具有冰结合活性的多肽
阅读：1023发布：2020-10-08
专利汇可以提供具有冰结合活性的多肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种具有 冰 结合性能的新型多肽，其导致冰晶体形成和/或生长减小或抑制活性。本发明还涉及一种含有该新型多肽的食用产品和固体载体。此外，本发明还涉及生产该新型多肽的方法，以及该新型多肽的各种用途。，下面是具有冰结合活性的多肽专利的具体信息内容。
1.一种分离的多肽，包含一氨基酸残基序列或者由一氨基酸残基序列组成，所述氨基酸残基序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，其中所述多肽能够减少或抑制冰晶体的形成和/或生长。
2.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：1。
3.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：2。
4.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：3。
5.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：4。
6.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：5。
7.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：6。
8.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：7。
9.权利要求1的多肽，其中所述序列为SEQ ID NO：8。
10.一种分离的多核苷酸，含有编码权利要求1至9任一项的多肽的核苷酸序列。
11.权利要求10的多核苷酸，进一步含有表达信号，该表达信号能够引导编码权利要求1至9任一项的多肽的核苷酸序列在适宜宿主细胞中的表达。
12.含有权利要求10和11任一项的多核苷酸的载体。
13.一种分离的重组细胞，含有权利要求10和11任一项的多核苷酸或权利要求12的载体或权利要求1至9任一项的多肽。
14.一种食用产品，含有权利要求1至9任一项的多肽。
15.如权利要求14的食用产品，其中所述食用产品是冷冻的。
16.如权利要求14的食用产品，其中所述食用产品是冷冻的甜食类产品。
17.如权利要求14的食用产品，其中所述食用产品是冰淇淋产品或面包。
18.一种固体载体材料，含有权利要求1至9任一项的多肽。
19.一种生产权利要求1至9任一项的多肽的方法，所述方法包括步骤：
i)提供权利要求10和11任一项的多核苷酸或权利要求12的载体；
ii)通过步骤i)提供的多核苷酸的重组表达，提供适于生产权利要求1至9任一项的多肽的宿主细胞；
iii)生产权利要求1至9任一项的多肽，以及可选地
iv)纯化和/或分离所述多肽。
20.一种原位生产权利要求1至9任一项的多肽的方法，所述方法包括步骤：
i)提供可发酵的起始原料，
ii)提供一种微生物，该微生物能够发酵所述可发酵的起始原料，并且当发酵所述可发酵的起始原料时，能够在适宜的条件下产生权利要求1至9任一项的多肽，
iii)在所述微生物存在下，发酵所述食品起始原料，由此生产发酵的食用产品，
其中所述发酵的食用产品含有权利要求1至9任一项的多肽。
21.一种减少或抑制冷冻食用产品中冰晶体形成的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻食用产品，或其生产所需的一种或多种成分，和
ii)根据具体情况，在所述产品生产之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与权利要求1至9任一项的多肽接触，
由此减少或抑制冷冻食用产品中的冰晶体形成。
22.一种减少或抑制冷冻食用产品中冰晶体生长的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻食用产品，或其生产所需的一种或多种成分，和
ii)根据具体情况，在所述产品生产之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与权利要求1至9任一项的多肽接触，
由此减少或抑制冷冻食用产品中的冰晶体生长。
23.一种在冷冻食用产品中构造冰晶体的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻食用产品，或其生产所需的一种或多种成分，和
ii)根据具体情况，在所述产品生产之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与权利要求1至9任一项的多肽接触，
由此在冷冻食用产品中构造冰晶体。
24.一种调整冷冻食用产品的质地或感官品质的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻食用产品，或其生产所需的一种或多种成分，和
ii)根据具体情况，在所述产品生产之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与权利要求1至9任一项的多肽接触，
由此调整冷冻食用产品的质地或感官品质。
25.一种监测冷冻食用产品的生产或储存期间的冰晶体形成的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻食用产品，或其生产所需的一种或多种成分，和
ii)根据具体情况，在所述产品生产之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与权利要求1至9任一项的多肽接触，
iii)在所述冷冻食用产品的生产或储存期间，在不同时间点监测冰晶体形成。
26.一种在雌性个体中进行体外受精处理的方法，所述方法包括步骤：
i)从雌性个体中移取一个或多个卵细胞，可选地，与含有卵泡液的生物样本一起移取；
ii)在权利要求1至9任一项的多肽存在下，冷冻所述一个或多个卵细胞，可选的是与所述生物样本一起冷冻；
iii)使所述一个或多个移取的卵细胞在体外受精；和
iv)将所述一个或多个受精的卵细胞植入所述雌性个体内。
27.一种增强雌性个体的怀孕可能性或几率的方法，所述方法包括步骤：
ii)从雌性个体中移取一个或多个卵细胞，可选的是与含有卵泡液的生物样本一起移取；
iii)在权利要求1至9任一项的多肽存在下，冷冻所述一个或多个卵细胞，可选的是与所述生物样本一起冷冻；
iv)使所述一个或多个移取的卵细胞在体外受精；和
v)将所述一个或多个受精的卵细胞植入所述雌性个体内，
其中在权利要求1至9任一项的多肽存在下，冷冻所述一个或多个卵细胞增加怀孕的可能性或几率。
28.如权利要求26和27任一项的方法，其中所述样本进一步包含颗粒黄体细胞或卵泡细胞，并且可选地还有从所述雌性个体的卵腺体移取的其他卵巢细胞。
29.如权利要求28的方法，其中所述样本进一步包含来自卵细胞环境的冷冻细胞。
技术领域
本发明涉及一种具有冰结合能力的新型多肽，其产生减少或抑制冰晶体形成和/或生长的活性。本发明还公开了这种多肽的生产和应用方法。
背景技术
生活在极地水中的海洋真骨鱼类的体温与周围海洋的温度是平衡的，因此冬季或者比如在南极水中，其全年都处于接近-1.8℃的温度。海洋真骨鱼类的血液对海水是低渗透性的，其融点预计约为-0.7℃。因此极地真骨鱼类过冷，并且在不适应这种严酷的气候条件的情况下，致命的冻结也在预料之中。
类似的观察报告也适用于各种适应寒冷的陆生生物，包括节肢动物、植物、真菌和细菌，不过这些生物中许多都能经受比海洋鱼类低得多的温度。
嗜冷(喜冷)生物已成功地适应地球上所有永久性寒冷地区：可以在深海、冰山顶以及甚至温度低到-60℃的极低区发现它们。尽管有这些致命的条件，但这些生物克服了永久性寒冷环境固有的关键障碍。这些障碍包括：酶活性降低，膜流动性减小，营养素和废物的运输改变，转录、翻译和细胞分化的速率减小，多肽冷变性，不恰当的多肽折叠和细胞内的冰形成。
对某些生物在零下温度下的生存机制的研究显示，它们依赖于至少两种策略：通过抑制冰生长或通过产生受控制的冰晶体形成来降低水的冰点(依数性地通过低分子量物质的合成和非依数性地通过特有多肽的合成)。人们认为，抗冻多肽(AFP)和低分子量物质，如多元醇、游离氨基酸和糖负责前面的过程，而冰核多肽(INP)负责后者。
抗冻多肽(AFP，在一些出版物上也被称作热滞后多肽THP，或冰结构多肽ISP)大大降低溶液的冰点，而预测的融点仅适度地降低。这意味着虽然冰点显著降低，但溶液的融点可通过依数性的融点降低来预测，对于存在冰的溶液来说确实如此。关于抗冻多肽是否能够降低无冰溶液的过冷点，这一问题很大程度上未得到解决。
冻结温度的偏移是有限的，并且快速的冰生长将在足够低的温度下发生。融化和冻结温度的分隔通常称作热滞后(TH)(Knight et al.1991，Raymond and DeVries 1977，Wilson 1993)，冰生长的温度称作滞后冰点。融点和滞后冰点之间的差异称作滞后作用或抗冻活性。AFP的第二个功能是处于冻结状态时，它们显示冰再结晶抑制作用(RI)。AFP在高于再结晶温度的温度下以小晶体作为代价抑制大晶体的形成(Knight et al.1984，1995，Knight and Duman 1986，et al.1996)。
抑制冰形成的机制
抗冻多肽抑制冰生长的机制仍然在调查研究中。AFP似乎都是两性分子。这意味着它们分子的一部分比其余部分更具疏水性。迄今为止，对于它们活性的解释是它们亲水性的一侧与冰晶体结合。然而，这一观点在过去十年已受到挑战，因为当观察冰/水时，人们会有充分的理由问：根据定义哪个是最亲水的-冰还是水。AFP经由它们的疏水性一侧/区域与水结合的多种证据正在显现出来，但就目前所有证据来看，确切的结合机制仍是未知的。
然而，最终在这点上的一致意见是，根据抗冻多肽的类型(以及同工型)，抗冻多肽识别并结合多种冰表面平面。在抗冻多肽结合的地方停止冰生长，但在抗冻分子之间一定程度上继续冰生长(Raymond and DeVries 1977，DeLuca et al.1998，Marshall et al.2004)。当抗冻多肽分子之间的冰生长曲率变得足够大(或弯曲)时，冰生长停止，因为弯曲表面的表面张力增大(称为凯尔文效应(Atkins and De Paula 2002，Wilson 1994，2005，Kristiansen2005))。这时，对水分子来说，结合弯曲的冰表面在能量上是不利的。
因此，滞后冰点是水分子与冰结合在能量上又变得有利并且冰生长继续爆发性进行时的温度(Knight et al.1991，Raymond and DeVries 1977，Wilson1993)。在大多数鱼抗冻溶液中，在滞后冰点时可看到针骨状冰生长。据推测这是由于鱼抗冻多肽与冰晶体上的棱柱平面结合，而不是与基面结合。在这种情况下，滞后冰点时的生长是由于水分子与基面的结合(附加)，此时在棱柱平面上的生长受到抑制，因此冰晶体像长矛(针骨状)一样生长。
在含有来自昆虫的抗冻多肽的溶液中，滞后冰点时的生长模式更为随机，有人提出这是因为昆虫抗冻多肽也与基平面结合(也产生从这些动物的溶液中观察到的高得多的抗冻活性)，因此一旦温度足够低(滞后冰点)，生长就在冰晶体的任意面上发生。
当在昆虫抗冻多肽的存在下于滞后冰点下发生冰生长时，冰生长模式是菜花状，而不是针骨状。因此热滞后取决于至少两个参数：1)抗冻多肽的类型(取决于生物体、同工型)；和2)浓度，即便该浓度依赖性显示饱和(DeVries 1983，Kao et al.1985，Schrag et al.1982)。
显然，抗冻多肽分子的大小和观察到的滞后量之间存在正相关性(Kaoet al.1985，Schrag et al.1982，Wu et al.2001)。除了以上提到的确定抗冻效应的参数以外，抗冻活性和冰晶体碎片之间为倒数关系(当冰晶体处于滞后间隔内时)。这种效应在昆虫抗冻多肽中最明显(Zachariassen et al.2002)。
来自昆虫的抗冻多肽
在昆虫中已经发现了几种AFP。这可能是因为昆虫暴露的温度比鱼碰到的温度低得多(海水的冰点约为-1.8℃)。
迄今为止，解释了三种昆虫AFP的结构：大黄粉虫(Tenebriomolitor)、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)和加拿大拟步甲虫(Dendroides Canadensis)。来自昆虫的这三种特色AFP中的两种(来自T.molitor和D.canadensis)有许多共有的结构，可能是因为它们都来自甲虫，而C.fumiferana是蛾虫。
一种充分表征的昆虫AFP的实例是来自甲虫Tenebrio molitor的AFP。在非常相似的至少9种同工型中发现该多肽，长度为84，96至120个氨基酸(Liou et al.1999)。在所有9种已知的同工型中，发现了12个氨基酸的重复序列：T/A-C-T-X-S-X-X-C-X-X-A-X。该序列在这些AFP中重复了6至9次。TmAFP是重复的氨基酸序列的右旋β螺旋结构。平β层上的苏氨酸残基的高度规则排列被认为是与水/冰相互作用，因为预测苏氨酸残基之间的距离恰好符合冰格结构的水分子中氧原子的位置。该AFP有非常规则的结构以及预测的高结构稳定性，是由大量半胱氨酸-半胱氨酸硫桥提供的；每隔六个氨基酸即为半胱氨酸。
从D.canadensis分离出不同长度和重量(7.3-12.3kDa)的13种同工型(Andorfer and Duman 2000，Duman et al.2002)。这些AFP中的重复序列与T.molitor中发现的相同，即便13种氨基酸有时出现在这些重复序列的某一些中(Duman 1998，Li et al.1998a，1998b)。半胱氨酸恰好位于在T.molitor的AFP中的相同位置(Li et al.1998a，1998b)。
来自C.fumiferana的AFP的氨基酸序列与其他两种昆虫的AFP氨基酸序列是非同源的。然而，每15个氨基酸就能发现序列T-X-T，唯独最后的苏氨酸保持不变；在很多情况下，第一个苏氨酸被缬氨酸(V)、精氨酸(R)或异亮氨酸(I)取代。来自C.fumiferana的AFP还包含比其他两种昆虫AFP更少的半胱氨酸(Doucet et al.2000)。然而，半胱氨酸全部参与二硫化物结合(Gauthier et al.1998)。显然，来自C.fumiferana的AFP包含一疏水核心，而且该多肽被网状的氢键和二硫桥稳定，它们同时稳定了该结构(Graether et al.2000，2003，Leinala et al.2002)。
类似的观察报告也适用于各种适应寒冷的陆生生物，包括节肢动物、植物、真菌和细菌，不过这些生物中许多都能经受比海洋鱼类低得多的温度。
嗜冷(喜冷)生物已成功地适应地球上所有永久性寒冷地区：可以在深海、冰山顶以及甚至温度低到-60℃的极低区发现它们。尽管有这些致命的条件，但这些生物克服了永久性寒冷环境固有的关键障碍。这些障碍包括：酶活性降低，膜流动性减小，营养素和废物的运输改变，转录、翻译和细胞分化的速率减小，多肽冷变性，不恰当的多肽折叠和细胞内的冰形成。
对某些生物在零下温度下的生存机制的研究显示，它们依赖于至少两种策略：通过抑制冰生长或通过产生受控制的冰晶体形成来降低水的冰点(依数性地通过低分子量物质的合成和非依数性地通过特有多肽的合成)。人们认为，抗冻多肽(AFP)和低分子量物质，如多元醇、游离氨基酸和糖负责前面的过程，而冰核多肽(INP)负责后者。
抗冻多肽(AFP，在一些出版物上也被称作热滞后多肽THP，或冰结构多肽ISP)大大降低溶液的冰点，而预测的融点仅适度地降低。这意味着虽然冰点显著降低，但溶液的融点可通过依数性的融点降低来预测，对于存在冰的溶液来说确实如此。关于抗冻多肽是否能够降低无冰溶液的过冷点，这一问题很大程度上未得到解决。
冻结温度的偏移是有限的，并且快速的冰生长将在足够低的温度下发生。融化和冻结温度的分隔通常称作热滞后(TH)(Knight et al.1991，Raymond and DeVries 1977，Wilson 1993)，冰生长的温度称作滞后冰点。融点和滞后冰点之间的差异称作滞后作用或抗冻活性。AFP的第二个功能是处于冻结状态时，它们显示冰再结晶抑制作用(RI)。AFP在高于再结晶温度的温度下以小晶体作为代价抑制大晶体的形成(Knight et al.1984，1995，Knight and Duman 1986，et al.1996)。
抑制冰形成的机制
抗冻多肽抑制冰生长的机制仍然在调查研究中。AFP似乎都是两性分子。这意味着它们分子的一部分比其余部分更具疏水性。迄今为止，对于它们活性的解释是它们亲水性的一侧与冰晶体结合。然而，这一观点在过去十年已受到挑战，因为当观察冰/水时，人们会有充分的理由问：根据定义哪个是最亲水的-冰还是水。AFP经由它们的疏水性一侧/区域与水结合的多种证据正在显现出来，但就目前所有证据来看，确切的结合机制仍是未知的。
然而，最终在这点上的一致意见是，根据抗冻多肽的类型(以及同工型)，抗冻多肽识别并结合多种冰表面平面。在抗冻多肽结合的地方停止冰生长，但在抗冻分子之间一定程度上继续冰生长(Raymond and DeVries 1977，DeLuca et al.1998，Marshall et al.2004)。当抗冻多肽分子之间的冰生长曲率变得足够大(或弯曲)时，冰生长停止，因为弯曲表面的表面张力增大(称为凯尔文效应(Atkins and De Paula 2002，Wilson 1994，2005，Kristiansen2005))。这时，对水分子来说，结合弯曲的冰表面在能量上是不利的。
因此，滞后冰点是水分子与冰结合在能量上又变得有利并且冰生长继续爆发性进行时的温度(Knight et al.1991，Raymond and DeVries 1977，Wilson1993)。在大多数鱼抗冻溶液中，在滞后冰点时可看到针骨状冰生长。据推测这是由于鱼抗冻多肽与冰晶体上的棱柱平面结合，而不是与基面结合。在这种情况下，滞后冰点时的生长是由于水分子与基面的结合(附加)，此时在棱柱平面上的生长受到抑制，因此冰晶体像长矛(针骨状)一样生长。
在含有来自昆虫的抗冻多肽的溶液中，滞后冰点时的生长模式更为随机，有人提出这是因为昆虫抗冻多肽也与基平面结合(也产生从这些动物的溶液中观察到的高得多的抗冻活性)，因此一旦温度足够低(滞后冰点)，生长就在冰晶体的任意面上发生。
当在昆虫抗冻多肽的存在下于滞后冰点下发生冰生长时，冰生长模式是菜花状，而不是针骨状。因此热滞后取决于至少两个参数：1)抗冻多肽的类型(取决于生物体、同工型)；和2)浓度，即便该浓度依赖性显示饱和(DeVries 1983，Kao et al.1985，Schrag et al.1982)。
显然，抗冻多肽分子的大小和观察到的滞后量之间存在正相关性(Kaoet al.1985，Schrag et al.1982，Wu et al.2001)。除了以上提到的确定抗冻效应的参数以外，抗冻活性和冰晶体碎片之间为倒数关系(当冰晶体处于滞后间隔内时)。这种效应在昆虫抗冻多肽中最明显(Zachariassen et al.2002)。
来自昆虫的抗冻多肽
在昆虫中已经发现了几种AFP。这可能是因为昆虫暴露的温度比鱼碰到的温度低得多(海水的冰点约为-1.8℃)。
迄今为止，解释了三种昆虫AFP的结构：大黄粉虫(Tenebriomolitor)、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)和加拿大拟步甲虫(Dendroides Canadensis)。来自昆虫的这三种特色AFP中的两种(来自T.molitor和D.canadensis)有许多共有的结构，可能是因为它们都来自甲虫，而C.fumiferana是蛾虫。
一种充分表征的昆虫AFP的实例是来自甲虫Tenebrio molitor的AFP。在非常相似的至少9种同工型中发现该多肽，长度为84，96至120个氨基酸(Liou et al.1999)。在所有9种已知的同工型中，发现了12个氨基酸的重复序列：T/A-C-T-X-S-X-X-C-X-X-A-X。该序列在这些AFP中重复了6至9次。TmAFP是重复的氨基酸序列的右旋β螺旋结构。平β层上的苏氨酸残基的高度规则排列被认为是与水/冰相互作用，因为预测苏氨酸残基之间的距离恰好符合冰格结构的水分子中氧原子的位置。该AFP有非常规则的结构以及预测的高结构稳定性，是由大量半胱氨酸-半胱氨酸硫桥提供的；每隔六个氨基酸即为半胱氨酸。
从D.canadensis分离出不同长度和重量(7.3-12.3kDa)的13种同工型(Andorfer and Duman 2000，Duman et al.2002)。这些AFP中的重复序列与T.molitor中发现的相同，即便13种氨基酸有时出现在这些重复序列的某一些中(Duman 1998，Li et al.1998a，1998b)。半胱氨酸恰好位于在T.molitor的AFP中的相同位置(Li et al.1998a，1998b)。
来自C.fumiferana的AFP的氨基酸序列与其他两种昆虫的AFP氨基酸序列是非同源的。然而，每15个氨基酸就能发现序列T-X-T，唯独最后的苏氨酸保持不变；在很多情况下，第一个苏氨酸被缬氨酸(V)、精氨酸(R)或异亮氨酸(I)取代。来自C.fumiferana的AFP还包含比其他两种昆虫AFP更少的半胱氨酸(Doucet et al.2000)。然而，半胱氨酸全部参与二硫化物结合(Gauthier et al.1998)。显然，来自C.fumiferana的AFP包含一疏水核心，而且该多肽被网状的氢键和二硫桥稳定，它们同时稳定了该结构(Graether et al.2000，2003，Leinala et al.2002)。
发明内容
本发明一方面涉及抗冻多肽及其片段，包括由某些天牛科(Cerambycid)树皮甲虫产生并且含有多个冰结合位点的抗冻多肽。以下更详细描述的用于制备和使用这类多肽的方法也属于本发明的范围。
天牛科树皮甲虫松皮天牛(Rhagium inquisitor)和密毛皮花天牛(Rhagium mordax)，二者在它们的成年和幼年期都能经受低至-30℃的温度，并仍然在斯堪的那维亚北部树桩的树皮下过冬。这两个物种都属于被称作“逃避冻结者”的耐寒动物的类别，意味着它们能在极低的温度下生存，而在它们的组织中不形成冰。它们可以被视为能适应超冷(或过冷)条件很长的时间。
过冷状态对Cerambycid树皮甲虫可能是致命的，因为冰形成原则上会在亚稳态、超冷液体中出现，这是由于随机的成核现象或者由周围环境中的冰接种导致。Cerambycid树皮甲虫难能在这种冰形成中幸免于难。
因此，R.inquisitor和R.mordax二者都适应这种气候条件，并且它们能够在低温下生存更长的时间。这使得Cerambycid树皮甲虫作为抗冻多肽(AFP)源特别引人注意。
在R.inquisitor中，对低温的适应包括在血淋巴区域积累防冷冻的甘油，从体液中消除潜在的冰成核剂(产生更高可能性的超冷现象)，以及在冬季来临前合成大量抗冻多肽。目前，在R.inquisitor中发现的抗冻多肽的抗冻活性(7℃)被视为已知的最高值。
R.mordax幼虫能够在差不多像R.inquisitor一样冷的温度下生存-尽管积累的防冷冻化合物非常有限。根据目前优选的一种假设，Rhagium mordax忍受低温的能力几乎可以完全归因于冬季来临前的一种或多种抗冻多肽(AFP)的合成与积累。
意外地发现，本发明的抗冻多肽具有比目前已知的其他昆虫AFP明显较少数量的半胱氨酸残基。这个特征，与本发明的多肽具有比许多最新式昆虫抗冻多肽更少的重复序列这一事实一起，使它们成为异源宿主生物体中更好的表达候选者。
在目前优选的实施方式中，本发明的抗冻多肽及其显示抗冻活性的功能片段，优选地具有少于4个半胱氨酸残基，例如少于3个半胱氨酸残基，例如2个半胱氨酸残基。
正如以下清楚描述的那样，本发明的抗冻多肽具有多种不同的用途和工业应用领域。多肽或编码该多肽的基因，可以以各种不同的方式用于抑制冰晶体生长。多肽可被直接引入，或者将它们作为基因引入，该基因在适宜的表达信号控制下在宿主细胞中表达以产生多肽。
抗冻多肽的适宜浓度会根据用途而改变，但典型地是在约一亿分之一份至约一千分之一份(即，约1μg/l至约1mg/l)。
在本发明的一个方面，将多肽引入食用产品中，或使其与食用产品接触，以便在例如冷冻条件下，在可食用产品的生产和/或储存期间，减少或抑制冰晶体生长和/或形成。
意外地发现，本发明的多肽提供的冰结晶明显不同于在其他已知的抗冻多肽存在下获得的晶体。尤其发现，在本发明多肽的存在下，获得了小的球形结构的晶体，而已知的抗冻多肽，如US 6,914,043中提到的抗冻蛋白III型HPLC 12或US 6,312,733中提到的冰晶体生长抑制剂，提供了针骨状结构的晶体。
因此，本发明的一个主要的优势在于，当本发明的多肽掺入比如冰淇淋时，可以获得改进的口感，因为在生产和储存期间，冰淇淋中形成的晶体会有非常小的球形结构，相比之下当使用已知的上述III型抗冻多肽时，得到的是粗糙的针骨状晶体。
包括蔬菜在内的冰冻食用产品的质地、味道以及有用的保存期限，都可以因本发明多肽的作用而大大改善。例如，冰冻蔬菜，如芹菜、土豆、芦笋、豌豆、胡萝卜、豆类、西兰花、甜玉米、菠菜等的质地、味道和有用的保存期限都将得到改善。类似地，各种冰冻水果的质地、味道和有用的保存期限也将被增强，包括草莓、蓝莓、覆盆子、柑橘类水果、香蕉、葡萄、猕猴桃、桃子、菠萝、李子、樱桃、西红柿和芒果。
例如，引入到蔬菜和其他食用产品可通过将适当的多核苷酸引入目标生物的基因引入法来实现。多核苷酸的表达，无论组成性还是诱导性，在食品加工开始之前或在收获和加工开始之后，都产生足够高水平的本发明多肽，以有效地保护包括食品在内的食用产品，比如按质量计高达总植物多肽约0.1％。表达也可以建立在组织特异性基础上。例如，与水果中的成熟基因连接可能产生表达，甚至是在从产品植物中收获之后。
在本发明的一个重要方面，多肽可添加到食品中，人们希望该食品直到消费、甚至在消费期间都保持冻结-尤其是以冻结或冷冻态消费的食用产品。
许多冷冻食品都是为了在冻结或冷冻态下消费，例如冰淇淋、冷冻酸奶、冰牛奶、果子露、冰棍、冷冻奶油、冷冻奶油馅饼、冷冻布丁等。尤其是，大的冰晶体的形成贯穿整个冻融循环，使质地和口味受到不利的影响，这发生在大多数家用无霜冰箱中或持续保存于冷冻态时。这种冰晶体生长过程可通过使用本发明的多肽来减少甚至完全防止，或者至少是尽可能地减少。本发明的抗冻多肽可掺入到整个食用产品，和/或比如它们可以选择性地涂在食用产品的表面，这里是冷凝和冰晶体形成预计最容易发生的地方。
本发明的另一个重要方面涉及含有编码本发明多肽的多核苷酸的酵母，包括面包酵母。涉及该方面的方法包括用编码这些多肽的多核苷酸转化面团酵母的方法。当该多核苷酸掺入酵母和表达，并且在冷冻面团中使用这些酵母时，面团一解冻就会自然发酵，因为酵母生存能力在解冻时会保持很高。因为在这些抗冻多肽的存在下，保存期间积累的损害较少，还因为融化的样品会具有高活力的酵母细胞，所以冷冻态下有可能保存较长的时间，或者较小的面团样品都需要保存。
将抗冻多肽掺入冷冻的、发酵的食用产品的一种替换方式是让生物体负责发酵过程，在发酵食品时产生抗冻多肽。因此，本发明还包括制备冷冻发酵食用产品的方法。该方法包括步骤：a)将食品与能够分泌本发明多肽的微生物接触，其中该微生物能够使该食品发酵，以生产发酵食品，b)用微生物在发酵进行的条件下培养该食品，以便生产含有本发明抗冻多肽的发酵食品，所述多肽存在的量有效地抑制冰晶体生长和/或形成；和c)在优选低于-5℃的温度下冷冻该发酵食品，以便生产冷冻发酵食品。
本发明的另一个方面涉及将本发明的抗冻多肽引入指定要冷藏的生物细胞或其提取物中。例如，含有本发明抗冻多肽的细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞具有增强的细胞或组织生存能力，最小限度地或没有因为冷冻-融化过程而失去固有特性。亚细胞样品或细胞提取物可能对冷冻具有相似的敏感性，尤其是在长期保存时。典型的实例是体外多肽翻译系统、酶制备、以及含有敏感性膜组分的特定样品，如叶绿体或线粒体的膜制备。
具体地，当添加本发明的抗冻多肽时，包含细胞器的样品就可显示增强的抗冻害能力。当在该多肽的存在下冷冻时，动物软组织显示出较少的损害，并且当冷冻和随后解冻时，细胞完整性很重要或者是为了组织培养保藏所需要时，本发明多肽的添加对这些情况也是有利的。因此，指定要冷冻保存的样本，如细胞或组织保藏，通常都可在其中加入本发明的多肽。生物细胞类型中通常保存的是细菌、真菌(包括酵母)、尤其是高等真核细胞(如杂交瘤株及组织培养细胞系)的基因变体。
本发明另一方面涉及非专门针对食品领域的用途。目前，本发明多肽的一种非食品应用是保护农作物和植物免受严寒气候条件的侵袭。本发明的抗冻多肽可通过表达引入的基因来内部地掺入细胞质中，或者该多肽可外部地涂在植物上-如通过喷涂或其他方式。因此外部应用可通过将多肽直接涂在植物上或者通过外部沉积在分泌该多肽的植物上来实现。这些引入的相同替换方式也适用于其他用途。
另一种实施方式是将抗冻多肽引入包围器官、组织或其他生物样本的液体中。一种具体的用途是为了移植手术或为了保存目的转移到医院期间。本发明的抗冻多肽目前可短期或长期保存在零下温度下，从而使固有的代谢或消化减至最小，但冰晶体生长导致的细胞损伤显著减少。其他医学上重要的温度敏感性生物样品是血液和血液制品、治疗药物、多肽药物、生物检测试剂和疫苗。
本发明还提供含有本发明多肽的化妆品或皮肤病制剂。本发明的多肽在化妆品或局部皮肤病制剂中的应用可能提供有效的治疗，还能预防因寒冷引起的皮肤的结构性和细胞性损伤。伴随明显气候或天气引起的温度下降，寒冷损伤通过失去细胞酶的最适温度，导致细胞中或细胞外空间的细胞生理学发生变化，例如由寒冷、风和/或紫外线，引起皮肤损伤、皮肤发红或皮肤紧绷感以及感官敏感性增加、温度敏感性皮肤，由环境压力(由温度变化和紫外线、吸烟、烟雾、活性氧簇、自由基)引起的皮肤、嘴唇、鼻子和口腔中的黏膜以及外皮附属物的消极变化。
本发明还包括组合物及用途，其基于本发明的抗冻多肽与本领域技术人员熟知的现有技术的稳定剂、乳化剂和表面活性剂以及其他添加剂而成的混合物。这些化合物可用来抑制腐烂、抑制氧化、防止变色、抑制微生物生长、稳定乳液等。
从上述内容可以明白，本发明一方面涉及能够抑制和/或减少冰晶体形成的多肽，该冰晶体形成与物体或物质(包括食用产品)的冻结或超冷现象相关。超冷条件是使物质冷却到通常发生状态变化(即从水相变为冰)的温度以下，而未出现状态的变化。因此，液体冷却到它的冰点以下而未发生冻结就构成了超冷现象，并产生一种亚稳态。
本发明的多肽在整个说明书中可由抗冻多肽和简称的多肽互换表示。
在一个方面，提供的一种选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的多肽。除非另有说明，注释SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、以及其他类似的表示一系列序列识别数字的起始数和结尾数的注解，用在本文中时都表示所述序列识别数中的每个或各个，例如以上引用的实例中，指序列识别数SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的多肽，或者由SEQ ID NO：1至SEQID NO：8任一项组成的多肽或其具有抗冻活性的片段，或者与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8任一项或其片段具有至少约75％同源性的变体，都属于本发明的范围。具体地，本发明还公开了一种包含或者由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8任一项组成的多肽的片段，其具有至少20个氨基酸和冰结合位点以及抗冻活性。该片段优选地具有少于200个氨基酸，例如优选地少于150个氨基酸，例如优选地少于100个氨基酸，例如80个氨基酸，例如60个氨基酸。
本发明还涉及包括本发明的一个或多个“冰结合位点”(IBS)的多肽，例如包含SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：72的任意一个或多个的多肽-共64个特异性“冰结合位点”(IBS)，如图3所示。
本发明尤其涉及以下多肽：
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：16的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：24的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：32的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：40的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：48的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：56的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：64的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：65至SEQ ID NO：72的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
本发明还提供含有SEQ ID NO：73至80的一个或多个序列的多肽，例如含有4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：80的所有序列-以保守的“冰结合域”(IBD)的形式。
SEQ ID NO：81至89涉及进一步的保守域，其可在本发明的多肽中单个地或以任意组合存在。
本发明还涉及通用冰结合域形式的SEQ ID NO：90，其可在本发明的多肽中多次出现，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、8次以上并优选地小于30次。相同的序列可以多次出现，或者SEQ ID NO：90的变种可以多次出现，如本文以下本发明的部分列举项目中所述。
下表1中列出了包含成对组合的冰结合域的多肽。列出共计64个不同组合-本文SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：80公开的8个冰结合域(IBD)的任意各个或每个成对和独立的组合形式。
本发明还涉及一种多肽，其含有选自SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：80的4个或更多序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
另一方面，本发明提供了一种多肽，其含有序列SEQ ID NO：90的4个或更多个拷贝，例如5个或更多拷贝，例如6个或更多拷贝，例如7个或更多拷贝，例如8个或更多拷贝，并且优选少于20个拷贝。
如本文以上所述，本发明一方面涉及包含不同冰结合位点(IBD)的组合的多肽，所述组合包括任意组合的2个IBD的至少1种组合，例如至少2种组合，选自本文下方表1列出的64种成对冰结合域序列组合。所述多肽优选地具有少于20个由SEQ ID NO：90定义的通用冰结合域，例如少于15个通用冰结合域，例如少于12个通用冰结合域，例如少于10个通用冰结合域。
表1
IBD I IBD II BD III IBD IV IBD V IBD VI IBD VII IBD VIII
IBD I A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
IBD II B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8
IBD III C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
IBD IV D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
IBD V E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
IBD VI F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
IBD VII G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8
IBD VIII H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8
IBD：冰结合域
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的每个序列都包括一共8个IBD，在本文上表1中表示为I、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。在表1中，IBD I代表SEQ ID NO 73，IBD II代表SEQ ID NO 74，IBD III代表SEQ ID NO 75，IBD IV代表SEQ ID NO 76，IBD V代表SEQ ID NO 77，IBD VI代表SEQID NO 78，IBD VII代表SEQ ID NO 79，IBD VIII代表SEQ ID NO 80。
本文上表1列出的矩阵中出现的各个独立的字母/数字组合是相互交叉结合的，以产生本文下表2列出的组合。举例说明，组合A1A1来源于两个IBD I域与另两个IBD I域的组合，而组合B3A6来源于一个IBD II和一个IBD III与一个IBD I和一个IBD VI的组合。由此所得的多肽包含以下多肽冰结合域：IBD I、IBD II、IBD III和IBD VI。
因此，本发明进一步提供包含不同冰结合域(IBD)组合的多肽，所述组合包括至少1种组合，例如至少2种组合，例如任意4个IBD的组合中的3种组合，该4个IBD选自本文下表2显示的任意4个冰结合域序列的4096种组合，所述多肽优选地具有少于20个由SEQ ID NO：90限定的通用冰结合域，例如少于15个通用冰结合域，例如少于12个通用冰结合域，例如少于10个通用冰结合域。
为了进一步说明表2，组合来源于64×64矩阵，A1A1是两个IBD I域与另两个IBD I域的组合，而组合B3A6来源于一个IBD II和一个IBD III域与一个IBD I和一个IBD VI域的组合。因此后者包含以下多肽域：IBD I、IBDII、IBD III和IBD VI。
表2
A1A1 A7A6 B6A3 C4A8 D3A5 E2A2
A1A2 A7A7 B6A4 C5A1 D3A6 E2A3
A1A3 A7A8 B6A5 C5A2 D3A7 E2A4
A1A4 A8A1 B6A6 C5A3 D3A8 E2A5
A1A5 A8A2 B6A7 C5A4 D4A1 E2A6
A1A6 A8A3 B6A8 C5A5 D4A2 E2A7
A1A7 A8A4 B7A1 C5A6 D4A3 E2A8
A1A8 A8A5 B7A2 C5A7 D4A4 E3A1
A2A1 A8A6 B7A3 C5A8 D4A5 E3A2
A2A2 A8A7 B7A4 C6A1 D4A6 E3A3
A2A3 A8A8 B7A5 C6A2 D4A7 E3A4
A2A4 B1A1 B7A6 C6A3 D4A8 E3A5
A2A5 B1A2 B7A7 C6A4 D5A1 E3A6
A2A6 B1A3 B7A8 C6A5 D5A2 E3A7
A2A7 B1A4 B8A1 C6A6 D5A3 E3A8
A2A8 B1A5 B8A2 C6A7 D5A4 E4A1
A3A1 B1A6 B8A3 C6A8 D5A5 E4A2
A3A2 B1A7 B8A4 C7A1 D5A6 E4A3
A3A3 B1A8 B8A5 C7A2 D5A7 E4A4
A3A4 B2A1 B8A6 C7A3 D5A8 E4A5
A3A5 B2A2 B8A7 C7A4 D6A1 E4A6
A3A6 B2A3 B8A8 C7A5 D6A2 E4A7
A3A7 B2A4 C1A1 C7A6 D6A3 E4A8
A3A8 B2A5 C1A2 C7A7 D6A4 E5A1
A4A1 B2A6 C1A3 C7A8 D6A5 E5A2
A4A2 B2A7 C1A4 C8A1 D6A6 E5A3
A4A3 B2A8 C1A5 C8A2 D6A7 E5A4
A4A4 B3A1 C1A6 C8A3 D6A8 E5A5
A4A5 B3A2 C1A7 C8A4 D7A1 E5A6
A4A6 B3A3 C1A8 C8A5 D7A2 E5A7
A4A7 B3A4 C2A1 C8A6 D7A3 E5A8
A4A8 B3A5 C2A2 C8A7 D7A4 E6A1
A5A1 B3A6 C2A3 C8A8 D7A5 E6A2
A5A2 B3A7 C2A4 D1A1 D7A6 E6A3
A5A3 B3A8 C2A5 D1A2 D7A7 E6A4
A5A4 B4A1 C2A6 D1A3 D7A8 E6A5
A5A5 B4A2 C2A7 D1A4 D8A1 E6A6
A5A6 B4A3 C2A8 D1A5 D8A2 E6A7
A5A7 B4A4 C3A1 D1A6 D8A3 E6A8
A5A8 B4A5 C3A2 D1A7 D8A4 E7A1
A6A1 B4A6 C3A3 D1A8 D8A5 E7A2
A6A2 B4A7 C3A4 D2A1 D8A6 E7A3
A6A3 B4A8 C3A5 D2A2 D8A7 E7A4
A6A4 B5A1 C3A6 D2A3 D8A8 E7A5
A6A5 B5A2 C3A7 D2A4 E1A1 E7A6
A6A6 B5A3 C3A8 D2A5 E1A2 E7A7
A6A7 B5A4 C4A1 D2A6 E1A3 E7A8
A6A8 B5A5 C4A2 D2A7 E1A4 E8A1
A7A1 B5A6 C4A3 D2A8 E1A5 E8A2
A7A2 B5A7 C4A4 D3A1 E1A6 E8A3
A7A3 B5A8 C4A5 D3A2 E1A7 E8A4
A7A4 B6A1 C4A6 D3A3 E1A8 E8A5
A7A5 B6A2 C4A7 D3A4 E2A1 E8A6
E8A7 F7A4 G6A1 H4A6 A3B3 B1B8
E8A8 F7A5 G6A2 H4A7 A3B4 B2B1
