[0002]本发明一般性地涉及在中性条件下具有活性的(neutral-active)可溶的透明 质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、其中的部分，特别是透明质酸酶结构域。更特别地， 本发明涉及化学修饰、药物组合物、表达质粒、制造方法和治疗方法，其中将透 明质酸酶糖蛋白和其结构域以及编码核酸分子应用于在疾病治疗中糖胺聚糖的治 疗性的修饰以及增加直径小于200纳米的其它注射分子在动物中的扩散。

[0003]糖胺聚糖(GAGs)是胞外基质(ECM)中复杂的线性多糖。GAG的特征为重复 的二糖结构，二糖结构由N-取代的氨基己糖和糖醛酸组成[透明质酸(HA)、硫酸 软骨素(CS)、软骨素(C)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(H)]或由N- 取代的氨基己糖和半乳糖组成[硫酸角质素(KS)]。除了HA之外，所有均共价结 合于核心蛋白(core proteins)。GAG连同它们的核心蛋白在结构上被称为蛋白多 糖(PGs)。

[0004]透明质酸(HA)主要发现于哺乳动物的结缔组织、皮肤、软骨中以及滑液中。 透明质酸也是眼睛玻璃体的主要组成成分。在结缔组织中，与透明质酸相关的水 合作用的水产生了组织之间的空间，从而为细胞运动和增殖创造了有利的环境。 透明质酸在与细胞运动有关的生物学现象中发挥关键作用，这些细胞运动包括快 速发育(rapid development)、再生、修复、胚胎发生、胚胎发育、伤口愈合、血 管生成和肿瘤发生(Toole 1991 Cell Biol.Extracell.Matrix，Hay(ed)，Plenum Press， New York，1384-1386；Bertrand et al.1992 Int.J.Cancer 52：1-6；Knudson et al，1993 FASEB J.7：1233-1241)。此外，透明质酸水平与肿瘤入侵(tumor aggressiveness) 有关(Ozello et al.1960 Cancer Res.20：600-604；Takeuchi et al.1976，Cancer Res. 36：2133-2139；Kimata et al.1983 Cancer Res.43：1347-1354)。

[0005]HA发现于许多细胞的胞外基质中，尤其是软结缔组织中。已发现HA具有 多种生理学功能，诸如在水和血浆蛋白质的动态平衡方面(Laurent TC et al(1992) FASEB J 6：2397-2404)。HA的产生增加了细胞繁殖，并可能在有丝分裂中发挥作 用。这已在运动(locomotion)和细胞迁移中得到启示。HA似乎在细胞调控、发 育和分化中发挥作用(Laurent et al，supra)。

[0006]HA已经被用于临床医学中。它的组织保护特性和流变特性已经证明可用于 眼科手术中，以在白内障手术中保护角膜内皮。血清HA在肝病和各种炎症病症 如类风湿性关节炎中具有诊断作用。由HA的积聚引起的间质水肿可引起各种器 官的功能紊乱(Laurent et al，supra)。

[0007]透明质酸蛋白质相互作用也参与胞外基质或“基质(ground substance)”的 结构。

[0008]透明质酸酶是一组中性和酸性活性酶，在整个动物界都能被发现。透明质 酸酶在底物特异性和作用机制方面有所变化。

[0009]有3大类透明质酸酶：

[0010]1.哺乳动物类型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)，其是内-β-N-乙酰氨基己糖苷酶， 以四糖和己糖作为主要的终产物。它们具有水解和转糖苷酶活性，能够降解透明 质酸和硫酸软骨素(CS)，尤其是C4-S和C6-S。

[0011]2.细菌透明质酸酶(EC 4.2.99.1)降解透明质酸，并不同程度地降解CS和 DS。它们是内-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，它们通过β消去反应发挥作用，主要产生 二糖终产物。

[0012]3.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，其是内 -β-葡糖醛酸酶，通过水解β1-3键产生四糖和己糖终产物。

[0013]哺乳动物透明质酸酶可以进一步分为两组：中性活性(neutral active)和酸性 活性(acid active)酶。在人基因组中有六种透明质酸酶样基因：HYAL1、HYAL2、 HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，HYAL3对任何 已知的底物都没有显示出具有酶活性。HYAL4是软骨素酶(chondroitinase)，对透 明质酸缺少活性。HYAL1是原型酸性活性酶，PH20是原型中性活性酶。酸性活 性透明质酸酶，诸如HYAL1和HYAL2在中性pH中缺少催化活性。例如，HYAL1 在体外pH4.5以上无催化活性(Frost et al Anal Biochemistry，1997)。HYAL2是酸性 活性酶，在体外具有非常低的比活性。

[0014]透明质酸酶样(hyaluronidase-like)酶也可以表征为那些通过糖基磷脂酰肌 醇锚锁定到质膜上的酶，诸如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova，et al. Proc Natl Acad Sci USA.2003 Apr 15；100(8)：4580-5，Phelps et al.，Science 1988)，和 那些为可溶性的酶，诸如人HYAL1(Frost et al，Biochem Biophys Res Commun.1997 Jul 9；236(1)：10-5)。然而，种与种之间是有变化的：例如牛PH20非常松散地附着 到质膜，而不通过磷脂酶敏感性的锚(phospholipase sensitive anchor)被锚定 (Lalancette et al，Biol Reprod.2001 Aug；65(2)：628-36)。牛透明质酸酶的这一独特特 征使得可以使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为提取物用于临床应用(Wydase、 Hyalase)。其它种的PH20是脂锚定的酶，其在不应用去污剂或脂肪酶的情况下 是不具可溶性的。例如，人PH20通过GPI锚被锚定到质膜。已经尝试制备不会引 入脂类锚的人PH20 DNA构建物，但得到的是无催化活性的酶，或者不可溶的酶 (Arming et al Eur JBiochem.1997 Aug 1；247(3)：810-4)。发现天然存在的猕猴精子 透明质酸酶既可以是可溶性的，又可以是膜结合形式的。64kDa膜结合形式在pH 7.0时具有酶活性，而54kDa形式仅在pH 4.0时具有活性(Cherr et al，Dev Biol. 1996 Apr 10；175(1)：142-53)。因此，可溶性形式的PH20在中性条件下缺乏酶活性。

[0015]软骨素酶是在整个动物界都能发现的酶。这些酶通过内切糖苷酶反应降解 糖胺聚糖。已知的软骨素酶的具体例子包括软骨素酶ABC(来自普通变形杆菌 (Proteus vulgaris)；日本专利特开号6-153947，T.Yamagata，H.Saito，O.Habuchi，and S.Suzuki，J.Biol.Chem.，243，1523(1968)，S.Suzuki，H.Saito，T.Yamagata，K.Anno， N.Seno，Y.Kawai，and T.Furuhashi，J.Biol.Chem.，243，1543(1968))；软骨素酶AC (来自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)；T.Yamagata，H.Saito，O.Habuchi，and S.Suzuki，J.Biol.Chem.，243，1523(1968))；软骨素酶AC II(来自Arthrobacter aurescens；K.Hiyama，and S.Okada，J.Biol.Chem.，250，1824(1975)，K.Hiyama and S.Okada，J.Biochem.(Tokyo)，80，1201(1976))；透明质酸酶AC III(来自黄杆菌某种 Hp102；Hirofumi Miyazono，Hiroshi Kikuchi，Keiichi Yoshida，Kiyoshi Morikawa，and Kiyochika Tokuyasu，Seikagaku，61，1023(1989))；软骨素酶B(来自肝素黄杆菌；Y.M. Michelacci and C.P.Dietrich，Biochem.Biophys.Res.Commun.，56，973(1974)，Y.M. Michelacci and C.P.Dietrich，Biochem.J.，151，121(1975)，Kenichi Maeyama，Akira Tawada，Akiko Ueno，and Keiichi Yoshida，Seikagaku，57，1189(1985))；软骨素酶C (来自黄杆菌某种Hp102；Hirofumi Miyazono，Hiroshi Kikuchi，Kelichi Yoshida， Kiyoshi Morikawa，and Kiyochika Tokuyasu，Seikagaku，61，1023(1939))和类似物。

[0016]糖蛋白由共价结合到一个或多个碳水化合物部分的多肽链组成。有两大类 糖蛋白，其具有通过N-糖苷键或O-糖苷键偶联到它们的组成蛋白质上的碳水化合 物。N-连接和O-连接的聚糖分别通过天冬酰胺-N-乙酰-D-葡萄糖胺和丝氨酸(苏氨 酸)-N-乙酰-D-半乳糖胺连接附着到多肽上。复合的N-连接寡糖不含有末端甘露糖 残基。它们只含有末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸残基。杂合寡糖含有末 端甘露糖残基以及末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸残基。

[0017]对于N连接的糖蛋白，在内质网中的肽合成期间，寡糖前体被附着到天冬 酰胺的氨基基团上。寡糖部分继而由一系列特异性酶进行加工，剔除和增加糖组 成部分。该加工在内质网中进行，并在通过顺面、中间和反面高尔基体的过程中 继续被加工。发明概述

[0018]本文提供了可溶性的、中性活性的透明质酸酶糖蛋白家族的成员，特别地， 提供了人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(本文中也称为sHASEGPs)。本文中提供 的sHASEGP是sHASEGP家族成员，本文中命名为sHASEGP。本文也提供了可 溶性的透明质酸酶结构域及其应用。

[0019]本发明基于这样的发现，即，通过导入人PH20 cDNA的缺少一个狭窄区域 (narrow region)的核酸，可以在哺乳动物表达系统中高产量地产生中性活性的透 明质酸酶活性，所述狭窄区域编码羧基末端的氨基酸。也提供了对sHASEGP的额 外的修饰，以利用非天然的前导肽增加分泌。本发明还提供了方法，其通过用聚 乙二醇掩蔽蛋白质和对天然的糖基化进行翻译后修饰来修饰sHASEGP，以延长它 的半衰期。先前已经尝试过生产分泌的中性活性的人sHASEGP，但都是失败的。 其结果表明，将人sHASEGP多肽截短不但导致中性酶活性丧失，还导致在哺乳动 物表达系统中细胞不能分泌重组蛋白质(Arming，et al Eur J Biochem 1997 Aug 1； 247(3)：810-4)。产生中性活性的分泌型sHASEGP对于透明质酸酶的商业生产和治 疗应用是至关重要的，本文中公开的发明了克服这些挑战。

[0020]本发明还包括具有催化活性的人sHASEGP糖蛋白，其中，该sHASEGP具 有至少一个N-连接糖部分。本文中描述的研究证明，人PH20需要N-连接的聚糖 以获得催化活性，而牛和蜂毒透明质酸酶在没有这样的N-连接聚糖的情况下仍具 有活性。无N-连接部分的人透明质酸酶结构域是不具有催化活性的。因此，不像 蜂毒HASEGP，其可以在大肠杆菌中产生，经典的重组DNA技术不能产生具有 催化活性的人sHASEGP。

[0021]本发明包括用于产生N-连接的sHASEGP糖蛋白多肽的方法和细胞，其通 过使用能够引入所述N-连接糖部分的细胞来进行，或通过在sHASEGP多肽上引 入所述N-连接部分来进行。还公开了鉴定适当地糖基化的sHASEGP的方法。

[0022]本发明也提供了具有催化活性的超-唾液酸化的sHASEGP(Super-Sialated sHASEGP)糖蛋白。相比起天然发生的非唾液酸化的牛和羊睾丸sHASEGPs、超- 唾液酸化sHASEGPs具有更大的血清半衰期，因此对于酶稳定性和用作静脉内药 物是优选的。本发明提供了用于制备超-唾液酸化sHASEGPs、组合物的方法及其 应用方法。

[0023]本发明也提供了由天然GPI锚定缺陷型sHASEGP的拼接变体(splice variants)编码的蛋白质。

[0024]本发明还提供了sHASEGP的组合物，其包括携带有金属离子的可溶性 sHASEGP糖蛋白，其中，该金属离子是钙、镁或钠。sHASEGPs在所述离子存在 的条件下具有最佳活性。也提供了含有所述的金属离子和sHASEGP的制剂。

[0025]本发明也提供对sHASEGP所作的修饰，以进一步延长半衰期。提供了利 用聚合物诸如聚乙二醇和葡聚糖对sHASEGP的化学修饰。这样的修饰使得 sHASEGP不会从循环和免疫系统中清除出去，作为甘露糖的糖基化受体和脱唾液 酸糖蛋白。本发明还提供了方法，用来连接到特定的功能基团诸如糖基化位点、 带正电荷的氨基酸和半胱氨酸。

[0026]本文也提供了用于鉴定可调节sHASEGP的活化、表达或活性的效应子 (effectors)例如包括小分子在内的化合物和诸如pH、温度和离子强度的条件的 分析方法。在示范性的分析方法中，评价了受测化合物对sHASEGP透明质酸酶结 构域切割已知底物的能力的影响，所述的已知底物通常是糖胺聚糖或蛋白聚糖。 调节透明质酸酶结构域的活性的试剂，一般是化合物，特别是小分子，是调节 sHASEGP的活性的候选化合物。透明质酸酶结构域也可以被用于产生具有活性扰 乱功能的透明质酸酶特异抗体。本文中提供的透明质酸酶结构域包括但不限于， 具有被截短的C-末端部分的N-末端糖基水解酶结构域，其在体外显示出催化活性。

[0027]也提供了编码蛋白质和透明质酸酶结构域的核酸分子。提供了编码可溶性 透明质酸酶结构域或其催化活性部分的核酸分子和那些编码全长sHASEGP的核 酸分子。编码透明质酸酶结构域的核酸和下游核酸如SEQ ID No.6所描述； sHASEGP的透明质酸酶结构域如SEQ ID No.1(氨基酸35-464)所描述。全长 sHASEGP的蛋白质序列和编码核酸序列如SEQ ID No.1和6所描述。

[0028]本发明也提供了这样的核酸分子，其沿着sHASEGP的编码核酸的全长或 沿着全长的至少70％、80％或90％与此sHASEGP编码核酸杂交，提供了编码透明 质酸酶结构域或其中的部分的核酸分子。杂交通常是在至少低、通常至少中等、 常常是高的严紧(stringency)条件下完成。

[0029]分离的核酸片段是DNA，包括基因组DNA或cDNA，或是RNA，或可以 包括其他组分，诸如蛋白质核酸(protein nucleic acid)或其他核苷酸类似物。分离 的核酸可以包括额外的组分，诸如异源或天然的启动子，以及其它的转录和翻译 调控序列，这些基因可以被连接至其他基因，诸如报告基因或其他指示基因 (indicator genes)或编码指示物的基因。

[0030]本发明也提供了分离的核酸分子，其包括与编码sHASEGP或其部分的核 苷酸序列互补的分子的序列。

[0031]本发明也提供了其片段或寡核苷酸，其可以被用作探针或引物，包含至少 约10、14、16个核苷酸，一般少于1000个核苷酸或少于或等于100个核苷酸， 如SEQ ID NO.6(或其互补物)所述；或包含至少大约30个核苷酸(或其互补物)； 或包含沿着它们的全长(或其至少约70、80或90％)与任意此种片段或寡核苷酸杂 交的寡核苷酸。片段的长度与使用它们的目的和/或感兴趣的基因组的复杂程度有 关。通常，探针和引物包含少于约50、150或500个核苷酸。

[0032]本发明也提供了包含本文中提供的任何核酸分子的质粒。也提供了含有所 述质粒的细胞。这样的细胞包括但不限于，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植 物细胞、昆虫细胞和动物细胞。

[0033]本发明也提供了增强的哺乳动物表达系统，其应用了能够有效分泌 sHASEGP的信号前导肽(signal leaders)。这样的有效促分泌的前导肽氨基酸序列 以及与sHASEGP形成的融合蛋白的例子参见SEQ ID Nos.43和46。

[0034]本发明也提供了用于产生sHASEGP的方法，其通过将上述细胞在 sHASEGP可被细胞表达的条件下培养，并回收表达的sHASEGP多肽或糖蛋白而 进行。用于分离编码其它sHASEGPs的核酸的方法也被提供。

[0035]本发明也提供了sHASEGP多肽表达于其表面的细胞，通常是真核细胞， 诸如哺乳动物细胞和酵母细胞。这样的细胞被用于药物筛选分析，以鉴定可调节 sHASEGP多肽的活性的化合物。这些分析方法包括体外结合分析、基于转录的分 析，在其中，由sHASEGP直接或间接——例如通过活化原生长因子(pro-growth factors)——介导的信号转导得到评测。

[0036]本发明也提供了由这样的核酸分子编码的肽。包括在那些多肽中的是 sHASEGP透明质酸酶结构域，或具有氨基酸变化的多肽，而特异性和/或透明质酸 酶活性基本上未变化。特别地，提供了基本上纯的哺乳动物sHASEGP糖蛋白，其 包括分泌型中性催化活性。

[0037]本发明也包括透明质酸酶催化结构域，并且还可以包括其他结构域。 sHASEGP可以形成同型二聚体，也可以与一些其他蛋白诸如膜结合蛋白形成异型 二聚体。本发明也提供了基本上纯化的糖蛋白，包括与sHASEGP具有至少60％、 70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，其中，百 分同一性应用标准算法和缺口罚值(gap penalties)来确定，缺口罚值使百分同一 性最大化。

[0038]sHASEGP的拼接变体，特别是那些具有催化活性透明质酸酶结构域的变体 在本文中被考虑到。

[0039]在其他实施方案中，提供了基本上纯化的多肽，其包括sHASEGP多肽的 透明质酸酶结构域或其催化活性部分，但不包含SEQ ID No.1中描述的整个氨基酸 序列。属于此列的多肽，包括与SEQ ID No.1或3具有至少70％、80％、85％、90％、 95％或100％序列同一性的氨基酸序列。

[0040]在特定的实施方案中，提供了编码真核生物透明质酸酶糖蛋白的核酸，命 名为sHASEGP。特别地，所述核酸包括在SEQ ID No.6中描述的核苷酸序列，特 别地，SEQ ID NO.6的核苷酸106-1446所描述的核苷酸序列，或其中编码具有催 化活性的多肽的部分核苷酸序列。

[0041]本发明也提供了这样的核酸分子，其在至少低严紧性、通常中等严紧性、 更经常地为高严紧性的条件下与SEQ ID NO.6或其简并型(degenerates)杂交。

[0042]在一种实施方案中，分离的核酸片段在高严紧性的条件下，与包含SEQ ID No：6(或其简并型)所述的核苷酸序列的核酸分子杂交。全长sHASEGP描述于SEQ ID No.1中，并由SEQ ID NO.6或其简并型编码。

[0043]本发明也提供了sHASEGP的透明质酸酶结构域的突变蛋白，特别是这样 的突变蛋白，其中，透明质酸酶结构域的游离Cys残基(即，不与透明质酸酶结 构域中的任何其它Cys残基形成二硫键)被另一氨基酸取代基所取代，通常，尽 管不是必须的，是被保守的氨基酸取代基或不会消除活性的取代基所取代，还提 供了这样的突变蛋白，其中，特定的糖基化位点被去除。

[0044]sHASEGP多肽，包括但不限于其拼接变体，以及编码sHASEGPs及其结构 域、衍生物和类似物的核酸在本文中被提供。也提供了单链分泌型的透明质酸酶 糖蛋白，其具有在功能上与通过激活信号肽形成sHASEGP而产生的N-末端相等 价的N-末端。在sHASEGP的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处 具有7个潜在的N-连接糖基化位点，如SEQ ID NO：1中所例示。在半胱氨酸残基 C60-C351和半胱氨酸残基C224至C238之间形成二硫键，从而形成核心的透明质 酸酶结构域。然而，在羧基末端，额外的半胱氨酸对于中性酶催化活性是被要求 的，这样，在SEQ ID No.1中，从氨基酸36到Cys 464的sHASEGP构成了最小 化的活性人sHASEGP透明质酸酶结构域。因此，N-连接糖基化位点N-490对于适 当的sHASEGP活性并不是必需的。

[0045]sHASEGP的N-连接糖基化作用对于它们的催化活性和稳定性是至关重要 的。尽管改变修饰糖蛋白的聚糖的类型会对蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解性 和稳定性产生巨大的影响，然而大部分的酶并不被认为为了最佳酶活性而需要糖 基化作用。就此而言，sHASEGPs因而是独特的，去除N-连接糖基化作用可能导 致透明质酸酶活性几乎完全失活。N-连接聚糖的存在对于产生活性的sHASEGP是 至关重要的。本发明包括了适于将至关重要的N-连接糖基化残基引入sHASEGP 的蛋白质表达系统。此外，本发明也包括在能够引入N-连接聚糖的提取物存在的 条件下，引入去糖基化的sHASEGP多肽。在本发明的一个方面，描述了用唾液酸 化(sialation)加帽的复杂糖基化作用，而用游离甘露糖残基加帽的其它糖基化作 用也被考虑到。优选地，唾液酸残基被发现于sHASEGP的N-连接糖基化作用的 末端残基中。

[0046]N-连接的寡糖分为几个主要的类型(甘露寡糖(oligomannose)、复合的、杂 合的、硫酸化的)，它们都通过在-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)中的Asn 残基的酰胺氮附着于(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。已经报道过凝集蛋白C在 -Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化作用。在测序期间，N-连接位点常常可由“空白(blank)” 循环的出现而间接指示出来。可以在由PNGase F释放寡糖之后，进行阳性鉴定， PNGase F将糖基化Asn转变为Asp。PNGase F进行释放之后，N-连接的寡糖可以 用Bio-Gel P-6层析进行纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析 (HPAEC)(Townsend et al.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体可以用 HPAEC分离。在HPAEC层析谱中海藻糖残基将较早地变换洗脱位置，而其他唾 液酸残基将会增加滞留时间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-1酸 性糖蛋白、卵白蛋白、RNAse B、转铁蛋白)被同时进行处理，这将方便寡糖峰的 指认。收集到的寡糖可以用成分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征 (Waegheet al.，(1983)Carbohydr Res.123，281-304.)，利用NMR光谱术来测定端基异 构构造(anomeric configurations)(Van Halbeek(1993)in Methods Enzymol 230)。

[0047]本发明也提供了sHASEGP的制剂。sHASEGPs可以配制成冻干的形式和稳 定化的溶液。含有特定的金属离子诸如钙、镁或钠的制剂，可以用于在中性pH时 获得最佳活性。除了稳定化的溶液制剂外，缓慢释放的制剂也被考虑到，其可以 用于延长去除糖胺聚糖的过程。还提供了试剂盒，其提供了带有sHASEGP的预先 包装好的注射器，以便在眼内外科操作和其他小体积操作中给予小体积的 sHASEGP。本发明也提供了可离体用于人工再生技术程序(artificial reproductive technology procedures)的平衡盐制剂(Balanced salt formulations)。

[0048]本发明也提供了将sHASEGP用于去除糖胺聚糖的方法。sHASEGP通过降 解糖胺聚糖，在间隙中打开通道，使得尺寸小于500nm的分子得以扩散。取决于 剂量和制剂，这些通道可保持24-48小时。此种通道可以被用来协助外源添加的分 子的扩散，所述外源添加的分子例如流体、小分子、蛋白质、核酸和基因治疗载 体和其他尺寸小于500nm的分子。

[0049]sHASEGPs也可以被用于去除过量的糖胺聚糖，诸如在缺血再灌注、炎症、 动脉硬化、水肿、癌症、脊髓损伤和其他形式的创伤之后出现的那些糖胺聚糖。 在一些情况下，sHASEGP可以通过静脉灌输被全身性地传送。当局部位置不能到 达时，可能是有好处的，例如心脏或脑或在播散性肿瘤的情况下，其中，疾病是 全身性的。相对于缺少末端唾液酸的天然透明质酸酶，超唾液酸化的sHASEGP可 优选用于增加血清半衰期和分布。

[0050]在某些情形中，诸如在脊髓损伤、青光眼和妆容处理的情形中，优选进行 持续的传送。

[0051]在其他适应症中，优选单次短期作用剂量(single short acting dose)。暂时 地去除糖胺聚糖可以被用来增强将溶液和药物传送入间质空间。这对于麻醉剂的 扩散是有用的，对于治疗性流体、分子和蛋白质的给药也是有用的。在sHASEGP 存在的条件下，分子的皮下给药和肌内给药也帮助它们更快地分布于全身。当静 脉内途径不能被利用或需要分子更快地进行全身性传送时，此种方法是非常有用 的。其他大分子诸如因子VIII-其在皮下给药时的生物利用度很差——的传送 可以通过与sHASEGP一起注射来完成，从而增加它们的可利用度。

[0052]也提供了使用sHASEGP来酶促地去除卵母细胞周围的卵丘(积云)基质 (cumulus matrix)。使用提取得到的透明质酸酶的不含毒性污染物的纯化 sHASEGP来去除卵丘基质，可使得卵母细胞以更强的存活能力被更温和地收回。 而且，sHASEGP可以在不使用携带病毒和其他病原体诸如可传递的海绵状脑病的 牛提取物或其他生物体的情况下进行制备。

[0053]用于眼内用途的小体积的sHASEGP的注射，也可以应用于较小的空间。 SHASEGPs可以被注射入眼睛的眼睛前房，以去除在手术期间被施用的过量的粘 弹性底物。sHASEGP的眼内注射也可以被用于降低青光眼中的眼内压、溶解玻璃 体聚集物或“漂浮物”、清除玻璃体出血，用于治疗黄斑变性、促进糖尿病视网膜 病变中的玻璃体视网膜脱离、用于与其他酶相混合来促进角膜经矫正镜片的再塑。 将会认识到，在一些情况下，sHASEGP诸如聚乙二醇化的sHASEGP的持续长时 间的使用会是有利的。

[0054]sHASEGP与其他物质组成的联合制剂(co-formulations)也被考虑用作注射 笔(injectable pens)，以用于少量的或快速的皮下给药。可以被配制的例子诸如 Epipent、胰岛素和其他流体。本发明的方法包括，在给予其他治疗性分子之前、 同时或之后，给予sHASEGP多肽或含有sHASEGP的药物组合物。sHASEGP可 以在与其他治疗分子的给药位点不同的位点给药，或sHASEGP可以在与其他治疗 分子的给药位点相同的位点给药。

[0055]因此，本发明提供了命名为sHASEGP的真核细胞分泌型中性活性透明质 酸酶糖蛋白家族、以及其功能结构域，特别是其透明质酸酶(或催化)结构域、 突变蛋白和其他衍生物和类似物。也提供了编码sHASEGPs的核酸。此外，还提 供了所述sHASEGP的制剂和所述sHASEGP在治疗疾病中的治疗用途和作为组织 修饰酶的用途。附图简述

[0056]图1是sHASEGP载体HZ24的载体图。发明详述

[0057]A.定义：除非另外指出，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属技术 领域技术人员的常规理解具有相同的含义。除非另外指出，在本文的全部公开内 容中所引用的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、网址和 其他公开材料通过引用方式将其整体并入本文。如果对于本文中的术语有许多定 义，以这部分中的定义为主。

[0058]当引用URL或其他此种标识或编址时，应该理解的是，此种标识可以变化， 因特网上的特定信息可以来来往往，但是通过搜索因特网可以找到等同的信息。 因此，所述的引用证明了信息是可利用的且是公开传播的。

[0059]如本文中所使用的，除非另外指出，任何保护基团、氨基酸和其他化合物 的缩写依据它们的常规用法、标识缩写或IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(参见(1972)Biochem.11：942-944)。

[0060]如本文中所使用的，真核透明质酸酶是指各种不同家族的糖胺聚糖内切氨 基葡萄糖苷酶，其中，透明质酸酶中的谷氨酸残基通过酸-碱催化机制水解透明质 酸和硫酸软骨素的β-1，4键。

[0061]特别感兴趣的是哺乳动物的sHASEGP，包括人来源的sHASEGP。本领域 技术人员将认识到，一般来说，在多肽的非实质性区域的单个氨基酸替代基本上 不改变生物学活性(参见如Watson et al.，(1987)Molecular Biology of the Gene，4th Edition，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。

[0062]如本文中所使用的，膜锚定sHASEGP(membrane anchored sHASEGP)是 指膜锚定的透明质酸酶家族，其具有本文中描述的共同结构特征。

[0063]如本文中所使用的，可溶性透明质酸酶(soluble hyaluronidase)是指在生理 条件下具有溶解性的多肽。可溶性HASEGP例如可以通过它分配进入加温到37℃ 的Triton X-114溶液的水相而被辨别(Bordier et al J Biol Chem.1981 Feb 25；256 (4)：1604-7)。另一方面，脂锚定HASEGP(Lipid anchored HASEGP)将分配进入 富含去污剂的相，但在用磷脂酶C处理后，将分配进入缺乏去污剂的相或水相中。

[0064]因此，在对例如“sHASEGP”进行引用时，包括了由sHASEGP基因家族 编码的所有糖蛋白，包括但不限于：人sHASEGP、小鼠sHASEGP，或从任何其 他来源获得的等同分子，其或者合成制备而得，或者显示出同样的活性。示范性 的sHASEGP和/或其结构域的编码核酸分子序列和编码的氨基酸序列描述于例如 SEQ ID NO：4中。该术语也包括具有氨基酸替代的sHASEGP，所述替代基本上不 改变每一成员的活性，该术语也包含其拼接变体(splice variants)。合适的替代， 包括——尽管不一定是——氨基酸的保守替代，是本领域技术人员已道的，并且 这样的替代可以在不消除所得分子的生物活性诸如催化活性的情况下进行。

[0065]如本文中所使用的，在本文中无论什么时候被引用时，sHASEGP都包括至 少一个或所有或任何组合的下述物质：由SEQ ID NO.6中阐述的核苷酸序列编码 的多肽，或由包括编码SEQ ID No.1的氨基酸1-509的核苷酸的核苷酸序列编码的 多肽：由在低、中等或高严紧型条件下与SEQ ID NO.6中所述的核苷酸序列杂交 的核苷酸序列编码的多肽；包括SEQ ID No.1的氨基酸1-509所述的氨基酸序列的 多肽；包括与SEQ ID No.1中所述的氨基酸序列或SEQ ID No.4中的氨基酸1-448 的序列具有至少约60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％ 序列同一性的氨基酸序列的多肽。

[0066]特别地，提供了sHASEGP多肽，其具有SEQ ID No.4所示的透明质酸酶结 构域。该多肽是单链多肽或双链多肽。本发明也提供了保留有透明质酸酶活性的 其更小的部分。sHASEGPs的透明质酸酶结构域在尺寸上和构成上有所变化，可以 包括在表面环(surface loops)上的插入和缺失。因此，对于本文的目的，催化结 构域是sHASEGP的一部分，如本文中所定义，并且与先前已被鉴定的其他透明质 酸酶样序列(hyaluronidase like sequences)诸如HYAL1、HYAL2、HYAL3的结构 域相同源；然而，还未发现，分离的单链形式的人透明质酸酶结构域能在体外测 定中发挥功能。对活性而言所必需的天冬氨酸和谷氨酸残基存在于保守的基序 (motifs)中。

[0067]如本文中所使用的，“可溶性sHASEGP的中性透明质酸酶结构域(neutral hyaluronidase domain of a soluble sHASEGP)”是指sHASEGP的β-1，4内切氨基葡 萄糖苷酶结构域，其在中性pH中显示出透明质酸酶活性，在所述的条件下是可溶 性的，并且与透明质酸酶糖基-水解酶家族结构域具有同源性和共同的结构特征， 但在羧基末端含有额外的序列，这对于中性条件下的活性是必需的。因此，它至 少是在标准的体外分析评价中显示出透明质酸酶活性并保留可溶性的结构域的最 小化的部分。本文中所考虑的是这样的透明质酸酶结构域和其催化活性部分。本 发明也提供了截短形式的透明质酸酶结构域，包括其最小的片段，它以单链形式 发挥催化作用。

[0068]在本文中无论什么时候被引用，sHASEGP的透明质酸酶结构域都包括下述 多肽中的至少一个或所有或任何组合或催化活性部分：包括SEQ ID No.1所述的氨 基酸序列的N-连接糖蛋白多肽；由在低、中等或高严紧型条件下与SEQ ID NO.6 中所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的多肽；包括SEQ ID No.1中所述的氨 基酸序列的多肽；包括与SEQ ID No.1中所述的氨基酸序列具有至少约70％、75％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，和/ 或由sHASEGP的拼接变体编码的多肽的透明质酸酶结构域。

[0069]因此，对于本文的目的，透明质酸酶结构域是sHASEGP的一部分，如本 文中所定义，并且与其他sHASEGP的结构域同源。对于透明质酸酶家族的更大的 分类的酶，sHASEGP催化结构域享有高度的氨基酸序列同一性。对于活性所必需 的Asp和Glu残基存在于保守基序中。

[0070]至于活性形式，是指在体内和/或体外具有活性的形式。如本文中所描述的， 透明质酸酶结构域也能以可溶的分泌的糖蛋白的形式存在。本文已经显示，至少 在体外，单链形式的sHASEGP和其催化结构域或酶活性部分(通常C-末端截短) 显示出透明质酸酶活性。因此，本文中提供的是分离形式的sHASEGP的透明质酸 酶结构域，以及它们在体外药物筛选分析中的应用，所述体外药物筛选分析用于 鉴定调节其活性的试剂。

[0071]如本文中所使用的，sHASEGP的催化活性结构域是指中性活性的内切氨基 葡萄糖苷酶结构域，如通过针对糖胺聚糖底物的体外活性所限定的。

[0072]感兴趣的sHASEGPs包括那些在体内和体外对硫酸软骨素和硫酸软骨素 蛋白聚糖(CSPG′s)具有活性的sHASEGPs；和那些对透明质酸具有活性的 sHASEGPs。如本文中所使用的，人sHASEGP是由存在于人基因组中的核酸诸如 DNA编码的sHASEGP，包括所有的等位基因变体和保守变异，只要它们不是在 其他哺乳动物中发现的变体就可以。

[0073]如本文中所使用的，编码sHASEGP的透明质酸酶结构域或其催化活性部 分的核酸可解释为只编码所述单链透明质酸酶结构域或其活性部分的核酸，该核 酸不编码作为连续序列的sHASEGP的其他相邻部分。

[0074]如本文中所使用的，“疾病(disease)”或“紊乱(disorder)”指由例如感染 或遗传缺陷引起的生物体中的病理状态，并表征为可检测的症状。

[0075]如本文中所使用的，拼接变体(splice variant)是指对基因组核酸诸如DNA 的初级转录物进行不同的加工而产生的变体，通过所述的不同的加工可以产生一 种以上类型的mRNA。本文中提供了sHASEGPs的拼接变体。

[0076]如本文中所使用的，sHASEGP蛋白的透明质酸酶结构域是指显示出中性内 切氨基葡萄糖苷酶活性的sHASEGP透明质酸酶结构域。因此，它至少是蛋白质的 最小的部分，其显示出用标准的体外分析所评价的内切氨基葡萄糖苷酶活性。示 范性的人透明质酸酶结构域包括SEQ ID No.4所述的氨基酸序列的至少一个足以 显示出内切氨基葡萄糖苷酶活性的部分。

[0077]本发明也考虑了这样的核酸分子，其编码在体外透明质酸酶分析中具有内 切氨基葡萄糖苷酶活性的多肽，并且与全长的sHASEGP多肽透明质酸酶结构域具 有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或 其沿着它们的全长或沿着全长的至少约70％、80％或90％与编码透明质酸酶结构 域的核酸杂交，特别是在中等，通常为高严紧的条件下杂交。

[0078]对于透明质酸酶结构域，在N-末端区域的残基可能对活性是至关重要的， 但不是充分的。本文显示，sHASEGP的透明质酸酶结构域是具有催化活性的。因 此，为了具有活性，透明质酸酶结构域通常需要N-末端氨基酸；C-末端部分可以 被截短，直到最后的半胱氨酸残基还需要额外的氨基酸来获得最佳活性。通过用 评价催化切割的体外分析来测试多肽的透明质酸酶活性，可以被截去的数量可以 经验性地被确定。

[0079]因此，本发明考虑了透明质酸酶结构域特别是单链结构域的较小部分，其 保留透明质酸酶活性。这样的较小的形式一般是透明质酸酶结构域的C-端截短形 式。透明质酸酶结构域在尺寸和构成上有所变化，包括在表面环中的插入和缺失。 这样的结构域显示出保守的结构，包括至少一个结构特征，诸如质子供体，和/或 内切氨基葡萄糖苷酶的透明质酸酶结构域的其他特征。因此，对于本文目的，透 明质酸酶结构域是sHASEGP的一个单链部分，如本文中所述，但在它的结构特征 和序列类似性或同源性的保留方面与其他透明质酸酶样序列的透明质酸酶结构域 具有同源性。作为单链，该糖蛋白显示出透明质酸酶活性。

[0080]如本文中所使用的，同源性是指约大于25％的核酸序列同一性，诸如25％、 40％、60％、70％、80％、90％或95％。如果有必要的话，百分同源性将被明确说 明。术语“同源性(homology)”和“同一性(identity)”常常交换使用。总之， 将序列进行联配比对，以便获得最高级别的匹配。(参见如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing： Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993； Computer Analysis of Sequence Data，Part/，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.， Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje， G.，Academic Press，1987和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.， eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et Al.(1988)et al.(1988)Slam J Applied Math 48)：1073)。

[0081]依照序列同一性，保守氨基酸的数目通过标准的联配算法程序而被确定， 其中使用由各供应商设立的默认缺口罚值。基本上同源的核酸分子将通常沿着感 兴趣的核酸分子的全长或沿着全长的至少约70％、80％或90％，在中等严紧度或 高严紧度的条件下发生杂交。本发明也考虑了这样的核酸分子，其包含了简并密 码子来替代杂交核酸分子中的密码子。

[0082]两种核酸分子是否具有至少例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％ 或99％“同一性”的核苷酸序列，可以使用已知的计算机算法诸如“FASTA”程 序来确定，使用例如Pearson et al(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444中的 默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al，Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，[S.][F.，][ET AL，J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，[ED.，]Academic Press，San Diego，1994，[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例 如，美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) 数据库的BLAST功能可以被用于确定同一性。其他商业的或公用的程序包括 DNASTAR″MEGALIGN″PROGRAM(Madison，WI)和威斯康星大学Genetics Computer Group(UWG)″Gap″程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的百分同 源性或同一性可以例如通过使用GAP计算机程序来比较序列信息而得以测定， GAP计算机程序例如Needleman et al.(1970)，J Mol Biol.48：443，按照Smith and Waterman Adv.Appl.Math(1981)2：482的修改。简言之，GAP程序将相似性定义 为，相似的联配符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两条序列中较短的一条 中的符号总数。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较阵列(unary comparison matrix)(对于同一的情况，所包含的值为1，对于非同一的情况，值为 0)和Gribskov et al(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较阵列(weighted comparison matrix)，如Schwartz and Dayhoff，eds.，Atlas Of Protein Sequence And Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)描述；(2)每 一缺口的罚值为3.0，每一缺口中的每一符号的附加罚值为0.10；和(3)末端缺口 无罚值。因此，如本文中所使用的，术语“同一性”代表了受测和参考多肽或多 核苷酸之间的比较。

[0083]如本文中所使用的，术语“至少90％同一性”是指相对于参考多肽的90至 99.99的百分同一性。90％或更高水平的同一性表明这样一个事实，示例性地假设 100个氨基酸长的受测和参考多核苷酸被比较的话，在受测多核苷酸中不超过10％ (即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。在受测和参考多核苷 酸之间，可以进行类似的比较。这样的差异可以体现为在全长的氨基酸序列中随 机分布的点突变，或可以它们可以聚集在变化长度的一个或多个位置，最高可至 所允许的最大值，例如10/100的氨基酸差异(约90％同源性)。差异可以定义为核 酸或氨基酸的替代或缺失。在同源性或同一性的水平超过约85-90％时，结果应该 不依赖于程序和缺口参数设置。这样的高水平的同一性可以很容易进行评估，通 常不需要依靠软件。

[0084]如本文中所使用的，引物是指包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核 苷酸的寡核苷酸，通常大于3个，由所述引物可以启动引物延伸产物的合成。有 助于合成的实验条件包括存在核苷三磷酸和用于聚合反应和延伸的试剂，诸如 DNA聚合酶，以及合适的缓冲液、温度和pH。

[0085]如本文中所使用的，动物包括任何动物，诸如但不限于山羊、牛、鹿、绵 羊、啮齿类动物、猪和人。非人动物是指除了人之外的被考虑到的动物。所提供 的sHASEGPs来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大部分的sHASEGP 来源于动物，包括哺乳动物来源。

[0086]如本文中所使用的，遗传疗法涉及将异源核酸例如DNA转移到哺乳动物特 别是人的某些细胞，即靶细胞，所述动物具有此疗法所要解决的紊乱或症状。核 酸例如DNA以这样的方式导入所选择的靶细胞，即，使得该异源核酸例如DNA 被表达并且所编码的治疗性产物由此产生。

