCMC株的不同而变动。 可以从图19中的照片可以看到，形成了由成纤维细胞组成的真皮层和由角 质形成细胞组成的表皮层。图20a中的照片显示了在提升至气-液界面后， CSE-1的表面外观。图20b显示了在CSE-1的胶原格子内聚集的UCMC 的外观。
表1：ECM培养基的组分
  6ml无细胞ECM培养   18ml细胞ECM培养基(3ml/
  基(1ml/支架)   支架)   10×DMEM   0.59ml   1.65ml   L-谷氨酰胺   0.05ml   0.15ml   胎牛血清   0.6ml   1.85ml   碳酸氢钠   0.17ml   0.52ml   胶原   4.6ml   14ml   UCMC   -   在1.5ml的PTT-4培养基中   5×105个细胞
实施例13：使用UCMC和UCEC生产皮肤等价物的方法
一般而言，下列实施例按与实施例12相同的方式进行。然而，与实施 例12相反，没有使用胶原作为ECM(所述胶原在实施例12中，在接种 UCMC到支架中之前，被掺入到支架内)。在本实施例中，UCMC细胞自 身分泌I型胶原，形成三维的细胞层，从而不必要使用额外的胶原层。通 过UCMC细胞生产胶原是通过在细胞培养基PTT-4中添加抗坏血酸实现 的。
首先，按实施例12中描述的收获UCMC细胞，UCEC按1×105个细 胞/ml的浓度接种在支架上，并孵育3天(37℃，5％CO2)。
3天后，在培养基PTT-4中补充50μg/ml抗坏血酸。然后再孵育细胞 2周(37℃，5％CO2)。在这些条件下，UCMC将自我沉积I型胶原，并形 成三维的细胞层，其模拟实施例12中单独产生的胞外基质。
为了生产上皮层，进行实施例12中已经描述的相同实验。
现在皮肤等价物(CSE-2)已经做好准备供组织学和电子显微镜分析。应 该注意到CSE-2的生长随方法中使用的UCEC和UCMC株的不同而变动。 可以从图21a中的照片显示了在提升至气-液界面后，CSE-2的表面外观。 图21b显示了在CSE-2的胶原格子内聚集的UCMC的形态。
实施例14：使用UCMC、HUVEC和UCEC与作为胞外基质组分的胶 原一起生产皮肤等价物的方法
一般而言，下列实施例使用与实施例12所述相同的组分和程序。
按实施例2和7中描述的分离和培养来自脐带羊膜的间充质和上皮干 细胞(UCMC和UCEC)。使用胶原酶自脐带血管培养人脐血管内皮细胞 (HUVEC)。简而言之，用PBS冲洗脐带血管去除所有血液。夹紧脐带末 端：将0.5％胶原酶溶液注射到脐带血管中，并在室温孵育20分钟。然后， 去掉夹子，并用含有10％胎小牛血清(FCS)的EGM培养基(康伯司公司 (Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)冲洗脐带血管，从而收集 HUVE-细胞悬浮液。离心细胞悬浮液，收集细胞沉淀，然后在EGM培养 基(康伯司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)中培养。
在进行实验不久前，在培养箱中(37℃，5％CO2)在EGM培养基(康伯 司公司(Cambrex Corporation)，New Jersey，USA)或M131培养基中培养 HUVEC细胞。使用因子VIII相关抗原或von Willebrand因子的免疫组织 化学分析验证这些细胞的细胞纯度(数据未显示)。简而言之，将HUVEC 接种在盖玻片上直到它们达到80％汇合。然后，将它们固定并用抗因子 VIII的一抗或抗von Willebrand因子的抗体孵育，然后用过氧化物酶缀合 的二抗孵育。阳性细胞的数目表达为标记了因子VIII或von Willebrand 因子的细胞的百分比。在显微镜下观察阳性的细胞以检查它们的纯度。
实验使用的所有组分都应该保持在冰上。为了产生不含有细胞的胞外 基质(无细胞ECM)，按表2中列举的顺序将无细胞ECM培养基组分混合 在一起。其它细节参见实验12中的描述。