F1A1 F7A6 G6A3 H4A8 A3B5 B2B2
F1A2 F7A7 G6A4 H5A1 A3B6 B2B3
F1A3 F7A8 G6A5 H5A2 A3B7 B2B4
F1A4 F8A1 G6A6 H5A3 A3B8 B2B5
F1A5 F8A2 G6A7 H5A4 A4B1 B2B6
F1A6 F8A3 G6A8 H5A5 A4B2 B2B7
F1A7 F8A4 G7A1 H5A6 A4B3 B2B8
F1A8 F8A5 G7A2 H5A7 A4B4 B3B1
F2A1 F8A6 G7A3 H5A8 A4B5 B3B2
F2A2 F8A7 G7A4 H6A1 A4B6 B3B3
F2A3 F8A8 G7A5 H6A2 A4B7 B3B4
F2A4 G1A1 G7A6 H6A3 A4B8 B3B5
F2A5 G1A2 G7A7 H6A4 A5B1 B3B6
F2A6 G1A3 G7A8 H6A5 A5B2 B3B7
F2A7 G1A4 G8A1 H6A6 A5B3 B3B8
F2A8 G1A5 G8A2 H6A7 A5B4 B4B1
F3A1 G1A6 G8A3 H6A8 A5B5 B4B2
F3A2 G1A7 G8A4 H7A1 A5B6 B4B3
F3A3 G1A8 G8A5 H7A2 A5B7 B4B4
F3A4 G2A1 G8A6 H7A3 A5B8 B4B5
F3A5 G2A2 G8A7 H7A4 A6B1 B4B6
F3A6 G2A3 G8A8 H7A5 A6B2 B4B7
F3A7 G2A4 H1A1 H7A6 A6B3 B4B8
F3A8 G2A5 H1A2 H7A7 A6B4 B5B1
F4A1 G2A6 H1A3 H7A8 A6B5 B5B2
F4A2 G2A7 H1A4 H8A1 A6B6 B5B3
F4A3 G2A8 H1A5 H8A2 A6B7 B5B4
F4A4 G3A1 H1A6 H8A3 A6B8 B5B5
F4A5 G3A2 H1A7 H8A4 A7B1 B5B6
F4A6 G3A3 H1A8 H8A5 A7B2 B5B7
F4A7 G3A4 H2A1 H8A6 A7B3 B5B8
F4A8 G3A5 H2A2 H8A7 A7B4 B6B1
F5A1 G3A6 H2A3 H8A8 A7B5 B6B2
F5A2 G3A7 H2A4 A1B1 A7B6 B6B3
F5A3 G3A8 H2A5 A1B2 A7B7 B6B4
F5A4 G4A1 H2A6 A1B3 A7B8 B6B5
F5A5 G4A2 H2A7 A1B4 A8B1 B6B6
F5A6 G4A3 H2A8 A1B5 A8B2 B6B7
F5A7 G4A4 H3A1 A1B6 A8B3 B6B8
F5A8 G4A5 H3A2 A1B7 A8B4 B7B1
F6A1 G4A6 H3A3 A1B8 A8B5 B7B2
F6A2 G4A7 H3A4 A2B1 A8B6 B7B3
F6A3 G4A8 H3A5 A2B2 A8B7 B7B4
F6A4 G5A1 H3A6 A2B3 A8B8 B7B5
F6A5 G5A2 H3A7 A2B4 B1B1 B7B6
F6A6 G5A3 H3A8 A2B5 B1B2 B7B7
F6A7 G5A4 H4A1 A2B6 B1B3 B7B8
F6A8 G5A5 H4A2 A2B7 B1B4 B8B1
F7A1 G5A6 H4A3 A2B8 B1B5 B8B2
F7A2 G5A7 H4A4 A3B1 B1B6 B8B3
F7A3 G5A8 H4A5 A3B2 B1B7 B8B4
B8B5 C7B2 D5B7 E4B4 F3B1 G1B6
B8B6 C7B3 D5B8 E4B5 F3B2 G1B7
B8B7 C7B4 D6B1 E4B6 F3B3 G1B8
B8B8 C7B5 D6B2 E4B7 F3B4 G2B1
C1B1 C7B6 D6B3 E4B8 F3B5 G2B2
C1B2 C7B7 D6B4 E5B1 F3B6 G2B3
C1B3 C7B8 D6B5 E5B2 F3B7 G2B4
C1B4 C8B1 D6B6 E5B3 F3B8 G2B5
C1B5 C8B2 D6B7 E5B4 F4B1 G2B6
C1B6 C8B3 D6B8 E5B5 F4B2 G2B7
C1B7 C8B4 D7B1 E5B6 F4B3 G2B8
C1B8 C8B5 D7B2 E5B7 F4B4 G3B1
C2B1 C8B6 D7B3 E5B8 F4B5 G3B2
C2B2 C8B7 D7B4 E6B1 F4B6 G3B3
C2B3 C8B8 D7B5 E6B2 F4B7 G3B4
C2B4 D1B1 D7B6 E6B3 F4B8 G3B5
C2B5 D1B2 D7B7 E6B4 F5B1 G3B6
C2B6 D1B3 D7B8 E6B5 F5B2 G3B7
C2B7 D1B4 D8B1 E6B6 F5B3 G3B8
C2B8 D1B5 D8B2 E6B7 F5B4 G4B1
C3B1 D1B6 D8B3 E6B8 F5B5 G4B2
C3B2 D1B7 D8B4 E7B1 F5B6 G4B3
C3B3 D1B8 D8B5 E7B2 F5B7 G4B4
C3B4 D2B1 D8B6 E7B3 F5B8 G4B5
C3B5 D2B2 D8B7 E7B4 F6B1 G4B6
C3B6 D2B3 D8B8 E7B5 F6B2 G4B7
C3B7 D2B4 E1B1 E7B6 F6B3 G4B8
C3B8 D2B5 E1B2 E7B7 F6B4 G5B1
C4B1 D2B6 E1B3 E7B8 F6B5 G5B2
C4B2 D2B7 E1B4 E8B1 F6B6 G5B3
C4B3 D2B8 E1B5 E8B2 F6B7 G5B4
C4B4 D3B1 E1B6 E8B3 F6B8 G5B5
C4B5 D3B2 E1B7 E8B4 F7B1 G5B6
C4B6 D3B3 E1B8 E8B5 F7B2 G5B7
C4B7 D3B4 E2B1 E8B6 F7B3 G5B8
C4B8 D3B5 E2B2 E8B7 F7B4 G6B1
C5B1 D3B6 E2B3 E8B8 F7B5 G6B2
C5B2 D3B7 E2B4 F1B1 F7B6 G6B3
C5B3 D3B8 E2B5 F1B2 F7B7 G6B4
C5B4 D4B1 E2B6 F1B3 F7B8 G6B5
C5B5 D4B2 E2B7 F1B4 F8B1 G6B6
C5B6 D4B3 E2B8 F1B5 F8B2 G6B7
C5B7 D4B4 E3B1 F1B6 F8B3 G6B8
C5B8 D4B5 E3B2 F1B7 F8B4 G7B1
C6B1 D4B6 E3B3 F1B8 F8B5 G7B2
C6B2 D4B7 E3B4 F2B1 F8B6 G7B3
C6B3 D4B8 E3B5 F2B2 F8B7 G7B4
C6B4 D5B1 E3B6 F2B3 F8B8 G7B5
C6B5 D5B2 E3B7 F2B4 G1B1 G7B6
C6B6 D5B3 E388 F2B5 G1B2 G7B7
C6B7 D5B4 E4B1 F2B6 G1B3 G7B8
C6B8 D5B5 E4B2 F2B7 G1B4 G8B1
C7B1 D5B6 E4B3 F2B8 G1B5 G8B2
G8B3 H6B8 A5C5 B4C2 C2C7 D1C4
G8B4 H7B1 A5C6 B4C3 C2C8 D1C5
G8B5 H7B2 A5C7 B4C4 C3C1 D1C6
G8B6 H7B3 A5C8 B4C5 C3C2 D1C7
G8B7 H7B4 A6C1 B4C6 C3C3 D1C8
G8B8 H7B5 A6C2 B4C7 C3C4 D2C1
H1B1 H7B6 A6C3 B4C8 C3C5 D2C2
H1B2 H7B7 A6C4 B5C1 C3C6 D2C3
H1B3 H7B8 A6C5 B5C2 C3C7 D2C4
H1B4 H8B1 A6C6 B5C3 C3C8 D2C5
H1B5 H8B2 A6C7 B5C4 C4C1 D2C6
H1B6 H8B3 A6C8 B5C5 C4C2 D2C7
H1B7 H8B4 A7C1 B5C6 C4C3 D2C8
H1B8 H8B5 A7C2 B5C7 C4C4 D3C1
H2B1 H8B6 A7C3 B5C8 C4C5 D3C2
H2B2 H8B7 A7C4 B6C1 C4C6 D3C3
H2B3 H8B8 A7C5 B6C2 C4C7 D3C4
H2B4 A1C1 A7C6 B6C3 C4C8 D3C5
H2B5 A1C2 A7C7 B6C4 C5C1 D3C6
H2B6 A1C3 A7C8 B6C5 C5C2 D3C7
H2B7 A1C4 A8C1 B6C6 C5C3 D3C8
H2B8 A1C5 A8C2 B6C7 C5C4 D4C1
H3B1 A1C6 A8C3 B6C8 C5C5 D4C2
H3B2 A1C7 A8C4 B7C1 C5C6 D4C3
H3B3 A1C8 A8C5 B7C2 C5C7 D4C4
H3B4 A2C1 A8C6 B7C3 C5C8 D4C5
H3B5 A2C2 A8C7 B7C4 C6C1 D4C6
H3B6 A2C3 A8C8 B7C5 C6C2 D4C7
H3B7 A2C4 B1C1 B7C6 C6C3 D4C8
H3B8 A2C5 B1C2 B7C7 C6C4 D5C1
H4B1 A2C6 B1C3 B7C8 C6C5 D5C2
H4B2 A2C7 B1C4 B8C1 C6C6 D5C3
H4B3 A2C8 B1C5 B8C2 C6C7 D5C4
H4B4 A3C1 B1C6 B8C3 C6C8 D5C5
H4B5 A3C2 B1C7 B8C4 C7C1 D5C6
H4B6 A3C3 B1C8 B8C5 C7C2 D5C7
H4B7 A3C4 B2C1 B8C6 C7C3 D5C8
H4B8 A3C5 B2C2 B8C7 C7C4 D6C1
H5B1 A3C6 B2C3 B8C8 C7C5 D6C2
H5B2 A3C7 B2C4 C1C1 C7C6 D6C3
H5B3 A3C8 B2C5 C1C2 C7C7 D6C4
H5B4 A4C1 B2C6 C1C3 C7C8 D6C5
H5B5 A4C2 B2C7 C1C4 C8C1 D6C6
H5B6 A4C3 B2C8 C1C5 C8C2 D6C7
H5B7 A4C4 B3C1 C1C6 C8C3 D6C8
H5B8 A4C5 B3C2 C1C7 C8C4 D7C1
H6B1 A4C6 B3C3 C1C8 C8C5 D7C2
H6B2 A4C7 B3C4 C2C1 C8C6 D7C3
H6B3 A4C8 B3C5 C2C2 C8C7 D7C4
H6B4 A5C1 B3C6 C2C3 C8C8 D7C5
H6B5 A5C2 B3C7 C2C4 D1C1 D7C6
H6B6 A5C3 B3C8 C2C5 D1C2 D7C7
H6B7 A5C4 B4C1 C2C6 D1C3 D7C8
D8C1 E6C6 F5C3 G3C8 H2C5 A1D2
D8C2 E6C7 F5C4 G4C1 H2C6 A1D3
D8C3 E6C8 F5C5 G4C2 H2C7 A1D4
D8C4 E7C1 F5C6 G4C3 H2C8 A1D5
D8C5 E7C2 F5C7 G4C4 H3C1 A1D6
D8C6 E7C3 F5C8 G4C5 H3C2 A1D7
D8C7 E7C4 F6C1 G4C6 H3C3 A1D8
D8C8 E7C5 F6C2 G4C7 H3C4 A2D1
E1C1 E7C6 F6C3 G4C8 H3C5 A2D2
E1C2 E7C7 F6C4 G5C1 H3C6 A2D3
E1C3 E7C8 F6C5 G5C2 H3C7 A2D4
E1C4 E8C1 F6C6 G5C3 H3C8 A2D5
E1C5 E8C2 F6C7 G5C4 H4C1 A2D6
E1C6 E8C3 F6C8 G5C5 H4C2 A2D7
E1C7 E8C4 F7C1 G5C6 H4C3 A2D8
E1C8 E8C5 F7C2 G5C7 H4C4 A3D1
E2C1 E8C6 F7C3 G5C8 H4C5 A3D2
E2C2 E8C7 F7C4 G6C1 H4C6 A3D3
E2C3 E8C8 F7C5 G6C2 H4C7 A3D4
E2C4 F1C1 F7C6 G6C3 H4C8 A3D5
E2C5 F1C2 F7C7 G6C4 H5C1 A3D6
E2C6 F1C3 F7C8 G6C5 H5C2 A3D7
E2C7 F1C4 F8C1 G6C6 H5C3 A3D8
E2C8 F1C5 F8C2 G6C7 H5C4 A4D1
E3C1 F1C6 F8C3 G6C8 H5C5 A4D2
E3C2 F1C7 F8C4 G7C1 H5C6 A4D3
E3C3 F1C8 F8C5 G7C2 H5C7 A4D4
E3C4 F2C1 F8C6 G7C3 H5C8 A4D5
E3C5 F2C2 F8C7 G7C4 H6C1 A4D6
E3C6 F2C3 F8C8 G7C5 H6C2 A4D7
E3C7 F2C4 G1C1 G7C6 H6C3 A4D8
E3C8 F2C5 G1C2 G7C7 H6C4 A5D1
E4C1 F2C6 G1C3 G7C8 H6C5 A5D2
E4C2 F2C7 G1C4 G8C1 H6C6 A5D3
E4C3 F2C8 G1C5 G8C2 H6C7 A5D4
E4C4 F3C1 G1C6 G8C3 H6C8 A5D5
E4C5 F3C2 G1C7 G8C4 H7C1 A5D6
E4C6 F3C3 G1C8 G8C5 H7C2 A5D7
E4C7 F3C4 G2C1 G8C6 H7C3 A5D8
E4C8 F3C5 G2C2 G8C7 H7C4 A6D1
E5C1 F3C6 G2C3 G8C8 H7C5 A6D2
E5C2 F3C7 G2C4 H1C1 H7C6 A6D3
E5C3 F3C8 G2C5 H1C2 H7C7 A6D4
E5C4 F4C1 G2C6 H1C3 H7C8 A6D5
E5C5 F4C2 G2C7 H1C4 H8C1 A6D6
E5C6 F4C3 G2C8 H1C5 H8C2 A6D7
E5C7 F4C4 G3C1 H1C6 H8C3 A6D8
E5C8 F4C5 G3C2 H1C7 H8C4 A7D1
E6C1 F4C6 G3C3 H1C8 H8C5 A7D2
E6C2 F4C7 G3C4 H2C1 H8C6 A7D3
E6C3 F4C8 G3C5 H2C2 H8C7 A7D4
E6C4 F5C1 G3C6 H2C3 H8C8 A7D5
E6C5 F5C2 G3C7 H2C4 A1D1 A7D6
A7D7 B6D4 C5D1 D3D6 E2D3 E8D8
A7D8 B6D5 C5D2 D3D7 E2D4 F1D1
A8D1 B6D6 C5D3 D3D8 E2D5 F1D2
A8D2 B6D7 C5D4 D4D1 E2D6 F1D3
A8D3 B6D8 C5D5 D4D2 E2D7 F1D4
A8D4 B7D1 C5D6 D4D3 E2D8 F1D5
A8D5 B7D2 C5D7 D4D4 E3D1 F1D6
A8D6 B7D3 C5D8 D4D5 E3D2 F1D7
A8D7 B7D4 C6D1 D4D6 E3D3 F1D8
A8D8 B7D5 C6D2 D4D7 E3D4 F2D1
B1D1 B7D6 C6D3 D4D8 E3D5 F2D2
B1D2 B7D7 C6D4 D5D1 E3D6 F2D3
B1D3 B7D8 C6D5 D5D2 E3D7 F2D4
B1D4 B8D1 C6D6 D5D3 E3D8 F2D5
B1D5 B8D2 C6D7 D5D4 E4D1 F2D6
B1D6 B8D3 C6D8 D5D5 E4D2 F2D7
B1D7 B8D4 C7D1 D5D6 E4D3 F2D8
B1D8 B8D5 C7D2 D5D7 E4D4 F3D1
B2D1 B8D6 C7D3 D5D8 E4D5 F3D2
B2D2 B8D7 C7D4 D6D1 E4D6 F3D3
B2D3 B8D8 C7D5 D6D2 E4D7 F3D4
B2D4 C1D1 C7D6 D6D3 E4D8 F3D5
B2D5 C1D2 C7D7 D6D4 E5D1 F3D6
B2D6 C1D3 C7D8 D6D5 E5D2 F3D7
B2D7 C1D4 C8D1 D6D6 E5D3 F3D8
B2D8 C1D5 C8D2 D6D7 E5D4 F4D1
B3D1 C1D6 C8D3 D6D8 E5D5 F4D2
B3D2 C1D7 C8D4 D7D1 E5D6 F4D3
B3D3 C1D8 C8D5 D7D2 E5D7 F4D4
B3D4 C2D1 C8D6 D7D3 E5D8 F4D5
B3D5 C2D2 C8D7 D7D4 E6D1 F4D6
B3D6 C2D3 C8D8 D7D5 E6D2 F4D7
B3D7 C2D4 D1D1 D7D6 E6D3 F4D8
B3D8 C2D5 D1D2 D7D7 E6D4 F5D1
B4D1 C2D6 D1D3 D7D8 E6D5 F5D2
B4D2 C2D7 D1D4 D8D1 E6D6 F5D3
B4D3 C2D8 D1D5 D8D2 E6D7 F5D4
B4D4 C3D1 D1D6 D8D3 E6D8 F5D5
B4D5 C3D2 D1D7 D8D4 E7D1 F5D6
B4D6 C3D3 D1D8 D8D5 E7D2 F5D7
B4D7 C3D4 D2D1 D8D6 E7D3 F5D8
B4D8 C3D5 D2D2 D8D7 E7D4 F6D1
B5D1 C3D6 D2D3 D8D8 E7D5 F6D2
B5D2 C3D7 D2D4 E1D1 E7D6 F6D3
B5D3 C3D8 D2D5 E1D2 E7D7 F6D4
B5D4 C4D1 D2D6 E1D3 E7D8 F6D5
B5D5 C4D2 D2D7 E1D4 E8D1 F6D6
B5D6 C4D3 D2D8 E1D5 E8D2 F6D7
B5D7 C4D4 D3D1 E1D6 E8D3 F6D8
B5D8 C4D5 D3D2 E1D7 E8D4 F7D1
B6D1 C4D6 D3D3 E1D8 E8D5 F7D2
B6D2 C4D7 D3D4 E2D1 E8D6 F7D3
B6D3 C4D8 D3D5 E2D2 E8D7 F7D4
F7D5 G6D2 H4D7 A3E4 B2E1 B8E6
F7D6 G6D3 H4D8 A3E5 B2E2 B8E7
F7D7 G6D4 H5D1 A3E6 B2E3 B8E8
F7D8 G6D5 H5D2 A3E7 B2E4 C1E1
F8D1 G6D6 H5D3 A3E8 B2E5 C1E2
F8D2 G6D7 H5D4 A4E1 B2E6 C1E3
F8D3 G6D8 H5D5 A4E2 B2E7 C1E4
F8D4 G7D1 H5D6 A4E3 B2E8 C1E5
F8D5 G7D2 H5D7 A4E4 B3E1 C1E6
F8D6 G7D3 H5D8 A4E5 B3E2 C1E7
F8D7 G7D4 H6D1 A4E6 B3E3 C1E8
F8D8 G7D5 H6D2 A4E7 B3E4 C2E1
G1D1 G7D6 H6D3 A4E8 B3E5 C2E2
G1D2 G7D7 H6D4 A5E1 B3E8 C2E3
G1D3 G7D8 H6D5 A5E2 B3E7 C2E4
G1D4 G8D1 H6D6 A5E3 B3E8 C2E5
G1D5 G8D2 H6D7 A5E4 B4E1 C2E6
G1D6 G8D3 H6D8 A5E5 B4E2 C2E7
G1D7 G8D4 H7D1 A5E6 B4E3 C2E8
G1D8 G8D5 H7D2 A5E7 B4E4 C3E1
G2D1 G8D6 H7D3 A5E8 B4E5 C3E2
G2D2 G8D7 H7D4 A6E1 B4E6 C3E3
G2D3 G8D8 H7D5 A6E2 B4E7 C3E4
G2D4 H1D1 H7D6 A6E3 B4E8 C3E5
G2D5 H1D2 H7D7 A6E4 B5E1 C3E6
G2D6 H1D3 H7D8 A6E5 B5E2 C3E7
G2D7 H1D4 H8D1 A6E6 B5E3 C3E8
G2D8 H1D5 H8D2 A6E7 B5E4 C4E1
G3D1 H1D6 H8D3 A6E8 B5E5 C4E2
G3D2 H1D7 H8D4 A7E1 B5E6 C4E3
G3D3 H1D8 H8D5 A7E2 B5E7 C4E4
G3D4 H2D1 H8D6 A7E3 B5E8 C4E5
G3D5 H2D2 H8D7 A7E4 B6E1 C4E6
G3D6 H2D3 H8D8 A7E5 B6E2 C4E7
G3D7 H2D4 A1E1 A7E6 B6E3 C4E8
G3D8 H2D5 A1E2 A7E7 B6E4 C5E1
G4D1 H2D6 A1E3 A7E8 B6E5 C5E2
G4D2 H2D7 A1E4 A8E1 B6E6 C5E3
G4D3 H2D8 A1E5 A8E2 B6E7 C5E4
G4D4 H3D1 A1E6 A8E3 B6E8 C5E5
G4D5 H3D2 A1E7 A8E4 B7E1 C5E6
G4D6 H3D3 A1E8 A8E5 B7E2 C5E7
G4D7 H3D4 A2E1 A8E6 B7E3 C5E8
G4D8 H3D5 A2E2 A8E7 B7E4 C6E1
G5D1 H3D6 A2E3 A8E8 B7E5 C6E2
G5D2 H3D7 A2E4 B1E1 B7E6 C6E3
G5D3 H3D8 A2E5 B1E2 B7E7 C6E4
G5D4 H4D1 A2E6 B1E3 B7E8 C6E5
G5D5 H4D2 A2E7 B1E4 B8E1 C6E6
G5D6 H4D3 A2E8 B1E5 B8E2 C6E7
G5D7 H4D4 A3E1 B1E6 B8E3 C6E8
G5D8 H4D5 A3E2 B1E7 B8E4 C7E1
G6D1 H4D6 A3E3 B1E8 B8E5 C7E2
C7E3 D5E8 E4E5 F3E2 G1E7 G8E4
C7E4 D6E1 E4E6 F3E3 G1E8 G8E5
C7E5 D6E2 E4E7 F3E4 G2E1 G8E6
C7E6 D6E3 E4E8 F3E5 G2E2 G8E7
C7E7 D6E4 E5E1 F3E6 G2E3 G8E8
C7E8 D6E5 E5E2 F3E7 G2E4 H1E1
C8E1 D6E6 E5E3 F3E8 G2E5 H1E2
C8E2 D6E7 E5E4 F4E1 G2E6 H1E3
C8E3 D6E8 E5E5 F4E2 G2E7 H1E4
C8E4 D7E1 E5E6 F4E3 G2E8 H1E5
C8E5 D7E2 E5E7 F4E4 G3E1 H1E6
C8E6 D7E3 E5E8 F4E5 G3E2 H1E7
C8E7 D7E4 E6E1 F4E6 G3E3 H1E8
C8E8 D7E5 E6E2 F4E7 G3E4 H2E1
D1E1 D7E6 E6E3 F4E8 G3E5 H2E2
D1E2 D7E7 E6E4 F5E1 G3E6 H2E3
D1E3 D7E8 E6E5 F5E2 G3E7 H2E4
D1E4 D8E1 E6E6 F5E3 G3E8 H2E5
D1E5 D8E2 E6E7 F5E4 G4E1 H2E6
D1E6 D8E3 E6E8 F5E5 G4E2 H2E7
D1E7 D8E4 E7E1 F5E6 G4E3 H2E8
D1E8 D8E5 E7E2 F5E7 G4E4 H3E1
D2E1 D8E6 E7E3 F5E8 G4E5 H3E2
D2E2 D8E7 E7E4 F6E1 G4E6 H3E3
D2E3 D8E8 E7E5 F6E2 G4E7 H3E4
D2E4 E1E1 E7E6 F6E3 G4E8 H3E5
D2E5 E1E2 E7E7 F6E4 G5E1 H3E6
D2E6 E1E3 E7E8 F6E5 G5E2 H3E7
D2E7 E1E4 E8E1 F6E6 G5E3 H3E8
D2E8 E1E5 E8E2 F6E7 G5E4 H4E1
D3E1 E1E6 E8E3 F6E8 G5E5 H4E2
D3E2 E1E7 E8E4 F7E1 G5E6 H4E3
D3E3 E1E8 E8E5 F7E2 G5E7 H4E4
D3E4 E2E1 E8E6 F7E3 G5E8 H4E5
D3E5 E2E2 E8E7 F7E4 G6E1 H4E6
D3E6 E2E3 E8E8 F7E5 G6E2 H4E7
D3E7 E2E4 F1E1 F7E6 G6E3 H4E8
D3E8 E2E5 F1E2 F7E7 G6E4 H5E1
D4E1 E2E6 F1E3 F7E8 G6E5 H5E2
D4E2 E2E7 F1E4 F8E1 G6E6 H5E3
D4E3 E2E8 F1E5 F8E2 G6E7 H5E4
D4E4 E3E1 F1E6 F8E3 G6E8 H5E5
D4E5 E3E2 F1E7 F8E4 G7E1 H5E6
D4E6 E3E3 F1E8 F8E5 G7E2 H5E7
D4E7 E3E4 F2E1 F8E6 G7E3 H5E8
D4E8 E3E5 F2E2 F8E7 G7E4 H6E1
D5E1 E3E6 F2E3 F8E8 G7E5 H6E2
D5E2 E3E7 F2E4 G1E1 G7E6 H6E3
D5E3 E3E8 F2E5 G1E2 G7E7 H6E4
D5E4 E4E1 F2E6 G1E3 G7E8 H6E5
D5E5 E4E2 F2E7 G1E4 G8E1 H6E6
D5E6 E4E3 F2E8 G1E5 G8E2 H6E7
D5E7 E4E4 F3E1 G1E6 G8E3 H6E8
H7E1 A5F6 B4F3 C2F8 D1F5 D8F2
H7E2 A5F7 B4F4 C3F1 D1F6 D8F3
H7E3 A5F8 B4F5 C3F2 D1F7 D8F4
H7E4 A6F1 B4F6 C3F3 D1F8 D8F5
H7E5 A6F2 B4F7 C3F4 D2F1 D8F6
H7E6 A6F3 B4F8 C3F5 D2F2 D8F7
H7E7 A6F4 B5F1 C3F6 D2F3 D8F8
H7E8 A6F5 B5F2 C3F7 D2F4 E1F1
H8E1 A6F6 B5F3 C3F8 D2F5 E1F2
H8E2 A6F7 B5F4 C4F1 D2F6 E1F3
H8E3 A6F8 B5F5 C4F2 D2F7 E1F4
H8E4 A7F1 B5F6 C4F3 D2F8 E1F5
H8E5 A7F2 B5F7 C4F4 D3F1 E1F6
H8E6 A7F3 B5F8 C4F5 D3F2 E1F7
H8E7 A7F4 B6F1 C4F6 D3F3 E1F8
H8E8 A7F5 B6F2 C4F7 D3F4 E2F1
A1F1 A7F6 B6F3 C4F8 D3F5 E2F2
A1F2 A7F7 B6F4 C5F1 D3F6 E2F3
A1F3 A7F8 B6F5 C5F2 D3F7 E2F4
A1F4 A8F1 B6F6 C5F3 D3F8 E2F5
A1F5 A8F2 B6F7 C5F4 D4F1 E2F6
A1F6 A8F3 B6F8 C5F5 D4F2 E2F7
A1F7 A8F4 B7F1 C5F6 D4F3 E2F8
A1F8 A8F5 B7F2 C5F7 D4F4 E3F1
A2F1 A8F6 B7F3 C5F8 D4F5 E3F2
A2F2 A8F7 B7F4 C6F1 D4F6 E3F3
A2F3 A8F8 B7F5 C6F2 D4F7 E3F4
A2F4 B1F1 B7F6 C6F3 D4F8 E3F5
A2F5 B1F2 B7F7 C6F4 D5F1 E3F6
A2F6 B1F3 B7F8 C6F5 D5F2 E3F7
A2F7 B1F4 B8F1 C6F6 D5F3 E3F8
A2F8 B1F5 B8F2 C6F7 D5F4 E4F1
A3F1 B1F6 B8F3 C6F8 D5F5 E4F2
A3F2 B1F7 B8F4 C7F1 D5F6 E4F3
A3F3 B1F8 B8F5 C7F2 D5F7 E4F4
A3F4 B2F1 B8F6 C7F3 D5F8 E4F5
A3F5 B2F2 B8F7 C7F4 D6F1 E4F6
A3F6 B2F3 B8F8 C7F5 D6F2 E4F7
A3F7 B2F4 C1F1 C7F6 D6F3 E4F8
A3F8 B2F5 C1F2 C7F7 D6F4 E5F1
A4F1 B2F6 C1F3 C7F8 D6F5 E5F2
A4F2 B2F7 C1F4 C8F1 D6F6 E5F3
A4F3 B2F8 C1F5 C8F2 D6F7 E5F4
A4F4 B3F1 C1F6 C8F3 D6F8 E5F5
A4F5 B3F2 C1F7 C8F4 D7F1 E5F6
A4F6 B3F3 C1F8 C8F5 D7F2 E5F7
A4F7 B3F4 C2F1 C8F6 D7F3 E5F8
A4F8 B3F5 C2F2 C8F7 D7F4 E6F1
A5F1 B3F6 C2F3 C8F8 D7F5 E6F2
A5F2 B3F7 C2F4 D1F1 D7F6 E6F3
A5F3 B3F8 C2F5 D1F2 D7F7 E6F4
A5F4 B4F1 C2F6 D1F3 D7F8 E6F5
A5F5 B4F2 C2F7 D1F4 D8F1 E6F6
E6F7 F5F4 G4F1 H2F6 A1G3 A7G8
E6F8 F5F5 G4F2 H2F7 A1G4 A8G1
E7F1 F5F6 G4F3 H2F8 A1G5 A8G2
E7F2 F5F7 G4F4 H3F1 A1G6 A8G3
E7F3 F5F8 G4F5 H3F2 A1G7 A8G4
E7F4 F6F1 G4F6 H3F3 A1G8 A8G5
E7F5 F6F2 G4F7 H3F4 A2G1 A8G6
E7F6 F6F3 G4F8 H3F5 A2G2 A8G7
E7F7 F6F4 G5F1 H3F6 A2G3 A8G8
E7F8 F6F5 G5F2 H3F7 A2G4 B1G1
E8F1 F6F6 G5F3 H3F8 A2G5 B1G2
E8F2 F6F7 G5F4 H4F1 A2G6 B1G3
E8F3 F6F8 G5F5 H4F2 A2G7 B1G4
E8F4 F7F1 G5F6 H4F3 A2G8 B1G5
E8F5 F7F2 G5F7 H4F4 A3G1 B1G6
E8F6 F7F3 G5F8 H4F5 A3G2 B1G7
E8F7 F7F4 G6F1 H4F6 A3G3 B1G8
E8F8 F7F5 G6F2 H4F7 A3G4 B2G1
F1F1 F7F6 G6F3 H4F8 A3G5 B2G2
F1F2 F7F7 G6F4 H5F1 A3G6 B2G3
F1F3 F7F8 G6F5 H5F2 A3G7 B2G4
F1F4 F8F1 G6F6 H5F3 A3G8 B2G5
F1F5 F8F2 G6F7 H5F4 A4G1 B2G6
F1F6 F8F3 G6F8 H5F5 A4G2 B2G7
F1F7 F8F4 G7F1 H5F6 A4G3 B2G8
F1F8 F8F5 G7F2 H5F7 A4G4 B3G1
F2F1 F8F6 G7F3 H5F8 A4G5 B3G2
F2F2 F8F7 G7F4 H6F1 A4G6 B3G3
F2F3 F8F8 G7F5 H6F2 A4G7 B3G4
F2F4 G1F1 G7F6 H6F3 A4G8 B3G5
F2F5 G1F2 G7F7 H6F4 A5G1 B3G6
F2F6 G1F3 G7F8 H6F5 A5G2 B3G7
F2F7 G1F4 G8F1 H6F6 A5G3 B3G8
F2F8 G1F5 G8F2 H6F7 A5G4 B4G1
F3F1 G1F6 G8F3 H6F8 A5G5 B4G2
F3F2 G1F7 G8F4 H7F1 A5G6 B4G3
F3F3 G1F8 G8F5 H7F2 A5G7 B4G4
F3F4 G2F1 G8F6 H7F3 A5G8 B4G5
F3F5 G2F2 G8F7 H7F4 A6G1 B4G6
F3F6 G2F3 G8F8 H7F5 A6G2 B4G7
F3F7 G2F4 H1F1 H7F6 A6G3 B4G8
F3F8 G2F5 H1F2 H7F7 A6G4 B5G1
F4F1 G2F6 H1F3 H7F8 A6G5 B5G2
F4F2 G2F7 H1F4 H8F1 A6G6 B5G3
F4F3 G2F8 H1F5 H8F2 A6G7 B5G4
F4F4 G3F1 H1F6 H8F3 A6G8 B5G5
F4F5 G3F2 H1F7 H8F4 A7G1 B5G6
F4F6 G3F3 H1F8 H8F5 A7G2 B5G7
F4F7 G3F4 H2F1 H8F6 A7G3 B5G8
F4F8 G3F5 H2F2 H8F7 A7G4 B6G1
F5F1 G3F6 H2F3 H8F8 A7G5 B6G2
F5F2 G3F7 H2F4 A1G1 A7G6 B6G3
F5F3 G3F8 H2F5 A1G2 A7G7 B6G4
B6G5 C5G2 D3G7 E2G4 F1G1 F7G6
B6G6 C5G3 D3G8 E2G5 F1G2 F7G7
B6G7 C5G4 D4G1 E2G6 F1G3 F7G8
B6G8 C5G5 D4G2 E2G7 F1G4 F8G1
B7G1 C5G6 D4G3 E2G8 F1G5 F8G2
B7G2 C5G7 D4G4 E3G1 F1G6 F8G3
B7G3 C5G8 D4G5 E3G2 F1G7 F8G4
B7G4 C6G1 D4G6 E3G3 F1G8 F8G5
B7G5 C6G2 D4G7 E3G4 F2G1 F8G6
B7G6 C6G3 D4G8 E3G5 F2G2 F8G7
B7G7 C6G4 D5G1 E3G6 F2G3 F8G8
B7G8 C6G5 D5G2 E3G7 F2G4 G1G1
B8G1 C6G6 D5G3 E3G8 F2G5 G1G2
B8G2 C6G7 D5G4 E4G1 F2G6 G1G3
B8G3 C6G8 D5G5 E4G2 F2G7 G1G4
B8G4 C7G1 D5G6 E4G3 F2G8 G1G5
B8G5 C7G2 D5G7 E4G4 F3G1 G1G6
B8G6 C7G3 D5G8 E4G5 F3G2 G1G7
B8G7 C7G4 D6G1 E4G6 F3G3 G1G8
B8G8 C7G5 D6G2 E4G7 F3G4 G2G1
C1G1 C7G6 D6G3 E4G8 F3G5 G2G2
C1G2 C7G7 D6G4 E5G1 F3G6 G2G3
C1G3 C7G8 D6G5 E5G2 F3G7 G2G4
C1G4 C8G1 D6G6 E5G3 F3G8 G2G5
C1G5 C8G2 D6G7 E5G4 F4G1 G2G6
C1G6 C8G3 D6G8 E5G5 F4G2 G2G7
C1G7 C8G4 D7G1 E5G6 F4G3 G2G8
C1G8 C8G5 D7G2 E5G7 F4G4 G3G1
C2G1 C8G6 D7G3 E5G8 F4G5 G3G2
C2G2 C8G7 D7G4 E6G1 F4G6 G3G3
C2G3 C8G8 D7G5 E6G2 F4G7 G3G4
C2G4 D1G1 D7G6 E6G3 F4G8 G3G5
C2G5 D1G2 D7G7 E6G4 F5G1 G3G6
C2G6 D1G3 D7G8 E6G5 F5G2 G3G7
C2G7 D1G4 D8G1 E6G6 F5G3 G3G8
C2G8 D1G5 D8G2 E6G7 F5G4 G4G1
C3G1 D1G6 D8G3 E6G8 F5G5 G4G2
C3G2 D1G7 D8G4 E7G1 F5G6 G4G3
C3G3 D1G8 D8G5 E7G2 F5G7 G4G4
C3G4 D2G1 D8G6 E7G3 F5G8 G4G5
C3G5 D2G2 D8G7 E7G4 F6G1 G4G6
C3G6 D2G3 D8G8 E7G5 F6G2 G4G7
C3G7 D2G4 E1G1 E7G6 F6G3 G4G8
C3G8 D2G5 E1G2 E7G7 F6G4 G5G1
C4G1 D2G6 E1G3 E7G8 F6G5 G5G2
C4G2 D2G7 E1G4 E8G1 F6G6 G5G3
C4G3 D2G8 E1G5 E8G2 F6G7 G5G4
C4G4 D3G1 E1G6 E8G3 F6G8 G5G5
C4G5 D3G2 E1G7 E8G4 F7G1 G5G6
C4G6 D3G3 E1G8 E8G5 F7G2 G5G7
C4G7 D3G4 E2G1 E8G6 F7G3 G5G8
C4G8 D3G5 E2G2 E8G7 F7G4 G6G1
C5G1 D3G6 E2G3 E8G8 F7G5 G6G2
G6G3 H4G8 A3H5 B2H2 B8H7 C7H4
G6G4 H5G1 A3H6 B2H3 B8H8 C7H5
G6G5 H5G2 A3H7 B2H4 C1H1 C7H6
G6G6 H5G3 A3H8 B2H5 C1H2 C7H7
G6G7 H5G4 A4H1 B2H6 C1H3 C7H8
G6G8 H5G5 A4H2 B2H7 C1H4 C8H1
G7G1 H5G6 A4H3 B2H8 C1H5 C8H2
G7G2 H5G7 A4H4 B3H1 G1H6 C8H3
G7G3 H5G8 A4H5 B3H2 C1H7 C8H4
G7G4 H6G1 A4H6 B3H3 C1H8 C8H5
G7G5 H6G2 A4H7 B3H4 C2H1 C8H6
G7G6 H6G3 A4H8 B3H5 C2H2 C8H7
G7G7 H6G4 A5H1 B3H6 C2H3 C8H8
G7G8 H6G5 A5H2 B3H7 C2H4 D1H1
G8G1 H6G6 A5H3 B3H8 C2H5 D1H2
G8G2 H6G7 A5H4 B4H1 C2H6 D1H3
G8G3 H6G8 A5H5 B4H2 C2H7 D1H4
G8G4 H7G1 A5H6 B4H3 C2H8 D1H5
G8G5 H7G2 A5H7 B4H4 C3H1 D1H6
G8G6 H7G3 A5H8 B4H5 C3H2 D1H7
G8G7 H7G4 A6H1 B4H6 C3H3 D1H8
G8G8 H7G5 A6H2 B4H7 C3H4 D2H1
H1G1 H7G6 A6H3 B4H8 C3H5 D2H2
H1G2 H7G7 A6H4 B5H1 C3H6 D2H3
H1G3 H7G8 A6H5 B5H2 C3H7 D2H4
H1G4 H8G1 A6H6 B5H3 C3H8 D2H5
H1G5 H8G2 A6H7 B5H4 C4H1 D2H6
H1G6 H8G3 A6H8 B5H5 C4H2 D2H7
H1G7 H8G4 A7H1 B5H6 C4H3 D2H8
H1G8 H8G5 A7H2 B5H7 C4H4 D3H1
H2G1 H8G6 A7H3 B5H8 C4H5 D3H2
H2G2 H8G7 A7H4 B6H1 C4H6 D3H3
H2G3 H8G8 A7H5 B6H2 C4H7 D3H4
H2G4 A1H1 A7H6 B6H3 C4H8 D3H5
H2G5 A1H2 A7H7 B6H4 C5H1 D3H6
H2G6 A1H3 A7H8 B6H5 C5H2 D3H7
H2G7 A1H4 A8H1 B6H6 C5H3 D3H8
H2G8 A1H5 A8H2 B6H7 C5H4 D4H1
H3G1 A1H6 A8H3 B6H8 C5H5 D4H2
H3G2 A1H7 A8H4 B7H1 C5H6 D4H3
H3G3 A1H8 A8H5 B7H2 C5H7 D4H4
H3G4 A2H1 A8H6 B7H3 C5H8 D4H5
H3G5 A2H2 A8H7 B7H4 C6H1 D4H6
H3G6 A2H3 A8H8 B7H5 C6H2 D4H7
H3G7 A2H4 B1H1 B7H6 C6H3 D4H8
H3G8 A2H5 B1H2 B7H7 C6H4 D5H1
H4G1 A2H6 B1H3 B7H8 C6H5 D5H2
H4G2 A2H7 B1H4 B8H1 C6H6 D5H3
H4G3 A2H8 B1H5 B8H2 C6H7 D5H4
H4G4 A3H1 B1H6 B8H3 C6H8 D5H5
H4G5 A3H2 B1H7 B8H4 C7H1 D5H6
H4G6 A3H3 B1H8 B8H5 C7H2 D5H7
H4G7 A3H4 B2H1 B8H6 C7H3 D5H8
D6H1 E3H8 F1H7 F7H6 G5H5 H3H4
D6H2 E4H1 F1H8 F7H7 G5H6 H3H5
D6H3 E4H2 F2H1 F7H8 G5H7 H3H6
D6H4 E4H3 F2H2 F8H1 G5H8 H3H7
D6H5 E4H4 F2H3 F8H2 G6H1 H3H8
D6H6 E4H5 F2H4 F8H3 G6H2 H4H1
D6H7 E4H6 F2H5 F8H4 G6H3 H4H2
D6H8 E4H7 F2H6 F8H5 G6H4 H4H3
D7H1 E4H8 F2H7 F8H6 G6H5 H4H4
D7H2 E5H1 F2H8 F8H7 G6H6 H4H5
D7H3 E5H2 F3H1 F8H8 G6H7 H4H6
D7H4 E5H3 F3H2 G1H1 G6H8 H4H7
D7H5 E5H4 F3H3 G1H2 G7H1 H4H8
D7H6 E5H5 F3H4 G1H3 G7H2 H5H1
D7H7 E5H6 F3H5 G1H4 G7H3 H5H2
D7H8 E5H7 F3H6 G1H5 G7H4 H5H3
D8H1 E5H8 F3H7 G1H6 G7H5 H5H4
D8H2 E6H1 F3H8 G1H7 G7H6 H5H5
D8H3 E6H2 F4H1 G1H8 G7H7 H5H6
D8H4 E6H3 F4H2 G2H1 G7H8 H5H7
D8H5 E6H4 F4H3 G2H2 G8H1 H5H8
D8H6 E6H5 F4H4 G2H3 G8H2 H6H1
D8H7 E6H6 F4H5 G2H4 G8H3 H6H2
D8H8 E6H7 F4H6 G2H5 G8H4 H6H3
E1H1 E6H8 F4H7 G2H6 G8H5 H6H4
E1H2 E7H1 F4H8 G2H7 G8H6 H6H5
E1H3 E7H2 F5H1 G2H8 G8H7 H6H6
E1H4 E7H3 F5H2 G3H1 G8H8 H6H7
E1H5 E7H4 F5H3 G3H2 H1H1 H6H8
E1H6 E7H5 F5H4 G3H3 H1H2 H7H1
E1H7 E7H6 F5H5 G3H4 H1H3 H7H2
E1H8 E7H7 F5H6 G3H5 H1H4 H7H3
E2H1 E7H8 F5H7 G3H6 H1H5 H7H4
E2H2 E8H1 F5H8 G3H7 H1H6 H7H5