[0087]可选择地，异源核酸，例如DNA，可以以某方式介导编码治疗性产物的 DNA的表达，或它可以编码某产物，例如肽或RNA，其以某方式直接或间接地介 导治疗性产物的表达。遗传疗法也可以被用来传送编码某基因产物的核酸，其替 代缺陷的基因，或补充由导入有所述核酸的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导 入的核酸可以编码治疗化合物，诸如其生长因子抑制剂，或其肿瘤坏死因子或抑 制剂，诸如受体，这些治疗化合物一般情况下不产生于哺乳动物宿主中，或不以 治疗上有效的量或不在治疗上有用的时间产生。在导入到病痛的宿主的细胞中之 前，编码治疗性产物的异源核酸例如DNA可以被修饰，以增强或改变该产物或其 表达。遗传疗法也可以涉及传送基因表达的抑制剂或阻抑物或其他调节物。

[0088]如本文中所使用的，异源核酸是这样的核酸，该核酸和(如果DNA是编码 RNA)蛋白质在正常情况下不由表达所述异源核酸的细胞在体内产生，或者异源 核酸介导内源性核酸例如DNA的表达或编码改变内源性核酸例如DNA的表达的 调节物，所述介导或改变是通过影响转录、翻译或其他可调节的生物化学过程来 实现的。异源核酸，例如DNA，也可以称为外源核酸，例如DNA。本领域技术人 员将其识别为或考虑为对于表达它的细胞来说是异源的或外来的任何核酸例如 DNA，均包括在本文的异源核酸之内；异源核酸包括外源性加入的核酸，其也被 内源性表达。异源核酸的例子包括，但不限于：编码可追踪的标记蛋白的核酸， 所述的可追踪的标记蛋白例如赋予药物抗性的蛋白；编码治疗上有效的物质的核 酸，所述的治疗上有效的物质例如抗癌剂、酶和激素；和编码其他类型的蛋白例 如抗体的核酸，例如DNA。由异源核酸编码的抗体可以分泌或表达在已经导入有 该异源核酸的细胞的表面。

[0089]通常，异源核酸在遗传上对于导入它的细胞来说不是内源性的，但是已经 从别的细胞获得或通过合成制备得到。

[0090]一般地，尽管不是必需的，这样的核酸编码的RNA和蛋白质在正常情况下 不由表达它的细胞产生。

[0091]如本文中所使用的，治疗上有效的产物是由异源核酸——通常是DNA—— 编码的产物，一旦将该核酸导入到宿主中后，产物被表达，可缓解或消除作为遗 传疾病或获得性疾病的表现的症状，或者该产物治愈该疾病。

[0092]如本文中所使用的，糖蛋白基本上由透明质酸酶结构域组成的这一叙述是 指，仅仅多肽的sHASEGP部分是透明质酸酶结构域或其催化活性部分。该多肽可 以任选地——并且一般将包括——额外的非sHASEGP衍生的氨基酸序列。

[0093]如本文中所使用的，结构域(domain)是指分子例如糖蛋白或编码核酸的 某部分，其在结构上和/或功能上不同于该分子的其他部分。

[0094]如本文中所使用的，透明质酸酶(hyaluronidase)是指催化糖胺聚糖的水解 的酶。

[0095]为了清楚起见，引用透明质酸酶时，是表示所有的形式，特定的形式将被 特别地指出。对于本文的目的，透明质酸酶结构域包括膜结合的和可溶形式的 sHASEGP蛋白。

[0096]如本文中所使用的，核酸包括DNA、RNA和其类似物，包括蛋白核酸 (protein nucleic acids，PNA)和其混合物。核酸可以是单链或双链的。当指探针 或引物时——其用可检测的标记诸如荧光或放射性标记任选地标记，通常考虑单 链分子。这样的分子通常是这样的长度，即，其使得在探察或起动一个文库时它 们的靶标是统计上独特的或低拷贝数的(通常小于5，一般小于3)。一般地，探 针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的至少14、16或30个连续的序列。探 针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多的核苷酸。

[0097]如本文中所使用的，编码sHASEGP片段或部分的核酸是指仅编码所述的 sHASEGP片段或部分，但不编码sHASEGP的其他相邻部分的核酸。

[0098]如本文中所使用的，异源核酸与调节或效应(effector)核苷酸序列，例如 启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其他信号序列的有效连接(operative linkage)是指此种核酸例如DNA和此种核苷酸序列之间的关系。例如，异源DNA 与启动子的有效连接是指DNA和启动子之间的一种物理关系，依据这样的关系， 此种DNA的转录由RNA聚合酶从启动子处启动，所述RNA聚合酶特异性地识别、 结合并转录阅读框中的DNA。因此，有效连接或操作性地结合是指，核酸例如DNA 与调节和效应核苷酸序列例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点或其他信号 序列之间的功能关系。例如，DNA与启动子之间的有效连接是指DNA和启动子 之间的物理和功能关系，依据这样的关系，此种DNA的转录由RNA聚合酶从启 动子开始启动，所述RNA聚合酶特异性识别、结合并转录DNA。为了优化表达 和/或体外转录，可能有必要去除、添加或改变克隆的5’非翻译部分，以消除多余 的、潜在不合适的选择性翻译起始(即，起始)密码子或其他序列，这样密码子 或其他序列或在转录水平或在翻译水平干扰或减少表达。可选择地，共有的核糖 体结合位点(参见如Kozak J.Biol.Chem.266：19867-19870(1991))可以紧挨着起始 密码子的5′端插入，从而可以增强表达。对此种修饰的愿望(或需要)可以经验性 地被确定。

[0099]如本文中所使用的，与RNA的至少一部分相互补的序列，称为反义寡核苷 酸，是指这样的序列，其与RNA充分互补，能与RNA杂交，一般是在中等或高 严紧型条件下杂交，形成稳定的双螺旋；在双链sHASEGP反义核酸的情况下，可 以测试双螺旋DNA(或dsRNA)的单链，或可以分析三股螺旋的形成。杂交的能力 取决于互补的程度和反义核酸的长度。一般地，杂交核酸越长，它能够容纳的与 sHASEGP的编码RNA的错配越多，并且依然能形成稳定的双螺旋(或三股螺旋， 如果可能的话)。通过使用标准的程序去测定杂交复合体的熔点，本领域技术人员 可以确定错配的可容忍程度。

[0100]至于本文目的，只要所得到的蛋白质显示有透明质酸酶活性，氨基酸替代 可以在任何的sHASEGPs和其透明质酸酶结构域进行。所考虑的氨基酸替代包括 保守性替代，例如表1中所述的那些，其不会消除蛋白水解活性。如本文中所描 述的，也考虑了改变蛋白质的特性的替代，例如去除切割位点和其他此类位点。 此类替代一般是非保守的，但会容易地被本领域技术人员完成。

[0101]合适的氨基酸保守性替代是本领域技术人员已知的，一般可以在不改变所 得分子的生物活性如酶活性的情况下进行。本领域技术人员将认识到，一般来说， 在多肽的非必需区域进行的单个氨基酸的替代基本上不会改变生物学活性(参见 如Watson et al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。同样包括在该限定中的是，sHASEGP的催化 活性片段，特别是单链透明质酸酶部分。可以进行的保守的氨基酸替代例如下面 表1所述。

[0102]表1原始残基保守性替代Ala(A)Gly；Ser，Abu Arg(R) Lys，orn Asn(N) Gln；His Cys(C)Ser Gin(Q)Asn Glu(E)ASP Gly(G)Ala；Pro His(H)Asn；Gin Ile (I)Leu；Val；Met；Nle；Nva Leu(L)；Val；Met；Nle；Nv Lys(K)Arg；Gin；Glu Met(M)Leu；Tyr；Ile；NLe Val Ornitine Lys；Arg Phe(F)Met；Leu；Tyr Set(S)Thr Thr(T)Ser Trp(W)Tyr Tyr(Y)Trp；Phe Val(V)ILE；Leu；Met；Nle；Nv。其他的 替代也是允许的，并可以经验性地确定，或根据已知的保守替代来确定。

[0103]如本文中所使用的，Abu是2-氨基丁酸；Orn是鸟氨酸。如本文中所使用 的，本文中出现的各种氨基酸序列中的氨基酸是根据它们公知的三字母或一字母 缩写来表示的。出现在各种DNA片段中的核苷酸，是用本领域常规使用的标准的 单字母标识来表示的。

[0104]如本文中所使用的，基于公开于本文中的核苷酸序列的探针或引物，包括 SEQ ID NO.6的至少10、14，通常至少16个连续的核苷酸序列，SEQ ID NO.6的 至少30、50或100个连续的核苷酸序列的探针。用于特定杂交的探针或引物的长 度是感兴趣的基因组的复杂度的函数。

[0105]如本文中所使用的，通过给予特定的药物组合物而导致的特定紊乱的症状 的缓解是指归因为组合物的给予或与组合物的给予相关的任何的减轻，无论是永 久的还是暂时的，持续的还是瞬时的。

[0106]如本文中所使用的，反义多核苷酸是指合成的核苷酸碱基序列，其与mRNA 或双链DNA的有义链相互补。有义和反义多核苷酸的混合物在合适的条件下导致 两分子的结合或杂交。当这些多核苷酸与mRNA结合(杂交)时，蛋白质合成(翻 译)的抑制发生。当这些多核苷酸结合到双链DNA时，RNA合成(转录)的抑 制发生。

[0107]所产生的翻译和/或转录的抑制作用抑制了有义链编码的蛋白质的合成。反 义核酸分子通常含有足够数目的核苷酸来特异性地结合目标核酸，通常有至少5 个连续的核苷酸，常常至少14或16或30个连续的核苷酸或修饰的核苷酸，与编 码感兴趣的基因的核酸分子的编码区域相互补，例如与编码sHASEGP的单链透明 质酸酶结构域的核酸互补。

[0108]如本文中所使用的，阵列是指元素例如抗体的集合，其含有3个或更多的 成员。可寻址阵列(addressable array)是这样的阵列，在其中，阵列的成员一般 可以通过在固相支持物上的位置而被鉴定。因此，一般而言，阵列的成员被固定 在固相表面的离散的可鉴定的位点上。

[0109]如本文中所使用的，抗体指免疫球蛋白，其是天然的或者部分或全部合成 产生的，包括它们的保留有抗体特异性结合能力的任何衍生物。因此，抗体包括 具有结合结构域的任何蛋白质，所述结合结构域与免疫球蛋白结合结构域同源或 基本上同源。抗体包括任何免疫球蛋白的成员，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

[0110]如本文中所使用的，抗体片段是指抗体的任何衍生物，其小于全长抗体， 保留了全长抗体的特异性结合能力的至少一部分。抗体片段的例子包括，但不限 于Fab、Fab′、F(AB)2、单链Fvs(scFV)、FV、dsFV双功能抗体和Fd片段。片段可 以包括例如通过二硫桥连接在一起的多条链。抗体片段通常含有至少50个氨基酸， 典型地含有至少200个氨基酸。

[0111]如本文中所使用的，Fv抗体片段是由一个可变重链结构域(VH)和一个可变 轻链结构域通过非共价相互作用联系在一起而组成。

[0112]如本文中所使用的，dsFV是指具有工程制造的分子间二硫键的Fv。

[0113]如本文中所使用的，F(AB)2片段是用胃蛋白酶在pH 4.0-4.5消化免疫球蛋 白而得到的抗体片段；它可以通过重组方法来表达，从而产生等同的片段。

[0114]如本文中所使用的，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而得到的抗体 片段；它们可以通过重组方法被表达，从而产生等同的片段。

[0115]如本文中所使用的，scFVs是指含有以任何顺序通过多肽连接子共价联系在 一起的可变轻链V和可变重链(VH)的抗体片段。该连接子的长度可以使两个可 变结构域在基本上无干扰的情况下连接起来。所述的连接子包括(Gly-Ser)n残基， 其中遍布着一些Glu或Lys残基，以增加溶解性。

[0116]如本文中所使用的，人源化抗体是指经修饰而包括人氨基酸序列的抗体， 这样，施用于人时不会引起免疫应答。制备此种抗体的方法是已知的。例如，为 了产生此种抗体，表达单克隆抗体的杂交瘤或其他原核或真核细胞诸如大肠杆菌 或CHO细胞，可以用重组DNA技术来改变以表达这样的抗体，在其中非可变区 的氨基酸组成是基于人抗体。已经设计出计算机程序来鉴定这样的区域。

[0117]如本文中所使用的，双功能抗体(diabodies)是二聚体的scFV；双功能抗 体通常具有比scFVs短的肽连接子，且它们一般是二聚体化。

[0118]如本文中所使用的，通过使用重组DNA方法的重组手段的生产，是指使用 已知的分子生物学方法来表达由克隆DNA编码的蛋白质。

[0119]如本文中所使用的，术语“评价(assessing)”旨在包括定量和定性测定， 这是为了获得存在于样品中的sHASEGP或其结构域的活性的绝对值，也可为了获 得表征活性的水平的指数、比率、百分比、视觉结果或其他值。评价可以是直接 的或间接的，实际被检测的化学物质当然不必一定是蛋白质水解产物本身，可以 例如是其衍生物或一些其他的物质。

[0120]如本文中所使用的，生物活性是指化合物的体内活性或由于体内给予化合 物、组合物或其他混合物而引起的生理应答。因此，生物活性包括此种化合物、 组合物和混合物的治疗效果和药物学活性。生物活性可以采用被设计用来测试或 应用此种活性的体外系统来观察。因此，对于本文的目的，荧光素酶的生物活性 是它的加氧酶活性，一旦底物被氧化之后，便产生光。

[0121]如本文中所使用的，功能活性是指多肽或其部分，其显示出一种或多种与 全长蛋白质相关的活性。

[0122]功能活性包括，但不限于生物活性、催化或酶活性、抗原性(结合多肽或与 多肽竞争来结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、特异性地结 合多肽的受体或配体的能力。

[0123]如本文中所使用的，共轭物(conjugate)指本文中提供的包括一个或多个 sHASEGP的化合物，其包括sHASEGP，特别是其单链透明质酸酶结构域和一种 或多种靶向试剂(targeting agents)。这些共轭物包括由重组方法产生的那些共轭物， 如融合蛋白；由化学方法产生的那些共轭物，例如通过化学偶联产生的，如通过 偶联到巯基基团；以及那些由其他任何方法产生的，其中至少一个sHASEGP或其 结构域通过连接子直接或间接地连接到靶向试剂。

[0124]如本文中所使用的，靶向试剂是任何组成部分(moiety)，例如蛋白质或其 有效部分，其特异性地将该共轭物结合于细胞表面受体，这可以使该共轭物或其 sHASEGP部分内在化。靶向试剂也可以是例如促进或帮助共轭物亲合分离或纯化、 将共轭物附着到表面、或检测共轭物或含有共轭物的复合物的试剂。

[0125]如本文中所使用的，抗体共轭物是指其中的靶向试剂是抗体的共轭物。

[0126]如本文中所使用的，分子的衍生物或类似物是指从分子衍生而来的一部分 或修饰形式的分子。

[0127]如本文中所使用的，用于治疗特定疾病的化合物的有效量是指这样的量， 其足以改善或以某方式减少与疾病相关的症状。这样的量可以以单次剂量被施给 或可以依据疗程被施给，并因此产生效果。该数量可以治愈疾病，但通常，是为 了改善疾病的症状而施用。反复的施用可能是为了获得理想的症状改善效果所必 需的。

[0128]如本文中所使用的，“等同的(equivalent)”，当用于两个核酸序列时，是指 这两条在研究中的序列编码同样序列的氨基酸或等同的蛋白质。当“等同的”一 词用于两个蛋白质或肽时，它是指这两个蛋白质或肽具有基本上相同的氨基酸序 列，只有基本上不改变蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸替代(例如但不限于保 守替代，诸如上面表1所述的)。当“等同的”一词用于性质时，该性质不必以相 同的程度存在(例如，两个肽对于相同类型的酶活性，可以显示出不同的速率)， 但活性通常是基本上相同的。“互补的(Complementary)”，当用于两条核苷酸序 列时，是指这两条核苷酸序列能够杂交，通常在相对的核苷酸之间具有小于25％、 15％、5％或0％的错配。如果必要的话，互补的百分比将被指明。通常，所选择 的这两个分子可以在高严紧的条件下杂交。

[0129]如本文中所使用的，调节蛋白的活性或者基因或核酸的表达的试剂，降低 或增加或者改变蛋白质的活性，或以某方式上调或下调或者改变核酸在细胞中的 表达。

[0130]如本文中所使用的，sHASEGP活性的抑制剂包括抑制或减少sHASEGP的 产生、翻译后加工修饰、成熟或膜定位的任何物质，或者干扰或降低其蛋白水解 效率——特别是在体外筛选分析中单链形式的蛋白的水解效率——的任何物质。

[0131]如本文中所使用的，用于治疗或预防肿瘤性疾病的方法是指，任何的症状 例如肿瘤、其转移、肿瘤的血管化作用或表征该疾病的其他参数被降低、改善、 预防、置于缓解的状态、或维持在缓解的状态。也指肿瘤性疾病和转移的特征 (hallmarks)可以通过该治疗而被消除、减少或预防。所述特征的非限制性的例 子包括基底膜(basement membrane)和附近的胞外基质不受控制的降解，内皮细 胞迁移、分裂和组织成新的功能化毛细管，以及这样的功能化毛细管的维持。

[0132]如本文中所使用的，共轭物的药学上可接收的盐、酯或其他衍生物包括任 何的盐、酯或衍生物，它们可以由本领域技术人员使用已知的用于这样的衍生化 作用的方法容易地制备得到，这样所产生的化合物能够施用于动物或人而基本上 没有毒性效应，并且它们或者具有药物学活性或者是药物前体。

[0133]如本文中所使用的，药物前体是指这样的化合物，其被体内施用之后，被 代谢或转化为具有生物活性、药物学活性或治疗活性形式的化合物。为了产生药 物前体，药物活性化合物被修饰，以便该活性化合物通过代谢过程被再生。药物 前体可以被设计以改变药物的代谢稳定性或运送特征、以掩蔽副作用或毒性、以 改善药物的风味，或者以改变药物的其他特征或性质。依据药物动力过程和体内 药物代谢的知识，一旦知道了该药学活性化合物，本领域技术人员便可以设计该 化合物的药物前体(参见如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages 388-392)。

[0134]如本文中所使用的，用本文中提供的筛选方法鉴定的药物，是指任何化合 物，其是用作治疗剂或用作用于设计治疗剂的先导化合物的候选化合物。此类化 合物可以是小分子，包括小的有机分子、肽、肽模拟物、反义分子或dsRNA，例 如RNAi、抗体、抗体片段、重组抗体和其他此类化合物，其可以充当药物候选者 或先导化合物。

[0135]如本文中所使用的，肽模拟物(peptidomimetic)是这样的化合物，其模拟 生物活性形式的特定肽的构象和某些立体化学特征。总的来说，肽模拟物被设计 用来模拟化合物的某些期望的特性，但不模拟不想要的特性，诸如可导致生物活 性构象丧失和键断裂的柔性。肽模拟物可以通过用生物等排物(bioisosteres)取代 形成不想要的特性的某些基团或键，由生物活性化合物制备得到。生物等排物是 本领域技术人员已知的。例如，亚甲基生物等排物CH2S已在脑啡肽类似物中被 用作酰胺取代(参见如Spatola(1983)pp.267-357in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，Weistein，Ed.volume 7，Marcel Dekker，New York)。吗啡，可以口服给药，是内啡肽的肽模拟物化合物。对于本文的目的，环 状肽被包括在肽模拟物之中。

[0136]如本文中所使用的，启动子区域或启动子元件是指控制与之有效连接的 DNA或RNA的转录的DNA或RNA片段。启动子区域包括特异性序列，其足以 被RNA聚合酶识别、结合和起始转录。

[0137]启动子区域的这一部分被称为启动子。此外，启动子区域包括调控RNA聚 合酶的这种识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用的，或 可以对反式作用因子作出反应。依据调控的性质，启动子可以是组成型的或可以 调控型的。被考虑用于原核生物的示范性启动子，包括噬菌体T7和T3启动子。

[0138]如本文中所使用的，受体是指对于给定的配体具有亲和力的分子。受体可 以是天然发生的或合成的分子。受体在本领域也可以指抗-配体(anti-ligands)。如 本文中所使用的，受体和抗-配体是可互换的。受体可以在它们的未加以改变的状 态下使用，或作为与其他物质的聚集体使用。受体可以直接地或通过特定的结合 物质或连接物而间接地，共价地或非共价地或以物理接触的方式附着到结合组分 上。受体的例子包括但不限于：抗体、细胞膜受体表面受体和内在化受体 (internalizing receptors)、单克隆抗体和对诸如病毒、细胞或其他物质、药物、多 核苷酸、核酸、肽、因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜和细胞器上的特异 性抗原决定簇具有活性的抗血清。

[0139]受体的例子和使用此类受体的应用的例子，包括但不限于：a)酶：对微生 物的存活至关重要的特定转运蛋白或酶，其可以充当抗生素[配体]选择的靶标；b) 抗体：抗体分子上的与感兴趣的抗原的表位相结合的配体结合位点的鉴定可以被 研究；通过模拟抗原表位的序列的测定可以开发出疫苗，其中免疫原是基于一种 或多种这样的序列，或可以开发出相关的诊断试剂或化合物，它们可以用于治疗 例如自免疫疾病(auto-immune diseases)；c)核酸：配体的鉴定，诸如蛋白质或 RNA，结合位点；d)催化多肽：聚合物，包括能够促进涉及将一种或多种反应物 转化为一种或多种产物的化学反应的多肽；这样的多肽一般包括对至少一种反应 物或反应中间产物具有特异性的结合位点，以及靠近该结合位点的功能活性，其 中，该功能性能够通过化学的方法修饰被结合的反应物(参见美国专利5,215,899)； e)激素受体：以高亲和力与受体相结合的配体的确定，可以用于开发激素替代疗 法；例如，通过对结合此类受体的配体的鉴定可以开发出控制血压的药物；和f)鸦 片受体：在脑中结合鸦片受体的配体的确定，可以用于开发出吗啡和相关毒品的 上瘾性较弱的替代品。

[0140]如本文中所使用的，样品是指含有分析物分析所期望的分析物的任何物质。 样品可以是生物学样品，例如生物流体或生物组织。生物流体的例子包括尿、血、 血浆、血清、唾液、精液、大便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液、精液、羊水或类 似物。生物组织是细胞的聚集体，通常是与它们的胞间物质一起形成的特定类型， 其构成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包括结缔组织、 上皮组织、肌肉和神经组织。生物组织的例子也包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉 和个体细胞。

[0141]如本文中所使用的：在测定错配百分比时的杂交严紧度描述如下：1)高严 紧度：0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃；2)中等严紧度：0.2×SspE，0.1％SDS，50℃； 3)低严紧度：1.0×SspE，0.1％SDS，50℃。本领域技术人员知道选择洗涤步骤对 稳定的杂交的选择作用，也知道SspE的成分(参见如Sambrook，E.F.Fritsch，T. Maniatis，in：Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol 3，p.B.13，也参见描述常规使用的实验室溶液的大量目录)。SspE是 pH 7.4的磷酸盐缓冲的0.18NaCl。进一步地，本领域技术人员知道杂交的稳定性 取决于TmT，它是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6+0.41(％G+C)-600/L))， 这样，在洗涤条件中仅有的对杂交稳定性至关重要的参数是SspE(或SSC)中的 钠离子浓度和温度。

[0142]应该理解的是，使用其它的缓冲液、盐和温度，可以获得等同的严紧度。 作为例子而不是为了限制，使用低严紧度的条件的程序如下(也参见Shilo and Weinberg，Proc.Natl.Acad Sci USA 78：6789-6792(1981))：含有DNA的滤膜在40℃ 预处理6小时，预处理在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500ug/ml变性鲑鱼精DNA(10×)的溶 液中进行，SSC是1.5M氯化钠和0.15M柠檬酸钠，调节到pH 7。

[0143]杂交在同样的溶液中进行，作下述修改：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％ BSA、100VG/M精子DNA、10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯和使用5-20×106cpm 32P- 标记的探针。滤膜在杂交混合物中40℃温育18-20小时，然后在55℃洗涤1.5小 时，洗涤在含有2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶 液中进行。洗涤溶液用新鲜溶液更换，在60℃再温育1.5小时。将滤膜进行斑点 干燥(blotted dry)并暴露以进行放射自显影。如果必要，滤膜可以在65-68℃进 行第三次洗涤，并再暴露于胶片。可以使用的低严紧度的其他条件是本领域已知 的，例如在种间交叉杂交(cross-species hybridizations)中所使用的。

[0144]作为例子而不是为了限制，使用中等严紧度的条件的程序包括但不限于： 含有DNA的滤膜在55℃预处理6小时，预处理在含有6×SSC、5×Denhart′s溶液、 0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中进行。杂交在同样的溶液中进行， 并使用5-20×106 32P标记的探针。滤膜在55℃在杂交化合物中温育18-20小时， 然后在60℃洗涤30分钟，洗涤2次，洗涤在含有1×SSC和0.1％SDS的溶液中进 行。将滤膜进行斑点干燥(blotted dry)并暴露以便放射自显影。可以使用的中等 严紧度的其他条件是本领域已知的。对滤膜的洗涤在37℃进行1小时，洗涤在含 有2×SSC、0.1％SDS的溶液中进行。

[0145]作为例子而不是为了限制，使用高严紧度的条件的程序描述如下：含有 DNA的滤膜的预杂交在65℃进行8小时至过夜，预杂交在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500ug/ml 变性鲑鱼精DNA组成的缓冲液中进行。滤膜在65℃杂交48小时，杂交在含有 100ug/ml变性鲑鱼精DNA和5-20×106CPM 32P标记探针的预杂交混合物中进行。 滤膜的洗涤在37℃进行1小时，洗涤在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和 0.01％BSA的溶液中进行。然后，在放射自显影之前，在50℃在0.1×SSC中洗涤 45分钟。可以使用的高严紧型的其他条件是本领域熟知的。

[0146]术语“基本上相同的”或“基本上同源的”或“类似的”随上下文而有所 变化，这是相关技术领域的技术人员所能理解的，一般是指至少60％或70％，优 选至少80％、85％，或更优选的至少90％，最优选至少95％的同一性。

[0147]如本文中所使用的，与产物基本上相同，是指足够地相似，以至于感兴趣 的特性不足以被改变，这样，该基本上相同的产物可以用于替代所述产物。

[0148]如本文中所使用的，基本上纯化的是指具有足够地匀质的，用标准的分析 方法进行测定时似乎没有可易被检测到的杂质，标准的分析方法诸如薄层层析 (TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)，它们被本领域技术人员用来评估此类纯 度，或指具有足够的纯度，以至于经过进一步的纯化作用，无法检测到物理和化 学特性的改变，诸如物质的酶活性或生物活性的改变。对化合物进行纯化以产生 化学上基本上纯的化合物的方法是本领域技术人员所知道的。化学上基本上纯的 化合物然而可以是立体异构体或异构体的混合物。在这样的情况下，进一步的纯 化可能增加混合物的比活性。

[0149]如本文中所使用的，目标细胞(或靶细胞)指体内表达sHASEGP的细胞。

[0150]如本文中所使用的，受测物质(或受测化合物)是指化学上定义的化合物 (例如有机分子、无机分子、有机/无机分子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、脂、 多糖、糖类，或这些分子的杂合物诸如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如受测化 合物文库、天然提取物或培养上清液等)，本文中提供了它们对sHASEGP，特别是 包括了透明质酸酶结构域的单链形式或其具有足够活性的部分的效应，这可以通 过体外方法例如本文所提供的分析方法进行测定。

[0151]如本文中所使用的，术语治疗剂、治疗方案、辐射防护剂或化学治疗剂是 指常规的药物和药物治疗，包括疫苗，其是本领域技术人员所知道的。辐射防护 剂是本领域已知的。

[0152]如本文中所使用的，治疗是指涉及状况、紊乱或疾病的症状得以改善或发 生其他有利改变的任何方式。

[0153]治疗也包括本文的组合物的任何药物学应用。

[0154]如本文中所使用的，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入到细胞中以 进行表达或复制的独立元件。载体通常保持为附加体(episomal)，但也可以被设 计成可以使得基因或其部分被整合入基因组染色体中。也考虑到人工染色体载体， 诸如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。此类载体的选择和使用对本领域技 术人员来说是熟知的。表达载体包括能够表达DNA的载体，该DNA与调控序列 有效连接，所述调控序列诸如启动子区域，其能够影响此类DNA片段的表达。因 此，表达载体是指重组的DNA或RNA构建物，诸如质粒、噬菌体、重组病毒或 其他载体，其一旦被导入合适的宿主细胞后，可以使克隆的DNA被表达。合适的 表达载体对本领域技术人员来说是公知的，包括那些在原核细胞和/或真核细胞中 可复制的载体，和那些保持为附加体的载体或那些整合入宿主细胞基因组的载体。

[0155]如本文中所使用的，蛋白质结合序列是指这样的蛋白质或肽序列，其能够 特异性结合到其他蛋白质或肽序列，一般地，是结合到一组蛋白质或肽序列，或 结合到特定的蛋白质或肽序列。

[0156]如本文中所使用的，表位标记(epitope tag)是指对应于表位的短的氨基酸 残基链，它们有利于随后对具有该表位标记的蛋白质或肽进行生化和免疫学分析。 通过将表位标记序列包括入合适表达载体中的蛋白质编码序列，可以完成对表位 的标记。表位标记的蛋白质可以用高特异性的抗体进行亲合纯化，所述抗体是用 该标记培育获得。

[0157]如本文中所使用的，金属结合序列是指这样的蛋白质或肽序列，其能够特 异性结合到金属离子，通常是一组金属离子，或结合到特定的金属离子。

[0158]如本文中所使用的，组合或联合(combination)指两个或更多个元素之间 的任何结合。

[0159]如本文中所使用的，组合物指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、 粉、糊，含水的、不含水的或其任何组合。

[0160]如本文中所使用的，流体指可以流动的任何组合物。因此流体包括半固体、 膏、溶液、水混合物、胶、洗液、乳液形式的组合物，和任何其他这样的组合物。

[0161]如本文中所使用的，细胞的提取物指由裂解的或破裂的细胞制得的制剂或 组分。

[0162]如本文中所使用的，当试剂是被随意选择而未考虑涉及单独蛋白质或蛋白 质同与之联系的底物、结合伴侣(binding partners)等的结合的特异性序列时，该 试剂被认为是随意选择的。随意选择的试剂的例子是使用化学文库或肽组合文库 (peptide combinatorial library)，或生物体的培养液或条件培养基。

[0163]如本文中所使用的，当试剂是在非随机的基础上被选择并考虑到了目标位 点的序列和/或它的与试剂的作用相关的构象时，该试剂被认为是理性选择的或设 计的。如描述于实施例中的，在具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的糖蛋白中， 提出了透明质酸酶结合位点和(催化)位点。通过利用构成这些位点的肽序列， 可以被理性地选择或理性地设计出试剂。例如，理性选择的肽试剂可以是其氨基 酸序列与ATP或钙调蛋白结合位点或结构域相同的肽。

[0164]寡糖被认为具有还原端和非还原端，无论在还原端的糖是否实际上是还原 糖。根据公认的命名法，本文在描述寡糖时将非还原端置于左边，将还原端置于 右边。本文在描述所有的寡糖时，使用了非还原糖的名字或缩写(例如Gal)，然后 是糖苷键的构型(α或β)、环键(ring bond)、在该键中涉及的还原糖的环位置， 然后是还原糖的名字或缩写(例如GlcNAc)。两个糖之间的连接可以表示为例如 2，3、2.fw darw.3或(2，3)。每个糖均为吡喃糖。

[0165]如本文中所使用的，N-连接糖部分(N-linked sugar moiety)是指通过Asn 残基的酰胺氮附着到sHASEGP的寡糖。N-连接寡糖分为几个主要的类型(甘露寡 糖、复合体、杂合物、硫酸化)，它们全都通过Asn残基的酰胺氮附着有(Man)3- GlcNAc-GlcNAc-核心，所述Asn残基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa不 是Pro)。在测序期间，N-连接位点常常可由“空白(blank)”循环的出现而间接指 示出来。可以在由PNGase F释放寡糖之后，进行阳性鉴定，PNGase F将糖基化 Asn转变为Asp。PNGase F进行释放之后，N-连接的寡糖可以用Bio-Gel P-6层析 进行纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析(HPAEC)(Townsend et al.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体可以用HPAEC分离。在HPAEC 层析谱中海藻糖残基将较早地变换洗脱位置，而其他唾液酸残基将会增加滞留时 间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-1酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAse B、转铁蛋白)被同时进行处理，这将方便寡糖峰的指认。收集到的寡糖可以用成 分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征(Waegheet al.，(1983)Carbohydr Res.123，281-304.)，利用NMR光谱术来测定端基异构构造(anomeric configurations)(Van Halbeek(1993)in Methods Enzymol 230)。

[0166]可选择地，寡糖可以用荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)进行鉴定。 Callewaert et al.(2001)Glycobiology 11，275-281。

[0167]如本文中所使用的，术语“唾液酸”指九碳羧基化糖(carboxylated sugars) 家族的任何成员。唾液酸家族最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3，5- 二脱氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-1-onic acid(常常缩写为Neu5Ac、NeuAc 或NANA)。该家族的另一个成员是N-羟乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其 中，NeuAc的N-乙酰基团被羟基化。唾液酸家族的第三个成员是2-酮-3-脱氧 -nonulosonic acid(KDN)(Nadano et al.(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557； Kanamori et al.(1990)J.Biol.Chem.265：21811-21819。该家族也包括9-取代的唾液 酸，诸如9-O-C.sub.1-C.sub.6酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰-Neu5Ac或9-O-乙酰 -Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。对于唾液酸家族的综 述，参见Varki(1992)Glycobiology 2：25-40；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，N.Y(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化 程序中的合成和应用公开于1992年10月1日公开的国际申请WO 92/16640中。

[0168]如本文中所使用的，PNGase是指天冬酰氨肽特异性N-糖苷酶F，诸如黄杆 菌maningoseptum肽-N-糖苷酶F。PNGASE酶的特征为对N-连接寡糖而不对O- 连接寡糖具有特异性。PNGASE效率的表征可以用SDS PAGE电泳或荧光辅助碳 水化合物电泳来限定。

[0169]如本文中所使用的，基本上末端化的唾液酸化作用(substantially terminated sialation)是指用唾液酸残基作为末端糖进行末端化处理的N-连接寡糖。末端唾液 酸可以通过用神经氨酸苷酶处理之后对释放的碳水化合物进行FACE分析来鉴定。

[0170]糖蛋白在血液中的循环寿命(circulatory lifetime)很大程度取决于它的N- 连接碳水化合物基团的组成和结构。该事实与打算经肠胃给药的治疗性糖蛋白直 接相关。一般来说，糖蛋白的最大循环半衰期要求它的N-连接碳水化合物基团以 序列NeuAc-Gal-GlcNAc终止。如果没有末端唾液酸(NeuAc)，糖蛋白通过涉及潜 在的N-乙酰半乳糖胺(GaINAc)或半乳糖(Gal)残基的识别的机制，迅速从血液中清 除掉(Goochee et al.(1991)Biol/Technology 9：1347-1355)。由于该原因，确保在治 疗性糖蛋白的N-连接碳水化合物基团上存在末端唾液酸，对于它们的商业开发是 重要的考虑因素。

[0171]循环中的糖蛋白被暴露于能去除末端唾液酸残基的唾液酸酶(或神经氨酸 苷酶)。通常，唾液酸的去除暴露半乳糖残基，这些残基被肝细胞中的半乳糖特异 性受体识别并结合(综述于Ashwell and Harford(1982)Ann.Rev.Biochem. 51：531)。肝脏也含有其他的糖特异性受体，其介导糖蛋白从循环中的清除。此类 受体的特异性也包括N-乙酰葡糖胺、甘露糖、海藻糖和磷酸甘露糖。通过肝细胞 的半乳糖受体而被清除的糖蛋白经历实质性的降解作用，然后进入胆汁；通过 Kupffer细胞的甘露糖受体而被清除的糖蛋白进入网状内皮系统(综述于Ashwell and Harford(1982)Ann.Rev.Biochem.51：53)。

[0172]如本文中所使用的，中性活性是指在pH 5和8之间，在盐小于150mM和 缓冲强度小于50mM的条件下，sHASEGP糖蛋白在体外对糖胺聚糖底物具有催化 活性。

[0173]如本文中所使用的，稳定的溶液是指在室温保存30天之后，保留大于60％ 的最初活性的sHASEGP。

[0174]如本文中所使用的，除非另外特别指出，单位用浊度降低单位(turbidity reducing units，TRU)来表示。一个TRU被定义为降低透明质酸的酸化溶液的浊 度所需要的透明质酸酶活性的量，并等同于U.S.P./National Formulary(NF XIII) units(MFU)。本文中描述的ELISA样酶分析可以通过经U.S.P.标准化的透明质酸酶 样品(例如USP或WHO标准)的标准曲线而与TRU、NFU和U.S.P.单位相关联。 因此，用ELISA样酶分析测定的酶活性实际上是相对TRU，因为酶活性不是用浊 度计分析实际测量得到的(Dorfman et al.，1948，J.Biol.Chem.172：367)。

[0175]如本文中所使用的，效价(potency)是用在体外降解底物所需要的sHASEGP 蛋白的量来定义的，其基于浊度降低单位或相对浊度降低单位(Relative Turbidity Reducing Unit)。

[0176]如本文中所使用的，比活性是指每毫克蛋白质的活性的单位数。sHASEGP 蛋白的量定义为在280nm处sHASEGP溶液的吸光度，假定摩尔消光系数为近似 1.7，单位为M-1cm-1。

[0177]聚乙二醇(PEG)已经被广泛用于生物材料、生物技术和医学中，主要是因为 PEG是生物可相容的、无毒的、无免疫原性的和水溶性的聚合物(Zhao and Harris， ACS Symposium Series 680：458-72，1997)。在药物传送领域，PEG衍生物已经被广 泛用于共价附着到蛋白质(即″聚乙二醇化作用″)，以减少免疫原性、蛋白水解和 肾清除，并增强溶解性(Zalipsky，Adv.Drug Del.Rev.16：157-82，1995)。类似地， PEG已经被附着到低分子量的、相对疏水的药物上，以增加溶解性、减少毒性和 改变生物分布(biodistribution)。通常，PEG化的药物作为溶液被注射。

[0178]紧密相关的应用是合成交联的可降解的PEG网络或制剂以用于药物传送， 用于设计可降解的可溶性药物载体的化学的许多方面也可以用于设计可降解的凝 胶(Sawhney et al.，Macromolecules 26：581-87，1993)。还知道，大分子间的复合体 可以通过混合两种互补的聚合物的溶液而形成。此类复合体一般通过所涉及的聚 合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(聚酸-聚碱)，和/或通过在 水环境中聚合物之间的疏水相互作用而得以稳定(Krupers et al.，Eur.Polym J.32： 785-790，1996)。例如，聚丙烯酸(PAAc)和聚氧乙烯(PEO)的混合溶液在合适的条件 下，主要基于氢键而形成复合体。这些复合体在生理条件的解离作用已经被用于 传送游离的(即，非PEG化的)药物。此外，互补聚合物的复合体已经由均聚物和 共聚物形成。

[0179]在一个方面，聚乙二醇的分子量在约3kD至约50kD范围内，优选约5kD 至约30kD范围内。通过已知的化学合成技术可将PEG共价附着到药物(称为“PEG 化”或“聚乙二醇化”)。例如，在本发明的一个方面，蛋白质的PEG化可以通过 在合适的反应条件下，通过将NHS活化的PEG与蛋白质反应而实现。

[0180]尽管已经描述了无数的关于PEG化作用的反应，那些最经常使用的反应是 赋予了方向性、使用温和的反应条件、并且不需要大量的下游工艺来去除毒性催 化剂或副产物的反应。例如，单甲氧PEG(mPEG)只有一个活性末端羟基，因此它 的使用一定程度地限制了所得到的PEG-蛋白产物混合物的异质性。与末端甲氧基 基团相反的聚合物末端的羟基的激活通常是获得有效的蛋白质PEG化作用所必需 的，目的是使得衍生的PEG更容易遭受亲核攻击。攻击性的亲核试剂通常是赖氨 酰残基的ε-氨基基团，但是其他的胺也可以反应(例如组氨酸的N-末端α-胺或环 胺)，如果局部条件是有利的话。在含有单个赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中可能发 生更为定向的附着。后一残基可以被PEG-马来酰亚胺作为目标，用于硫醇特异性 的修饰。可选择地，PEG酰肼可以与高碘酸盐氧化的sHASEGP反应，并在 NaCNBH3存在的条件下被还原。更特别地，PEG化的CMP糖可以与sHASEGP 在合适的糖基转移酶存在的条件下发生反应。一种技术是“聚乙二醇化作用”技 术，其中，许多聚合物分子被偶联到被研究的多肽上。当使用该技术时，免疫系 统难以识别形成抗体所需的多肽表面上的表位，从而减少免疫应答。对直接引入 人体循环系统以给予特定的生理效应的多肽(即药品)，典型的潜在免疫应答是IgG 和/或IgM应答，而通过呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)潜在地可以引起IgE 应答(即过敏应答)。解释减少的免疫应答的理论之一是聚合物分子掩蔽了多肽表 面上的表位，而正是这些表位对导致抗体形成的免疫应答负有责任。另一理论或 至少部分因素是共轭物越重，所能获得的免疫应答的减少程度越大。