一旦无细胞ECM聚合(在胶原凝胶已经倒入支架后，其通常需要约0.5 至约12小时)，就可以胰酶消化培养中的UCMC和HUVEC，并将其彻底 重悬在PTT-4(用于UCMC)和M131(用于HUVEC)细胞培养基中，达终浓 度为5×105细胞/ml(UCMC/HUVEC-1∶1混合物)，准备与胶原溶液混合。
对于细胞ECM培养基(参见表2)，所有组分都应该保持在冰上。为了 产生含有细胞的胞外基质(细胞ECM)，按表2中列举的顺序将细胞ECM 培养基组分混合在一起。应该在最后加入UCMC/HUVEC混合物，从而确 保混合物已经通过添加胶原而中和化，从而细胞不会被碱性pH破坏。混 匀并添加3ml到支架中，并且允许其在培养箱中(37℃，5％CO2)成凝胶。 当凝胶凝固(30分钟后)，将它们用3至4ml的PTT-4/M131(1∶1)覆盖并孵 育4至7天，直到凝胶收缩稳定且完全。PTT-4培养基允许细胞分化为成 纤维细胞。在时间间隔期间，基质的体积减少50倍。应该每2天更换培养 基。
准备好时胰酶消化UCEC，从而可以将50μl PTT-7中高至1×106个细 胞铺到每个支架中。细胞悬浮液可以用200μl自动移液器放置到收缩的胶 原凝胶的中央突起的平顶样部分。
当UCEC在培养箱中贴附到已经形成的成纤维细胞层上时，2至3小 时内不要碰触平板。在该孵育期后，在UCEC(2ml)的顶部加入PTT-7到 孔内(4ml)，培养达7天。应该每2天更换培养基。UCEC与PTT-7的孵 育允许细胞分化为角质形成细胞。
在这一点上，在孔中，皮肤等价物(CSE-3)生长在气液界面，使用溶解 在PTT-7培养基(仅1.5-2ml)中的高钙(0.6mM)，并培养达10天。应该每2 天更换培养基。
现在皮肤等价物(CSE-3)已经做好准备供组织学、共聚焦、电子显微镜 和免疫学分析。应该注意到CSE-3的生长随方法中使用的UCMC、HUVEC 和UCEC株的不同而变动。
表2：ECM培养基的组分
  6ml无细胞ECM培养   基(1ml/支架)   18ml细胞ECM培养基(3ml/   支架)   10×DMEM   0.59ml   1.65ml   L-谷氨酰胺   0.05ml   0.15ml   胎牛血清   0.6ml   1.85ml   碳酸氢钠   0.17ml   0.52ml   胶原   4.6ml   14ml
  UCMC -   在1.5ml的PTT-4/M131混合   物培养基中的5×105个细胞
实施例15：UCEC和UCMC分别分化为β-胰岛样细胞
按实施例2中描述的分离来自脐带羊膜的间充质和上皮干细胞 (UCMC和UCEC)。
在PTT-4培养基(见上文PTT-4的组成(90％(v/v)CMRL1066、 10％(v/v)FCS))或PTT-10培养基中孵育UCMC。PTT-10培养基含有 99.4％(v/v)CMRL-1066和0.2％(v/v)胰岛素、0.2％(v/v)转铁蛋白和 0.2％(v/v)亚硒酸。
在PTT-7培养基(见上文PTT-7的组成)或PTT-5和PTT-6培养基中 孵育UCEC。PTT-5培养基含有98.8％(v/v)CMRL-1066、0.4％(v/v)胰岛 素、0.4％(v/v)转铁蛋白、0.4％(v/v)亚硒酸和10ng/ml表皮生长因子(EGF)。 PTT-6培养基含有99.4％(v/v)M171、0.2％(v/v)胰岛素、0.2％(v/v)转铁蛋 白、0.2％(v/v)亚硒酸和10ng/ml表皮生长因子(EGF)。
通过添加1mM烟酰胺到培养着细胞的各自的细胞培养基中，分别诱 导UCEC和UCMC的分化。应该每2或3天更换细胞培养基。
在显微镜下观察β-胰岛样细胞的外观(图23；在有或无诱导物，即烟 酰胺的PTT-10中的UCEC)。收集β-胰岛样细胞用于显微镜分析。为了确 定根据本发明的方法获得的细胞是否确实是β-胰岛样细胞，使用在 Technical Manual of StemCell Technologies Inc.，标题：In-vitro differentiation of murine ES cells into pancreatic islet-like clusters，或 “Epithelial-to-mesenchymal transition generates proliferative human islet precursor cells”，Science，2004，306，第2261-2264页中描述的一种方法。