E2H3 E8H2 F6H1 G3H8 H1H7 H7H6
E2H4 E8H3 F6H2 G4H1 H1H8 H7H7
E2H5 E8H4 F6H3 G4H2 H2H1 H7H8
E2H6 E8H5 F6H4 G4H3 H2H2 H8H1
E2H7 E8H6 F6H5 G4H4 H2H3 H8H2
E2H8 E8H7 F6H6 G4H5 H2H4 H8H3
E3H1 E8H8 F6H7 G4H6 H2H5 H8H4
E3H2 F1H1 F6H8 G4H7 H2H6 H8H5
E3H3 F1H2 F7H1 G4H8 H2H7 H8H6
E3H4 F1H3 F7H2 G5H1 H2H8 H8H7
E3H5 F1H4 F7H3 G5H2 H3H1 H8H8
E3H6 F1H5 F7H4 G5H3 H3H2
E3H7 F1H6 F7H5 G5H4 H3H3
上述多肽可以进一步含有选自SEQ ID NO：81至89的一个或多个序列。
本发明还提供一种组合物，包含本文以上限定的多个相同或不同的多肽和生理学上可接受的载体。该组合物可以是干燥组合物，并且该干燥组合物可以是冻干形式或喷雾干燥形式。
在进一步方面，本发明涉及一种具有冰结合活性并且能够减少或抑制冰晶体的生长和/或形成的多肽，
其中所述多肽含有序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)，
其中，X1选自氨基酸残基S、A、G和D；
X2选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
X3选自非大体积氨基酸残基；
X4选自氨基酸残基S、I、T和V；
X5选自氨基酸残基S、A、I和T；
X6选自氨基酸残基S、T和V；
X7选自非大体积氨基酸残基；
X8选自氨基酸残基S、T和V；
X9选自氨基酸残基S、A和G；并且
其中SEQ ID NO：1的X2、X4、X6和X8中至少一个残基是T或V；以及
其中该多肽的氨基酸残基的总数小于250。
序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)在本文中指通用“冰结合域”。所述域是直接参与冰结合还是仅间接地参与冰结合(即需要它来使多肽具有冰结合活性)对于该定义是不重要的。
本发明进一步涉及一种多肽，其包含多个通用“冰结合域”，例如具有与SEQ ID NO：90基本同源/一致的序列。在这方面，与SEQ ID NO：90基本同源应包括与SEQ ID NO：90的序列相比，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9仅一个或最多两个位置不同的任意序列。
此处使用的多个应该包括整数2、3、4、5、6、7、8、8、9，例如小于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，例如小于25，其中所述多个通用“冰结合域”中的任一个可以与SEQ ID NO：90相同或基本相同或基本同源。
本发明还涉及本发明多肽的修饰物和衍生物，其含有SEQ ID NO：90的一个或多个副本，并且可选择地进一步含有SEQ ID NO：90的一个或多个拷贝或与其基本相同或基本同源的序列。
术语“分离的多肽”表明本发明的多肽至少本质上没有受到与该多肽自然相关的细胞成分的污染。
本发明的多肽可以表达为融合多肽。这种融合多肽可以发挥很多功能，例如辅助多肽在活性构象中的纯化和/或生产。融合多肽的一个实例是本发明的多肽与亲和标签融合。融合多肽还可以形成本文定义的补体/抗补体对的一部分，但这个术语不是仅限于多肽。多肽的变化，如本文定义的剪接变体、等位基因变体、直系同源体和旁系同源体也属于本发明的范围。融合多肽的实例在下文将有更详细的描述。
本发明的多肽可以用可检测的标记物标记，例如荧光检测标记。这可以帮助实践者分离或鉴别本发明的多肽。
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸；多核苷酸构建体，如含有所述核苷酸的线性或环形形式的载体；用所述多核苷酸或含有所述核苷酸的载体转染的宿主细胞；以及含有所述宿主细胞的转基因生物。
除非另有说明，多核苷酸可以与“核酸”和“核酸分子”相互交换使用。原则上，本发明可以使用这种多肽或该多肽的补体，例如cDNA或“反义寡核苷酸”的形式。所述多肽可以是个别核苷酸的简并序列，只要该多核苷酸编码本发明的多肽。
该多核苷酸不需要包含从自然宿主生物中分离的天然基因的所有单个核苷酸。那些天然基因的任意截断，包括与天然基因有至少75％同源或相同的序列，例如至少80％同源或相同，例如至少85％同源或相同，例如至少90％同源或相同，例如至少91％同源或相同，例如至少92％同源或相同，例如至少93％同源或相同，例如至少94％同源或相同，例如至少95％同源或相同，例如至少96％同源或相同，例如至少97％同源或相同，例如至少98％同源或相同，例如至少99％同源或相同，例如至少99.5％同源或相同，都应被本发明涵盖。天然基因的任意此类功能性截断，包括它的能够在适当的宿主生物中表达的任意衍生或修饰，都应表示“结构基因”。
例如，当多核苷酸序列在克隆载体中克隆或者将表达载体引入宿主生物并表达时，就可以实现表达。表达适当地受到调控序列的指示，调控序列通常含有启动子，启动子可能又含有一些元件，例如核心启动子以及一个或多个调控元件，包括表达的增强子。
宿主生物通常是重组宿主，即非天然地具有待表达的多核苷酸序列的宿主、或非天然地含有可操作地连接天然表达信号的待表达的多核苷酸序列的宿主。当处于分泌信号序列之后时，本发明的多肽进行分泌-不管这种分泌是否需要发生。
为了清楚阐明，本发明的多肽将称为“分离的”多肽，以便与天然环境中的相同或相关的多肽进行区分。类似地，本文定义的术语“异源多核苷酸”表示一种多核苷酸或多核苷酸构建体，其不同于本发明多肽的天然形式。本发明的多肽在染色体上可以是整合或游离的。
本发明还提供特异性针对本发明多肽的抗体或其结合片段。该抗体可以通过任意现有方法来生产，并且该抗体可以是：例如裸抗体、抗体的结合片段、抗体成分、抗独特型抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
本发明的范围内还提供用于生产和使用a)本发明的多核苷酸、b)本发明的多肽、以及c)本发明的特异性针对所述多肽的抗体的方法。本发明的抗体可用于从大量多肽中识别或划分本文定义的“目标多肽”或“目标肽”。“目标肽”可以是本文定义的抗原肽。
在进一步方面，本发明提供含有本发明的多肽和/或抗体的固体载体，以及制备和使用这种固体载体的方法。
附图简要说明
图1说明了R.Inquisitor AFP的片段的氨基酸序列。推定的冰结合基序(motif)用黑框标示。正向(F)和反向(R)引物都提供了序列，多肽的部分的来源也已标示。该氨基酸序列具有代表或隐藏冰结合(IB)基序的域(一致的A/G-Q/R-G-T-A-T-T-T-A-T-G-X-A/G)，其重复X次并且被1-8个氨基酸残基隔开。
图2说明R.mordax.的AFPs 1-8的全长cDNA序列。划线的是推定的信号肽的编码序列。与这些cDNA对应的AFP(AFP 1-8)主要在它们的N-端部分有差异，其中AFP4似乎没有信号序列。这些AFP各自含有8个重复的氨基酸序列，核心一致的序列为T-A-T-T-T-A-T。这与R.inquisitor同样观察到的推定IB-基序部分相匹配(图1)，并且可以设想这代表R.mordax的IB基序、或至少是它的一部分。
图3：Rhagium mordax的AFP 1-8的全长氨基酸序列。这些序列分别表示为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8。推定的信号序列用下划线标示，并且推定的冰结合基序用框标示。
图4显示具有克隆到表达载体pET26B(+)的全长cDNA的E.coli细胞。IPTG可以用来诱导相关的AFP的合成。起初我们在E.coli中诱导AFP1的合成。结果表明E.coli中产生的AFP1赋予了E.coli细胞耐冻能力。
图5说明野生型(wt)同工型RmAFP1和缺失变体(Δ2-9，WC(Trp-Cys))的SDS-PAGE凝胶。RmAFP变体构建为RmAFP1(Δ2-Δ9)的C-端的冰结合域缺失，每次一个(例如Δ4表明推定的冰结合域4-9(见图2)已经缺失)，而在C-端(WC)含有Trp和Cys残基的变体。将这些克隆到pGEX载体系统(GE Healthcare)并在E.coli(菌株：Origami，BL21)中转化。蛋白质被表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，其在GST与RmAFP之间含有凝血酶裂解位点。
图6显示“冰生长-激增”的进展，其在滞后冰点时出现在1)RmAFP1的溶液中和2)粘鱼类Zoarces viviparous(带有3型AFP的丹麦鱼)的血清中。在这两种情况下，在温度降低前小的冰晶体可以在溶液中退火。当降低RmAFP溶液的温度时，最初的冰晶体(箭头1A)在滞后冰点到达前没有生长或改变形状。在滞后冰点(1B)时，冰晶体爆发，并且溶液因超冷的环境而冻结。请注意，在这种情况下，滞后冰点下的冰生长模式是菜花状(1B，1C)。这与冷却时冰晶体缓慢变形并变为带有六角基面(2A)的双棱锥的情形(见2)(Z.viviparus血清)形成对比。在滞后冰点下，冰生长是针骨状(2B)，并且所有的冰在溶液中以针骨状生长(2C)。
图7显示克隆和纯化的Rhagium mordax AFP1的分子量测定。
图8显示rRmAFP1的二聚化。A：在原生条件下，rRmAFP表现为二聚体，因为当它通过体积排阻柱(Superdex 75，10/30，GE Healthcare)时，它具有比其他相同Mw范围的蛋白更短的保留时间。当Superdex 75用牛血清白蛋白(68KDa，BSA)、胰蛋白酶(25KDa)和人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(13KDa)校准时，从SEC评估rRmAFP1的Mw为28KDa。B：类似地，RmAFP表现为二聚体，当在跑SDS PAGE时得到预估的28KDa的Mw。第一泳道1：牛血清白蛋白(BSA)；2：胰蛋白酶；3：RNAse A；4：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；5：溶菌酶；6：RmAFP1；7：谷胱甘肽S转移酶(GST)。
图9显示本发明的多肽的圆二色光谱(CD)。
图10显示在温度范围6-100℃中RmAFP1的温度稳定性，接着在温度范围6-70℃进行11次扫描。
图11显示pH对RmAFP1的活性和稳定性的影响。
定义
通过与冰晶体结合并抑制晶体生长，抗冻蛋白非依数性地降低了溶液的冻结温度，但该蛋白仅通过依数性效应改变溶液的融化温度。这种热滞后(冻结和融化温度之间的差异)是通过观察温度对单冰晶体生长的影响来确定。当冰晶体的面变成圆形时，发生融化；当冰晶体沿着其c-轴伸长时，发生冻结。
因此，术语“抗冻活性”指融化和冻结温度之间的分隔。它也指融点和冰点之间的差异。它进一步指在高于再结晶温度的温度下以小晶体为代价，抑制大晶体的形成。术语抗冻活性可以与热滞后互换使用。
本文使用的“核酸”或“核酸分子”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段、以及通过任意连接、裂解、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。多核苷酸分子可以由天然产生的核苷酸单体(例如DNA和RNA)、或天然产生的核苷酸的类似物(如天然产生的核苷酸的α-对映体形式)、或两者的结合来构成。修饰的核苷酸可以在糖基和/或嘧啶或嘌呤碱基基团中变化。例如，糖修饰包括用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者糖可以官能化为醚或酯、此外，整个糖基团可以用空间位阻和电子上类似的结构取代，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基基团修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶、或其他众所周知的杂环取代。多核苷酸单体可以通过磷酸二酯键或这些键的类似物来连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸盐(phosphoroselenoate)、phosphorodiselenoate、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽多核苷酸”，其包含天然形成的或修饰的与聚酰胺骨架相连的多核苷酸基。多核苷酸可以是单链或双链的。
术语“多核苷酸分子的补体”指与参考核苷酸序列相比具有互补核苷酸序列并且反转方向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
术语“简并核苷酸序列”表示与编码该多肽的参考多核苷酸分子相比，含有一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三连体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三连密码子各自编码Asp)。
术语“结构基因”指转录到信使RNA(mRNA)中的多核苷酸分子，然后被翻译成特定多肽性质的氨基酸序列。
“分离的多核苷酸分子”是没有被整合在生物基因组DNA中的多核苷酸分子。例如，编码从细胞基因组DNA中分离出来的生长因子的DNA分子就是一种分离的DNA分子。分离的多核苷酸分子的另一个实例是未整合到生物的基因组中的化学合成的多核苷酸分子。从具体物种中分离的多核苷酸分子小于来自该物种的染色体的完整DNA分子。
“核酸分子构建体”是单链或双链的多核苷酸分子，其通过人工干预进行修饰，以便含有以自然界不存在的排列方式进行组合和并列的多核苷酸的片段。
“线性DNA”表示具有游离5′端和3′端的非环状DNA分子。线性DNA可以由闭合的环状DNA分子(例如质粒)通过酶消化或物理中断来制备。
“互补DNA(cDNA)”是由mRNA模板通过逆转录酶形成的单链DNA分子。通常，采用与部分mRNA互补的引物来引发逆转录。本领域的技术人员也用术语“cDNA”表示由这种单链DNA分子与它的互补DNA链组成的双链。术语“cDNA”还表示由RNA模板合成的cDNA分子的克隆体。
“启动子”是引导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码区，接近结构基因的转录起始位点。在转录起始中发挥作用的启动子中的序列元件通常特点是有一致的核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化-特异性元件(DSE；McGehee et al.，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环磷酸腺反应元件(CRE)、血清反应元件(SRE；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))、糖皮质激素反应元件(GRE)、以及用于其他转录因子的结合位点，如CRE/ATF(O′Reilly et al.，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye et al.，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP反应元件结合多肽(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))以及八聚体因子(总体见Watson et al.，eds.，Molecular Biology of the Gene，4th ed.(The Benjamin/Cummings PublishingCompany，Inc.1987)和Lemaigre and Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))。如果启动子是诱导型启动子，则作为对诱导剂的响应，转录的速率增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录的速率不能通过诱导剂调控。阻抑型启动子也是已知的。
“核心启动子”含有启动子功能(包括TATA盒和开始转录)的基本核苷酸序列。通过这个定义，在缺乏特定序列的情况下，核心启动子可能具有或不具有检测活性，特定序列可增强该活性或赋予组织特异性活性。
“调控元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包括与细胞因子结合的核苷酸序列，使转录能够专门地或优选地在特定的细胞、组织或细胞器中进行。这些类型的调控元件通常与以“细胞-特异性”、“组织-特异性”或“细胞器-特异性”方式表达的基因有关。
“增强子”是一类可以增加转录效率的调控元件，不管增强子相对于转录起始位点的距离或方向如何。
“异源性DNA”指在给定的宿主细胞内非天然存在的DNA分子、或DNA分子群。特定宿主细胞的异源性DNA分子可能含有来源于宿主细胞物种的DNA(即内源性DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即外源性DNA)结合。例如，编码多肽的非宿主DNA片段可操作地与含有转录启动子的宿主DNA片段连接，则含有该非宿主DNA片段的DNA分子视为异源性DNA分子。反过来说，异源性DNA分子可以含有与外源性启动子可操作地连接的外源性基因。再举个例子，如果将DNA分子引入缺少野生型基因的突变细胞中，则含有源于野生型细胞的基因的DNA分子视为异源性DNA。
“多肽”是优选地仅通过肽键连接的氨基酸残基的聚合体，或天然产生或者合成产生。通过非宿主DNA分子的表达而产生的多肽是“异源性”肽或多肽。
“氨基酸残基”可以是与肽键或不同于肽键的键相连的天然或非天然的氨基酸残基。氨基酸残基可以是D-构型或L-构型。
“均聚物”是通过将几个相似的多肽添加到一原始多肽中而组成的多肽，由此将相同多肽的多个拷贝形成为一个较大的多肽。
“杂聚物”是通过将几个不同的多肽添加到一原始多肽中而组成的多肽，由此将不同多肽的多个拷贝形成为一个较大的多肽。
“非大体积氨基酸残基”优选地是天然氨基酸，不包括具有环状(脂肪族或芳香族)侧链的氨基酸，如Pro、Phe、Trp、Tyr和His，或者有长的或分支的脂肪族侧链的氨基酸，如Arg、Lys、Leu、Ile、Met和Val，或者更一般地说，大体积氨基酸具有至少含3个碳原子的侧链，这些碳原子连接并形成分支或无分支的侧链。目前“非大体积氨基酸”的优选实例包括Gly、Ala和Ser。
“本发明的多肽”是指本专利申请或在本专利申请权利要求基础上的授权专利的权利要求中引用的任意多肽。
“本发明的多核苷酸”或“本发明的核苷酸”是任意的编码“本发明的多肽”的多核苷酸，该多肽包括本专利申请或在本专利申请权利要求基础上的授权专利的权利要求中引用的任意多肽。
“整合的遗传元件”是通过人工操作将元件引入宿主细胞后，掺入宿主细胞染色体中的DNA片段。在本发明中，整合的基因元件最常见的是来源于经由电穿孔或其他技术引入细胞的线形质粒。整合的遗传元件从原始宿主细胞传给它的后代。
“克隆载体”是一种在宿主细胞中具有自主复制能力的多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、或噬菌体。克隆载体通常包含一个或少数限制性内切酶识别位点，其使多核苷酸分子以确定的方式插入，而不损失载体的重要生理功能；以及编码标记基因的核苷酸序列，该标记基因适用于识别和筛选用该克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄西林抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的多核苷酸分子。通常，表达载体包括转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常是位于控制启动子下游。所述基因被认为是“可操作地连接到”该启动子。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件和核心启动子可操作地连接。
“重组宿主”是含有异源性多核苷酸分子(如克隆载体或表达载体)的细胞。
“整合的转化体”是重组的宿主细胞，其中异源性DNA已经被整合到该细胞的基因组DNA中。
“融合多肽”是由含有至少两种基因的核苷酸序列的多核苷酸分子表达的杂交多肽。例如，融合多肽可以包括至少部分本发明的多肽与结合亲和基质的多肽相融合。这种融合多肽提供一种采用亲和层析来分离大量本发明的多肽的手段。
术语“分泌信号序列”表示编码一种肽(“分泌肽”)的DNA序列，其作为更大多肽的一个组成部分，指导更大的多肽通过细胞中合成的分泌途径。在运输穿过该分泌途径期间，该更大的多肽常常被分切以除去分泌肽。
“分离的多肽”是基本没有受到细胞成分，例如碳水化合物、脂质或其他与天然多肽有关的多肽类杂质污染的多肽。通常，制备分离的多肽包括高纯度形式的多肽，即至少约80％纯度，至少约90％纯度，至少约95％纯度，大于95％纯度，或大于99％纯度。一种显示特定多肽制剂含有分离的多肽的方式是：多肽制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶的考马斯亮蓝染色中显示单条带。然而，术语“分离的”不排除相同多肽以替换的物理形式出现，例如二聚体或替代的糖基化或衍生化的形式。
术语“氨基-末端”和“羧基-末端”在本文用于表示多肽中的位置。在上下文允许的情况下，这些术语是针对多肽的特定序列或部分使用，以表示接近或相对的位置。例如，位于多肽中参考序列羧基端的某一序列就是位于接近该参考序列的羧基端，但不一定是在整个多肽的羧基端。
术语“表达”指基因产品的生物合成。例如，以结构基因为例，表达包括将结构基因转录到mRNA以及将mRNA翻译成一个或多个多肽。
术语“剪接变体”在本文中用来表示从一种基因转录的RNA的替换形式。通过使用转录的RNA分子内的、或者较少见的是独立转录的RNA分子之间的替换剪接位点，剪接变异自然地产生。剪接变体可编码含有改变的氨基酸序列的多肽。术语剪接变体在本文中还用来表示由转录自一种基因的mRNA的剪接变体所编码的多肽。
术语“补体/抗补体对”表示在适当条件下形成非共价连接的稳定对的非同一的基团。例如，生物素和亲合素(或链亲合素)是补体/抗补体对的原型成员。其他示范性的补体/抗补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、正义/反义多核苷酸对，等等。当需要随后分离补体/抗补体对时，该补体/抗补体对优选地具有小于109M-1的结合亲和度。
“抗独特型抗体”是与免疫球蛋白的可变区域相结合的抗体。在本说明书中，抗独特型抗体与抗-抗体的可变区结合，因此，抗独特型抗体类似于本发明多肽的表位。
“抗体片段”是抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等。无论结构如何，抗体片段与完整抗体识别的相同抗原相结合。例如，抗-(本发明多肽)单克隆抗体片段结合本发明多肽的表位。
术语“抗体片段”还包括与特异性抗原结合的合成的或基因工程多肽，例如由轻链可变区组成的多肽，由轻链和重链的可变区、重组单链多肽分子组成的“Fv”片段，其中重链和轻链通过肽连接头(“scFv多肽”)相连，以及由类似于高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
“嵌合抗体”是一种重组多肽，其含有来自鼠抗体的可变域和互补决定区，而抗体分子的其余部分来自人抗体。
“人源化抗体”是一种重组多肽，其中单克隆抗体的鼠互补决定区已经从鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移至人可变域。
“检测标记”是一种分子或原子，其可以与抗体基团偶联以产生对诊断有用的分子。检测标记的实例包括螯合剂、光活性剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁离子或其他标记基团。
术语“亲和标签”在本文中用于表示可以连接到第二多肽上的多肽片段，以为第二多肽的纯化或检测做好准备，或者为第二多肽与底物的连接提供位点。原则上，抗体或其他特定结合剂可得的任意肽或多肽都可用作亲和标签。亲和标签包括聚组氨酸道、多肽A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smithand Johnson，Gene 67：31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204(1988))、链亲和素结合肽、或其他抗原表位或结合域。总体见Ford et al.，polypeptide Expression and Purification 2：95(1991)。编码亲和标签的DNA可从商业供应商获得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)。
“裸抗体”是一种与抗体片段形成对照的完整抗体，其不与治疗剂偶联。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体，如嵌合抗体和人源化抗体。
本文使用的术语“抗体成分”包括整个抗体和抗体片段。
“目标多肽”或“目标肽”是包括至少一个表位并且在靶细胞(如肿瘤细胞)或携带传染原抗原的细胞上表达的氨基酸序列。T细胞识别目标多肽或目标肽的主要组织相容性复合体分子提呈的表位，并通常溶解靶细胞或将其他免疫细胞吸收到靶细胞的位点，由此杀灭该靶细胞。
“抗原肽”是一种肽，它与主要组织相容性复合体分子结合以形成由T细胞识别的MHC-肽复合物，从而在提呈给T细胞时诱导细胞毒性淋巴细胞应答。因此，抗原肽能够结合适宜的主要组织相容性复合体分子并诱导细胞毒性T细胞应答，例如针对靶细胞的细胞溶解或特定细胞因子释放，该靶细胞结合或表达抗原。在I类或II类主要组织相容性复合体分子的背景下，抗原肽可以结合在抗原提呈细胞或靶细胞上。
在真核生物中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录以生成mRNA。多核苷酸分子可以设计为含有RNA聚合酶II模板，其中RNA转录具有与特定mRNA互补的序列。RNA转录称作“反义RNA”，编码该反义RNA的多核苷酸分子称为“反义基因”。反义RNA分子能够与mRNA分子结合，产生对mRNA翻译的抑制。
“特异性针对编码本发明多肽的多核苷酸的反义寡核苷酸”是指具有序列(a)能够用编码本发明多肽的部分基因形成稳定的三重体，或(b)能够用该基因的部分mRNA转录形成稳定的二重体的寡核苷酸。
术语“变异基因”指编码多肽的多核苷酸分子，该多肽具有本发明多肽修饰后的氨基酸序列。这些变体包括本发明基因的自然发生的多形性，以及含有本发明多肽的氨基酸序列的保守氨基酸替换的合成基因。另外的基因变异形式是含有本文所述核苷酸序列的插入或缺失的多核苷酸分子。本发明的变异基因可以通过确定该基因在严格条件下是否与本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子、或其补体进行杂交来鉴别。
此外，变异基因可以通过序列比对来鉴别。如果对齐时两个氨基酸序列的氨基酸残基相同达到最大的一致性，则两个氨基酸序列具有“100％氨基酸序列同一性”。类似地，如果对齐时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同达到最大的一致性，则两个核苷酸序列具有“100％核苷酸同一性”。序列比对可以通过标准软件程序来完成，例如由DNASTAR(Madison，Wis.)生产的LASERGENE生物信息学计算套件中包含的那种程序。其他的通过确定最佳比对来比较两个核苷酸或氨基酸序列的方法也是本领域技术人员熟知的(例如，见Peruski and Peruski，The Intemet and the New Biology：Tools for Genomicand Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)，Wu et al.(eds.)，″InformationSuperhighway and Computer Databases of polynucleotides and polypeptides，″Methods in Gene Biotechnology，pages 123-151(CRC Press，Inc.1997)，Bishop(ed.)，Guide to Human Genome Computing，2nd Edition(Academic Press，Inc.1998))。以下描述确定序列同一性的具体方法。
与识别变异基因的具体方法无关，变异基因编码一种多肽，该多肽的特征在于它能够与抗-(本发明的多肽)抗体特异性地结合。
术语“等位变体”在本文用于表示占据相同染色体位点的基因的任意两种或多种替换形式。等位变体通过突变自然地产生，并且可导致种群内的表型多态形。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没发生变化)，或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体在本文中也用于表示由基因的等位变体编码的多肽。
术语“直系同源体”表示一种多肽或来自一种物种的多肽，其功能性对应于一种多肽或来自不同物种的多肽。直系同源体之间的序列差异是物种形成的结果。
“旁系同源体”是由生物体制得的明显不同的、但结构上有关的多肽。旁系同源体被认为是通过基因复制产生。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌红蛋白互为旁系同源体。
由于标准分析方法的不精确性，聚合体的分子量和长度理解为近似值。当这些值表述为“约”X或“近似”X时，所称的X值应理解为精确到+/-20％，例如+/-10％，例如+/-5％。
发明详细说明
本发明在一种实施方式中提供分离的多肽，该多肽含有或者其组成为选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列，或者与所述序列任一项有至少75％同一性的序列，其中所述多肽能够减少或抑制冰晶体的形成和/或生长，或其片段能够减少或抑制冰晶体的形成和/或生长。
本发明还提供一种含有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸可以进一步含有表达信号，该表达信号能够在适当的宿主细胞中指导编码本发明多肽的核苷酸序列的表达。本发明还提供一种含有本发明的多核苷酸的载体，该多核苷酸能够表达本发明的多肽。一种分离的重组细胞，可以含有本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的多肽。
本发明还提供一种含有本发明的多肽的食用产品，其中该食用产品可以是冻结的，或者是冷冻甜食产品的形式，例如冰淇淋产品、或面包。
本发明提供的非食品应用的实例是含有本发明的多肽的固体载体材料。
本发明还涉及制备或使用本发明的多肽的方法，在一种实施方式中包括生产本发明的多肽的方法，所述方法包括步骤：
i)提供本发明的多核苷酸或本发明的载体，
ii)通过步骤i)中提供的多核苷酸的重组表达，提供适用于生产本发明的多肽的宿主细胞，
iii)生产本发明的多肽，以及可选地
iv)纯化和/或分离所述多肽。
当原位生产本发明的多肽时，本发明提供一种方法，包括步骤：
i)提供可发酵的起始原料，
ii)提供微生物，其能够使所述可发酵的食品起始原料发酵，并且发酵所述可发酵的食品起始原料时能够在适宜条件下产生本发明的多肽，
iii)在所述微生物的存在下发酵所述食品起始原料，由此产生发酵的食用产品，其中所述发酵的食用产品含有本发明的多肽。
在进一步的实施方式中，本发明提供以下方法：
一种减少或抑制冷冻食用产品中冰晶体形成的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此减少或抑制该冷冻食用产品中的冰晶体形成。
一种减少或抑制冷冻食用产品中冰晶体生长的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此减少或抑制该冷冻食用产品中的冰晶体生长。
一种在冷冻食用产品中构建冰晶体的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此在该冷冻食用产品中构建冰晶体。
一种调节冷冻食用产品的质地或感官性质的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此调节冷冻食用产品的质地或感官性质。
一种监测冷冻食用产品的生产或储存期间的冰晶体形成的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
iii)监测该冷冻食用产品的生产或储存期间的不同时间点的冰晶体形成。
一种在雌性个体中进行体外受精(IVF)处理的方法，所述方法包括步骤：从雌性个体中移取一个或多个卵细胞，可选择地连同包含卵泡液的生物样本一起移取；在本发明多肽的存在下，冷冻该一个或多个卵细胞，可选择地连同生物样本一起冷冻；使一个或多个移取的卵细胞在体外受精；以及将一个或多个受精的卵细胞植入该雌性个体中。
一种增加雌性个体怀孕的可能性或几率的方法，所述方法包括步骤：从雌性个体中移取一个或多个卵细胞，可选择地连同含有卵泡液的生物样本一起移取；在本发明多肽的存在下，冷冻该一个或多个卵细胞，可选择地连同该生物样本一起冷冻；使一个或多个移取的卵细胞在体外受精；以及将一个或多个受精的卵细胞植入该雌性个体中，其中在本发明多肽的存在下冷冻该一个或多个卵细胞减少了冰晶体在卵细胞上或者卵细胞存在的环境中的生长和/或形成，从而增加怀孕的可能性或机率。
该样本可以进一步包含颗粒黄体细胞或卵泡细胞，并且可选择地还有其他来自雌性个体卵巢的卵巢细胞。在一种实施方式中，该样本进一步包含来自卵细胞环境的冷冻细胞。
本发明在进一步实施方式中涉及一种多肽，其具有冰结合活性并且含有序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)的一个或多个拷贝，例如通用冰结合域SEQ ID NO：90的2、3、4、5、6、7、8、9或10个单独选择的拷贝，其中：
X1选自氨基酸残基S、A、G和D；
X2选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
X3选自非大体积氨基酸残基；
X4选自氨基酸残基S、I、T和V；
X5选自氨基酸残基S、A、I和T；
X6选自氨基酸残基S、T和V；
X7选自非大体积氨基酸残基；
X8选自氨基酸残基S、T和V；
X9选自氨基酸残基S、A和G；并且
其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中至少一个是T或V；和
其中该多肽的氨基酸残基的最大数目小于1000。
本发明多肽的氨基酸残基的最大数目优选小于500，例如小于400，例如小于300，例如小于250，例如小于240，例如小于230，例如小于220，例如小于210，例如小于200，例如小于190，例如小于180，例如小于150，例如小于140，例如小于130，例如小于120，例如小于110，例如小于100，例如小于95，例如小于90，例如小于85，例如小于80，例如小于75，例如小于70，例如小于65，例如小于60，例如小于55，例如小于50，例如小于45，例如小于40，例如小于30，例如小于20，例如小于15。
在与上述列举的限制大小的多肽进行功能性偶联中，本发明多肽的氨基酸残基的最小数目可以是10或更多，例如12或更多，例如14或更多，例如16或更多，例如18或更多，例如20或更多，例如22或更多，例如24或更多，例如26或更多，例如28或更多，例如30或更多，例如32或更多，例如34或更多，例如36或更多，例如38或更多，例如40或更多，例如42或更多，例如44或更多，例如46或更多，例如48或更多，例如50或更多，例如55或更多，例如60或更多，例如65或更多，例如70或更多，例如75或更多，例如80或更多，例如85或更多，例如90或更多，例如95或更多，例如100或更多，其中任意最大数或最小数是成对的，最大数目大于最小数目。
在一种实施方式中，本发明的多肽包含多个通用冰结合域，每个都含有序列SEQ ID NO：90或如本文其他地方所述的其变体或衍生物或修饰物，并且优选地最多具有250个氨基酸残基。
在一种实施方式中，本发明涉及一种包含第二序列的多肽序列，该序列是SEQ ID NO：90的另外的独立选择的拷贝的形式，其中SEQ ID NO：90的另外的拷贝与SEQ ID NO：90的第一拷贝不重叠。本发明在另一种实施方式中涉及一种另外含有SEQ ID NO：90的第三拷贝的多肽(即该多肽含有SEQ IDNO：90的三个独立选择的拷贝)，并且在进一步实施方式中，该多肽另外含有SEQ ID NO：90的第四拷贝(即该多肽包含SEQ ID NO：90的三个独立选择的拷贝)。SEQ ID NO：90的独立选择的拷贝可以是相同或不同的，正如本文其他地方所述。
SEQ ID NO：90的拷贝相互可以以任意序列存在，并且任意两个序列可以被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
本发明的多肽可以与载体连接，例如固体载体或半固体载体。该多肽可以共价或非共价地连接任意的这类载体，例如合意地陈列本发明多肽的材料的表面。
本发明进一步涉及与亲和标签融合的本发明的多肽。这类亲和标签的实例是文献已知的，并且可以选自以下实例，例如：His-tag、多肽A标记、亲合素/链亲合素、多肽G、谷胱甘肽S转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、绿色荧光多肽(GFP)、聚精氨酸、聚胱氨酸、c-myc、钙调素结合多肽、流感病毒血凝素、麦芽糖结合蛋白(MBP)(HA)。
本发明还包括其中一个或多个氨基酸残基被修饰的多肽，其中所述一个或多个修饰优选地选自体内或体外化学衍生作用，如乙酰化或羧基化；糖基化作用，例如将多肽暴露于酶中引起的糖基化作用，该酶影响糖基化作用，如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶；磷酸化作用，如产生磷酸化氨基酸残基的氨基酸残基的修饰，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。
本发明的多肽可以含有一个或多个氨基酸，独立地选自天然产生的L-氨基酸、天然产生的D-氨基酸以及非天然产生的合成氨基酸。
本发明还涉及引入了保护基团的本发明的多肽，以便保护和/或稳定该多肽的N-和/或C-端，避免遭受不需要的退化。这种保护基团可选自分支或未分支的烷基和酰基，例如甲酰或乙酰基，及其取代形式，例如乙酰氨甲基。
本发明进一步涉及本发明多肽的修饰物和衍生物，编码所述多肽的核苷酸，含有所述核苷酸的载体，用所述载体转化的宿主细胞以及含有所述细胞的转基因生物。
根据布达佩斯条约的专利保藏
以下菌株已经根据布达佩斯条约的规定于2007年6月4日保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。
Escherichia coli ALO3231
DSM 19401：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP 1的E.coli菌株JM109
Escherichia coli ALO3232
DSM 19402：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP2的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3233
DSM 19403：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP3的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3234
DSM 19404：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP4的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3235
DSM 19405：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP5的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3236
DSM 19406：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP6的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3237
DSM 19407：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP7的E.coli菌株JM109
Escherichia coli ALO3238
DSM 19408：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP8的E.coli菌株JM109
针对下述地区和国家就上述DSMZ保藏号作出以下声明。
EPO：本申请人特此要求，直至欧洲专利授权通知公布，或者直至本申请被驳回或撤回或视为撤回，自申请日起20年内，EPC细则28(3)规定的本生物材料向公众的公开只能通过向由请求人指定的专家提供样品的形式完成。
澳大利亚：本申请人据此声明，微生物样本的发放仅在专利授权之前、或者本申请失效、驳回或撤回之前有效，提供给对本申请无利害关系的技术人员(澳大利亚专利法条例3.25(3))。
加拿大：本申请人请求，直至在本申请的基础上授予加拿大专利或者本申请被驳回、或放弃且不再恢复、或撤回，专利委员会委员只能批准本申请提到的保藏生物材料的样品发放给委员指定的独立专家。
克罗地亚：本申请人特此要求，在本申请公开和专利授权之间，本样品仅根据请求提供给独立专家。