[0181]偶联到多肽的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，具有依据本发明 所限定的分子量，包括天然的和合成的均聚物，诸如多元醇(即聚-OH)、聚胺(即聚 -NH2)和聚羧酸(即聚-COOH)，以及进一步地，杂聚物，即包括一个或多个不同的 偶联基团如羟基基团或胺基团的聚合物。

[0182]合适的聚合物分子的例子包括选自下列的聚合物分子：聚环氧烷烃(PAO)， 诸如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二 醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支链聚乙二醇 (PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯顺 丁烯二酸酸酐共聚物、聚苯乙烯苹果酸酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖、 肝素、同源白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟 乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，壳聚糖的水解物，淀粉诸如羟乙基- 淀粉和羟丙基-淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物，瓜尔豆胶、短醒霉多糖、菊糖、 黄原胶、卡拉胶、果胶、海藻酸水解产物和生物多聚物。

[0183]优选的聚合物分子是无毒性的聚合物分子，诸如(m)聚乙二醇(mPEG)，进 一步地，它们需要相对简单的化学过程便能够共价偶联到酶表面上的附着基团。

[0184]常见的聚环氧烷烃(PAO)，诸如聚环氧乙烷，例如PEG，特别是mPEG，是 优选的聚合物分子，这是因为这些聚合物分子相比起多糖例如葡聚糖、短醒霉多 糖和类似物，具有更少的能够发生交联的活性基团，而交联是不利的。B.sHASEGP的组织表达情况

[0185]尽管先前认为sHASEGP是睾丸特异性的，但当使用更灵敏的技术如 RT-PCR时，发现人sHASEGP表达在人的多种组织中。sHASEGP转录物被发现于 髓质(脑)、微血管内皮、前列腺、胸、视网膜、收集的人黑素细胞、胎儿心脏和怀 孕子宫中。sHASEGP也表达在生殖细胞肿瘤中。sHASEGP转录物的RT-PCR检测 通常是检测在除睾丸之外的组织中的水平所必需的。C.sHASEGP酶活性的分析

[0186]透明质酸酶活性的浊度法微量滴定测定

[0187]透明质酸酶活性可以通过修饰的浊度法分析在酸化的血清溶液中进行检 测。所需要的试剂如下：   用作灌洗的UV灭菌的2×去离子水或无菌水   Braun   R5000-01   Hylumed Medical-透明质酸钠，高分子量HA   Genzyme Advanced   Biomaterials   4876   透明质酸酶参考标准   USP   31200   乙酸钾，粒状，USP，ACS   JTBaker   2914-01   冰醋酸，99+％   Sigma   A-6283   一水合磷酸二氢钠，USP，粒状   Mallinkrodt   7774   无水磷酸氢钠，USP   Mallinkrodt   7771   氯化钠，晶体，GR，ACS   EMScience   SX0420-5   明胶水解产物，酶促形成   Sigma   G-0262   马血清，供体群，受测的细胞培养物，受测的   杂交瘤培养物，美国来源   Sigma   H-1270   人血清白蛋白20％   Griffols   盐酸，ACS试剂   Sigma   H-7020   氯化钙，二水合物，粒状，USP，-FCC   JTBaker   1336-01

[0188]制备下述试剂： 醋酸缓冲溶液-将14.0g的乙酸钾和25.0mL的冰乙酸加 入水中制得1000mL溶液。 磷酸缓冲溶液-将2.5g的磷酸二氢钠、1.0g的无水磷 酸氢钠和8.2g的氯化钠加入水中制得1000mL溶液。 酶稀释贮存液-500mL的 磷酸缓冲溶液加500mL的水。 酶稀释工作液-将33mg的水解明胶加入到50mL 的酶稀释贮存液中——制备后2小时内使用。 样品稳定缓冲溶液(″SSB″Soln.)- 将125μL的20％人血清白蛋白溶液和50μL的1M氯化钙溶液加入到50mL的酶 稀释工作液中，充分混合。 血清贮存液-用9体积的醋酸缓冲溶液稀释1体积的 马血清。用4N盐酸将pH值调到3.1，并使溶液在室温保持18至24小时。将溶 液保存在4℃，并在30天内使用。 血清工作液-将10mL的血清贮存液加入到30 mL的醋酸缓冲溶液中，调节到室温。 透明质酸贮存液-将透明质酸钠配制为浓度 为5.0mg/mL的水溶液。 透明质酸工作液-将0.75mL的透明质酸贮存液加入到 4.25mL的磷酸缓冲溶液。 标准贮存液-在一个容器中制备浓度为1000单位/mL 的USP参考标准的透明质酸酶的水溶液，分为50μL的小份，保存在-20℃。 标准 工作液-将40μL的标准贮存液加入到960μL的冷酶稀释工作液，获得已知浓度 为40单位/mL的溶液，制备后立即用于测定。

[0189]依据下述指导，将所有的酶样品稀释于“低蛋白结合(Low Protein Binding)” 96-孔板中。

[0190]a)该测定的最大的灵敏度的范围在10-30单位/mL之间。为了获得在该范 围内的结果，测定需要反复进行，为了使次数最小化，首先确定样品的总单位数/mL 的近似值，然后选择稀释倍数(整数)，以便最终浓度为大约20单位/ml。

[0191]b)为了实施测定所需要的最小的样品体积描述如下：FPLC级分＝50μL，组 织培养物上清液＝1mL，纯化的/浓缩的/最终步骤的材料＝10μL。

[0192]c)对于连续稀释的样品，通过将360μL的“SSB”溶液和40μL的样品吸到 各个孔中，在“低蛋白结合”96-孔板上进行1∶10的稀释，一式三份。

[0193]为了制备USP标准，按如下所述利用“低蛋白结合”96-孔板制备USP标 准曲线：                          USP标准曲线：
                     酶         标准        最终
                         稀释            工作           浓度
孔           标准        溶液(μL)：     溶液(μL)：    (单位/mL)：
A1-A3        St01        0               100            40
B1-B3        St02        20              80             32
C1-C3        St03        40              60             24
D1-D3        St04        60              40             16
E1-E3        St05        80              20             8
F1-F3        St06        90              10             4
G1-G3        St07        100             0              0

[0194]为了制备1-3栏的透明质酸对照，按下述方法在“平底”96-孔板中制备H.A. 对照：

[0195]                                H.A.对照：
                         透明质酸            酶稀释
孔：       对照：        工作溶液(μL)：     工作溶液(μL)：
H1-H3      Co01          0                   60

[0196]反应板(Reaction Plate)：以每孔30μL的量，使用50μL 8-通道转移移液管， 将透明质酸工作液吸放到“平底”96-孔微量滴定板，让孔H1-H3空着。以60μL/ 孔的量，将酶稀释工作液吸放到同样的板的孔H1-H3中，作为HA对照。

[0197]血清工作液：将40mL的血清工作液分配入转移盘(transfer basin)，并靠 近热块(Heat Block)。

[0198]预热阶段：一旦两种板制备完成之后，将含有稀释样品、标准样、对照样 的低蛋白结合96-孔板，和含有透明质酸工作液的平底96-孔板置于热块上，将它 们在37℃温热5分钟。

[0199]通过将酶加入到底物来起始反应：使用5-50μL 8-通道移液管将来自酶板的 30μL加入到96-孔平底板(含底物)的#1栏中的所有孔中。在第一个15秒中，将 酶/底物反应混合物吹吸5次(用移液器上下吹吸溶液)，以确保样品完全混合。将 酶和底物混合之后，驱除掉吸头，将一组新的吸头装载于转移移液管上以用于下 一栏的操作。重新启动计时器，在时间(t)＝0:30时，对栏2重复该过程。在下一 30秒间隔(t)＝1:00时，对栏3重复该过程。该过程从左到右横跨整个板重复进行， 每30秒进行一次，直到所有的孔含有酶和底物。

[0200]终止反应：当时间达到6分钟(t)＝6:00时，使用50-300μL 8-通道转移移液 管，将240μL的血清工作液吸放到每一个孔，由临近的50mL试剂容器吸放到96- 孔平底板的栏1中。在第一个10秒中，混合物被吹吸3次(用移液器上下吹吸溶 液)，以确保完全混合。该过程每30秒重复进行，从栏1进行到栏12。一旦完成 最后一栏(栏12)，将反应板从热块上移去，并将板置于平板读数器的阅数盘上， 640nM。由标准曲线产生线性曲线拟合，由此可以对受测样品进行推断。

[0201]透明质酸酶的其他可供选择的分析方法

[0202]生物素化透明质酸微量滴定分析

[0203]使用生物素-酰肼(Pierce)、硫代NHS(Pierce)和1-乙基二甲氨基丙基-碳二 亚胺(Sigma)，使透明质酸的葡糖醛酸残基上游离的羧基在一步反应中被生物素 化。该生物素化的HA底物在第二个反应中，被共价偶联到96孔微滴定板上。酶 反应完成时，残留的底物用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应进行检测，其可以用标 准的ELISA平板读数器读出。因为底物是被共价结合于微滴定板，所以矫作结果 (artifact)例如生物素化底物的pH依赖性的置换没有发生。灵敏度使得能够对来 自培养细胞和生物样品的透明质酸酶活性进行快速测定，分析之间的偏差小于 10％。

[0204]透明质酸酶的比活性用浊度降低单位(turbidity reducing units，TRU)来表 示。一个TRU被定义为降低透明质酸的酸化溶液的浊度所需要的透明质酸酶活性 的量，并等同于U.S.P./National Formulary(NF XIII)units(NFU)。用于纯化的ELISA 样酶分析可以通过经U.S.P.标准化的透明质酸酶样品(例如USP)的标准曲线而与 TRU、NFU和U.S.P.单位相关联。因此，用ELISA样酶分析测定的酶活性实际上 是相对TRU，因为酶活性不是用浊度计分析实际测量得到的(Dorfman et al.，1948， J.Biol.Chem.172：367)。

[0205]许多透明质酸酶分析是基于测量新的还原性N-乙酰氨基基团的产生 (Bonner and Cantey，Clin.Chim.Acta 13：746-752，1966)，或粘性的损失(De Salegui et al.，Arch.Biochem.Biophys 121：548-554，1967)或浊度(Dorfman and Ott，J.Biol. Chem.172：367，1948)。采用纯化的底物，所有这些方法足以测定内切葡萄糖胺 (endoglucosamidic)活性的存在或不存在。

[0206]基本上纯的糖胺聚糖底物也可以被用于凝胶迁移分析(Gel Shift Assay)。 将糖胺聚糖与重组sHASEGP混合，以测试内切葡糖苷酶活性，所述的内切葡糖苷 酶活性导致底物在凝胶中的迁移率发生变化。硫酸软骨素-4和6、硫酸皮肤素、硫 酸类肝素可以从Sigma Chemical获得。人脐带透明质酸可以从ICN获得。将每一 受测底物用pH 3.5-7.5范围内的缓冲液稀释到0.1mg/ml。10μL纯化的sHASEGP 样品或来自表达sHASEGP的细胞的条件培养基与90μl的受测底物在理想的缓冲 液中混合，并在37℃温育3小时。温育之后，样品用样品缓冲液(Tris EDTA pH 8.0、 溴酚蓝和甘油)中和，然后进行电泳。通过在含有0.5％阿尔新蓝的3％冰乙酸中将 凝胶染色过夜，然后在7％冰乙酸中脱色，来检测糖胺聚糖。通过比较存在或不存 在酶的情况下的底物迁移率，对降解结果进行测定。

[0207]透明质酸酶活性也可以用底物凝胶酶谱法(substrate gel zymography)进行 检测(Guentenhoner et al.，1992，Matrix 388-396)。在这种测定中，将样品应用于含 有透明质酸的SDS-PAGE凝胶，然后通过电泳分离样品中的蛋白。然后将该凝胶 在酶分析缓冲液中温育，随后进行染色，以检测凝胶中的透明质酸。通过底物凝 胶中的透明带(cleared zone)，可以看出透明质酸酶活性。

[0208]D.sHASEGP多肽基因的鉴定和分离

[0209]sHASEGP多肽基因和/或其结构域可以通过利用本领域已知的DNA分离方 法获得。任何本领域技术人员所知道的用于鉴定编码期望基因的核酸的方法都可 以被使用。本领域可以利用的任何方法都可以用来获得编码sHASEGP多肽的全长 (即包括整个编码区)cDNA或基因组DNA克隆。例如，聚合酶链反应(PCR)可 以用来从基因组或cDNA文库中扩增在正常组织中表达的序列，例如编码 sHASEGP多肽的核酸(SEQ.No：1和2)。与在鉴定的序列的3′和5′末端的序列杂 交的寡核苷酸引物可以被用作引物，以便通过PCR扩增来自合适的来源(例如睾 丸、前列腺、乳腺)的核酸样品(RNA或DNA，一般是cDNA文库)的序列。

[0210]PCR可以例如通过使用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(Gene Amp)来进行。被扩增的核酸可以包括来自真核物种的mRNA或cDNA或基因组 DNA。可以选择合成若干不同的简并引物，以用于PCR反应。

[0211]也可以改变用于引发PCR反应的杂交条件的严紧度，以便扩增核酸同源物 (例如，为了从除人之外的物种获得sHASEGP多肽序列，或为了获得与sHASEGP 多肽同源的人序列)，这通过允许在已知的核苷酸序列和正在被分离的核酸同源物 之间存在或大或小的核苷酸序列相似性来进行。对于种间交叉杂交(cross-species hybridization)，可以使用低至中等严紧度的条件。对相同物种的杂交，可以使用中 等严紧至高度严紧的条件。这些条件可以经验性确定。

[0212]在含有整体的或部分的被鉴定的sHASEGP多肽序列的核酸，或编码整体 的或部分的sHASEGP多肽同源物的核酸，被成功扩增之后，该片段可以进行分子 克隆和测序，并可用作探针来分离全cDNA或基因组克隆。这又使得能够测定该 基因的全核苷酸序列、分析它的表达，和生产它的蛋白质产物以用于功能分析。 一旦核苷酸序列被确定，编码sHASEGP多肽基因蛋白质产物的开放阅读框，可以 用本领域已知的用于确定开放阅读框的任何方法来确定，例如，使用用于核苷酸 序列分析的共用计算机程序来确定开放阅读框。一旦开放阅读框被定义之后，确 定由该开放阅读框编码的蛋白质的氨基酸序列便是常规的了。这样，整个sHASEGP 多肽基因的核苷酸序列以及sHASEGP多肽蛋白质的氨基酸序列和类似物得以确 定。

[0213]任何真核细胞都可能作为用于sHASEGP多肽基因的分子克隆的核酸来源。 核酸可以从脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬以及其他灵长类、 昆虫、植物和其他生物体分离得到。DNA可以通过本领域已知的标准程序从克隆 的DNA(例如DNA“文库”)获得、由化学合成获得、由cDNA克隆获得，或通过对 从期望的细胞纯化获得的基因组DNA或其片段进行克隆而获得(参见如Sambrook et al.1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.Ed.，1985，DNA Cloning：A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.1，11)。从基因组 DNA获得的克隆除了编码区域之外，可以含有调控和内含子DNA区域；从cDNA 获得的克隆将只含有外显子序列。对于任何来源，将该基因克隆入合适的载体， 以对其进行增殖。

[0214]对来自基因组DNA的基因进行分子克隆，产生DNA片段，其中的一些将 编码想要的基因。

[0215]使用各种限制性酶，可以将DNA在特定位点切割。

[0216]可选择地，可以使用DNAse在锰存在的条件下切碎DNA，或者可以用物 理的方法剪切DNA，例如利用超声波法。线性DNA片段然后可以依据大小用标 准的技术进行分离，包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析。

[0217]一旦DNA片段被产生，对含有想要的基因的特定DNA片段的鉴定可以用 许多方法来完成。

[0218]例如，(任何物种的)sHASEGP多肽基因的一部分(例如按上面描述的方法获 得的PCR扩增产物，或具有已知核苷酸序列的一部分序列的寡核苷酸)或它的特定 RNA，或其片段可以被纯化和标记，所产生的DNA片段可以通过将核酸与标记的 探针杂交而进行筛选(Benton and Davis，Science 196：180(1977)；Grunstein and Hogness，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961(1975))。那些与该探针基本上同源 的DNA片段将发生杂交。也能够通过下述方法鉴定正确的片段：进行限制性酶消 化，并将依据已知的限制性图谱(如果有的话)的那些期望片段与消化片段大小 相比较来鉴定正确的片段；或进行DNA序列分析，并与sHASEGP多肽的已知核 苷酸序列进行比较来鉴定正确的片段。依据该基因的特性还可以作进一步的筛选。 可选择地，可以基于它的表达产物的物理、化学或免疫学特性的分析，来检测该 基因的存在与否。例如，杂交-选择正确的mRNA的cDNA克隆或DNA克隆可以 被选择，其产生具有类似或相同的电泳迁移行为、等电聚焦行为、蛋白水解消化 图谱、抗原特性、透明质酸酶活性的蛋白质。如果抗sHASEGP多肽的抗体是可以 利用的，可以在ELISA(酶联免疫吸收测定)类型的程序中，通过标记的抗体与推断 合成sHASEGP多肽的克隆的杂交来鉴定蛋白质。

[0219]分离sHASEGP多肽基因组DNA的可供选择的方法包括，但不限于：利用 已知的序列通过化学的方法合成基因序列，或由cDNA制备编码sHASEGP多肽的 mRNA。

[0220]例如，用于sHASEGP多肽基因的cDNA克隆的RNA可以从表达该蛋白的 细胞中分离得到。然后可以将被鉴定和分离出的核酸插入到合适的克隆载体中。 可以使用许多本领域已知的载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰 的病毒，但是载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。此类载体包括但不限于细 菌噬菌体，诸如λ衍生物，或质粒，诸如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript 载体(Stratagene，La Jolla，CA)。例如，通过将DNA片段连接入携带有互补粘性末 端的克隆载体中，可以将DNA片段插入到克隆载体中。

[0221]如果克隆载体中不存在用于切割该DNA的互补限制性位点，DNA分子的 末端可以进行酶法修饰。可选择地，通过将核苷酸序列(连接子)连接到DNA末端， 可以产生任何想要的位点，这些被连接的连接子可以包括特定的化学合成的寡核 苷酸，其编码限制性核酸内切酶识别序列。在另一方法中，切割的载体和sHASEGP 多肽基因可以用均聚物加尾(homopolymeric tailing)的方式进行修饰。

[0222]重组分子可以通过转化、转染、感染、电穿孔、钙沉淀和其他方法被导入 宿主细胞中，这样，产生许多拷贝的基因序列。

[0223]在具体的实施方案中，用整合有分离的sHASEGP多肽基因、cDNA或合成 的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞，能产生多拷贝的基因。

[0224]因此，基因可以通过下述方法大量获得：培养转化子，从转化子中分离重 组DNA分子，并且必要时，从分离的重组DNA中回收感兴趣的基因。

[0225]E.含有编码SHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域的核酸的载体、质粒和 细胞，以及SHASEGP多肽载体和细胞的表达

[0226]为了重组表达一个或多个sHASEGP多肽，含有编码sHASEGP多肽的核苷 酸序列的所有序列或部分序列的核酸可以被插入到合适的表达载体中，所述的表 达载体含有用于转录或翻译插入的蛋白质编码序列的必要元件。必要的转录和翻 译信号也可以由sHASEGP基因的天然启动子和/或它们的侧翼区域提供。

[0227]也提供了这样的载体，其含有编码sHASEGP的核酸，该核酸可以被导入 到能够产生可溶性中性活性sHASEGP的表达系统中。

[0228]也提供了含有载体的细胞。该细胞包括真核或原核细胞，且该载体适合用 于那些细胞中。

[0229]提供了含有所述载体的真核细胞，包括二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵 巢细胞(DG44)。合适的细胞包括酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和动 物细胞。细胞可以被用来生产sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域，通过下述方 法：(a)将上述细胞在编码的sHASEGP多肽或sHASEGP多肽的透明质酸酶结构 域被细胞表达的条件下培养，然后(b)回收表达的透明质酸酶结构域蛋白。在示 范性的实施方案中，透明质酸酶结构域被分泌入培养基中。

[0230]在一种实施方案中，提供的载体包括编码多肽的核苷酸序列，其中，该多 肽具有透明质酸酶活性并且含有sHASEGP蛋白的所有或部分的透明质酸酶结构 域或其多份拷贝。也提供了这样的载体，其包括编码透明质酸酶结构域和额外部 分的sHASEGP蛋白——可长达全长sHASEGP蛋白并包括全长sHASEGP蛋白质 在内——的核苷酸序列，也提供了其多个拷贝。载体可以被选择以便在细胞中表 达sHASEGP蛋白质或其透明质酸酶结构域，或，sHASEGP蛋白可以作为分泌蛋 白而被表达。可选择地，载体可以包括对于编码蛋白的分泌所必需的信号。当透 明质酸酶结构域被表达时，核酸可以被连接到编码分泌信号的核酸上，诸如酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)的接合因子(mating factor)信号序列或其部分， 或天然的信号序列。

[0231]为了产生可溶性的中性活性的sHASEGP，能够引入N-连接糖基化作用的 细胞是被要求的。在优选的实施方案中，二氢叶酸还原酶缺陷型的哺乳动物中国 仓鼠卵巢细胞诸如DG44，用质粒进行电转，所述质粒编码强哺乳动物启动子诸如 CMV启动子、sHASEGP编码核酸以及跟随着的内部核糖体进入位点、小鼠二氢 叶酸还原酶基因和SV40多聚腺苷酸化序列，如SEQ ID NO.51所显示。然后将此 类细胞在缺少次黄嘌呤和胸苷的化学成份确知的培养基中培养，然后再随着增加 浓度的甲氨蝶呤进行基因扩增。

[0232]各种宿主-载体系统可以被用来表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于： 用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆 状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物诸如含有酵母载体的酵母；或用噬菌体、 DNA、质粒DNA或柯斯DNA转化的细菌。载体的表达元件在它们强度和特异性 方面有所变化。取决于所使用的宿主-载体系统，有大量合适的转录和翻译元件可 以选择使用。注意，sHASEGP DNA在细菌中的表达本身不会产生具有催化活性的 sHASEGP，但是当同时进行合适的糖基化作用时——可以通过人工的方法进行这 样的糖基化作用，便能产生催化活性。

[0233]本领域技术人员所知道的用于将核酸片段插入载体的任何方法都可以被用 于构建含有嵌合基因的表达载体，其含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码 序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。 编码sHASEGP多肽或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列的表达可以受 到另一核酸序列的调控，以便基因或其片段表达于用重组DNA分子转化的宿主中。 例如，蛋白质的表达可以受到本领域已知的启动子/增强子的控制。在特定的实施 方案中，启动子对于sHASEGP多肽的基因来说不是天然的。可以被使用的启动子 包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981)、 包含在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto et al.，Ce//22： 787-797(1980)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42 (1982))；原核表达载体诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 75：3727-3731 1978))或TAC启动子(Deboer et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80：21-25(1983))；也参见″Useful Proteins from Recombinant Bacteria″：in Scientific American 242：79-94(1980))；包含乳白合成酶(opaline synthetase)启动 子的植物表达载体(Herrar-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或花椰菜花叶 病毒35S RNA启动子(Garder et al.，Nucleic Acids RES.9：2871(1981))，和光合成酶 核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))； 来自酵母和其他真菌的启动子元件诸如Gal4启动子、乙醇脱氢酶启动子、磷酸甘 油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子，和下述的显示出组织特异性并已被应用于转 基因动物的动物转录控制区域：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性酶I基因控制区 (Swift Et Al.，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz Et Al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol.50：399-409(1986)；Macdonald，Hepatology 7：425-515(1987))；在胰腺β细胞 中具有活性的胰岛素基因控制区域(Hanahan et AL.，Nature 315：115-122(1985))，在 淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et AL.，Cell 38：647-658 (1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et AL.，Mol.Cell Biol. 7：1436-1444(1987))，在睾丸、胸、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病 毒控制区(Leder et AL.，CELL 45：485-495(1986))，在肝脏中具有活性的白蛋白基因 控制区(PINCKERT et AL.，Genes and Devel.1：268-276(1987))，在肝脏中具有活性 的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf et AL.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)； Hammer et AL.，Science 235：53-581987))，在肝脏中具有活性的α-1抗胰蛋白酶基 因控制区(Kelsey et al.，Genes And Devel.1：161-171(1987))，在髓细胞中具有活性的 β球蛋白基因控制区(Mogram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et AL.， CE//46：89-94(1986))，在脑的少突细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区 (Readhead et al.，Cell 48：703-712(1987))，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2 基因控制区(Sani，Nature 314：283-286(1985))，和在下丘脑的促性腺激素细胞中具 有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason et al.，Science 234：1372-1378 (1986))。

[0234]在特定的实施方案中，使用这样的载体，其含有启动子，其可有效连接到 编码sHASEGP多肽或其结构域、片段、衍生物或同源物的核酸，还含有一个或多 个复制起点，以及任选地，一个或多个选择性标记(例如抗生素抗性基因)。

[0235]特异性的起始信号是有效地翻译sHASEGP序列所必需的。这些信号包括 ATG起始密码子和临近的序列。对于sHASEGP，在它的起始密码子和上游序列被 插入到合适的表达载体中的情况下，可以不需要额外的翻译控制信号。然而，在 仅仅编码序列或其一部分被插入的情况下，需要提供外源的转录调控信号，包括 ATG起始密码子。而且，起始密码子必须在正确的阅读框中，以确保整个插入物 能够转录。外源的转录元件和起始密码子可以是各种来源的，可以天然的或合成 的。通过纳入适合于所使用的细胞系统的增强子，表达的效率可以得到增强 (Scharf D et al(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Bittner et al(1987)Methods in Enzymol 153：516-544)。

[0236]此外，可以选择能够调节感兴趣的序列的表达或能以期望的方式对表达的 蛋白质进行加工的宿主细胞菌株。对多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化作用、 羧化作用、糖基化作用、磷酸化作用、脂化作用和酰化作用。对“前原(prepro)” 形式的蛋白质进行切割的翻译后加工，对于正确的插入、折叠和/或功能也是重要 的。不同的宿主细胞诸如CHO(DG44、DXB11 CHO-K1)、HeLa、MDCK、293、 WI38等都具有实现这样的翻译后活性的特定细胞器(cellular machinery)和特征 机制(characteristic mechanisms)，可以对它们加以选择以确保对引入的外来蛋白 质进行正确的修饰或加工。

[0237]为了长期地高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，稳定 表达sHASEGP的细胞系可以用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择性标 记基因的表达载体进行转化。引入载体后，细胞可以在富集培养基中培养1-2天， 再转移到选择性培养基。选择性标记的目的是赋予抗性以便进行选择，它的存在 使得成功地表达被引入的序列的细胞能够生长和被回收。稳定转化的细胞的抗性 群落(resistant clumps)可以用适合于该细胞类型的组织培养技术进行繁殖。

[0238]大量的选择系统可以被用于回收转化的细胞系。这些选择系统包括但不限 于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M et al(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖 转移酶(Lowy I et al(1980)Cell 22：817-23)基因，它们分别可以被用于TK-或APRT- 细胞。另外，抗代谢药、抗生素或除草剂抗性可以被用作选择的基础；例如DHFR， 其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M et al(1980)Proc Natl Acad Sci 77：3567-70)； npt，其赋予对氨基糖苷新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin F et al(1981)J Mol Biol 150：1-14)，和als或pat，其分别赋予对氯磺隆和草铵膦乙酰转移酶的抗性 (Murry，supra)。其他的选择性标记基因已经被描述，例如，trpB，其使得细胞可以 利用吲哚来替代色氨酸，或hisD，其使得细胞可以利用组氨醇来替代组氨酸 (Hartman S C and R C Mulligan(1988)Proc Natl Acad Sci 85：8047-51)。最近，使用 可视化的标记已成为流行，这样的标记如花青素、B葡萄糖醛酸酶和它的底物GUS 以及荧光素酶和它的底物虫荧光素，这不但已经被广泛用于鉴定转化子，也被用 于对通过特定的载体系统来实现的瞬时或稳定的蛋白表达进行量化(Rhodes C A et al(1995)Methods Mol Biol 55：121-131)。

[0239]对含有多核苷酸序列的转化子的鉴定

[0240]尽管标记基因表达的存在/不存在表明了感兴趣的基因的存在与否，但是活 性sHASEGP的存在和表达应该被确证。例如，如果sHASEGP被插入到标记基因 序列中，含有sHASEGP的重组细胞可以通过标记基因功能的缺失而得以鉴定。可 选择地，标记基因可以与sHASEGP序列一前一后地置于同一个启动子的控制之 下。标记基因因诱导或选择而发生的表达通常表示与之串连的sHASEGP也被表 达。通过在合适的条件下测试条件培养基的sHASEGP酶活性，可以检测被适当糖 基化的具有中性活性的sHASEGP。

[0241]SHASEGP的纯化

[0242]用sHASEGP核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于表达被编码的蛋白 质和从细胞培养物中对其进行回收的条件下进行培养。由重组细胞产生的蛋白质 优选是可分泌的，但可以包含于细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。如本 领域技术人员所知道的，包含sHASEGP的表达载体，可以设计为具有信号序列， 这有利于sHASEGP通过原核或真核细胞膜直接分泌出来。其他重组构建可以将 sHASEGP与编码有助于可溶性蛋白的纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接起来 (Kroll D J et al(1993)DNA Cell Biol 12：441-53；cf discussion of vectors infra containing fusion proteins)。

[0243]sHASEGP作为重组蛋白也可以与一个或多个额外的多肽结构域一起表达， 添加这些额外的多肽结构域是为了方便蛋白纯化。这样的有助于纯化的结构域包 括但不限于金属螯合肽，诸如组氨酸-色氨酸模块，其允许在固定化的金属上进行 纯化、蛋白A结构域，其允许在固定化的免疫球蛋白上进行纯化，以及用于FLAGS 延伸/亲合纯化系统的结构域(Immunex Corp，Seattle Wash.)。在所述纯化结构域和 sHASEGP之间包含入可切割的连接子序列诸如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，San Diego Calif.)，可用于帮助纯化。一个用于表达包含sHASEGP的融合蛋白的这样 的表达载体被提供，其含有编码六组氨酸残基的核酸，并接有硫氧还蛋白和肠激 酶切割位点。所述组氨酸残基有助于在IMIAC(固定化金属离子亲合层析)上进 行纯化，如Porath et al(1992)Protein Expression and Purification 3：263-281中所述， 而肠激酶切割位点为由融合蛋白纯化趋化因子提供了手段。

[0244]除了重组产生之外，sHASEGP片段也可以使用固相技术通过直接的肽合成 产生(cf Stewart et al(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，W H Freeman Co，San Francisco；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc 85：2149-2154)。使用手工技术或自动 化技术，可以进行蛋白质的体外合成。自动化合成例如可以通过使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer，Foster City Calif.)，依据制造商提供的说 明书来完成。SHASEGP的不同片段可以分别进行化学合成，然后使用化学的方法 组合起来，产生全长的分子。

[0245]含有sHASEGP多肽的编码序列或其部分的表达载体，例如可以通过将所 述编码部分亚克隆入3个PGEX载体中的每一个的EcoRI限制性位点而制备得到 (谷胱甘肽S-转移酶表达载体(Smith and Johnson，Gene 7：31-40(1988))。这使得产物 可以以正确的阅读框被表达。用于表达sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域的示范 性载体和系统包括公知的毕赤酵母(Pichia)载体(例如可从Invitrogen，San Diego， CA获得)，特别是那些设计用于分泌被编码的蛋白质的载体和系统。蛋白质也可 以在细胞质内被表达，诸如以包涵体的形式。一个示范性的载体描述于实施例中。

[0246]用于转化大肠杆菌的质粒包括例如pET表达载体(参见美国专利4,952,496； 来自Novagen，Madison，WI；也参见Novagen出版的文献，其描述了该系统)。

[0247]这样的质粒包括pET 11a，其包含T7lac启动子、T7终止子、诱导型大肠杆 菌lac操纵子和lac阻遏物基因；pET 12A-C，其含有T7启动子、T7终止子和大 肠杆菌OMPT分泌信号；和pET 15B和pET19B(Novagen，Madison，Wi)，其含有 便于用His柱纯化的His-Tag前导序列和便于在柱纯化之后进行切割的凝血酶切割 位点；T7-lac启动子区域和T7终止子。

[0248]载体被导入宿主细胞，诸如毕赤酵母细胞和细菌细胞诸如大肠杆菌中，蛋 白质表达于其中。示范性的毕赤酵母菌株例如包括GS115。示范性的细菌宿主含 有编码T7RNA聚合酶的DNA的染色体拷贝，其有效连接到诱导型启动子诸如 LACUV启动子(参见美国专利4,952,496)。这样的宿主包括但不限于溶原性大肠 杆菌菌株BL 21(DE3)。

[0249]sHASEGP结构域、衍生物和类似物可以通过各种本领域已知的方法产生。 例如，一旦表达HASEGP多肽或其结构域、片段或衍生物的重组细胞被鉴定出之 后，单独的基因产物可以被分离和分析。这可以通过基于该蛋白的物理/或功能特 性的分析来实现，所述分析包括但不限于：对产物进行放射性标记，然后通过凝 胶电泳、免疫测定、与标记物标记的产物进行交联和测定蛋白水解活性来进行分 析。

[0250]sHASEGP多肽可以用本领域已知的标准方法分离和纯化(或者从天然来源 或者从表达复合体或蛋白质的重组宿主细胞获得)，所述方法包括但不限于柱层析 (例如，离子交换、亲合、凝胶排阻、反相高压和快速蛋白液体(fast protein liquid))、 差异离心、差异溶解，或通过用于纯化蛋白质的其它任何标准技术。

[0251]在一种实施方案中，sHASEGP可以由HZ24转染和甲氨蝶呤扩增的DG44 细胞的化学成分确定的条件培养基中纯化至同质，这通过下述方法进行：1)切向 流渗滤，2)利用阴离子交换层析进行结合并洗脱，3)流经苯基琼脂糖层析，4)利 用苯基硼酸盐层析进行结合并洗脱，和4)利用羟磷灰石层析进行结合并洗脱。

[0252]可以使用本领域已知的任何合适的分析方法来评价功能特性。

[0253]可选择地，一旦鉴定出sHASEGP多肽或它的结构域或衍生物，该蛋白的 氨基酸序列可以从编码它的基因的核苷酸序列推断出来。结果，蛋白或它的结构 域或衍生物可以用本领域已知的标准化学方法合成得到(例如参见Hunkapiller et al， Nature 310：105-111(1984))，再进行体外的糖基化作用。

[0254]可以在蛋白质水平对sHASEGP多肽序列进行操作。本文也考虑这样的 sHASEGP多肽、其结构域、其衍生物或类似物或片段，即，其在翻译期间或翻译 后进行不同的修饰，例如糖基化作用、乙酰基化作用、磷酸化作用、氨基化作用、 聚乙二醇化作用、通过已知的保护/封阻基团进行的衍生化作用、蛋白质水解切割、 连接到抗体分子或其他细胞配体。

[0255]许多化学修饰中的任何一种都可以用已知技术来实施，包括但不限于用溴 化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8、NABH4进行特异性的化学切割， 乙酰基化作用、甲酰基化作用、氧化作用、还原作用、新陈代谢合成，这是在衣 霉素和其他这样的试剂存在的情况下进行的。

[0256]此外，sHASEGP多肽的结构域、类似物和衍生物可以化学合成。例如，对 应于sHASEGP多肽的某部分的肽——其包括想要的结构域或者其在体外介导想 要的活性——可以使用肽合成仪来合成。

[0257]而且，如果有必要的话，非基本的氨基酸或化学氨基酸类似物可以被引入， 以替代或加入到sHASEGP多肽序列。总体上说，非基本的氨基酸包括但不限于常 见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、E-ABU、 e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬 氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯 基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、特别设计的氨基酸诸如β- 甲基氨基酸、ca-甲基氨基酸、na-甲基氨基酸和氨基酸类似物。此外，氨基酸可以 是d(右旋)或1(左旋)的。

[0258]当天然产物被怀疑是突变体或者是分离自新种时，分离自该天然来源的 sHASEGP多肽的氨基酸序列，以及那些在体外表达的或者在体内或体外由合成的 表达载体表达的多肽的氨基酸序列，可以通过对DNA序列的分析来确定，或者可 选择地，可以通过对分离的蛋白质进行直接测序来确定。这样的分析可以通过人 工测序或通过使用自动氨基酸测序仪来实施。

[0259]修饰—本文考虑了许多的sHASEGP多肽和结构域的修饰方法。编码 sHASEGP的核酸分子可以利用本领域已知的许多策略来进行修饰(Sambrook ET A/.(1990)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。这些序列可以用限制性内切酶在合适的 位点进行切割，然后进行进一步的酶促修饰，如果有必要的话，再分离并进行体 外连接。在编码sHASEGP的结构域、衍生物或类似物的基因的生产中，应该小心 以确保在编码期望活性的基因区域，该被修饰的基因保留原始的翻译阅读框，而 不被翻译终止信号阻断。

[0260]此外，编码sHASEGP的核酸分子可以在体外或体内进行突变，以产生和/ 或破坏翻译、起始和/或终止序列，或者产生编码区域中的变异，和/或形成新的限 制性内切酶位点或破坏先前存在的位点，从而方便进一步的体外修饰。而且，如 本文中所描述地，也考虑了一级序列发生变化的突变蛋白，例如Cys残基的替代 和糖基化位点的消除或添加。SEQ ID No.1中描述的sHASEGP具有7个潜在的糖 基化位点。这样的修饰可以由本领域已知的用于突变发生的任何技术来完成，这 些技术包括但不限于化学诱变技术和体外定点诱变技术(Hutchinson et al.，j.Biol. Chem.253：6551-6558(1978))，可以使用TABE Linkers(Pharmacia)。在一种实施方 案中，例如，sHASEGP多肽或其结构域被修饰以包括进荧光标记。在其它特定的 实施方案中，sHASEGP多肽被修饰以具有异质双功能试剂，这样的异质双功能试 剂可以被用于交联复合体中的成员。

[0261]此外，sHASEGP的结构域、类似物和衍生物可以用化学的方法合成。例如， 对应于sHASEGP多肽的某部分的肽——其包括想要的结构域或者其在体外介导 想要的活性——可以使用肽合成仪来合成。而且，如果有必要的话，非基本的氨 基酸或化学氨基酸类似物可以被引入，以替代或加入到sHASEGP序列。总体上说， 非基本的氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁 酸、Abu、2-氨基丁酸、E-ABU、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨 基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、 t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基 酸、特别设计的氨基酸诸如ti-甲基氨基酸、ca-甲基氨基酸、na-甲基氨基酸和氨基 酸类似物。此外，氨基酸可以是d(右旋)或1(左旋)的。

[0262]F.具有N-连接糖部分的功能活性糖基化SHASEGP的产生

[0263]适当地N-糖基化的人sHASEGP是产生催化性能稳定的蛋白质所必需的。 sHASEGP的N-连接糖基化可以通过各种技术来实现。sHASEGP的糖基化作用可 以通过下述方法实现：将编码sHASEGP的核酸引入能够进行适当的糖基化的真核 细胞，或者，将sHASEGP多肽与能够引入期望的N-连接糖部分的无细胞提取物 或纯化的酶相接触。表达系统的选择

[0264]由真核细胞表达系统引入到异位表达的多肽中的糖基化作用的程度和类型 会有所变化。例如，CHO细胞可高效率地将N-连接糖基化作用引入到活性 sHASEGP多肽中。

[0265]可以引入N-连接的糖基化作用以产生功能性sHASEGP产物的其他真核表 达系统可以通过将人sHASEGP表达质粒引入所述细胞中并测试中性活性而得以 测试。合适的N-连接糖基化作用可以利用PNGASE释放的寡糖的FACE分析来确 定。本文中进一步提供了具有催化活性的sHASEGP的糖基化情况。糖基化的确认 也可以通过用PNGASE-F处理来自所述细胞的sHASEGP来进行，或通过在导入 编码sHASEGP的核酸之后将此细胞培养在衣霉素中来进行。