下文中描述了诱导UCEC(CLEC)的胰岛素-生产细胞分化诱导的替代 方法。用上述培养基之一(PTT-5、PTT-6或PTT-7培养基)孵育UCEC。 为了诱导UCEC分化为胰岛素-生产细胞，将这些细胞暴露在ESCult培养 基(购自干细胞技术公司(StemCell Technologies Inc.)，Vancouver，Canada) 或BBRC06培养基中7天。
ESCult培养基(干细胞技术公司(StemCell Technologies Inc.)， Vancouver，Canada)含有100毫克/ml烟酰胺，与20ml/l B27和10ml/l N2 添加物一起添加。
BBRC06培养基含有无血清DMEM/F12培养基，其具有17.5mM葡 萄糖，并存在烟酰胺10mM、激活蛋白-A 2nM、毒蜥外泌肽-410nM、肝 细胞生长因子100pM和五肽胃泌素10nM(西格玛-阿尔德里克公司 (Sigma-Aldrich)，Missouri，USA)以及B-27无血清添加物，N-2添加物(干 细胞技术公司(StemCell Technologies Inc.)，Vancouver，Canada)，和1％ 青霉素/链霉素5000U/L(Biochem.Biophys.Res.Commun.2006，March 24；341(4)第1135-40页)。
在ES Cult培养基或BBRC06培养基中孵育7天后，使用来自 QIAGEN(Hilden，德国)用于RNA提取和纯化的Rneasy提取试剂盒收 获总RNA，单个样本经过RT-PCR测定来检测胰岛素基因表达。作为阳 性对照使用胰岛素引物，其描述在Timper K.，Seboek等人，Biochem. Biophys.Res.Commun.2006，March 24；341(4)第1135-40页中。
图25显示了该替代诱导方法的结果。图25显示在ES Cult培养基或 BBRC06培养基的诱导下，多个UCEC样品中的胰岛素表达。指定为 CLEC25、28和30的样品表示来自不同脐带供体的不同样品。指定为 CLEC30(1)和CLEC30(2)的样品表示同一个样品的一式两份。因此，证明 了UCEC具有分化为可用于治疗糖尿不的胰岛素-生产细胞的潜力。
实施例16：UCEC分化为黏蛋白-生产细胞
按实施例2中描述的分离来自脐带羊膜的上皮干细胞(UCEC)。
分离的UCEC生长在PTT-5或PTT-6细胞培养基中(37℃，5％CO2)， 其组成已经描述在实施例15中。本发明令人惊讶的发现使用PTT-5或 PTT-6培养UCEC使UCEC生产黏蛋白(参见图22a)。在移液和更换培养 基的过程中，观察细胞培养物上清液的粘度。
黏蛋白凝块测试：黏蛋白凝块测试是对PTT-5或PTT-6中培养的 UCEC生产的黏蛋白的质量和数量的评估。该测试还一般描述在Corfield A.P.，Glycoprotein method and protocols：The Mucins，第29-65页. Humana Press 2000；Gatter R.A.和Schumacher R.H.，A practical handbook of join fluid analysis，第59-63页，Lea&Febiger，1991中。在 该测试中，在UCEC细胞培养条件培养基中喷入7N冰醋酸。醋酸导致黏 蛋白形成凝块。含有普通黏蛋白的UCEC细胞培养条件培养基表现为具有 紧密、粘稠凝块的清澈液体。
为了定量UCEC生产的黏蛋白的量，进行SDS-PAGE和随后的考马 斯染色(参见图22b)。对于SDS-PAGE，使用100kDa截留膜CentrisartI(赛 多利斯公司(Sartorius AG)，德国)浓缩从UCEC细胞培养物收集的2.5ml 细胞培养基。将100μl浓缩的上清液上样到6％SDS-PAGE中用于电泳。 然后用考马斯染色凝胶，并拍摄照片。
实施例17：UCMC直接分化为软骨细胞(软骨形成系)