丹麦：本申请人特此要求，直至本申请已经(由丹麦专利局)向公众公开，或最终由丹麦专利局决定未向公众公开，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给本领域的专家。
芬兰：本申请人特此要求，直至本申请已经(由国家专利注册委员会)向公众公开，或最终由国家专利注册委员会决定未向公众公开，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给本领域的专家。
德国：本申请人特此要求，直至专利授权或者直至本申请被驳回或撤回，自申请日起20年内，样本只能发放给请求人指定的独立专家。
冰岛：本申请人特此要求，直至专利授权或者冰岛专利局关于本申请作出没有授权的最终决定，本申请提到的保藏生物材料的样品仅提供给本领域的专家。
挪威：本申请人特此要求，直至本申请已经(由挪威专利局)向公众公开，或最终由挪威专利局决定未向公众公开，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给本领域的专家。
新加坡：本申请人特此要求，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给专家。
西班牙：本申请人特此要求，直至西班牙专利授权通知公布，或者本申请被驳回或撤回，自本申请日起20年内，SPL45条规定的本申请保藏生物材料向公众的公开只能通过向独立专家发放样品的形式完成。
瑞典：本申请人特此要求，直至本申请已经(由瑞典专利局)向公众公开，或最终由瑞典专利局决定未向公众公开，本申请中提到的保藏生物材料的样品仅提供给本领域的专家。
英国：本申请人特此要求，本申请中提到的保藏生物材料的样品仅提供给专家。
序列同源性和同一性的确定
本发明一方面还提供一种分离的多肽，它与本发明多肽，如SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8的任一项或它们的直系同源体，具有基本相似的序列同一性。
术语“基本相似的序列同一性”在本文用于表示与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列、或它们的直系同源体具有至少70％序列同一性的多肽，例如至少72％，例如至少74％，例如至少76％，例如至少78％，例如至少80％，例如至少82％，例如至少84％，例如至少86％，例如至少88％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％，或者大于99％。
本发明还考虑到变异的多核苷酸分子，其可以用两种标准来识别：a)测定具有序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意氨基酸序列的多肽与上述(多核苷酸分子)之间的同一性或相似性，和b)在严格条件下进行杂交试验。例如，某些基因变体包含多核苷酸，该多核苷酸保持与本发明的多核苷酸如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意序列杂交，或者与这些多核苷酸的互补序列杂交，接着在严格的冲洗条件下冲洗，其中冲洗严格度相当于以0.5X～2X SSC，0.1％SDS在55℃～65℃下进行。或者，变异基因可以定性为多核苷酸分子，其保持与编码本发明多肽的多核苷酸如SEQ ID NO：1至SEQID NO：8的任意序列杂交，或者与这些多核苷酸的互补序列杂交，接着在严格的冲洗条件下冲洗，其中冲洗严格度相当于以0.1X～0.2X SSC，0.1％SDS在55℃～65℃下进行。
序列同一性的百分比可通过常规方法确定。例如，参见Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603(1986)和Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1992)。简言之，将两个氨基酸序列进行比对，用空位开放罚分10、空位延伸罚分1，以及Henikoff and Henikoff(同前)的″BLOSUM62″得分矩阵来优化比对评分。同一性百分数计算为：[(相同配对的总数)/较长序列长度×为了比对两序列而向该较长序列引入的空位数]×(100)
本领域的技术人员可以理解，许多建立的算法可以用来比对两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是合适的多肽比对方法，用于检查本文公开的氨基酸序列与推定的或变体的氨基酸序列共有的同源性水平。FASTA算法在Pearson and Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA85：2444(1988)和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)中都有描述。
简言之，FASTA首先通过识别查询序列(例如SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列)和测试序列共享的区域来定性序列相似度，这些区域具有最高的同源性密度(如果ktup变量是1)或者同源对(如果ktup＝2)，而不考虑保守氨基酸替代、插入或缺失。然后通过利用氨基酸替代矩阵比较所有成对的氨基酸的相似性，将有最高同一性密度的十个区重新打分，并且这些区域的末端被“修整”以便仅含有那些对最高评分作出贡献的残基。如果有几个区域的评分高于“临界”值(基于序列长度和ktup值，通过预定的公式计算)，然后检验修整的起始区以确定是否这些区可以接合以形成有差距的近似对齐。最后，用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法，将两个氨基酸序列的最高评分区对齐(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))，其允许有氨基酸插入和缺失。FASTA分析的优选参数是：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1，替代矩阵＝BLOSUM62。通过修改得分矩阵文件(″SMATRIX″)，可以将这些参数引入FASTA程序，正如Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2所解释的那样。
利用如上所公开的比率，FASTA还可以用于确定多核苷酸分子的序列同一性。对核苷酸序列比对来说，ktup值可以是在1至6之间，优选3至6，并且最优选为3。其他参数可以设定为：空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1。
本发明多肽中的氨基酸残基的替代
本发明还针对与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意序列的氨基酸序列相比，具有一个或多个保守氨基酸替代的多肽以及编码具有一个或多个氨基酸替代的多肽的多核苷酸。也就是说，可以获得含有SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列的一个或多个氨基酸替代的变体。变体包括以下序列：其中烷基氨基酸替代烷基氨基酸，其中芳香族氨基酸替代芳香族氨基酸，其中含硫氨基酸替代含硫氨基酸，其中含羟基氨基酸替代含羟基氨基酸，其中酸性氨基酸替代酸性氨基酸，碱性氨基酸替代碱性氨基酸，或者其中二盐基一羧氨基酸替代二盐基一羧氨基酸。
例如，在常见氨基酸中，“保守的氨基酸替代”也可以通过以下各组中的氨基酸之间的替换来解释：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸，精氨酸和组氨酸。
BLOSUM62表是多肽序列片段的约2000局部多重比对得到的氨基酸替代矩阵，代表500多组相关多肽的高度保守区域(Henikoff and Henikoff，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：10915(1992))。相应地，BLOSUM62替代频率可用于限定可引入本发明氨基酸序列的保守氨基酸替代。虽然可能仅基于化学性质来设计氨基酸替代(如上所讨论)，“保守氨基酸替代”的表述优选地指大于-1的BLOSUM62值所表示的替代。例如，如果替代是以0、1、2，或3的BLOSUM62值为特征，则氨基酸替代是保守的。根据该系统，优选的保守氨基酸替代的特征是至少为1(如1、2或3)的BLOSUM62值，而更优选的保守氨基酸替代的特征是至少为2(如2或3)的BLOSUM62值。
例如，当氨基酸序列中的变化是由于一个或多个保守氨基酸替代引起时，具体的多肽变体的特征在于，与本文公开的相应氨基酸序列(即SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8的任意序列)有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的序列同源性。
氨基酸序列的变体，例如“保守氨基酸”变体，可以通过寡核苷酸指导的诱变、连接体扫描诱变，用聚合酶链反应的诱变等获得(见Ausubel(1995)，pages 810-822；和McPherson(ed.)，Directed Mutagenesis：A Practical Approach(IRL Press 1991))。
本发明的多肽还可以包括非自然产生的氨基酸残基。例如，非自然产生的氨基酸残基包括但不限于：反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基半胱乙酯、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酸、同型谷氨酸、哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-以及4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、戊氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
本领域中已知有几种方法可用于将非自然产生的氨基酸残基掺入多肽。例如，可以采用体外培养系统，其中无义突变可用化学氨基酰化抑制剂tRNA来抑制。合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域中已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译通常可在包含E.coli S30提取物和商业可得的酶和其他试剂的无细胞体系中进行。多肽可通过层析法纯化。例如，见Robertson et al.，J.Am.Chem.Soc.113：2722(1991)，Ellman et al.，MethodsEnzymol.202：301(1991)，Chung et al.，Science 259：806(1993)和Chung et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 90：10145(1993)。
多个氨基酸取代可用已知的诱变和筛选的方法来进行和测试，例如Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241：53(1988))或Bowie and Sauer(Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 86：2152(1989))公开的那些。简言之，这些作者公开了一些方法，用于同时使多肽中的两个或多个位置随机化，选择功能多肽，然后测序该诱变的多肽以确定每个位置的允许替代物的光谱。可以使用的其他方法包括噬菌体展示法(例如，Lowman et al.，Biochem.30：10832(1991)，Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,223,409，Huse，国际公布No.WO 92/06204和定位突变(Derbyshire et al.，Gene 46：145(1986)和Ner et al.，DNA 7：127，(1988))。
本发明公开的核苷酸和多肽序列的变体还可以通过DNA改组来生成，如Stemmer，Nature 370：389(1994)，Stemmer，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA91：10747(1994)和国际公布No.WO 97/20078所述。简言之，变体DNA分子是通过体外同源重组，通过亲代DNA的随机分裂接着用PCR重新装配而生成，得到随机引入的点突变。该技术可以用亲代DNA分子的家族，比如来自不同物种的等位基因变体或DNA分子来改造，以将另外的变异引入该过程。选择或筛选所需要的活性，接着进行额外的反复诱变和分析，通过选择所需要的变异，同时针对不利的变化进行选择，提供序列的快速“进化”。
本文公开的诱变方法可以和高通量自动化筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。可以将编码生物活性多肽或与特异性抗体结合的多肽的诱变DNA分子从宿主细胞中除去，并且用现有设备快速测序。这些方法可以快速确定所关注的多肽中个别氨基酸残基的重要性，并且可以适用于未知结构的多肽。
本发明多肽的片段
本发明还包括多肽的“功能性片段”以及编码这些功能性片段的本发明的多核苷酸分子。可以进行多核苷酸分子的常规缺失分析，以获得编码本发明的多肽的多核苷酸分子的功能性片段。例如，编码SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列的DNA分子可以用Bal31核酸酶消化，以获得一系列嵌套缺失。然后将该片段在适当的阅读框内插入表达载体中，分离出表达的多肽并测试其与抗体特异性结合的能力。核酸外切酶消化的一种替换方式是用寡核苷酸指导的诱变来引入缺失或终止密码子，以详细说明特异性片段的产生。或者，本发明的基因的特定片段可以用聚合酶链反应合成。
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的片段优选地包含一个或多个冰结合位点，用本文其他地方所述的SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：72表示。本发明还提供了嵌合多肽和多肽片段。
以下片段：
GSYSCRAVGVDASTVTDVQGTCHAKATGPGAVASGTSVDGSTSTATATGSC来源于全长序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ NO 7和SEQID NO8，并且在C-末端含有替换的残基C，在N-末端含有GS。
用于识别功能域的方法是本领域技术人员熟知的。例如，对干扰素的一个或两个端点的截取研究已被Horisberger and Di Marco，Pharmac.Ther.66：507(1995)概括总结。此外，用于多肽的功能性分析的标准技术已经有描述，例如Treuter et al.，Molec.Gen.Genet.240：113(1993)，Content et al.，″Expressionand preliminary deletion analysis of the 42 kDa 25A synthetase induced by humaninterferon，″Biological Interferon Systems，Proceedings of ISIR-TNO Meeting onInterferon Systems，Cantell(ed.)，pages 65-72(Nijhoff 1987)，Herschman，″TheEGF Receptor，″Control of Animal Cell Proliferation，Vol.1，Boynton et al.，(eds.)pages 169 199(Academic Press 1985)，Coumailleau et al.，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga et al.，J.Biol.Chem.270：25291(1995)；Yamaguchi etal.，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)以及Meisel et al.，Plant Molec.Biol.30：1(1996)。
本发明还考虑了本发明多肽的功能性片段，其与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8任意序列的氨基酸序列相比有氨基酸变化。变体多肽可以通过用本文公开的具体氨基酸序列根据结构确定同一性的水平来识别。根据结构识别变体多肽的另一种替换方法是确定是否编码潜在变体多肽的多核苷酸分子能够与具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8任意序列的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
本发明还提供多肽片段或肽，其含有本文所述的本发明多肽的表位承载部分。这种片段或肽可含有“免疫表位”，这是当整个多肽用作免疫原时，引出抗体应答的多肽的一部分。免疫原的表位承载肽可以用标准方法识别(例如，见Geysen et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 81：3998(1983))。
与此相反，多肽片段或肽可含有“抗原表位”，其是抗体能够与之特异性结合的多肽分子的一个区域。某些表位包括线性或连续延伸的氨基酸，并且这种表位的抗原性不受变性剂的干扰。本领域知道，能够模拟多肽表位的相对短的合成肽可以用于刺激针对该多肽的抗体的产生(例如，见Sutcliffe etal.，Science 219：660(1983))。因此，本发明的抗原表位承载肽和多肽可用于产生与本文所述多肽相结合的抗体。
承载抗原表位的肽和多肽可以含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8任意序列的至少4至10个氨基酸，例如至少10至15个氨基酸，例如约15至约30个氨基酸。这种承载抗原表位的肽和多肽可以通过本文所述的将本发明的多肽裂解或者化学肽合成来生产。此外，表位可以通过随机肽库的噬菌体展示来选择(例如，见Lane and Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)，Corteseet al.，Curr.Opin.Biotechnol.7：616(1996))。用于识别表位以及由含上述表位的小肽生产抗体的标准方法已有描述，例如Mole，“Epitope Mapping”，Methods in Molecular Biology，Vol.10，Manson(ed.)，pages 105116(TheHumana Press，Inc.1992)，Price，“Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies”，Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，pages 6084(CambridgeUniversity Press 1995)，Coligan et al.(eds.)，Current Protocols in Immunology，pages 9.3.19.3.5和pages 9.4.19.4.11(John Wiley&Sons 1997)。
与本发明的变异基因的具体核苷酸序列无关，该基因编码一种多肽，该多肽的特征在于它能够与一抗体特异性结合，该抗体能够与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意序列特异性结合。
含有本发明的抗冻多肽或冰结合位点或冰结合域的融合多肽
本发明还包括抗冻融合多肽。本发明的抗冻融合多肽可能针对特定的细胞区室或细胞外间隙，针对特定的细胞或特定的细胞类型。通过将指定或确定目标的多肽片段连接到细胞区室，抗冻片段可能针对特定的细胞器。肽不仅针对该细胞器，而且被其他肽片段包围时抗冻功能仍发挥作用。通过与抗体或者结合中具有细胞特异性的其他分子融合，冷冻时对细胞损伤的抗性可以赋予这些细胞类型。该技术在器官方面也是有用的。以下列出可以与本发明的多肽相结合的多肽：
融合到(蛋白质) 融合的优势
蛋白质A 检测性，分泌自GRAM-阳性菌，纯化，易于切开以产生游离态
β-半乳糖苷酶 通过酶分析法测定，Western Blots上的可检测性
β-内酰胺酶 Western Blots上的检测性，分泌至GRAM-阴性菌的外周胞质
氯霉素乙酰基转移酶 Western Blots上的检测性，在植物提取物中通过酶分析法测定
与病原相关的多肽 从双子叶植物中分泌
α-淀粉酶 从单子叶植物中分泌
植物血球凝集素 针对植物中的液泡
RuBPCASE小亚基 针对植物中的叶绿体
菜豆蛋白 在种子中积聚
乙醇脱氢酶 在酵母中表达
α-交配因子 从酵母中分泌
荧光素酶 通过光发射检测
因此，含有本发明多肽的融合多肽可用于在重组宿主中表达本发明的多肽，并分离表达的多肽。融合多肽的一种类型包括从重组宿主细胞中引导本发明的多肽的肽。为了将本发明的多肽引入真核宿主细胞的分泌途径，将分泌信号序列(也称作信号肽、引导序列、前导序列或前序列)设置在适宜的表达载体中。分泌信号序列可能来源于本发明的多肽，适宜的信号序列也可能源于另一分泌多肽或者重新合成。该分泌信号序列可操作地与编码本发明序列的基因连接，使得两个序列在恰当的阅读框中接合并定位，以引导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码所关注的多肽的核苷酸序列的5′，然而某些分泌信号序列可能位于所关注的核苷酸序列的其他位置(例如，见Welch et al.，U.S.Pat.No.5,037,743；Holland et al.，U.S.Pat.No.5,143,830)。
虽然本发明基因的分泌信号序列或由哺乳动物细胞产生的其他多肽(例如，U.S.Pat.No.5,641,655中所述的组织型纤溶酶原激活信号序)可用于在重组哺乳动物细胞中表达本发明的基因，但对于酵母细胞中表达来说，酵母信号序列是优选的。适宜的酵母信号序列的实例包括来源于酵母交配信息素α-因子(由MF-α基因编码)、转化酶(由SUC2基因编码)或酸性磷酸酶(由PHO5基因编码)的那些。例如，见Romanos et al.，″Expression ofCloned Genes in Yeast，″DNA Cloning 2：A Practical Approach，2.sup.nd Edition，Glover and Hames(eds.)，pages 123167(Oxford University Press 1995)。
在细菌细胞中，人们常常希望将异源性多肽表达为融合多肽以降低毒性，增加稳定性，以及提高表达多肽的回收。例如，本发明的多肽可以表达为含有谷胱甘肽S-转移酶多肽的融合多肽。谷胱甘肽S-转移酶融合多肽通常是水溶性的，并且易于在固定的谷胱甘肽柱上从E.coli溶解物中提纯。以类似的方式，本发明含有麦芽糖结合多肽的融合多肽可以用直连淀粉树脂柱分离，而含有截断的多肽A基因的C-末端的融合多肽可以用IgG-Sepharose纯化。已经建立的用于将异源性多肽在细菌细胞中表达为融合多肽的技术已有描述，例如Williams et al.，″Expression of Foreign polypeptides in E.coli UsingPlasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies，″DNA Cloning2：A Practical Approach，2.sup.nd Edition，Glover and Hames(Eds.)，pages 1558(Oxford University Press 1995)。此外，商用表达系统是可以购买的。例如，PINPOINT Xa多肽纯化系统(Promega Corporation；Madison，Wis.)提供一种分离融合多肽的方法，该融合多肽含有一种在用含亲合素的树脂表达期间被生物素化的多肽。
用于通过原核或真核细胞表达来分离异源性多肽的肽标签包括聚组氨酸标签(其对镍螯合树脂具有亲和力)、c-myc标签、钙调素结合多肽(用钙调素亲和层析法分离)、P物质、RYIRS标签(其与抗-RYIRS抗体结合)、Glu-Glu标签以及FLAG标签(其与抗-FLAG抗体结合)。例如，见Luo etal.，Arch.Biochem.Biophys.329：215(1996)，Morganti et al.，Biotechnol.Appl.Biochem.23：67(1996)和Zheng et al.，Gene 186：55(1997)。编码这些肽标记的多核苷酸分子是可购买的，例如购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，Mo.)。
另一种形式的融合多肽含有本发明的多肽和免疫球蛋白重链恒定区(通常为Fc片段)，其含有两个恒定区域和一个铰链区，但没有可变区。例如，Chang et al.，U.S.Pat.No.5,723,125描述了一种含人干扰素和人免疫球蛋白Fc片段的融合多肽。干扰素的C-端通过肽连接头基团连接到Fc片段的N-端。肽连接头的一个实例是主要含有T细胞惰性序列的肽，其属于免疫惰性。一种示范性的肽连接头具有氨基酸序列GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ IDNO：91)。在该融合多肽中，优选的Fc基团是人γ4链，它在溶液中是稳定的并且几乎或根本没有补体激活活性。因此，本发明考虑的融合多肽，其含有本发明的多肽或其片段，以及人Fc片段，其中本发明的多肽或其片段的C-端经由肽连接头连接到Fc片段的N-端。
在另一变种中，含有本发明多肽的融合多肽进一步含有IgG序列。本发明的多肽基团共价地连接IgG序列的氨基末端和信号肽，该信号肽共价地连接本发明多肽的氨基端，其中IgG序列包括或者由以下元件按下列顺序组成：铰链区、CH2域、以及CH3域。相应地，IgG没有CH1域。本发明的多肽基团显示出冰结合活性。生产含有抗体和非抗体部分的融合多肽的以上常用方法在LaRochelle et al.，EP 742830(WO 95/21258)中已有描述。
融合多肽可以通过本领域技术人员已知的方法通过制备融合多肽的各个组分并且将它们化学地偶联来制备。或者，编码该融合多肽的两组分的多核苷酸用已知技术在恰当的阅读框中生成，并且用本文描述的方法来表达。融合多肽的酶和化学裂解的通用方法已有描述，例如Ausubel(1995)，pages 1619-1625。
生产本发明的多肽及其片段的通用方法
本发明的抗冻多肽的合成可以两种形式进行，或者生物学的或者合成的。生物学方法是通过表达编码序列或基因的多核苷酸；合成方法是通过化学合成多肽。
优选的合成方法利用固相肽合成，例如由Merrifield开发的那种(J.Am.Chem.Soc.，(1963)85：2149-2156)。该方法尤其用于测试特定的组合物或配方的抗冻活性。
为了大规模生产，生物学表达通常是优选的。编码多核苷酸或基因可以是带有重组修饰的天然基因或者完全合成的序列，其是在适当的表达系统中表达。将天然序列片段插入适当的载体中的方法是本领域普通技术人员熟知的，见Maniatis or Wu，et al.(1987)Methods in Enzymology，Vol.153，AcademicPress，New York，N.Y。
合成的序列可以通过亚磷酰胺化学法合成，以制备该序列的特定部分(Beaucage and Carruthers，(1981)Tet.Letters，22：1859-1862)。可以合成重叠部分然后将其连接在一起以产生较大的基因。
最后，通过选择抗冻片段的特定序列，可以引入限制性酶切位点，其可以提供便利的片段，它们易于连在一起或插入以生成串联重复序列，对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
抗冻多肽的纯化可以用多肽纯化领域的普通技术人员已知的方法进行。标准纯化技术可以是细胞裂解液，或者培养基(如果该多肽被分泌)。典型的方法是柱色谱法、硫酸铵盐沉淀法、抗体亲和柱层析法及其他。天然产生的多肽(例如，在鱼中产生)，优选的纯化方法在DeVries et al.(1977)Biochem Biophys.Acta 495：388-392中已有描述。
优选地，抗冻多肽被纯化至基本同质，通常至少约70％至80％纯度，优选地约90-95％纯度，最优选99％或更纯。通常，该多肽基本上是无污染物的天然相关的鱼化合物(fish compounts)。
从以上所述清楚地看出，本发明的多肽，包括全长多肽、功能性片段以及融合多肽，能够方便地按以下常规技术在重组宿主细胞中生产。
为了表达本发明的基因，编码多肽的多核苷酸必须可操作地与调控序列连接，然后再引入宿主细胞内，该调控序列控制表达载体中的转录表达。除了转录调控序列，例如启动子和增强子，表达载体可以含有翻译调控序列和标记基因，标记基因适用于筛选携带表达载体的基因。
适用于在真核细胞中生产外源性多肽的表达载体通常含有(1)编码细菌复制起源和抗生素抗性标记的原核DNA元件，为表达载体在细菌宿主中的生长和选择做准备；(2)控制转录起始的真核DNA元件，如启动子；和(3)控制转录进展的DNA元件，如转录终止/聚腺苷化序列。
如上所讨论，表达载体还可以包括编码分泌序列的核苷酸序列，其指导异源性多肽进入宿主细胞的分泌途径。例如，表达载体可包含本发明的基因和来自所述基因或其他分泌基因的分泌序列。
通常用于细菌的载体的实例包括pET系列(Novagen)、pGEX系列(Ge Healthcare)、pBAD-系列(Invitrogen)。酵母中的载体的实例是用于毕赤酵母属的pPic(Invitrogen)、来自Kluyveromyces lactis的pKlac体系(New England biolabs)、S.cereviseae载体(Patel，O.，Fearnley，R.，andMacreadie，I..3002.Saccharomyces cerevisiae expression vectors with thrombin-cleavable N-and C-terminal 6x(His)tags.Biotechnol Lett.200325(4)：331-334)，以及用于S.cereviseae的pYes体系(Invitrogen)。
真菌中使用的载体的实例是pBAR系列(在Pall，M.L.and J.Brunelli.1993.A series of six compact fungal transformation vectors containing polylinkerswith unique restrictions sites.Fungal Genetics Newsletter 40：59-61中有描述)。基于pIEx质粒的系统(Merck)或基于杆状病毒的系统(Merck)是用于昆虫细胞的系统的两个实例。类似的产品可购买自其他公司。
昆虫细胞中使用的载体的实例包括四环素调控系统pTet和pTre、基于腺病毒的系统Adeno-X、基于逆转录酶病毒的系统Rethro-X(全部来自Clontech)以及pcDNA载体(Invitrogen)。此外，还有更多的实例并且在市场上有售。
本发明的多肽可在哺乳细胞中表达。适宜的哺乳动物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚胎肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL 8544，ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44[Chasin et al.，Som.Cell.Molec.Genet.12：5551986])、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40-转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)以及小鼠胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。
对于哺乳动物宿主来说，转录的和翻译的调控信号可来源于病毒源，例如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猴病毒等，其中调控信号与特定的具有高表达水平的基因相关。适宜的转录和翻译调控序列还可以从哺乳动物基因获得，例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。
转录调控序列包含足以指导RNA开始合成的启动子区。适宜的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer et al.，J.Molec.Appl.Genet.1：273(1982))、疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355(1982))、SV40早期启动子(Benoist et al.，Nature 290：304(1981))、劳氏肉瘤病毒启动子(Gorman et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 79：6777(1982))、巨细胞病毒启动子(Foecking et al.，Gene 45：101(1980))以及小鼠乳房肿瘤启动子(总体见Etcheverry，″Expression of Engineered polypeptides in Mammalian Cell Culture，″polypeptide Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 163181(John Wiley&Sons，Inc.1996))。
或者，如果该原核启动子被真核启动子调控，则原核启动子，如噬菌体T3RNA聚合酶启动子，可以用于控制哺乳动物细胞中的基因表达(Zhou etal.，Mol.Cell.Biol.10：4529(1990)，Kaufman et al.，Nucl.Acids Res.19：4485(1991))。
表达载体可以用各种标准技术引入宿主细胞中，包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的传递、电穿孔等。转染的细胞可以被选择和繁殖以提供含有该表达载体的重组宿主细胞，该表达载体稳定地整合在该宿主细胞基因组中。
用于将载体引入真核细胞中的技术以及用显性可选标记选择那些稳定的转化体的技术已有描述，例如Ausubel(1995)以及Murray(ed.)，Gene Transferand Expression Protocols(Humana Press 1991)。因此本发明的基因可在更高级的真核生物中表达，例如禽类、真菌、昆虫、酵母菌及植物细胞。
例如，一种稳定的可选标记是对抗生素新霉素提供抗性的基因。在这种情况下，选择是在新霉素类药物的存在下进行，例如G-418或诸如此类。选择体系还可用于增加所关注的基因的表达水平，一种称为“扩增”的过程。扩增是通过在低水平选择剂的存在下培养转染子，然后增加选择剂的量以筛选细胞，这些细胞产生高水平的引入基因的产物。
适宜的扩增可选标记是二氢叶酸还原酶，其对甲氨喋呤具有抗性。其他药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)也可以使用。或者，引入改变表型的标记物，例如绿色荧光多肽，或细胞表面多肽，如CD4、CD8、Class I MHC、胎盘碱性磷酸酶，都可用于从未转染的细胞中通过如FACS分选或磁珠分离技术等手段来分选转染细胞。
还可以利用病毒传递系统，通过培养的哺乳动物细胞来生产本发明的多肽。用于此目的的示范性病毒包括重组腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和腺-相关病毒(AAV)。腺病毒，一种双链DNA病毒，是目前研究的最好的基因，用于传递异源性多核苷酸的基因转移载体(参见Becker et al.，Meth.CellBiol.43：161(1994)和Douglas and Curiel，Science&Medicine 4：44(1997))。腺病毒系统的优势包括相对较大的DNA插入物的适应性，增长到高滴度的能力，感染广泛的哺乳动物细胞类型的能力，以及允许使用大量可得的含有不同启动子的载体的灵活性。
通过删除腺病毒基因组的一部分，可以容纳较大的异源性DNA插入物(高达7kb)。这些插入物可以通过直接连接或通过与共转染的质粒的同源重组来掺入病毒DNA中。一种选择是从病毒载体中删除基本的E1基因，这导致复制不能进行，除非由宿主细胞提供E1基因。例如感染腺病毒载体的人293细胞(ATCC No.CRL-1573、45504、45505)可以生长为粘附细胞或者在相对高细胞浓度下悬浮培养以生产大量多肽(见Garnier et al.，Cytotechnol.15：145(1994))。
生成转基因生物的方法是本领域已知的，参见表3：
细菌、酵母和真菌 简单地通过引入相关的表达质粒来获得转基因生物。本文其他地方
列出了此类方法。
昆虫 Li W，Jin L，An L.2003.Construction of targeting vector and expression
of green fluorescent polypeptide in the silkworm，Antheraea pernyi.
DNA Cell Biol.22：441-6.Yamao M，Katayama N，Nakazawa H，
Yamakawa M，Hayashi Y，Hara S，Kamei K，Mori H.1999.
Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus.Genes Dev.
13：511-6.Allen ML，Scholl PJ.2005.Quality of transgenic laboratory
strains of Cochliomyia hominivorax(Diptera：Calliphoridae).J Econ
Entomol.98：2301-6.
植物 见专利第47页(Horsch et al.，Science 227：1229(1985)，Klein et
al.，Biotechnology 10：268(1992)，以及Miki et al.，″Procedures for
Introducing Foreign DNA into Plants，″Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology，Glick et al.(eds.)，pages 6788(CRC
Press，1993).
鱼 Rembold M，Lahiri K，Foulkes NS，Wittbrodt J.2006.Transgenesis in
fish：efficient selection of transgenic fish by co-injection with a
fluorescent reporter construct.Nature Protocols 1：1133-9
Rahman MA，Mak R，Ayad H，Smith A，Maclean N.1998.Expression of
a novel piscine growth hormone gene results in growth enhancement in
transgenic tilapia(Oreochromis niloticus).Transgenic Res.7：357-69.
Uzbekova S，Chyb J，Ferriere F，BailhacheT，Prunet P，Alestrom P，
Breton B.2000.Transgenic rainbow trout expressed sGnRH-antisense
RNA under the control of sGnRH promoter of Atlantic salmon.
J Mol Endocrinol.25：337-50.
动物 Nagashima H，Fujimura T，Takahagi Y，Kurome M，Wako N，Ochiai T，
Esaki R，Kano K，Saito S，Okabe M，Murakami H.2003.Development of
efficient strategies for the production of genetically modified pigs.
Theriogenology.59：95-106
Lai L，Prather RS.2003.Creating genetically modified pigs by using
nuclear transfer.Reprod Biol Endocrinol.1：82
Hofmann A，Kessler B，Ewerling S，Weppert M，Vogg B，Ludwig H，
Stojkovic M，Boelhauve M，Brem G，Wolf E，Pfeifer A.2003.Efficient
transgenesis in farm animals by lentiviral vectors.EMBO Rep.4：1054-60.
DNA显微注射 (Gordon，J.W.and Ruddle，F.H.1981.Integration and stable germ line
transformation of genes injected into mouse pronuclei.Science
214：1244-1246)，
胚胎干细胞介导的 Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell line.