[0266]sHASEGP多肽在体外的N-糖基化作用。sHASEGP多肽可以通过下述方法 进行N-糖基化：将sHASEGP多肽与无细胞提取物接触，该无细胞提取物具有将 N-连接的糖转移到sHASEGP多肽的活性，无细胞提取物诸如犬微粒体膜，或者通 过偶联的转录和翻译，如通过商业渠道可获得的(Promega Madison WI)。

[0267]寡糖被认为具有还原端和非还原端，无论在还原端的糖是否实际上是还原 糖。根据公认的命名法，本文在描述寡糖时将非还原端置于左边，将还原端置于 右边。本文在描述所有的寡糖时，使用了非还原糖的名字或缩写(例如Gal)，然后 是糖苷键的构型(α或β)、环键(ring bond)、在该键中涉及的还原糖的环位置， 然后是还原糖的名字或缩写(例如GlcNAc)。两个糖之间的连接可以表示为例如 2，3、2.fw darw.3或(2，3)。每个糖均为吡喃糖。

[0268]如本文中所使用的，N-连接糖部分(N-linked sugar moiety)是指通过Asn 残基的酰胺氮附着到sHASEGP的寡糖。N-连接寡糖分为几个主要的类型(甘露寡 糖、复合的、杂合的、硫酸化的)，它们所具有的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心附 着于Asn残基的酰胺氮，所述Asn残基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa 不是Pro)。N-连接位点常常可由在测序期间“空白(blank)”循环的出现而间接指 示出来。可以在由PNGase F释放寡糖之后，进行阳性鉴定，PNGase F将糖基化 Asn转变为Asp。PNGase F进行释放之后，N-连接的寡糖可以用Bio-Gel P-6层析 进行纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析(HPAEC)(Townsend et al.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体可以用HPAEC分离。在HPAEC 层析谱中海藻糖残基将较早地变换洗脱位置，而其他唾液酸残基将会增加滞留时 间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-1酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAse B、转铁蛋白)被同时进行处理，这将方便寡糖峰的指认。收集到的寡糖可以用成 分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征(Waegheet al.，(1983)Carbohydr Res.123，281-304.)，利用NMR光谱术来测定端基异构构造(anomeric configurations)(Van Halbeek(1993)in Methods Enzymol 230)。

[0269]可选择地，寡糖可以用荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)进行鉴定。 Callewaert et al.(2001)Glycobiology 11，275-281。

[0270]G.sHASEGP上的N-连接糖部分的检测和表征

[0271]确定蛋白是否被糖基化是糖蛋白聚糖分析中首要的步骤。在十二烷基磺酸 钠存在的条件下进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是可选择作为在蛋白质测 序之前的最终步骤的方法。糖基化的蛋白质在SDS-PAGE中常常以弥散的条带进 行迁移。用肽-N4(-(N-乙酰-D-氨基葡萄糖基)天冬酰胺酰胺酶(PNGase F)处理之后带 宽的显著增加和迁移位置的变化被认为表明发生了N-糖基化作用。如果其他类型 的糖基化作用是主要的，其他方法必须被使用。凝集素印迹法提供了一种独立于 糖基化类型(N和O)的方法。凝集素，从各种植物组织得到的碳水化合物结合蛋白， 对于许多在糖蛋白聚糖上发现的确定的糖表位不但具有高的亲和力且具有窄的特 异性(Cummings，R.D.(1994)Methods in Enzymol.230，66-86.)。当与生物素或地高辛 结合时，利用与碱性磷酸酶连接的抗生物素蛋白或抗-地高辛抗体，可以容易地通 过比色反应在膜印迹上将它们鉴定出(Haselbeck，et al.(1993)Methods in Mol.Biol. 14，161-173.)，这类似于蛋白质印迹中使用的二抗-碱性磷酸酶反应。用一组具有清 楚限定的特异性的凝集素所进行的筛选可以提供关于糖蛋白的碳水化合物补充物 的大量信息。重要的是，颜色显影放大(color development amplification)是足够 高的，以致10-50ng的糖蛋白能容易地在SDS-PAGE的膜印迹上看见。尽管凝集 素对它们的同系配体显示出很高的特异性，一些人的确非常希望了解结构相关的 表位。因此，重要的是，当选择一组凝集素时，应该注意交叉反应性的可能性， 并使用那些最有可能将复合的、杂合的和高甘露糖的N-连接聚糖与O-连接的结构 独立地区分开来的凝集素。

[0272]单糖分析也可以被用来确定sHASEGP是否被糖基化，并且在凝集素分析 的情况下，这提供了关于结构特征的额外信息。定量单糖成分分析i)鉴定糖基化 蛋白，ii)给出各种糖与蛋白质的摩尔比，iii)在某些情况下提示寡糖类型的存在， iv)是设计结构阐明策略(structural elucidation strategy)的第一步，和v)为用于 重组糖蛋白疗法的产品的一致性提供了一种测量手段。近年来，使用脉冲电流检 测(pulsed amperometric detection)的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)已被 广泛用于测定单糖成分(Townsend，et al.(1995)in Carbohydrate Analysis： High-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis(Z.El Rassi ed.). pp.181-209.)。更最近地，基于荧光团的标记方法已被引入，并且许多可以以试剂 盒的形式获得。荧光方法的明显优点是灵敏性增加(50倍)。一个潜在的不利之处是， 在水解产物中或者在外部标准混合物(external standard mixture)中，在偶联反应 期间，不同的单糖对荧光团可能显示出不同的选择性。然而，灵敏性的增加和由 可获得的糖蛋白的总量中的一小部分便能鉴定出存在哪些单糖的能力，以及应用 激光诱发荧光所带来的潜在的更大的灵敏性使得该方法具有吸引力。

[0273]小量的sHASEGP的单糖成分分析最好在电印迹——如果待分析的是更少 量的等份的话，等份试样最好是被点印迹——之后，再在PVDF(PSQ)膜上进行 (Weitzhandleret al，(1993)J.Biol.Chem.268，5121-5130.)。PVDF是碳水化合物分析 的理想基质，这是因为一旦通过酸或酶促水解被释放之后，单糖或寡糖都不能再 结合于膜。

[0274]FACE分析是检测sHASEGP的糖基化情况的有效手段。应用了30％寡糖凝 胶的FACEN-连接寡糖作图(Prozyme)便是一种这样的机制。通过用N-聚糖酶 (a.k.a PNGase)进行酶促消化而从100μg的糖蛋白上切下的、经荧光团ANTS标记 并通过电泳分离而得到的寡糖可以用于检测sHASEGP的糖基化情况。通过将样品 和该样品的稀释物以及寡糖标准梯度标记物一同跑胶，可以确定寡糖条带的相对 位置，其中，以聚合度(DP)单位来表示迁移距离。

[0275]H.用于鉴定调节sHASEGP活性的化合物的筛选方法

[0276]本文中例举并描述了若干类分析方法。应该理解的是，透明质酸酶结构域 可以用于其他分析方法。然而，这里要说明的是，透明质酸酶结构域显示出催化 活性。

[0277]同样地，它们对于体外的筛选分析也是理想的。

[0278]它们也可以用于结合分析。

[0279]sHASEGP全长酶原、活性酶和透明质酸酶结构域都被考虑应用于本领域技 术人员已知的筛选分析中，包括本文中所提供的那些分析方法。因此，下面的描 述，如果是涉及透明质酸酶分析，则旨在应用包括sHASEGP在内的任何透明质酸 酶的单链透明质酸酶结构域或其催化活性部分。其他分析例如结合分析也在本文 中提供，特别是应用于sHASEGP，包括任何变体例如其拼接变体。

[0280]1.用于鉴定调节sHASEGP蛋白的透明质酸酶活性的试剂的催化分析方法。 本文提供了用于鉴定sHASEGP，特别是其单链透明质酸酶结构域或催化活性部分 的催化活性的调节物的方法。该描述通过下述步骤实施：将全长酶原或活化形式 的sHASEGP，特别是其单链结构域在受测物质存在的情况下与该sHASEGP的底 物相接触，检测底物的蛋白水解，由此评估该sHASEGP的活性，并将该活性与对 照相比较。例如，对照可以是通过下述步骤评估出的sHASEGP活性：将包括全长 酶原或活化形式在内的sHASEGP，特别是其单链结构域与该sHASEGP的底物相 接触，检测底物的蛋白质水解，由此评估出sHASEGP的活性。在存在和不存在所 述的受测化合物时的结果被比较。活性的差异指示了受测物质调节sHASEGP的活 性。sHASEGP活化切割的激活剂也被考虑到；这样的分析在后面被讨论到。

[0281]在一种实施方案中，多种受测物质在上述的筛选方法中同时被筛选。在另 一实施方案中，sHASEGP从靶细胞中分离出，然后作为工具用于鉴定对所述靶细 胞具有潜在的特异性的试剂。

[0282]在另一种实施方案中，受测物质是治疗性化合物，因此，在受测物质存在 和受测物质不存在的情况下所测得的sHASEGP活性的差异表明靶细胞对治疗性 化合物有应答。

[0283]一种方法包括下述步骤：(a)将sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域与一 种或多种化合物在有助于所述配体和所述化合物相互作用的条件下相互接触；和 (b)在所述的一系列化合物中鉴定出特异性地结合于所述配体的一种或多种化合 物。

[0284]本文中提供的另一方法包括下述步骤：a)将sHASEGP多肽或其透明质酸 酶结构域与该sHASEGP多肽的底物接触，检测底物的降解，由此评估该sHASEGP 多肽的活性；b)在受测物质存在的情况下，将该sHASEGP多肽与该sHASEGP 多肽的底物接触，检测底物的降解，由此评估sHASEGP多肽的活性；和c)比较 在步骤a)和b)中所评估的sHASEGP多肽的活性，从而，由步骤a)中测得的活性 与由步骤b)中测得的活性的差异表明该受测物质调节该sHASEGP多肽的活性。

[0285]在另一种实施方案中，多种受测物质同时被筛选。在比较存在或不存在受 测物质时的HASEGP多肽活性以评估该受测物质是否是该sHASEGP多肽的调节 物时，没有必要平行地测定活性，尽管这样的平行测量是常用的。在一个时间点 测量sHASEGP多肽的活性，并将所测得的活性与该sHASEGP多肽的活性历史值 相比较是可行的。

[0286]例如，可以在受测物质存在的情况下测量该sHASEGP多肽的活性，并与 先前在没有该受测物质的情况下所测得的sHASEGP多肽的活性历史值相比较，反 之亦然。这可以通过在与用于执行分析的试剂盒一同提供的插页或者小册子上提 供该sHASEGP多肽的活性数值来实现。

[0287]用于选择特定sHASEGP的底物的方法在实施例中被描述，并例举了特定 的透明质酸酶分析方法。

[0288]提供了联合物以及含有所述联合物并任选地包括用于实施分析的说明书的 试剂盒。所述联合物包括sHASEGP多肽和待分析的sHASEGP多肽的底物，以及 可任选的用于检测所述底物的水解的试剂。所述底物，可以是生色或荧光分子， 包括糖胺聚糖，可被特定的sHASEGP多肽水解，它可以通过测试该sHASEGP多 肽切割该受测底物的能力而被经验性地鉴定。鉴定出可被最有效地切割的底物， 即，以最低的蛋白浓度和/或最快的速度或在理想的条件下被切割的底物。

[0289]本文中还提供了含有上述联合物的试剂盒。该试剂盒可任选地包括鉴定 sHASEGP多肽的活性的调节物的说明书。任何sHASEGP多肽都被考虑作为鉴定 其活性的调节物的靶标。

[0290]2.结合分析。本文也提供了用于鉴定和分离结合sHASEGPs的试剂特别是 化合物的方法。这些分析是被设计用来鉴定结合于分离的透明质酸酶结构域(或含 有sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域的非sHASEGP多肽的其它蛋白质)的试剂， 或结合于包括衍生自全长酶原或衍生自延伸的透明质酸酶结构域的活化形式在内 的活化形式的试剂。这样被鉴定得到的化合物是用于鉴定用来治疗涉及异常透明 质酸酶活性的紊乱或疾病的化合物的候选化合物或先导化合物。用于所述方法中 的sHASEGP多肽包括本文中定义的任何sHASEGP多肽，包括sHASEGP单链透 明质酸酶结构域或其蛋白质水解活性部分。

[0291]多种方法在本文中被提供。这些方法可以在溶液中或在固相反应中实施， 其中，在固相反应中，sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域通过连接子直接或间 接地连接到固体支持物上。筛选分析被描述于实施例中，并且这些分析方法已经 被用来鉴定候选化合物。

[0292]对于本文的目的，所有上述结合分析都是被提供用于sHASEGP。

[0293]本文提供了鉴定试剂例如化合物的方法，所述试剂特异性地结合于 sHASEGP单链透明质酸酶结构域、全长活化的sHASEGP或其双链透明质酸酶结 构域。该方法可以通过下述步骤来实施：(a)在有利于sHASEGP和试剂之间发生 结合的条件下，将sHASEGP与一种或多种受测试剂接触；和(b)在所述的一系 列试剂中鉴定出特异性地结合sHASEGP的一种或多种试剂。

[0294]例如，在实施这样的方法时，将sHASEGP多肽与可能的结合伴侣或细胞 提取物或细胞级分在允许潜在的结合伴侣与多肽相结合的条件下混合。在混合之 后，将已与sHASEGP结合的肽、多肽、蛋白或其他分子从混合物中分离出来。结 合到sHASEGP上的结合伴侣然后可以被移走并作进一步的分析。为了鉴定和分离 结合伴侣，整个蛋白质例如SEQ ID No.1的整个公开的蛋白质可以被使用。可选 择地，可以使用该蛋白质的片段。

[0295]许多方法都可以被用来获得细胞提取物或体液，诸如血液、血清、尿、汗 液、滑液、CSF和其他这样的液体。

[0296]例如，可以使用物理或化学破碎方法将细胞破碎。物理破碎方法的例子包 括但不限于超声波和机械剪切。化学裂解方法的例子包括但不限于去污剂裂解和 酶裂解。为了获得用于本方法的提取物，技术人员可以方便地采用制备细胞提取 物的方法。

[0297]一旦细胞的提取物被制备得到，在蛋白质和结合伴侣能够结合的条件下， 将提取物与sHASEGP混合。可以使用各种条件，包括类似于人细胞的细胞质中的 条件或体液中的条件的条件，所述体液例如血液。特性，例如所使用的细胞提取 物的重量克分子渗透浓度、pH、温度和浓度可以被改变，以优化蛋白质与结合伴 侣的结合。类似地，用于从体液中分离出感兴趣的分子的方法也是已知的。

[0298]在合适的条件下混合之后，将结合的复合体从混合物中分离出来。可以使 用各种技术来分离混合物。例如，对sHASEGP具有特异性的抗体可以被用来免疫 沉淀结合伴侣复合体。可选择地，可以使用标准的化学分离技术诸如层析和密度/ 沉淀离心。

[0299]将提取物中的非结合的细胞组分除去之后，可以使用常规方法，将结合的 伴侣从复合体上解离下来。例如，可以通过改变混合物的盐浓度或pH来完成解离 作用。

[0300]为了帮助将结合在一起的结合伴侣对从混合提取物中分离出来，可以将 sHASEGP固定到固体支持物上。例如，该蛋白质可以附着到硝化纤维基质或丙烯 酸珠子上。该蛋白质或其片段与固体支持物的粘附有助于将肽/结合伴侣对与提取 物中的其他组分分离开来。被鉴定出的结合伴侣可以是单个蛋白质或由两个或更 多个蛋白质构成的复合物。

[0301]可选择地，编码单链透明质酸酶的核酸分子可以被用于酵母双杂交系统。 酵母双杂交系统已被用于鉴定其他的蛋白伴侣对，并且可以容易地加以应用，以 利用本文中描述的核酸分子。

[0302]其他的体外结合分析，特别是sHASEGP的体外结合测定，使用的是多肽 的混合物，其至少包括这些蛋白质中的一个的催化结构域和一个或多个候选结合 目标或底物。在合适的条件下温育混合物之后，sHASEGP或其含有催化结构域的 多肽片段结合候选底物或与候选底物相互反应的能力被评估。对于无细胞的结合 分析，这些成分中的一种成分包括可检测的标记或与可检测的标记偶联。所述标 记可以提供直接的检测，诸如放射性、发光性、光密度或电子密度等，或间接的 检测，诸如表位标签、酶等。许多方法都可以被用来检测标记，具体取决于标记 的性质以及其它的分析成分。例如，可被检测的结合于固体基质的标记物或含有 该标记物的结合复合体的一部分，可以从该固体基质上分离出来，然后所述标记 可以被检测。

[0303]3.信号转导的检测。作为膜锚定蛋白的sHASEGP，可以直接或间接地涉及 信号转导，即，可以直接作为细胞表面受体参与信号转导，或间接地通过激活蛋 白质例如能够引发信号转导的促生长因子来参与信号转导。

[0304]此外，分泌的sHASEGP，诸如SEQ ID NO.4中描述的sHASEGP的可溶性 结构域可以参与信号转导，或者直接地通过结合到细胞表面受体或与细胞表面受 体相互作用而进行，或间接地通过激活蛋白质例如可以引发信号转导的促生长因 子而进行。用于评价信号转导的分析方法是本领域技术人员已知的，它们可以适 用于sHASEGP多肽。

[0305]提供了用于鉴定可影响或改变信号转导的试剂的分析方法，所述信号转导 由sHASEGP直接或间接地介导的，特别地，例如通过全长的sHASEGP或 sHASEGP的足以将胞外结构域或其功能部分锚定在细胞表面的部分来激活促生长 因子。这样的分析例如包括基于转录的分析，其中，转导信号的调节是通过检测 对报告基因表达的影响而被评估的(参见美国专利5,436,128)。

[0306]4.用于鉴定调节编码sHASEGP的核酸的表达的试剂的方法。另一实施方 案提供了用于鉴定调节sHASEGP编码核酸的表达的试剂的方法。这样的分析方法 可以使用任何可利用的用于监控编码sHASEGP的核酸的表达水平的变化的手段。

[0307]可以使用任何分析形式来监控试剂调节编码sHASEGP的核酸的表达的能 力。例如，mRNA表达可以通过与核酸的杂交而被直接监测。而且，所描述的酶 分析方法可以被用来检测可调节sHASEGP的表达的试剂。

[0308]在合适的条件下和在合适的时间，将细胞系暴露于待被测试的试剂，并通 过标准的程序分离总RNA或mRNA(参见，例如Sambrook et al(1989) MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press)。用于检测暴露于试剂的细胞和对照细胞之间在RNA表达水平上 的差异的探针可以由核酸制备得到。通常地，但不是必需的，所设计的探针在高 严紧度的条件下只与目标核酸杂交。在高严紧度的条件下，只有高度互补的核酸 杂交体形成。因此，分析条件的严紧度决定了为了能够形成杂交体而在两核酸链 之间应该存在的互补的数量。应该选择可以将探针：靶标杂交体和可能的探针：非靶 标杂交体之间的稳定性的差异最大化的严紧度。

[0309]例如，sHASEGP的N末端和C末端片段可以表达在细菌中，并用来搜索 与这些片段相结合的蛋白质。融合蛋白，例如在sHASEGP的N或C末端区域融 合有His标记或GST的蛋白可以被制备，以用作底物。这些融合蛋白可以偶联到 例如谷胱甘肽-琼脂糖珠子上，然后探查细胞裂解物或体液。在裂解之前，细胞或 体液可以用候选试剂处理，所述候选试剂能够调节sHASEGP或与其上的结构域相 互作用的蛋白。结合于所述融合蛋白的裂解物蛋白可以用SDS-PAGE来分辨、通 过蛋白质测序或质谱分析进行分离和鉴定，如本领域所知的。

[0310]抗体探针可以通过使用肽、多肽或蛋白质，采用合适的免疫方案，对合适 的哺乳动物宿主进行免疫而制备得到，如果所述的肽、多肽或蛋白质足够长(例如 sHASEGP多肽的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、 40或更多的连续氨基酸)，或者如果需要增强免疫原性的话，可以将它们偶联到合 适在载剂上。用于制备携有载剂——例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH) 或其他载剂蛋白质——的免疫原性偶联物的方法是本领域已知的。在某些情况下， 使用例如碳二亚胺试剂所进行的直接偶联是有效的；在其他例子中，连接试剂诸 如那些由Pierce Chemical Co.，Rockford，IL提供的试剂是被期望的，它们能使得半 抗原容易被接近。半抗原肽可以在带有Cys残基的氨基或羧基端处延伸出来，或 者缀于多个半胱氨酸残基，例如，这可以方便与载剂的连接。

[0311]免疫原的施用通常可以通过在一段合适的时间内进行注射来完成，可以与 合适的佐剂一同使用，如本领域常规理解的。在实施免疫方案期间，对抗体进行 滴定，以确定形成了足够的抗体。

[0312]抗肽抗体(anti-peptide antibodies)可以应用合成的肽来产生，所述的合成 的肽例如对应于sHASEGP的羧基末端氨基酸。

[0313]合成肽的长度可以小至1-3个氨基酸，通常至少4个氨基酸残基或更长。 可以使用的标准方法，将肽偶联到KLH，并将其免疫到动物诸如兔或有蹄类动物 中。然后可以纯化出多克隆抗体，例如使用含有共价结合的肽的Actigel珠子进行 纯化。

[0314]尽管使用这种方法产生的多克隆抗血清可以满足某些应用，例如药物组合 物，但通常是使用单克隆制剂。如通常所知道的，通过使用Kohler等人的标准方 法(Nature 256：495-7(1975)或进行修饰——该修饰可以实现淋巴细胞或脾细胞的无 限增殖，可以制备出分泌期望的抗体的无限增殖细胞系。通过免疫测定，筛选出 分泌期望的抗体的无限增殖细胞系，其中，抗原是肽半抗原、多肽或蛋白质。

[0315]当分泌期望抗体的合适的无限增殖细胞系被鉴定出之后，该细胞可以借助 于腹水在体外培养或在体内产生。特别有价值的是识别sHASEGP的催化结构域或 活化切割位点(区域)的单克隆抗体。

[0316]也可以产生抗体或片段。特异性地结合受体的期望区域的区域也可以利用 多个物种来源以嵌合体的形式产生。

[0317]在上述方法中被分析的试剂可以是被随机选择的或者被理性选择或设计 的。

[0318]试剂可以是例如肽、小分子和碳水化合物。本领域技术人员容易理解，对 试剂的结构性质是没有限制的。

[0319]如本领域所知道的，肽试剂可以使用标准的固相(或液相)肽合成方法来 制备。此外，编码这些肽的DNA可以使用商业上可获得的寡核苷酸合成仪器合成， 并使用标准的重组生产系统重组产生。如果欲包括进非基因编码的氨基酸，则使 用固相肽合成的生产方法是必需的。

[0320]I.治疗方法

[0321]由本文中的方法鉴定出的sHASEGP被用于治疗或预防sHASEGP底物在动 物特别是哺乳动物包括人中的异常积聚。在一种实施方案中，该方法包括给予哺 乳动物有效量的sHASEGP多肽，从而疾病或紊乱得以治疗或预防。

[0322]在另一实施方案中，sHASEGP抑制剂可以被用于处理过量的中性透明质酸 酶活性。被处理的哺乳动物可以是人。本文中所使用的抑制剂是那些通过筛选分 析鉴定出来的抑制剂。此外，考虑了抗体或反义核酸或双链RNA(dsRNA)，诸如 RNAi。

[0323]1.反义治疗(antisense treatment)：在特定的实施方案中，如上文所描述的， sHASEGP多肽功能可以被sHASEGP多肽反义核酸降低或抑制，从而治疗或预防 过度的软骨素酶活性。提供了至少6个核苷酸，一般可高达150个核苷酸的核酸 的治疗或预防用途，这些核酸对于编码sHASEGP多肽或其部分的基因或cDNA是 反义的。本文中所使用的sHASEGP多肽“反义”核酸指这样的核酸，其借助于一 定程度的序列互补性，并且通常在高严紧度的条件下，能够与sHASEGP多肽 RNA(一般是mRNA)的一部分序列相杂交的核酸。反义核酸可以与sHASEGP多肽 mRNA的编码和/或非编码区域相互补。这样的反义核酸具有治疗剂的用途，其可 以减弱或抑制sHASEGP多肽功能，可以用于治疗或预防上述的紊乱。

[0324]sHASEGP多肽反义核酸至少6个核苷酸，通常是寡核苷酸(范围在6至约 150个核苷酸内，包括6至50个核苷酸)。反义分子可以与透明质酸酶结构域的所 有或部分序列互补。例如，寡核苷酸至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少 100个核苷酸或至少125个核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物 或其衍生物或修饰形式，可以单链的或双链的。寡核苷酸可以在碱基部分、糖部 分或磷酸骨架上有修饰。寡核苷酸可以包括其他附加的基团，诸如肽或有助于转 运通过细胞膜的试剂(参见，例如Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86： 6553-6556(1989)；Lemaitre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652(1987)；PCT 公开号WO 88/09810，公开于1988年12月15日)或有助于转运通过血脑屏障的试 剂(参见例如PCT公开号WO 89/10134，公开于1988年4月25日)、杂交引发切 割试剂(hybridization-triggered cleavage agents)(参见例如Krol et al.，BioTechniques 6：958-976(1988))或间插试剂(参见例如Zon.Pharm.Res.5：539-549(1988))。

[0325]sHASEGP多肽反义核酸通常是寡核苷酸，通常是单链DNA或RNA或其类 似物或其混合物。例如，该寡核苷酸包括与编码人sHASEGP多肽的核酸的一部分 序列反义的序列。寡核苷酸可以用本领域已知的取代物在它的结构的任何位置进 行修饰。

[0326]sHASEGP多肽反义寡核苷酸可以包括至少一个经修饰的碱基部分，其可以 选自下列但不限于下列：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次 黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫 尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、次黄嘌 呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟 嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、 7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-尿嘧啶、 β-D-mannosylqueosine、5-apos-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲巯-N6- 异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2- 硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、 尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基 -3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶、(ACP3)w和2，6-二氨基嘌呤。

[0327]在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个修饰的糖部分，其可以选自下 述但不限于下列：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。寡核苷酸可以包括至 少一个修饰的磷酸骨架，其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯 (phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三 酯和甲乙缩醛(formacetal)或其类似物。

[0328]寡核苷酸可以是a-异头(anomeric)寡核苷酸。a-异头寡核苷酸与互补RNA 形成特异性的双链杂交体，其中，双链相互平行(Gautier et al.，Nucl.Acids Res. 15：6625-6641(1987))。

[0329]寡核苷酸可以联接到另一分子，例如但不限于肽；杂交引发交联试剂 (hvbridization triggered cross-linking agent)、转运试剂或杂交引发切割试剂 (hybridization-triggered cleavage agent)。寡核苷酸可以使用本领域已知的标准方 法合成，例如使用自动DNA合成仪(例如可以商购自Biosearch，Applied Biosystems 等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可以使用Stein et al.，Nucl.Acids Res.16：3209(1988) 的方法合成；甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用可控有孔玻璃聚合物支持物 (controlled pore glass polymer supports)来制备(Sarin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85：7448-7451(1988))等。在特定的实施方案中，sHASEGP多肽反义寡核苷 酸包括具有催化活性的RNA或核酶(参见如PCT国际公布WO 90/11364，公开于 1990年10月4日；Sarver et al.，Science 247：1222-1225(1990))。在另一实施方案 中，寡核苷酸是2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，Nucl.Acids Res. 15：6131-6148(1987))，或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue et al.，FEBS Lett. 215：327-330(1987))。

[0330]可选择地，寡核苷酸可以是双链RNA(dsRNA)，诸如RNAi。

[0331]在可选择的实施方案中，sHASEGP多肽反义核酸通过外源序列的转录而在 细胞内产生。

[0332]例如，载体可以被导入体内，这样它被细胞吸收，在该细胞中，载体或其 一部分被转录，产生反义核酸(RNA)。这样的载体将含有编码sHASEGP多肽反义 核酸的序列。这样的载体可以保持为附加体的形式或整合入染色体，只要它能被 转录以产生期望的反义RNA。这样的载体可以用本领域标准的重组DNA技术构 建得到。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其他载体，它们可以用于在哺乳 动物细胞内的复制和表达。编码sHASEGP多肽反义RNA的序列的表达可以借助 于本领域已知的在包括人在内的哺乳动物的细胞中起作用的任何启动子。这样的 启动子可以是诱导型的或组成型的。这样的启动子包括但不限于：SV40早期启动 子区域(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981))；包含在劳斯肉瘤病毒的 3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto et al.，Ce//22：787-797(1980))；疱疹胸苷激 酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))；金属硫蛋 白基因的调控序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))等。

[0333]反义核酸包括这样的序列，即，该序列与HASEGP多肽基因——包括人 sHASEGP多肽基因——的RNA转录子的至少一部分互补。绝对的互补是不被要 求的。可有效地治疗或预防赘生性疾病的sHASEGP多肽反义核酸的量取决于疾病 的性质，并且可以通过标准的临床技术经验性地确定。

[0334]如果可能，在用人进行测试和进行应用之前，在体外测定在细胞中的反义 细胞毒性(antisense cytotoxicity)然后再在有用的动物模型系统中进行测定是被需 要的。

[0335]2.RNA干扰。RNA干扰(RNAi)(参见例如Chuang et al.(2000)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 97：4985)可以被用来抑制编码sHASEGP的基因的表达。干扰RNA (RNAi)片段，特别是双链(ds)RNAi可以被用来产生sHASEGP功能的丧失。在生 物体中，包括哺乳动物、线虫(C.elegans)、果蝇和植物以及人中，使用RNAi来 使得基因沉默的方法是已知的(参见例如Fire et al.(1998)Nature 391：806-811；Fire (1999)Trends Genet.15：358-363；Sharp(2001)Genes Dev.15：485-490；Hammond et al.(2001)Nature Rev，Genet.2：110-119；Tuschl(2001)Chem.Biochem.2：239-245； Hamilton et al.(1999)Science 286：950-952；Hammond et al.(2000)Nature 404： 293-296；Zamore et al.(2000)Cell 101：25-33；Bernstein et al.(2001)Nature 409： 363-366；Elbashir et al.(2001)Genes Dev.15：188-200；Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-498；国际PCT申请WO 01/29058；国际PCT申请WO 99/32619)。

[0336]表达双链RNA(dsRNA)的构建物被导入宿主，诸如动物和植物，其中使用 可保持为附加体或者可整合入基因组的可复制载体。通过选择合适的序列，dsRNA 的表达可以干扰编码sHASEGP的内源mRNA的积聚。RNAi也可以在体外被用来 抑制表达。

[0337]包括有至少约21(或21)个对sHASEGP具有选择性的(即，对sHASEGP是 独特的)核苷酸的区域，被用来制备RNAi。约21个核苷酸的小片段可以直接(即， 在体内或在体外)转化入细胞中；更大的RNAi dsRNA分子通常通过使用编码它们 的载体而被导入细胞中。dsRNA分子至少约21bp长或更长，例如50、100、150、 200或更长。在体外或体内，将核酸分子导入细胞的方法、试剂和实验方案是本领 域技术人员知道的。

[0338]3.基因疗法。在示范性的实施方案中，借助于基因疗法，给予包括编码 sHASEGP多肽或其功能结构域或其衍生物的核苷酸序列的核酸，以促进sHASEGP 多肽功能。基因疗法是指通过将核酸给予患者而进行的治疗。在该实施方案中， 由核酸产生它的编码蛋白，而该蛋白通过促进sHASEGP多肽功能来实现治疗效 果。可以使用任何本领域可利用的用于基因治疗的任何方法(参见Goldspiel et al.， Clinical Pharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)； Tolstoshev，An.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260： 926-932(1993)；和Morgan and Anderson，An.Rev.Biochem.62：191-217(1993)； TIBTECH 115：155-215(1993))。例如，用于基因治疗的一种治疗组合物包括编码 sHASEGP多肽的序列，其是表达载体的一部分，可以在合适的宿主中表达 sHASEGP多肽或其结构域、片段或嵌合蛋白。特别地，这样的核酸具有与sHASEGP 多肽编码区域有效连接的启动子，该启动子是诱导型的或组成型的，并且，可任 选地，可以是组织特异性的。在另一特定的实施方案中，使用这样的核酸分子， 在该核酸分子中，有助于在基因组的期望位点发生同源重组的区域位于sHASEGP 多肽编码序列和任何其他期望的序列的两侧，从而使得sHASEGP蛋白质核酸可以 在染色体中表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935 (1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。

[0339]将核酸传送到患者，可以是直接的，在这种情况下，病人被直接暴露于核 酸和携带核酸的载体，或可以间接的，在这种情况下，细胞首先用核酸进行体外 转化，然后移植到患者中。这两种途径都是已知的，分别称为体内或离体基因疗 法。

[0340]在特定的实施方案中，核酸被直接体内给药，在体内，它被表达从而产生 被编码的产物。这可以通过利用本领域已知的许多方法中的任何方法来实现，诸 如将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并将它给予患者，由此，它变为细胞 内的物质，这可以例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体来实 现(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击法(例 如基因枪；Biolistic，Dupont)，或包覆以脂质或细胞表面受体或转染试剂，封装在 脂质体、微颗粒或微胶囊中，或通过将其连接到已知能进入核内的肽上并将它给 予患者，或通过将其连接到将遭受受体介导的胞吞作用的配体并将它给予患者(参 见如Wu and Wu，J.Biol.Chem，262：4429-4432(1987))(其可以被用来靶向特异性 表达某些受体的细胞类型)，等等。在另一实施方案中，可以形成核酸-配体复合物 体，在该复合物中，配体是破坏核内体的促融合性病毒肽，这使得核酸可以免遭 溶酶体降解。在另一个实施方案中，通过靶向特异性的受体，核酸可以在体内被 作为靶标，被细胞特异性地吸收和表达(参见例如PCT公布WO 92/06180，日期为 1992年4月16日，(Wu et al.)；WO 92/22635，日期为1992年12月23日(Wilson et al.)；WO 92/20316，日期为1992年11月26日(Findeis et al.)；WO 93/14188，日 期为1993年7月22日(Clarke et al.)，WO 93/20221，日期为1993年10月14日 (Young))。可选择地，核酸可以被导入细胞内，并整合入宿主细胞DNA中以便于 表达，这是通过同源重组进行的(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86： 8932-8935(1989)；Zijistra et al.，Nature 342：435-438(1989))。

[0341]在特定的实施方案中，可以使用含有sHASEGP多肽核酸的病毒载体。例 如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller et al.，Meth.Enzymol.217：581-599 (1993))。这些逆转录病毒载体已被修饰以剔除对于病毒基因组的包装和整合入宿 主细胞DNA是非必要的逆转录病毒序列。用于基因疗法的sHASEGP多肽核酸被 克隆入载体，其帮助基因传送到患者中。关于逆转录病毒载体的更为详细的描述 可以参见Boesen et al.，Biotherapy 6：291-302(1994)，其公开了使用逆转录病毒载体 将mdr1基因传送给造血干细胞，以便使干细胞对化学疗法更具抗性。

[0342]阐述逆转录病毒载体在基因治疗中的应用的其他参考文献是：Clowes et al.， J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；和Grossman and Wilson，Curr. Opin.In Genetics And Devel.3：110-114(1993)。

[0343]腺病毒是可以用于基因治疗的另一种病毒载体。腺病毒是可以用来将基因 传送给呼吸上皮细胞的特别具有吸引力的载体。腺病毒天然地感染呼吸上皮细胞， 在那里它们引起轻微的疾病。基于腺病毒的传送系统的其他靶标是肝、中枢神经 系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染未分裂细胞的优点。Kozarsky and Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)综述了基于腺 病毒的基团治疗。Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)证明了使用腺病毒 载体将基因转移到猕猴的呼吸上皮细胞。腺病毒在基因治疗中的应用的其他例子 参见Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155 (1992)；和Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)。

[0344]腺相关病毒(AAV)已被提议用于基因疗法(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol. Med.204：289-300(1993))。

[0345]基因治疗的其他途径涉及，通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导转染或 病毒感染的方法，将基因转移到组织培养物的细胞中。通常，转移的方法包括将 选择性标记转移到细胞中。然后对细胞进行选择，以分离出已经吸收并正在表达 被转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞传送给患者。

[0346]在这种实施方案中，将核酸导入细胞，然后再在体内给予所得到的重组细 胞。这种导入可以用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、 微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体进行感染、细胞融合、染色体介导 的基因转移、微细胞(microcell)介导的基因转移、原生质体融合等。用于将外源 基因导入细胞的许多技术是本领域已知的(参见如Loeffler and Behr，Meth.Enzymol. 217：599-618(1993)；Cohen et al.，Meth.Enzymol.217：618-644(1993)；Cline， Pharmac.Ther.29：69-92(1985))，并且它们都可以被使用，只要作为接受者的细胞 的必要的发育和生理功能不被破坏。该技术应该能够稳定地将核酸转移入细胞中， 这样，核酸被细胞表达并且通常能遗传给子代细胞并被子代细胞表达。

[0347]所获得的重组细胞可以通过本领域已知的各种方法被传送给患者。在一种 实施方案中，上皮细胞被注射，例如进行皮下注射。在另一实施方案中，重组皮 肤细胞可以用作皮移植片，移植到患者上。重组血细胞(例如造血干细胞或祖先细 胞)可以通过静脉给予。欲使用的细胞的数量取决于所想要的效果、患者的状态等， 并可以由本领域技术人员确定。

[0348]可以导入核酸以便实施基因治疗的细胞包括任何期望的可以利用的细胞类 型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质化细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、 肝细胞；血细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒 细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干 细胞或祖细胞，例如诸如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏和其他来源获得的 细胞。

[0349]例如，用于基因治疗的细胞对于患者是自体的。在重组细胞被用于基因治 疗的实施方案中，sHASEGP多肽核酸被导入细胞中，这样，它被细胞或它们的子 代表达，然后该重组细胞被体内施用以获得治疗效果。在特定的实施方案中，使 用干细胞或祖细胞。依据该实施方案，可以体外分离和培养的任何干细胞和/或祖 细胞都具有潜在应用价值。

[0350]这样的干细胞包括但不限于造血干细胞(HSC)、上皮组织诸如皮和肠内膜 (lining)的干细胞、胚胎心脏干细胞、肝脏干细胞(PCT公开号WO 94/08598，日 期为1994年4月28日)和神经干细胞(Stemple and Anderson，Cell 71：973-985 (1992))。

[0351]上皮干细胞(ESC)或角质化细胞可以通过已知的程序从组织诸如皮肤和肠 内膜获得(Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229(1980))。在成层上皮组织诸如皮肤 中，通过胚层——最靠近基膜的层——内的干细胞的有丝分裂，发生更新作用 (renewal)。肠内膜内的干细胞使得该组织可以快速的更新。从患者或供体的皮肤 或肠内膜获得的ESC或角质化细胞可以培养在组织培养基中(Rheinwald，Meth. Cell Bio.21A：229(1980)；Pittelkow and Scott，Cano.Clinic Proc.61：771(1986))。如 果ESC由一个供体提供，也可以使用抑制宿主对移植物的反应活性的方法(例如 放射、给予药物或抗体，以促进温和的免疫抑制)。

[0352]至于造血干细胞(HSC)，能分离、增殖或体外培养HSC的任何技术都可以 用于本实施方案中。可以被用来实现这些实施方案的技术包括(a)从骨髓细胞分离 并建立HSC培养物，所述骨髓细胞分离自未来的宿主或者供体；(b)应用先前建立 的长期HSC培养物，其可以是过敏原性的或异种的。

[0353]在使用非自体的HSC时，通常也使用抑制未来宿主/患者的移植免疫反应的 方法。在特定的实施方案中，人骨髓细胞可以通过针吸法(needle aspiration)从后 髂嵴获得(参见例如Kodo et al.，J.Clin.Invest.73：1377-1384(1984))。例如，HSC可 以制备成高度富集或基本上纯的形式。所述的富集可以在长期培养之前、期间或 之后完成，并且可以使用本领域已知的任何技术来进行。骨髓细胞的长期培养可 以通过使用例如修饰的Dexter细胞培养技术(Dexter et al.，J.Cell Physiol.91：335 (1977))或Witlock-Witte培养技术(Witlock and Witte，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79： 3608-3612(1982))来建立和维持。

[0354]在特定的实施方案中，待被导入以进行基因治疗的核酸包括有效连接于编 码区域的诱导型启动子，这样，该核酸的表达通过控制合适的转录诱导物的存在 或不存在而得以控制。

[0355]3.药物前体(prodrugs)-提供了治疗肿瘤的方法。该方法通过给予药物前 体而得以实施，该药物前体被HASEGP在特定的位点切割从而释放出活性药物或 能够在体内被转化为活性药物的前体(precursor)。一旦与表达sHASEGP活性的 细胞接触，所述药物前体被转化为活性药物。药物前体可以是共轭物(或称为偶 联物)，其含有连接到目标sHASEGP的底物上的活性试剂，诸如抗肿瘤药物，例 如细胞毒性试剂或其他治疗试剂(TA)，这样，该共轭物中的药物或试剂是无活性的 或者不能进入细胞，但是在切割之后便被激活。例如，药物前体可以含有硫酸软 骨素分子，通常是相对短的小于约20个双糖单位的，其被目标sHASEGP催化切 割。细胞毒性试剂包括但不限于烷化剂、抗增殖剂和微观蛋白结合试剂。其他的 包括长春花类药物(vinca drugs)、丝裂霉素、争光霉素和紫杉醇。

