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一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法

阅读：1040发布：2020-11-24

专利汇可以提供一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，主要包括如下步骤：（1）制备含胎牛血清、人表皮生长因子，人碱性成纤维样细胞生长因子和达氏鲟鱼血清的pH值为7.2-7.4的MEM培养液，于4℃ 冰箱保存备用；（2）从达氏鲟鱼体内分离出脾脏组织，采用组织块培养法进行原代培养；（3）待细胞生长形成单层，底部覆盖率70%以上时，用0.25%胰酶消化进行传代培养；（4）对生长旺盛，形态均一的脾脏细胞进行液氮冷冻保存及复苏培养。本发明构建的脾脏组织细胞系，增殖快速，形态多呈成纤维样，可连续传代，并可冻存复苏。该构建方法技术简单，易操作，可推广到其它鲟鱼类脾脏细胞的培养，还可望用于达氏鲟物种资源保护及鲟鱼疾病病原尤其是病毒病原的分离鉴定。，下面是一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：制备专用培养液，细胞的原代培养，细胞的传代培养以及细胞的冷冻保存和复苏，
（1）专用培养液的具体制备步骤为：选取健康的达氏鲟，尾静脉取血，分离出的血清过滤除菌后将该达氏鲟鱼血清、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子添加到Minimum Essential Medium 的基础培养液中，制备成达氏鲟脾脏细胞完全培养液，置于4℃保存备用；
（2）细胞原代培养的具体步骤为：选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70%乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用过量的的青霉素和链霉素，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏组织剪
3
成1mm的小块，在25℃下，采用胰蛋白酶和胶原酶的混合物对脾脏组织消化5-8分钟，再将脾脏组织置于步骤（1）的专用培养液中进行悬浮，收集脾脏组织块均匀接种于培养瓶中，
25℃下倒置干贴6小时后加步骤（1）制备的专用培养液启动脾脏组织原代培养，培养2-3d后，得到原代培养的脾脏组织细胞；
（3）细胞传代培养的具体步骤为：待脾脏组织细胞从组织块周围迁出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70%以上时，开始第1次传代，先吸出所有组织块和培养液，用无菌磷酸缓冲液洗涤两次，再加入质量浓度0.25%胰酶溶液，25℃培箱中消化1-3分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，加入步骤（1）中的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1200r/min离心3-6分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25℃培养箱中进行传代培养，每隔3-4d，重复一次传代培养的步骤，得到传代培养的细胞；
（4）细胞的冷冻保存和复苏具体步骤为：在Minimum Essential Medium 基础培养液中加入二甲基亚砜，胎牛血清，青霉素、链霉素、两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取传代培养的细胞，加入胰酶溶液消化2分钟后按照（3）中传代培养的步骤操作得到细胞沉淀，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，再转入冻存管中，将冻存管放入冻存盒中进行连续降温后，再放入液氮超低温保存；复苏时，取出冷冻的细胞直接投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，将该细胞沉淀转移至培养瓶中，加入步骤（1）中的专用培养液，且每
12-24小时后更换新鲜达氏鲟脾脏细胞专用培养液，得到贴壁生长的达氏鲟脾脏组织细胞，即，完成达氏鲟脾脏组织细胞系的构建。
2.如权利要求1所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1）中，所述的达氏鲟鱼血清的体积浓度为0.5%，胎牛血清的体积浓度为30%、青霉素的浓度为200 IU/ml、链霉素的浓度为200 IU/ml、两性霉素B浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子浓度为
20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml。
3.如权利要求2所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，按体积分数计体积浓度为0.5%的达氏鲟鱼血清200-300μl、体积浓度为30%的胎牛血清10-18ml、
10000 IU/ml的青霉素0.6-1.4ml、10000 IU/ml的链霉素0.6-1.4ml、12.5μg/ml的两性霉素B 0.6-1.4ml、10μg/ml的人表皮生长因子80-120μl、10μg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子80-120μl、Minimum Essential Medium 基础培养液30-33ml。
4.如权利要求2所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，按体积分数计体积浓度为0.5%的达氏鲟鱼血清250μl、体积浓度为30%的胎牛血清15ml、10000 IU/ml的青霉素1ml、10000 IU/ml的链霉素1ml、12.5μg/ml的两性霉素B 1ml、10μg/ml的人表皮生长因子100μl、10μg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子100μl、Minimum Essential Medium 基础培养液31.55ml。
5.如权利要求1所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2）中，所述的青霉素和链霉素的浓度均为500IU/ml，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸的浓度为
1.25μg/ml。
6.如权利要求1所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2）中，所述的胰蛋白酶和胶原酶的混合物为质量浓度为0.0625%-0.25%胰蛋白酶与质量浓度为
0.08%-0.1%胶原酶Ⅱ按体积为1：1的混合物。
7.如权利要求1所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，步骤4）中，所述的二甲基亚砜的体积浓度为10%，胎牛血清的体积浓度为30%，青霉素的浓度为200 IU/ml，链霉素的浓度为200 IU/ml，两性霉素B的浓度为0.5μg/ml，胰酶的质量浓度为0.25%。
8.如权利要求7所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，按体积比计，体积浓度为10%的二甲基亚砜80-120μl、10000 IU/ml的青霉素15-23μl、10000 IU/ml的链霉素15-25μl、12.5μg/ml的两性霉素B 15-23μl、质量浓度为0.25%胰酶1.8-2.5ml。
9.如权利要求7所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，按体积比计，体积浓度为10%的二甲基亚砜100μl、10000 IU/ml的青霉素20μl、10000 IU/ml的链霉素20μl、12.5μg/ml的两性霉素B 20μl、质量浓度为0.25%胰酶2ml。
10.如权利要求1所述的达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，步骤4）中，所述的连续降温步骤为将置有细胞沉淀的冻存盒先在4℃冰箱中平衡10分钟，然后在-80℃超低温冰箱中置4小时以上，再将冻存管放入液氮面平衡5分钟，最后将冻存管转入液氮中，进行长期保存。

