一种果胶及其用于抗衰老用途
阅读：1039发布：2020-07-30
专利汇可以提供一种果胶及其用于抗衰老用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了权利中所涉特定结构的果胶可抑制 活性 氧 诱导的人原代 成 纤维 细胞 BJ 细胞的体外衰老；该特定结构果胶可抑制人原代成纤维细胞BJ细胞中beta-galactosidase的活性、以及衰老标志蛋白DEC-1的积累。有望开发出用该特定结构果胶以单独或者组合形式制备成固体饮料、口服液、口服片剂等不同剂型的抗衰老健康产品。，下面是一种果胶及其用于抗衰老用途专利的具体信息内容。
1.权利涉及果胶为白色粉末状固体，纯度测试表明，该果胶由两个组份组成，其分子量分别为8.13×105 D和6.86×102 D；权利要求的果胶是分子量范围为2×102 -2×106 D的果胶，该果胶由均聚半乳糖醛酸，RG1型果胶和葡聚糖组成，单糖组成为Rha:GalA:Glc:Gal:
Ara=1.6:50:38.6:7.4:2.4。
2.如权利要求1所述的果胶的一种功能应用；其应用在于将该果胶用于抑制成纤维细胞，包括人原代成纤维细胞BJ细胞的衰老和抗自由基积累的多糖。
3.如权利要求1所述的果胶的一种功能应用；其应用在于将该果胶作为能够抑制人原代成纤维细胞BJ细胞中抗衰老标志物beta-galactosidase的活性，抑制Dec1蛋白的累积，达到抑制细胞衰老的作用。
4.如权利要求1所述的果胶的一种功能应用；即将该果胶用于抗衰老等产品的应用，包括单独或者以组合形式用于护肤品或者化妆品，或者单独或者以组合形式用于制备成固体饮料、口服液、口服片剂、等不同剂型。
一种果胶及其用于抗衰老用途
技术领域
背景技术
[0002] 多糖（polysaccharide）是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。多糖在自然界分布极广，亦很重要。有的是构成动植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。多糖的结构单位是单糖，多糖相对分子质量从几万到几千万。结构单位之间以苷键相连接，常见的苷键有α-1，4-、β-1，4-和α-1，
6-苷键。结构单位可以连成直链，也可以形成支链，直链一般以α-1，4-苷键（如淀粉）和β-1，
4-苷键9如纤维素）连成；支链中链与链的连接点常是α-1，6-苷键。国外内越来越多的研究和应用聚焦于多糖的独特功能。Honda Yasuki等从西洋樱草属(Polyanthus)植物中获得一种具有良好的保湿、抗皱等作用的酸性杂多糖。Sawai Yasuko等从石菖蒲(Acorusgram/neus)的根茎中分离得到的多糖可抑制黑色素的产生，具有抗炎、抗氧化作用，可用于黑变病的治疗，且因其具有良好的保湿作用，故又可作为化妆品的有效成分。Shimomura K nji~
等从甲壳类动物的肉类降解产物中得到一种具有美容功效的酸性多糖。实验证明，此酸性多糖可抑制延缓衰老的透明质酸的分解，减少皮肤细纹和干裂，因而可作为美容食品和化妆品的有效成分。本发明的技术开发背景就是基于特定结构的多糖，利用自由基H2O2诱导的原代成纤维细胞衰老模型，开发出具有重要的抗衰老作用的多糖。
6-苷键。结构单位可以连成直链，也可以形成支链，直链一般以α-1，4-苷键（如淀粉）和β-1，
4-苷键9如纤维素）连成；支链中链与链的连接点常是α-1，6-苷键。国外内越来越多的研究和应用聚焦于多糖的独特功能。Honda Yasuki等从西洋樱草属(Polyanthus)植物中获得一种具有良好的保湿、抗皱等作用的酸性杂多糖。Sawai Yasuko等从石菖蒲(Acorusgram/neus)的根茎中分离得到的多糖可抑制黑色素的产生，具有抗炎、抗氧化作用，可用于黑变病的治疗，且因其具有良好的保湿作用，故又可作为化妆品的有效成分。Shimomura K nji~