与UCMC发育为成骨细胞相似(参见实施例10)，它们也具有发育为组 成软骨的软骨细胞的能力。
为了发育为软骨，按实施例2中描述的分离脐带羊膜间充质细胞 (UCMC)。为了UCMC分化为成骨细胞，在DMEM/10％FCS中培养细胞 直到100％汇合。然后将它们暴露在补充了10ng/ml转化生长因子 -β3(TGF-β3；R&D系统公司(R&D Systems)，Minneapolis，USA)、100nM 地塞米松、50mg/mL抗坏血酸、100mg/mL丙酮酸钠、40mg/mL脯氨酸(西 格玛-阿尔德里克公司(Sigam-Aldrich)，Missouri，USA)的PTT-5培养基 中，持续4周。细胞层用阿辛蓝染色(其染色酸性糖胺聚糖和黏多糖)。
与其中没有显示此类分化的对照相比(图24A)，在图24B中观察到用 阿辛蓝阳性染色的软骨细胞或软骨形成系。对照由未处理的UCMC组成， 其培养在其它条件相同但没有用补充的PTT-5(上文)诱导的 DMEM/1％FCS中。结果显示，UCMC具有形成软骨的软骨细胞的潜力， 用于软骨修复和再生。通过使用支架例如TissueFleece(奥地利百特公司 (Baxter AG)，Austria；描述在实施例21中)或水凝胶可以将细胞用于机体。
实施例18：UCMC直接分化为多巴胺-生产细胞
该实施例描述了UCMC分化为多巴胺和酪氨酸羟化酶(TH)-生产细 胞。
为了多巴胺和TH的发育，按实施例2中描述的分离脐带羊膜间充质 细胞(UCMC)。
在100mm组织培养皿中以200000个细胞的密度培养UCMC，并在 PTT-4培养基中维持5天直到80％汇合。然后将细胞暴露在PTT-2培养基 中48小时。孵育后，收集细胞培养物上清液用于分析。PTT-2培养基是 M154(黑素细胞培养基)和EpiLife(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologics Inc.)，Oregon，USA)按3∶1比例的混合物。
对UCMC细胞或条件培养基(上清液，如上文)进行Western印迹或免 疫组织化学(IHC)分析。图26A显示CLMC(UCMC)细胞分泌TH到条件 培养基中。当暴露给PTT-2培养基时，在第4和5道观察到更多的TH分 泌。图26B显示CLMC(UCMC)细胞的多巴胺分泌。图26C显示阴性对照。 用多巴胺哄诱(coax)这些UCMC细胞。它们保持未分化，但可以检测到大 量的多巴胺。表示：UCMC具有生产多巴胺和多巴胺前体-TH的潜力。
实施例19：UCMC和UCEC分化为HLA-G-生产细胞
该实施例描述了UCMC和UCEC分化为HLA-G-生产细胞。HLA-G 是HLA I类抗原，主要在胎盘中表达，推测可能保护胎儿不被它的母亲的 免疫系统攻击。HLA-G是特殊的HLA，涉及多种免疫介导的疾病和病症， 如器官-、细胞移植和自身免疫病。此类自身免疫病的实例是多发性硬化、 类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、甲状腺疾病、系统性红斑狼疮、 硬皮病或乳糜泻。已经报道了与流产和先兆子痫的风险相关的特定变体。 HLA分型对于骨髓移植的供体和受体匹配是关键的；使用匹配好的供体增 加了存活并降低了移植物对抗宿主的疾病。HLA分型对于实体器官移植， 以及其它领域的应用也是重要的。
为了HLA-G的发育，按实施例2中描述的分离脐带羊膜上皮细胞和 间充质细胞(分别为UCEC和UCMC)。
从UCMC和UCEC细胞收集总RNA和条件培养基，对其进行 RT-PCR和Western印迹分析。图27A显示在UCMC和UCEC中的HLA-G mRNA的表达。使用JAR滋养层细胞作为HLA-G表达的阳性对照。图 27B显示UCEC分泌HLA-G蛋白质到条件培养基中。
该实验第一次显示幼稚UCEC(UCEC)表达和生产HLA-G。对 于HLA-G的生产，UCEC的特异性诱导不是必须的。HLA-G-生产UCEC 和UCMC细胞具有良好的免疫抑制性质。这些细胞是低免疫原性的，是 同种异体移植的良好候选物。
实施例20：使用UCMC诱导衰老的皮肤角质形成细胞(asK)的增殖