[0356]J.药物组合物和给药方式

[0357]1.组合物的成分。本文提供了含有活性sHASEGP的药物组合物。本文也 提供了调节sHASEGP多肽活性的化合物与其它的用于治疗透明质酸酶紊乱的疗 法或化合物诸如抗体化合物的联合。

[0358]sHASEGP多肽和另外的试剂可以作为分离开的组合物进行包装，以便可以 一起给药或连续给药或间断给药。可选择地，它们可以提供为单一的组合物来施 用，或提供为两种组合物但给药时作为单一的组合物。所述的这些联合可以包装 为试剂盒。

[0359]2.制剂和给药途径

[0360]本文中提供的sHASEGP多肽和其可溶性人透明质酸酶结构域可以配制成 药物组合物，通常用于单剂量给药。所述制剂中的多肽的浓度可以用效地传送在 给药之后对于目的治疗为有效的量。通常，组合物被配制成便于单次剂量给药的 形式。为了配制组合物，一定重量分数的sHASEGP多肽、其可溶性人透明质酸酶 结构域或其混合物以有效的浓度溶解、悬浮、分散或者混合于所选择的媒介物中， 这样，被治疗的症状可以被缓解或改善。

[0361]适用于本文提供的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的给药的药 物载体或媒介物包括本领域技术人员所知道的适用于特定的给药模式的任何载 体。

[0362]此外，多肽可以作为组合物中唯一的药物活性组分而配制于组合物中，或 者，可以与其他活性组分组合。脂质体悬浮液，包括以组织为靶标的脂质体，也 可以用作药物学上可接受的载体。这些都可以依据本领域技术人员已知的方法来 制备。例如，脂质体制剂可以按美国专利4,522,811中所述的制备。

[0363]活性sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域被包括于药物学上可接受 的载体中，其数量足以在不对被治疗的患者产生不利副作用的情况下产生治疗上 有用的效果。治疗上有效的浓度可以通过在已知的体外和体内系统中测试多肽而 经验性地确定，例如其中可以使用本文中提供的分析方法，或参见Taliani et al. (1996)Anal.Biochem.240：60-67，Filocamo et al.(1997)J Virology 71：1417-1427， Sudo et al.(1996)Antiviral Res.32：9-18；Buffard et al.(1995)Virology 209：52-59； Bianchi et al.(1996)Anal.Biochem.237：239-244；Hamatake et al.(1996) Intervirology 39：249-258；Steinkühler et al.(1998)Biochem.37：8899-8905；D′Souza et al.(1995)J.Gen.Virol.76：1729-1736；Takeshita et al.(1997)Anal.Biochem.247： 242-246；也参见例如Shimizu et al.(1994)J Yirol.68：8406-8408；Mizutani et al. (1996)J.Virol.70：7219-7223；Mizutani et al.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun. 227：822-826；Lu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93：1412-1417；Hahm et al. (1996)Virology 226：318-326；Ito et al.(1996)J.Gen.Virol.77：1043-1054；Mizutani et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.212：906-911；Cho et al.(1997)J.Virol. Meth.65：201-207，然后由此推断出用于人的剂量。

[0364]通常，考虑治疗上有效的剂量。被给予的量可以在每毫升血液体积0.001 至1mg的级别，包括约0.005-0.05mg/ml血液体积和约0.01mg/ml血液体积。制 备药物的单元剂量形式(Pharmaceutical dosage unit forms)，其在每单元剂量形式 中可提供约1mg至约1000mg的必需活性组分或必需组分的组合，包括约10至约 500mg，包括约25-75mg的必需活性组分或必需组分的组合。精确的剂量可以经验 性地确定。

[0365]在一些例子中，优选高单元剂量的人sHASEGP。例如，对于sHASEGP的 静脉内给药，优选的sHASEGP浓度为每毫升500-100,000单位。冻干的sHASEGP 制剂对于保存大的单元剂量的sHASEGP是理想的。考虑将200,000单位的 sHASEGP冻干小瓶装制剂用于静脉内传送。

[0366]高浓度的剂量也被考虑用于传送小体积的sHASEGP。在白内障和有晶体眼 人工晶体植入手术期间，考虑将10-100μl的5000单位/ml的sHASEGP注射入眼 睛前房，以溶解之前施用的粘弹性物质。50-200U/ml剂量的小体积注射也被考虑 用于玻璃体内操作，例如治疗糖尿病视网膜病的玻璃体出血或玻璃体视网膜脱落。

[0367]活性组分可以一次给予，或者可以分为较小的剂量，间隔一段时间给药。 可以理解的是，精确的剂量和治疗的持续时间取决于正在被治疗的疾病，并且可 以使用已知的测试方案经验性地确定，或由体内或体外的测试数据推出。应该注 意的是，浓度或剂量值也可以随待减轻的症状的严重程度而有所变化。进一步应 该理解的是，对于任何特定的患者，具体的剂量方案应该随着时间的推移，根据 个体的需要以及实施和监控该组合物的给药的人员的专业判断作出调整，应该理 解本文中所阐述的浓度范围仅仅是示范性的，不是为了限制所要求保护的组合物 和含有它们的联合物的范围或应用。

[0368]药学上可接受的衍生物包括酸、盐、酯、氢氧化物、溶剂化形式和药物前 体形式。通常所选择的衍生物的药物动力学特性优于对应的中性sHASEGP或其可 溶性人透明质酸酶结构域。

[0369]因此，为了全身性的、外部的或局部的给药，将有效浓度或数量的一种或 多种在本文中提供的多肽或其药学上可接受的衍生物与合适的药物载体或媒介物 混合，从而形成药物组合物。sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域以可 有效地改善或治疗正被考虑处理的紊乱的量包括在其中。组合物中活性多肽的浓 度取决于活性多肽的吸收、失活、排放率、给药方案、给药量、具体剂型以及本 领域技术人员已知的其他因素。

[0370]用于本方法的治疗剂可以通过本领域技术人员已知的任何途径来施用，例 如但不限于局部给药、关节内给药、脑池内给药、眼内给药、心室内给药、鞘内 给药、静脉内给药、肌内给药、腹腔内给药、皮内给药、气管内给药以及其中的 任何两种或更多种给药途径的组合。也可尝试干粉状肺制剂(dry powder pulmonary formulations)。

[0371]最合适的给药途径将依据所打算的用途而变化，所述的用途例如用作传送 试剂(delivery agent)以促进液体的皮下传送、用来降低接受粘弹性物质的青光眼 患者的眼内压力，或用作“扩散剂”以增强化学治疗剂的活性，还将依据感兴趣 的位置而变化，所述的位置例如具体的内脏、肿瘤生长物、眼内腔和表皮。给药 的方式包括但不限于外部给药、局部给药、关节内给药、脑池内给药、眼内给药、 心室内给药、鞘内给药、静脉内给药、肌肉内给药、气管内给药、腹腔内给药、 皮内给药以及其中的任何两种或更多种给药方法的组合。例如，对于各种癌症的 治疗，例如鳞状细胞癌、乳腺癌、膀胱癌和肠胃癌的治疗，局部给药，包括给药 于肿瘤生长的位点(例如，鞘内给药、心室内给药或脑池内给药)，是有益的，其优 点在于，治疗剂可以高的浓度被施用，而无并发症的危险，而这些并发症会伴随 着治疗剂的全身性给药而发生。

[0372]适合用于本文中提供的sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域的 给药的药物或饰容载体或媒介物包括本领域技术人员已知的适合于该特定的给药 方式的任何载体。此外，多肽可以作为组合物中唯一的药学上具有活性的组分而 被配制，或可以与其他活性组分组合配制，其中，所述的其他活性组分不会损害 所想要的作用，或与能够补充所想要的作用的材料组合配制，这是本领域技术人 员所知道的。例如，本文中提供的sHASEGP多肽可以作为传送试剂或“扩散”剂 与另一活性化合物组合，以促进所述的另一活性组分的传送或增强所述的另一活 性组分的活性，所述的另一活性化合物例如治疗活性试剂，包括但不限于药物或 药物前体。在特定的实施方案中，sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域 可以与麻醉剂诸如利多卡因、布比卡因或两者的化合物以及可任选的激素试剂例 如肾上腺素共同配制成制剂，以在眼科手术期间减少或停止血液摄取。sHASEGP 多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域可以与各种化学治疗剂例如毒素和肿瘤坏死 因子共同配制成制剂，以增强所述化学治疗剂的活性和/或目标肿瘤对所述化学治 疗剂的可接触性。活性化合物以足以产生治疗上有用的效果而不对接受治疗的个 体产生严重的毒性作用的量包含于载体中。有效浓度可以通过使用体外或体内系 统——包括本文中描述的动物模型——来测试化合物而经验性地确定。

[0373]用于肠胃外、皮内、皮下或外部应用的溶液或悬浮液，可以包括下述的任 何成分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙 二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂， 例如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；掩蔽剂(cheating agents)，例如乙二铵四乙酸(EDTA)； 缓冲液，例如醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液；以及用于调整渗透压的 试剂，包括但不限于氯化钠、氯化钙、氯化镁、右旋糖、丙三醇或硼酸。肠胃外 给药的制剂可以装入由玻璃、塑料或其他合适材料制成的安瓿、一次性注射器或 者单剂量或多次剂量的小瓶中。

[0374]sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域可以以微粉化的形式或其他 合适的形式被悬浮，或可以被衍生化以产生更加可溶性的活性产物或产生药物前 体。所得到的混合物的形式取决于许多因素，包括预期的给药方式和多肽在所选 择的载体或媒介物中的溶解性。有效的浓度是足以改善目标症状的浓度，并可以 使用本领域技术人员已知的方法经验性地确定。为了配制组合物，一定重量分数 的多肽以可有效缓解或改善的所要治疗的症状的浓度被溶解、悬浮、分散或者混 合于所选择的媒介物中。

[0375]在sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域显示出不足的溶解性的 情形下，可以使用溶解多肽的方法。此类方法是本领域技术人员知道的，包括但 不限于使用辅助溶剂诸如二甲亚砜(DMSO)、使用表面活性剂诸如TWEEN和 PluronicF68；或者溶解在含水碳酸氢钠中。多肽的衍生物，诸如多肽的药物前体， 也可以用于配制有效的药物组合物。对于眼科适应症，将组合物配制在眼科可接 受的载体中。对于本文中的眼科用途，考虑局部给药，这可以通过外部给药或通 过注射给药来进行。缓时释放制剂也是理想的。通常，组合物可以配制成用于单 剂量给药的形式，这样的单次剂量可以提供有效的数量。

[0376]在将多肽与媒介物混合或将多肽加入媒介物后，所得到的混合物可以是溶 液、悬浮液、乳液或其他组合物，并可以配制成含水混合物、乳液、胶状物、药 膏、乳剂、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、糊状、泡沫、气溶胶、灌洗剂、 喷雾剂、栓剂、绷带形式或任何其他的适于全身性给药、外部给药或局部给药的 制剂形式。

[0377]所得的混合物的形式取决于许多因素，包括预期的给药方式和化合物在所 选择的载体或媒介物中的溶解性。如果必要的话，可以制备成化合物的药学上可 接受的盐或其他衍生物。对于局部的内部给药，诸如肌肉内给药、肠胃外给药或 关节内给药，化合物优选用含水介质例如等渗缓冲盐水配制成悬浮溶液，或者与 适用于内部给药的生物相容性支持物或生物粘合剂组合起来。

[0378]sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域被包括于药学上可接受的载 体中，其数量足以在不对接受治疗的患者产生不利副作用的情况下产生治疗上有 用的效果。应该理解的是，副作用的数量和程度取决于化合物被给药时的情况。 例如，某些毒性的和不利的副作用在治疗威胁生命的疾病时是可以接受的，而在 治疗具有较轻后果的紊乱时则是无法接受的。对治疗用途而言有效的量当然将取 决于疾病的严重性和患者的体重和总体状态以及给药途径。尽管在局部给药之后 治疗剂的局部浓度在某些情况下可能高于全身性给药后安全获得的浓度，但治疗 剂的局部给药通常需要比任何方式的全身性给药的剂量都要小的剂量。

[0379]因为各个患者的症状的严重程度各有不同，而且每种治疗剂都具有其独特 的治疗特性，所以实施人员应该确定患者对治疗的反应，并相应地改变剂量。在 体外使用的剂量可以为药学组合物的原位施用数量提供有用的指导，并且动物模 型在某些情况下可以被用来确定治疗具体的紊乱时的有效剂量。总的来说，对于 局部给药，可以考虑，治疗剂的有效量为每kg体重约0.1皮克(pg)至约1ng的范围 内。获得有效剂量时的各种考虑因素对本领域技术人员来说是已知的，并已被描 述(参见如Goodman And Gilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990；和Mantyh et al.，Science，278：275-79，1997，其涉 及鞘内注射神经元特异性配体-毒素，其中的每一篇文献都通过引用方式整体并入 本文)。

[0380]本文中应用的sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域的制剂包括 那些适用于口服给药、直肠给药、外部给药、吸入给药、口腔含化给药(例如舌下 含化给药)、肠胃外给药(例如皮下、肌肉内、皮内或静脉内)、透皮给药或任何给 药途径的制剂。在任何给定情况下的最合适的途径取决于正在治疗的症状的性质 和严重性，以及正在使用的特定活性化合物的性质。制剂可以以单元剂量形式给 予人和动物，诸如片剂、胶囊、药丸、粉剂、颗粒、无菌肠胃外给药溶液或悬浮 液、口服给药溶液或悬浮液、和油-水乳剂，它们都含有合适数量的多肽和/或其他 试剂或其药学上可接受的衍生物。药学上具有治疗活性的多肽和/或其他试剂和其 衍生物通常以单元剂量形式或多剂量形式配制并给药。本文中所使用的单元剂量 形式是指适用于人和动物个体的物理上独立的单元，它们被独立包装，如本领域 已知的。

[0381]药物组合物可以以单元剂量形式给予人和动物，诸如片剂、胶囊、药丸、 粉末、颗粒、无菌肠胃外给药溶液或悬浮液、口服给药溶液或悬浮液、和油-水乳 剂，它们都含有合适数量的sHASEGP多肽和/或其可溶性人透明质酸酶结构域和 可任选的另一试剂或其药学上可接受的衍生物。药学上具有治疗活性的化合物和/ 或其衍生物通常以单元剂量形式或多剂量形式配制并给药。本文中所使用的单元 剂量形式是指适用于人和动物个体的物理上独立的单位，并独立地包装，如本领 域已知的。每一单元剂量含有足以产生期望的治疗效果的预先确定数量的治疗上 有活性的化合物，所述化合物与必需的药物载体、媒介物或稀释剂结合。单元剂 量的形式的例子包括但不限于安瓿、注射器和各自包装的片剂或胶囊。例如，含 有稳定溶液和1至5000单位的sHASEGP的小体积诸如5至50μl的制剂可以预先 包装于注射器中，例如可以在粘弹性试剂注射之后使用。单元剂量形式可以以其 小部分给药或多倍地给药。多剂量形式是一系列完全相同的单元剂量形式，其包 装于单个容器中，可以以分离的单元剂量形式被施用。多剂量的形式的例子包括 小药水瓶、片剂瓶或胶囊瓶或品脱瓶或加仑瓶。因此，多剂量形式是在包装中不 隔离开来的单元剂量形式的倍数。

[0382]除了活性组分例如sHASEGP多肽之外，组合物可以含有：稀释剂，诸如 乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑 石；和粘合剂，诸如淀粉、天然胶，例如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙 烯吡咯烷、纤维素和其衍生物，聚维酮、交聚维酮和其他这样的粘合剂，如本领 域技术人员所知道的。液体的药学上可施用的组合物可以通过例如将上面定义的 活性化合物和可任选的药物佐剂溶解、分散或混合在载体中，从而形成溶液或悬 浮液来制备，所述的载体例如水、盐水、含水右旋糖、丙三醇、乙二醇、乙醇和 类似物。如果需要的话，待施用的药物组合物也可以含有很小量的无毒辅助物质 诸如润湿剂、乳化剂或增溶剂、pH缓冲剂和类似物，例如醋酸盐、柠檬酸钠、环 状糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺油酸盐和其 他这样的试剂。制备这样的剂型的方法是已知的，或对于本领域技术人员是显而 易见的(参见如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company， Easton，Pa.，15th Edition，1975)。待施用的组合物或制剂含有一定数量的活性化合 物，该数量足以改善接受治疗的对象的症状。例如，本文提供的sHASEGP或其可 溶性人透明质酸酶结构域的标准稳定化制剂包括EDTA、NaCl和CaCl2中配制的 150单位/ml的可溶性糖蛋白。此外，抗细菌或抗真菌试剂——包括但不限于硫柳 汞——可以存在于制剂中。本文中提供的另一制剂是于EDTA、NaCl和CaCl2中 的稳定化溶液或冻干形式的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，其中含有 有效活性数量的可溶性糖蛋白，例如150单位/ml，并加入了乳糖，例如13mg/ml。 本文也提供了含有处于EDTA、NaCl和CaCl2中的稳定化溶液或冻干形式的 sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的制剂，其中含有有效活性数量的可溶 性糖蛋白，例如150单位/ml，并加入了乳糖，例如13mg/ml，和白蛋白、Pluronic F68、TWEEN和/或其他去污剂。本文中提供的另一制剂，或者是冻干的或者是作 为稳定溶液，含有有效数量的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，例如1 至300单位/ml，它们处于EDTA、NaCl和CaCl2中。

[0383]可以制备含有0.005％至100％的活性组分并由非毒性载体来平衡的剂型或 组合物。对于口服给药，药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，其用药学 上可接受的赋形剂，利用常规的方法制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如预糊化的 玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素或 磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧甲 淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂可以用本领域已知的方法包被。 [0384]sHASEGPs或其可溶性人透明质酸酶结构域或药学上可接受的衍生物可以 用可保护该可溶性糖蛋白免遭身体的快速清除的载体来制备，例如缓时释放制剂 或包衣。组合物可以包括其他药学上具有活性的试剂，所述试剂是该常规领域已 知在治疗一种或多种疾病或医学症状中具有价值的试剂，包括但不限于化学治疗 剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、 抗痢疾剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、 抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素激动剂、α封阻剂、麻醉剂、支气管扩张剂、 杀生物剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素封阻剂、钙通道封阻剂、心血管药剂、避 孕药剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激 素、促血糖增高药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理 兴奋剂、镇定剂、拟交感神经药、安定剂、泌尿剂(urinary agent)、阴道用药剂、 杀病毒剂、维生素药剂、非类固醇类抗炎药剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、 蛋白质、核酸、药物、药物前体、有机分子和促睡眠剂(sleep inducer)，这样可以 获得理想的特性组合。应该理解的是，这样的联合治疗构成了本文中提供的治疗 组合物和方法的又一方面。

[0385]1.口服组合物

[0386]口服药物剂型是固体、胶状和液体的。固体剂型是片剂、胶囊、颗粒和整 装粉剂。口服片剂的类型包括压缩的、可咀嚼的锭剂和片剂，其可以是肠衣包被 的、糖衣包被的或膜包被的。胶囊可以是硬的或软的明胶胶囊，而颗粒和粉末可 以与本领域技术人员已知的其它组分联合起来以非泡腾或泡腾的形式提供。

[0387]含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的药物组合物可以是液体 形式，例如溶液、糖浆或悬浮液，或可以以在使用之前需要与水或其他合适的载 体进行重构的药物产品的方式提供。这样的液体制品可以通过常规的手段用药学 上可接受的添加剂来制备，所述的添加剂例如悬浮剂(诸如山梨醇糖浆、纤维素衍 生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(诸如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水的介质(诸如杏仁油、 油酯或分级分离的植物油)；和防腐剂(诸如p-羟基苯甲酸甲酯或p-羟基苯甲酸丙酯 或山梨酸)。

[0388]在某些实施方案中，制剂是固体剂型形式，优选胶囊或片剂。片剂、药丸、 胶囊、药片和类似物可以含有下述的任何组分或者具有类似性质的化合物：粘合 剂；稀释剂；分解剂；润滑剂；助滑剂；甜味剂；和调味剂。

[0389]粘合剂的例子包括微晶纤维素、黄芪胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶、植物粘 胶、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、 石松和硬脂酸。稀释剂包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸 氢钙。助滑剂包括但不限于胶状二氧化硅。分解剂包括交联羧甲纤维素钠、羧甲 淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基 纤维素。着色剂包括例如任何被批准的合法的可溶于水的FD和C染料、其混合 物；和悬浮在水化氧化铝上的不溶于水的FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、 甘露醇和人工甜味剂例如糖精和任何数量的喷干香料(spray dried flavors)。调味 剂包括从植物例如水果提取得到的天然香料，和可产生愉悦感觉的合成的化合物 混合物例如但不限于薄荷油和水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、脱水 山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylene laural ether)。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫漆、氨化虫漆和醋酸邻苯二甲酸纤维 素。膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素纳、聚乙二醇4000和醋酸邻苯二甲 酸纤维素。

[0390]如果希望口服给药，sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域可以以这样 的组合物形式提供，即，该组合物可以保护它免遭胃的酸性环境的破坏。例如， 该组合物可以配制在肠衣中，该肠衣在胃中维持它的完整性，并在肠中释放出活 性化合物。组合物也可以与抗酸剂或其他这样的组分联合起来进行配制。

[0391]当单元剂型是胶囊时，除了上面类型的物质外，它可以含有液体载体诸如 脂肪油。此外，单元剂量形式可以含有各种其他的材料，其修饰该剂量单元的物 理形式，例如糖和其他肠内吸收试剂的包衣。化合物也可以作为酏剂、悬浮液、 糖浆、干糊片(wafer)、喷洒剂、口香糖或类似物的组分而被施用。除了活性化合 物外，糖浆可以含有蔗糖作为甜味剂，还可以含有某些防腐剂、染料和着色料以 及香料。

[0392]sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域也可以与不会削弱期望的作用的 其他活性材料混合，或与可以补充期望的作用的材料例如抗酸剂、H2封阻剂和利 尿剂混合。活性组分是本文中描述的化合物或其药学上可接受的衍生物。可以包 括更高浓度的活性组分，最高可达重量的约98％。

[0393]包括在片剂中的药学上可接受的载体是粘合剂、润滑剂、稀释剂、分解剂、 着色剂、调味剂和润湿剂。肠包衣片剂，由于该肠衣的缘故，可以抵抗胃酸的作 用，并在中性和碱性的肠中溶解或分解。糖包被的片剂是压缩片剂，其涂有不同 层的药学上可接受的物质。膜包被的片剂是压缩片剂，其已用聚合物或其他合适 的包衣包被。多重压缩片剂(Multiple compressed tablet)是利用先前提及的药学上可 接受的物质通过一个以上的压缩循环制成的压缩片剂。着色剂也可以用于上述剂 型。调味剂和甜味剂被用于压缩片剂、糖包被的、多重压缩的和可咀嚼的片剂。 调味剂和甜味剂在可咀嚼片剂和锭剂的制备中是特别有用的。

[0394]液体口服剂型包括含水溶液、乳剂、悬浮液、溶液和/或由非泡腾颗粒重构 的悬浮液和由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。含水溶液包括例如酏剂和糖浆。乳剂是 水包油的或油包水的。

[0395]酏剂是清透的、增甜的氢醇(hydroalcoholic)制剂。用于酏剂的药学上可 接受的载体包括溶剂。糖浆是糖例如蔗糖的浓缩水溶液，并可以含有防腐剂。乳 状液是两相体系，在其中，一种液体以小球体的形式分散于另一种液体中。用于 乳剂的药学上可接受的载体是非水液体、乳化剂和防腐剂。悬浮液使用药学上可 接受的悬浮试剂和防腐剂。用于可以被重新配成液体口服剂型的非泡腾颗粒的药 学上可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。用于可以被重新配成液体口服 剂型的泡腾颗粒的药学上可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。着色剂和增味 剂被用于上述的所有剂型中。

[0396]溶剂包括甘油、山梨醇、乙醇和糖浆。防腐剂的例子包括甘油、对羟基苯 甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和乙醇。用于乳剂的非含水液 体的例子包括矿物油和棉籽油。乳化剂的例子包括明胶、阿拉伯胶、黄芪胶、膨 润土和表面活性剂诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。悬浮剂包括羧甲基纤维 素钠、果胶、黄芪胶、维格姆胶(Veegum)和阿拉伯胶。稀释剂包括乳糖和蔗糖。 甜味剂包括蔗糖、糖浆、甘油和人造甜味剂诸如糖精。润湿剂包括丙二醇单硬脂 酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。有机添加 剂包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括任何批 准合法的可溶于水的FD和C染料以及其混合物。调味剂包括从植物例如水果提 取得到的天然风味剂，以及任何可以产生贻人味觉的合成的化合物混合物。

[0397]对于固体剂型，将处于例如碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液或悬 浮液封装于明胶胶囊中。这样的溶液、制剂和其封装方法描述于美国专利 4,328,245；4,409,239和4,410,545中。对于液体剂型，处于例如聚乙二醇中的溶液 可以用足够数量的药学上可接受的液体载体例如水稀释，这可以在施用时被容易 地确定。

[0398]可选择地，液体或半固体制剂可以通过将sHASEGP或其可溶性人透明质 酸酶结构域溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(例如碳酸丙烯酯) 和其他此类载体中，并将这些溶液或悬浮液封装于硬的或软的明胶胶囊壳中而制 备得到。其他有用的制剂包括在美国专利Re 28,819和4,358,603中所描述的。

[0399]适用于口腔含化给药(舌下含化给药)的制剂包括例如锭剂，其含有处于有风 味的基质(flavored base)中的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，所述 的风味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；还例如喉片，其含有处于惰性基质 (inert base)中的化合物，所述的惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶。

[0400]在所有的实施方案中，片剂和胶囊制剂可以按本领域技术人员所知道的那 样进行包被，以便改变或抵抗活性组分的溶解过程。因此，例如，它们可以用常 规的肠道可消化包衣——例如水杨酸苯酯、蜡和醋酸邻苯二甲酸纤维素来包被。

[0401]2.可注射剂、溶液和乳剂

[0402]本文也考虑了sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的肠胃外给药， 通常以注射为特征，皮下、肌肉内或静脉内给药。可注射剂可以以常规的形式制 备，或者作为液体溶液或者作为悬浮液；也可以以适于在注射之前用液体溶解或 悬浮的固体形式制备；或作为乳状液。合适的赋形剂例如水、盐水、右旋糖、丙 三醇或乙醇。此外，如果需要的话，待施用的药物组合物也可以含有很小数量的 非毒性辅助物质，诸如润湿剂和乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其他试剂 诸如例如醋酸钠、失水山梨醇单月桂酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。本文也考虑 应用缓慢释放或持续释放的体系，以便维持恒定水平的剂量(参见例如美国专利 3,710,795)。sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域在此类肠胃外组合物中的百 分比取决于其特定性质以及化合物的活性和患者的需要。

[0403]组合物的肠胃外给药包括皮下和肌肉内给药。用于肠胃外给药的制剂包括 用于注射的无菌溶液、无菌干状可溶性产品，诸如冻干的粉末，其仅在使用之前 才与溶剂或无菌溶液混合，包括用于皮下注射的片剂、用于注射的无菌悬浮液、 仅在使用之前才与媒介物混合的无菌干状不可溶性产品，和无菌乳剂。溶液可以 是含水的或者不含水的。

[0404]如果是静脉内给药，合适的载体包括生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS)，以及 含有增稠剂和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。

[0405]用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载体包括含水媒介、无水媒介、抗微 生物剂、等渗试剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、 螯合剂或掩蔽剂和其他药学上可接受的物质。

[0406]含水媒介的例子包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无 菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。无水肠胃外媒介包括植物来源的固定油、 棉籽油、玉米油、香油和花生油。其浓度可以达到抑制细菌或抑制真菌效果的抗 微生物剂必须加入到包装于多剂量容器中的肠胃外制剂中，其中包括苯酚或甲酚、 水银剂、苯甲醇、三氯丁醇、p-羟基苯甲酸甲酯和p-羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯 扎氯铵和苄索氯铵。等渗试剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸 盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸利多卡因。悬浮和分散剂包括 羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇 酯80(TWEEN80)。金属离子的螯合剂或掩蔽剂包括EDTA。药物载体也包括用 作可与水混溶的媒介的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于调节pH的氢氧化钠、盐 酸、柠檬酸或乳酸。

[0407]药物活性化合物的浓度被调节，以便注射液提供可以产生理想药理效果的 有效用量。准确的剂量取决于患者或动物的年龄、体重和状态，如本领域所知道 的。

[0408]单元剂量肠胃外制剂被包装于安瓿、小瓶或携带针的注射器中。所有用于 肠胃外给药的制剂必须是无菌的，如本领域所已知并实践的。

[0409]示范性地，含有活性化合物的无菌水溶液的动脉内或静脉内灌输是一种有 效的给药方式。另一实施方案是含有为了产生理想的药理效果所必需的活性材料 的无菌含水溶液或油溶液或悬浮液。

[0410]可设计注射剂以用于局部给药和全身性给药。通常，治疗上有效的剂量被 配制，相对于接受治疗的组织，其含有浓度至少约0.1％w/w至高达约90％w/w， 或更多的活性化合物，优选浓度大于1％w/w的活性化合物。活性组分，诸如 sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域可以一次给药，或分为许多较小的剂量 在间隔的时间里给药。应该理解的是，精确的剂量和治疗的持续时间与正在被治 疗的组织有关，并且可以利用已知的测试方案经验性地确定，或由体内或体外测 试数据推断得到。应该注意，浓度和剂量值也可以随着接受治疗的个体的年龄而 变化。应该进一步理解的是，对于任何特定的患者，具体的给药方案应该依据个 体的需要和正在执行或监督制剂给药的人员的专业判断而随着时间的推移进行调 整，还应该理解的是，本文中阐述的浓度范围只是示范性的，并不是为了限制要 求保护的制剂的范围或实施。

[0411]本文中提供的化合物可以被配制用来通过注射——例如通过弹丸注射或持 续灌输——进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以以单元剂量形式存在于例如安 瓿中或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。组合物可以是处于油或含水载体中的 悬浮液、溶液或乳状液，可以含有配方试剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可 选择地，活性组分可以是粉末形式，其在使用之前与合适的介质，例如无菌无热 原的水或其他溶剂重新配制。例如，本文所提供的是稳定化溶液或冻干形式的肠 胃外制剂，其中含有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，例如为 500至500,000单位。

[0412]化合物可以以微粉化或其他合适的形式悬浮，或可以被衍生化以产生更可 溶的活性产物或产生药物前体。所得到的混合物的形式取决于许多因素，包括所 打算的给药方式以及化合物在所选择的载体或媒介物中的溶解性。有效的浓度足 以改善状况的症状并可以经验性地确定。

[0413]3.冻干粉末

[0414]本文也提供了含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的冻干粉末， 其可以被再配制为溶液、乳状液和其他混合物而给药。这些制剂也可以被重构和 配制为固体或胶。

[0415]无菌的冻干粉末可以通过将含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构 域的实体部分溶解在合适的溶剂中或者将含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸 酶结构域的溶液的小等份与合适的溶剂相混合而得以制备。所述溶剂可以含有改 善该粉末或由该粉末所制备得到的重构溶液的稳定性的赋形剂或其他药理学组 分。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、 甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂。所述溶剂也可以含有缓冲液，诸 如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其他这样的缓冲液，这是本领域技术人员所知道 的，通常为约中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，再在本领域技术人员已知的标 准条件下进行冻干，从而得到冻干的制剂。通常，将由无菌过滤获得的溶液分配 入小瓶中进行冻干。每个小瓶可以含有单剂量的化合物，诸如10-1000mg或 100-500mg，或者含有多倍剂量的化合物。

[0416]简言之，冻干粉末可以这样来制备，将右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、 木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂以约1-20％的量溶解于合适 的缓冲液例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它的本领域技术人员所知道的这样 的缓冲液中并使pH约为中性。然后将所选择的盐例如sHASEGP的钠盐(每 10-100gm的缓冲溶液约1gm，通常约1gm/30gms)在室温之上的温度例如约30-35℃ 加入到所得到的混合物中，并进行搅拌直到它溶解。所获得的混合物通过加入更 多的缓冲液进行稀释，以将所获得的盐浓度降低约10-50％，通常约15-25％。所获 得的混合物进行无菌过滤或处理，以去除微粒并确保其无菌，并分配入小瓶中用 于冻干。冻干的粉末可以在合适的条件下例如在约4℃至室温进行保存。

[0417]用注射用水重构该冻干粉末，从而提供了用于肠胃外给药的制剂。为了重 构，在每毫升的无菌水或其他合适的载体中，加入治疗上有效数量的含有sHASEGP 或其可溶性人透明质酸酶结构域的冻干粉末。精确的数量取决于所选择的化合物， 并可以通过本领域技术人员知道的方法经验性地确定。

[0418]4.外部给药

[0419]外用混合物(topical mixtures)按照局部和全身性给药中所描述的方法来制 备。所得到的混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂或类似物，可以配制成乳液、胶、 药膏、乳剂、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、膏、泡沫、气溶胶、灌洗剂、 喷雾剂、栓剂、绷带、皮贴或任何其他适合于外部给药的制剂。

[0420]sHASEGP或可溶性人透明质酸酶结构域或其药学上可接受的衍生物的组合 物可以配制成气溶胶以用于外部应用，诸如通过吸入方法(参见例如美国专利 4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用来传送类固醇的气溶胶，所述类固 醇可用于治疗炎症疾病，特别是哮喘)。这些呼吸道给药的制剂可以是用于喷雾器 的气溶胶或溶液形式，或是作为可吸入的超细粉末，其单独使用或与惰性载体诸 如乳糖联合使用。在这样的情况下，制剂的颗粒通常具有小于50微米的直径，例 如小于10微米。

[0421]对于吸入给药，本文使用的组合物可以以气溶胶喷雾给药的形式从加压的 包装或喷雾器中传送出来，其中使用合适的推进剂，包括但不限于二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和其他合适的气体。在加压气溶胶的情况 中，单元剂量可以通过提供阀来传送计量数量(metered amount)的气溶胶来确定。 用于吸气器或吹药器的——例如明胶的——胶囊和弹筒可以配制成含有所述的化 合物的粉末混合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉。

[0422]组合物可以被配制用于局部或外部应用，例如以凝胶、乳液和洗液的形式 外部应用于皮肤和粘膜诸如眼睛里，或应用于眼睛或用于脑池内或椎管内应用。 外部给药也被考虑用于透皮传送，以及用于眼给药或粘膜给药，或用于吸入治疗。 单独的活性化合物的鼻部给药溶液或与其他药学上可接受的赋形剂相联合的活性 化合物的鼻部给药溶液也可以被施用。

[0423]例如，适合于外部应用于皮肤或眼的制剂通常配制为药膏、乳液、洗液、 糊、凝胶、喷雾剂、气溶胶和油。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二 醇、乙醇和其两种或更多种物质的组合。外用制剂还可以有利地含有重量比例为 0.05％至15％的增稠剂，包括但不限于：羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯 基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(亚烷基乙二醇)、聚羟烷基、(meth)丙烯酸酯或聚(meth) 丙烯酰胺。外用制剂常常通过滴注或作为进入结膜囊的药膏来应用。也可以用于 眼、面窦(facial sinuses)和外耳道的灌洗或润滑。液体状的外用制剂也可以存在 于亲水性的三维聚合物基质中，例如作为条带(strip)、隐形眼镜和类似物的形式， 从中可以释放出活性组分。也可以注射入眼睛前房和其他地方。例如，本文提供 了在注射粘弹性试剂之后于眼内应用的制剂，其含有有效数量的sHASEGP或其可 溶性人透明质酸酶结构域的稳定化溶液，例如含有1至5000单位的可溶性糖蛋白， 它们具有30至150,000单位/mg的比活性，所述溶液的体积是小量的，例如5至 50μl。

[0424]这些溶液，特别是那些眼用的溶液，可以用合适的盐配制成0.01％-10％等 渗溶液，pH约5-7。

[0425]5.用于其他给药途径的组合物

[0426]其他的给药途径，诸如外部给药，透皮膏贴以及直肠给药也在本文考虑之 中。

[0427]例如，直肠给药的药物剂型是产生全身性效果的直肠栓剂、胶囊和片剂。 本文中所使用的直肠栓剂是指用于插入到直肠中的固体，其在体温下融解或软化， 释放出一种或多种药理学上或治疗上具有活性的成分。在直肠栓剂中被利用的药 学上可接受的物质是基质(bases)或介质和可以提高熔点的试剂。基质的例子包 括可可油、甘油-明胶、碳蜡(聚氧乙二醇)和合适的脂肪酸的甘油单酯、甘油双酯 和甘油三酯的混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸油 和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过铸型方法来制备。直肠栓剂一般重量为 约2至3gm。

[0428]用于直肠给药的片剂和胶囊可以使用同样的药学上可接受的物质并采用与 制备口服给药制剂相同的方法来制造。

[0429]适用于透皮给药的制剂可以是独立的膏贴，其适于在延长的时间段内与接 受者的表皮保持紧密接触。此种膏贴适当地含有活性化合物，对于该活性化合物， 可相当于浓度为例如0.1至0.2M的可任选地缓冲的水溶液。适合于透皮给药的制 剂也可以用离子电渗疗法传送(参见例如Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986))， 并且通常采用活性化合物的可任选地缓冲的含水溶液的形式。

[0430]药物组合物也可以通过可控释放手段和/或传送装置来给药(参见例如美国 专利3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719； 4,687,610；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,566；5,591,767； 5,639,476；5,674,533和5,733,566)。活性化合物或药学上可接受的衍生物可以用可 保护化合物免被身体迅速清除的载体来制备，例如定时释放的制剂或包衣。

[0431]在本文提供的组合物和方法的一种实施方案中，治疗剂通过缓慢释放传送 媒介物局部地施用，例如，将治疗剂封装于胶体分散体系中或聚合物稳定化晶体 中。有用的胶体分散体系包括纳米胶囊、微球体、珠子和基于脂的体系，包括水 包油乳剂、微胞、混合微胞和脂质体。例如，胶体分散体系可以是脂质体或微球 体。脂质体是人造膜载剂，当被注射或植入时可用作缓慢释放传送介质。脂类聚 合物共轭物和脂质体的一些例子公开于美国专利5,631,018中，其通过引用方式整 体并入本文中。缓慢释放传送介质的其他例子是生物可降解的水凝胶基质(美国专 利5,041,292)、树枝状聚合物共轭物(美国专利5,714,166)和脂质体多囊颗粒 (DepofoamsDepotech，San Diego，CA)(美国专利5,723,147和5,766,627)。适用于 封装治疗剂以用于局部注射(例如注射入皮下组织)的一类微球体是聚(D，L)交酯微 球体，其描述于D.Fletcher，Anesth.Analg.84：90-94，(1997)中。例如，含有有效量 的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域——例如1至5000单位/ml——的缓 慢释放制剂可以用于各种用途或用于治疗各种症状，包括但不限于整容制剂和治 疗脊髓损伤。

[0432]理想的血液水平可以通过持续输入活性试剂来维持，通过血浆水平进行确 证。应该注意的是，主治医生将知道依据毒性或者骨髓、肝脏或肾功能紊乱的情 况，如何以及何时停止、中断或调整治疗，以降低剂量。反过来，如果临床反应 不足(排除毒性副作用)，主治医生也知道如何以及何时将治疗调到更高的水平。

[0433]sHASEGP多肽和/或它的抑制剂——单独或与其他试剂例如治疗活性试剂 的联合——的效用和/或毒性也可以通过本领域已知的方法来评估(参见例如O & Apos；Reilly，Investigational New Drugs 15：5-13(1997))。

[0434]6.制造产品

[0435]SHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域或含有任何前述试剂的组 合物可以包装为制造产品，其中含有包装材料、在包装材料内的本文中提供的化 合物或其合适的衍生物——它们可以有效地治疗本文所考虑的疾病或紊乱、标明 所述化合物或其合适的衍生物是用于治疗本文所考虑的疾病或紊乱的标签。该标 签可以任选地包括被证明可以治疗的紊乱。

[0436]本文提供的制造产品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料是本领 域技术人员熟知的(参见例如美国专利5,323,907、5,052,558和5,033,352)。药物包 装材料的例子包括但不限于硬质泡沫塑料包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、 容器、注射器和任何适用于所选择的制剂和所打算的给药和治疗方式的任何包装 材料。本文所提供的化合物和组合物的多种制剂被考虑，用于为任意的紊乱提供 多样的治疗，在所述的紊乱中，HCV感染涉及作为症状或病因的介导物或原因所 在。