等从甲壳类动物的肉类降解产物中得到一种具有美容功效的酸性多糖。实验证明，此酸性多糖可抑制延缓衰老的透明质酸的分解，减少皮肤细纹和干裂，因而可作为美容食品和化妆品的有效成分。本发明的技术开发背景就是基于特定结构的多糖，利用自由基H2O2诱导的原代成纤维细胞衰老模型，开发出具有重要的抗衰老作用的多糖。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供权利所涉果胶糖组成和分子量等结构表征；本发明的另一目的是提供权利涉及的果胶抑制H2O2诱导的人原代成纤维细胞BJ细胞的衰老标志物beta-galactosidase的活性；本发明的还有一目的是提供权利所涉果胶下调人原代成纤维细胞BJ细胞衰老标志DEC-1的表达水平；附图说明
[0004] 图1 权利所涉的果胶的糖组成分析、核磁共振谱图（H1-NMR，C13-NMR）图谱；图1A为权利所涉果胶纯度及分子量测定图；图1B为权利所涉果胶的糖组成分析图谱；图1C为权利所涉果胶 H1-NMR谱图；图1D为权利所涉果胶 C13-NMR谱图（dept135谱图）；图1E为权利所涉果胶 C13-NMR谱图（BB谱图）；图2 为果胶抑制人原代成纤维细胞BJ细胞衰老标志物beta-galactosidase的活性结果图；
图3为果胶抑制人原代成纤维细胞BJ细胞中衰老标志DEC-1的表达水平图；
图3为果胶抑制人原代成纤维细胞BJ细胞中衰老标志DEC-1的表达水平图；
具体实施方式
[0005] 实施例1：权利所涉果胶结构表征的测定1）分子量及纯度测定
所用仪器为Agilent 1260 高效液相色谱，配置串联waters凝胶色谱柱
UltrahydrogelTM 2000和UltrahydrogelTM 500（25 cm × 0.75 cm）色谱柱。流动相为0.1 M NaNO3，流速为0.5 ml/min，色谱柱工作温度为25 ℃，用RID检测器检测。纯度测试表明此果胶由两个组份组成。其分子量分别为8.13×105 D和6.86×102 D。如图1A所示；
权利所涉果胶糖组成分析：
现准备混合单糖标准品。称取各单糖标准品（L-Fuc；L-Rha；L-Ara；L-Xyl；D-Man；D-Gal；D-Glc；D-GalA；D-GlcA）溶于去离子水中，配成1 mg/ml以待分析；
果胶多糖的水解：称取2-4 mg 果胶样品于鸡心瓶（10 ml）中，加入1 ml H2O预溶，再加入1 ml 4 M的TFA，橡皮膏封闭瓶口，置110 ℃烘箱中水解4 h；冷却至室温后，加甲醇多次（4次）除去多余的TFA至无酸味；水解的多糖样品复溶于200 μL H2O；
单糖的PMP衍生化。取50μL 果胶水解液或50 μL混合单糖标准品溶液于2 ml EP管中，分别与50 μL的0.6 mol/L的 NaOH溶液充分混合，加入100 μL 0.5 mol/L的PMP（0.2613 g/
3ml）甲醇溶液，塞紧塞子封紧后，漩涡振荡仪混匀；在70 ℃水浴中反应100 min，取出冷却至室温。加入100 μL 0.3 mol/L的HCl中和，再加700 μl去离子水以及1 ml氯仿萃取，漩涡振荡，静置1-2 h。吸取上层水相900 μl，再加入900 μl的氯仿萃取一次，静置1 h，再去上层水相800 μl，再加入800 μl的氯仿萃取一次，或用低速离心代替静置处理。用带有0.22 μm微孔滤膜的注射器过滤后，装入液相瓶中待HPLC进样分析；
HPLC分析糖组成：利用Agilent 1260高效液相色谱系统实现。所用色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm, 5μm）；所用流动相为Buffer A: 15%乙腈+85%磷酸盐缓冲液；Buffer B: 40%乙腈+60%磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液：0.05 M 磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）； KH2PO4 13.6 g及NaOH 1.8 g溶液2 L水中；
流动相按照以下表格顺序实现过载：
试验中，柱温为20 ℃；紫外检测波长为254 nm；流速为1 ml/min；进样体积为20μl；
实验结果：通过PMP衍生分析果胶糖组成，我们通过面积归一化法，结合每个单糖的校正因子，得知果胶单糖组成为Rha:GalA:Glc:Gal:Ara=1.6:50:38.6:7.4:2.4。由此可知，此多糖可能由均聚半乳糖醛酸，RG1型果胶和葡聚糖组成。糖组成图谱如图1B所示；