在下列实施例中，展示了UCMC如何可以诱导衰老的皮肤角质形成 细胞(asK)和人真皮成纤维细胞(NF)的增殖。
按实施例2中描述的分离脐带羊膜的间充质细胞(UCMC)。在PTT-4 培养基中培养UCMC直到80％汇合。然后，收获细胞并在1200rpm离心 约10分钟。离心后，向细胞沉淀中按每8百万细胞1ml低渗水的比例加 入低渗水。总细胞裂解物在4℃4000rpm离心30分钟。收集“UCMC提取 物”的澄清相并储存在-30℃。从实足年龄的皮肤(60岁以上的患者)中分离 衰老的皮肤角质形成细胞(asK)。在24孔平板中以4000细胞/孔的密度种 植ask细胞，并维持在生长EpiLife培养基中(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)24小时。然后将ask细胞暴露在基础EpiLife培养基中(卡斯卡德生物公司(Cascade Biologies Inc.)，Oregon，USA)持续 48小时，然后按不同稀释度在基础EpiLife培养基中添加2.5％、5％、10％ 和20％稀释的UCMC提取物。在不同的时间间隔实施标准MTT测定。 图28A显示在第6和7天以2.5％、5％和10％浓度的UCMC提取物诱导 的ask细胞增殖。图28A中展示的“对照”样品柱代表维持在没有添加 UCMC提取物或生长因子的基础EpiLife培养基中的衰老的皮肤角质形成 细胞。术语“asK10(1)p3”指已经传过3代的衰老的皮肤角质形成细胞。图 28A中展示的“阳性”样品柱代表维持在没有UCMC提取物的优化条件的 生长培养基(基础EpiLife培养基+生长因子)中的细胞。相似的，人真皮成 纤维细胞的不同的细胞系(分别是NF125和NF119)如上述用“UCMC提取 物”处理。这些实验的结果显示在图28B和图28C中。
由于“UCMC提取物”对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞具有阳性影 响，可以制备提取物用于促进创伤愈合、皮肤修复、再生和复壮 (rejenuvation)。
实施例21：使用不同的支架材料用于UCMC的培养
在第一个实验中，通过在胶原格子中增殖的UCMC细胞制备间充质 组织等价物(MTE)。为了制备器官型共培养构建体，将MTE转移到 Transwell插入物中(康宁公司(Corning Inc.))。将CLEC或人皮肤角质形成 细胞按100,000个细胞/cm2的密度种植到MTE上，并维持在EpiLife培养 基中。然后将器官型共培养构建体提升到气-液界面，持续3周。然后对构 建体进行H&E染色，用于组织学分析(参见图29A和29B)。
进行的第二个实验证明了UCMC接种入商购的生物材料支架例如 TissuFleece(奥地利百特公司(Baxter AG)，Austria)、INTEGRA Bilayer Matrix Wound DressingTM(纽罗科学公司(Neuro Sciences)，New Jersey， USA)、BoneSaxe(美国史赛克公司(Stryker Inc.)，MI，USA)或Synthese(AO) 中的能力。
TissuFleeceE(奥地利百特公司(Baxter AG)，Austria)的活性成分是由 自由干燥的马皮肤胶原组成的支架。1cm2的TissuFleece含有2.8mg的天 然胶原原纤维。一般的，胶原与血液的接触导致血小板聚集，然后大量附 着在胶原基质上，碎裂并释放凝固因子，所述凝固因子与血浆因子一起， 导致纤维蛋白的形成。此外胶原基质增加凝块。由于它的结构，TissuFleece 胶原网状物能够吸收大量液体。仅通过该机械过程，吸收UCMC。因此， 加速肉芽组织的形成。
INTEGRA Bilayer Matrix Wound DressingTM(下文仅称为Integra) 是包含交联的牛腱胶原和糖胺聚糖的多孔基质以及半渗透性聚硅氧烷(硅 氧烷)层的支架。半渗透性硅氧烷膜控制水蒸气丧失，提供覆盖创伤表面的 可变通的附着，为装置添加了增强的撕裂度。胶原-糖胺聚糖生物可降解的 基质提供了用于细胞侵入和毛细血管生长的支架。