[0437]本文也提供了含有组合物和/或与其给药说明书的组合的试剂盒。试剂盒还 可以包括通常以无菌形式包装的用于注射复合物的针或注射器，和/或包装好的酒 精片。说明书也可以任选地包含在其中，以指导临床医生或患者使用活性试剂。 例如，本文提供了这样的试剂盒，其含有小体积的注射器，连带有有效数量的 sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，例如1至5000单位的可溶性糖蛋白， 体积为5至50μl，可任选地含有包含粘弹性试剂的第二个注射器。本文也提供了 这样的试剂盒，其含有小体积的注射器，其中含有有效数量的sHASEGP或其可溶 性人透明质酸酶结构域，例如1至5000单位的可溶性糖蛋白，以及治疗量的另一 活性组分，诸如药物、小分子、蛋白或核酸。

[0438]K.动物模型

[0439]本文提供了转基因动物模型和动物，诸如啮齿类动物包括小鼠和大鼠、牛、 鸡、猪、山羊、绵羊、猴类包括大猩猩和其他灵长类。特别地，提供了转基因非 人动物，其含有编码sHASEGP多肽的异源核酸，或提供了这样的转基因动物，在 其中，所述多肽的表达已被改变，例如通过置换或修饰内源基因的启动子区域或 其他调控区域。此类动物可以通过促进内源性核酸和外源性sHASEGP基因之间通 过同源性或其它重组事件而发生的重组来产生，其中，所述外源性sHASEGP基因 可以被过量表达或不当地表达，例如通过在强启动子下进行表达。

[0440]转基因动物可以通过使用任何已知的传送方法将核酸导入种系细胞或体细 胞例如胚胎干细胞而产生，所述的传送方法包括但不限于微注射、脂转染和其他 基因传送方式。通常将核酸导入细胞例如胚胎干细胞(ES)中，然后将该ES细胞注 射入胚球，并将胚球植入代孕母亲，再产生转基因动物。通常，异源的sHASEGP 编码核酸和内源性核酸之间的重组将异源核酸分子整合入动物染色体。异源核酸 可以靶向特定的染色体。在一些例子中，可以产生基因敲除动物。此类动物可以 首先通过促进它的染色体中的sHASEGP多肽基因和生物学上失活的外源性 sHASEGP多肽基因(通常，通过插入异源序列例如抗生素抗性基因来实现)之间的 同源重组而产生。在一种实施方案中，这种同源重组通过用含有插入失活的 sHASEGP多肽基因的载体转化胚胎衍生的干细胞来实施，这样，发生同源重组， 然后将ES细胞注射入胚球，并将胚球植入代孕母体，由此产生嵌合动物(“基因 敲除动物”)，在其中，sHASEGP多肽基因已失活(参见Capecchi，Science 244： 1288-1292(1989))。可以培育该嵌合动物，以产生纯合的基因敲除动物，其然后可 以被用来产生额外的基因敲除动物。基因敲除动物包括但不限于小鼠、仓鼠、羊、 猪、牛和其他非人动物。例如，产生基因敲除小鼠。所得到的动物可以充当特定 疾病例如癌症的模型，其显示出不足的sHASEGP多肽表达水平。这样的基因敲除 动物可以用作此类疾病的动物模型，它们可以例如用来筛选或测试能够治疗或预 防此类疾病或紊乱的分子。

[0441]其他类型的转基因动物也能被产生，包括过量表达sHASEGP多肽的转基 因动物。这样的动物包括“基因敲入(knock-in)”动物，这里是指这样的动物， 它的正常基因被变体例如突变体——可造成过量表达的形式或其他形式——所替 代。例如，一个物种例如啮齿类动物的内源性基因用其他物种例如人的基因替代。 动物也可以通过非同源重组进入染色体中的其他位点而产生；包括发生过一系列 整合事件的动物。

[0442]在产生第一代转基因动物之后，可以对嵌合动物进行育种，以产生额外的 动物，这些动物产生过量表达的或不当表达的sHASEGP多肽。这样的动物包括但 不限于小鼠、仓鼠、羊、猪、牛和其他非人哺乳动物。所得到的动物可以充当特 定疾病例如癌症的模型，其显示出sHASEGP多肽的过量表达或不当表达。这样的 动物可以用作此类疾病的动物模型，例如用来筛选或测试能够治疗或预防此类疾 病或紊乱的分子。在特定的实施方案中，产生具有过量表达的或不当表达的 sHASEGP多肽的小鼠。

[0443]下面的实施例只是用于示范的目的，而不是为了限制本发明的范围。

[0444]L.sHASEGP的治疗用途

[0445]在过去的40年里，来自屠宰物的天然发生的透明质酸酶已经成为临床酶制 剂的重要来源。牛和羊睾丸是这种材料的主要来源。然而，这种临床酶制剂是非 常粗糙的，被售的制剂的纯度在0.5-5％范围内，已知的比活性为30-100,000单位 /mg之间。因此，它们纯度的缺乏以及它们的屠宰场来源使得它们不但成为人的免 疫源而且成为克-雅二氏症(Jacob Creutzfeld)和其他牛和羊病原体的潜在来源。 已经知道发生过对牛和羊透明质酸酶制剂的过敏反应。

[0446]牛或细菌来源的透明质酸酶已经被用于治疗与过量透明质酸有关的疾病， 还被用来增强生理流体和/和治疗剂的循环。例如，牛透明质酸酶可以与球周、球 后和sub-Tenon′s麻醉阻断剂一起注入，用于眼科手术程序。而且，在缺乏透明质 酸酶时手术并发症也出现增加(Brown SM et al.J Cataract Refract Surg.1999 Sep；25 (9)：1245-9.)。牛透明质酸酶也可以用作局部坏死(local necrosis)的解毒剂，该局 部坏死来自于致坏死物质例如长春花植物碱的静脉旁注射(Few，B.J.(1987)Amer. J.Matern.Child Nurs.12，23-26)。牛睾丸透明质酸酶也可用于治疗神经节囊肿(Paul et al.J Hand Surg 1997 Apr；22(2)：219-21)。透明质酸酶也可以用来帮助流体在皮下 灌注术中的皮下传送(Berger EY，Am Geriatr Soc 1984 Mar；32(3)：199-203)。透明质 酸酶也已被用于降低接受粘弹性物质的青光眼患者和白内障患者眼睛内的眼内压 (美国专利4,820,516，1989年4月11日)。

[0447]牛或细菌来源的透明质酸酶已被用作“扩散剂”，来增强化学治疗剂的活性 和/或使得肿瘤能更容易接近化学治疗剂(Schuller et al.，1991，Proc.Amer.Assoc. Cancer Res.32：173，abstract no.1034；Czejka et al.，1990，Pharmazie 45：H.9)。化学 治疗和透明质酸酶的联合在治疗各种癌症中是有效的，所述癌症包括膀胱癌(Horn et al.，1985，J.Surg.Oncol.28：304-307)、鳞状细胞癌(Kohno et al.，94，J.Cancer Res. Oncol.120：293-297)、乳腺癌(Beckenlehner et al.，1992，J.Cancer Res.Oncol.118： 591-596)，和肠胃癌(Scheithauer et al.，1988，Anticancer Res.8：391-396)。透明质酸 酶作为治疗脑癌(神经胶质瘤)的唯一治疗剂是很有效的(PCT公开申请号WO 88/02261，1988年4月7日公布)。透明质酸酶的给药也诱导胰腺、胃、结肠、卵 巢和乳房的以前对化学治疗具有抵抗性的肿瘤发生应答(Baumgartner et al.，1988， Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker et al.，1986，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27： 390)。不幸的是，污染物和此类透明质酸酶的非人属性会产生过敏反应。

[0448]除了它的间接的抗肿瘤效应外，牛来源的透明质酸酶具有直接的抗癌效应。 透明质酸酶预防移植入小鼠的肿瘤的生长(De Maeyer et al.，1992，Int.J.Cancer 51： 657-660)，抑制在暴露于致癌物质时肿瘤的形成(Pawlowski et al.，1979，Int.J.Cancer 23：105-109；Haberman et al.，1981，Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology，Washington，D.C.，22：105，abstract no.415)。

[0449]考虑到牛来源的透明质酸酶作为治疗剂的价值，特别是在与传统的化疗剂 一起用于化学治疗时的价值，或者它单独作为化学治疗的治疗剂时的价值，就存 在着对基本上纯的人来源的透明质酸酶制剂的需求。也需要用有效率的、具成本 效益的方法来制备透明质酸酶，以提供商业上显著数量的酶。本发明便解决了这 些问题。

[0450]透明质酸是胞外基质的重要成分。透明质酸发现于哺乳动物的结缔组织中， 是眼玻璃体的主要构成成分。在结缔组织中，与透明质酸相关的水合的水在组织 之间创造出空间，从而产生有利于细胞运动和增殖的环境。透明质酸在与细胞运 动相关的生物学现象中起到关键作用，包括快速发育、再生、修复、胚胎发生、 胚胎发育、伤口愈合、血管生成和肿瘤发生(Toole，1991，Cell Biol.Extracell.Matrix， Hay(ed)，Plenum Press，New York，1384-1386；Bertrand et al.，1992，Int.J.Cancer 52： 1-6；Knudson et al.，1993，FASEB J.7：1233-1241)。此外，透明质酸水平与肿瘤侵 入相关(Ozello et al.，1960，Cancer Res.20：600-604；Takeuchi et al.，1976，Cancer Res.36：2133-2139；Kimata et al.，1983，Cancer Res.43：1347-1354)。

[0451]脊髓损伤之后，神经胶质瘢痕由星形细胞产生，并含有硫酸软骨素蛋白聚 糖(CSPGs)。CSPGs在轴突生长的抑制中发挥关键作用(Levine，1994；Powell et al.， 1997)。例如，在胚胎发育期间，CSPGs压迫轴突并抑制神经细胞粘着。CSPGs也 在边界形成(boundary formation)中发挥重要作用(Snow et al.，1990，1992；Powell and Geller，1999)。此外，在CNS损伤之后CSPG的表达增加(Mckeon et al.，1991； Davies et al.，1997)。

[0452]研究表明，CSPGs的抑制作用主要是由硫酸软骨素(CS)糖胺聚糖(GAG)糖 链引起的(Snow et al.，1990；Cole and McCable，1991；Geisert and Bidanset，1993)。 这得到了下面的发现的支持，即，细菌软骨素酶的鞘内给药事实上促进了轴突再 生。而且，电生理学实验证明，再生的CST轴突建立功能联系(Bradbury，et al 2002)。 除了CSPGs的直接抑制效果之外，CSPGs也可以与细胞粘附分子或神经营养因子 相互作用，来影响神经突的生长(Roberts et al.，1988；Ruoslahti and Yamaguchi，1991； Milev et al.，1994)。重组的哺乳动物透明质酸酶因此可以用于逆转CSPG在神经胶 质瘢痕中的抑制作用以及促进损伤之后的轴突再生。

[0453]充分降解神经胶质瘢痕中的CSPG所需的sHASEGP的数量将会变化。在 一些情况下，通过鞘内传送反复地给予10-5000单位的sHASEGP将是去除瘢痕内 的CSPG所必需的。在其他情况下，优选通过使用缓慢释放制剂持续释放 sHASEGP。可选择地，给予编码sHASEGP的基因治疗载体可以有效地增强CSPG 的清除。

[0454]sHASEGPs也可以在称为化学髓核溶解术的方法中被用来治疗椎间盘突出。 软骨素酶ABC和切割类似底物的酶例如sHASEG能诱导降低腰脊椎中的椎间盘内 压力(Sasaki et al.，2001，Ishikawa et al.，1999)。有三类椎间盘损伤。伸出的椎间盘 (protruded disk)是完整但是凸出的一种类型。在挤出的椎间盘(extruded disk) 中，纤维质包裹物(fibrous wrapper)被撕裂，NP泄出，但依然与椎间盘相联。在 分离的椎间盘(sequestered disk)中，NP的片段从椎间盘脱开，并游离于脊髓。化 学髓核溶解术对于伸出的椎间盘和挤出的椎间盘是有效的，但对于分离的椎间盘 损伤没有效果。在美国，化学髓核溶解术仅被批准用于腰部(更低的)脊椎。在其他 国家，它已经被成功地用于治疗颈(上部脊椎)突出。因此，当优选要降低椎间盘压 力时，化学髓核溶解术是椎间盘手术的保守性替代方案。

[0455]糖蛋白上的碳水化合物链的精确组成和结构能直接影响它的血清寿命，这 是因为肝脏和网状内皮系统中的细胞能够结合携带特定碳水化合物的循环糖蛋白 并使之内在化。肝细胞在它们的表面上具有受体，这些受体识别具有末端(即，聚 糖相对于多肽的最远端)Gal残基的寡糖链，巨噬细胞含有识别末端Man或GlcNAc 残基的受体，肝细胞和淋巴细胞具有识别暴露的海藻糖残基的受体。然而，还没 有发现唾液酸特异性受体。尽管与寡糖的空间排布有些许关系，但按照一般规则 来说，被肝脏和网状内皮系统中的细胞表面受体识别的暴露糖残基的数量越多， 糖蛋白被清除出血清的速度越快。然而，因为不存在唾液酸特异性受体，所有分 支由唾液酸来末端化或“加帽”的寡糖不会加快与之连接的蛋白质的清除。

[0456]除了影响它被肝脏和网状内皮的细胞中的糖特异性受体识别之外，糖蛋白 上寡糖链的存在和性质也能影响重要的生物化学特性。将碳水化合物从糖蛋白去 除通常将降低它的溶解性，并且它也可以通过将正确的多肽折叠形式去稳定化和/ 或暴露蛋白酶敏感性位点，而使得它更易遭受蛋白水解的降解作用。由于类似的 原因，蛋白质中的糖基化状况能够影响免疫系统对它的识别。

[0457]在冷冻保藏和其他体外受精技术例如细胞质内精子注射(ICSI)之前， sHASEGPs可以被用来去除卵周围的卵丘细胞。在缓冲盐溶液中，可以将 10-200U/ml之间的透明质酸酶加入到收集的卵母细胞中。通过吹吸和用缺少透明 质酸酶的介质进行数次的洗涤，将卵母细胞与释放的卵丘细胞分离开来。然后可 以对卵进行处理，以用于冷冻保藏或IVF技术。

[0458]sHASEGPs也可以用于使化学治疗剂更有效地渗入实体肿瘤中。sHASEGPs 可以与抗癌症试剂一起进行肿瘤内注射，或者对于弥散性癌症或难以到达的肿瘤， 可以静脉内注射。抗癌症剂可以是化学治疗剂、抗体、肽或基因治疗载体、病毒 或DNA。此外，sHASEGP可以被用来将肿瘤细胞招募至循环库(cycling pool)， 以对具有获得性多元药物抗性的化学治疗难以对付的肿瘤进行增敏作用(St Croix et al Cancer Lett 1998 Sep 11；131(1)：5-44)。sHASEGPs也可以用于帮助生物制剂例 如单克隆抗体、细胞因子和其他药物传送到积聚糖胺聚糖的肿瘤中。许多肿瘤剔 除了参与糖胺聚糖的分解代谢的基因，这样局部的积聚可以阻止抗肿瘤试剂和免 疫系统到达肿瘤块。

[0459]sHASEGP也可以用于增加对常规的化学治疗有抗性的肿瘤的敏感性。在一 种实施方案中，将sHASEGP施用于带有与LuCa-1缺陷相关的肿瘤的患者，施用 量足以增加在肿瘤位点周围的扩散(例如，增加化学治疗因子的循环；例如，促进 化学治疗试剂在肿瘤位点和肿瘤位点周围的循环和/或浓缩)、抑制肿瘤细胞运动性 (例如，通过HA降解)，和/或降低肿瘤细胞凋亡阈值(即，将肿瘤细胞带入失巢凋 亡状态)，该状态使得肿瘤细胞更易遭受化学治疗试剂或其他可促进细胞死亡的试 剂的作用，优选选择性地促进细胞以失巢凋亡的形式发生程序性细胞死亡。本文 中使用的化学治疗剂旨在包括所有分子，合成的(例如，顺铂)以及天然发生的(例 如，肿瘤坏死因子IF))，它们帮助抑制肿瘤细胞生长，优选地促进——更优选地选 择性促进——肿瘤细胞死亡。

[0460]特别有价值的是，使用sHASEGP来治疗转移性和非转移性癌症，特别是 转移性癌症，它们相对于非癌症(正常)细胞，具有已经降至不能被检测的透明质酸 酶活性。sHASEGP可以用作化学治疗剂(单独或与其他化学治疗剂联合)，可以用 于治疗许多不同的癌症，特别是入侵性肿瘤。例如，sHASEGP可以被用来治疗肺 小细胞癌、肺鳞状细胞癌以及胸、卵巢、头和颈癌症，或任何其他与降低的透明 质酸酶水平相关的癌症，或与缺陷型LuCa-1(hpHAse)基因(例如，不能表达足够水 平的hpHAse的LuCa-1基因，或编码不能提供足够水平的透明质酸酶活性的缺陷 hpHAse的LuCa-1基因)相关的癌症，或任何其他与降低的透明质酸分解代谢相关 的缺陷。sHASEGP优选用于治疗与HA分解代谢缺陷相关的恶性病，它不需要细 胞来参与降解作用。

[0461]适于施用的具体剂量可以由本领域普通技术人员根据上面讨论的因素容易 地确定(参见例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，11th Ed.，1987)。此外， 人中的合适剂量的估计可以通过sHASEGP在体外的酶活性水平的测定和/或在动 物研究中的有效剂量来进行推断。例如，70-300TRU的透明质酸酶能有效地减少 鼠中的肿瘤负荷。考虑到该信息，在人中的对应剂量的范围为平均70kg体重中约 250,000-1,200,000TRU透明质酸酶。给予人类患者的sHASEGP的数量通常在1 TRU至5,000,000TRU的酶活性的范围内，优选在约1,000TRU至2,500,000TRU 的范围内，更优选在约100,000TRU至1,500,000TRU的范围内，正常情况下在约 250,000TRU和1,200,000TRU之间，约725,000TRU的剂量代表了平均处方剂量。

[0462]在一种实施方案中，sHASEGP配制于0.15M盐溶液中，其中含有浓度约 150,000TRU/cc的sHASEGP。然后将制剂以15,000TRU/kg患者体重的量静脉内 注射。可选择地，该酶制剂也可以皮下注射，以使得透明质酸酶可以灌注至肿瘤 位点的周围。在优选的实施方案中，将HASEGP在肿瘤周围注射，或者注射入肿 瘤块。在另一优选的实施方案中，sHASEGP配制成脂质体，通过静脉内注射而被 传送，或者，通过在与LuCa-1(hpHAse)基因的缺陷相关的癌细胞的位点处或其附 近进行注射而被传送。SHASEGP的静脉内注射导致在肿瘤位点中具有sHASEGP。 而且，因为sHASEGP上的末端唾液酸防止该酶被网状内皮系统从循环中清除掉， 所以超唾液酸化的sHASEGP对于肠胃外给药是优选的。超唾液酸化的sHASEGP 与非唾液酸化的牛和羊透明质酸酶的比较显示，其具有更加有利的药物动力学。

[0463]基因治疗的易化

[0464]大部分的基因传送媒介物的体内效率并不与在体外所观察到的效率相对 应。糖胺聚糖能阻碍DNA和病毒载体转移和扩散入许多细胞类型中。这样的胞外 基质材料的水平能大大地阻碍该过程。Dubensky et al.，(Proc Natl Acad Sci USA 1984 Dec；81(23)：7529-33)证明，当与胶原酶联合时，透明质酸酶可帮助DNA的 体内转导。已经证明，腺相关病毒也能胜任透明质酸酶介导的基因治疗(Favre et al， Gene Ther 2000 Aug；7(16)：1417-20)。

[0465]我们已经在本文中证明，在胞外基质中具有确定尺寸的通道用sHASEGP 打开。这些孔没有增加直径大于约200-500nm的物质的扩散。然而，更小的分子 诸如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和DNA复合物可发生由sHASEGP介导的 扩散。

[0466]可选择地，病毒也可以装配有sHASEGP基因，以方便它们在靶组织中复 制和传播。靶组织可以是癌症组织，因此，病毒能够在肿瘤内选择性地复制。病 毒也可以是非裂解性病毒，其中，病毒在组织特异性启动子下选择性地复制。随 着病毒的复制，sHASEGP与病毒基因的共表达将促进病毒在体内的传播。

[0467]可选择地，感兴趣的核酸和sHASEGP可以同时使用，或连续使用或错开 时间使用。同时使用是指同时给药。在这种情况下，这两种主要成分可以在给药 之前混合成组合物，或者可以同时给予细胞或宿主生物体。也可以连续给药，也 就是说相继给药，不论本发明的联合产品中的哪种成分先被给予。最后，可以使 用这样的给药方式，即，错开时间给予，或者间断给予，其停止又再重新开始， 可以是有规律和无规律的。应该指出的是，两种成分的给药途径和位点可以是不 同的。根据一种特别优选的实施方案，sHASEGP在所述核酸之前给予，而这两种 成分的给药途径优选是相似的。注射之间的时间间隔不是关键的，可以由技术人 员来确定。可以推荐10min至72h的时间间隔，有利地为30min至48h的时间 间隔，优选1至24h的时间间隔，非常优选地，为1至6h的时间间隔。

[0468]此外，本发明的联合产品也可以与一种或多种旨在改善核酸给药的分子相 联合。所述分子可以是这样的分子，其对核酸具有保护性作用(防止其在细胞内 降解)、其改善它对宿主细胞的渗透或它在宿主细胞中的表达(促融合肽、核定位 信号等)、其使得能够靶向特定的细胞类型(识别细胞表面蛋白质的配体或抗体， 等)，或其延长治疗效应(免疫抑制试剂，等)。所述的联合产品也可以与促进转 染的试剂(蛋白质等)联合。

[0469]本发明的联合产品可以以局部或肠胃外给药为目的或以通过消化途径给药 为目的进行制备。本文中特别提到的途径是胃内、皮下、心脏内、静脉内、腹腔 内、滑液内、肿瘤内、肺内、鼻内和气管内途径，并且更特别地，是肌肉内途径。 给药可以通过本领域的任何技术(注射、口服途径、气溶胶、灌输等)来实现，可以 作为单一剂量或作为在特定的时间间隔之后再重复一次或若干次的剂量。给药途 径可以进行调整以适应被转染的感兴趣的基因和被治疗的疾病。制剂可以包括药 学上可接受的介质(赋形剂、辅助剂等)。导致胞外基质解体的物质和感兴趣的核酸 优选溶解于缓冲液中，该缓冲液适合用于药物用途且可以是高渗性的、低渗性的 或等渗性的。可以考虑各种缓冲液。可以列举出的缓冲液有生理盐溶液(0.9％ NaCl)、非生理盐溶液(1.8％NaCl)、Hepes-Ringer溶液、乳酸盐-Ringer溶液，基于 Tris-HCl(10mM Tris-HCl，pH 7.5至8、1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH 7.5至8、 1mM MgCl2)的缓冲液、磷酸缓冲液(克雷布斯磷酸盐H2O缓冲液)、糖(葡萄糖、蔗 糖、海藻糖等)溶液或仅仅是水。

[0470]皮下灌注术

[0471]皮下灌注术，流体的皮下灌输，是有用和方便易行的水合作用技术，适合 于轻微至中等程度失水的成年患者，尤其是老年患者。该方法被认为是安全的， 且不会造成任何严重的并发症。最常见的不利影响是轻微的皮下浮肿，这可以通 过局部按摩和全身性利尿剂而得以处理。可以在24小时内在两个不同的位置给予 大约3L。常用的灌输位置是胸腔、腹、大腿和上肢。优选的溶液是生理盐水，但 可以使用其他溶液，例如半生理盐水，盐水葡萄糖或5％葡萄糖。如果需要的话， 可以将氯化钾加入到溶液袋中。此外，其他药物可以通过类似的途径传送。可以 加入人sHASEGP，以增强流体吸收和增加给药的总速度。因为它不可能具有如同 牛的酶所知道的那样的免疫原性，所以相对于屠宰场来源的酶来说，人sHASEGP 是优选用于反复的皮下灌注术的。

[0472]在非卧床患者中，皮下灌注术的位点包括腹、上胸腔、乳房以上、肋间隙 和肩胛区。在卧床患者中，优选的位点是大腿、腹部和上肢外侧。1至4天后，应 该更换针和导管，尽管灌输装置曾经被使用更长的时间而无并发症出现。可以1 天3次，一次1或2小时，给予500mL的用量，在第一次的早上输注之前于皮下 位点给予150U的sHASEGP。

[0473]治疗性注射的易化

[0474]许多经皮注射的分子缓慢地或以非常缓慢的效率进入循环。若干因素调控 皮下注射(SC)或肌内注射(IM)的分子的药动学和药效学。通常，更大的分子以更缓 慢的速度和更低的效率进入循环，它们不是通过主动运输进入循环的。皮下生物 利用度，是通过计算SC与静脉内注射时的曲线下面积的比率(AUCsc/AUC静脉内)来 确定的。另一因素是基质分子的电荷和亲合性，它们在分子在皮下的扣留过程中 发挥重要的作用。如果这些材料在局部便被降解，它们可能从未到达它们的期望 靶标，并因而对靶器官而言表现出降低的全身性总生物利用度。

[0475]大的蛋白通常是静脉内给药，因此药剂在血流中直接被利用。然而，如果 药剂可以皮下给药、肌内给药或皮内给药的话，这会是有利的，这是因为这些给 药形式对患者来说更容易操作。尤其是，当药剂必需在一生中有规律地施用时， 以及治疗很早就开始，当患者是儿童时就开始治疗时。然而，具有非常大的和不 稳定的分子例如170至300kDa的凝结因子VIII的药剂，如果被皮下、肌内给药或 皮内给药的话，则通常具有非常低的生物利用度，这是因为吸收不足并且降解严 重。

[0476]除了需要增加许多皮下给药的生物制剂的生物利用度之外，更快速的药物 动力学在急诊的情况下也是至关重要的。当全身性地给药时，对于许多患者而言， 接通静脉内通路所需要的时间阻止了本应快速作用的药物被利用。在一些情况下， 在不能接通静脉内通路之后，再进行皮下注射，这进一步延长了到达靶器官的时 间。因此，皮下注射的药物的更迅速的可利用性，将是有利的，这样可实现第一 线的治疗，而不会由于接通静脉所需要的时间而冒险。可以皮下传送以及静脉内 传送的分子的例子包括肾上腺素、阿托品、纳洛酮(narcan)、利多卡因和右旋糖。

[0477]许多经皮注射的分子缓慢地或以非常缓慢的效率进入循环。若干因素调控 皮下注射(SC)或肌内注射(IM)的分子的药动学和药效学。通常，更大的分子以更缓 慢的速度和更低的效率进入循环，它们不是通过主动运输进入循环的。皮下生物 利用度，是通过计算SC与静脉内注射时的曲线下面积的比率(AUCsc/AUC静脉内)来 确定的。另一因素是基质分子的电荷和亲合性，它们在分子在皮下的扣留过程中 发挥重要的作用。如果这些材料在局部便被降解，它们可能从未到达它们的期望 靶标，并因而对靶器官而言表现出降低的全身性总生物利用度。

[0478]大的蛋白通常是静脉内给药，因此药剂在血流中直接被利用。然而，如果 药剂可以皮下给药、肌内给药或皮内给药的话，这会是有利的，这是因为这些给 药形式对患者来说更容易操作。尤其是，当药剂必需在一生中有规律地施用时， 以及治疗很早就开始，当患者是儿童时就开始治疗时。然而，具有非常大的和不 稳定的分子例如170至300kDa的凝结因子VIII的药剂，如果被皮下、肌内给药或 皮内给药的话，则通常具有非常低的生物利用度，这是因为吸收不足并且降解严 重。

[0479]除了需要增加许多皮下给药的生物制剂的生物利用度之外，更快速的药物 动力学在急诊的情况下也是至关重要的。当全身性地给药时，对于许多患者而言， 接通静脉内通路所需要的时间阻止了本应快速作用的药物被利用。在一些情况下， 在不能接通静脉内通路之后，再进行皮下注射，这进一步延长了到达靶器官的时 间。因此，皮下注射的药物的更迅速的可利用性，将是有利的，这样可实现第一 线的治疗，而不会由于接通静脉所需要的时间而冒险。可以皮下传送以及静脉内 传送的分子的例子包括肾上腺素、阿托品、纳洛酮(narcan)、利多卡因和右旋糖。

[0480]本发明的另一优点在于，能够以SC或IM的方式传送相等体积或更大体积 的溶液，而不存在与在注射位点处的溶液压力或体积相关的疼痛和病态。

[0481]玻璃体出血

[0482]为了将在进行玻璃体切割术期间造成视网膜的进一步脱离或撕裂的可能性 最小化，美国专利5,292,509(Hageman)先前已经提出，在去除玻璃体之前，将某些 无蛋白酶的糖胺聚糖酶注射入玻璃体，从而使玻璃体与视网膜解离开或“去附着 (disinserted)”。玻璃体的这种去附着或解离的目的在于使当玻璃体被去除时视网 膜被进一步撕裂或脱离的可能性最小化。可以用来实现这种玻璃体去附着(vitreal disinsertion)的特定的无蛋白酶的糖胺聚糖酶的例子据称包括软骨素酶ABC、软 骨素酶AC、软骨素酶B、4-硫酸软骨素酶、6-硫酸软骨素酶、透明质酸酶和β-葡 萄糖醛酸酶。

[0483]尽管已经知道透明质酸酶可以用于各种眼科用途，包括美国专利5,292,509 (Hageman)描述的玻璃体切除辅助应用，但已公开的研究已经表明透明质酸酶本身 对于视网膜和/或眼的其他解剖学结构是有毒性的。参见The Safety of Intravitreal Hyaluronidase；Gottleib，J.L.；Antoszyk，A.N.，Hatchell，D.L.and Soloupis，P.，Invest Ophthalmol Vis Sci 31：11，2345-52(1990)。而且，使用不纯的屠宰场来源的透明质 酸酶制剂可能引起眼色素层炎或眼部炎症。因此，由于其增加的效价、纯度和非 动物的来源，人sHASEGP是优选被使用的，而对于动物来源来说，在反复的给药 之后，它会引起免疫原性反应和抗体介导的中和作用。在另一实施方案中，可以 将聚乙二醇化形式的sHASEGP注射入眼睛。此种聚乙二醇化的sHASEGP不会以 快速的方式从玻璃体清除，从而在玻璃体中在更长的时间内维持它的活性。

[0484]一些透明质酸酶制剂的眼毒性已经被其他研究者证实，依据动物毒性模型， 这些研究者认为此类透明质酸酶制剂被用作毒性刺激物，导致实验条件下诱导的 眼的新血管形成(参见An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit；Antoszyk，A.N.，Gottleib，J.L.，Casey，R.C.，Hatchell，D.L.and Machemer，R.， Invest Ophthalmol Vis Sci 32：1，46-51(1991)。没有水银基污染物和牛或细菌来源的 污染物的高度纯化的sHASEGP对于眼内程序是优选的。而且，考虑到其纯度、无 牛病原体和具有降低的免疫原性风险，重组的人sHASEGP相比起屠宰场来源的制 剂是优选的。最优选地，考虑聚乙二醇化的sHASEGP。

[0485]因此，提供了使用人sHASEGP来治疗哺乳动物眼的眼障碍的酶学方法。 在本发明的一种实施方案中，所述sHASEGP被聚乙二醇化，以延长它在玻璃体内 的滞留时间，并防止在局部被摄取。新血管形成的预防和将对视网膜具有毒性的 材料从玻璃体清除的速度的增加，能够通过给予一定数量的透明质酸酶来实现， 这些透明质酸酶有效地液化接受治疗的眼睛的玻璃体液(vitreous humor)，而不对 眼睛产生毒性损害。玻璃状液的液化增加了玻璃体腔的液体交换的速度。该交换 的增加去除了那些造成眼科损害和视网膜损害的物质和条件。

[0486]sHASEGP的整容用途

[0487]已经知道，透明质酸酶具有将基础物质(fundamental substance)的黏多糖 长链解聚化的作用，而正是这些黏多糖长链使得保持住了结合水，并通过毛细压 缩减慢了消除代谢废物的有机液体的扩散。水和废物的这种滞留与脂细胞的脂肪 超载相关，构成了经典的“猪皮水肿(pigskin)”水肿或“桔皮(orange peel)”水 肿。因此，该解聚作用将黏多糖的长链切割成较短的链，从而消除了结合水，消 除了废物，恢复了静脉和淋巴循环，局部水肿也从而消失。

[0488]因此，经由皮下给药的sHASEGP的应用，对于去除在所谓的脂肪团积聚 过程中涉及的糖胺聚糖和促进淋巴流，是优选的。人sHASEGP对于脂肪团的处理 是优选的，这是因为它能够去除所述的糖胺聚糖，而没有屠宰场来源的蛋白的促 炎成分，且纯度高并不太可能具有免疫原性。sHASEGP可以通过反复的皮下注射 来给药、以药膏或乳液的形式透皮传送来给药，或通过使用可注射的缓慢释放制 剂来给药，这样可以促进糖胺聚糖的持续降解，并防止它们的重新形成。

[0489]器官移植

[0490]透明质酸具有若干生物学作用，在某种程度上这与它的分子尺寸有关(West， D.C.，Kumar，S.Exp.Cell.Res.183，179-196，1989)。器官中的透明质酸的含量在该 器官出现炎症的不同条件下会增加。因此，在表征为炎症性免疫损伤 (inflammatory-immunological injury)例如牙槽炎(Nettelbladt 0 et al，Am Rev Resp Dis 1989；139：759-762)和心急梗塞(Waldenstrom et al，J Clin Invest 1991；88(5)： 1622-1628)的各种器官的组织中，透明质酸的浓度是增加的。其他的例子是在肾 (Ha′llgren et al，J Exp Med 1990a；171：2063-2076；Wells et al，Transplantation 1990； 50：240-243)、小肠(Wallander et al，Transplant Int 1993；6：133-137)或心脏(Hallgren et al，J Clin Invest 1990b；85：668-673)移植之后的同种异体移植排斥；病毒引起的心肌 炎症(Waldenstrdm et al，Eur J Clin Invest 1993；23：277-282)。

[0491]与器官移植相关的间质水肿的发生是移植手术领域中严重的问题。多达 25％的移植会肿胀到导致功能暂时失去的程度。而且，在2-3％的情形中，肿胀导 致了肾的破裂，并导致大出血。

[0492]SHASEGP可以用于降解在器官移植中积聚的糖胺聚糖。这些糖胺聚糖的去 除促进了水从移植物中去除，并因此促进了器官功能。同样地，可以以500-10,000 单位/kg范围内的剂量来给药，以减少间质压力。

[0493]糖胺聚糖在脑中的病理性积聚

[0494]在许多脑脊髓病理状态中，透明质酸水平被提高。在成年中，脑脊髓透明 质酸的水平在正常情况下小于200μg/L(Laurent et al，Acta Neurol Scand 1996 Sep； 94(3)：194-206)。在疾病例如脑膜炎、椎管狭窄、头部损伤和脑梗塞中，这些水平 可以提高到8,000μg/L以上。因此，通过超唾液酸化sHASEGP的鞘内传送或全身 性注射而进行的sHASEGP给药可以被用来降解水平提高了的底物。

[0495]头部损伤之后，脑中缺乏有效的淋巴也能导致危及生命的水肿。透明质酸 积聚是HA合成酶介导的合成增加和降解减少的结果。透明质酸的积聚可以增加 受伤组织中的水含量，以帮助白细胞渗出，但可能是致命的。将人sHASEGP给予 患有头部损伤的患者因此可以去除组织透明质酸积聚和与它相联系的水。人 sHASEGP可以通过分流管(shunt)进行鞘内给药，或者可选择地，超唾液酸化 sHASEGP可以被静脉内给药，从而可以到达脑组织。

[0496]伴随着在中风中发生的脑缺血，透明质酸含量显著增加，这是由于HA合 成酶的表达增加和分解代谢减少的缘故。离子泵失灵并且血浆泄漏入间质中，导 致液体滞留，如果滞留的液体不能被淋巴系统完全清除掉，会导致组织坏死。一 些研究者企图通过阻断血管渗透，来防止缺血再灌注之后的间质流体积聚。然而， 一旦流体已经渗出，阻止血管渗透性则可能阻止了水肿的消解，并使情况恶化。

[0497]人sHASEGP也可以用于治疗与脑瘤有关的水肿，特别是与多形性成胶质 细胞瘤相关的水肿。与脑瘤有关的水肿由透明质酸的积聚产生，其处于该肿瘤附 近的非癌症部分的脑中。将透明质酸酶施用于透明质酸积聚的位置(例如通过静脉 注射或通过旁通管)，可以通过降解这些位置过量的透明质酸来缓解与此种恶性质 相关的水肿。因此，透明质酸酶能成功地治疗脑瘤，不但减少了肿瘤块并抑制肿 瘤生长和/或转移，而且也可用于缓解与该恶性质相关的水肿。以与施用牛睾丸透 明质酸酶来治疗水肿的方式相类似的方式，人sHASEGP可以被施用以治疗水肿(参 见例如Sa Earp Arq.Braz.Med.44：217-20)。

[0498]心血管疾病中的糖胺聚糖积聚的处理

[0499]已经显示，在患有实验性心肌梗塞的动物模型中，给予透明质酸酶可以减 少梗塞面积(Maclean，et.al Science 1976 Oct 8；194(4261)：199-200)。牛透明质酸酶 减少动物的梗塞面积的机制被认为是减少缺血再灌注之后出现的透明质酸积聚。 梗塞尺寸的减少被认为是由淋巴排泄(lymph drainage)增加和组织氧化作用增加 和心肌水含量减少引起的。尽管减少的梗塞尺寸可以在动物模型中获得，但是该 好处并没有在针对人的更大的临床研究中发现。牛睾丸透明质酸酶在动物和人中 具有非常短的血清半衰期，约3分钟(Wolf，et.al.，J Pharmacol Exp Ther 1982 Aug； 222(2)：331-7)。该短暂的半衰期是由于末端甘露糖残基的缘故，所述末端甘露糖 容易被网状内皮系统的清道夫受体(scavenger receptors)识别。尽管小的动物由于 其较小的血管床的原因可能受益于透明质酸酶，但也需要具有更长的半衰期的酶。 由于不存在识别唾液酸化作用的清道夫受体，所以超唾液酸化的sHASEGP具有更 有利的药物动力学特性。在100-200,000单位/kg范围内的超唾液酸化sHASEGP 剂量可以被用于帮助溶解缺血再灌注后过量的透明质酸，并减少梗塞面积。

[0500]超唾液酸化sHASEGP也可以被用于限制动脉硬化的冠脉斑块(coronary plaques)。此种斑块积聚糖胺聚糖并介导巨噬细胞和泡沫细胞粘附。Kolodgie et al， Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002 Oct 1；22(10)：1642-8。超唾液酸化sHASEGP 的给药可以被用来减少斑块形成。考虑以100-100,000U/kg的剂量反复地给予透明 质酸酶，利用低免疫原性和半衰期增加的人重组蛋白将使得斑块明显减少。

[0501]治疗外周组织坏死

[0502]组织坏死发生在因静脉机能不全而造成的许多疾病中。缺少足够的充氧是 组织再生的主要障碍之一。已经证明，动脉内透明质酸酶治疗显著地改善患有外 周动脉阻塞性疾病的患者的临床表现(Elder et.al，Lancet(1980)648-649)。 sHASEGP可以动脉内注射，一周3-5次，剂量为10-200,000单位。

[0503]麻醉的增强

[0504]屠宰场来源的透明质酸酶通常被用来在眼手术之前的局部麻醉中进行球周 阻断(peribulbar block)。该酶的存在避免了对其它阻断的需求并加速了运动不能(眼 睛运动的丧失)的发作。球周和sub-Tenon′s阻断是透明质酸酶在眼科手术中最常见 的应用。自从Wydase停产以来，复视和下垂现象的增加就已经被报导与球周阻 断有关(Brown et al J Cataract Refract Surg 1999；25：1245-9)。

[0505]由于惠氏公司停止供给Wydase，牛睾丸来源的透明质酸酶材料现在由复 合药剂供应。然而，对于使用临时的复合无菌产品，存在着若干问题。 http：//www.ashp.org/shortage/hvaluronidase.cfm？cfid＝11944667&CFToken＝9426953-r ef#ref。复合制剂并不是FDA批准的产品。同样地，FDA并没有对该制造工艺的 质量和一致性的控制标准。

