一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法
专利汇可以提供一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种检测 卷烟 烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，包括以下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人 肺 成 纤维 细胞 单细胞悬浮液的制备；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)受试物孵育品的收集；(10)细胞早期凋亡影响率的计算。本发明对样品检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡的影响。作为卷烟烟气总粒相物细胞毒性检测的补充方法以区别制品对细胞 坏死 和凋亡的影响。，下面是一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物的孵育；
(9)受试物孵育品的收集；
(10)细胞早期凋亡影响率的计算。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T 19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每孔中的液体体积补足到2mL/孔；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：收集步骤(8)中的培养液，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后连同收集的培养液，1000rpm转速下，4℃离心5min，收集细胞；
(10)细胞早期凋亡影响率的计算：用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤步骤(9)所得细胞2次，每次均于1000rpm转速下，4℃离心5min，收集细胞，再加入100μL的结合液：重悬细胞，再加入10μL的染料，轻轻混匀，然后避光、室温下反应10min，再加入400μL的重悬细胞进行混匀得到检测样品，在1小时内用流式细胞仪检测，即得到细胞早期凋亡影响率。
一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法
技术领域
背景技术
发明内容
2mL/孔；
图1为受试样品在检测剂量范围内细胞早期凋亡率和检测剂量间存在剂量效应关系图。
具体实施方式
2mL/孔；
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