3）权利所涉果胶核磁共振谱图（H1-NMR，C13-NMR）
果胶用D2O交换冻干后，用500 MHz低温探头核磁共振仪分析其H1-NMR，C13-NMR；H1-NMR的谱图如图1C所示；化学位移在4.85 ppm处是D2O的峰，2.29 ppm处是丙酮峰；化学位移在
1.0-1.5处是Rha上C6的信号峰；化学位移在3.5-4.5是糖环上除异头氢外所有的氢的峰；化学位移在4.5-5.5处是异头氢的信号峰；C13-NMR谱图如图1D所示，图1D中上图是dept 135谱图，图1E是BB谱图。dept135图中，化学位移31.5处是内标丙酮信号峰。化学位移在60-65 ppm之间的倒峰是Glc或Gal的C6的峰。65-90 ppm之间是非异头碳的信号峰。90-110 ppm是异头碳的信号峰。BB谱的信号与dept135信号一样。多出的216 ppm化学位移是丙酮的信号峰。
所用仪器为Agilent 1260 高效液相色谱，配置串联waters凝胶色谱柱
UltrahydrogelTM 2000和UltrahydrogelTM 500（25 cm × 0.75 cm）色谱柱。流动相为0.1 M NaNO3，流速为0.5 ml/min，色谱柱工作温度为25 ℃，用RID检测器检测。纯度测试表明此果胶由两个组份组成。其分子量分别为8.13×105 D和6.86×102 D。如图1A所示；
权利所涉果胶糖组成分析：
现准备混合单糖标准品。称取各单糖标准品（L-Fuc；L-Rha；L-Ara；L-Xyl；D-Man；D-Gal；D-Glc；D-GalA；D-GlcA）溶于去离子水中，配成1 mg/ml以待分析；
果胶多糖的水解：称取2-4 mg 果胶样品于鸡心瓶（10 ml）中，加入1 ml H2O预溶，再加入1 ml 4 M的TFA，橡皮膏封闭瓶口，置110 ℃烘箱中水解4 h；冷却至室温后，加甲醇多次（4次）除去多余的TFA至无酸味；水解的多糖样品复溶于200 μL H2O；
单糖的PMP衍生化。取50μL 果胶水解液或50 μL混合单糖标准品溶液于2 ml EP管中，分别与50 μL的0.6 mol/L的 NaOH溶液充分混合，加入100 μL 0.5 mol/L的PMP（0.2613 g/
3ml）甲醇溶液，塞紧塞子封紧后，漩涡振荡仪混匀；在70 ℃水浴中反应100 min，取出冷却至室温。加入100 μL 0.3 mol/L的HCl中和，再加700 μl去离子水以及1 ml氯仿萃取，漩涡振荡，静置1-2 h。吸取上层水相900 μl，再加入900 μl的氯仿萃取一次，静置1 h，再去上层水相800 μl，再加入800 μl的氯仿萃取一次，或用低速离心代替静置处理。用带有0.22 μm微孔滤膜的注射器过滤后，装入液相瓶中待HPLC进样分析；
HPLC分析糖组成：利用Agilent 1260高效液相色谱系统实现。所用色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm, 5μm）；所用流动相为Buffer A: 15%乙腈+85%磷酸盐缓冲液；Buffer B: 40%乙腈+60%磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液：0.05 M 磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）； KH2PO4 13.6 g及NaOH 1.8 g溶液2 L水中；
流动相按照以下表格顺序实现过载：
试验中，柱温为20 ℃；紫外检测波长为254 nm；流速为1 ml/min；进样体积为20μl；
实验结果：通过PMP衍生分析果胶糖组成，我们通过面积归一化法，结合每个单糖的校正因子，得知果胶单糖组成为Rha:GalA:Glc:Gal:Ara=1.6:50:38.6:7.4:2.4。由此可知，此多糖可能由均聚半乳糖醛酸，RG1型果胶和葡聚糖组成。糖组成图谱如图1B所示；
3）权利所涉果胶核磁共振谱图（H1-NMR，C13-NMR）