BoneSaxe(美国史赛克公司(Stryker Inc.)，MI，USA)是由磷酸钙陶瓷 组成的支架。
ChronOS(林赛丝公司(Synthes GmbH)，Switzerland)是由β-磷酸三 钙组成的支架。
为了实验，按实施例2中描述的分离脐带羊膜的间充质细胞(UCMC)。 在PTT-4培养基中培养UCMC直到80％汇合。收获细胞并在1200rpm下 离心约5分钟以获得细胞沉淀。为了在TissuFleece、Integra BoneSave(美国史赛克公司(Stryker Inc.)，MI，USA)和ChronOS(林赛 丝公司(Synthes GmbH)，Switzerland)中接种入UCMC，将细胞沉淀按每 1ml培养基8百万个细胞的比例重悬在PTT-4培养基中。然后以100000 个细胞/cm2的密度将UCMC细胞悬浮液种植在TissuFleece或Integra层 上。BoneSave(美国史赛克公司(Stryker Inc.)，MI，USA)或ChronOS(林 赛丝公司(Synthes GmbH)，Switzerland)的骨移植颗粒浸没在UCMC细胞 悬浮液中，并混匀。将接种入生物材料的UCMC细胞在细胞培养培养箱 中于37℃在PTT-4培养基中维持48小时，并在用FDA和碘化丙啶染色后 对其进行共聚焦显微镜分析。将活的UCMC细胞接种入TissuFleece(图 30A)和BoneSave(美国史赛克公司(Stryker Inc.)，MI，USA)(图30B)中， 如上述孵育，然后用FDA和碘化丙啶(PI)染色，然后进行共聚焦显微镜分 析。结果显示在图30A和30B中。用PI染色的细胞呈现红色(在图30A和 30B中用“R”显示)，用FDA染色的细胞呈现绿色(在图30A和30B中用“G” 显示)。
醋酸荧光素(FDA)(50μg/ml)和PI(25μg/ml)都用1×PBS制备。为了细 胞的染色，从培养箱中取出它们并用1×PBS洗涤两次。然后将它们与 FDA(50μg/ml)在37℃培养箱中孵育15分钟。此后，将细胞用1×PBS洗涤 两次。然后再用PI(25μg/ml)在室温复染5分钟。然后，将细胞用1×PBS 洗涤两次并将样品保存在1×PBS中防止干燥。此后，如上述在共聚焦显微 镜下观察细胞。
该实验的结果显示UCMC在不同种类的支架上生长。因此，UCMC 可用于改造活的软组织和硬组织，用于修复和再生。
实施例22：将UCMC-增殖的胶原支架植入免疫活性的小鼠中
该实验证明了UCMC的血管生成性质。如之前在实施例12中描述的 将细胞种植到支架内。图31A显示了在体外UCMC-增殖的胶原格子(支架) 的外观。图31B显示了在小鼠中的第21天植入的无细胞胶原格子对照和 UCMC-增殖的胶原格子。没有观察到免疫排斥的信号。在第21天，在植 入的UCMC-增殖的胶原格子中观察到宏观的血管生成。图31C显示了 UCMC-增殖的胶原格子的微观的血管生成(由箭头指出)。
该实验清楚的表明了UCMC的血管生成性质。因此，这些细胞可用 于增强在组织修复和再生中的血管生成，并用于治疗局部缺血性障碍。
实施例23：UCMC用于全层烧伤治疗的临床应用
该实验显示了对遭受全层烧伤的53岁女性患者的治疗。一般而言，这 类烧伤必需皮肤移植来完全治愈。
为了实验，按实施例2中描述的分离脐带羊膜的间充质细胞(UCMC)。
对于该实验，首先将待治疗的患者全身麻醉，然后在将UCMC增殖 的Biobrane-L尼龙膜(陶氏里克曼药物公司(Down Hickam Pharmaceuticals)，Texas，USA)应用到患者的创伤之前，使用外科刮器外 科手术去除烧伤坏死的组织(参见图32B)。
在本实验中，将Biobrane-L尼龙膜剪切成适合32mm组织培养皿的 圆片。在150mm组织培养皿中培养UCMC，通过细胞刮收获、离心并按 本文前述的计数。在以100000个细胞/cm2的密度将UCMC接种到膜上之 前，用DMEM培养基湿润膜片48小时(参见图32B，第一幅图)。