说明书全文

一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

[0002] 达氏鲟(Acipenser dabryanus)又名长江鲟，主要分布在长江中上游干流及金沙江下游，为我国特有鱼类，具有重要的物种价值，被列为国家Ⅰ级保护的水生野生动物。由于过度捕捞、水体污染、水利工程兴建等原因，长江流域中达氏鲟的资源已极为稀少，随着长江上游及金沙江水电工程的建设，其天然资源将受到更加严峻的威胁，如能冷冻保存其卵子或者胚胎，无疑对保护濒危达氏鲟物种是很有意义的。但通常由于野生达氏鲟很难获得成对的成熟亲本，甚至很难得到存活的个体，且卵子或者胚胎的冷冻保存技术难以攻克，迫切需要其它技术来弥补现有技术的不足。对于鱼类来说，保存的细胞既可以长期传代，又可以通过冻存来减少保藏带来的物资消耗。在细胞水平保存物种为未来濒危物种的复活提供了可能。因此，构建濒危鱼类细胞系显得十分必要，既是解决鱼类种质资源保存、可持续繁衍和挽救濒危物种的有效途径之一，也对探索珍稀濒危水生物种种质资源保存具有重要的指导意义，目前，有关脾脏细胞系的构建仅在花鲈、石斑鱼、高首鲟等少数鱼类中有过相关报道，而本发明针对像达氏鲟这种濒危鲟鱼类物种，以达氏鲟脾脏组织为材料，提供了一种适用于达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，此法也可供中华鲟、白鲟等鲟鱼类细胞培养提供参照。