基因转移 Proc.Natl.Acad.Sci.83：9065-9069)
逆转录酶病毒介导 Jaenisch，R.1976.Germ line integration and Mendelian transmission of
的基因转移 the exogenous Moloney leukemia virus.Proc.Natl.Acad.Sci.73：1260-
1264)
杆状病毒系统提供有效的手段以将本发明克隆的基因引入昆虫细胞中。适宜的表达载体是基于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)，并且含有众所周知的启动子，如果蝇热休克多肽(hsp)70启动子、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒即刻早期基因启动子(ie-1)和延迟早期39K启动子、杆状病毒p10启动子以及果蝇金属硫蛋白启动子。
用于制备重组杆状病毒的第二种方法采用了Luckow描述的基于转座子的系统(Luckow，et al.，J.Virol.67：4566(1993))。使用转移载体的这种系统是以BAC-to-BAC试剂盒销售(Life Technologies，Rockville，Md.)。该系统使用含有Tn7转座子的转移载体，PFASTBAC(Live Technologies)，以将编码本发明多肽的DNA移动到保持在E.coli中的杆状病毒基因组内，成为一种大的称作“杆粒”的质粒。见Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，et al.，J.Gen.Virol.75：1551(1994)和Chazenbalk，andRapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。
此外，转移载体可以包括与DNA的框内融合，该DNA编码本发明的表达多肽的C-或N-端的表位标记，如Glu-Glu表位标记(Grussenmeyer et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.82：7952(1985))。使用本领域已知的技术，将含有本发明基因的转移载体转化到E.coli，并筛选杆粒，该杆粒含有指示重组杆状病毒的中断lacZ基因。然后用常规技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA。
该说明性的PFASTBAC载体可以在很大程度上被修饰。例如，多角体启动子可以被除去并用杆状病毒基本多肽启动子替代(也称作Pcor、p6.9或MP启动子)，其在杆状病毒感染中较早表达，并且显示对表达分泌多肽是有利的(例如，见Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，et al.，J.Gen.Virol.75：1551(1994)和Chazenbalk and Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995))。在这种转移载体构建体中，可以使用基本多肽启动子的短或长的形式。而且，可以构建转移载体，其用来自昆虫多肽的分泌信号序列代替本发明多肽的天然分泌信号序列。例如，来自蜕皮激素葡糖基转移酶(EGT)的分泌信号序列、蜜蜂蜂毒肽(Invitrogen Corporation；Carlsbad，Calif.)、或杆状病毒gp67(PharMingen：San Diego，Calif.)都可用于构建体中以代替天然分泌信号序列。
将重组病毒或杆粒用于转染宿主细胞。适宜的昆虫宿主细胞包括来源于IPLB-Sf-21的细胞系，一种草地夜蛾蛹卵巢细胞系，例如Sf9(ATCC CRL1711)、Sf21AE和Sf21(Invitrogen Corporation；San Diego，Calif.)，以及果蝇Schneider-2细胞、来源于粉纹夜蛾(T.ni)的HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)(U.S.Pat.No.5,300,435)。商业购买的无血清培养基可以用于培养和维持这些细胞。适宜的培养基是用于Sf9细胞的Sf900IITM(LifeTechnologies)或ESF 921TM(Expression Systems)；以及用于T.ni细胞的Ex-cellO405TM(JRH Biosciences，Lenexa，Kans.)或Express FiveOTM(LifeTechnologies)。当使用重组病毒时，细胞通常从约2～5×105细胞的接种密度生长到1～2×106细胞，届时在感染复数(MOI)为0.1至10，更典型地在接近3时，添加重组病毒保存株。
已建立的用于在杆状病毒系统中生产重组多肽的技术由Bailey et al.，″Manipulation of Baculovirus Vectors，″在Methods in Molecular B iology，Volume7：Gene Transfer and Expression Protocols，Murray(ed.)，pages 147168(TheHumana Press，Inc.1991)；Patel et al.，″The baculovirus expression system，″DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，pages 205244(Oxford University Press 1995)；Ausubel(1995)在pages 1637至1657；Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)，以及Lucknow，″Insect Cell Expression Technology，″在polypeptide Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 183218(John Wiley&Sons，Inc.1996)提供。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可以用于表达本文所描述的基因。在这方面尤其关注的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。适宜的在酵母中表达的启动子包括GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(乙醇脱氢酶)、AOX1(乙醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等的启动子。许多酵母克隆载体已经被设计出并且易于得到。这些载体包括基于YIp的载体，如YIp5；YRp载体，如YRp17；Yep载体，如YEp13；以及YCp载体，如YCp19。用外源DNA转化酿酒酵母细胞的方法以及由其生产重组多肽的方法已被公开，例如Kawasaki，U.S.Pat.No.4,599,311，Kawasaki et al.，U.S.Pat.No.4,931,373，Brake，U.S.Pat.No.4,870,008，Welch et al.，U.S.Pat.No.5,037,743，以及Murray et al.，U.S.Pat.No.4,845,075。通过可选标记确定的表型、常见的药物抗性或者在缺乏特定营养素(如，亮氨酸)时的生长能力，来选择转化细胞。在酿酒酵母中使用的适宜载体系统是Kawasaki等人(U.S.Pat.No.4,931,373)公开的POT1载体系统，其可以通过在含葡萄糖的培养基中的生长来选择转化细胞。酵母中使用的其他适宜的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(例如，见Kawasaki，U.S.Pat.No.4,599,311，Kingsman et al.，U.S.Pat.No.4,615,974和Bitter，U.S.Pat.No.4,977,092)和乙醇脱氢酶基因的那些。又见U.S.Pat.No.4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。适用于酵母的常用和/或商业可得的载体的其他实例是pPic系列(Invitrogen)，来自Kluyveromyces lactis的pKlac系统(New EnglandBiolabs)，以及用于S.cerevisae的S.cerevisae载体(Patel et al.，Biotechnology letters 2003 vol 25(4)：331-334)和pYes系统(Invitrogen)。在真菌中可以使用pBAR系列(Pall et al.，1993vol.40：59-61，Functional GeneticsNewsletter)。
其他酵母的转化系统都是本领域已知的，包括多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦牙糖念珠菌(Candida maltosa)。例如，见Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.132：3459(1986)和Cregg，U.S.Pat.No.4,882,279。根据McKnight et al.，U.S.Pat.No.4,935,349的方法，可使用曲霉细胞。Sumino et al.，U.S.Pat.No.5,162,228公开用于转化产黄头孢霉的方法。Lambowitz，U.S.Pat.No.4,486,533公开了用于转化脉孢菌属的方法。
例如，甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组多肽的用途被Raymond，U.S.Pat.No.5,716,808、Raymond，U.S.Pat.No.5,736,383、Raymond et al.，Yeast 14：1123(1998)以及国际公布No.WO 97/17450，WO 97/17451，WO 98/02536和WO 98/02565公开。在转化P.methanolica中使用的DNA分子通常被制备为双链、环状质粒，其可以在转化之前被线性化。对于在P.methanolica中生产多肽来说，质粒中的启动子和终止子可以是P.methanolica基因的那些，如P.methanolica乙醇利用基因(AUG1或AUG2)。其他有用的启动子包括二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的那些。为了促进DNA在宿主染色体中的整合，优选的是使质粒的整个表达片段位于宿主DNA序列两端的侧翼。在甲醇毕赤酵母中使用的适宜的可选标记是P.methanolica ADE2基因，其编码磷酸核糖-5-氨基咪唑羧化脢(AIRC；EC 4.1.1.21)，并且能够使ADE2宿主细胞在缺乏腺嘌呤的情况下生长。对于希望甲醇用量最小的大规模工业处理来说，有可能使用两种甲醇利用基因(AUG1和AUG2)都缺失的宿主细胞。对于分泌多肽的生产，可以使用缺少液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主细胞。可利用电穿孔来帮助将质粒引入P.methanolica细胞，该质粒含有编码所关注多肽的DNA。P.methanolica细胞可以通过电穿孔来转化，使用场强度为2.5至4.5kV/cm的指数衰减脉冲电场，优选约3.75kV/cm，时间常数为1至40毫秒，最优选约20毫秒。
表达载体也可以引入植物原生质体、完整的植物组织、或分离的植物细胞中。将表达载体引入植物组织的方法包括用根癌农杆菌、基因枪法介导的传递、DNA注入、电穿孔等直接侵染或共培养植物组织。例如，见Horsch etal.，Science 227：1229(1985)，Klein et al.，Biotechnology 10：268(1992)和Miki etal.，″Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，″Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Glick et al.(eds.)，pages 6788(CRC Press，1993)。
或者，本发明的基因可以在原核宿主细胞中表达。可以用于在原核细胞中表达本发明多肽的适宜的启动子是本领域技术人员所熟知的，包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR与PL启动子，E.coli的trp、recA、热击、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和lacZ启动子，B.subtilis的启动子，芽孢杆菌的噬菌体的启动子，链霉菌启动子，噬菌体λ的int启动子，pBR322的bla启动子，以及氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子在Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)，Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4th Ed.(Benjamin Cummins 1987)和Ausubel et al.(1995)中已有评论。
适宜的原核宿主包括E.coli和芽孢杆菌属。适宜的E.coli菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(例如，见Brown(ed.)，Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991))。适宜的芽孢杆菌属菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(例如，见Hardy，″Bacillus Cloning Methods，″DNACloning：A Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press 1985))。
当在细菌如E.coli中表达本发明的多肽时，该多肽可保留在细胞质中，通常为不溶性颗粒，或者可被细菌分泌序列引导至周质间隙。在前一种情况下，将细胞溶解，并且用如异硫氰酸胍或尿素来回收颗粒并使其变性。然后通过稀释该变性剂，例如通过透析尿素的溶液以及还原与氧化的谷胱甘肽的组合物，接着透析缓冲盐溶液，该变性的多肽可以被重折叠和二聚化。在后一种情况下，通过破坏细胞(例如，通过超声处理或渗透性冲击)以释放周质间隙的内容物并回收多肽，该多肽可以从周质间隙以可溶的和功能性的方式被回收，从而省却了变性和重折叠。
在原核宿主中表达多肽的方法是本领域技术人员熟知的(例如，见Williams et al.，″Expression of foreign polypeptides in E.coli using plasmidvectors and purification of specific polyclonal antibodies，″DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page 15(Oxford UniversityPress 1995)，Ward et al.，″Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，″Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995)和Georgiou，″Expression of polypeptides in Bacteria，″polypeptideEngineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，page 101(John Wiley&Sons，Inc.1996))。
将载体引入细菌、酵母、昆虫和植物细胞的标准方法已有提供，例如Ausubel(1995)。
表达和回收由哺乳动物细胞体系产生的外源多肽的一般方法已有提供，例如Etcheverry，″Expression of Engineered polypeptides in Mammalian CellCulture，″polypeptide Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 163(Wiley-Liss，Inc.1996)。回收由细菌体系产生的多肽的标准技术已有提供，例如Grisshammer et al.，″Purification of over-produced polypeptidesfrom E.coli cells，″DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，pages 5992(Oxford University Press 1995)。已建立的从杆状病毒体系中分离重组多肽的方法由Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(TheHumana Press，Inc.1995)公开。
另外，本发明的多肽可以通过专门的固相合成、部分固相法、片段缩合或经典溶液合成法来合成。这些合成方法是本领域技术人员熟知的(例如，见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963)，Stewart et al.，″Solid Phase PeptideSynthesis″(2nd Edition)，(Pierce Chemical Co.1984)，Bayer and Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3(1986)，Atherton et al.，Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach(IRL Press 1989)，Fields and Colowick，″Solid-Phase Peptide Synthesis，″Methods in Enzymology Volume 289(Academic Press 1997)和Lloyd-Williams etal.，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and polypeptides(CRCPress，Inc.1997))。化学合成总策略的变化，如“自然化学连接”和“表达多肽连接”都是标准的(例如，见Dawson et al.，Science 266：776(1994)，Hackeng etal.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 94：7845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.287：34(1997)，Muir et al，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95：6705(1998)和Severinov andMuir，J.Biol.Chem.273：16205(1998))。
本发明涉及含有本文所述的肽或多肽的组合物。这些组合物可以进一步包含载体。载体可以是常规的有机或无机载体。载体的实例包括水、缓冲液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。
本发明多肽的分离
就污染大分子，尤其是其他多肽和多核苷酸来说，本发明的多肽可以纯化到至少约80％纯度、至少约90％纯度、至少约95％纯度、甚至大于95％纯度，并且不含传染性和高热的物质。本发明的多肽还可以纯化到大于99.9％纯度的药学纯态。在特定制备中，纯的多肽基本没有其他多肽，尤其是其他动物源多肽。
分级分离和/或常规纯化方法可以用于从天然源中提纯获得本发明多肽的制剂，从重组宿主细胞中提纯获得本发明的重组多肽以及本发明的融合多肽。一般地，硫酸铵沉淀以及酸或离液剂提取可用于样本的分级分离。示范性的纯化步骤可包括羟磷灰石、体积排阻、FPLC和反相高效液相色谱法。适宜的色谱介质包括衍生右旋糖酐、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特色硅酸盐等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是优选的。示范性的色谱介质包括以苯基、丁基、辛基衍生的那些，如苯基-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，Pa.)、辛基-琼脂糖凝胶(Pharmacia)等；或聚丙烯树脂，如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适宜的固体载体包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等，它们在使用条件下是不溶的。这些载体可用反应基团修饰，使多肽被氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化合物基团连接起来。
偶联化学物质的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧活化、巯基活化、酰肼活化、以及碳二亚胺偶联化学物的羧基和氨基衍生物。这些及其他固体媒介是本领域熟知和广泛使用的，并且可以从商业供应商购得。多肽分离和纯化的具体方法的选择是常规设计方面的问题，并且在某种程度上是由所选载体的性质来确定。例如，见Affinity Chromatography：Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988)和Doonan，polypeptide Purification Protocols(The Humana Press 1996)。
本发明多肽的分离和纯化中的额外变化可以由本领域技术人员进行设计。例如，识别如下所得的本发明多肽及其片段的特异性抗体，可以用于通过免疫亲和纯化法来分离大量多肽。
本发明的多肽还可以通过采用特定属性来分离。例如，固定化金属离子吸附(IMAC)色谱可以用于纯化富组氨酸的多肽，包括那些含有聚组氨酸标记的多肽。简言之，凝胶首先带上二价金属离子以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。富组氨酸的多肽会根据所用的金属离子，以不同的亲和力吸附到该基质上，并且通过竞争性洗脱或使用强螯合剂来洗脱，降低pH。其他纯化方法包括用凝集素亲和色谱和离子交换色谱法纯化糖基化多肽(M.Deutscher，(ed.)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明另外的实施方式中，可以构建所关注多肽与亲和标签(如麦芽糖结合多肽、免疫球蛋白域)的融合物，以促进纯化。
如上所述，本发明的多肽及其片段还可以通过化学合成来制备。本发明的多肽可以是单体或多聚体；糖基化的或非糖基化的；聚乙二醇化的或非聚乙二醇化的；并且可包括或不包括最初的蛋氨酸氨基酸残基。
本发明多肽的特异性抗体的生产
本发明的冰结合多肽及其片段的抗体可以通过在适宜的宿主生物中将含有本发明基因的表达载体所产生的产物作为抗原来获得，或者通过使用从天然源中分离的或用任意常规固相合成法合成的本发明的多肽来获得，尤其有用的抗体与本发明的多肽“特异性结合”。如果抗体表现出以下两个性质中的至少一个，则该抗体视为特异性结合：(1)抗体以结合活性的阈值水平与本发明的多肽结合，和(2)抗体与那些和本文以下限定的本发明多肽相关的多肽没有明显地交叉反应。
至于第一个特征，如果抗体结合多肽、肽或表位的结合亲和度(Ka)为106M-1或更高，则抗体为特异性结合，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高。该抗体的结合亲和力可以被本领域的普通技术人员很容易地测定，例如通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660(1949))。至于第二个特征，例如，在标准的Western blot分析中，如果抗体检测到本发明的多肽，但没有检测到以相似或相同量加入的已知多肽，则抗体没有与相关的多肽分子显著地交叉反应。
本发明的抗体可以利用承载抗原表位的肽或多肽来生产。本发明的承载抗原表位的肽和多肽优选地含有任意SEQ ID NO：5至12中包含的至少4个，或15至约30个氨基酸序列。然而，包含本发明氨基端序列中较大部分的肽或多肽，如包含30至50个氨基酸，或任意长度的达到及包含本发明多肽的整个氨基酸序列，也可以用于诱导与本发明的多肽相结合的抗体。人们希望的是，选择表位承载肽的氨基酸序列，以提供在水性溶剂中的大的溶解性(即，该序列含有相对亲水的残基，而疏水的残基优选地被消除)。此外，也可能需要含有脯氨酸残基的氨基酸序列用于抗体生产。
例如，可用Jameson-Wolf法识别(Jameson and Wolf，CABIOS 4：181，(1988))，按照LASERGENE(DNASTAR；Madison，Wis.)的PROTEAN程序(3.14版)鉴定本发明多肽的潜在抗原位点。该分析中使用缺省参数。
通过将用于多肽结构预测的六个主要子程序相结合，Jameson-Wolf法预测了潜在的抗原决定簇。简言之，首先，用Hopp-Woods方法(Hopp et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 78：3824(1981))识别代表最大的局部亲水区域的氨基酸序列(参数：平均7个残基)。在第二步，用Emini的方法(Emini et al.，J.Virology 55：836(1985))计算表面概率(参数：表面判定阈值(0.6)＝1)。第三，用Karplus-Schultz法(Karplus and Schultz，Naturwissenschaften 72：212(1985))预测主链灵活性(参数：灵活性阈值(0.2)＝1)。在分析的第四和第五步中，将二级结构预测应用到该数据中，用Chou-Fasman法预测多肽结构和多肽构象的原则(Chou，″Prediction of polypeptide Structural Classesfrom Amino Acid Composition，″Prediction of polypeptide Structure and thePrinciples of polypeptide Conformation，Fasman(ed.)，pages 549586(PlenumPress 1990)和Garnier-Robson，Garnier et al.，J.Mol.Biol.120：97(1978))(Chou-Fasman参数：构象表＝64种多肽；α区阈值＝103；β区阈值＝105；Garnier-Robson参数：α和β决定常数＝0)。在第六个子程序中，将弹性参数和亲水性/溶解可接触性因素结合起来以确定表面轮廓值，指定为“抗原指数”。最后，将峰值扩大功能应用于该抗原指数，其扩展主要表面峰，使各个峰值增加20、40、60或80％，以说明相对内部区域而言，来自表面区域的移动性的额外自由能。然而，该计算并不适用于任何保留在螺旋区的主要峰，因为螺旋区往往不太灵活。
针对重组多肽或从天然源分离的多肽的多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的方法制备，例如，见Green et al.，″Production of Polyclonal Antisera，″Immunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages 1to 5(Humana Press 1992)和Williams et al.，″Expression of foreign polypeptides in E.coli using plasmidvectors and purification of specific polyclonal antibodies，″在DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page 15(Oxford UniversityPress 1995)。可以通过使用佐剂来增加多肽的免疫原性，如铝(氢氧化铝)或Freund′s完全或不完全佐剂。用于免疫的多肽还包括融合多肽，例如，本发明的多肽或其部分与免疫球蛋白多肽，或者与麦芽糖结合蛋白的融合物。该多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样”，则这个部分可有利地接合或连接到用于免疫的大分子载体上(钥孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)。
虽然多克隆抗体典型地出现在动物，如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中，但特异性针对本发明多肽的抗体也可能来源于非人灵长类动物抗体。例如，在狒狒中培养对诊断和治疗有用的抗体的通用技术可以在Goldenberg et al.，国际专利公布No.WO 91/11465和Losman et al。Int.J.Cancer 46：310(1990)中找到。
此外，可以生成特异性针对本发明多肽的单克隆抗体。特异性抗原的鼠类单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法来获得(例如，见Kohler etal.，Nature 256：495(1975)，Coligan et al.(eds.)，Current Protocols in Immunology，Vol.1，pages 2.5.12.6.7(John Wiley&Sons 1991)[″Coligan″]，Picksley et al.，″Production of monoclonal antibodies against polypeptides expressed in E.coli，″在DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page 93(Oxford University Press 1995))。
简言之，单克隆抗体可以通过以下方法获得：用含有基因产品的组合物注射小鼠，通过抽取血清样品证实抗体产品的存在，摘除脾脏以获得B淋巴细胞，将该B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆体，培养产生抗原抗体的该克隆体，并从杂交瘤培养物中分离该抗体。
另外，特异性针对本发明多肽的抗体可来源于人单克隆抗体。人单克隆抗体获取自转基因小鼠，该小鼠经工程设计以产生对抗原激发作出应答的特异性人抗体。在这项技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入小鼠品系中，该品系来源于含有靶向断裂的内源性重链和轻链基因座的胚胎干细胞系。转基因小鼠可以合成特异性针对人抗原的人抗体，并且该小鼠可以用于生产人类分泌抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法已有描述，例如Green et al.，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg et al.，Nature 368：856(1994)和Taylor et al.，Int.Immun.6：579(1994)。
单克隆抗体可以通过各种完善技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这些分离技术包括蛋白-A琼脂糖凝胶的亲和色谱法，体积排阻色谱法，和离子交换色谱法(例如，见Coligan，pages 2.7.12.7.12和pages 2.9.12.9.3；Baines etal.，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)，″Methods in Molecular Biology，Vol.10，pages 79104(The Humana Press，Inc.1992))。
对于具体应用来说，可能需要制备特异性针对本发明多肽的抗体片段。例如，这种抗体片段可以通过抗体的蛋白酶水解来获得。抗体片段可以通过常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶进行抗体的酶裂解来生产，以提供一种表示F(ab′)2的5S片段。该片段可以进一步用巯基还原剂裂解，以生产3.5S Fab′单价片段。可选择地，该裂解反应可以用双硫键裂解产生的硫氢基的保护基来进行。作为替代方案，使用胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法已有描述，例如Goldenberg，U.S.Pat.No.4,331,647；Nisonoff et al.，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)和Edelman et al.Coligan，二者均见Methods in Enzymology Vol.1，(AcademicPress 1967)。
裂解抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步裂解，或其他酶、化学或基因技术也可使用，只要该片段与完整抗体识别的抗原相结合。
例如，Fv片段包括VH和VL链的结合。该结合可以是非共价的，正如Inbar et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659(1972)所述。或者，不同的链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质如戊二醛连接(例如，见Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992))。
Fv片段可包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)可以通过构建包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL域的DNA序列的结构基因来制备。将该结构基因插入表达载体，接着将其引入宿主细胞，如E.coli。该重组宿主细胞合成单一的多肽链，用连接肽桥接这两个V域。用于生产scFvs的方法已有描述，例如Whitlow et al.，Methods：A Companionto Methods in Enzymology 2：97(1991)(又见，Bird et al.，Science 242：423(1988)，Ladner等，美国专利No.4,946,778，Pack et al.，Bio/Technology 11：1271(1993)和Sandhu，上文)。
例如，scFV可以通过在体外将淋巴细胞暴露于多肽中，并在噬菌体或类似载体中选择抗体展示库(如，通过使用固定的或标记的多肽或肽)来获得。编码有潜在多肽结合域的多肽的基因可以通过筛选展示在噬菌体(噬菌体展示)或细菌(如E.coli)上的随机肽库来获得。编码该多肽的核苷酸序列可以以多种方式获得，例如通过随机突变和随机多核苷酸合成。这些随机肽展示库可用于筛选与已知目标相互作用的肽，该目标可以是多肽或多肽，例如配体或受体，生物的或合成的大分子，或有机或无机物。用于创建和筛选这些随机肽展示库的技术是本领域已知的(Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,223,409，Ladner et al.，U.S.Pat.No.4,946,778，Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,403,484，Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,571,698，和Kay et al.，Phage Display ofPeptides and polypeptides(Academic Press，Inc.1996))，并且随机肽展示库和用于筛选这些库的试剂盒都是商业可得的，例如购自CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，Calif.)，Invitrogen Inc.(San Diego，Calif.)，NewEngland Biolabs，Inc.(Beverly，Mass.)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，N.J.)。随机肽展示库可用本文公开的序列筛选，以识别与其相结合的多肽。
抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码感兴趣的抗体CDR的基因来获得。例如，这些基因可利用聚合酶链反应制备，由抗体生成细胞的RNA合成可变区(例如，见Larrick et al.，Methods：A Companion to Methods in Enzymology2：106(1991)，Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application，Ritter etal.(eds.)，page 166(Cambridge University Press 1995)和Ward et al.，″GeneticManipulation and Expression of Antibodies，″在Monoclonal Antibodies：Principlesand Applications，Birch et al.，(eds.)，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995))。
或者，特异性针对本发明多肽的抗体可来源于“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体可以通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补决定区转入人可变区来生产。然后人抗体的典型残基在小鼠对应物的框架区内被取代。来源于人源化单克隆抗体的抗体成分的应用排除了与小鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问题。用于克隆小鼠免疫球蛋白可变域的通用技术已有描述，例如Orlandi et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)。用于生产人源化单克隆抗体的技术已有描述，例如Jones et al.，Nature 321：522(1986)，Carter et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，Singer et al.，J.Immun.150：2844(1993)，Sudhir(ed.)，Antibody Engineering Protocols(Humana Press，Inc.1995)，Kelley，″Engineering Therapeutic Antibodies，″polypeptide Engineering：Principles andPractice，Cleland et al.(eds.)，pages 399434(John Wiley&Sons，Inc.1996)以及Queen et al.，U.S.Pat.No.5,693,762(1997)。
通过采用标准技术，用特异性针对本发明多肽的抗体或抗体片段免疫动物，可以制备多克隆抗独特型抗体。例如，见Green et al.，″Production ofPolyclonal Antisera，″Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols，Manson(ed.)，pages 1-12(Humana Press 1992)。又见Coligan，pages 241-247。或者，单克隆抗独特型抗体可以用特异性针对本发明多肽的抗体或抗体片段作为免疫源，用如上所述的技术来制备。另一种替代方案，可以用上述技术制备人源化抗独特型抗体或非人灵长类动物抗独特型抗体。用于生产抗独特型抗体的方法已有描述，例如Irie，U.S.Pat.No.5,208,146，Greene，et.al.，U.S.Pat.No.5,637,677和Varthakavi and Minocha，J.Gen.Virol.77：1875(1996)。
宿主细胞及其相关用途
含有本发明多肽的宿主细胞可以举例为动物细胞、哺乳动物宿主细胞、昆虫细胞、鱼细胞、真菌细胞、酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。
天然的或合成的编码本发明抗冻多肽的核酸片段可并入多核苷酸结构中，该结构能够引入最终的靶向表达细胞中和/或在最终的靶向表达细胞中表达。通常，该多核苷酸构建体适合在单细胞或多细胞宿主(例如酵母或细菌)中复制，但也可用于引入和整合在培养的哺乳动物或其他真核细胞系的基因组中，尤其是植物。制备的用于引入细菌或酵母的多核苷酸构建体包括：被宿主识别的复制体系，编码所需要的抗冻多肽产物的多核苷酸片段，与编码抗冻多肽的多核苷酸序列的5′端相连的转录及翻译起始调控序列，以及与该序列的3′端相连的转录及翻译终止调控序列。转录调控序列包括被宿主识别的异源启动子。方便地，可采用现成可用的表达载体，其包含复制体系、转录及翻译调控序列、以及抗冻多肽编码序列的插入位点。
该基因将包含任意的含有抗冻多肽的编码序列的多核苷酸片段。通常，该基因包含所述编码序列加上上游和下游相关序列，尤其是任意的增强子、启动子、核糖体结合位点或转录起始标记。下游片段对信息聚腺苷酸化和处理而言也可能很重要，因此在通常情况下都考虑在内。
将基因引入细胞或细胞组中进行表达是通常将多肽引到关注的样本内的另一种方法。转化的终产物也应纳入作为本发明的产物，并且术语“转化细胞”包括实际转化的细胞以及该细胞的所有子代。在典型的情况下，最终生物包含的每个细胞中都含有该基因。标准转化程序适用于细菌(Maniatis)、真菌(Sherman et al.(1986)，在Laboratory Course Manual for Methods in YeastGenetics CSH)、植物(van den Elzen et al.(1985)Plant Mol.Biol.，5：149-154)和动物(Hanahan，(1988)Ann.Rev.Genetics，22：479-519)。
酵母和真菌宿主细胞
适用于本发明的酵母宿主细胞的非限制性实例包括来自酵母菌科家族的酵母，包括Saccharomyces和Candida属的成员。优选的实例包括但不限于：脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、酿酒酵母(Saccharomycescervisae)、乳酸酵母(Saccharomyces lactis)、伪热带念珠菌(Candidapseudotropicalis)。
细菌
细菌细胞可用作本发明的宿主细胞，用于生产本发明的多肽。
细菌，如乳酸杆菌以及许多酵母菌和霉菌，在发酵食品，如奶酪、酱菜、酱油、泡菜、醋、酒和酸奶的制备中已经使用了几千年。
本发明的抗冻多肽可用于保持制备那些食品所用的微生物的生存能力，并用于制备益生元和益生菌食用组合物，包括动物饲料组合物和供人类消费的食品。
与本发明相关且适合作为本发明宿主细胞的优选的细菌实例有大肠杆菌(Escherichia coli)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、柠胶链球菌(Leuconostoc citrovorum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、德氏乳酸杆菌属保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus.casei)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
细菌还可以作为杀虫剂的替代品用在生物虫害控制计划中。本发明在一种实施方式中尤其适用于这种用途，并且提供含有本发明多肽及产生本发明多肽的重组微生物，其能够用作环保的生物杀虫剂。一个实例是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，一种革兰氏阳性土壤细菌。