果胶用D2O交换冻干后，用500 MHz低温探头核磁共振仪分析其H1-NMR，C13-NMR；H1-NMR的谱图如图1C所示；化学位移在4.85 ppm处是D2O的峰，2.29 ppm处是丙酮峰；化学位移在
1.0-1.5处是Rha上C6的信号峰；化学位移在3.5-4.5是糖环上除异头氢外所有的氢的峰；化学位移在4.5-5.5处是异头氢的信号峰；C13-NMR谱图如图1D所示，图1D中上图是dept 135谱图，图1E是BB谱图。dept135图中，化学位移31.5处是内标丙酮信号峰。化学位移在60-65 ppm之间的倒峰是Glc或Gal的C6的峰。65-90 ppm之间是非异头碳的信号峰。90-110 ppm是异头碳的信号峰。BB谱的信号与dept135信号一样。多出的216 ppm化学位移是丙酮的信号峰。
[0006] 实施例2：果胶抑制人原代成纤维细胞BJ细胞经过H2O2诱导的衰老标志物beta-galactosidase的活性1）成纤维细胞的培养和衰老模型诱导：
人皮肤原代细胞BJ 细胞系购买自ATCC（59899913）。BJ细胞用含有10%(v/v)胎牛血清、
1%(v/v)的青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基培养。在37度，含有5%的二氧化碳和3%氧气的培养箱中无菌培养。用于评估的细胞初始传代数低于第5代（P5）；
BJ细胞的衰老用H2O2来模拟活性氧胁迫。用1200μM浓度的H2O2添加于培养基处理BJ细胞2小时，来诱导活性氧诱导的衰老。实验起始，用40000个细胞培养于2 ml完全培养基，铺板于6孔板中培养。实验初期，定义为第0天。实验总计设置5组平行组。第一组设置为空白对照组，一直用标准培养方法培养，每24小时换一次细胞培养液；第二组、第三组为供第四组和第五组H2O2处理后提供更换的培养液；第四组为只用H2O2处理诱导活性氧胁迫产生的组别；第五组为1200μM H2O2与果胶共同处理的组别。第二组和第三组在更换培养基后就不再参与实验。需要注意的是，果胶在整个过程中一直添加；果胶的最终浓度为1mg/ml。在培养到第4天的时候，用倒置显微镜拍照，随机选择9个区域，每个区域拍照9张，进行统计；
2）1 mg/ml果胶抗H2O2诱导的衰老结果：
在实验的第1天，用1200μM H2O2处理BJ成纤维细胞2小时后，继续培养72小时，诱导使得BJ细胞的beta-galactosidase的活性升高，在x-gal染色中，使得18.1%的BJ细胞呈现衰老状态。而x-gal染色中，一直用果胶培养的BJ细胞用1200μM H2O2处理2小时后，继续培养72小时没有明显的细胞衰老染色，，呈现阳性染色的细胞比率0.98%，与对照的1.04%比率没有统计学差异。
人皮肤原代细胞BJ 细胞系购买自ATCC（59899913）。BJ细胞用含有10%(v/v)胎牛血清、
1%(v/v)的青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基培养。在37度，含有5%的二氧化碳和3%氧气的培养箱中无菌培养。用于评估的细胞初始传代数低于第5代（P5）；
BJ细胞的衰老用H2O2来模拟活性氧胁迫。用1200μM浓度的H2O2添加于培养基处理BJ细胞2小时，来诱导活性氧诱导的衰老。实验起始，用40000个细胞培养于2 ml完全培养基，铺板于6孔板中培养。实验初期，定义为第0天。实验总计设置5组平行组。第一组设置为空白对照组，一直用标准培养方法培养，每24小时换一次细胞培养液；第二组、第三组为供第四组和第五组H2O2处理后提供更换的培养液；第四组为只用H2O2处理诱导活性氧胁迫产生的组别；第五组为1200μM H2O2与果胶共同处理的组别。第二组和第三组在更换培养基后就不再参与实验。需要注意的是，果胶在整个过程中一直添加；果胶的最终浓度为1mg/ml。在培养到第4天的时候，用倒置显微镜拍照，随机选择9个区域，每个区域拍照9张，进行统计；
2）1 mg/ml果胶抗H2O2诱导的衰老结果：
在实验的第1天，用1200μM H2O2处理BJ成纤维细胞2小时后，继续培养72小时，诱导使得BJ细胞的beta-galactosidase的活性升高，在x-gal染色中，使得18.1%的BJ细胞呈现衰老状态。而x-gal染色中，一直用果胶培养的BJ细胞用1200μM H2O2处理2小时后，继续培养72小时没有明显的细胞衰老染色，，呈现阳性染色的细胞比率0.98%，与对照的1.04%比率没有统计学差异。