发明内容

[0003] 本发明的目的是利用达氏鲟脾脏组织，提供一种达氏鲟脾脏细胞系的构建方法，以满足对达氏鲟及其它濒危鱼类物种保护研究的需要。

[0004] 本发明的构建方法，包括以下步骤：制备专用培养液，细胞的原代培养，细胞的传代培养以及细胞的冷冻保存和复苏，

[0005] (1)专用培养液制备的具体步骤为：选取健康的达氏鲟，尾静脉取血，分离出的血清过滤除菌后将该达氏鲟鱼血清、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子添加到Minimum Essential Medium的基础培养液中，制备成达氏鲟脾脏细胞完全培养液，置于4℃保存备用；所述的达氏鲟鱼血清的体积浓度为0.5％，胎牛血清的体积浓度为30％、青霉素的浓度为200IU/ml、链霉素的浓度为200IU/ml、两性霉素B浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml。步骤1)中，所述的达氏鲟鱼血清的体积浓度为0.5％，胎牛血清的体积浓度为30％、青霉素的浓度为200IU/ml、链霉素的浓度为200IU/ml、两性霉素B浓度为
0.5μg/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml。

[0006] 按体积分数计体积浓度为0.5％的达氏鲟鱼血清200-300μl、体积浓度为30％的胎牛血清10-18ml、10000IU/ml的青霉素0.6-1.4ml、10000IU/ml的链霉素0.6-1.4ml、12.5μg/ml的两性霉素B 0.6-1.4ml、10μg/ml的人表皮生长因子80-120μl、10μg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子80-120μl、Minimum Essential Medium基础培养液30-33ml。
进一步优选为：体积浓度为0.5％的达氏鲟鱼血清250μl、体积浓度为30％的胎牛血清
15ml、10000IU/ml的青霉素1ml、10000IU/ml的链霉素1ml、12.5μg/ml的两性霉素B 1ml、
10μg/ml的人表皮生长因子100μl、10μg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子100μl、Minimum Essential Medium基础培养液31.55ml。

[0007] (2)细胞原代培养的具体步骤为：选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70％乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用过量的的青霉素和链霉素，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏3
组织剪成1mm的小块，在25℃下，采用胰蛋白酶和胶原酶的混合物对脾脏组织消化5-8分钟，再将脾脏组织置于步骤(1)的专用培养液中进行悬浮，收集脾脏组织块均匀接种于培养瓶中，25℃下倒置干贴6小时后加步骤(1)制备的专用培养液启动脾脏组织原代培养，培养2-3d后，显微镜镜下可见大量细胞从组织块中迁移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样(图1-A)，及得到原代培养的脾脏组织细胞。

[0008] 该步骤中，所述的青霉素和链霉素的浓度均为500IU/m，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸的浓度为1.25μg/ml。所述的胰蛋白酶和胶原酶的混合物为质量浓度为0.0625％-0.25％胰蛋白酶与质量浓度为0.08％-0.1％胶原酶Ⅱ按体积为1：1的混合物。

[0009] (3)细胞传代培养的具体步骤为：待脾脏组织细胞从组织块周围迁出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70％以上时，开始第1次传代，先吸出所有组织块和培养液，用无菌磷酸缓冲液洗涤两次，再加入质量浓度0.25％胰酶溶液，25℃培箱中消化1-3分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，加入步骤(1)中的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1200r/min离心3-6分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25℃培养箱中进行传代培养，培养3-4d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样，为长条形或梭形(图1-B)。之后，每隔3-4d，重复一次按照(3)中传代培养的步骤，得到传代培养的细胞。

[0010] (4)细胞的冷冻保存和复苏具体步骤为：在MEM基础培养液中二甲基亚砜，胎牛血清，l青霉素、链霉素、两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取传代培养的细胞，加入胰酶溶液消化2分钟后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞沉淀，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，再转入冻存管中，将冻存管放入冻存盒中先在4℃冰箱中平衡10分钟，然后在-80℃超低温冰箱中置4小时以上，再将冻存管放入液氮面平衡5分钟，最后将冻存管转入液氮中，长期保存。细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，直接投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，将该细胞沉淀转移至培养瓶中，加入步骤(1)中的专用培养液，且每12-24小时后更换新鲜达氏鲟脾脏细胞专用培养液，直到得到达氏鲟脾脏组织细胞，即可完成达氏鲟脾脏组织细胞系的构建。