适合本发明使用的细菌宿主细胞的进一步非限制性的实例包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。优选的细菌细胞也可以选自革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性球菌和革兰氏阴性杆菌。适合本发明使用的细菌宿主细胞的实例包括但不限于选自以下属的细菌：Acaricomes、Acetitomaculum、Acetivibrio、Acetobacter、Acetobacterium、Acetobacteroides、Acetohalobium、Acetomicrobium、Acetomonas、Acetonema、Achromobacter、Acidaminobacter、Acidaminococcus、Acidicaldus、Acidimicrobium、Acidiphilium、Acidithiobacillus、Acidobacterium、Acidocaldus、Acidocella、Acidomonas、Acidovorax、Acinetobacter、Acrocarpospora、Actinacidiphilus、Actinoacidiphilus、Actinoalloteichus、Actinobacillus、Actinobaculum、Actinobifida、Actinobispora、Actinocatenispora、Actinocorallia、Actinokineospora、Actinomadura、Actinomyces、Actinoplanes、Actinopolyspora、Actinopycnidium、Actinospica、Actinosporangium、Actinostreptospora、Actinosynnema、Actinotalea、Actinotelluria、Adhaeribacter、Aequorivita、Aerobacter、Aerococcus、Aerococcus-like Organism、Aeromicrobium、Aeromonas、Aestuariibacter、Afipia、Agarbacterium、Aggregatibacter、Agitococcus、Agreia、Agrobacterium、Agrococcus、Agromonas、Agromyces、Ahrensia、Albidovulum、Alcaligenes、Alcanivorax、Algibacter、Algicola、Algoriphagus、Alicycliphilus、Alicyclobacillus、Alishewanella、Alistipes、Alkalibacillus、Alkalibacter、Alkalibacterium 、Alkalilimnicola 、Alkalispirillum、Alkanindiges、Allisonella、Allobaculum、Allochromatium、Allofustis、Alteromonas、Alysiella、Aminobacter、Aminobacterium、Aminomonas、Ammonifex、Ammoniphilus、Amoebobacter、Amorphosporangium、Amphibacillus、Ampullariella、Amycolata、Amycolatopsis、Anaeroarcus、Anaerobacter、Anaerobaculum、Anaerobiospirillum、Anaerobranca、Anaerocellum、Anaerococcus、Anaerofilum、Anaerofustis、Anaerolinea、Anaeromusa、Anaerophaga、Anaeroplasma、Anaerosinus、Anaerostipes、Anaerotruncus、Anaerovibrio、Anaerovirgula、Anaerovorax、Ancalomicrobium、Ancylobacter、Aneurinibacillus、Angiococcus、Angulomicrobium、Anoxybacillus、Antarctobacter、Aquabacter、Aquabacterium、Aquamicrobium、Aquaspirillum、Aquicella、Aquifex、Aquiflexum、Aquimarina、Aquimonas、Arcanobacterium、Archangium、Arcicella、Arcobacter、Arenibacter、Arhodomonas、Arizona、Arsenicicoccus、Arsenophonus、Arthrobacter、Asanoa、Asiosporangium、Asticcacaulis、Astrosporangium、Atopobium、Atopococcus、Atopostipes、Aurantimonas、Aureobacterium、Avibacterium、Axonoporis、Azoarcus、Azohydromonas、Azomonas、Azorhizobium、Azorhizophilus、Azospira、Azospirillum、Azotobacter Bacillus、Bacteriovorax、Bacterium、Bacteroides、Balnearium、Balneatrix、Barnesiella、Bartonella、Bdellovibrio、Beggiatoa、Beijerinckia、Belliella、Belnapia、Beneckea、Bergeriella、Betabacterium、Beutenbergia、Bifidobacterium、Bilophila、Blastobacter、Blastochloris、Blastococcus、Blastomonas、Blastopirellula、Bogoriella、Bordetella、Borrelia、Bosea、Brachybacterium、Brachymonas、Brachyspira、Brackiella、Bradyrhizobium、Branhamella、Brenneria、Brevibacillus、Brevibacterium、Brevigemma、Brevundimonas、Brochothrix、Brucella、Bryantella、Budvicia、Bulleidia、Burkholderia、Buttiauxella、Butyribacterium、Butyrivibrio、Byssovorax、Caenibacterium、Caldanaerobacter、Caldicellulosiruptor、Caldilinea 、Caldithrix、Caldocellum、Caloramator、Caloranaerobacter、Caminibacillus、Caminibacter、Caminicella、Campylobacter、Capnocytophaga、Carbophilus、Carboxydocella、Carboxydothermus、Cardiobacterium、Carnobacterium、Caryophanon、Caseobacter、Castellaniella、Cat Scratch Disease Bacillus、Catellatospora、Catellibacterium、Catellicoccus、Catenibacterium、Catenococcus、Catenulispora、Catenuloplanes、Catenulospora、Caulobacter、Cdc Enteric Group 36/37、Cdc Group Vd、Cedecea、Cellulomonas、Cellulophaga、Cellulosimicrobium、Cellvibrio、Centipeda、Cerasibacillus、Chainia、Chelatobacter、Chelatococcus、Chitinibacter、Chitinimonas、Chitinophaga、Chlorobaculum、Chlorobium、Chloroflexus、Chondrococcus、Chondromyces、Chromatium、Chromobacterium、Chromohalobacter、Chryseobacterium、Chryseomonas、Chrysiogenes、Citreicella、Citricoccus、Citrobacter、Clavibacter、Clavisporangium、Clo Group Type 2、Clostridium、Cobetia、Cohnella、Collimonas、Collinsella、Colwellia、Comamonas、Conchiformibius、Conexibacter、Coprothermobacter、Corallococcus、Coriobacterium、Corynebacterium、Couchioplanes、Crossiella、Cryobacterium、Cryptanaerobacter、Cryptobacterium、Cryptosporangium、Cupriavidus、Curtobacterium、Curvibacter、Cyclobacterium、Cystobacter、Cytophaga、Dactylosporangium、Dechloromonas、Dechlorosoma、Deefgea、Deferribacter、Defluvibacter、Dehalobacter、Dehalospirillum、Deinococcus、Deleya、Delftia、Demetria、Dendrosporobacter、Denitrovibrio、Dermabacter、Dermacoccus、Dermatophilus、Derxia、Desemzia、Desulfacinum、Desulfarculus、Desulfatibacillum、Desulfitobacterium、Desulfoarculus、Desulfobacca、Desulfobacter、Desulfobacterium、Desulfobacula、Desulfobulbus、Desulfocapsa、Desulfocella、Desulfococcus、Desulfofaba、Desulfofrigus、Desulfofustis、Desulfohalobium、Desulfomicrobium、Desulfomonile、Desulfonatronovibrio、Desulfonatronum、Desulfonauticus、Desulfonema、Desulfonispora、Desulfopila、Desulforegula、Desulforhabdus、Desulforhopalus、Desulfosarcina、Desulfospira、Desulfosporosinus、Desulfotalea、Desulfothermus、Desulfotignum、Desulfotomaculum、Desulfovermiculus、Desulfovibrio、Desulfovirga、Desulfovirgula、Desulfurella、Desulfurobacterium、Desulfuromonas、Desulfuromusa、Dethiosulfovibrio、Devosia、Dialister、Diaphorobacter、Dichelobacter、Dichotomicrobium、Dickeya、Dictyoglomus、Dietzia、Diplococcus、Dokdoa、Dokdonella、Dokdonia、Dolosicoccus、Donghaeana、Dorea、Duganella、Dyadobacter、Dyella、Eberthella、Ectothiorhodospira、Edwardsiella、Eggerthella、Eikenella、Elizabethkingia、Elytrosporangium、Empedobacter、Enhygromyxa、Ensifer、Enterobacter、Enterococcus、Enterovibrio、Epilithonimonas、Eremococcus、Erwinia、Erysipelothrix、Erythrobacter、Erythromicrobium、Escherichia、Ethanoligenens、Eubacterium、Ewingella、Excellospora、Exiguobacterium、、Faecalibacterium、Faenia、Falcivibrio、Fastidiosipila、Ferribacter、Ferrimonas、Ferrobacillus、Fervidobacterium、Filibacter、Filifactor、Filobacillus、Filomicrobium、Finegoldia、Flammeovirga、Flavimonas、Flavobacterium、Flectobacillus、Flexibacter、Flexistipes、Flexithrix、Fluoribacter、Fluviicola、Formivibrio、Francisella、Frankia、Frateuria、Friedmanniella、Frigoribacterium、Fulvimarina、Fulvimonas、Fusibacter、Fusobacterium、Gaetbulibacter、Gaffkya、Gallibacterium、Gallicola、Garciella、Gardnerella、Gariaella、Gelidibacter、Gemella、Gemmata、Gemmatimonas、Gemmobacter、Geoalkalibacter、Geobacillus、Geobacter、Geodermatophilus、Geopsychrobacter、Georgenia、Geosinus、Geospirillum、Geothermobacter、Geothrix、Geovibrio、Giesbergeria、Gillisia、Glaciecola、Globicatella、Gluconacetobacter、Gluconoacetobacter、Gluconobacter、Glycomyces、Goodfellowia、Gordona、Gordonia、Gracilibacillus、Gracilibacter、Granulicatella、Granulobacter、Grimontia、Group Ii D、Guggenheimella、Gulosibacter、Haemophilus、Hafnia、Hahella、Halanaerobacter、Halanaerobium、Haliangium、Haliscomenobacter、Haloactinomyces、Haloanaerobacter、Haloanaerobium、Halobacillus、Halobacteroides、Halocella、Halochromatium、Halococcus、Halolactibacillus、Halomonas、Halonatronum、Halorhodospira、Halothermothrix、Halothiobacillus、Helcococcus、Helicobacter、Heliobacillus、Heliobacterium、Heliophilum、Heliorestis、Herbaspirillum、Herbidospora、Herminiimonas、Herpetosiphon、Hespellia、Hippea、Hirschia、Hoeflea、Holdemania、Holophaga、Hongiella、Hordeomyces、Hyalangium、Hydrocarboniphaga、Hydrogenivirga、Hydrogenobacter、Hydrogenobaculum、Hydrogenomonas、Hydrogenophaga、Hydrogenophilus、Hydrogenothermophilus、Hydrogenothermus、Hydrogenovibrio、Hylemonella、Hymenobacter、Hyphomicrobium、Hyphomonas、Idiomarina、Ignatzschineria、Ignavigranum、Ilyobacter、Inflabilis、Inquilinus、Intrasporangium、Iodobacter、Isobaculum、Isochromatium、Isoptericola、Jahnia、Janibacter、Jannaschia、Janthinobacterium、Jensenia、Jeotgalibacillus、Jeotgalicoccus、Jiangella、Jonesia、、Kangiella、Kerstersia、Kibdellosporangium、Kibdelosporangium、Kineococcus、Kineosphaera、Kineosporia、Kingella、Kitasatoa、Kitasatospora、Kitasatosporia、Klebsiella、Kluyvera、Knoellia、Kocuria、Kofleria、Koserella、Kozakia、Kribbella、Ktedobacter、Ktedonobacter、Kurthia、Kutzneria、Kytococcus、Labrys、Laceyella、Lachnobacterium、Lachnospira、Lactobacillus、Lactobacterium、Lactococcus、Lactonifactor、Lamprocystis、Lampropedia、Laribacter、Lautropia、Leadbetterella、Lebetimonas、Lechevalieria、Leclercia、Leeuwenhoekiella、Legionella、Leifsonia、Leisingera、Leminorella、Lentibacillus、Lentzea、Leptospirillum、Leptothrix、Leptotrichia、Leucobacter、Leuconostoc、Leucothrix、Levilinea、Levinea、Limnobacter、List、Listeria、Listonella、Loktanella、Lonepinella、Longispora、Lophomonas、Luteibacter、Luteimonas、Luteococcus、Lysobacter、Macrococcus、Macromonas、Magnetospirillum、Mahella、Malikia、Malonomonas、Manjusharmella、Mannheimia、Maribacter、Maricaulis、Marichromatium、Marinibacillus、Marinilabilia、Marinilactibacillus、Marinithermus、Marinitoga、Marinobacter、Marinobacterium、Marinococcus、Marinomonas、Marinospirillum、Marinovum、Marmoricola、Massilia、Mechercharimyces、Mechercharomyces、Megamonas、Megasphaera、Meiothermus、Melittangium、Mesonia、Mesophilobacter、Mesorhizobium、Methanomonas、Methylobacillus、Methylobacter、Methylobacterium、Methylocapsa、Methylocella、Methylocystis、Methylomicrobium、Methylomonas、Methylophaga、Methylophilus、Methylopila、Methylosarcina、Methylotenera、Methylovorus、Microbacterium、Microbispora、Microbulbifer、Microcella、Micrococcus、Microcyclus、Microechinospora、Microellobosporia、Microlunatus、Micromonas、Micromonospora、Micropolyspora、Micropruina、Microscilla、Microstreptospora、Microtetraspora、Microvirgula、Millisia、Mima、Mitsuokella、Mobiluncus、Modestobacter、Moellerella、Mogibacterium、Moorella、Moraxella、Moraxella (Branhamella)、Moraxella(Moraxella)、Morganella、Moritella、Muricauda、Muricoccus、Myceligenerans、Mycetocola、Mycobacterium、Mycoplana、Myroides、Myxobacter、Myxococcus、、Nakamurella、Nannocystis、Natroniella、Natronincola、Nautilia、Naxibacter、Neisseria、Nereida、Nesterenkonia、Nevskia、Nicoletella、Nih Group 12、Nitratifractor、Nitratireductor、Nitratiruptor、Nitrobacter、Nocardia、Nocardioides、Nocardiopsis、Nonomuraea、Novosphingobium、Obesumbacterium、Oceanibulbus、Oceanicaulis、Oceanicola、Oceanimonas、Oceanithermus、Oceanobacillus、Oceanobacter、Oceanomonas、Oceanospirillum、Ochrobactrum、Octadecabacter、Odontomyces、Oenococcus、Oerskovia、Oleiphilus、Oleispira、Oligella、Oligotropha、Olsenella、Opitutus、Orenia、Oribacterium、Ornithinicoccus、Ornithinimicrobium、Ornithobacterium、Oryzihumus、OttoWia、Oxalicibacterium、Oxalobacter、Oxalophagus、Oxobacter、Paenibacillus、Paludibacter、Pandoraea、Pannonibacter、Pantoea、Papillibacter、Parabacteroides、Paracoccus、Paracolobactrum、Paralactobacillus、Paraliobacillus、Parascardovia、Parasporobacterium、Parvibaculum、Parvimonas、Parvopolyspora、Pasteurella、Pasteuri a、Patulibacter、Paucibacter、Paucimonas、Paucisalibacillus、Pectinatus、Pectobacterium、Pediococcus、Pedobacter、Pelczaria、Pelobacter、Pelodictyon、Pelomonas、Pelosinus、Pelospora、Pelotomaculum、Peptococcus、Peptoniphilus、Peptostreptococcus、Peredibacter、Persephonella、Persicivirga、Persicobacter、Petrimonas、Petrobacter、Petrotoga、Phaeobacter、Phaeospirillum、Phascolarctobacterium、Phenylobacterium、Phocoenobacter、Photobacterium、Photorhabdus、Phyllobacterium、Phytomonas、Pigmentiphaga、Pilimelia、Pimelobacter、Pirellula、Planctomyces、Planifilum、Planobispora、Planococcus、Planomicrobium、Planomonospora、Planosporangium、Planotetraspora、Plantibacter、Pleomorphomonas、Plesiocystis、Plesiomonas、Podangium、Polaribacter、Polaromonas、Polyangium、Polymorphospora、Pontibacillus、Porphyrobacter、Porphyromonas、Pragia、Prauserella、Prevotella、Proactinomyces、Promicromonospora、Promyxobacterium、Propionibacterium、Propionicimonas、Propioniferax、Propionigenium、Propionimicrobium、Propionispira、Propionispora、Propionivibrio、Prosthecobacter、Prosthecochloris、Prosthecomicrobium、Protaminobacter、polyPeptideiphilum、Proteus、Providencia、Pseudaminobacter、Pseudoalteromonas、Pseudoamycolata、Pseudobutyrivibrio、Pseudoclavibacter、Pseudomonas、Pseudonocardia、Pseudoramibacter、Pseudorhodobacter、Pseudospirillum、Pseudoxanthomonas、Psychrobacter、Psychroflexus、Psychromonas、Psychroserpens、Pullulanibacillus、Pusillimonas、Pyxicoccus、Quadrisphaera Rahnella、Ralstonia、Ramibacterium、Ramlibacter、Raoultella、Rarobacter、Rathayibacter、Reinekea、Renibacterium、Renobacter、Rhabdochromatium、Rheinheimera、Rhizobacter、Rhizobium、Rhizomonas、Rhodanobacter、Rhodobacter、Rhodobium、Rhodoblastus、Rhodocista、Rhodococcus、Rhodocyclus、Rhodoferax、Rhodomicrobium、Rhodonellum、Rhodopila、Rhodopirellula、Rhodoplanes、Rhodopseudomonas、Rhodospirillum、Rhodothalassium、Rhodothermus、Rhodovibrio、Rhodovulum、Riemerella、Rikenella、Robiginitalea、Roseateles、Roseburia、Roseiflexus、Roseinatronobacter、Roseobacter、Roseococcus、Roseospira、Roseospirillum、Roseovarius、Rothia、Rubritepida、Rubrivivax、Rubrobacter、Ruegeria、Ruminobacter、Ruminococcus、Runella、、Saccharibacter、Saccharococcus、Saccharomonospora、Saccharophagus、Saccharopolyspora、Saccharothrix、Sagittula、Salana、Salegentibacter、Salinibacter、Salinibacterium、Salinicoccus、Salinimonas、Salinispora、Salinivibrio、Salinospora、Salipiger、Salmonella、Samsonia、Sanguibacter、Saprospira、Sarcina、Sarraceniospora、Scardovia、Schlegelella、Schwartzia、Sebekia、Sedimentibacter、Sedimenticola、Segniliparus、Seinonella、Sejongia、Selenomonas、Seliberia、Serinicoccus、Serratia、Shewanella、Shigella、Shinella、Shuttleworthia、Silanimonas、Silvimonas、Simonsiella、Simplicispira、Simsoniella、Sinococcus、Sinorhizobium、Skermania、Slackia、Smaragdicoccus、Smithella、Sodalis、Soehngenia、Sorangium、Sphaerobacter、Sphaerophorus、Sphaerosporangium、Sphaerotilus、Sphingobacterium、Sphingobium、Sphingomonas、Sphingopyxis、Sphingosinicella、Spirilliplanes、Spirillospora、Spirillum、Spirochaeta、Spirosoma、Sporacetigenium、Sporanaerobacter、Sporichthya、Sporobacter、Sporobacterium、Sporocytophaga、Sporohalobacter、Sporolactobacillus、Sporomusa、Sporosarcina、Sporotalea、Sporotomaculum、Stackebrandtia、Staleya、Staphylococcus、Stappia、Starkeya、Stella、Stenotrophomonas、Sterolibacterium、Stigmatella、Streptacidiphilus、Streptimonospora、Streptoallomorpha、Streptoalloteichus、Streptobacillus、Streptobacterium、Streptococcus、Streptomonospora、Streptomyces、Streptomycetoides、Streptomycoides、Streptosporangium、Streptoverticillium、Subdoligranulum、Subtercola、Succiniclasticum、Succinimonas、Succinispira、Succinivibrio、Sulfitobacter、Sulfobacillus、Sulfuricurvum、Sulfurihydrogenibium、Sulfurimonas、Sulfurospirillum、Sutterella、Suttonella、Syntrophobacter、Syntrophobotulus、Syntrophococcus、Syntrophomonas、Syntrophothermus、Syntrophus、、Tatlockia、Tatumella、Taxeobacter、Taylorella、Teichococcus、Telluria、Tenacibaculum、Tepidanaerobacter、Tepidibacter、Tepidimicrobium、Tepidimonas、Tepidiphilus、Terasakiella、Terrabacter、Terracoccus、Terribacillus、Terrimonas、Tessaracoccus、Tetragenococcus、Tetrasphaera、Tetrathiobacter、Thalassobacillus、Thalassobacter、Thalassobius、Thalassolituus、Thalassomonas、Thalassospira、Thauera、Thaxtera、Thermacetogenium、Thermaerobacter、Thermanaeromonas、Thermanaerovibrio、Thermicanus、Thermincola、Thermithiobacillus、Thermoactinomyces、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium、Thermoanaerobium、Thermoanaerolinea、Thermobacterium、Thermobacteroides、Thermobifida、Thermobispora、Thermobrachium、Thermochromatium、Thermocrinis、Thermocrispum、Thermodesulfatator、Thermodesulfobacterium、Thermodesulfobium、Thermodesulforhabdus、Thermodesulfovibrio、Thermoflavimicrobium、Thermohydrogenium、Thermolithobacter、Thermomicrobium、Thermomonas、Thermomonospora、Thermonema、Thermonospora、Thermopolyspora、Thermosediminibacter、Thermosiculum、Thermosinus、Thermosipho、Thermosyntropha、Thermotoga、Thermovenabulum、Thermovibrio、Thermovirga、Thermus、Thetysia、Thialkalimicrobium、Thialkalivibrio、Thioalkalimicrobium、Thioalkalivibrio、Thiobaca、Thiobacius、Thiobacter、Thiocapsa、Thiococcus、Thiocystis、Thiodictyon、Thiohalocapsa、Thiolamprovum、Thiomicrospira、Thiomonas、Thiopedia、Thioreductor、Thiorhodoccocus、Thiorhodococcus、Thiorhodovibrio、Thiosphaera、Thiothrix、Thorsellia、Tindallia、Tissierella、Tolumonas、Trabulsiella、Treponema、Trichococcus、Trichotomospora、Truepera、Tsukamurella、Tuberibacillus、Turicella、Turicibacter、、Unclassified、Ureibacillus、Uruburuella、、Vagococcus、Varibaculum、Variovorax、Veillonella、Verrucomicrobium、Verrucosispora、Vibrio、Victivallis、Virgibacillus、Virgisporangium、Vitreoscilla、Vogesella、Volcaniella、Volucribacter、Vulcanibacillus、Vulcanithermus、、Waksmania、Wautersia、Weeksella、Weissella、Williamsia、Wolinella、Woodsholea、Xanthobacter、Xanthomonas、Xenophilus、Xenorhabdus、Xylanibacter、Xylanibacterium、Xylanimicrobium、Xylanimonas、Xylella、Xylophilus、Yania、Yersinia、Yokenella、、Zavarzinia、Zimmermannella、Zobellia、Zoogloea、Zooshikella、Zymobacter、Zymobacterium、Zymomonas 以及Zymophilus。
含有本发明多肽的植物
当气候条件不是作物生产的最佳条件时，本发明的多核苷酸和多肽在植物宿主细胞和其他转基因生物中的应用可以防止有价值的作物的损失。具体地，本发明提供新颖和创新的转基因植物和作物，它们能够经受现有植物和作物难以忍受的气候条件。本发明的包含多核苷酸并生产本发明的多肽的植物宿主细胞形式的作物实例是：葡萄、油籽植物、如油菜籽、谷物(燕麦、大麦、黑麦等)，柑橘类水果和甘蔗。
本发明还涉及含有本发明多肽的转基因水果和蔬菜。含有本发明多肽的转基因水果和蔬菜能够经受更低的温度，比如在储存和/或运输期间。实例包括草莓、蓝莓、覆盆子、柑橘类水果、香蕉、葡萄、猕猴桃、桃子、菠萝、李子、樱桃、西红柿和芒果。
含有本发明多肽的花
本发明涉及的冷冻花包括郁金香、玫瑰、百合等。
鱼
适用于本发明的鱼的实例为长鳍金枪鱼(Thunnus alalunga)、剑齿鲽鱼(Atheresthes stomias)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)、大西洋刀鱼(Trichiurus lepturus)、大西洋鲑鱼(Salmo salar)、大西洋狼鱼(Anarhichas lupus)、多须石首鱼(Pogonias cromis)、乌鲳(Parastromateus niger)、黑脊比目鱼(Sole，Pleuronectes americanus)、黑鳍鲨(Carcharhinus limbatus)、鲶鱼(Ictalurus furcatus)、蓝蟹(Callinectes sapidus)、枪鱼(Makaira nigricans)、岩鱼(Sebastesauriculatus)、河豚(Sphoeroides annulatus)、鲉鱼(Scorpaena guttata)、红鲈(Semicossyphus pulcher)、岩鱼(Sebastes pinniger)、鲷鱼(Lutjanuspurpureus)、鲶鱼(Ictalurus punctatus)、岩鱼(Sebastes goodei，Sebastesnebulosus)、奇努克(Oncorhynchus tshawytscha)、鲭鱼(Scomberjaponicas)、银鲑鱼(银，中红)(Oncorhynchus kisutch)、长尾鲨(Alopiasvulpinus)、石斑鱼(Epinephelus fulva)、单鳍鳕(Brosme brosme)、鲯鳅鱼(Coryphaena hippurus)、鳎鱼(Microstomus pacificus)、鳎鱼(Pleuronectes vetulus)、玉梭鱼(Lepidocybium flavobrunneum)、海鲂(Zeus faber)、大洋鲈(Sebastes norvegicus)、鲷鱼(Lutianus griseus)、鳎鱼(比目鱼)(Glyptocephalus cynoglossus)、梭鱼(Sphyraenabarracuda)、黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)、金枪鱼(Euthynnusaffinis)、鲷鱼(Lutjanus synagris)、蛇鳕(Ophiodon elongates)、遮目鱼(Chanos chanos)、罗非鱼(Tilapia mossambica)、尼罗罗非鱼(Tilapianilotica)、河豚(Sphoeroides maculates)、方头鱼(Caulolatilusprinceps)、油鱼(Ruvettus pretiosus)、橙连鳍鲑(Hoplostethusatlanticus)、梭鱼(Sphyraena argentea)、松鱼(Sarda chiliensis)、鳕鱼(太平洋鳕，Gadus macrocephalus)、杰克鱼(Caranx caninus)、杰克鱼(Selene peruviana)、大洋鲈(Sebastes alutus)、鲭鱼(Scomberscombrus)、马鲛鱼(Scomberomorus sierra)、鲷鱼(Lutjanus peru)、巴塔哥尼亚齿鱼(Dissostichus eleginoides)、鳎鱼(比目鱼，Eopsetta jordanl)、粉红鲑(弓背)、(Oncorhynchus gorbuscha)、青鳕(Pollachius virens)、岩鱼(Sebastes maliger)、鳟鱼、虹鳟(钢头)(Oncorhynchus mykiss)、红鼓鱼(雄鲑)(Sciaenops ocellatus)、棘鬣鱼(Chrysophrys auratus)、鲷鱼(Lutjanus campechanus)、岩鱼(Sebastes proriger)、鳎鱼(比目鱼，Errexzachirus)、笛鲷(Lutjanus apodus)、红鲈(Archosargusprobatocephalus)、鲨鱼、灰鲭鲨(Isurus oxyrinchus)、鲷鱼(Lutjanusvivanus)、平鱼(Pampus argenteus)、岩鱼(Sebastes brevispinis)、鲣鱼(Katsuwonus pelamis)、刺足鱼(Siganusjavus)、白花鱼或石首鱼(Roncador stearnsi)、比目鱼(Platichthys stellatus)、枪鱼(Tetrapturusaudax)、鲈鱼(Morone chrysops x saxatilis)、旗鱼(Xiphias gladius)、鲤鱼(Barbodes schwanefeldl)、青鳕(阿拉斯加青鳕，Theragrachalcogramma)、海鳕(Urophycis tenuis)、岩鱼(Sebastes entomelas)、比目鱼(Scophthalmus aquosus)、石首鱼(黄鱼、Pseudosciaenamanchurica)、岩鱼(Sebastes ruberrimus)、金枪鱼(Thunnus albacores)、黄条纹鲹(Selaroides leptolepis)、黄尾鱼(Seriola lalandel)、比目鱼(Limanda ferruginea)、岩鱼(Sebastes flavidus)和鲷鱼(Ocyuruschrysurus)、红点鲑(Salvelinus alpines)、多宝鱼、格林兰鲽(Reinhartdiushippoglossoides)、大比目鱼(Hippoglossus hippoglossus)。
冷冻的食品和食用产品
冷冻食品(包括冷冻蔬菜)的再结晶导致这类食品的口味和质地变差。本发明的抗冻多肽可以用于处理冷冻食品或待冷冻的食品，以防止发生再结晶。用本发明处理的食品实例包括但不限于：冰淇淋、冷冻酸奶、汤、布丁、雪酪、雪糕、冷冻甜点如奶油冻、布丁等，以及其他需冷冻的液体或半液体。冷冻蔬菜，如芹菜、土豆、芦笋、豌豆、胡萝卜、豆子、花椰菜、甜玉米、菠菜、绿豆等也都属于本发明的考虑范围。
本发明的多肽还可影响乳糖晶体的形成。因此，在不受任意具体理论的约束的情况下，可以认为本发明的多肽抑制乳糖晶体的结晶和/或生长。众所周知，在冰淇淋冷冻期间，所有物质(包括乳糖)的含量都越来越浓缩。液态水的含量除外，它是递减的。当乳糖的含量达到一定水平时，乳糖晶体开始结晶。这种结晶是一个缓慢的过程，其发生在-20℃。通常，冰淇淋储存在约-20℃。然而，在许多情况下，冰淇淋并非储存在稳定和恒定的温度下，但温度在约-20℃波动。因此，在温度高于-20℃的期间，乳糖的晶体将会生长并且形成新晶体。所以，冰淇淋的口感会变得更粗糙，而大多数人觉得这种口感不太好。现在意外地发现，当本发明的多肽在冰淇淋冷冻之前加到冰淇淋中时，明显地减少了乳糖晶体的形成，并且在约-20℃储存时明显防止了新晶体的形成。因此，储存的冰淇淋产品的质量明显提高。
本发明的冷冻食用产品的实例在本文以下有更详细的描述。
含有本发明多肽的冷冻发酵产品
冷冻或冷藏食品是目前发达国家人类饮食中的主要部分。因此食品科学家已经和正在进行广泛研究，以确保为消费者提供高质量的产品。对于冷冻蔬菜及冷冻甜食(如冰淇淋和酸奶)来说尤其如此。
冷冻甜食，如冰淇淋或酸奶，通常是在冷冻状态下食用。因此，对消费者来说，冷冻产品的质地及其口味都很重要。质地在很大程度上是由冰晶体的大小决定的。这些冷冻甜食的程序耗费了相当多的精力和费用来保证产品有爽滑的质地。然而，在冷冻储存期间，冰晶体会生长并因此变粗糙和破坏这种质地。冰晶体在冷冻储存期间的生长称作再结晶。当冷冻储存条件不够理想时，这个问题尤其常见，例如运输或在现代无霜家用冰箱储存期间。在零上温度(即0℃以上)、甚至在持久的冷冻温度下，由于冰再结晶过程，冷冻食品会在相对短时间后就变得不可口，甚至不适合人食用。
将抗冻多肽掺入冷冻发酵食品的理想方法是让生物负责发酵过程，在发酵食品时产生抗冻多肽。
因此，本发明包括制备冷冻发酵食品的方法。该方法包括步骤：(a)使食品与能够分泌本发明多肽的微生物接触，其中该微生物能够发酵该食品，以产生发酵食品，(b)在发酵进行的条件下用微生物培养该食品，使得产生具有抗冻多肽的发酵食品，抗冻多肽是以有效抑制该产品再结晶的量存在；和(c)在-5℃下冷冻该发酵食品，以便产生冷冻的发酵食品。
在一种实施方式中，该食品可以是奶制品(如牛奶)，其可以发酵来生产酸奶、脱脂奶或奶酪。
本发明的微生物通常是细菌(即保加利亚乳杆菌、乳酪链球菌、乳链球菌、两岐双岐杆菌、长双歧杆菌)，还可以是真菌，如酵母菌(即脆壁酵母、酿酒酵母、乳酸酵母及其他)。根据本发明，这些微生物经基因工程处理，使得它们能够分泌本发明的多肽。
在最优选的实施方式中，本发明包括：用能够发酵牛奶产生酸奶并且能够分泌抗冻多肽的细菌物种保加利亚乳杆菌和乳链球菌培养牛奶，这些细菌物种能够发酵牛奶以生产酸奶并且能够分泌抗冻多肽；在生产酸奶的条件下培养该细菌和牛奶；以及在低于-5℃的温度下冷冻酸奶，以生产冷冻酸奶。
本发明还提供一种包含酸奶和微生物的组合物，其中微生物含有编码本发明的多肽的基因。
本文使用的“发酵”指食品中的碳水化合物或多肽通过使用微生物而发生的化学转化。在该过程中，碳水化合物通常转化为乳酸。
本文使用的“发酵食品”指通过用包括微生物发酵的工艺制备的食用产品。
本文使用的“酸奶”指通过微生物的作用，由乳酸发酵的牛奶生产的奶制品。
本文使用的“重组产生的多肽”指用重组DNA技术生产的多肽。重组DNA技术是众所周知的，其特征在于将非天然连接的至少两个DNA片段连接起来(例如，细菌启动子和多肽编码序列)。
参考序列可能比全长的天然形成的多肽或多核苷酸序列短，但对多肽来说至少为12个残基长，而对多核苷酸来说为至少36个碱基长。
本发明还提供通过加入微生物制备冷冻发酵食品的方法，该微生物能够发酵食品以生产发酵的食品，并且还能分泌本发明的多肽。分泌本发明的多肽并使食品发酵的微生物的应用相对于影响冰晶体形成和冻结温度的其他方法而言具有几个优势。例如，该方法避免了在加入到食品中之前纯化本发明多肽的花费需要，此外，这会消除纯化过程以及与外来微生物相关的发热引起的任意可能的污染。而且，因为本发明的多肽是通过发酵本发明提出的微生物而分泌得到，所以该过程需要的步骤比其他方法少。
本发明的食品通常是牛奶，但也可以使用其他的食品，这些食品可以发酵以生产食用发酵食品。实例包括卷心菜(可发酵来生产泡菜)、黄瓜(可发酵来生产腌菜)以及大豆(可发酵来生产味噌和其他食品)。
在本发明的一个步骤中，将食品与能发酵该食品的微生物接触或混合。食品发酵中可用的微生物的实例是众所周知的(例如，见van de Guchte，1992，FEMS Microbiology Reviews，88：73-92)。
在优选的实施方式中，食品是奶类(例如来自奶牛(即牛)、母羊、母马或山羊)。根据选择的细菌和孵化的条件，微生物(通常为细菌)对奶制品的发酵作用产生酸奶、酪乳或某些奶酪。在最优选的实施方式中，本发明的方法用于由奶类生产酸奶。酸奶在世界各地有各种不同的名称。以下列出常见的酸奶品种的名称和原产国：
产品名称 原产地
Jugurt/Eyran/Ayran 土耳其等
Busa 土耳其斯坦
Kissel Mleka 尔干半岛
Urgotnic 尔干山脉
Leban/Laban 黎巴嫩/阿拉伯国家
Zabady(Zabbady) 埃及/苏丹
Mast/Dough 伊朗/阿富汗
Roba 伊拉克
Dahi/Dadhi/Dahee 印度
Mazun/Matzoon/Matsun/Matsoni 美尼亚
Katyk 外高加索
Tiaourti 希腊
Cieddu 意大利
Mezzoradu 西西里岛
Gioddu 撒丁岛
Biokys 捷克斯洛伐克
Karmdinka 波兰
Tarho 匈牙利
Tykmaelk/Ymer 匈牙利
Villi(Fiili) 芬兰
Filmjolk/Fillbunke/Surmelk/Taettemjolk/Tettemelk 斯堪的那维亚
Iogurte 巴西/葡萄牙
Proghurt 智利
Skyr 冰岛
Gruzovina 南斯拉夫
Kefir/Donskaya/Varentes (前)苏联
Kurunga/Koumiss/Ryazhenka/Guslyanka
Tarag 蒙古
Shosim/Sho/Thara 尼泊尔
生产酸奶的方法可以在Nakazawa and Hosono，1992年编的Functions ofFermented Milk中找到，由Elsevier Applied Science出版，London-New York，p.32，将其在此纳入作为参考。在美国，酸奶是由奶牛的全脂或脱脂奶生产。奶被标准化为10.5-11.5％固体物，加热至90℃以上(30至60分钟)，以破坏任意污染微生物，然后再冷却。然后将该物质用1∶1比例的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合培养物接种。通常需要这两种生物的结合作用以获得产品中所需要的风味和酸。在其他情况下，还可以使用其他高发酵细菌，包括保加利亚细菌、L.jugarti、L.acidophilus、双歧杆菌属酵母和乳酸真菌。以下列出的是用于牛奶发酵以生产酸奶的细菌和其他生物的实例：
种属 习性 发酵 主要物种
Streptococcusa 球菌链 同型 S.cremoris，lactis，thermophilus
Leuconostocb 球菌对 异型 L.citrovorum，mesenteroides
Lactobacillusc 杆状 同型 L.acidophilus，bulgaricus，casei，jugurti，lactis
Bifidobacterium 杆状 异型 B.bifidum，breve，longum
其他：
酵母(Torulopsis holmil；Saccharomyces fragilis，cerevisiae，lactis；Candida pseudotropicalis等)
真菌(Geotrichum candidum)
醋酸菌(Acetobacter aceti，rasens)
a目前的Lactococcus lactis subsp.cremoris，Lac，lactis subsp.lactis和S.thermophilus。
b目前的L.mesenteroides subsp.cremoris和L.mesenteroides subsp.mesenteroides。
c目前的L.acidophilus，L.delbrueckii subsp.bulgaricus，L.casei subsp.casei，L.helveticusbiovar.Jugurti和L.delbrueckii subsp.lactis。
可以对这些微生物进行基因工程设计(即，采用重组DNA技术)，以便它们能够分泌本发明的多肽。
已经建立了改造能够表达和分泌异源性多肽的细菌和真菌的方法(例如，见Maniatis et al.(1982)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Berger and Kimmel，Guide to MolecularCloning Techniques，Methods in Enzymology 152(Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif.)；Simon et al.，1986，Appl.Environ.Microbiol.52：394-395；vonWright et a.，1985，Appl.Environ.Microbiol.50：1100-1102，将其全部引入作为参考)。