[0506]10-500单位的SHASEGP可以直接与5ml的2％利多卡因(Xylocaine)、5ml 的0.5％布比卡因(Marcaine)以及可任选的肾上腺素(1∶200,000)混合。sHASEGP 可以用于增加运动不能的发作并减少对其它的阻断的需求。sHASEGP对于眼睑整 容和脸部整容中的整容手术时的运动不能也是理想的。sHASEGP也可以在此种手 术程序之后被使用，以扩散抗炎症剂和减少组织肿胀。

[0507]SHASEGP也可以与缓冲溶液诸如碳酸氢钠混合，以预防在注射程序中的不 适。SHASEGP也可以与用于伤口的麻醉剂混合，以减少注射所需要的材料的总量 并减少因组织肿胀引起的疼痛。

[0508]眼内压的降低

[0509]术后白内障患者中发生的一个普遍副效应是早期的——有时候会延长的— —显著的眼内压增加。此种状况有时候是严重的，特别在具有青光眼视神经盘变 化的患者中。尽管当在手术期间将粘弹性试剂例如透明质酸注射入眼睛中时，压 力增加往往会更加严重，但即使不使用此种试剂，术后眼内压也会升高。而且， 即使在手术过程中不使用其它附加的药物，此种压力增加也会发生。在一些情况 下，让粘弹性试剂留在眼睛里是有益处的，这常常使得有必要给予患者大剂量的 碳酸酐酶抑制剂。这些抑制剂通过减少房水的形成而降低眼内压，房水是正常情 况下在眼睛中由睫状体分泌的流体。目前用于减缓眼睛内术后压力增加的方法包 括各种类型的滴眼液，诸如β-肾上腺能阻断剂、拟交感神经药、缩瞳药、αII选 择性试剂、碳酸酐酶抑制剂和前列腺素试剂。

[0510]去除粘弹性试剂例如透明质酸的优选方法是在前节或后节手术程序的期间 或之后紧接着注射sHASEGP，尽管本领域已知的其他给药方法也是可能的。如果 透明质酸和sHASEGP在前节眼手术程序期间通过注射投药于眼睛前房，可以使得 透明质酸在手术程序开始期间能够充当间隔物，则是优选的。在一些角膜移植的 情况中，可以在适当位置缝合角膜移植物之前，将透明质酸和sHASEGP组合置于 眼内结构的表面。该组合也可以用于后节手术中，例如视网膜或玻璃体手术中。

[0511]在一些情况下，在手术结束时，将粘弹性试剂例如HealonTM、ViscoatTM或 其他可占据空间的物质置于眼的前房是明智的。对于在眼内内含物趋向于向前运 动并压迫角膜后表面时的正压力升高，这是尤其适用的。如果这发生在在适当位 置具有人工晶体的眼中，则角膜内皮上的压力可能显著伤害细胞并随后引起角膜 肿胀，并且发生浑浊化现象，其与视力减低相关。通常，如果在手术程序结束时 患者的眼内压显著升高，则有必要给予这样的患者大剂量的碳酸酐酶抑制剂，以 及外用滴眼液诸如β-阻断剂和αII促效药，以便减少水形成和/或增加水外流。这 些试剂都具有显著的副作用，并且在一些情况下，对于具有不同医学症状例如呼 吸问题、心脏病或高血压的患者，它们的使用则属于治疗不当。然而，在这些情 况下使用sHASEGP将省去给予这些患者大剂量的此类药物的必要。

[0512]而且，在小梁网中具有相当数量的透明质酸。sHASEGP将分解这些透明质 酸，并因此促进水通过小梁网流出。患者的眼内压将因此减小。sHASEGP与其他 前房试剂例如甲基纤维素(Ocucoat.RTM.，例如商购自Storz Instrument Co.)——在 白内障手术中用作间隔剂和/或保护试剂——的组合也将有效地防止压力的显著升 高，这是因为它将有效地打开小梁网，通过降解小梁网中存在的大量的透明质酸 来排除更多的房水。

[0513]从小梁网去除糖胺聚糖，对于患有隅角开放性青光眼的个体的眼内压的降 低也是有用的。人sHASEGP可以通过结膜下注射或直接注射在眼前房中而被给 药。

[0514]神经节囊肿

[0515]神经节囊肿(也称为腕囊肿、Bible囊肿或背腱鞘囊肿)是最常见的手软组织 块。它是充满流体的囊，其可以在皮肤下被感觉到。它通常附着于手或腕中的腱 鞘(可润滑腱的衬里结构)，或与下面的关节连接；然而，有一些并不会明显地连接 于任何结构。这些神经节囊肿也可以出现在足中。当腱的衬里结构或关节上面的 韧带中出现撕裂和由于韧带缺陷而造成衬里突出并导致在皮肤下形成肿块时，它 便发生了。因为常常伴随有炎症，发炎的组织产生果酱样的流体，充满突出的囊。 它们可以如岩石般坚硬，这是由于在该囊肿内含有压力很高的粘液样流体，它们 常常被误认为是骨突出。

[0516]sHASEGP可以被用于改善神经节囊肿。损伤区内注射入5-1000单位的 sHASEGP，然后进行细针抽吸，可以去除囊肿，而不需要手术。可任选地，皮质 类固醇可以sHASEGP一起注射。对于某些患者，则还需要其他注射。

[0517]粘液性水肿

[0518]皮肤的糖胺聚糖(GAG)渗透是甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症、胫 前粘液性水肿、苔藓性粘液水肿和硬化病的一个特征。在所有的病况中和在正常 的皮肤里透明质酸都是主要的GAG。GAG的皮肤分布具有最小的组织多样性。获 得性皮肤粘蛋白症(acquired cutaneous mucinoses)显示出类似的皮肤GAG分布和 生化组成。成纤维细胞活性的形态学差异表明，硬化病和苔藓性粘液水肿的粘蛋 白症代表的是一个局部进程，而甲状腺疾病的GAG渗透则可能具有全身性起源。 这些紊乱可以通过sHASEGP的局部给药和全身性给药而得以改善。对于慢性治 疗，可以考虑使用聚乙二醇化的sHASEGP。

[0519]sHASEGP的肺部应用

[0520]来自正常个体的支气管肺泡灌洗液(BAL)的透明质酸水平通常在15ng/ml以 下。然而，在呼吸窘迫的情况下，BAL水平大大上升(Bjermer Br Med J(Clin Res Ed) 1987 Oct 3；295(6602)：803-6)。例如，在ARDS中，透明质酸可以上升到500ng/ml， 然而在农民的肺中，BAL水平可以超过1000ng/ml(Hallgren et al Am Rev Respir Dis. 1989 Mar；139(3)：682-7)，(Larrson et al Chest.1992 Jan；101(1)：109-14)。在肺中增 加的透明质酸可以阻止氧扩散和气体交换并且活化嗜中性粒细胞和巨噬细胞应 答。

[0521]牛透明质酸酶制剂并不是治疗此种病况的优选之物，原因有许多。首先， 已经知道屠宰物睾丸来源的透明质酸酶制剂受到丝氨酸蛋白酶例如顶体蛋白酶的 污染。第二，牛的酶的外源性质增加了过敏反应的可能性，其能导致患者死亡。 因此，高纯度的重组人sHASEGP制剂可以通过肺或静脉内传送的方法而被传送。 也可以将人sHASEGP施予患有与升高的糖胺聚糖有关的其他肺部并发症的患者， 或者，给予人sHASEGP以增强其他共同传送的分子至肺部的传送。

[0522]本发明现在将通过参考下面的非限制性实施例来进行更加详细的描述。

[0523]实施例1

[0524]基于微量滴定的透明质酸酶测定

[0525]下面的实施例提供了测量sHASEGP透明质酸酶活性的快速分析方法。该 分析方法可以是关于TRU、IU或NFU，其中使用W.H.O.标准的透明质酸酶制剂。

[0526]生物素化的透明质酸微量滴定测定

[0527]使用生物素-酰肼(Pierce)、Sulfo NHS(Pierce)和1-乙基二甲氨基丙基-碳二亚 胺(Sigma)，使透明质酸的葡糖醛酸残基上游离的羧基在一步反应中被生物素化。 该生物素化的HA底物在第二个反应中，被共价偶联到96孔微滴定板上。酶反应 完成时，残留的底物用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应进行检测，其可以用标准的 ELISA平板读数器读出。因为底物是被共价结合于微滴定板，所以矫作结果 (artifact)例如生物素化底物的pH依赖性的置换没有发生。灵敏度使得能够对来 自培养细胞和生物样品的透明质酸酶活性进行快速测定，分析之间的偏差小于 10％。

[0528]a.实验方案

[0529]生物素化的HA底物的制备

[0530]在偶联到生物素之前，将100mg的HA(Sigma Chemicals)溶解于0.1M MES， pH 5.0中，至最终浓度为1mg/ml，在4℃溶解至少24小时。将Sulfo-NHS(Pierce； Rockford IL)加入到该CS04MES溶液中，至最终浓度为0.184mg/ml。将生物素酰 肼(Pierce)溶解于DMSO，作为100mM的贮存液，再加入到CS04溶液，至最终浓 度为1mM。将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)的贮存液制备为溶于 蒸馏水中的100mM贮存液，再加入到HA生物素溶液，至最终浓度为30mM。将 该溶液在4℃搅拌过夜。未连接的生物素和EDAC通过用水透析而去除，其中3 次更换1000×体积的水。将透析过的、生物素化的HA(bHA)进行等分，可在-20℃ 保存达数月。

[0531]用含有浓度为0.2mg/ml的bHA的水将Sulfo-NHS稀释至0.184mg/ml，并 吸放到96孔COVALINK-NH板(NUNC；Placerville NJ)，每孔50μl。将EDAC用 水稀释至0.123mg/ml，并吸放到含有bHA溶液的COVALINK-NH板，结果，bHA 的最终浓度为10μg/孔，EDAC的最终浓度为6.15μg/孔。将板在4℃温育过夜，或 23℃温育2小时，这给出了相当的结果。将bCS04共价固定在微量滴定板上之后， 通过振荡去除偶联溶液(coupling solution)，并将板在含有2M NaCl和50mM MgSO4的PBS(缓冲液A)中洗涤3次。该板可以保存在4℃达1周。

[0532]带有固定化的bHA的COVALINK-NH板可以用100μl/孔的测定缓冲液平 衡，测定缓冲液是0.1M甲酸，pH 3.7、0.1M NaCl、1％TRITON X-100去污剂、 5mM葡糖二酸单内酯，用于溶酶体透明质酸酶；或者是10mM Hepes，PH 7.4，具 有1mM CaCl2和1mg/ml人血清蛋白(ICN)，用于中性活性酶。用于“相对浊度降 低单位”(rTRUs)的酶活性的校准的一组标准通过下述步骤产生：用中性酶缓冲 液将牛睾丸透明质酸酶(Sigma Type VI-S)稀释为1.0至1×10-6 rTRU/孔并进行测定 100μl/孔，一式三份。用溶酶体酶测定缓冲液将酸性活性透明质酸酶的样品稀释为 1∶10至1∶130,000，按100μl/孔的量移取，一式三份。对于大部分的组织提取物和 人血浆分析，37℃温育30分钟是足够的。阳性和阴性对照孔(分别没有酶或没有 ABC(参见下面))也被包括，一式三份。

[0533]通过加入200μl/孔的6M盐酸胍来终止反应，然后以300μl/孔的量用PBS、 2M NaCl、50mM MgSO4、0.05％TWEEN 20去污剂(缓冲液B)洗涤3次。抗生物 素蛋白-生物素复合物(ABC)试剂盒(Vector Labs；Burlingame CA)可以在10ml的含 有0.1％TWEEN 20去污剂的PBS中制备，其在温育期间在室温下预先温育30分 钟。加入ABC溶液(100μl/孔)，并在室温温育30分钟。将板用缓冲液B洗涤5次， 然后以100μl/孔的量加入o-苯二胺(OPD)底物，该底物溶液通过将1片10mg的OPD 片剂溶解于10ml的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，pH 5.3，并加入7.5μl的30％H2O2 来制成。将板在黑暗中温育10-15分钟，然后使用492nm过滤器，在ELISA平板 读数仪(Titertek Multiskan PLUS；ICN)上读数，通过使用Biometallics(Princeton NJ) 的Delta Soft II平板读数软件的计算机来进行监控。应用了牛睾丸透明质酸酶的标 准曲线可以利用通过商业渠道购得的透明质酸酶制剂的四参量曲线拟合而产生， 未知样品通过它们在492nm的吸收值，借助于内插法而被估算出。

[0534]为了分析透明质酸酶的pH依赖性，纯化的重组sHASEGP和牛睾丸透明质 酸酶被应用。酶活性对pH的依赖性可以通过将纯化的sHASEGP或部分纯化的牛 睾丸透明质酸酶用下述缓冲液稀释至0.1rTRU来进行测量：50mM甲酸盐，pH 3-4.5；50mM醋酸盐，pH 5-6；50mM MES，pH 6-7；或50mM HEPES，pH 7-8。 将样品在37℃测定30分钟，活性用最大活性的百分比来表示。缓冲液中不能使用 NaCl，这是因为NaCl能改变睾丸透明质酸酶制剂的pH最适宜值(Gold，Biochem.J. 205：69-74，1982；Gacesa et al.Biochem.Soc.Trans.7：1287-1289，1979)；生理盐浓度 (0.15M)使得表观pH最适宜值降低，这一影响在睾丸酶的纯化制剂中比在原始的 粗样品中更为显著。

[0535]b.结果

[0536]透明质酸在使用了生物素-酰肼和EDAC的一步反应中被生物素化。EDAC 是将HA上的游离羧基基团与生物素酰肼进行偶联，将EDAC进行限制，则HA 上只有一小部分的葡糖醛酸残基被标记。将EDAC(3×10-5M)加入到HA(2.8×10-3 M)，按这一数量，则产生最大值：每93个HA二糖单位偶联1分子的生物素酰肼。

[0537]制备牛睾丸透明质酸酶标准反应的四参量曲线拟合值，所述的标准反应在 pH 3.7进行测量，并稀释为1.0至1×10-6TRU/孔。四参量曲线拟合值由方程来建 立：y＝((A-D)/(1+(浓度/C)^B))+D)，其中，logit y＝ln(y′/l-y′)，y′＝(y-D)/(A-D)， B＝-b/ln 10，C＝EXP(a/B)。四个参量(A、B、C、D)用软件程序来计算，该软件程 序利用了2+2线性回归运算法则(Rodbard et al.，Clin.Chem.22：350，1976)。该曲线 拟合具体表现为标准曲线的S形特征。样品测定时的最佳准确性通常在0.001至 0.01TRU/孔温育30分钟时获得。在60分钟的温育期间，可检测到1/1000的TRU。 对于更小范围的值，也可以利用标准对数曲线来建立标准曲线拟合值。尽管本发 明已经依据特定的优选实施方案进行了描述，但应该理解的是，要求保护的发明 不应该限于这些特定的实施方案。

[0538]实施例2

[0539]sHASEGP cDNA的克隆

[0540]编码人sHASEGP的核酸可以由本领域技术人员通过许多方法来获得，包 括但不限于人工基因合成、RT-PCR和cDNA文库杂交(例如参见Gmachl et al FEBS 336(3)1993，Kimmel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 1993 10071-10075)。 可选择地，编码人sHASEGP的克隆可以从IMAGE或人基因序列的其他供应商那 里获得(Invitrogen Clone ID IOH10647)。

[0541]全长人PH20cDNA经计算长为2009个核苷酸，含有1530个核苷酸的开放 阅读框。5′UTR非同寻常的大，其可能象征滞留的内含子(retained intron)，而且 它可能由于5′UTR中的9个非编码起始密码子的缘故，通过阻止核糖体结合到正 确的起始甲硫氨酸密码子而抑制翻译。该蛋白(Genbank序列号为NP_003108)经预 测包含有509个氨基酸，SEQ ID No.1，计算出的分子量为58kDa。

[0542]为了克隆的测序，PCR扩增条带被切割，并用胶提取回收试剂盒(Qiagen) 洗出，再克隆入合适的经限制性消化而具有粘末端的载体。双链DNA的所有测序 反应依据制造商的说明进行，其中使用了Taq染料脱氧终止循环测序试剂盒 (Applied Biosystems)，是在ABI PrismTM自动测序仪(Applied Biosystems)上进行测 序。

[0543]使用引物SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 47进行聚合酶链式反应，扩增人睾 丸cDNA文库(Clontech，Palo Alto CA)，获得了人PH-20开放阅读框。PCR产物用 NheI和BamHI消化，并克隆到载体IRESpuro2(Clontech)的NheI和BamHI位点。

[0544]实施例4

[0545]从人PH20cDNA分离出SHASEGP

[0546]能够在哺乳动物细胞中有效进行糖基化作用的具有催化活性的分泌型重组 人sHASEGP表达载体按照下面描述的方法产生。携带针对不同物种的启动子和选 择性基因的其他表达构建物也被考虑，不同的物种诸如酵母和昆虫细胞，其也能 产生sHASEGP。也可以使用阳性选择性基因诸如谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原 酶(DHFR)。下面给出的例子不是为了限制目的，而是提供可以使用的若干质粒表 达系统的例子。

[0547]为了构建分泌形式的sHASEGP，缺少疏水性C末端的截短变体被构建。使 用GPI切割预测程序，GPI锚切割位点被定位于该全长的GPI锚定的蛋白中的氨 基酸位置N483附近。由7个嵌套3′引物组成的引物组被用来构建7个截短的缺失 变体，所述变体从位置Y482处开始缺少预测的GPI锚，并由此剔除一个又一个的 氨基酸。这些引物被设计成具有相容的NheI(5′)和BamHI(3′)位点，以便将所述的 截短变体克隆进载体Irespuro2，其中或者在3′引物中未用终止密码子进行标记， 或者其作为C末端用His标记的蛋白质以方便纯化和检测。例如，反向引物SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10被用来产生剔除突变子，以位置Y482、F481 和I480为末端，无6-His标记。其他变体引物用同样的碱基设计产生，其中进行 适当的修饰以包括和排除特定的氨基酸。为了产生His-标记的变异体，用于非标 记的变异体的同一组引物可以被类似地使用，不同的是在各自的反向引物中缺少 终止密码子，而正向引物是相同的(对于His标记的构建物，是指具有SEQ ID No 19、20、21、22、23、24和25的引物，它们是没有终止密码子的反向引物，对应 于它们各自的构建物的非标记的反向引物)。重叠的引物被用来构建6个氨基酸的 间隔子，然后跟着在Irespuro2载体中的BamHI和NotI位点内的六聚组氨酸，这 样，His-标记的变体通过在含有所述his标记的Irespuro2载体中的NheI和BamHI 位点内将PCR扩增并经过限制性消化的产物连接起来而产生。

[0548]为了确认人sHASEGP是否可以在它的羧基末端进行修饰而产生分泌型中 性活性酶，在GPI锚附着位点至预测的“催化结构域”范围进行一系列的截短， 被预测的“催化结构域”是依据与蜂毒酶的同源性获得的。

[0549]在IRESPuro2中的编码人sHASEGP全长GPI锚定克隆的DNA被用作模板 以产生各种截断的缺失变体。软件建模程序给出了全长多肽的若干预测的切割位 点。这样的预测出的位点之一在氨基酸位置N483(SEQ ID No.1)。PCR引物被设 计用来从N483起连续地截短蛋白质，从而产生6个缺失变体，以Y482(缺少N) 开始，至E477(缺少P)结束。

[0550]a.实验方案

[0551]产生缺少N483的截短变体：

[0552]在pIRESPuro2的NheI和BanHI之间的全长GPI锚定sHASEGP克隆被用 作模板。该模板用含有NheI位点的5′引物——其从天然信号肽的起始甲硫氨酸 M1开始(SEQ ID No.14)，和含有BamHI位点的3′引物——其在Y482处结束(SEQ ID No.8)进行扩增。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上跑胶，以分离并确认准确大小 的扩增带，将胶纯化，用NheI和BamHI消化，再克隆入载体pIRESPuro2(Clontech) 的NheI和BamHI位点之间，产生用于表达该SHASEGP截短变体的表达载体，该 截短变体在氨基酸位置Y482处结束，缺少GPI锚，具有所描述的氨基酸序列(SEQ ID No.5，对应于所获得的sHASEGP多肽的序列，直至Y482)和核苷酸序列(SEQ ID No.48：为SEQ ID No.5多肽的编码核苷酸)。

[0553]其他的分别缺少Y482、F481、I480、Q479和P478的截短变体被产生。

[0554]使用同样的策略，唯一的差异是对于各个变体使用合适的3′引物。各3′引 物描述如下：

[0555]用于缺少Y482的sHASEGP变体的3′引物-SEQ ID No.9

[0556]用于缺少F481的变体的3′引物-SEQ ID No.10

[0557]用于缺少I480的变体的3′引物-SEQ ID No.11

[0558]用于缺少Q479的变体的3′引物-SEQ ID No.12

[0559]用于缺少P478的变体的3′引物-SEQ ID No.13

[0560]产生进一步的缺失变体以确定sHASEGP的最小化的活性结构域：

[0561]进一步的剔除作用是从上述的sHASEGP截短至最内部的、序列至E477的 中性pH活性截短变体的3′末端，以10至20个氨基酸的氨基酸块为单位，来进行 的。NheI正向引物SEQ ID No.14与适当定位的3′引物被用来PCR扩增sHASEGP 剔除变体，其中从羧基末端剔除掉了所期望的长度。例如，用描述于SEQ ID No.14 和SEQ ID No.26的引物分别作为5′和3′引物进行PCR，当被IresPuro2载体中的表 达构建物表达时，产生了SEQ ID No.49中的多肽。类似地，用SEQ ID No 27、28、 29、30、31和32中描述的反向3′引物进行PCR，产生分别以成熟sHASEGP的氨 基酸位置A447、S430、G413、S394、A372和S347为末端的剔除变体。在每一种 情况下，PCR产物用NheI和BamHI消化，消化得到的产物克隆入plresPuro2载体 的NheI和BamHI位点之间。通过瞬时转染入在CD-CHO无血清培养基(Invitrogen， CA)中的CHO细胞，每一组的最终表达构建物的一些独立克隆被测试其分泌型中 性活性sHASEGP活性，样品在指定的时间点被取出以用于测定。依照制造商推荐 的实验方案，从过夜培养物制备得到的小量制备DNA用Genejuice(Novagen，CA) 转染试剂转染。用上面描述的微量滴定分析方法测量透明质酸酶活性。

[0562]b.结果

[0563]sHASEGP截短变体的透明质酸酶活性被测量，从而鉴定出分泌型中性活性 透明质酸酶活性的最小化活性结构域。  氨基酸1至   U/ML/24小时 PH7.4  347   0.000  372   0.000  394   0.000  413   0.000  430   0.000  447   0.000  467   0.089  477   0.567  478   0.692  479   0.750  480   0.575  481   0.740  482   0.329  483   0.800  509   0.044

[0564]结果显示，上述的所有6个氨基酸剔除变体——其以Y482至E477中的指 示出的氨基酸为末端，均比GPI锚定sHASEGP，给出更高的分泌的活性。

[0565]结果还显示，剔除范围超过A467的剔除消除了所有的分泌型活性。A467 克隆的分泌型中性活性降至P478或N483克隆中所发现的活性的大约10％。因此 推断，比起先前由蜂毒酶假定的情况，需要人sHASEGP羧基末端区域的更多部分 来产生中性活性透明质酸酶结构域。因此，羧基末端区域中的半胱氨酸是中性活 性所必需的。N483处的GPI切割位点之前的约10个氨基酸的非常窄的范围限定 了最小活性结构域。

[0566]实施例5信号肽的修饰对SHASEGP分泌活性的影响

[0567]人sHASEGP具有非常长的预测出的天然前导肽。此外，在该前导肽中的 两个邻近的半胱氨酸残基的存在可能导致在高水平表达期间多肽多聚体在内质网 中的聚集，并因此阻止了sHASEGP的高水平表达。因此，一系列更具效率的促分 泌前导肽被测试，以检测它们增强sHASEGP靶向分泌的能力。

[0568]a.实验方案

[0569]通过重叠引物退火并用引物进行PCR延伸，构建出Kappa前导肽，所述的 引物对应于SEQ ID No 37、38、39和40中的序列。所获得的PCR扩增的kappa 序列，用侧翼引物进行扩增，所述侧翼引物在5′端含有NheI位点(如SEQ ID No.41 中描述)，在3′端含有EcoRI位点(如在SEQ ID No.42中描述)。这使得能在Litmus 39(NEB)载体的NheI和EcoRI位点之间克隆Kappa前导肽(该多肽序列在SEQ ID No.43中描述)。sHASEGP具有内部EcoRI位点；因此，NheI位点和EcoRI位点 之间的该kappa构建物，进一步用5′SpeI引物(如SEQ ID No.44中描述)和3′MluI 引物(如SEQ ID No.45中描述)扩增。以P478为末端的无GPI锚的sHASEGP用 NheI和BamHI从pIresPuro2中切割出来，并克隆入Litmus 39(NEB)载体的NheI 和BamHI位点内。由此获得的含有sHASEGP的Litmus载体用SpeI和MluI限制 酶消化，将用SpeI和MluI引物扩增的kappa前导构建物克隆入该载体中。在该含 有Kappa和sHASEGP序列的Litmus 39载体上进行定点突变，以使sHASEGP的 成熟多肽与Kappa前导序列能够融合在同一阅读框架中。对应于SEQ ID No.34和 35的引物对被用来产生以天然Asp为末端氨基酸的kappa前导链，该Asp被融合 到sHASEGP的F38(sHASEGP的序列至P478)(如SEQ ID No.46中描述的融合 蛋白质的多肽序列)。其他引物对组合例如SEQ ID No.33和SEQ ID No.35，被用 来产生以Asp(D)为末端的Kappa前导链，其融合到SHASEGP的L36；SEQ ID No.33和SEQ ID No.36被用来产生以Gly(G)(在所述的末端Asp(D)前面)为末端的 Kappa前导链，其融合到SHASEGP的L36；SEQ ID No.34和SEQ ID No.36被用 来产生以Gly(G)(在所述的末端Asp(D)的前面)为末端的Kappa前导链，其融合到 SHASEGP的F38。通过定点突变获得的Kappa-sHASEGP融合蛋白用凝胶纯化， 用酶DpnI消化，以消化任何延续下来的亲代DNA，然后用NheI和BamHI消化， 并克隆入已用NheI/BamHI消化的HisIresPuro2骨架，该骨架在pIRESPuro2的 BamHI和NotI位点之间克隆有his标记(6个氨基酸的间隔子，随后跟着6个组氨 酸)。因此，连接完成之后，我们获得了pIresPuro2中的 NheI-kappa-SHASEGP-BamHI-His构建物。获得4组这样的构建物，其对应于作为 Kappa前导链的末端的G或D和作为成熟sHASEGP的起始端的L36或F38的组 合。来自每一类构建物的一些独立克隆被转染入CD-CHO培养基(Invitrogen，CA) 中的CHO细胞，以测试与天然的分泌前导链相比，kappa分泌前导链的存在是否 会促进分泌蛋白质的水平增加。从过夜培养物制备获得的小量制备DNA用 Genejuice(Novagen，CA)转染试剂，依据制造商推荐的方案进行转染，在指定的时 间点收取样品以用于微量滴定分析测试。透明质酸酶活性按照上面描述的微量滴 定分析方法来测量。

[0570]小鼠IgG Kappa链前导肽sHASEGP融合构建物被测试，以测试出更高水平 的分泌型中性活性sHASEGP活性。

[0571]b.结果   人sHASEGP基因构建物   U/ML/24小时，PH7.4   IgG Kappa前导肽sHASEGP氨基酸38-478 HIS6   3.0257   天然前导肽sHASEGP氨基酸1-478 HIS6   0.4857

[0572]酶分析的结构表明，当与缺少IgG Kappa前导链的克隆P478、Y482或N483 相比时，相对于天然的分泌前导链，IgG Kappa前导链能够将sHASEGP的分泌增 强约7至8倍。具有变化的前导链融合位点的其它kappa前导构建物也产生了增加 水平的分泌型中性活性透明质酸酶活性，其中所述的前导链融合位点是从该Kappa 前导链的Asp或Gly至sHASEGP的L36或F38。这些实施例旨在扩展而不是限制 本发明的范围，其他有效的促分泌前导序列可以采用同样的技术而被利用。

[0573]实施例6

[0574]人sHASEGP表达载体的产生

[0575]通过克隆入双顺反子表达序列盒HZ24(SEQ ID NO 47)，产生不带表位标记 的sHASEGP。表达sHASEGP的HZ24质粒载体包括pCI载体骨架(Promega)、编 码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA序列、来自ECMV病毒(Clontech) 的内部核糖体进入位点(IRES)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架也 包括编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒即刻早 期增强子/启动子区(CMV)、嵌合内含子和SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。编 码sHASEGP构建物的DNA在天然信号前导链的甲硫氨酸处含有Kozak共有序列 和在酪氨酸482含有终止密码子。所得到的构建物pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ-24)导致由CMV启动子驱动的单一mRNA，它编码PH20的氨基酸1-482和二 氢叶酸还原酶的氨基酸1-187，它们由内部核糖体进入位点分隔开。

[0576]利用5′引物和反向引物，将人PH20开放阅读框从Invitrogen ORF克隆 (IOH10647，CA)中扩增出来，其中所述的5′引物在PH20的甲硫氨酸之前引入了 NheI位点和Kozack共用序列，所述的反向引物在酪氨酸482之后引入了终止密码 子并引入了BamHI限制性位点。用NheI和BamHI消化PH20 PCR片断，将所得 到的PCR产物连接入质粒pIRESpuro2(Clontech，Palo Alto，CA)。

[0577]实施例7

[0578]sHASEGP表达细胞系的产生

[0579]将培养于补充有4mM谷氨酰胺和18ml Plurionic F68/L(Gibco)的用于 DHFR(-)细胞的GIBCO改良型CD-CHO培养基中的未转染DG44 CHO细胞，在 0.5×106细胞/ml时接种到摇瓶中以准备用于转染。细胞于37℃培养在5％CO2的湿 润培养器中，并进行120rpm的振荡。在转染之前，测试指数生长的未转染DG44 CHO细胞的存活率。

[0580]将未转染的DG44 CHO细胞培养物的60,000,000个存活细胞进行沉淀，并 重新悬浮于0.7mL的2×转染缓冲液(2×HeBS＝40mM Hepes，pH7.0、274mM NaCl、 10mM KCl，1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中，浓度为20,000,000个细胞。向 每一等份的重悬浮细胞，加入0.09mL的线性HZ24质粒(250ug)，在室温下将细胞 /DNA溶液转移入0.4cm间隙BTX(Gentronics)电穿孔小盒。用没有混合质粒DNA 的细胞作为阴性对照进行电穿孔。细胞/质粒混合物被电穿孔时，电容器的放电条 件为330V和960uF或者350V和960uF。

[0581]电穿孔之后，将细胞从小盒中移去，并转移到5mL的改良CD-CHO培养 基中，该培养基是用于DHFR(-)细胞，补充有4mM谷氨酰胺和18ml Plurionic F68/L (Gibco)，让培养物在6孔组织培养板的孔中生长两天而不进行选择，培养板是置 于37℃的5％CO2湿润温育器中。

[0582]电穿孔2天之后，从各个孔中移出0.5mL的组织培养基，并测试透明质酸 酶活性的存在。

[0583]在转染后的40小时，HZ24转染的DG44 CHO细胞的初始透明质酸酶活性   稀释   活性，单位/ml   转染1330V   1至10   0.25   转染2350V   1至10   0.52   阴性对照   1至10   0.015

[0584]来自转染2(350V)的细胞从组织培养孔中收集，计数，并稀释至每毫升 10,000至20,000个存活细胞。将0.1mL的细胞悬浮液等份试样转移到5个96孔圆 底组织培养板的各个孔中。将0.1mL的CD-CHO培养基(GIBCO)加入到含有细胞 的孔中(最终体积0.2mL)，所述CD-CHO培养基含有4mM Glutamax-1并且没有 次黄嘌呤和胸苷补充物。

[0585]由在无甲氨蝶呤的条件下培养的5个板中鉴定得到的10个克隆   板/孔ID   相对透明质酸酶活性   1C3   261   2C2   261   3D3   261   3E5   243   3C6   174   2G8   103   1B9   304   2D9   273   4D10   302   1E11   242   A1(+)对照  333   H12(-)对照  0

[0586]6个HZ24克隆被培养放大，并作为单细胞悬浮液转移到摇瓶。使用二维无 限稀释策略(two-dimensional infinite dilution strategy)，将克隆3D3、3E5、2G8、 2D9、1E11和4D10接种到96孔圆底组织培养板。将稀释的克隆培养在500个未 转染DG44 CHO细胞/孔的背景中，以为最初几天的培养提供必要的生长因子。每 一亚克隆制备10个板。

[0587]克隆3D3产生24个可见的亚克隆。这24个亚克隆中8个亚克隆的上清液 中测量到了明显的透明质酸酶活性(＞50单位/mL)，这8个亚克隆在存在50nM甲氨 蝶呤的条件下放大培养于T-25组织培养瓶中。克隆3D3 50nM在存在500nM甲氨 蝶呤的条件下被进一步放大，在摇瓶中获得了活性超过1,000单位/ml的克隆(克隆 3D3 5M)。

[0588]实施例8

[0589]sHASEGP的产生

[0590]将一小管的3D35M解冻，并由T摇瓶通过1L转瓶来进行放大，它们培养 在补充有100nM甲氨蝶呤和Glutamax(Invitrogen)的CHO CDM(Invitrogen， Carslbad CA)中。细胞由转瓶转移到5L生物反应器(Braun)，接种密度为4.0×10E5 个存活细胞/ml。参数为温度设置值37℃、pH 7.2(起始设置值)、溶解氧设置值25％ 和空气覆盖(air overlay)为0-100cc/min。在168小时时，加入250ml的供给#1 培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖)。在216小时时，加入250ml的供给#2培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖+10mM丁酸钠)，在264小时时，加入250ml的供给#2培养 基。该过程产生的最终生产率为1600单位/ml，最大细胞密度为6百万细胞/ml。 发现在生产的最后阶段加入丁酸钠显著地增加了sHASEGP的产量。3D3-5M生长& sHASEGP产量，5L生物反应器   操作时间   存活细胞   ×10E5   ％存活   单位/ml   体积(mL)   [葡萄糖]   供给料   0   4.4   100   0   4500   547   24   5.7   100   0   4500   536   48   10.1   100   37   4500   501   72   17.1   99   62   4500   421   96   28.6   99   118   4500   325   120   28.8   99   240   4500   274   144   60.2   100   423   4500   161   168   55   100   478   4500   92   250ml供给#1   192   66.6   98   512   4750   370   216   55.2   92   610   4750   573   250ml供给#2   240   53   88   710   5000   573   264   49.8   84   852   5000   474   250ml供给#2   288   40   70   985   5250   770   312   31   61   1467   5250   773   336   25.4   52   1676   5250   690

[0591]实施例9

[0592]sHASEGP的纯化

[0593]通过深度过滤和在10mM Hepes pH 7.0中切向流透析，将来自3D3克隆的 条件培养基澄清化。然后通过Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换、苯基琼脂糖(Pharmacia) 疏水相互作用层析、苯基硼酸盐(Prometics)和羟磷灰石层析(Biorad，Richmond，CA) 的连续层析，纯化可溶性HASEGP。

[0594]SHASEGP被结合到琼脂糖，再用含有400mM NaCl的同样的缓冲液洗脱。 将洗脱物用2M硫酸铵稀释至最终浓度为500mM ASO4，并通过苯基琼脂糖(low sub)柱，然后在同样的条件下结合到苯基硼酸树脂。用pH 9.0，无ASO4的50mM N-二(羟乙基)甘氨酸洗涤之后，sHASEGP用Hepes pH 6.9从该苯基琼脂糖树脂上 洗脱下来。将洗脱物上载到陶瓷羟磷灰石树脂上，pH 6.9，在5mM PO4 1mM CaCl2中，再用含有0.1mM CaCl2的80mM PO4 pH 7.4洗脱。

[0595]借助于使用USP参考标准的微浊度分析(microturbidity assay)，确定所获 得的纯化的sHASEGP具有超过65,000USP单位/mg蛋白的比活性。纯化的 sHASEGP在24至26分钟的时间里以单峰的形式，用在0.1％TFA/H2O和 0.1％TFA/90％乙腈/10％H2O之间的梯度从Pharmacia 5RPC苯乙烯二乙烯基苯柱上 洗脱出来，经SDS电泳的辨认，为单一的61kDa的较宽条带，而用PNGASE-F处 理之后，其减为51kDa的较锐利的条带。N-末端氨基酸测序揭示，前导肽已被有 效地去除。

[0596]生物化学方法纯化的sHASEGP的N-末端氨基酸序列。   位置  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   理论上  Leu   Asn   Phe   Arg   Ala   Pro   Pro   Val   Ile   Pro   Asn   观察到  -   Asn   Phe   Arg   Ala   Pro   Pro   Val   Ile   Pro   Asn

[0597]实施例10

[0598]DG44 CHO来源的sHASEGP糖基化作用的分析

[0599]关于来自不同物种的sHASEGP是否需要糖基化作用以实现它们的催化活 性，存在相互矛盾的数据。例如，据报道，具有酶促催化活性的蜜蜂蜂毒透明质 酸酶可以在缺少糖基化机制的细胞诸如大肠杆菌中合成。而且，用PNGase处理纯 化的牛睾丸透明质酸酶不会使酶活性失活(Yamagata et al 1997)。其他研究报道，去 糖基化作用之后，活性丧失，而且二硫键是额外地需要的。

[0600]所有之前的测试都是使用粗制的或部分纯化的制剂来进行，然而，还没有 弄清楚，活性的丧失是由于去糖基化的酶被暴露于粗制剂中污染的蛋白酶，还是 由于糖基化作用和催化活性之间的直接功能关系。

[0601]a.实验方案

[0602]为了确定在无蛋白质的条件下使用CHO表达系统，功能性的N-连接糖基 化作用是否能被导入人sHASEGP，编码人sHASEGP-HIS6的cDNA被表达于CHO 细胞中，这是通过使用IRESpuro双顺反子表达盒在化学成分确定的培养基中进行 的。将细胞在CHO CDM(Invitrogen/Gibco)中培养72小时，然后浓缩，用30kDa 截留膜(cutoff membranes)在Pellicon TFF单元(Millipore)上进行切向流透析。将 浓缩物与10mM Hepes PH 7.4 50mM NaCl进行交换。然后将透析后所得物上载在 DEAE流线形琼脂糖树脂上，并在Pharmacia FPLC树脂上，用梯度为0-1M NaCl的NaCl洗脱。人sHASEGP用10-30％NaCl洗脱下来。柱分离级分中的sHASEGP 的水平证明，大部分的酶在10-30％NaCl的梯度中被回收。来自10-30％NaCl梯 度的酶然后进一步通过亲合层析在带有Ni的IMAC树脂上纯化。用50mM醋酸盐 PH 5.0、10M Imidizole洗涤之后，人sHASEGP从IMAC树脂上洗脱得到。浓缩该 蛋白，并用10mM Hepes PH 7.4透析。在基于ELISA的生物素化底物的微量滴定 分析中，测得高度纯化的酶在1mM钙和1mg/ml HAS存在的条件下，具有97,000 单位/mg蛋白的比活性。

[0603]为了检测蛋白质相对分子量的变化，纯化的人sHASEGP用PNGASE或神 经氨酸酶处理过夜，然后进行凝胶电泳、电转移，用连接有抗His6单克隆抗体的 HRP(Qiagen)进行蛋白质印迹分析，并进行ECL检测。

[0604]b.结果

[0605]蛋白质印迹分析证明，在CHO细胞中产生的人sHASEGP对PNGASE的 处理敏感。人sHASEGP的相对分子量显示，蛋白质是高度糖基化的。一旦用 PNGASE进行完整的过夜消化之后，人sHASEGP降为单一物质，这证明未消化的 条带的中度异质性可能是由N-连接糖残基造成的。PNGaseF的部分消化显示出一 系列的中间产物，其由未处理的蛋白转化而来，经过更长时间的处理，则发生进 一步的转化。尽管条带在7％凝胶上稍显弥散，但至少可以看见6个不同的中间同 工异构型。

[0606]用神经氨酸酶对sHASEGP进行的处理揭示，CHO细胞事实上能够合成唾 液酸化的人sHASEGP。用神经氨酸酶进行处理，并在7％凝胶上对sHASEGP进行 蛋白质印迹分析后发现，与未处理的sHASEGP相比，CHO来源的人重组sHASEGP 在迁移中显示出约1-3kDa的变化。因此，这是第一次报道了基本上唾液酸化的人 sHASEGP的产生。这对于人sHASEGP的稳定性和血清半衰期的增加都是非常有 价值的，因为许多物种的天然精液sHASEGP缺少唾液酸化，不能与唾液酸特异性 凝集素进行反应。

[0607]sHASEGP的FACE分析

[0608]利用FACE分析对活性sHASEGP寡糖进行分析，使得能够快速确定具有催 化活性的sHASEGP的特性。

[0609]实验方案

[0610]使用FACEN-连接寡糖作图方法(N-Linked Oligosaccharide Profiling) (Prozyme)，对来自3D3 5M克隆的纯化的透明质酸酶进行评价。寡糖从用N-聚糖 酶(a.k.a PNGase)通过酶促消化从128.7μg的糖蛋白上切割下来，用荧光团ANTS 标记，并用电泳进行分离。通过将样品以及该样品的稀释物和寡糖标准梯度物一 同跑胶，确定出寡糖条件的相对位置，其中，所述寡糖标准梯度物以聚合度(DP) 单位来表示迁移距离。

[0611]结果

[0612]透明质酸酶样品的N-图由10个条带组成，其中的6个(其与寡糖标准条 带G5-G12一同迁移)的强度大于9％。而且，与G9标准物一同迁移的条带的强 度最强，为35％-46％。

[0613]sHAS

[0614]EGP寡糖分析  sHASEGP寡糖   聚合度   占总数的百分比  1   15.64   1.2  2   13.68   3.4  3   11.6   10.0  4   10.04   10.4  5   8.37   35.4  6   7.32   9.7  7   6.14   9.0  8   5.57   12.4  9   3.84   2.3   10   3.26   0.5

[0615]实施例11

[0616]酶活性对SHASEGP N-连接糖基化作用的依赖性

[0617]a.实验方案

[0618]将纯化的HIS6sHASEGP与缓冲液在37℃混合过夜，该缓冲液含有神经氨 酸酶和PNGASE，并含有或不含有50mM辛基葡糖苷。通过凝胶迁移(gel shift)， 由蛋白质印迹分析证明，寡糖已经被去除。

[0619]b.