[0011] 该步骤中，所述的二甲基亚砜的体积浓度为10％，胎牛血清的体积浓度为30％，青霉素的浓度为200IU/ml，链霉素的浓度为200IU/ml，两性霉素B的浓度为0.5μg/ml，胰酶的质量浓度为0.25％，所述的二甲基亚砜的体积浓度为10％，胎牛血清的体积浓度为30％，青霉素的浓度为200IU/ml，链霉素的浓度为200IU/ml，两性霉素B的浓度为0.5μg/ml，胰酶的质量浓度为0.25％。

[0012] 按体积比计，体积浓度为10％的二甲基亚砜80-120μl、10000IU/ml的青霉素15-23μl、10000IU/ml的链霉素15-25μl、12.5μg/ml的两性霉素B 15-23μl、质量浓度为0.25％胰酶1.8-2.5ml。进一步优选为体积浓度为10％的二甲基亚砜100μl、10000IU/ml的青霉素20μl、10000IU/ml的链霉素20μl、12.5μg/ml的两性霉素B 20μl、质量浓度为0.25％胰酶2ml。

[0013] 技术原理：该培养方法是指从达氏鲟体内组织取出细胞，模拟体内出现的环境，在无菌，适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。不同物种，即便同一种物种不同组织的细胞及原代细胞和传代细胞之间在培养基及培养的环境条件都有所差异。

[0014] 本发明与已有技术对比，其优点在于：

[0015] (1)目前除本发明外，国内外尚无达氏鲟脾脏细胞培养的报道，本发明建立的达氏鲟脾脏细胞培养方法也适用于中华鲟、白鲟等其它鲟鱼。

[0016] (2)本发明方法，其所述的制备的培养液中添加了20ng/ml人表皮生长因子和20ng/ml人碱性成纤维样细胞生长因子以及5％的达氏鲟鱼血清。

[0017] (3)本发明构建的方法，其所述的原代培养步骤中需对组织块用浓度为0.0625％-0.25％的胰蛋白酶和0.08％-0.1％胶原酶Ⅱ联合消化5-8分钟。

[0018] (4)本发明构建的达氏鲟脾脏细胞系增殖速度快，可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，既可为鲟鱼类种质资源保存的相关研究奠定技术基础，又可作为鲟鱼病毒病体外研究的理想材料。附图说明

[0019] 图1为实施例1脾脏组织细胞，其中，图1-A为达氏鲟脾脏组织细胞原代培养的细胞形态；

[0020] 图1-B为第1次传代后脾脏细胞的形态。

[0021] 图2为实施例1达氏鲟脾脏组织细胞密度。

[0022] 图3为实施例1达氏鲟脾脏组织细胞直径。

具体实施方式

[0023] 本发明的技术方案具体实施例如下。

[0024] 对于像达氏鲟这种濒危物种通常是很难获得成对的成熟野生亲本，甚至很难得到存活的个体。为了尽力挽救这些濒危物种资源，该专利通过构建达氏鲟脾脏细胞系，在细胞水平上更加完整的保持生物体的遗传信息，为未来濒危物种的复活提供了可能，为更好的保护达氏鲟种质资源提供技术支撑。从长远来讲，这对达氏鲟资源的恢复和保护具有十分重要的意义。

[0025] 实施例1

[0026] 实施对象：

[0027] 1龄人工养殖达氏鲟幼鱼脾脏组织，实验鱼全长48cm，体长37.5cm，体重0.4kg。

[0028] 达氏鲟脾脏细胞专用培养液的制备：

[0029] 选取健康的达氏鲟，尾静脉取血2ml，将分离出的血清用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌备用，取Minimum Essential Medium(MEM)基础培养液31.55ml，向其中添加经过滤除菌的达氏鲟鱼血清250μl、胎牛血清15ml、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子，使达氏鲟鱼血清体积浓度占专用培养液体积的5％，胎牛血清体积浓度占专用培养液体积的30％，青霉素和链霉素的质量浓度均为200IU/ml、两性霉素B质量浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子质量浓度均为20ng/ml，制备成达氏鲟脾脏细胞专用培养液，置于4℃保存备用；