图32A显示在53岁女性患者的全层烧伤(3度)上的创面床准备。将 UCMC接种到Biobrane-L创伤敷料(陶氏里克曼药物公司(Down Hickam Pharmaceuticals)，Texas，USA)上。将UCMC-Biobrane构建体转移到创 伤上(图32B)。在第7天看到完全愈合(没有皮肤移植物)，并在随访3个月 稳定。该情况显示，UCMC可以具有干细胞的治愈力，不使用皮肤移植物 也治愈此类烧伤，表示该技术在将来可替代自体皮肤移植。
图34显示对2岁男性患者的全层烧伤的治疗。实验与前述实验相似的 进行。将UCMC在组织培养皿上培养在DMEM/10％FCS中直到汇合。然 后刮擦收获细胞并与SoloSite凝胶(施乐辉公司(Smith&Nephew)，Hull， UK)混合，并以1百万个细胞/em2的密度糊到创伤上。SoloSite是有防腐 剂的水凝胶创伤敷料，其包含水膨胀性的多聚体，其保持凝胶样直到饱和。 它可以贡献水分再水合坏死的组织。它吸收渗出物同时保持它在创伤上的 结构。不用皮肤移植，在第5天观察到使用该方法的完全的愈合。
实施例24：UCMC用于部分皮层创伤治疗的临床应用
该实验表明了UCMC用于2岁男性患者的部分皮层创伤(2度)治疗的 临床应用。实验按实施例23中描述的进行(创伤准备和创伤敷料的准备， 等)。在Tegaderm创伤敷料(3M健康护理公司(3M Health Care)， Minnesota，USA)上培养UCMC并将其转移到创伤上。
Tegaderm创伤敷料是快速毛细作用、不膨胀的聚氨基甲酸酯泡沫， 具有高透气性的薄膜背衬(film backing)，其防止创伤渗出物透出并且是外 界污染的屏障，而敷料保持完整不渗漏。创伤敷料由氨基甲酸乙酯薄膜背 衬(5-10wt.-％)、聚氨基甲酸酯泡沫(90-95wt.-％)和少量墨(0.1-1wt.-％)组 成。
在第3天观察到部分皮层创伤的完全愈合(参见图33)。图33中左侧的 箭头指示区域A，即用装有UCMC的Tegaderm创伤敷料治疗的创伤部 分。右侧的箭头指示区域B，即用常规方法治疗的创伤部分。
实施例25：UCMC用于非愈合性辐射创伤治疗的临床应用
该实施例表明UCMC用于在1岁儿童中治疗非愈合性辐射创伤的临 床应用，该儿童患有血管瘤。用常规创伤治疗，最初的创伤在超过90天的 时期没有愈合。实验按实施例23中描述的进行。将UCMC按100000个 细胞/cm2的密度培养在Tegaderm创伤敷料上，并每周两次转移到创伤上。 如图35中可见，经过20多天的UCMC细胞疗法的时期辐射创伤完全愈 合。
实施例26：UCMC用于非愈合性糖尿病创伤和非愈合性糖尿病食物创 伤治疗的临床应用
这些实施例表明UCMC用于治疗非愈合性糖尿病创伤(图36)、非愈合 性糖尿病食物创伤(图37B)和失败的皮瓣供体位置创伤(图37A)的临床应 用。后两者在为期6年多的常规治疗下愈合失败。
按实施例23中描述培养UCMC，并与SoloSite凝胶(施乐辉公司 (Smith&Nephew)，Hull，UK)混合。UCMC/SoloSite凝胶混合物按1百万 个细胞/cm2的密度糊在创伤上。每周一次进行对创伤的应用。在第26天观 察到非愈合性糖尿病创伤的完全愈合(图36)，而在非愈合性糖尿病食物创 伤(图37B)和失败的皮瓣供体位置创伤(图37A)的情况下，可以观察到创伤 愈合的过程。
实施例27：UCEC直接分化为肝细胞
按实施例2中描述的分离脐带羊膜的上皮干/祖细胞(UCEC)。为了 UCEC分化为肝细胞，将细胞暴露在含有制瘤素-M(50μg/ml)的BBRC06H 培养基中(BBRC06H培养基是按实施例15中描述的BBRC06的修饰版本， 没有添加烟酰胺并添加了50μg/ml的制瘤素-M)。
图38显示了在用含有制瘤素-M(50μg/ml)的BBRC06H培养基诱导后， UCEC的清蛋白表达。甲胎蛋白是肝干/祖细胞的干细胞标志。当用诱导培 养基诱导时，UCEC分化为生产更多清蛋白的成熟肝细胞。微管蛋白是管 家基因，用于显示Western印迹测定中的等量上样。该实验显示，UCEC 具有分化为肝细胞的潜力，其可用于肝病治疗或测试新药细胞毒性的体外 模型。
相关申请的交叉文献
本发明要求享有于2005年10月21日提交的美国临时申请号60/729,172 的优先权，其内容出于所有目的以其全文引用到本文中作为参考。