[0620]结果   样品   U/ML   无Rx   22.01   神经氨酸酶O/N 50mM辛基葡糖苷   23.57   PNGaseF w/50mM辛基葡糖苷   0.0   PNGaseF，无50mM辛基葡糖苷o/n   10.74

[0621]实施例12

[0622]SHASEGP对硫酸化的和非硫酸化的糖胺聚糖的活性

[0623]除了使用HA的微量滴定分析之外，sHASEGP对其他糖胺聚糖或蛋白聚糖 的底物特异性，可以用纯化的底物利用凝胶迁移分析来测试，以确定sHASEGP对 其他糖胺聚糖的活性。许多透明质酸酶分析是基于对新的还原性N-乙酰氨基基团 的产生(Bonner and Cantey，Clin.Chim.Acta 13：746-752，1966)或粘性的损失(De Salegui et al.，Arch.Biochem.Bioplays.121：548-554，1967)或浊度(Dorfman and Ott，J. Biol.Chem.172：367，1948)的测定来进行的。采用纯化的底物时，所有这些方法都 足以测定内切葡萄糖胺活性的存在或不存在。

[0624]a.实验方案

[0625]凝胶迁移分析(GEL SHIFT ASSAY)——将纯化的底物与重组sHASEGP 混合，以测试内切葡糖苷酶活性，该活性将使底物在凝胶中的迁移增加。硫酸软 骨素A，Aggrecan和D来自Calbiochem。透明质酸(人脐带)硫酸软骨素C、硫 酸皮肤素和硫酸肝素从Calbiochem获得。人脐带透明质酸从ICN获得。将每一受 测底物稀释至0.1mg/ml。将纯化的sHASEGP或来自表达sHASEGP的细胞的条件 培养基的10μl样品与90μl的受测底物在理想的缓冲液中混合，在37℃温育3小时。 温育之后，用样品缓冲液(Tris EDTA PH 8.0、溴酚蓝和甘油)中和样品，然后在15％ 聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将胶在含有0.5％阿尔新蓝的3％冰乙酸中染色过夜，然后 在7％冰乙酸中脱色，检测糖胺聚糖。通过比较在酶存在和不存在的情况下底物的 迁移，来确定降解情况。

[0626]b.结果

[0627]将含有100单位的HASEGPHIS6的10μl溶液与带有50μg/ml人血清白蛋白 的90μl 10mM Hepes缓冲液在37℃温育2小时，其中含有10μg的各种糖胺聚糖和 蛋白聚糖。电泳分析及随后的阿尔新蓝染色显示，硫酸软骨素A、C和D、Aggrecan 和透明质酸中的每一种都显示出增加的迁移变化，而硫酸肝素和硫酸软骨素B没 有显示出增加的迁移。未消化的糖胺聚糖的迁移在凝胶的中部是表现为成片的条 带(smear)，而消化的产物显示出，大部分的阿尔新蓝染色跑在染料的前端，少量 的物质是以增加的梯度在迁移。

[0628]实施例13金属离子对sHASEGP活化的影响

[0629]除了需要糖基化作用以获得最佳酶活性之外，发现人sHASEGP还用阳离 子激活以获得最佳的酶活性。在纯化的过程中，在连续的层析步骤之后，发现 sHASEGP具有低的比活性。当通过DEAE以及随后继续的Ni-IMAC纯化被纯化 至同质时，发现HIS6标记的sHASEGP具有非常低的比活性。因为IMAC树脂能 螯合金属离子，所以将各种金属加回到sHASEGP，以测定相对酶活性。

[0630]a.实验方案

[0631]纯化的sHASEGP在用0.1mM镍(Ni)、钴(Co)、锌(Zn)、钙(Ca)和镁(Mg)在 室温下温育2小时后，用微量滴定分析来测定透明质酸酶活性，从而对纯化的 sHASEGP进行测试。

[0632]b.结果   金属盐添加物   中性活性U/ml   无添加物   11.909   100uM Ni   6.0306   100uM Co   8.972   100uM Zn   3.7476   100uM Ca   101.9892

[0633]用0.1mM钙或0.1mM镁温育sHASEGP之后，发现透明质酸酶活性显著增 加。用其他金属温育之后，未见此种激活作用。基于A280的测量，向sHASEGP 加入钙将使酶的比活性增加至约97,000单位/mg蛋白。然后测试钙和镁金属的剂 量响应曲线，以确定酶的最佳金属离子浓度。   mM二价金属   [Ca++]   [Mg++]   100   1   1.3   10   108   104   1   169   164   0.1   123   78   0.01   59   18   0.001   47   13   0.0001   39   13   0.00001   55   15

[0634]发现sHASEGP的激活作用发生在微摩尔范围内。对钙和镁来说，大于 10mM的浓度都是抑制性的。为了排除针对底物而不是酶的非特异性激活作用，将 含有氯化钙的10mM Hepes缓冲液与固定化的生物素化的底物在微量滴定板上温 育，然后洗涤。当将酶加入到已洗涤过的用钙预温育的板上时，没有发现激活作 用。该激活作用还在用磷脂酶C释放的天然sHASEGP上进行了测试，其结果显 示出类似的钙激活作用，这排除了羧基末端HIS6表位标记可能带来的假结果。

[0635]实施例14

[0636]白蛋白对sHASEGP活性的影响

[0637]发现为了获得最佳活性，除了钙外，对重组rHUPH20和其他屠宰物睾丸来 源的透明质酸酶制剂的稀释还需要白蛋白。

[0638]a.实验方案

[0639]将人血清白蛋白(ICN)稀释入含有钙的10mM Hepes缓冲液中，以测定白蛋 白蛋白对酶活性的影响。使用1mMCaCl2和1mg/ml人血清白蛋白，对sHASEGP 和商业制剂进行酶分析。

[0640]b.结果

[0641]在存在白蛋白的条件下的高度稀释，发现了透明质酸酶活性的激活。至于 该激活作用是否是阻止了变性的结果，或者白蛋白是否影响了底物的可利用性， 尚不清楚。因此，人sHASEGP的优选试剂可以包括白蛋白和由钙或镁组成的金属 盐。

[0642]实施例15纯化的sHASEGP在体内的扩散活性

[0643]a.实验方案

[0644]将在10mM Hepes PH 7.4、150mM NaCl 0.1％Pluronic(普流尼克)中的纯 化的sHASEGP用含0.15M NaCl的无热原的水稀释至浓度为0.5U/ul。用盐水进行 一系列的稀释，最后的体积均为20μL，得到每一次注射量为总共0.01、0.05、0.1 单位的产物。加入20μL的台盼蓝溶液至最终体积为40μL，并皮下注射入balbNu/Nu 小鼠每一侧的侧面皮肤，这些小鼠之前已通过腹膜内注射被麻醉，例如给予氯胺 酮/甲苯噻嗪。用微测径器，从t＝0至t＝45分钟，在2维方向上测量染色面积。面 积用mm2表示。作为对照，缺少中性活性但为分泌型的重组人HYAL1被包括入 该实验。

[0645]b.结果   受测项目   面积@45分钟   A.盐水对照   51.5mm2   B.sHASEGP 0.01U   76.8mm2   C.sHASEGP 0.05U   98.22mm2   D.sHASEGP 0.10U   180.4mm2   E.HYAL1 100U   67.48mm2

[0646]实施例16 sHASEGP扩散活性的动力学

[0647]a.实验方案

[0648]将重组纯化的sHASEGPHis6分为2个等份试样。一份等份试样在带有加热 盖的热循环仪中加热至95℃共15分钟，另一等份试样保持在室温中。在微量滴定 分析中确认酶活性的热失活。为了进行动力学分析，热失活的和天然的材料被测 试。将4单位纯化的sHASEGP或等量热失活物质与台盼兰染料一同皮下注射。在 长至15分钟之内的各个时间点测量面积。

[0649]b.结果   4个单位  4个单位，热失活的   T注射后分钟  T注射后分钟   t0＝52.38  t0＝50.58   t3＝116.51  t3＝65.48   t6.5＝181.93  t6.5＝63.87   t10＝216.96  t10＝65.80   t16＝279.99  t16＝74.3

[0650]实施例17 sHASEGP分解的皮肤屏障的恢复

[0651]a.实验方案

[0652]为了确定在皮下给药后被sHASEGP打开的孔的再生时间，在t＝0时，将2 单位的纯化的sHASEGP或盐水对照经皮下注射入动物的两个相对的侧面位点，然 后在30分钟、60分钟和24小时时，在同样的位点注射台盼蓝。在注射后第15分 钟记录染料扩散的面积，并与对照相比较。

[0653]b.结果   2单位   盐水对照   T注射sHASEGP后小时   T注射sHASEGP后小时   t0.5h＝183   t0.5h＝54   t1hr＝167   t1hr＝50   t22hr＝61   t22hr＝48

[0654]该结果显示，皮肤屏障在给予2单位酶之后的24小时内重新形成。

[0655]实施例18 sHASEGP开启的通道大小的测定

[0656]已经显示，人sHASEGP在间质中打开了足以允许小分子例如台盼蓝染料 扩散通过的通道。然而，不知道在sHASEGP存在的情况下可以扩散的颗粒的尺寸 上限是多少。

[0657]a.实验方案

[0658]各种不同大小的荧光分子被用来测定由人sHASEGP打开的通道的大小。 以40μl的体积，在皮下注射入平均分子量为4,400和2,000,000Da的荧光葡聚糖 (Flouresceinated Dextrans，Sigma)以及具有20纳米至500纳米范围内的确定直径 的荧光标记珠(Molecular Probes)，然后在同样的位置注射sHASEGP或盐水对照。 在注射后15分钟，在二维方向上测量染料前线包括的面积。

[0659]b.结果   扩散试剂   扩散测试颗粒大小   15分钟时的面积   标准偏差   sHASEGP   4400Da   84.2   25.7   对照   4400Da   38.0   5.8   sHASEGP   2×10E6Da   141.2   4.5   对照   2×10E6Da   51.7   8.1   sHASEGP   20nm直径   92.3   20.6   对照   20nm直径   51.6   3.0   sHASEGP   100nm直径   61.0   5.7   对照   100nm直径   40.0   7.0   sHASEGP   200nm直径   35.5   1.6   对照   200nm直径   27.9   8.2   sHASEGP   500nm直径   44.8   13.6   对照   500nm直径   41.2   9.8

[0660]结果显示，给予sHASEGP之后，从约1kDa(台盼蓝)至直径50nm的分子(乳 胶珠)都显示出扩散增加。牛血清白蛋白(66kDa)显示出与台盼蓝相似的动力学，而 50nm乳胶珠则需要更多的时间来扩散。500nm珠直到480分钟时也没有显示出扩 散。

[0661]实施例19与人SHASEGP皮下共注射之后生物素化抗体的血清药物动力学 特性

[0662]a.实验方案

[0663]雌性Balb/c小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉。然后小鼠用与20μl盐水 或20μL含有4单位活性的sHASEGP相混合的20μL 0.5mg/ml的生物素化鼠IgG 进行皮下注射。

[0664]b.结果 注射后时间   对照   sHASEGP(4U) 血清IgGt＝0小时   0ng/ml   0ng/ml 血清IgGt＝2小时   0ng/ml   360ng/ml 血清IgGt＝51小时   4152ng/ml   4176ng/ml

[0665]结果证明，sHASEGP增加了大分子在循环中的血清分布动力学。在2小时 时，对照组中没有检测到生物素化的IgG，而在sHASEGP组中，在2小时时，明 显地检测到360ng/ml的浓度。

[0666]实施例20在静脉内注射人sHASEGP之后，皮下注射的分子的扩增活性

[0667]a.实验方案

[0668]对于每种剂量的受测物质和载剂对照，四个位点被利用来进行染料注射。 染料注射在静脉注射的45分钟后进行。每种剂量的受测物质或对照物质被静脉注 射入2只动物。对于每种剂量或载体对照，在酶给药45分钟之后进行染料注射， 在2.5、5、10和15分钟计算测定的染料前沿面积。

[0669]b.结果

[0670]结果显示，在静脉内给药后，高度纯化的sHASEGP是可全身性地获得的， 直至末梢组织。全身性地给予的sHASEGP的扩散活性是剂量依赖性的，10单位 的注射不能与载剂对照辨别开来。   类型   剂量Ⅳ   时间分钟   平均面积(mm2)   SD   PH20   PH20   PH20   PH20   1000   1000   1000   1000   2.5   5   10   15   86.417   102.17   124.53   129.81   2.834193   2.221146   6.304944   1.434319   PH20   PH20   PH20   PH20   300   300   300   300   2.5   5   10   15   59.137   73.638   87.092   92.337   7.218615   7.51197   8.686008   10.66466   PH20   PH20   PH20   PH20   100   100   100   100   2.5   5   10   15   56.308   63.156   76.519   77.432   7.741934   11.42052   16.18449   17.32264   PH20   PH20   PH20   PH20   30   30   30   30   2.5   5   10   15   50.534   59.493   68.102   71.118   10.64287   5.163971   11.00071   9.934212   PH20   PH20   PH20   PH20   10   10   10   10   2.5   5   10   15   36.4   39.859   45.649   48.41   3.807072   6.680932   4.44936   6.546835   对照   对照   对照   对照   0   0   0   0   2.5   5   10   15   34.652   36.279   44.687   53.002   5.935037   3.614544   5.821216   2.812439相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求在35 U.S.C.§119(e)下，于2003年3月5日提交的美国申请序列 号60/452,360的优先权，其内容整体地引入本文以作参考。                                   序列表
                                   序列表
<110>海洋酶公司(Halozyme，Inc.)
     A·昆度(Kundu，Anirban)
     L·布宾枫(Bookbinder，Louis)
     G·I·弗罗斯特(Frost，Gregory I.)
<120>可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、
     制备它们的方法、它们的用途和包含它们的药物组合物
<130>DELIA1340CN
<150>PCT/US2004/006656
<151>2004-03-05
<150>US 60/452,360
<151>2003-03-05
<160>53
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>509
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>82，166，235，254，368，393，490
<400>1
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Ash Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly GLy Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Va1 Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val
                485                 490                 495
Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
            500                 505
<2l0>2
<211>35
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr
        35
<210>3
<211>474
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>3
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp
 1               5                  10                  15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro
            20                  25                  30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala
        35                  40                  45
Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr
    50                  55                  60
Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp
            100                 105                 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val
        115                 120                 125
Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg
                165                 170                 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His
            180                 185                 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile
        195                 200                 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu
    210                 215                 220
Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile
                245                 250                 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val
            260                 265                 270
Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr
        275                 280                 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp
    290                 295                 300
Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu
                325                 330                 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys
            340                 345                 350
Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp
        355                 360                 365
Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly
    370                 375                 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys
385                 390                 395                 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp
                405                 410                 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala
            420                 425                 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn
        435                 440                 445
Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu
    450                 455                 460
Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
465                 470
<210>4
<211>448
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>4
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp
 1               5                  10                  15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro
            20                  25                  30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala
        35                  40                  45
Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr
    50                  55                  60
Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp
            100                 105                 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val
        115                 120                 125
Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg
                165                 170                 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His
            180                 185                 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile
        195                 200                 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu
    210                 215                 220
Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile
                245                 250                 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val
            260                 265                 270
Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr
        275                 280                 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp
    290                 295                 300
Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu
                325                 330                 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys
            340                 345                 350
Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp
        355                 360                 365
Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly
    370                 375                 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys
385                 390                 395                 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp
                405                 410                 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala
            420                 425                 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn
        435                 440                 445
<210>5
<211>482
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>5
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Mer Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
Phe Tyr
<210>6
<211>1530
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1530)
<223>PH-20 GPI锚定透明质酸酶糖蛋白
<400>6
atg gga gtg cta aaa ttc aag cac atc ttt ttc aga agc ttt gtt aaa   48
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                   10                  15
tca agt gga gta tcc cag ata gtt ttc acc ttc ctt ctg att cca tgt   96
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
             20                  25                  30
tgc ttg act ctg aat ttc aga gca cct cct gtt att cca aat gtg cct   144
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
         35                  40                  45
ttc ctc tgg gcc tgg aat gcc cca agt gaa ttt tgt ctt gga aaa ttt   192
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
     50                  55                  60
gat gag cca cta gat atg agc ctc ttc tct ttc ata gga agc ccc cga   240
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
 65                  70                  75                  80
ata aac gcc acc ggg caa ggr gtt aca ata ttt tat gtt gat aga ctt   288
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                 85                  90                  95
ggc tac tat cct tac ata gat tca atc aca gga gta act gtg aat gga   336
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
gga atc ccc cag aag att tcc tta caa gac cat ctg gac aaa gct aag   384
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
aaa gac att aca ttt tat atg cca gta gac aat ttg gga atg gct gtt   432
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
att gac tgg gaa gaa tgg aga ccc act tgg gca aga aac tgg aaa cct   480
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
aaa gat gtt tac aag aat agg tct att gaa ttg gtt cag caa caa aat   528
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
gta caa ctt agt ctc aca gag gcc act gag aaa gca aaa caa gaa ttt   576
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
gaa aag gca ggg aag gat ttc ctg gta gag act ata aaa ttg gga aaa   624
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
tta ctt cgg cca aat cac ttg tgg ggt tat tat ctt ttt ccg gat tgt   672
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
tac aac cat cac tat aag aaa ccc ggt tac aat gga agt tgc ttc aat    720
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn G1y Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
gta gaa ata aaa aga aat gat gat ctc agc tgg ttg tgg aat gaa agc    768
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
act gct ctt tac cca tcc att tat ttg aac act cag cag tct cct gta    816
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
gct gct aca ctc tat gtg cgc aat cga gtt cgg gaa gcc atc aga gtt    864
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
tcc aaa ata cct gat gca aaa agt cca ctt ccg gtt ttt gca tat acc    912
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
cgc ata gtt ttt act gat caa gtt ttg aaa ttc ctt tct caa gat gaa    960
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
ctt gtg tat aca ttt ggc gaa act gtt gct ctg ggt gct tct gga att    1008
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
gta ata tgg gga acc ctc agt ata atg cga agt atg aaa tct tgc ttg    1056
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
ctc cta gac aat tac atg gag act ata ctg aat cct tac ata atc aac    1104
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
gtc aca cta gca gcc aaa atg tgt agc caa gtg ctt tgc cag gag caa    1152
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
gga gtg tgt ata agg aaa aac tgg aat tca agt gac tat ctt cac ctc    1200
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
aac cca gat aat ttt gct att caa ctt gag aaa ggt gga aag ttc aca    1248
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
gta cgt gga aaa ccg aca ctt gaa gac ctg gag caa ttt tct gaa aaa    1296
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
ttt tat tgc agc tgt tat agc acc ttg agt tgt aag gag aaa gct gat    1344
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
gta aaa gac act gat gct gtt gat gtg tgt att gct gat ggt gtc tgt    1392
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
ata gat gct ttt cta aaa cct ccc atg gag aca gaa gaa cct caa att    1440
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
ttc tac aat gct tca ccc tcc aca cta tct gcc aca atg ttc att gtt    1488
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val
                485                 490                 495
agt att ttg ttt ctt atc att tct tct gta gcg agt ttg taa            1530
Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu  *
            500                 505
<210>7
<211>509
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>82，166，235，254，368，393，490
<400>7
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val
                485                 490                 495
Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
            500                 505
<210>8
<211>34
<212>DNA
<212>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少N483并以Y482作为结束，5’端有BamHI位点
<400>8
aattggatcc tcagtagaaa atttgaggtt cttc                                34
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少Y482并以F481作为结束，5’端有BamHI位点
<400>9
aattggatcc tcagaaaatt tgaggttctt ctg                                 33
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少F481并以I480作为结束，5’端有BamHI位点
<400>10
aattggatcc tcaaatttga ggttcttctg tctc                                34
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少I480并以Q479作为结束，5’端有BamHI位点
<400>11
aattggatcc tcattgaggt tcttctgtct cc                                  32
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少Q479并以P478作为结束，5’端有BamHI位点
<400>12
aattggatcc tcaaggttct tctgtctcca tg                                  32
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少P478并以E477作为结束，5’端有BamHI位点
<400>13
aattggatcc tcattcttct gtctccatgg g                                   31
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，5’端带有NheI限制性位点
<400>14
aattgctagc atgggagtgc taaaattcaa gc                                  32
<210>15
<211>1473
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1473)
<223>sHASEGP，直至P478，带His标签
<400>15
atg gga gtg cta aaa ttc aag cac atc ttt ttc aga agc ttt gtt aaa   48
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                   10                  15
tca agt gga gta tcc cag ata gtt ttc acc ttc ctt ctg att cca tgt   96
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
             20                  25                  30
tgc ttg act ctg aat ttc aga gca cct cct gtt att cca aat gtg cct   144
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
         35                  40                  45
ttc ctc tgg gcc tgg aat gcc cca agt gaa ttt tgt ctt gga aaa ttt   192
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
     50                  55                  60
gat gag cca cta gat atg agc ctc ttc tct ttc ata gga agc ccc cga   240
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
 65                  70                  75                  80
ata aac gcc acc ggg caa ggt gtt aca ata ttt tat gtt gat aga ctt   288
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                 85                  90                  95
ggc tac tat cct tac ata gat tca atc aca gga gta act gtg aat gga   336
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
gga atc ccc cag aag att tcc tta caa gac cat ctg gac aaa gct aag   384
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
aaa gac att aca ttt tat atg cca gta gac aat ttg gga atg gct gtt   432
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
att gac tgg gaa gaa tgg aga ccc act tgg gca aga aac tgg aaa cct   480
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
aaa gat gtt tac aag aat agg tct att gaa ttg gtt cag caa caa aat   528
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
gta caa ctt agt ctc aca gag gcc act gag aaa gca aaa caa gaa ttt   576
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
gaa aag gca ggg aag gat ttc ctg gta gag act ata aaa ttg gga aaa   624
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
tta ctt cgg cca aat cac ttg tgg ggt tat tat ctt ttt ccg gat tgt   672
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
tac aac cat cac tat aag aaa ccc ggt tac aat gga agt tgc ttc aat   720
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
gta gaa ata aaa aga aat gat gat ctc agc tgg ttg tgg aat gaa agc   768
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
act gct ctt tac cca tcc att tat ttg aac act cag cag tct cct gta   816
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
gct gct aca ctc tat gtg cgc aat cga gtt cgg gaa gcc atc aga gtt   864
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
tcc aaa ata cct gat gca aaa agt cca ctt ccg gtt ttt gca tat acc   912
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
cgc ata gtt ttt act gat caa gtt ttg aaa ttc ctt tct caa gat gaa   960
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
ctt gtg tat aca ttt ggc gaa act gtt gct ctg ggt gct tct gga att   1008
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
gta ata tgg gga acc ctc agt ata atg cga agt atg aaa tct tgc ttg   1056
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
ctc cta gac aat tac atg gag act ata ctg aat cct tac ata atc aac   1104
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
gtc aca cta gca gcc aaa atg tgt agc caa gtg ctt tgc cag gag caa   1152
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
gga gtg tgt ata agg aaa aac tgg aat tca agt gac tat ctt cac ctc   1200
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
aac cca gat aat ttt gct att caa ctt gag aaa ggt gga aag ttc aca   1248
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
gta cgt gga aaa ccg aca ctt gaa gac ctg gag caa ttt tct gaa aaa   1296
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
ttt tat tgc agc tgt tat agc acc ttg agt tgt aag gag aaa gct gat   1344
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
gta aaa gac act gat gct gtt gat gtg tgt att gct gat ggt gtc tgt   1392
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
ata gat gct ttt cta aaa cct ccc atg gag aca gaa gaa cct gga tcc   1440
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gly Ser
465                 470                 475                 480
ggt tct ggt gct cac cat cac cat cac cat taa                       1473
Gly Ser Gly Ala His His His His His His  *
                485                 490
<210>16
<211>490
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>16
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gly Ser
465                 470                 475                 480
Gly Ser Gly Ala His His His His His His
                485                 490
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>间隔子His，正向引物
<400>17
ataattggat ccggttctgg tgctcaccat caccatcac                         39
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>间隔子His，反向引物
<400>18
tataattgcg gccgcctaat ggtgatggtg atggtgag                          38
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以N483结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>19
aatggatcca ttgtagaaaa tttgaggttc                                   30
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以Y482结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>20
aatggatccg tagaaaattt gaggttcttc                                   30
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以F481结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>21
aattggatcc gaaaatttga ggttcttctg                                   30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以1480结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>22
attggatcca atttgaggtt cttctgtctc                                   30
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以Q479结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>23
aattggatcc ttgaggttct tctgtctcc                                    29
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以P478结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>24
aattggatcc aggttcttct gtctccatg                                    29
<210>25
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以E477结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>25
aattggatcc ttcttctgtc tccatggg                                     28
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以A467结束的sHASEGP删除突变体
<400>26
aattggatcc ctaagcatct atacagacac catcag                            36
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以A447结束的sHASEGP删除突变体
<400>27
aattggatcc ctaagctttc tccttacaac tcaag                             35
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以S430结束的sHASEGP删除突变体
<400>28
aattggatcc ctaagaaaat tgctccaggt cttc                              34
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以G413结束的sHASEGP删除突变体
<400>29
aattggatcc ctatccacct ttctcaagtt gaatag                            36
<210>30
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以S394结束的sHASEGP删除突变体
<400>30
aattggatcc ctatgaattc cagtttttcc ttatac                            36
<210>31
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以A372结束的sHASEGP删除突变体
<400>31
aattggatcc ctatgctagt gtgacgttga ttatg                             35
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以S347结束的sHASEGP删除突变体
<400>32
aattggatcc ctaacttcgc attatactga ggg                               33
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LN正向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，
     L36作为kappa前导序列之后的第一个sHASEGP氨基酸
<400>33
ctgaatttca gagcacctcc tgttattcc                                    29
<210>34
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FR正向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，
     F38作为kappa前导序列之后的第一个sHASEGP氨基酸
<400>34
ttcagagcac ctcctgttat tccaaatg                                     28
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Asp反向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，
     Asp作为最后一个Kappa前导序列氨基酸，其在PH-20的L36或F38之前
<400>35
gtcaccagtg gaacctggaa ccc                                          23
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gly反向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，
     Gly作为最后一个Kappa前导序列氨基酸，其在PH-20的L36或F38之前
<400>36
accagtggaa cctggaaccc agag                                         24
<210>37
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，其用于kappa前导序列的第一片段
<400>37
gagacagaca cactcctgct atgggtactg                                   30
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，其用于kappa前导序列的第一片段
<400>38
cccagagcag cagtacccat agcaggagtg                                   30
<210>39
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，其用于kappa前导序列的第二片段
<400>39
ggtactgctg ctctgggttc caggttccac                                   30
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，其用于kappa前导序列的第二片段
<400>40
gcgtcaccag tggaacctgg aacccag                                      27
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Nhe正向引物，用于kappa前导序列
<400>41
attgctagca tggagacaga cacactcctg                                   30
<210>42
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EcoR1反向引物，用于kappa前导序列
<400>42
aattgaattc gtcaccagtg gaacctgg                                     28
<210>43
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠IgK-链前导序列
<400>43
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp
            20
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>K-前导序列SPE1正向引物
<400>44
actcactagt gctagcatgg agacagacac                                   30
<210>45
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>K-前导序列MLU1反向引物
<400>45
aattacgcgt gaattcgtca ccagtggaac                                   30
<210>46
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Kappa前导序列与sHASEGP的融合蛋白，F38
     作为推定的成熟分泌sHASEGP的第一个氨基酸(直至P478)
<400>46
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
            20                  25                  30
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
        35                  40                  45
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
    50                  55                  60
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
                85                  90                  95
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
            100                 105                 110
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
        115                 120                 125
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
    130                 135                 140
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
145                 150                 155                 160
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
                165                 170                 175
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
            180                 185                 190
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
    210                 215                 220
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
225                 230                 235                 240
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
                245                 250                 255
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
            260                 265                 270
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
        275                 280                 285
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
    290                 295                 300
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
305                 310                 315                 320
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
                325                 330                 335
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
            340                 345                 350
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
        355                 360                 365
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
    370                 375                 380
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
385                 390                 395                 400
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
                405                 410                 415
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
            420                 425                 430
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
        435                 440                 445
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro
    450                 455                 460
<210>47
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3’引物BAM反向sHASEGP带有GPI锚，直至L509，包括终止密码子
<400>47
aattggatcc ctacagaaga aatgataaga aacaaaatac                          40
<210>48
<211>1449
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>48
atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta   60
tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca   120
cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt   180
cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga   240
ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct   300
tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta   360
caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg   420
ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct   480
aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt   540
ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg   600
gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt   660
tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat   720
gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac   780
ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat   840
cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt   900
tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa   960
cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga   1020
accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact   1080
atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt   1140
tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc   1200
aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa   1260
ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc   1320
ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct   1380
gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt   1440
ttctactaa                                                           1449
<210>49
<211>467
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>49
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala
465
<210>50
<211>1536
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>50
atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta   60
tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca   120
cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt   180
cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga   240
ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct   300
tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta   360
caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg   420
ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct   480
aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt   540
ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg   600
gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt   660
tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat   720
gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac   780
ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat   840
cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt   900
tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa   960
cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga   1020
accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact   1080
atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt   1140
tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc   1200
aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa   1260
ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc   1320
ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct   1380
gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt   1440
ttctacaatg cttcaccctc cacactatct gccacaatgt tcatttggag gctggaagtc   1500
tgggatcaag gtattagcag aattggtttc ttctga                             1536
<210>51
<211>6630
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>HZ24质粒载体
<400>51
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta   60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc   120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg   180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc     240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat     300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc     360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga     420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg     480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac     540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt     600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc     660
cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc     720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat     780
tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc     840
gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa     900
actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac     960
tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta    1020
aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca    1080
catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct    1140
tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc    1200
tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact    1260
agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt    1320
tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt    1380
aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa    1440
gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga    1500
agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc    1560
tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc    1620
aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa    1680
attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca    1740
ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga    1800
tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca    1860
gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt    1920
ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt    1980
tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac    2040
tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat    2100
gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa    2160
cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat    2220
aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca    2280
acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca    2340
attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga    2400
tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt    2460
tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa    2520
cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg    2580
tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc    2640
cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa    2700
ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga    2760
caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc    2820
ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc    2880
cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac    2940
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg    3000
tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac    3060
ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg    3120
ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg    3180
gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa    3240
tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct    3300
ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta    3360
gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct    3420
taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag    3480
gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa    3540
ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata    3600
aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt    3660
ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg    3720
gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag    3780
aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac    3840
cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt    3900
tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat    3960
cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca    4020
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt    4080
gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc    4140
gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg    4200
gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat    4260
tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg    4320
ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct    4380
atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa    4440
aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt    4500
tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca    4560
ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac    4620
ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga    4680
ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac    4740
gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt    4800
agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct    4860
aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat    4920
attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg    4980
cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg    5040
aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc    5100
ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat    5160
gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact    5220
attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca    5280
tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact    5340
tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg    5400
atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg    5460
agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg    5520
aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg    5580
caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag    5640
ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc    5700
gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga    5760
tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat    5820
atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc    5880
tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag    5940
accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct    6000
gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac    6060
caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc    6120
tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg    6180
ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt    6240
tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt    6300
gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc    6360
tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca    6420
gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata    6480
gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg    6540
ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct    6600
ggccttttgc tcacatggct cgacagatct                                     6630
<210>52
<211>2009
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>52
atgtggctca cataaattca gaaagtatga tagcagtgta ggtggttagc agcacctcat      60
aaggtccttc ctagcaaggc aaagggatgc taatgactag ccaatgctct aggaagacat     120
tgagaccagc caacttcttg ccttgataac tactgaagag acattgggtg gctggatttt     180
gaaagcagac ttctggttat aggtgatgca acttgaaaaa caatcctgaa acatgaaaca     240
agaataataa tatttaaatg taacttaatc attatacctc tttatccatc aaagtgaatt     300
cattccattc cctttcatct gtgctcatac tttgcatcag atattgggta aaccaaagtg     360
tgtaggaaga aataaatgtt ttcatagtca ttactcttta caatgggagt gctaaaattc     420
aagcacatct ttttcagaag ctttgttaaa tcaagtggag tatcccagat agttttcacc     480
ttccttctga ttccatgttg cttgactctg aatttcagag cacctcctgt tattccaaat     540
gtgcctttcc tctgggcctg gaatgcccca agtgaatttt gtcttggaaa atttgatgag     600
ccactagata tgagcctctt ctctttcata ggaagccccc gaataaacgc caccgggcaa     660
ggtgttacaa tattttatgt tgatagactt ggctactatc cttacataga ttcaatcaca     720
ggagtaactg tgaatggagg aatcccccag aagatttcct tacaagacca tctggacaaa     780
gctaagaaag acattacatt ttatatgcca gtagacaatt tgggaatggc tgttattgac     840
tgggaagaat ggagacccac ttgggcaaga aactggaaac ctaaagatgt ttacaagaat     900
aggtctattg aattggttca gcaacaaaat gtacaactta gtctcacaga ggccactgag     960
aaagcaaaac aagaatttga aaaggcaggg aaggatttcc tggtagagac tataaaattg    1020
ggaaaattac ttcggccaaa tcacttgtgg ggttattatc tttttccgga ttgttacaac    1080
catcactata agaaacccgg ttacaatgga agttgcttca atgtagaaat aaaaagaaat    1140
gatgatctca gctggttgtg gaatgaaagc actgctcttt acccatccat ttatttgaac    1200
actcagcagt ctcctgtagc tgctacactc tatgtgcgca atcgagttcg ggaagccatc    1260
agagtttcca aaatacctga tgcaaaaagt ccacttccgg tttttgcata tacccgcata    1320
gtttttactg atcaagtttt gaaattcctt tctcaagatg aacttgtgta tacatttggc    1380
gaaactgttg ctctgggtgc ttctggaatt gtaatatggg gaaccctcag tataatgcga    1440
agtatgaaat cttgcttgct cctagacaat tacatggaga ctatactgaa tccttacata    1500
atcaacgtca cactagcagc caaaatgtgt agccaagtgc tttgccagga gcaaggagtg    1560
tgtataagga aaaactggaa ttcaagtgac tatcttcacc tcaacccaga taattttgct    1620
attcaacttg agaaaggtgg aaagttcaca gtacgtggaa aaccgacact tgaagacctg    1680
gagcaatttt ctgaaaaatt ttattgcagc tgttatagca ccttgagttg taaggagaaa    1740
gctgatgtaa aagacactga tgctgttgat gtgtgtattg ctgatggtgt ctgtatagat    1800
gcttttctaa aacctcccat ggagacagaa gaacctcaaa ttttctacaa tgcttcaccc    1860
tccacactat ctgccacaat gttcattgtt agtattttgt ttcttatcat ttcttctgta    1920
gcgagtttgt aattgcgcag gttagctgaa atgaacaata tgtccatctt aaagtgtgct    1980
ttttcgacta attaaatctt tgaaaagaa                                      2009
<210>53
<211>2395
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>53
atgtggctca cataaattca gaaagtatga tagcagtgta ggtggttagc agcacctcat      60
aaggtccttc ctagcaaggg atgctaatga ctagccaatg ctctaggaag acattgagac     120
cagccaactt cttgccttga taactactga agagacattg ggtggctgga ttttgaaagc     180
agacttctgg ttataggtga tgcaacttga aaaacaatcc tgaaacatga aacaagaata     240
ataatattta aatgtaactt aatcattata cctctttatc catcaaagtg aattcattcc     300
attccctttc atctgtgctc atactttgca tcagatattg ggtaaaccaa agtgtgtagg     360
aagaaataaa tgttttcata gtcattactc tttacaatgg gagtgctaaa attcaagcac     420
atctttttca gaagctttgt taaatcaagt ggagtatccc agatagtttt caccttcctt     480
ctgattccat gttgcttgac tctgaatttc agagcacctc ctgttattcc aaatgtgcct     540
ttcctctggg cctggaatgc cccaagtgaa ttttgtcttg gaaaatttga tgagccacta     600
gatatgagcc tcttctcttt cataggaagc ccccgaataa acgccaccgg gcaaggtgtt     660
acaatatttt atgttgatag acttggctac tatccttaca tagattcaat cacaggagta     720
actgtgaatg gaggaatccc ccagaagatt tccttacaag accatctgga caaagctaag     780
aaagacatta cattttatat gccagtagac aatttgggaa tggctgttat tgactgggaa     840
gaatggagac ccacttgggc aagaaactgg aaacctaaag atgtttacaa gaataggtct     900
attgaattgg ttcagcaaca aaatgtacaa cttagtctca cagaggccac tgagaaagca     960
aaacaagaat ttgaaaaggc agggaaggat ttcctggtag agactataaa attgggaaaa    1020
ttacttcggc caaatcactt gtggggttat tatctttttc cggattgtta caaccatcac    1080
tataagaaac ccggttacaa tggaagttgc ttcaatgtag aaataaaaag aaatgatgat    1140
ctcagctggt tgtggaatga aagcactgct ctttacccat ccatttattt gaacactcag    1200
cagtctcctg tagctgctac actctatgtg cgcaatcgag ttcgggaagc catcagagtt    1260
tccaaaatac ctgatgcaaa aagtccactt ccggtttttg catatacccg catagttttt    1320
actgatcaag ttttgaaatt cctttctcaa gatgaacttg tgtatacatt tggcgaaact    1380
gttgctctgg gtgcttctgg aattgtaata tggggaaccc tcagtataat gcgaagtatg    1440
aaatcttgct tgctcctaga caattacatg gagactatac tgaatcctta cataatcaac    1500
gtcacactag cagccaaaat gtgtagccaa gtgctttgcc aggagcaagg agtgtgtata    1560
aggaaaaact ggaattcaag tgactatctt cacctcaacc cagataattt tgctattcaa    1620
cttgagaaag gtggaaagtt cacagtacgt ggaaaaccga cacttgaaga cctggagcaa    1680
ttttctgaaa aattttattg cagctgttat agcaccttga gttgtaagga gaaagctgat    1740
gtaaaagaca ctgatgctgt tgatgtgtgt attgctgatg gtgtctgtat agatgctttt    1800
ctaaaacctc ccatggagac agaagaacct caaattttct acaatgcttc accctccaca    1860
ctatctgcca caatgttcat ttggaggctg gaagtctggg atcaaggtat tagcagaatt    1920
ggtttcttct gagagtcatg agggaaaaat gtgtttcagg cctcttccct tggcttacag    1980
gaaatgaaaa aaccatgact atcatcacca acatccttgg gtattaagtg cagtcactct    2040
cctagatgct gtggggagaa ggcaagttac aaagatagac cttccctcaa gataatcaga    2100
ttttcatggt attatcctta acctttttga catcatggag gctttgggaa tctgatgaag    2160
cctatcaatt ttcttccaga agatatttat ataagattat aagaaaaatt atgtacacag    2220
cttattttat tgcattggat caaaatgcca tttataaaga attatgcctt ttccatcaat    2280
tttagcatgg aaaaataatt tcaggcaata tgcttaaaaa ttgggggaag acaaaagaaa    2340
tccatatcgt gtaaataaaa ataaattttg gttttgctca aaaaaaaaaa aaaaa         2395