[0030] 细胞原代培养：

[0031] 选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70％乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用含浓度均为500IU/ml的青霉素和链霉素，浓度为1.25μg/ml的两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾3
脏组织剪成1mm的小块，将浓度为0.125％的胰蛋白酶和0.1％胶原酶Ⅱ按体积为1：1配比混合后，25℃对脾脏组织消化6分钟，用步骤(1)制备的专用培养液充分悬浮，收集组织
2
块均匀接种于多个25cm培养瓶中，25℃下倒置干贴6小时后加5ml步骤(1)制备的专用培养液启动原代培养，培养2d后，显微镜下可见大量细胞从组织块中迁移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样(图1-A)。

[0032] 细胞传代培养：

[0033] 待细胞从组织块周围迁出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70％以上时，开始第1次传代。先吸出所有组织块和培养液，用3ml的无菌磷酸缓冲液洗涤两次，加入质量浓度0.25％胰酶溶液2ml，25℃培箱中消化2分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，迅速加入3ml的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1200r/min离心4分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25℃培养箱中进行传代培养。培养4d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样，为长条形或梭形(图1-B)。
之后，按照(3)中传代培养的步骤，每隔4d传代一次。

[0034] 细胞的冷冻保存和复苏：

[0035] 在MEM基础培养液中添加体积浓度为10％二甲基亚砜，体积浓度为30％胎牛血清，200IU/ml青霉素和链霉素、0.5μg/ml两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取对数期生长的细胞，加入质量浓度0.25％胰酶溶液消化2分钟，之后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞悬液，取少许的细胞悬液，用scepter 2.0细胞计数器测定得到6
细胞的密度和直径(图2)，然后调节细胞密度约为5×10/ml，离心去上清，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，转入2ml冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，先在4℃冰箱中平衡
10分钟，之后在-80℃超低温冰箱中置6小时，再将冻存管放入液氮面平衡5分钟，最后将冻存管转入液氮中，长期保存。细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，转移至培养瓶中培养观察，为了去除DMSO对细胞的毒害，在25℃培养箱培养20小时后，更换新鲜脾脏细胞专用培养液，得到复苏后贴壁快速，形态均一的达氏鲟脾脏组织细胞。

[0036] 实施例2

[0037] 实施对象：

[0038] 1龄人工养殖达氏鲟幼鱼脾脏组织，实验鱼全长43.5cm，体长34.5cm，体重0.4kg。

[0039] 达氏鲟脾脏细胞专用培养液的制备：

[0040] 选取健康的达氏鲟，抽取尾静脉血1.5ml，将分离出的血清过滤除菌备用，取Minimum Essential Medium(MEM)基础培养液31.4ml，向其中添加经过滤除菌的达氏鲟鱼血清500μl、胎牛血清15ml、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子，使达氏鲟鱼血清体积浓度占专用培养液体积的10％，胎牛血清体积浓度占专用培养液体积的30％，青霉素和链霉素的质量浓度均为200IU/ml、两性霉素B质量浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子质量浓度均为10ng/ml，制备成达氏鲟脾脏细胞专用培养液，置于4℃保存备用；

[0041] 细胞原代培养：

[0042] 选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴20分钟，再用75％乙醇擦拭鱼体表面1分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用含浓度均为500IU/ml的青霉素和链霉素，浓度为1.25μg/ml的两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将浓度为0.0625％的胰蛋白酶和0.08％胶原酶Ⅱ按体积为1：1配比混合后，22℃对脾脏组织消化10分钟，用步骤(1)制备的专用培养液中和过量的胰蛋白酶消化液和胶原酶Ⅱ的混合消3 2
化液，后将脾脏组织剪成1mm的小块，收集组织块均匀接种于多个25cm 培养瓶中，22℃下倒置干贴4小时后加5ml步骤(1)制备的专用培养液启动原代培养，培养2d后，显微镜下可见部分细胞从组织块中迁移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样。

[0043] 细胞传代培养：

[0044] 待细胞从组织块周围迁出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70％以上时，开始第1次传代。先吸出所有组织块和培养液，用3ml的无菌磷酸缓冲液洗涤两次，加入质量浓度0.25％胰酶溶液2ml，22℃培箱中消化1分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，迅速加入3ml的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1000r/min离心5分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，22℃培养箱中进行传代培养。培养3d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样，为长条形或梭形之后，按照(3)中传代培养的步骤，每隔5d传代一次。