能够表达和分泌AFP的微生物的生产可以用普通技术人员知道的各种方法完成。编码AFP的DNA序列优选地被可操纵地连接(即，被定位以确保其功能)到操纵子，其使DNA转录(成为RNA转录本)并在微生物中翻译成多肽。用于细菌和真菌的启动子都是本领域众所周知的。优选用于在乳酸菌中表达的操纵子包括S.thermophilus的乳糖操纵子、L.lactic的lacABCDFEGX操纵子，因为它们已经成功地用于驱动宿主中的外源基因表达(例如，见Simons et al.，1993，J.Bact.175：5186-5175；Mollet et al.，1993，J.Bact.175：4315-4324)。
本发明的多肽可表达为融合多肽，以便增强稳定性或其他有益性质。此外，通过修改编码多肽的基因可以修饰本发明的多肽。一般地，基因的修饰可以用各种众所周知的技术完成，例如定向诱变(例如，见Gillman and Smith，1979，Gene 8：81-97and Roberts et al.，1987，Nature 328：731-734)。
本发明的微生物能够分泌本发明的多肽。因此，本发明的多肽优选与信号肽序列连结。适宜的信号肽序列包括选自L.lactis ssp lactis MG 1363的usp45基因以及L.lactis ssp cremoris SK11细胞壁相关的蛋白酶基因(vanAsseldonk et al.，1990，Gene 95：155-160；De vos et al.，1989，J.Dairy Sci.72：3398-3405)。对于细菌，如L.lactis来说，优选的是usp45信号肽，因为它来自同样的宿主。在一种优选的实施方式中，本发明的多肽基因与转录终止序列连接，以确保本发明多肽的转录在宿主系统中正确终止。
用质粒如pUC19、pNZ18和pDBN183作为载体，构建包含上述元件的基因构建体(Solaiman et al.，1992，Plasmid，28：25-36)。用同源重组技术，将该基因构建体并入乳酸菌物种的基因组中(Mollet et al.，1993，J.Bact.，175：4315-4324)。乳酸菌和E.coli菌株可以按照Maniatis et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，上文和Chagnand et al.，1992，Can.J.Microbiol.38：67-74的推荐来保存。
含有本发明多肽的微生物可以通过任意常规方法应用到食品中。在产品，如牛奶中，细菌或者真菌可以在初始与待发酵和冷冻的食品混合。本领域的技术人员知道，有时用不同微生物的混合物来生产所需的产品。例如，在制备酸奶时，通常一起使用S.thermophilus和L.bulgaricus。
添加到食品中的FAE微生物的数量取决于该微生物和食品的性质。一般而言，乳酸FAE启动细菌(1010-1011/ml)以1-5％培养进入杀菌并冷却的牛奶中，使得这种比例使本发明多肽在产品中为合适的量。产品中AFP的量应该是有效防止和抑制冰再结晶的量(1-100mg/L奶)。这可以按照Knight etal.(1988)Cryobiology，vol.25，pp.55-60的描述用急冷分析法来确定。
该方法的另一个步骤中，发酵食品是用传统的冷冻机操作进行冷冻，如气流冷冻机(-20至40℃)或接触平板冻结机(-300到40℃)或真空冷冻干燥机。对普通技术人员来说显而易见的是，上述实施方式可能有多种变化。
含有本发明的多肽的冰淇淋
另一方面，本发明提供了一种含有本发明多肽的冰淇淋产品。该冰淇淋产品还可以含有伴随本发明多肽的乳化体系。该乳化体系可以是技术人员知道的任意体系。然而，特别优选的是包含1，2-丙二醇的单酯和脂肪酸的体系，如US 2005/0163902或WO 2008/064675中描述的那些。
在按本文以下描述生产的冰淇淋中，本发明的多肽可以作为纯化多肽添加，在冰淇淋的生产期间与其他成分混合，或者本发明的多肽可以作为用于发酵牛奶的微生物的分泌物存在。
以下是一种制备本发明的冰淇淋的方法。
在第一步中，将食品中间体与上述乳化剂体系接触。
本文使用的术语“食品中间体”表示适合制备冰淇淋的成分的混合物。适于制备冰淇淋的成分可包括水、脂肪，如乳脂或植物油、非脂性乳固体(MSNF)、甜味剂、稳定剂、香料和色素。此外，本发明的多肽可能已经存在于乳固体中，或者可以作为单独的成分加到混合物中。
优选地，食品中间体包含脂肪。优选地脂肪是高月桂酸脂肪或乳脂。术语“高月桂酸脂肪”是指其中主要脂肪酸为月桂酸的脂肪。高月桂酸脂肪，如棕榈仁油硬化和硬化椰子油是β′稳定性的。因此，食物中间体优选地包含β′稳定性脂肪。
在第一步接触步骤之后，将选择的成分混合在一起。通常先将液体成分混合，随后添加干燥成分。液体成分可以是冷的或者可加热至约60℃。混合要求快速搅动以便掺入粉末，并且通常使用高速混合机。
如果使用黄油/乳脂油或植物脂肪，理想的应该是单独融化，并在40℃添加混合中，或者通过计量泵的方式在匀浆器的入口处经由静止混合器混合。
该混合物随后被巴氏灭菌。进行巴氏灭菌是为了消灭致病细菌和变质生物，如嗜冷生物。巴氏灭菌有三个不同的阶段：巴氏灭菌、均化和冷却。
进行混合物的匀化是为了通过将脂肪球的尺寸分解或降低到小于1μm，而形成脂肪乳剂。
巴氏灭菌可以通过连续巴氏灭菌或者分批巴氏灭菌来进行。
目前用的最常见的巴氏灭菌原理是连续巴氏灭菌，其中通常将冰淇淋混合物在平板热交换器中于80-90℃温度范围加热最少16秒。通常在一个大绝缘物料罐中混合成份，随后在高温短时(HTST)热交换器中进行连续巴氏灭菌。为了成份的增溶，有时可能需要预热至30℃至40℃。HTST系统配备有加热段、冷却段和再生段。
分批巴氏灭菌是一种老方法，其中所有的混合物成份在配备有热水套的桶内缓慢加热。为避免在罐的底部和侧面沉积污垢，加热过程必须温和，在混合物和加热介质之间有低的温度差(ΔT)。当ΔT必须较低并且混合体积/罐表面的比率通常较高时，这必然要花费几分钟时间以使混合物加热至60℃的温度。为了提高热从罐表面至混合物的转移，需要有效的搅拌混合物。分批巴氏灭菌的能量消耗非常高，与连续巴氏灭菌不同，其不存在热回收。
巴氏灭菌后，混合物通过高压方式均化。均化通常在约80℃的温度下进行，并且在温度为65-75℃下，均化压力可以是90巴(1300psi)至250巴(3600psi)。分批灌通常一前一后地运作，使得一个在保压时其他的在准备。自动计时器和阀门确保满足合适的保压时间。
匀化可以在巴氏灭菌之前或之后进行。
接着通过使混合物通过热交换器(板或双重或三重管)，将该混合物冷却至冷藏温度(4℃)。
混合物冷却至约为4℃的老化温度。然后，混合物老化最少4小时，但优选隔夜。这留出时间使脂肪结晶，并使多肽和多糖充分水合。
在老化之后，混合物被吸入调味罐，其中添加了任意液体调味料、果酱或色素。然后该混合物进入动态冻结过程，其冷冻部分水并搅动空气进入该冷冻混合物中。冷冻可以通过连续冷冻过程或分批冷冻/搅动进行。
连续冻结可以在桶式冷冻机中进行。桶式冷冻机是一种刮板式、管状热交换器，其上套有沸腾致冷剂，如氨或氟利昂。该混合物被泵入桶式冷冻机，并在约30秒至3分钟内从另一末端排出。就分批冷冻机来说，这一过程需要10至15分钟。当混合物从另一末端排出时，其中约50％的水被冻结。桶式冷冻机内部有转动叶片，其保持冰从冷冻机的表面刮离。在机器内部也有搅拌装置，其有助于搅动混合物并掺入空气。
冰淇淋含有大量的空气，通常高达其体积的一半。这使得产品具有轻质的性质。空气含量被称为膨胀率(overrun)。
当冰淇淋吸取的水约一半冻结时，可以向该半冻结浆体中加入颗粒物，如果粒、坚果或饼干。然后将冰淇淋包装并置于-30℃至-40℃的气流冷冻机中，在此将大部分残留水冻结。
硬化包括在气流冷冻机中静态(安静、无声)冻结包装好的产品。冻结速度最好应该是快速的，因此冻结技术包含带有加强的对流(带压缩风机的冻结管)或加强的传导(平板冻结机)的低温(-40℃)。
除了传统的硬化过程，冰淇淋可以从冰淇淋冷冻中泵入低温挤压机中(单或双螺杆挤压机)，将冰淇淋的温度调低到-12℃至-18℃。在填充或者挤压之后，冰淇淋可直接送入冷藏器中。
硬化的冰淇淋应该在低于-25℃储存。低于约-25℃，冰淇淋长时间保存相当稳定，不存在快速冰晶生长的危害。
如前所述，本发明的过程包括将食品中间体与乳化剂体系接触的步骤。
在一种优选的实施方式中，该过程包括将乳化剂体系溶解在水中的步骤。在该实施方式中，乳化剂体系可溶解在水中，然后食品中间体再与水接触。
在一种优选的实施方式中，该过程包括将乳化剂体系溶解在脂肪中的步骤。在该实施方式中，乳化剂体系可溶解在脂肪中，然后食品中间体再与脂肪接触。
在一种优选的实施方式中，该过程包括动态冻结步骤。
本文定义的术语“动态冻结步骤”是指使食品中间体经受冻结条件，同时搅拌该食品中间体。这与静态冻结步骤是相反的，静态冻结步骤中食品中间体经受冻结条件，同时保持静止。
在一种优选的实施方式中，该过程包括冻结步骤。
在一种优选的实施方式中，该步骤包括以低于-4℃的冷冻机回火温度进行冻结的步骤。回火温度优选为约-4℃至-7℃，优选约-5℃至-7℃，更优选约-5℃至-6℃，更优选约-6℃。回火温度是指离开冷冻机时的冰淇淋的温度。
含有本发明多肽的充气食品
本发明还提供一种含有本发明多肽的充气食品。冰淇淋、果子露、雪酪和冷冻酸奶可以作为食品的实例，可定性为充气产品。
术语“充气(的)”是指气体被有目的地掺入混合物中，例如通过机械手段。气体可以是任意气体，但是在食品方面优选地是食品级气体，如空气、氮气、氧化亚氮或二氧化碳。本发明的充气食品包含大量气泡，其中至少65％的气泡的具有低于20μm的直径。优选至少75％，更优选至少80％的气泡具有低于20μm的直径。优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少75％的气泡具有低于10μm的直径。
充气量通常称作“膨胀率”。在本发明中，％膨胀率是根据充气产品的体积和未充气混合物的体积进行定义：
膨胀率是在大气压力下测定。产品中存在的膨胀率的量会根据所需产品的性质而变化。
优选地食品具有至少20％的膨胀率，更优选至少50％，最优选最少80％。优选地食品具有最多400％的膨胀率，更优选最多200％，最优选最多120％。
充气食品可由本领域已知的任意方法制备。例如，使用预充气途径，这是从未充气混合物开始生产含大量小气泡的充气食品的过程。
在预充气途径中，包含本发明多肽并可选地含有其他成分的混合物(即，水溶液和/或悬浮液)进行充气步骤。该充气步骤必须有足够高的“强度”，以便产生大量的非常小的气泡(直径小于20μm)。充气过程的强度取决于很多因素，最重要的是充气步骤中能量损耗的速率，混合物和气泡在充气步骤中经历的流动的性质，以及混合物的粘度和温度。此外，充气步骤应该足够长，以便达到理想的充气程度(即，膨胀率)。
机械充气装置通常以切割混合物的转子为基础。能量消耗的速率是该装置转速的函数。一般而言，需要高速的能量消耗(因此高转速)以产生小气泡(例如，见：″Chemical Engineering for the Food Industry″，Fryer，Pyle andRielly，Blackie，London，1997)。
充气步骤的有效性还取决于充气装置中流动的性质。一般通过初始掺入相对大的气泡，随后分裂成较小的气泡来实现充气。人们已经知道，与简单的剪切流相比，拉伸流或伸长流对分裂气泡特别有效(见Rallinson，J.M.Ann.Rev.Fluid Mech.16，pp 45-66，1984)。适宜的可以提供至少一部分拉伸流的高剪切充气过程及装置包括：在转子-定子装置中连续振荡，如Oakes混合器(E.T.Oakes Corp)、Megatron混合器(Kinematica AG)、Mondo混合器(Haas-Mondomix BV)或Silverson混合器(Silverson Machines Inc)；气体注入后接着在连续流体装置中进行混合和分散，如刮面式换热器；分批振荡包含气体的表面夹带，例如用Hobart whisk混合器(Hobart UK)、KenwoodChef混合器(Kenwood Ltd)、Ultra-Turrax混合器(IKA Werke GmbH&Co.KG)或电动手持式混合器，如Breville kitchen手持搅拌器。
充气步骤的有效性还取决于混合物的粘度和/或温度。通过增加混合物的粘度和/或降低温度，充气装置对气泡尺寸减小的影响被增强。此外，充气步骤的效果还取决于混合物的配方。
尽管充气步骤的效果取决于所用的工艺和装置以及正充气的混合物的具体细节，通过考虑上述因素，本领域技术人员通过考虑上述因素，在具体情况下确定合适的工艺条件也属于本发明的范围。具体地，可以通过增加消耗的能量和/或通过增加拉伸流部分和/或增加混合物的粘度和/或通过降低混合物的温度，都可以增加非常小的气泡的比例。
例如，如果终产品是冷冻充气产品，如冰淇淋或雪酪，充气混合物可选择地在充气期间和/或之后进行冷冻。冷冻可以与充气同步进行，比如在刮面式换热器中。同步冻结和充气可以有助于形成非常小的气泡，因为冰形成时混合物的粘度增加。优选的是冻结在充气后进行，使得很少或者没有进一步掺入气体。
通过随后的冷冻操作可以进一步增加冰含量，例如低温挤压，将充气的混合物置于模具中，该模具浸在冷液体浴中，如盐水或乙二醇；将部分充气混合物直接滴入低温液体浴中，如液体氮气，或者将包含充气混合物的容器置于冷环境中，如冷冻机、气流冷冻器或冷藏库中。随后的冻结步骤优选地是在低剪切或零剪切下进行，使得很少或者没有进一步掺入气体。
除了本发明的多肽，本发明的充气食品(以及制备它们的混合物)可包含食品中常规存在的其他成分，如脂肪、奶或奶油；油或脂肪，特别是乳化相的形式；糖、盐、水果和/或蔬菜原料、提取物、果汁、增稠剂，如多糖、稳定剂、色素、调味剂，化学乳化剂，如单甘油酯；酸和防腐剂。优选的食品包括冰淇淋、雪酪、慕斯、生奶油、充气饮料，如奶昔和沙冰、低脂肪的糊状食品(如脂肪含量0-60wt％)、调料和调味汁。优选地，食品是冷冻或冷藏的充气甜食，如冰淇淋、冰糕或慕斯。
本发明冷冻充气甜食包含本发明的多肽，并可选地有一种或多种本发明多肽以外的抗冻多肽。在充气产品中，抗冻多肽的总量通常为至少约0.0001wt％，更优选至少0.0005wt％，最优选至少0.001wt％。抗冻多肽可以很低的浓度使用，因此优选地甜食含有小于0.05wt％的抗冻多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％。抗冻多肽可以单独使用，或者与本领域已知的其他抗冻多肽联合使用。
冷冻充气产品可选择地包含包衣，如巧克力层、或糖皮和/或内含物，如坚果、水果、太妃糖或巧克力片。在这种情况下，冷冻充气甜食中的脂肪含量不包括存在于包衣或内含物中的脂肪。
在一种实施方式中，冷冻充气甜食包含3wt％或更少的脂肪。优选2wt％或更少，更优选1wt％或更少。在优选的实施方式中，甜食是无脂肪的，意思是甜食基本上不包含脂肪(即，低于0.1wt％)。
包含本发明的多肽以及疏水蛋白和表面活性剂的充气食品
本发明还提供一种包含本发明的多肽以及疏水蛋白和表面活性剂的冷冻充气食品，如甜食。优选地，该充气食品包含大量气泡，其中至少65％的气泡具有低于20μm的直径。
冷冻充气甜食中存在的疏水蛋白的量一般会随甜食配方和气相的体积而变化。通常，甜食含有至少0.001wt％的疏水蛋白，更优选至少0.005或0.01wt％。通常，甜食含有低于1wt％的疏水蛋白。疏水蛋白可以是单一源或多源的形式，例如，疏水蛋白可以是两种或多种不同疏水蛋白多肽的混合物。
疏水蛋白是以可以稳定气相的形式和量添加。术语“添加”是指疏水蛋白有意地引入甜食中，目的在于利用其稳定泡沫的性质。所以，当存在或添加含有真菌污染物的成分，其可能含有疏水蛋白多肽时，这并不构成本发明上下文所指的添加疏水蛋白。
疏水蛋白通常以一种形式添加到甜食中，使得它能够在气-液表面自我组装。
疏水蛋白通常以分离的形式添加到本发明的甜食中。通常至少部分被纯化，比如基于固体重量，至少10％的纯度。“以分离的形式添加”是指疏水蛋白不是作为天然产生的有机体被添加，例如天然地表达疏水蛋白的蘑菇。相反，疏水蛋白通常提取自天然产生源，或者通过在宿主有机体中重组表达来获得。
在一种实施方式中，疏水蛋白是以单体、二聚体和/或寡聚体(即，由10个或更少的单体单元组成)添加到甜食中。优选地，添加的疏水蛋白的至少50wt％是这些形式中的至少一种，更优选至少75％、80％、85％或90wt％。一旦加入，疏水蛋白通常将在气体、液体界面进行组装，因此单体、二聚体和寡聚体的量预计将减少。
本文使用的术语“表面活性剂”(或“表面活化剂”)表示降低介质的表面张力的物质，其中该物质溶解于介质中，并因此积极吸附在液/气界面。
该术语包括通过在液体表面自发扩散，降低液体表面张力的难溶性物质。在本发明上下文中，术语“表面活性剂”不包括疏水蛋白。
术语“表面活性剂”不包括可能以非常低的量存在于其他(非表面活性)成分中的微量表面活性成分，例如稳定剂，如果胶、刺槐豆胶和瓜尔豆胶。在这种情况下，表面活性剂的量通常低于食品重量的0.05％。
表面活性剂通常是充气食品中使用的成分，因为它对口味和/或质地有有益作用。这种表面活性剂包括(但不限于)：
乳多肽：如酪蛋白，乳清(及其多肽片段)、酪蛋白钠、酪蛋白钙和水解乳清多肽；
其他多肽，如明胶、鸡蛋多肽、大豆多肽；
饱和或不饱和脂肪酸的单甘油酯和双甘油酯，如单甘油棕榈酸酯；
六元醇(通常为山梨醇)、乙二醇、乙二醇酯、聚甘油酯、山梨醇酐酯、硬脂酰乳酸、醋酸酯、乳酸酯、柠檬酸酯、乙酰单酸甘油乙酯、双乙酰酒石酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐酯(如聚山梨醇酯80)的聚氧乙烯衍生物；
非-离子表面活性剂，如烷基聚(环氧乙烷)、脂肪醇和蔗糖酯；
磷脂、磷脂类(如卵磷脂)混合物；以及上述任意混合物。
优选地，表面活性剂的量是产品重量的至少0.05％，更优选至少0.1％。优选地，表面活性剂为多肽，更优选乳多肽，并且是以食品重量的至少0.5％的量存在，更优选至少1％。优选地，表面活性剂是以食品重量的最多20％的量存在，更优选最多10％，最优选最多5％。
本发明的充气食品可以用“预充气”途径来生产(上述公开了进一步的细节)，这是一种从含有疏水蛋白和表面活性剂的未充气混合物开始，生产含大量小气泡的充气食品的过程。另一种途径称作“后添加”，提供了一种在充气之后添加表面活性剂的过程。
后添加途径提供一种方式，其中疏水蛋白的量可以增加，这与气泡形成时的表面活性剂的量有关，但充气发生之后添加表面活性剂时，它在终产品中保持不变。由此，将包含疏水蛋白而不含表面活性剂的混合物充气；随后将含有表面活性剂的第二混合物与该充气混合物合并。第二混合物经配方设计，使得合并的混合物具有令人满意的终产品配方。混合步骤可以用于改善合并混合物的均匀性。混合步骤优选在相对低剪切和短时间下进行，使得很少或几乎没有掺入气体(即，混合步骤膨胀率增加不超过10％)。适宜的混合装置包括：静态混合器；直列式动态混合器，如螺丝钻、搅拌机或加果机；分批混合装置，如搅拌容器。在批处理中，第二(含表面活性剂的)混合物通常会在接近处理周期的末尾时注入。该混合步骤可以以连续过程进行，比如在刮面式换热器中，或者螺旋挤压机中，在产物快要排出的时刻，将第二混合物注入刮面式换热器或者螺旋挤压机的桶内。
例如，假如成品是冷冻充气产品，如冰淇淋或雪酪，充气混合物可选择地可以在充气之前和/或之后进行冷冻。冷冻可以与充气同步进行，比如在刮面式换热器中。同步冷冻和充气可以有助于形成小气泡，因为当冰形成时混合物粘度增加。当冷冻在充气之后进行时，优选地是这样进行，使得很少或没有进一步掺入气体。当表面活性剂在充气之后加入时(即，后加入途径)，冷冻可以在混合步骤之前和/或混合期间进行。表面活性剂流可在混合之前变冷或部分冷冻。
含有本发明多肽的冷冻水甜食
冷冻水甜食通常相对较小，例如平均体积小于1ml，更优选小于0.5ml。举例来说，5mm至10mm直径的珠的体积会在约0.065ml至约0.5ml。通常离散的冷冻甜食具有最小的平均体积，使得各甜食能够容易地被消费者区分。例如，离散的冷冻甜食优选地具有至少约0.02ml的最小平均体积。
离散冷冻水甜食可以制成任意形状，比如立方体或球体。优选的是，冷冻甜食基本上是球体。
冷冻水甜食可以是复合产品的形式，其中该产品的至少一部分或区域，比如核或层，不含有本发明的多肽。这种情况的一个实例是含有冰淇淋核的产品，该冰淇淋核不含本发明的多肽，涂上一层含有本发明多肽的水冰。优选地，基本上复合甜食的外层含有本发明的多肽，即会接触到其他离散的冷冻甜食的区域。可以理解的是，对于复合产品来说，加到甜食中的本发明多肽的wt％量的计算仅与含有本发明多肽的甜食组分有关，而与完整的产品无关。
冷冻水甜食可以是充气或未充气的。未充气是指膨胀率小于20％的冷冻甜食，优选小于10％。未充气的冷冻甜食不进行有意的步骤，比如振荡以增加气体含量。然而，可以理解的是，在未充气冷冻甜食的制备期间，低水平的气体，如空气，可能掺入该产品中。
水冰甜食通常含有糖、水、色素、果酸或其他酸化剂，水果或水果调味剂和稳定剂。优选地，总固体含量为至少6wt％，更优选至少8wt％，或至少10、12、15或20wt％，并且可高达约35wt％。优选地总固体含量小于35wt％，更优选小于25wt％。水冰可以是充气或未充气的。如果充气，膨胀率通常小于约50％，比如约25％至30％。在一种实施方式中，本发明的水冰甜食是未充气的。
水冰甜食优选地包含低于2wt％的人造甜味剂，更优选小于1wt％。在高度优选的实施方式中，水冰甜食中不存在人造甜味剂，如阿斯巴甜或安赛蜜。
本发明的冷冻水甜食通常包含一种或多种稳定剂，例如选自树胶、琼脂、藻酸盐及其衍生物、明胶、果胶、卵磷脂、羧甲基纤维素钠、卡拉胶和红藻胶的一种或多种稳定剂。优选使用稳定剂的混合物，如树胶和卡拉胶的混合物。在优选的实施方式中，冷冻甜食包含0.1-1wt％的稳定剂。
本发明冷冻水甜食通常包含至少约0.0005wt％的本发明多肽。本发明多肽可以以非常低的浓度使用，因此甜食优选地包含小于0.05wt％的本发明多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％。
本发明冷冻水甜食可以用本领域内已知的多种技术来生产。例如，通过将液体混合物分配滴加至液氮的冷藏室内制备自由流动的珠子(见WO96/29896)。通过模制技术可以生产其他形状，例如通过将液体预混合料引入冷却的模具中。模制产品可包含复杂的形状，并且具有高度的表面定义。
含冰淇淋的产品及类似产品不需要进行低于-20℃至-25℃的冷硬化步骤，不过视需要也可以用到该步骤，尤其当产品是具有不含本发明多肽的层或核心的复合产品。
本发明冷冻水甜食产品可以包装在容器中作为独立的单元向消费者出售。这种容器的体积通常为100ml至1000ml，例如200ml至500ml。
然而，该产品也可以包装在较大的容器中用于零售目的，在零售条件下将产品分散到较小的容器中，比如在快餐店，或者作为混合选择模式，此时消费者可以从本发明具有不同形状、味道和/或颜色的冷冻甜食中进行选择。例如这些较大的容器具有大于约1000ml的体积，如至少2000ml或5000ml。
含有本发明多肽的离散冷冻乳制品甜食
本发明还提供冷冻甜食产品，包含多种离散未充气的乳制品冷冻甜食，它们能够直接接触产品中的其他离散冷冻甜食。
冰甜食是用于以冷冻状态(即，在食品温度小于0℃的条件下，并且优选地在食品包含大量冰的条件下)消费的甜味加工食品。本发明的冰甜食包含1-8wt％的脂肪，并且总固体含量为10-25wt％。脂肪和总固体的这些量，与水溶性充气气体以及本发明的多肽一起，使产品具有令人满意的质地和外观。典型的水冰配方(不含脂肪)和标准冰淇淋配方(总固体含量至少约30wt％)不属于离散冷冻乳制品甜食的定义。
本发明的冰甜食优选地包含2-6wt％，更优选2.5-5wt％的脂肪。脂肪可以来自任意适宜的来源，如乳脂、椰子油、棕榈油、可可油、葵花籽油、橄榄油或菜油、及其混合物或馏分。
冰甜食总固体含量是甜食的干重，即除去水之外的所有成分的总重，表示为总重量的百分比。它是按照Ice Cream，6th Edition，p 296中的描述来测定。本发明的冰甜食具有的总固体含量为冰甜食的10-25wt％。总固体含量优选地为至少12％，更优选至少15％，最优选至少18％。总固体量优选地最多为24％，更优选最多22％。
本发明的冰甜食含有冰。因为总固体含量是10-25wt％，水含量相应地为90-75wt％。在-18℃的温度下，大部分而不是全部的水被冻结。
本发明的冰甜食通常包含至少约0.0001wt％的本发明多肽，更优选至少0.0005wt％。本发明的多肽可以在非常低的浓度下使用，因此优选地甜食包含低于0.05wt％的本发明多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％，更优选0.005-0.01wt％。
充气剂是指因为其具有的表面活性和/或粘度而有助于形成小气泡并且抵制气泡合并和分离的任意成分。充气剂应理解为不包含充气的气体。充气剂优选地是多肽基充气剂，例如水解的乳多肽，如HygelTM和HyfoamaTM(购自Kerry Biosciences)；或者水解的大豆多肽，如Versawhip(购自KerryBiosciences)，和D-100TM(购自Gunter Industries)。或者，充气剂可以是非蛋白基的，例如单甘油酯，如Myverol 18-04K(由植物油制备的经蒸馏的95％单甘油酯，购自Quest International)，或聚甘油酯，如PGE 55(脂肪酸的聚甘油脂，购自Danisco)。甜食中的充气剂的量为至少0.1wt％，优选至少0.15wt％。
优选地，充气剂的量小于0.5wt％，优选小于0.4wt％，更优选小于0.25wt％。
本发明的冰甜食可包含稳定剂。稳定剂包括多肽，如明胶；植物压出物，如阿拉伯树胶、茄替胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶；种子胶，如刺槐豆胶、瓜尔豆胶、塔拉胶、洋车前子种子胶、温悖种子胶或罗望子种子胶；魔芋甘露聚糖；海藻提取物，如琼脂、海藻酸、卡拉胶或红藻胶；果胶，如低甲氧基或高甲氧基型果胶；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、甲基纤维素和甲基乙基纤维素、或羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；以及微生物胶，如葡聚糖、黄原胶或β-1，3-葡聚糖。稳定剂可以是单一稳定剂，或者两种或多种稳定剂的混合物。优选地，稳定剂是刺槐豆胶。稳定剂的量优选为最多0.3wt％，更优选最多为0.25wt％。例如，稳定剂的量通常为0-0.2wt％。
本发明的冰甜食可包含多肽(除任意的多肽基充气剂之外)，优选地是至少1wt％的量，更优选至少1.5wt％。包含至少上述量多肽的冰甜食被认为是乳冰型产品，与大量不含多肽的冰甜食相比更吸引众多消费者。优选地，多肽含量小于8wt％，更优选小于6wt％，最优选小于3wt％。用于本发明的适宜的多肽包括乳多肽、蛋多肽和胶质以及蔬菜多肽，如大豆多肽。尤其优选的是乳多肽，因为它们有更好的味道和热稳定性。乳多肽的适宜来源包括牛奶、浓缩奶、奶粉、乳清、乳清粉和乳清多肽浓缩分离物。
本发明的冰甜食通常包含糖，如蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、玉米糖浆、糖醇；它们还可包括其他成分，如色素和调味品。
冰甜食优选地具有至少20％的膨胀率，更优选至少40％，最优选至少60％。优选地，膨胀率为最多150％，更优选最多120％，最优选最多120％。
“混合物”指充气前(或融化的冰甜食除气后)的未充气混合物。膨胀率是在大气压力下测定。
本发明的冰甜食可构成整个产品或可为复合产品的一个组分。在复合产品中，本发明的冰甜食提供的质地和外观与产品其他组分形成对照。优选地，这种复合产品包含冰甜食作为其结构中的离散元素。例如，相对软的冰淇淋核可以包覆一层冰甜食，以提供包围冰淇淋核的硬质酥脆层。另一个实例是掺入冰甜食作为内含物。或者，冰甜食可以在至少一个表面上设置有比如冰衣、未充气的水冰或巧克力的连续或部分包衣。在复合产品中，总固体和脂肪、充气剂、冰结构多肽、稳定剂以及多肽含量的测定仅考虑冰甜食，而不考虑复合产品其他组分。
含有本发明多肽的离散冷冻乳制品甜食可用本领域已知的任意适宜的方法来制备，然而，离散乳制品甜食优选地通过以下方法制备，包含步骤：
(a)制备成分的混合物；然后
(b)巴氏杀菌并匀化该混合物；然后
(c)添加本发明的多肽；
(d)同时使该混合物冷冻并用充气气体对该混合物充气，充气气体含有至少50％体积的二氧化碳、氧化亚氮或其混合物，以生产冰甜食(例如在冰淇淋冷冻机中)；
(e)冷加工硬化该冰甜食，其中步骤(c)可以在步骤(b)期间或之前、之后进行。
混合物用气体充气，该气体含有至少约50％体积的二氧化碳、氧化亚氮或其混合物，优选至少约70％，更优选100％。充气气体的剩余部分通常为含氮气的气体，如空气。充气气体最优选地是100％二氧化碳。
冷冻后，得到的冰甜食可以在冷硬化步骤之前，比如通过挤压，随后切割或模制来成型。冰甜食优选地是在4℃至-1.5℃的温度下挤压，更优选-2.5℃至-1.5℃。相对高的挤压温度产生相当好的泡沫状外观。
冷硬化步骤优选地在约-25℃或更低的温度下进行，例如通过鼓风冷冻。在冷硬化之后，冰甜食优选地储存在-25℃至-10℃温度下，通常约-18℃。
含有本发明多肽的低脂肪乳制品
本发明还提供冷冻的低脂肪乳制品。冷冻乳制品甜食是通常含有乳或乳固体的甜食，如冰淇淋、奶冰、冷冻酸奶和果子露。术语“乳”包括乳替代品，如大豆乳，但优选的是哺乳动物的奶。冷冻乳制品甜食优选地是冰淇淋或奶冰。
本发明的低脂肪产品优选包含3wt％或更少的脂肪，优选2wt％或更少，更优选小于2wt％，或1wt％或更少。在一种实施方式中，该产品是不含脂肪的，意思是该产品中基本不含脂肪(即低于0.1wt％)。当产品包覆有非乳成分，如巧克力或糖皮层时，该产品脂肪量的测定应该排除包衣。
含乳的冷冻甜食优选包含至少约3wt％的无脂乳固体(MSNF)，更优选约5wt％至约25wt％的MSNF。
稳定剂可存在于本发明的冷冻产品中，但应该注意的是，本发明多肽的稳定作用在某些情况下可以代替稳定剂。然而，在某些产品配方中，比如含有低于1wt％脂肪的极低脂肪产品，除了本发明的多肽之外，仍可能需要大量的稳定剂，以产生令人满意的产品稳定性。然而，所得产品较以前的产品有所改进。因为本发明的多肽降低或改善了稳定剂对质地和味道的不良效果。
适宜的稳定剂包括藻酸盐、明胶、阿拉伯树胶、瓜尔豆胶、刺梧桐树胶、刺槐豆胶、卡拉胶及其盐、黄树胶、微晶纤维素、纤维素醚或其混合物。按重量计，稳定剂的量优选地为1.5％或更少，更优选1％或更少，如0.1-0.8wt％。
在一种实施方式中，产品包含至少0.5wt％的稳定剂，如至少0.7wt％的稳定剂。这种产品中的脂肪水平优选地为小于2wt％或1wt％。在另一种实施方式中，产品包含小于0.5wt％的稳定剂。这种产品中的脂肪水平优选地为至少1wt％或更多，更优选至少2wt％。
本发明的冷冻甜食通常包含至少约0.0001wt％的本发明的多肽。更优选至少0.0005wt％。本发明的多肽可以在非常低的浓度下使用，因此甜食优选地包含小于0.05wt％的本发明的多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％，更优选0.005-0.01wt％。
冷冻甜食可以是充气或未充气的，优选充气。未充气是指冷冻甜食具有小于20％的膨胀率，优选小于10％。未充气的冷冻甜食不进行有意的步骤，如振荡以增加气体含量。然而，可以理解的是，在未充气冷冻甜食的制备期间，低水平的气体，如空气，可能掺入该产品中。充气产品中存在的膨胀率的量会根据所需的产品性质而变化。例如，冰淇淋中膨胀率的量通常为70-100％，甜食如慕斯中的膨胀率可以高达200-250wt％，而奶冰中的膨胀率为25-30％。充气冷冻甜食优选地具有30％至200％的膨胀率，更优选50％至150％。
本发明的冷冻甜食可以用本领域内已知的各种技术来制备。产品通常静止或者使用搅拌冷冻，比如在刮面式换热器中。产品可以是模制的。产品可以包含复杂形状，并具有高度的表面定义，因为本发明多肽的添加保持了这种形状和结构的稳定性。
本发明的多肽可以在产品冷冻之前、期间或之后添加。如果在冷冻之后添加，则这将在产品仍可塑时进行，以便本发明的多肽可以被混合，例如在从刮面式换热器挤压后以及在硬化之前。
冰淇淋产品及其类似品可以进行可选的低于-20℃至-25℃的冷硬化步骤。
本发明还包括用于生产本发明的低脂肪冷冻甜食产品的组合物，该组合物包含本发明的多肽，优选至少0.005wt％的本发明多肽。这种组合物包括液体预混合物和干燥混合物，比如粉末，其中向干燥混合物中添加水液，比如奶或水。
设计用于在微波中解冻的冷冻食品，所述食品含有本发明的多肽
冷冻是用于贮存食品的非常常见的技术。除了某些明显的例外，冷冻食品通常在使用之前或者进一步处理之前解冻(如，烹饪)。通过将冷冻食品置于室温下圆满地完成解冻。然而，即使在家用规模上，完成令人满意的解冻所耗费的时间长也是相当大的。在工业规模上，解冻还通过对冷冻食品应用传导或对流热来完成。然而，需要完成这种解冻的设备对于消费者不容易获得。
微波炉正日益广泛地用于工业和家庭背景。它们其中的一个用途是解冻冷冻食品。微波解冻比在室温下解冻更快速。它也具有许多缺点：
■冷冻食品的低热扩散需要使用脉冲微波，以允许建立温度平衡；
■液体水比冰更容易吸收微波能量，往往导致“热点”及不平衡的解冻。
■与大小和形状相关的食品的几何学必须是适宜的；
■因为必须只用间歇的微波脉冲，解冻食品的时间是相当可观的。
已经发现，如果将含有中间相的水、乳化剂以及本发明多肽的组合物掺入食品中，以及如果至少水的量是作为未冻结水存在于冷冻食品中，则获得了改进的食品。
此处词汇“中间相”同时包括层状结构和传统的中间相，即片状、立方体、六角形(1和2)，L2和L1也分散的中间相，即脂质体、立方晶和六角相。此外，它包括形成胶束，该胶束也会形成这类表面。
已经发现，通过应用直接的微波能量可以均匀并快速地解冻上述冷冻食品，而没有必要使用间歇或脉冲微波。
可以相信的是，本发明系统保持冷冻食品中存在的部分未冻结水的能力是因为组合物形成中间相的能力。中间相是一种结构，其中极性乳化剂和水根据它们的极性排列在清晰的结构中。乳化剂的极性端基与水相接触。相信存在许多不同的中间相结构。与乳化剂的极性端基接近的水是以一种免于冻结的方式进行组织排列。
本发明组合物中水与乳化剂的比率取决于使用的乳化剂，以及组合物的具体应用。已经发现，对于任意具体的乳化剂/水系统，低于0℃存在的液体水的量(“未冻结水”)往往随水的比例增加直至最大值。达到该最大点时，基本上系统内所有的水被认为是未冻结的。超过该点时，存在的水的固定量是未冻结的，与冻结相平衡。
优选地，当存在于-15℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
优选地，当存在于-20℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
优选地，当存在于约-25℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
优选地，当存在于约-40℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
当存在于冷冻产品中时，本发明的组合物优选包含一定量的未冻结水，该未冻结水在低于0℃温度下是热力学稳定的。
优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少0.1％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少1％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少2％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少3％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少5％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少10％的量存在。
优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多99.9％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多50％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多40％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多30％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多25％的量存在。
优选地，水组分是以基于组合物总重量的0.1-99.9％之间的量存在。更优选地，水组分是以基于组合物总重量的1-25％之间的量存在。
优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少0.1％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少50％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少60％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少70％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少80％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少99.0％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少99.9％的量存在。
优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至99.9％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至99％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至97％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至95％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至90％的量存在。
优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的0.1-99.9％之间的量存在。更优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的75-90％之间的量存在。
优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少0.001％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少0.01％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少0.1％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少1％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少5％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少10％的量存在。
优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多90％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多50％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多25％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多15％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多10％的量存在。
优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的0.001-90％之间的量存在。更优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的0.01-10％之间的量存在。
在一个优选的方面，组合物包含低于25％w/w的油。更优选地，组合物包含低于10％w/w的油。更优选地，组合物包含低于5％w/w的油。更优选地，组合物包含低于1％w/w的油。更优选地，组合物包含低于0.1％w/w的油。最优选地，组合物基本不包含油。
其余组分也可存在于本发明的组合物中，只要它们在冷冻食品中存在时不影响保留至少一部分未冻结水的能力。
进行结合技术的一个实例是混合。将水与本发明的多肽和乳化剂混合可通过本领域技术人员显而易见的任意一种方法来实现。在电动混合器中混合就是一个实例。
如果组合物中存在除本发明的多肽、乳化剂和水以外的成分，那么这些成分可以在任意合适的阶段掺入。
优选地，食品包含足够量的组合物，以便食品中作为整体形式存在的未冻结水的量使均匀和快速的微波解冻成为可能。实际上，这相当于食品中作为整体存在的未冻结水的量为至少0.1％w/w。
用量水平取决于具体的食品、应用以及在冷冻后需要多少水来保持食品质地。
总产品的低至约0.1％的非冻结水的量使产品在微波炉中加热时快速并均匀地解冻。这种炉解冻使产品具有改进的结构性质。为得到本发明0.1％的未冻水，需要用大约0.20％的PGE。准确的乳化剂的量取决于乳化剂的性质，并且可由本领域技术人员快速确定。例如，0.14％的MO90或0.14％的PGE O70(Danisco，Denmark)会产生相同的效果。
优选地，食品包含至少0.1％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.2％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.3％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.4％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.5％w/w的本发明的组合物。
优选地，食品包含小于10％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含小于5％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含小于4％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含小于3％w/w的本发明的组合物。
优选地，食品包含0.1-5％w/w的本发明的组合物，更优选0.5-3％w/w。
本发明组合物的应用模式取决于所讨论食品的性质。例如，如果食品在室温下是液体或者半液体，则该组合物可以简单地通过将其与食品混合而掺入。
在本发明的某些实施方式中，水、本发明的多肽和乳化剂可以分别添加到食品中。本发明的多肽和乳化剂可以在加水之后加入。或者，水可在加入本发明的多肽和乳化剂之后加入。
优选的是，本发明的多肽、乳化剂和水在添加到食品之前合并。
或者，该组合物可以在食品制备工艺的任意时刻掺入。例如，组合物可以喷在食品的表面。组合物可以注入食品中(如，就禽、肉或鱼而言)。
技术人员可以判断何时最佳实现这种纳入。
优选地，食品选自低脂肪涂布的蛋黄酱、酸奶、面包馅料、人造黄油、重组水果、果酱、水果配料、水果馅、奶粉(ripple)、水果酱、炖水果、咖啡奶精、即时水果甜食、甜食(如棉花糖)，土豆基食品(如炸土豆条、炸薯条和炸丸子)，配制的餐食(如砂锅和炖菜)，以及精制食品(如调料，包括沙拉调料；番茄酱、油酱汁和汤)。该食品可以是饮料类、生的，经过处理或巴氏灭菌的食品，包括生肉、熟肉、生的家禽产品、熟的家禽产品、生的海鲜产品、熟的海鲜产品、[生或熟肉、禽和海鲜产品]、腊肠、香肠、易于吃掉的餐食、通心粉酱、巴氏灭菌的汤、腌泡汁、水油包乳剂、油包水乳剂、涂抹干酪、加工奶酪、乳制品甜食、调味乳、奶油、发酵乳制品、奶酪、黄油、炼乳制品、涂抹干酪、巴氏灭菌鸡蛋液、冰淇淋混合物、大豆制品、巴氏灭菌液体蛋、糕点产品、水果产品，以及带有脂肪基或含水填料的食品。食品可以是焙烤食品，如面包、蛋糕、精面包和生面团。
本发明的化妆品和皮肤病治疗的组合物
本发明还提供一种化妆品或皮肤科制剂，其包含本发明多肽-可选择地联合有一种或多种选自抗冻多肽或抗冻糖蛋白的另外多肽。
这种制剂可仅包含本发明的多肽，或者该制剂可包含至少一种另外的抗冻多肽。而且，该组合物可包含至少一种抗冻糖蛋白以及本发明的多肽。
在制备时，本发明的多肽在制剂中可以基于该制剂的总重量的0.0001％至50％重量的浓度存在，例如0.001％至50％重量，例如0.1％至10％重量，例如0.1％至1％重量的浓度。
在一些情况下，当选自抗冻多肽和抗冻糖蛋白的一种或多种另外多肽与本发明的多肽一起也存在于该制剂中时，多肽的总量是基于该制剂总重量的0.0001％至50％重量，例如0.001％至50％重量，例如0.1％至10％重量，例如0.1％至1％重量的浓度。
优选地，所述至少一种另外的抗冻多肽可包含至少一种选自AFP 1、AFP 2、AFP 3和AFP 4的多肽，例如，至少一种AFP 1型多肽，该多肽是由pseudopluronectes americanus、myoxocephalus scorpius、myoxocephalusaenaeus和/或myoxocephalus scorpiodes合成；至少一种AFP2型多肽，该多肽是由hemitripterus americanus、osmerus mordax和/或clupea harengusharengus合成；至少一种AFP3型多肽，该多肽是由macrozoarcesamericanus、rhigophila dearbomi lycodes polaris和/或“狼鱼”合成；和/或至少一种AFP 4型多肽，该多肽是由myoxocephalus octodecimspinosis合成。优选地，所述至少一种抗冻糖蛋白可包含至少一种多肽，该多肽是由rematomasborgrevinki、dissostichus mawsoni、boreogadus saida和/或gadus morhua合成。
本发明的一个方面，将制剂中一种或多种多肽的至少一部分装入胶囊。
本发明还提供一种化妆品或者皮肤科制剂，其包含本发明的多肽以及一种或多种选自抗冻多肽或抗冻糖蛋白的多肽，该多肽由pseudopluronectesamericanus、myoxocephalus scorpius、myoxocephalus aenaeus、myoxocephalusscorpiodes、hemitripterus americanus、osmerus mordax、clupea harengusharengus、macrozoarces americanus、rhigophila dearborni、lycodes polaris、anarhichas lupus、myoxocephalus octodecimspinosis、trematomas borgrevinki、dissostichus mawsoni、boreogadus saida和gadus morhua中的至少一种合成。
优选地，本发明的多肽在所述化妆品和皮肤科制剂中的总量是基于所述制剂的总重量的0.001％至50％重量，例如，浓度为0.1％至10％的重量。优选地，多肽在化妆品或皮肤科制剂中的总量可以是基于所述制剂的总重量的0.001％至50％重量，例如浓度为0.1％至10％的重量。
本发明还提供一种化妆品或皮肤科产品，它是o/w型乳膏、w/o型乳膏、w/o/w型乳膏、o型乳膏、w/o型乳剂、水分散剂、凝胶状乳霜、w/o型棒或o型棒，并且它包含本发明的制剂，包括其各种形式。
本发明还提供一种治疗或预防不良皮肤状况的方法。该方法包括将本发明的多肽以及可选地一种或多种多肽施予至少部分皮肤，所述一种或多种多肽选自抗冻多肽和抗冻糖蛋白。
一方面，不良皮肤状况包括皮肤炎症、色素失调、外在和内在的皮肤老化的症状和/或紫外线辐射造成的皮肤损伤。
在化妆品和皮肤科制剂的技术领域，术语“抗冻多肽”用于描述使机体即使在极端的条件下仍能保持重要的细胞结构功能活性的多肽。考虑到它们的功能，“抗冻多肽”从这种意义上讲还代表细胞水平上的“防冻保护化合物”。
本领域的技术人员不能预见到的是，本发明的制剂比现有技术的制剂更好地预防皮肤由于寒冷造成的结构和细胞损坏，更好地维持或恢复皮肤的阻隔性能，更好地对抗皮肤的干燥行为，更好地对抗皮肤变色行为，更好地克服发炎的皮肤状况，更好地对抗皮肤老化，以及更好地保护皮肤对抗周围环境的影响。