[0007] 实施例3：果胶下调人原代成纤维细胞BJ细胞抗衰老中衰老标志Dec-1的表达水平的结果图图3 果胶抑制了H2O2诱导的衰老细胞DEC-1蛋白的上升
1）细胞培养和细胞蛋白提取
人皮肤原代细胞BJ 细胞系购买自ATCC（59899913）。BJ细胞用含有10%(v/v)胎牛血清、
1%(v/v)的青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基培养。在37度，含有5%的二氧化碳和3%氧气的培养箱中无菌培养。用于评估的细胞初始传代数低于第5代（P5）；
BJ细胞的衰老用H2O2来模拟活性氧胁迫。用1200μM浓度的H2O2添加于培养基处理BJ细胞2小时，来诱导活性氧诱导的衰老。实验起始，用40000个细胞培养于2 ml完全培养基，铺板于6孔板中培养。实验初期，定义为第0天。实验总计设置5组平行组。第一组设置为空白对照组，一直用标准培养方法培养，每24小时换一次细胞培养液；第二组、第三组为供第四组和第五组H2O2处理后提供更换的培养液；第四组为只用H2O2处理诱导活性氧胁迫产生的组别；第五组为1200μM H2O2与果胶共同处理的组别。第二组和第三组在更换培养基后就不再参与实验。需要注意的是，果胶在整个过程中一直添加；果胶的最终浓度为1 mg/ml。在培养到第4天的时候，用抽取细胞的蛋白质，用western blot法检测衰老标志物DEC-1的表达，用beta-actin作为内参蛋白；
2）1 mg/ml果胶抑制了H2O2处理的BJ细胞中衰老标志蛋白的累积
在实验的第1天，用1200μM H2O2处理BJ成纤维细胞2小时后，继续培养72小时，收集的细胞蛋白质，用免疫印迹即western blot方法比较了细胞衰老蛋白标志物DEC-1的表达；
结果表明，1200μM H2O2处理BJ成纤维细胞2小时后，继续培养72小时后，显著累积了BJ成纤维细胞中衰老标志蛋白DEC-1的表达。而果胶的添加抑制了1200μM H2O2诱导的这种衰老标志蛋白DEC-1的累积。
1）细胞培养和细胞蛋白提取
人皮肤原代细胞BJ 细胞系购买自ATCC（59899913）。BJ细胞用含有10%(v/v)胎牛血清、
1%(v/v)的青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基培养。在37度，含有5%的二氧化碳和3%氧气的培养箱中无菌培养。用于评估的细胞初始传代数低于第5代（P5）；
BJ细胞的衰老用H2O2来模拟活性氧胁迫。用1200μM浓度的H2O2添加于培养基处理BJ细胞2小时，来诱导活性氧诱导的衰老。实验起始，用40000个细胞培养于2 ml完全培养基，铺板于6孔板中培养。实验初期，定义为第0天。实验总计设置5组平行组。第一组设置为空白对照组，一直用标准培养方法培养，每24小时换一次细胞培养液；第二组、第三组为供第四组和第五组H2O2处理后提供更换的培养液；第四组为只用H2O2处理诱导活性氧胁迫产生的组别；第五组为1200μM H2O2与果胶共同处理的组别。第二组和第三组在更换培养基后就不再参与实验。需要注意的是，果胶在整个过程中一直添加；果胶的最终浓度为1 mg/ml。在培养到第4天的时候，用抽取细胞的蛋白质，用western blot法检测衰老标志物DEC-1的表达，用beta-actin作为内参蛋白；
2）1 mg/ml果胶抑制了H2O2处理的BJ细胞中衰老标志蛋白的累积
在实验的第1天，用1200μM H2O2处理BJ成纤维细胞2小时后，继续培养72小时，收集的细胞蛋白质，用免疫印迹即western blot方法比较了细胞衰老蛋白标志物DEC-1的表达；
结果表明，1200μM H2O2处理BJ成纤维细胞2小时后，继续培养72小时后，显著累积了BJ成纤维细胞中衰老标志蛋白DEC-1的表达。而果胶的添加抑制了1200μM H2O2诱导的这种衰老标志蛋白DEC-1的累积。
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