[0045] 细胞的冷冻保存和复苏：

[0046] 在MEM基础培养液中添加体积浓度为10％二甲基亚砜，体积浓度为20％胎牛血清，200IU/ml青霉素和链霉素、0.5μg/ml两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取对数期生长的细胞，加入质量浓度0.25％胰酶溶液消化1分钟，之后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞悬液，取少许的细胞悬液，测定细胞的密度和直径，调节细胞密度至5×106/ml，离心去上清，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，转入2ml冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，先在4℃冰箱中平衡30分钟，然后在-80℃超低温冰箱中置4小时，最后将冻存管转入液氮中，长期保存，细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，转移至培养瓶中培养观察，24小时后更换新鲜达氏鲟脾脏细胞专用培养液，直到得到达氏鲟脾脏组织细胞，即可完成达氏鲟脾脏组织细胞系的构建。

[0047] 实施例3

[0048] 实施对象：

[0049] 1龄人工养殖达氏鲟幼鱼脾脏组织，实验鱼全长40cm，体长31.5cm，体重0.36kg。

[0050] 达氏鲟脾脏细胞专用培养液的制备：

[0051] 选取健康的达氏鲟，尾静脉取血2.5ml，将分离出的血清过滤除菌备用，取Minimum Essential Medium(MEM)基础培养液31.45ml，向其中添加经过滤除菌的达氏鲟鱼血清400μl、胎牛血清15ml、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子，使达氏鲟鱼血清体积浓度占专用培养液体积的8％，胎牛血清体积浓度占专用培养液体积的30％，青霉素和链霉素的质量浓度均为200IU/ml、两性霉素B质量浓度为
0.5μg/ml、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子质量浓度均为15ng/ml，制备成达氏鲟脾脏细胞专用培养液，置于4℃保存备用；

[0052] 细胞原代培养：

[0053] 选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用75％乙醇擦拭鱼体表面1分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用含浓度均为500IU/ml的青霉素和链霉素，浓度为1.25μg/ml的两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾3
脏组织剪成1mm的小块，将浓度为0.25％的胰蛋白酶和0.08％胶原酶Ⅱ按体积为1：1配比混合后，24℃对脾脏组织消化8分钟，用步骤(1)制备的专用培养液充分悬浮，收集组织
2
块均匀接种于多个25cm培养瓶中，24℃下倒置干贴4.5小时后加5ml步骤(1)制备的专用培养液启动原代培养，培养5d后，显微镜下可见大量细胞从组织块中迁移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样。

[0054] 细胞传代培养：

[0055] 待细胞从组织块周围迁出形成单层，铺满70％的瓶底时，开始第1次传代。先吸出所有组织块和培养液，用3ml的无菌磷酸缓冲液洗涤两次，加入质量浓度0.25％胰酶溶液1ml，24℃培箱中消化2分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，迅速加入3ml的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1000r/min离心3分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，24℃培养箱中进行传代培养。培养
3d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样。之后，按照(3)中传代培养的步骤，每隔4d传代一次。

[0056] 细胞的冷冻保存和复苏：

[0057] 在MEM基础培养液中添加体积浓度为10％二甲基亚砜，体积浓度为30％胎牛血清，200IU/ml青霉素和链霉素、0.5μg/ml两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取对数期生长的细胞，加入质量浓度0.25％胰酶溶液消化2分钟，之后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞悬液，取少许的细胞悬液，测定细胞的密度和直径，调节细胞密度至5×106/ml，离心去上清，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，转入2ml冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，先在4℃冰箱中平衡30分钟，然后在液氮面平衡5分钟，最后将冻存管转入液氮中，长期保存，细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，转移至培养瓶中培养观察，18小时后更换新鲜达氏鲟脾脏细胞专用培养液，直到得到达氏鲟脾脏组织细胞，即可完成达氏鲟脾脏组织细胞系的构建。

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一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法

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