本发明的多肽可选地与另外的抗冻多肽(AFP)和/或抗冻糖蛋白(AFGP)一起使用，或者带有有效量的、可选地与另外的AFP和/或AFGP一起的本发明多肽的化妆品或局部皮肤科制剂，不但使有效的治疗成为可能，而且能预防皮肤由于寒冷造成的结构和细胞损伤，这种损伤伴随明显的气候和天气引起的温度下降，通过损失细胞酶的最佳温度引起细胞内和细胞外间隙的生理学变化、皮肤损害、皮肤发红和皮肤紧绷感、以及增加的感官敏感度，例如由寒冷、风和/或紫外线引起的温度敏感皮肤，由环境压力引起的(由温度变化和紫外线、吸烟、烟雾、活性氧簇、自由基引起)皮肤、嘴唇、鼻和口腔粘膜以及外皮的附着物的负面变化。
本发明的多肽可选地与另外的AFP和/或AFGP一起使用，或者带有有效量的、可选地与另外的AFP和/或AFGP一起的本发明多肽的化妆品或局部皮肤科制剂的使用，有效地治疗及预防缺陷的、敏感的或活动力低下的皮肤状况，或者显示皮肤过早老化的外皮附属物(如皱纹、老年性角化症、毛细血管扩张)或环境(吸烟、烟雾、活性氧簇、自由基)引起的外皮附属物的缺陷、敏感或活动力低下状况，尤其是光引起的皮肤和外皮附属物的负面变化，光引起的皮肤损伤，色素失调，敏感、刺激及瘙痒的皮肤，干燥的皮肤状况以及角质层屏障的紊乱，脱发及为了促进头发生长，皮肤老化的迹象，如皱纹、减少的皮肤再生，炎症皮肤状况和异位性湿疹、脂溢性湿疹、多形性光照性皮肤病、牛皮癣、白斑病，用以舒缓过敏或者刺激性皮肤，以刺激胶原、透明质酸和弹性蛋白的合成，健康皮肤正常的透明质酸和糖胺多糖的变化，以刺激皮肤神经酰胺的合成，以刺激细胞内DNA的合成，尤其是对于有缺陷或活动低下的皮肤状况，以增加细胞更新和皮肤再生，以增加皮肤自身保护和修复机制(比如，功能失调的酶、DNA、脂质和多肽)，缺陷、敏感或者活动低下的皮肤状况或缺陷、敏感或者活动低下的皮肤附属物中的细胞-细胞交流的减少，健康皮肤的神经酰胺、脂质和能量机制的变化，脂质和多肽过氧化反应的变化，生理性经皮水分散失的变化，皮肤保湿度的下降，皮肤水分含量正常的渗透调节和下降，天然保湿因子含量的变化，DNA损伤以及内源性DNA修复机制的下降，金属蛋白酶和/或其他蛋白酶的激活，或这些酶对应的内源性抑制剂的抑制，健康皮肤的结缔组织翻译后修饰的偏差，在头发和发区形成头皮屑，皮肤的脆性，丧失弹性和皮肤疲劳，正常角化细胞增殖的增加，减少皮肤和头发的天然再生和结构的下降，用在局部应用的激光和磨蚀处理的前处理和后处理中，比如，以减少皮肤皱纹和疤痕，以抵消形成的皮肤刺激并促进损伤皮肤的再生过程。
因此，本发明的多肽，可选地与另外的AFP和/或AFGP的共同使用，用于预防和治疗炎症皮肤状况-和异位性湿疹-和/或倾向于敏感和干燥的皮肤情况中的皮肤保护，也属于本发明的范围。
因此，该化妆品或皮肤科制剂的用途，用于生产化妆品和护肤品制剂，用于治疗和/或预防色素失调也属于本发明的范围。
因此，该制剂的用于生产化妆品或皮肤科制剂的用途，用于治疗和/或预防内部和/或外部皮肤老化症状以及用于治疗和预防紫外线辐射对皮肤的不良影响也属于本发明的范围。
因此，本发明的多肽，可选地与另外的AFP和/或AFGP的共同使用，用于生产化妆品或皮肤科制剂，以便增加神经酰胺生物的合成也是本发明的一个方面。
此外，AFP和/或AFGP在制备化妆品或皮肤科制剂以便增强皮肤屏障功能中的应用，也是本发明的另一个方面。
基于制剂的重量，本发明的化妆品或皮肤科制剂优选地包含基于该制剂的总重量的0.0001％至50％重量的本发明的多肽，尤其优选0.01％至10％重量，可选择地，本发明的多肽与另外的AFP和/或AFGP或所述AFP和/或AFGP的两种或多种的组合一起使用。
根据本发明，常规抗氧剂可以用于本发明的包含活性物质结合物的制剂。
有益的是，抗氧剂选自氨基酸(如甘氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸、β-丙氨酸)及其衍生物；咪唑类(如咪唑丙烯酸)及其衍生物；肽类，如D，L-肌肽，D-肌肽，L-肌肽及其衍生物(如鹅肌肽)；类胡萝卜素、胡萝卜素(如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素)及其衍生物；硫辛酸及其衍生物(如二氢硫辛酸)；金硫葡萄糖、丙基硫尿嘧啶和其他硫醇(如硫氧还蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺和糖基、N-乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊烷基、丁基和十二烷基、榈酰基、油烯基、γ-吲哚基、胆甾醇和甘油基酯)及其盐；硫代二丙酸月桂酯、二硫代丙酸二硬脂酰酯、硫二丙酸及其衍生物(酯、醚、肽、脂质、核苷酸、核苷和盐)和以非常低耐受剂量(如pmol-μmol/kg)的亚砜亚胺化合物(如丁硫氨酸亚砜亚胺、巯基丁氨酸亚砜亚胺、五-、六-和七-硫堇亚砜亚胺)；还有(金属)螯合剂(如α-羟基脂肪酸、棕榈酸、植酸、乳铁蛋白)；α-羟基酸(如柠檬酸、乳酸和苹果酸)、腐殖酸、胆汁酸、胆汁提取物、胆红素、胆绿素、EDTA、EGTA及其衍生物；不饱和脂肪酸及其衍生物(如γ-亚麻酸、亚油酸、油酸)；叶酸及其衍生物；丙氨酸二乙酸、类黄酮、多酚、儿茶酚、维生素C及其衍生物(如抗坏血酸棕榈酸酯、Mg-抗坏血酸磷酸酯、抗坏血酸醋酸酯)；维生素E及其衍生物(如维生素E醋酸酯)；以及安息香树脂的苯甲酸松脂、芸香亭酸及其衍生物；阿魏酸及其衍生物；丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、去甲二氢愈创木脂酸、去甲二氢愈创木酸、三羟基苯丁酮、尿酸及其衍生物；甘露糖及其衍生物；锌及其衍生物(如ZnO、ZnSO4)；硒及其衍生物(如硒代蛋氨酸)；芪类及其衍生物(如二苯乙烯氧化物、反式二苯乙烯氧化物)以及上述提及的本发明适用的活性成分的衍生物(盐、酯、醚、糖、核苷酸、核苷、肽和脂质)。
制剂中抗氧化剂(一种或多种化合物)的量优选地为基于制剂总重量的0.001％至30％的重量，尤其优选0.05％至20％的重量，尤其优选1％至10％的重量。
此外，有益的是将本发明活性成分用熔蜡封装，就像所称的固体脂质纳米微粒一样。熔蜡可选自但不限于蜡酯、甘油三酯蜡或烃蜡。而且，有益的是将本发明的活性成分封装在聚合物中，比如封装在基于高度交联聚甲基丙烯酸树脂和/或纤维三醋酸酯的颗粒中和/或作为芯/壳颗粒，该颗粒带有由聚甲醛、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚酯、胶质和聚烯烃制成。
用本发明的活性成分或者以本发明使用的活性成分作为有效内容物的化妆品或局部皮肤科制剂进行的预防或化妆品或皮肤科治疗，可以以常规的方式完成，即通过将本发明使用的活性成分或者以本发明使用的活性成分作为有效内容物的化妆品或局部皮肤科制剂施予皮肤疫区。
本发明使用的活性成分可以有利地掺入常规化妆品和皮肤科制剂中，它们可以呈现不同的形式。例如，它们可以是溶液、油包水(W/O)型或水包油(O/W)型的乳剂、或者复合乳剂，如水包油包水(W/O/W)型或油包水包油型(O/W/O)、水分散剂或油分散剂、凝胶、Pickering乳液、固体棒或喷雾剂。
为了本发明的目的，本发明的乳剂，比如乳霜、洗液、护肤乳的形式是有益的，并且可包含可能包括脂肪、油、蜡和/或其他油性物质和水，以及这类配方常规使用的一种或多种乳化剂。
为了本发明的目的，还可能有益地将本发明使用的活性成分掺入水体系或表面活性剂制剂中，用于清洁或处理皮肤和头发。
当然，本领域的技术人员可以意识到，要求严格的化妆品组分在不含常规的辅剂和添加剂时是难以想象的。辅剂和添加剂的实例包括增洁剂、填料、香料、染料、乳化剂、附加的有效成分，如维生素或多肽、光保护剂、稳定剂、杀虫剂、乙醇、水、盐，以及抗微生物的、蛋白分解的或促角质层分离的活性物质等。
相应的要求通过必要的变更可适用于药品制剂配方。
用于本发明目的的局部药用成分通常包括有效浓度的一种或多种药物。为简单起见，为明确区别化妆品和药物应用以及相应的产品，可参考德意志联邦共和国的法律规定(如化妆品指令、食品和药品法案)。
在这一方面，同样有益的是将本发明使用的活性成分作为添加剂添加到用于其他目的的已经包含其他活性成分的制剂中。
因此，为了本发明的目的，化妆品或局部皮肤科组分可以根据其配方用作护肤霜、洁肤乳、防晒乳液、营养霜、日霜或晚霜、护唇膏、鼻喷雾剂等。在某些情况下，可能有益的是将本发明的组合物用作药物配方的基础。
为了本发明的目的，同样有益的是提供一种化妆品和皮肤科制剂，它们的主要目的不是防晒，但是仍然含有一定量的UV防护物质。因此，如UVA和/或UVB过滤物通常包含在日霜或者面膜产品中。同时UV防护物质，视需要还有抗氧剂和防腐剂，都能有效保护制剂防止其变质。此外，遮光剂的形式的化妆品和皮肤科制剂也是有利的。
因此，本发明的制剂，除本发明的一种或多种活性成分组合外，优选地可额外地包含至少一种UVA过滤物质和/或UVB过滤物质。尽管不是必须的，该配方也可以选择性地包含一种或多种有机和/或无机色素作为UV过滤物质，该物质可以存在于水相和/或油相中。
优选的无机色素是在水中不溶或难溶的金属氧化物和/其他金属化合物，尤其是二氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)、氧化铁(如Fe2O3)、氧化锆(ZrO2)、氧化硅(SiO2)、氧化锰(如MnO)、氧化铝(Al2O3)、铈(如Ce2O3)、相应金属的混合氧化物，以及这些氧化物的混合物。
根据本发明，这些色素可以有利地进行表面处理(“包衣”)，比如，由此形成或保留了这些色素的亲水或疏水性质。这种表面处理可以包括通过已知的方法为色素本身提供一个薄的疏水层。
根据本发明，例如以辛基硅醇包衣的二氧化钛色素是有利的。适宜的二氧化钛颗粒可购自Degussa公司，商品名为T805。此外，以硬脂酸铝包衣的TiO2色素是尤其有利的，例如购自TAYCA公司，商品名MT100T。
无机色素进一步有利的包衣包括二甲基亚砜(又叫DMSO)，用三甲基硅氧基单元进行末端保护的完全甲基化的、线性硅氧烷聚合物的混合物。为了本发明的目的，尤其有利的色素是以这种方法包衣的氧化锌色素。
另一个优点是用二甲基聚硅氧烷(尤其是平均链长为200至350个二甲基硅氧烷单位的二甲基聚硅氧烷)和硅胶的混合物包衣的无机色素，硅胶也称作二甲基硅油。尤其有利的是无机色素已经另外用氧化铝或水合氧化铝(也叫矾土，CAS No.：1333-84-2)包衣。尤其有利的是被二甲基硅油和氧化铝包衣的氧化钛，该包衣也可能包含水。它的一个实例是购自merk公司、商品名为Eusolex T2000的二氧化钛。
为了本发明的目的，一种有利的有机色素包括2，2′-次甲基双-(6-(2H-苯并三氮唑-2-基)-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚)[INCI：双辛基三氮唑]，其可购自CIBA Chemikalien GmbH公司，商品名为Tinosorb(R)M。
有利的是，本发明的制剂含有吸收UVA和/或UVB范围内的UV辐射的物质，例如，该过滤物质的总量是基于制剂总重量的0.1％重量至30％重量，优选0.5-20％重量，尤其是1.0-15％的重量，以便提供保护头发或皮肤抵御整个范围紫外线辐射的化妆品制剂。它们也可以用作头发或皮肤的遮光剂。
为了本发明的目的，进一步有利的UVA过滤物质包括二苯甲酰甲烷衍生物，尤其是4-(叔丁基)-4′-甲氧基二苯酰甲烷(CAS No.70356-09-1)，由Givaudan公司销售，商品名1789以及由merk公司销售，商品名9020。
进一步有利的UVA过滤物质包括亚苯基-1，4-二-(2-苯并咪唑)-3，3′，5，5′-四磺酸及其盐，尤其是相应的钠盐、钾盐或三乙醇铵盐；尤其是亚苯基-1，4-二(2-苯并咪唑)-3，3′，5，5′-四磺酸二钠盐，INCI名为Bisimidazylate，可以购自Haarmann&Reimer公司，商品名Neo Heliopan AP。
1，4-二(2-氧代-10-硫-3-bornylidenemethyl)苯及其盐(尤其是相应的10-硫酸根合化合物，尤其是相应的钠盐、钾盐或三乙醇铵盐)也是有利的，它也被称为苯基-1，4-二(2-氧-3-bornylidenemethyl-10-磺酸。
为了本发明的目的，有利的UV过滤物质也是所谓的宽带过滤器，即同时吸收UVA和UVB辐射的过滤物质。
例如，有利的宽带过滤器或者UVB过滤物质包括bis-resorcinyltriazine衍生物。尤其优选的是2，4-二{[4-(2-乙基己氧基)-2-羟基苯基}-6-(4-甲氧基苯基)-1，3，5-三嗪(INCI：Aniso Triazine)，可购自CIBA-Chemikalien GmbH，商品名S。
为了本发明的目的，尤其有利的制剂的特征是具有高或很高的UVA保护，优选包含几种UVA和/或宽带过滤物，尤其是单独或者相互任意结合的二苯甲酰甲烷衍生物[如，4-(叔丁基)-4′甲氧基二苯甲酰甲烷]、苯并三唑衍生物[如，2，2′亚甲基-二-(6-(2H-苯并三氮唑-2-基)-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚]、亚苯基-1，4-二(2-苯并咪唑基)-3，3′，5，5′-四磺酸和/或其盐、1，4-二(2-氧代-10-硫基-3-bornylidenemethyl)苯和/或其盐，和/或2，4-二{[4-(2-乙基己氧基)-2-羟基苯基}-6-(4-甲氧苯基)-1，3，5-三嗪。
本发明有利地使用的另一种光保护过滤物质是乙基己基-2-腈基-3，3-二苯基丙烯酸酯(氰双苯丙烯酸辛酯)，其可购自BASF公司，商品名N539。
另外相当有利的是，在本发明的制剂中使用聚合物束或聚合物UV过滤物质，尤其是WO-A-92/20690中描述的那些。
此外，还可能有利的是将进一步的UVA和/或UVB过滤物纳入本发明的化妆品或皮肤科制剂中，例如某些水杨酸衍生物，如4-异丙基苄基水杨酸酯、2-乙基己基水杨酸酯(-辛基水杨酸盐)以及原膜散酯。
当然，上述列出的可以用于本发明目的的UV过滤物并不是对本发明的限制。
本发明的制剂有利地包含可以吸收UVA和/或UVB范围中的UV辐射的物质。例如，它们是基于制剂的总重量的0.1％重量至30％重量，优选0.5％至20％重量，尤其是1.0％至15％重量，以便制备可获得的化妆品制剂，其可以保护头发或皮肤免受整个范围的紫外线辐射。它们还可以用作头发和皮肤的遮光剂。
本发明的化妆品和皮肤科制剂可以包括化妆品活性成分，这种制剂中常规使用的辅助剂和添加剂，例如抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、香料、消泡剂、染料、着色颜料、增稠剂、表面活性剂、乳化剂、润肤剂、保湿剂和/或润湿剂、脂肪、油、蜡和其他常规的化妆品或皮肤科制剂组分，如醇、多元醇、聚合物、泡沫稳定剂、电解质、有机溶剂或有机硅衍生物。
如果本发明的化妆品或皮肤科制剂是以溶液或乳剂或分散剂的形式存在，则以下可用作溶剂：水或水溶液；油，如癸酸或辛酸的甘油三酯，优选蓖麻油；脂肪、蜡以及其他天然和合成脂质，优选脂肪酸与低碳(C)数的醇形成的酯，例如异丙醇、丙二醇或甘油，或脂肪醇与低碳数的烷酸或与脂肪酸形成的酯；低碳数的醇、二元醇或多元醇及其醚，优选乙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、乙二醇、乙二醇单乙醚或单丁醚、丙二醇单甲醚或单乙醚或单丁醚、二乙二醇单乙醚或单乙醚，以及类似产品。
尤其可使用上述溶剂的混合物。在醇溶剂的情况下，水可以是进一步的组分。
本发明的乳化剂、油凝胶或水-或酯-分散剂的油相有利地选自饱和和/或不饱和、分支和/或无分支的链长度为3至30个碳原子的烷基羧酸与饱和和/或不饱和、分支和/或无分支的链长度为3至30个碳原子的醇所形成的酯，选自芳香羧酸与饱和和/或不饱和、分支和/或无分支的链长度为3至30个碳原子形成的酯。在这种情况下，这种酯油可有利地选自肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、油酸异丙酯、硬脂酸正丁酯、月桂酸正己酯、油酸正癸酯、硬脂酸异辛酯、硬脂酸异壬酯、异壬酸异壬酯、2-乙基己基棕榈酸酯、2-乙基己基月桂酸酯、2-己基癸醇硬脂酸酯、2-辛基十二醇棕榈酸酯、油酸油酯、芥酸油酯、瓢儿菜醇油酸酯、瓢儿菜醇芥酸酯，以及这些酯的合成、半合成和天然的混合物，如霍霍巴油。
而且，油相可有利地选自分支和无分支的烃和烃蜡、硅油、二烷基醚；饱和或不饱和的、分支或无分支的醇和脂肪酸甘油三酯，即，饱和和/或不饱和的、分支和/或不分支的链长度为8至24，尤其为12至18个碳原子的烷基羧酸的甘油三酯。例如，脂肪酸甘油三酯可有利地选自合成、半合成和天然的油，如橄榄油、葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕榈油、椰子油、棕榈仁油等。
这种油和蜡组分的任意混合物也可有利地用于本发明。如果合适，也可能有利地使用蜡，如十六酸鲸蜡酯，作为油相的唯一脂质组分。
油相可有利地选自2-乙基己基异硬脂酸酯、辛基十二烷醇、异十三烷醇异壬酸酯、异二十烷、2-乙基己基椰油酸、C12-15烷基安息香酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、二辛基醚。
尤其有利的混合物是C12-15烷基安息香酸酯与2-乙基己基椰油酸的混合物、C12-15烷基安息香酸酯和异十三烷醇异壬酸酯的混合物、以及C12-15烷基安息香酸酯、2-乙基己基椰油酸和异十三烷醇异壬酸酯的混合物。
在碳氢化合物中，液体石蜡、角鲨烷和角鲨烯可有利地用于本发明。
油相可进一步有利地包括环状或线性硅油、或者完全由这些油组成，但优选的是除了硅油之外，使用额外含量的其他油相组分。
环二甲基硅酮(八甲基环四硅氧烷)可有利地作为硅油用于本发明。然而，其他硅油也可有利地用于本发明，例如六甲基环丙硅氧烷、聚二甲硅氧烷和聚甲基苯基硅醚。
此外尤其有利的混合物是环二甲基硅酮与异十三醇异壬酸酯的混合物以及环二甲基硅酮与2-乙基己基异硬脂酸酯的混合物。
如果合适，本发明的制剂的水相可有利地包括：低碳数的醇、二醇或聚醇、及其醚，优选乙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、乙二醇、乙二醇单乙醚或单丁醚、丙二醇单甲醚、单乙醚或单丁醚、二乙二醇单甲醚或单乙醚，及其类似产品；还有低碳数的醇，如乙醇、异丙醇、1，2-丙二醇、甘油；尤其，一种或多种增稠剂，其可有利地选自二氧化硅、铝硅酸盐、多糖及其衍生物，例如透明质酸、黄原胶、羟丙基甲基纤维素，尤其有利地选自聚丙烯酸酯，优选地选自称作Carbopol的聚丙烯酸，如型号980、981、1382、2984和5984Carbopol；它们在每种情况下均单独或者结合使用。
本发明可使用的凝胶通常包括低碳数的醇，如乙醇、异丙醇、1，2-丙二醇，甘油和水，或者在增稠剂存在的情况下包括上述油类。就油-酒精凝胶而言，增稠剂优选地为二氧化硅或者铝硅酸盐，就水-酒精或酒精凝胶而言，增稠剂优选地为聚丙烯酸酯。
例如，固体棒可包括天然或合成的蜡、脂肪醇或脂肪酸酯。
适用于本发明的化妆棒的常规基本材料包括液体油(如液体石蜡、蓖麻油、豆蔻酸异丙酯)、半固体组分(如凡士林、羊毛脂)、固体组分(如蜂蜡、纯白地蜡和微结晶蜡或地蜡)以及高熔点的蜡(如巴西棕榈蜡和小烛石)。
适用于本发明的化妆品和/或皮肤科制剂的推进剂是常规已知的易挥发的液化推进剂，其可由喷雾剂容器喷出，例如碳氢化合物(丙烷、丁烷、异丁烷)，它们可以单独或者相互混合使用。加压空气也可以被有利地使用。
当然，本领域的技术人员熟知，有些无毒推进剂原则上以气雾剂的形式适用于本发明；然而，建议不要使用这些物质，尤其是氟代烃和氟氯烃(FCHC)，因为它们对环境或者其他相关情况产生不良作用。
本发明的化妆品制剂可采用凝胶的形式，其不仅包含本发明的有效量的活性成分以及常规使用的溶剂，优选地为水，而且包含有机增稠剂，如阿拉伯胶、黄原胶；海藻酸钠；纤维素衍生物，优选甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素；或者无机增稠剂，如铝硅酸盐，如膨润土；或者聚二乙醇与聚二乙醇硬脂酸酯或聚二乙醇二硬脂酸酯的混合物。凝胶包括增稠剂，例如为0.1％至30％重量，优选0.5％至15％重量。
对本发明的目的尤其有益的是，本发明的化妆品或皮肤科制剂包含进一步的活性成分，尤其是天然活性物质和/或其衍生物，如α-硫辛酸、八氢番茄红素、D-生物素、辅酶Q10、α-葡萄糖芦丁、肉碱、肌肽、渗透调节物质、三叶草提取物、啤酒花提取物或啤酒花-麦芽提取物。
活性成分(一种或多种物质)的浓度有利地是基于制剂总重量的0.0001％至30％的重量。本发明的化妆品或皮肤科制剂可以本领域已知的任意方法制备。
器官和组织样品的处理
用包含本发明抗冻多肽的组合物灌注器官或组织样品，使得有可能在较低的温度下储存这类器官和组织样品、或其他生物材料，从而防止样品变质或降解，而所述组织、器官、细胞或其他生物材料不会产生冻伤的风险。在许多情况下，对器官和生物组织的损害主要不是由所讨论的器官或组织产生的冷冻状态引起，而是由可能发生的再结晶引起的。
生物材料、器官和组织样品的实例包括但不限于：例如，含有一种或多种多肽的样品；含有一种或多种微粒体或微团的样品，该微粒体或微团含有一种或多种多肽；包含全血的样品；包含血浆的样品；包含血小板的样品；包含红血细胞的样品；包含精液的样品，包含配子的样品。
组织培养样品可以包括任意形式的生物细胞，包括哺乳动物细胞，如动物和人体细胞，鼠细胞和昆虫细胞。例如，待处理的器官可以是肾、肺、心脏、脾脏或肝脏。因此，本发明提供一种用于抑制器官或生物样品的再结晶的方法，所述方法包括步骤：在多肽能防止器官或生物样品再结晶的条件下，将器官或生物样品与本发明的多肽接触。
本发明还提供一种用于改善器官或生物样品保存的方法，所述方法包括步骤：在多肽能接触所讨论的器官或生物样品的条件下，将器官或生物样品与本发明的多肽接触，从而这种待储存的器官或生物样品与未处理的器官或生物样品相比能够在亚冷冻温度下储存。
近来开发了一种基于玻璃化的新方法。然而，该方法遇到的实际情况是，配子、胚胎或干细胞解冻期间发生了松弛，这意味着有冰晶体形成。在解冻过程中，这些冰晶体由于再结晶而生长。我们认为，如果配子、胚胎或干细胞所在的溶剂中存在本发明的一种或多种多肽，则在玻璃化过程中，晶体形成以及晶体生长将显著减少甚至可被防止。
本发明多肽的进一步冷冻保护用途将在下文更详细地公开。
在一个单独的方面，本发明涉及一种保护细胞及其膜免受暴露于非生理条件时所遭遇的损害的方法。例如，温度不正常，包括高温、低温和零下温度。在不包含冰形成的广泛条件下，包括高于冻结范围的温度和在玻璃化条件下低于冻结范围的温度，观察到细胞存活率提高。迄今为止，这些多肽的唯一已知的性质是它们能够与冰晶体相互作用。在冰晶体形成的条件下进一步发现，多肽与人体细胞一起以它们在源生物体中天然产生的浓度使用，导致细胞的损害加重而不是减轻，但是当使用低浓度时，损害缓解并且存活率提高。这样，多肽在细胞悬浮液、组织和整个器官的保存和改善中提供了有益作用。我们进一步发现，多肽具有阻断哺乳动物细胞膜的离子通道的能力，从而在治疗病情方面提供进一步的用途。
本发明利用了已识别但未使用的抗冻多肽的性质以及它们与细胞和细胞膜相互作用的能力。这种与细胞膜的相互作用发生在广泛的结构中，如细胞悬浮液中的个别细胞，组织和器官中的相连的细胞团，以及遍布血管系统的细胞结构。这种相互作用是有利的，为细胞膜以及包含这些膜的结构提供了各种益处，包括改善细胞活性和存活率，延长功能性、稳定性以及细胞和细胞组织的结构完整性，降低在不利条件下对膜和细胞结构损害的发生率，以及控制离子跨细胞膜的运输。
相互作用的不同类型与这些多肽对冰晶增殖的已知作用是不相关的，因为这些相互作用的有益作用是在根本没有冰晶形成的条件下观察到的，除了它们在冰晶存在的情况下出现以外。例如，从低温至远高于生理温度的温度范围内观察到这些益处。本发明因此延伸到涉及生理条件和非生理条件的情形，以及涉及存在冰晶体的和完全不存在冰晶体的情形。在非生理条件下观察到了对活细胞和细胞膜的有益作用，因此非生理条件包括：(i)温热条件，由高于水的正常冰点(0℃)且低于细胞的生理温度的温度定义，因此不可能形成冰晶体；(ii)玻璃化条件，由玻璃形成(或玻璃相变)时或低于玻璃形成的温度定义，例如从150K降至约4K；或者由玻璃化剂的存在定义，该玻璃化剂促进玻璃化并抑制结晶化；(iii)冷冻条件，如从水的正常冰点降至约4K，其允许冰晶体形成；(iv)过热条件，由高于细胞生理温度的温度定义，例如从生理温度上升至高于生理温度约10℃的温度范围；以及(v)由化学环境定义的条件，其不同于细胞的生理化学环境，例如非生理pH条件和生理化学组成的其他变化，以及与非生理温度条件相结合的那些条件。
本发明目标的适用性扩展到非正常的生理条件，例如与细胞膜的不稳定性相关的疾病，以及与细胞内和细胞外间隙之间的离子不平衡、导致跨细胞膜的离子转运不正常相关的疾病。这种行为的意外性质通过一次发现而变得显著，即，离子通道的阻断得以实现，如上皮细胞的钙离子和钾离子，而未干扰细胞的其他代谢功能，包括ATP离子泵以及与碳酰胆碱的相互作用。进一步，本发明提供了对正常生理条件下的细胞的益处，比如通过使用那些设计用于恢复、保存或修复表皮组织的化妆品或药物。
本发明对广泛的肝脏细胞具有适应性，包括动物细胞和植物细胞。然而，与本发明相关的尤其不寻常和有意义的发现在于抗冻多肽在处理和保存哺乳动物细胞、组织和器官中的用途。在它们的天然形式下，这些多肽仅存在于非哺乳动物物种中。这些物种和哺乳动物在细胞和细胞膜，以及在血液和细胞质组成方面的差异，使得当前发现的益处是令人惊讶和意料不到的。因此，当哺乳动物细胞、组织和器官和生物体暴露在不同于哺乳动物正常生理条件下时，将本发明用于它们将具有特别的意义和用途。本发明适用的细胞的实例是哺乳动物卵母细胞、肝细胞、红细胞和白细胞，以及各种类型的植物细胞。组织和器官的实例是肝脏、心脏和肾脏的组织，以及器官自身。生物体的实例是胚胎、自给自立的整个动物、植物种子和整棵植物。
本发明产生的额外益处是多方面的，其中包括在冻结至低温期间不再需要维持快速冷却速率，在比已知的细胞冻结剂明显较低的浓度下多肽具有提高溶液粘度的能力，以及多肽保存冷冻食物的能力。从下面的描述可以明显看出本发明的其他优点、益处以及用途。
在低温储藏的技术领域，以下使用的术语定义如下：
细胞、组织、器官或生物体的“异常”或“非生理条件”是指不同于正常生理条件的条件。异常或非生理条件包括但不限于：温度显著高于或低于健康生物体的正常生理温度，其中健康有机体的细胞、组织或器官是与生俱来的，或者为生物体本身；二氧化碳、氧气、无机盐或有机化合物的量超过或低于正常；pH值显著高于或低于正常生物体的pH，以及这些条件的结合。
“抗冻多肽”(anti-freeze polypeptides，AFPS)、“抗冻糖蛋白”和“抗冻糖肽”(AFGP)指在一些动物的体液中发现的大分子，其具有普遍已知的性质，即它们非依数性地降低水的冰点。抗冻多肽、多肽、糖蛋白和糖肽也称为“热滞多肽”，因为比起任意依数性质的多肽所产生的程度来说，发生冻结的温度在更大程度上降低。然而在融化被削弱期间，冰融化的温度明显较低，仅与依数行为一致。
“低温温度”(cryogenic temperature)指低于0℃的温度。
“冷冻”是指从液相水到固相水的转变。
“过热的”是指高于细胞、组织、器官或生物体的正常生理温度，如从生理温度轻微上升高出生理温度约20℃，优选高出约10℃，更优选高出约5℃。
“低温的”是指低于细胞、组织、器官或微生物的正常生理温度，但是并没有低到足以引起相转变为固相。
“分离的和纯化的”指分子种类，它们是从天然产生的有机体中提取，并通过常规的实验室技术来浓缩，如色谱法，优选浓缩至至少约85％的浓度，更优选至少约95％。本发明进一步延伸到另一类分子，它们具有的分子结构与前述天然产生的分子形式相同、高度相似或者同源，并且它们可通过化学手段或通过DNA重组技术来合成。
“哺乳动物”和该术语通常用在生物学上一样，指猪、牛、兔、马和人等。
“极地鱼类”是指冷血水生动物，尤其是脊椎动物，它们生活在地球极地区域的水中，包括北极和南极圈内的区域。尤其与本发明相关的极地鱼类是那些在满是冰的水中仍能生活的鱼类。
“针骨”和“针骨状”是指冰晶体和冰晶体生长，其中晶体增殖的主要方向是沿C-轴，即与基平面垂直，以形成针状的晶体。
“能生存的”指在正常生理条件下或者返回到正常生理条件下能够生存、能够存活和发展，或在正常的有利于发芽的条件下能够发芽。
“玻璃化”指在低温下固化，以这种方式形成玻璃相，即非晶态固体，与结晶的冰形成对照。
“外观玻璃化”是指在显微镜下通过目视观察确定的玻璃化。一般通过向材料中引入任意一种防冷冻剂或“玻璃化”剂，包括多元醇，如甘油和丙二醇，或者引入其他化合物，如二甲基亚砜，来实现生物材料的玻璃化。玻璃化试剂的引入常常伴有相对高的冷却速率。每种情况下的最佳速率随系统的组分和热动力学而变化。对于无组织的小细胞，如卵子、精子和胚胎，以及器官而言，大多数情况下的典型冷却速度一般是在约100℃/min至约2,000℃/min的范围内下降，优选约200℃/min至约1,750℃/min，更优选700℃/min至约1,750℃/min。通常使用的是约1500℃/min的速率。
在本发明的实践中，本发明的抗冻多肽一般是以液体溶液的形式使用，优选水相溶液。本发明的抗冻多肽可以单独使用或者与其他多肽联合使用。当联合使用多肽时，最便捷的是使用源物种中天然出现的生理组合的多肽，即多肽种类的混合物和比例与从鱼类、昆虫或其他生物体的液体中提取发现的相同；但从液体的其他组分中分离，并且再次溶解于不同的溶剂或溶液中，可能总浓度不同于该混合物在自然环境中存在的浓度。然而，在某些情况下，通过分馏源混合物中的多肽，并以最佳的方式选择和重组馏分，可以使活性和有效性得到改善。
在本发明使用的液体溶液中，本发明抗冻多肽的浓度可能有很大不同，但在某些情况下，改善的结果是在一定浓度范围内和一定情况下获得的，该浓度必须限制在一定范围，以避免多肽自身产生的损害。然而一般而言，多肽的使用浓度为约0.01mg/mL至约80mg/mL，优选约0.1mg/mL至约60mg/mL，更优选约1mg/mL至约40mg/mL，最优选约1mg/mL至约20mg/mL。当与人体细胞使用时，尤其是在低于细胞的生理温度时，优选的浓度是约0.1mg/mL至约40mg/mL，更优选约0.1mg/mL至约3mg/mL。当多肽用于在温度低于组织的生理温度时保护该组织时，优选的浓度是约0.1mg/mL至约50mg/mL，而且当组织是人体组织时，优选的浓度是约0.1mg/mL至约3mg/mL。在温度一般低于细胞的生理温度但高于细胞的冻结温度，或者低于细胞的冻结温度但是在玻璃化剂或其他非肽类防冷冻剂存在时，多肽用于保护该细胞时，优选的浓度是约0.01mg/mL至约60mg/mL，更优选的浓度范围从约1mg/mL至约40mg/mL。当多肽用于阻断跨细胞膜的离子通道时，优选的浓度是至少约0.01mg/mL，更优选至少约0.1mg/mL，最优选约0.5mg/mL至约40mg/mL。当溶液包含不同抗冻多肽的混合物时，抗冻多肽的所有浓度都表示为单个抗冻多肽浓度的总和。
用于本发明的抗冻多肽的水溶液可进一步含有任意的各种盐、糖、离子和其他营养素的混合物，它们被包含在本领域已知的电解质溶液中，用于保存生物制剂，这包括组织培养基、器官灌注液等。电解质溶液尤其用于增强多肽的生物相容性。本领域已知的许多电解质溶液的实例是：生理盐水，其中NaCl浓度为0.9％或0.95％Ringer′s注射液(U.S.)，列于Facts andComparisons，p.50，Lippincott Publishing Co.，St.Louis，Mo.(1981.10)，哺乳动物Ringer′s溶液(U.K.&Canada)，列于Best and Taylor，Basis of Medical Practice，6th ed.，Baltimore(1950)，乳酸盐Ringer′s溶液(U.S.)，列于Facts andComparisons，p.50，Lippincott Publishing Co.，St.Louis，Mo.(1981.10)，乳酸盐Ringer′s溶液(Hartmann)，列于Hartmann，A.F.，J.Am.Med.Assoc.103：1349-1354(1934)，醋酸Ringer′s溶液，列于Fox，C.L.，et al.，J.Am.Med.Assoc.148：825-833(1952)，Locke′s溶液，列于Locke，F.S.，Zbl.Physiol.8：166(1894)；14：670(1900)；15：490(1901)，Tyrode′s溶液，列于Tyrode，M.J.，Arch.Int.Pharmacodyn.20：205(1910)，Krebs Henseleit溶液，列于Krebs，H.A.，et al.，Hoppe-Seyle′s Z.Physiol.Chem.210：33-66(1932)，Krebs Ringer磷酸盐溶液，列于Krebs，H.A.，Hoppe-Seyle′s Z.Physiol.Chem.217：193(1933)，Krebs血清替代溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta 4：249-269(1950)，Krebs改进的Ringer II溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta 4：249-269(1950)，Krebs改进的Ringer III溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta 4：249-269(1950)，含有牛血清白蛋白和红细胞的Krebs肝脏灌注液，列于Hem，R.，et al.，Biochem.J.101：284(1966)，Schimassek肝脏灌注液，列于Schimassek，H.，et al.，Biochem.Z.336，440(1963)，Krebs肾脏灌注液，列于Nishiitsutsuji-Uwo，J.，et al.，Biochem.J.103：852-862(1967)，Hepatocyte孵化液，列于Crow，K.E.，et al.，Biochem.J.172：29-36(1978)，Bahlman肾脏灌注液，列于Bahlman，J.，et al.，Am.J.Physiol.212：77(1967)，Fulgraff肾脏灌注液，列于Fulgraff，et al.，Arch.Int.Pharmacodyn.172：49(1972)。
对于任意具体应用来说，电解质溶液的最佳选择会随着应用而变化，例如即将用抗冻多肽处理或保护的细胞的形式(是否该细胞存在为细胞悬浮液、组织或器官)，产生该细胞的动物的形式，以及细胞已经或将要暴露的条件。
在本发明的涉及玻璃化条件的实施方式中，抗冻多肽与玻璃化剂联合使用，当冷却至冰点以下的温度时，玻璃化剂在细胞内和细胞外液体的固化期间防止或抑制冰晶体的形成。各种的玻璃化剂是本领域已知的，可以单独使用或者与其他玻璃化剂或生物相容性溶质一起使用。玻璃化剂的实例是甘油、二甲亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、蔗糖、丙二醇、丁二醇和羧甲基纤维素。多元醇是一类有用的玻璃化剂。突出的实例是甘油、乙二醇、丙二醇、丁二醇和丁三醇。玻璃化剂的浓度可能变化很大，取决于体系中其他组分的浓度、冷却速率和达到的最低温度。一般而言，以约5％至约35％重量的浓度可以获得最好的结果。玻璃化一般以快速冷冻速率进行，例如超过100℃/min的速率，优选超过1,000℃/min。
在涉及使用非肽类防冻剂，不一定避免冰晶体的形成的实施方式中，也需要进行许多相同的考虑。以上列出的作为玻璃化剂实例的试剂在类似浓度范围内也起着防冻剂的作用。
抗冻多肽对细胞和/或细胞膜的有益作用是通过将多肽与细胞接触实现，并且在暴露于其他有害条件时的整个或大部分期间保持这种接触而实现的。当细胞是细胞悬浮液的形式，简单地向悬浮液中添加这种多肽就实现了这种接触。当细胞是组织或器官的形式，通过将组织或器官浸入多肽溶液中来实现接触。当细胞是含有血管系统的组织或器官的形式，通过将多肽溶液注满该血管系统来实现接触，并且一旦注满，在整个储藏、保存或暴露在有害条件期间都使多肽保持在血管系统中。灌注的方法是生理学和外科程序的技术人员熟知的。
可以从本发明抗冻多肽处理中受益的细胞包括各种类型。实例是卵细胞、胚胎、白细胞、红细胞、血小板、胰岛和肝细胞。可以从本发明受益的器官也是广泛的。实例包括：肝、肾、心、脑、肺、胰、脾、卵巢和胃。可以从本发明受益的组织包括这些器官的任意组织，以及皮肤组织、骨髓组织、角膜组织以及其他各种组织。本发明一般适用于哺乳动物，并且在人类细胞、组织和器官方面尤其具有意义和效用。
本发明的抗冻多肽在抑制跨膜离子转运中的作用可延伸到各种离子，尤其是Ca++、K+和Na+离子，以及这些离子的两种或多种的结合。
由于过度的离子运输是一种伴随低温的生理效应，本发明抗冻多肽抑制离子转运的能力可能与该多肽在低温条件下增强细胞活力的能力相关。因此，为实现该离子转运的抑制作用所施予的多肽的量和浓度一般与低温暴露下用于增强活力时所用的量相似。
多肽抑制离子跨膜转运的能力也使该多肽可用于治疗存在过量跨膜离子转运的疾病和异常生理状况。这种疾病和状况的实例是囊性纤维变性、Kartagener综合症、尿崩症、糖尿病、抗利尿激素异常。用于该作用的多肽的施予可通过注射、血管注射、局部应用以及其他手段来实现。其他手段是用其他药物和治疗剂治疗或处理这些疾病和状况时，通常使用的手段。而且，得到有益结果时的浓度一般与上述提及的浓度相同，并且用药的剂量或频率由所处理的状况已进展的程度以及观察到的对处理的反应来决定。
含有本发明多肽的抗冻多肽的应用还延伸到该多肽在具有细胞结构的食物储藏中的应用。尤其适用该应用的食物是肉类和肉制品，但对其他类型的食品也是有益的。对于本发明的该目的，肉类和肉制品包括鲜肉和禽肉，以及冷冻的、罐装的和干的肉和家禽肉。在运输或储藏期间，冷冻避免变质的许多这种食物往往失去饱满性、新鲜感和其他有助于味道、口感和一般诉求的品质。通过用本发明的多肽溶液处理这些食物，可以保存这些品质。处理模式对一种类型的食物和另一种会有变化，但是一般来说涉及溶液中食物与多肽的平衡，无论是通过浸没、灌注，还是任意其他类型的吸收或实现延长接触的其他手段。上述涉及本发明其他用途方面的溶液类型、浸没和灌注方法在此处也是适用的。
含有本发明多肽的流体
本发明提供了本发明的抗冻多肽作为流体和液体(如制冷剂)以及许多不同类型水溶液的添加剂的用途，以便防止制冷剂或水溶液的冻结。这种防止溶液冻结的特征在许多不同的技术领域中都是有益的。
与本发明多肽连接的载体和固体载体
本发明的多肽可以与载体连接，如固体载体或半固体载体。多肽可以共价或非共价地连接到任意载体，例如理想地展示本发明多肽的材料的表面。本发明的表面和固体载体可以含有本发明的一种或多种多肽，或其展示抗冻活性的功能片段，它们可直接或间接地连接到表面，如固体或半固体载体上。
连接原则上包括用于将多肽共价或非共价连接在表面的所有现有先进技术，例如通过接头残基直接包封笼状结构中的多肽，其保留多肽与表面的反应接触；或者将本发明多肽与固体或半固体载体接触的其他方式。
可利用多种技术将多肽连接到固体或半固体载体。多肽与固体表面的连接已有公开，例如Cordek et al.1999，Anal.Chem.，71：1529-1533，Blasi et al.2005，Enzyme and Microbial Tech.，36：818-823；Parrado et al.(1995)，Proc.Chem.，30(8)：735-741；Yakovleva et al.(2003)，Biosensors and Bioelectronics，19：21-34；Cao，L.，Carrier-bound Immobilized Enzymes.Principles，Applications andDesign，Wiley-VCH，2005；Immobilization of Enzymes and Cells(Methods inBiotechnology)，Birkerstaff，G.F.，eds.，Humana Press，1997。其他技术也可以采用，并且是技术人员所熟知的。
在本发明的一个方面，提供了一种包含本发明的一种或多种多肽的包衣组合物。包衣组合物可以进一步包含一种或多种其他成分，包括色素和树脂，下文将更详细地说明。
应集中注意的是生物分子(包括多肽)在由溶胶凝胶形成的硅酸盐玻璃中的固定化(Eggers et al.，Protein Sci.2001，10，250-261)。该过程包括水解醇盐以产生溶胶，其然后再进行缩聚作用形成凝胶。在溶胶-凝胶转变期间，生物分子被包封在凝胶中而固定。溶胶-凝胶材料比传统用于生物分子包封的有机聚合物更具优势，因为这些材料具有增加的机械强度、化学稳定性、生物兼容性以及对微生物攻击的抵抗力。
本发明多肽的溶胶-凝胶包封可以使用基于多元醇硅酸盐和多元醇硅氧烷的前体来完成，尤其是来自甘油的那些。聚甘油硅酸盐(PGS)可以制备并用于多肽的溶胶-凝胶生物包封，该方式以高度生物相容性以及温和的包封条件而著称，并且可能使硅石内的多肽再生且有效隔离。
以上公开的方法可以延伸至金属硅酸盐、烷基硅氧烷、功能化的硅氧烷，以及各种复合溶胶-凝胶，从而可以构建体理化学上多样的含有本发明抗冻多肽的生物掺杂聚合物。
本发明的杂合材料优选地显示与游离抗冻多肽相近的活力，以及表征溶胶-凝胶生物陶瓷的高度稳定性和坚固性。
在本发明的一个方面，使用本领域普通技术人员熟知的溶胶-凝胶工艺，将本发明的多肽连接到固体或半固体载体。这种溶胶-凝胶工艺是常规的，并且通常产生一种溶胶-凝胶玻璃，这是由透明的无定性硅胶或硅酸盐材料产生，通过在粘度增加的情况下在胶体亚微米颗粒的网络中形成相互连接，直至该网络变得完全坚硬而制成，其密度约为玻璃的一半。因此，含有本发明一种或多种多肽的溶胶-凝胶玻璃也请求保护。其中特别参考Gill andBallesteros，J.Am.Chem.Soc.1998，120，8587-8598。溶液聚合以形成交联颗粒的溶胶已被如US 5,863,996公开，可以将其与本发明结合使用。
根据本发明的另一方面，包衣组合物优选地包含与本发明多肽相容的树脂，即在形成包衣组合物的一部分时，允许所述多肽发挥抗冻活性。树脂是本领域众所周知的，多肽相容的树脂在现有技术中也已公开。例如，见WO01/72911和US 5,998,200。
本发明还提供一种包含具有三维纳米结构的介孔气凝胶的组合物，该气凝胶含有本发明的多肽。三维纳米结构优选包含一种包封抗冻多肽生物复合超级结构的胶态金属，该胶态金属在其中被纳米胶合。因此，本发明还提供一种制备带有胶态金属的三维纳米结构的介孔气凝胶的方法，其中包封抗冻多肽生物复合物的胶态金属被纳米胶化，所述方法包括步骤：通过将本发明所述一种或多种抗冻多肽与所述的胶态金属混合，形成包封抗冻多肽生物复合物的金属；通过将催化剂和醇盐(如硅醇盐)混合，形成溶胶，如硅溶胶；通过将所述溶胶(如硅溶胶)与所述生物复合材料混合并使所述溶胶变化至凝胶，形成凝胶；以及用CO2提取并超临界干燥所述胶体，以形成所述气凝胶，其中包封抗冻多肽生物复合物超级结构的金属被纳米胶化。在一种实施方式中，介孔气凝胶是介孔二氧化硅气凝胶，参考US2004/0209338。
本发明的多肽在抑制气体水合物的形成中的用途
本发明的多肽还可以用于抑制海洋中的气体水合物的形成。众所周知，气体水合物是冰状结晶分子复合物，它由水与适宜大小的“寄生(guest)”气体分子的混合物形成。水分子(寄主，host)根据氢键形成带有几个空隙腔体的格状结构。寄生的气体分子可以占据格状腔体，并且当最小量的腔体被填满时，晶体结构将变得稳定，甚至在明显高于水冰的熔点的温度时，形成固体气体水合物。当气体水合物分离(融化)时，晶格分解成液态水(或者，在低于水的冰点条件下变成冰)，并且释放出气体。商业上，气体可以用于能源生产。然而，在该气体以非控制的方式逸出的情况下，该现象不代表环境风险。这可能存在于地球不时干裂的地区。
众所周知，关于气体水合物形成的问题也出现在海洋底部的管道中。然而，因为本发明多肽的抑制冰晶体形成的性质，可以相信的是所述多肽的存在可以抑制气体水合物的形成，因为这些水合物与冰晶体的结构非常相似。
下文公开本发明所选择的条目：
1、一种含有多个连续相连的氨基酸残基的多肽，所述多肽包括序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)，其中
X1选自氨基酸残基S、A、G和D；
X2选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
X3选自非大体积的氨基酸残基；
X4选自氨基酸残基S、I、T和V；
X5选自氨基酸残基S、A、I和T；
X6选自氨基酸残基S、T和V；
X7选自非大体积氨基酸残基；
X8选自氨基酸残基S、T和V；
X9选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少一个是T或V；
其中多肽的氨基酸残基的总数小于250；和
其中多肽具有冰结合能力。
2.条目1的多肽，其中X1是S。
3.条目1的多肽，其中X1是A。
4.条目1的多肽，其中X1是G。
5.条目1的多肽，其中X1是D。
6.条目1的多肽，其中X2是A。
7.条目1的多肽，其中X2是V。
8.条目1的多肽，其中X2是I。
9.条目1的多肽，其中X2是T。
10.条目1的多肽，其中X2是S。
11.条目1的多肽，其中X3不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
12.条目1的多肽，其中X4是S。
13.条目1的多肽，其中X4是I。
14.条目1的多肽，其中X4是T。
15.条目1的多肽，其中X4是V。
16.条目1的多肽，其中X5是S。
17.条目1的多肽，其中X5是A。
18.条目1的多肽，其中X5是I。
19.条目1的多肽，其中X5是T。
20.条目1的多肽，其中X6是S。
21.条目1的多肽，其中X6是T。
22.条目1的多肽，其中X6是V。
23.条目1的多肽，其中X7不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
24.条目1的多肽，其中X8是S。
25.条目1的多肽，其中X8是T。
26.条目1的多肽，其中X8是V。
27.条目1的多肽，其中X9是S。
28.条目1的多肽，其中X9是A。
29.条目1的多肽，其中X9是G。
30.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少一个是T。
31.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少两个是T。
32.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少三个是T。
33.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的四个都是T。
34.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少一个是V。
35.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少两个是V。
36.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少三个是V。
37.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的四个都是V。
38.条目1的多肽，其中所述多肽的氨基酸残基的最大数量少于240，例如少于230，例如少于220，例如少于210，例如少于200，例如少于190，例如少于180，例如少于150，例如少于140，例如少于130，例如少于120，例如少于110，例如少于100，例如少于95，例如少于90，例如少于85，例如少于80，例如少于75，例如少于70，例如少于65，例如少于60，例如少于55，例如少于50，例如少于45，例如少于40，例如少于30，例如少于20，例如少于15。
39.条目1的多肽，其中所述多肽的氨基酸残基的最小数量为10或更多，例如12或更多，例如14或更多，例如16或更多，例如18或更多，例如20或更多，例如22或更多，例如24或更多，例如26或更多，例如28或更多，例如30或更多，例如32或更多，例如34或更多，例如36或更多，例如38或更多，例如40或更多，例如42或更多，例如44或更多，例如46或更多，例如48或更多，例如50或更多，例如55或更多，例如60或更多，例如65或更多，例如70或更多，例如75或更多，例如80或更多，例如85或更多，例如90或更多，例如95或更多，例如100或更多。
40.条目1的多肽，进一步含有SEQ ID NO：90第二拷贝，其与SEQ IDNO：90第一拷贝不重叠，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝含有序列：
Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-Xf-Xg-Xh-Xi(SEQ ID NO：90)，
其中：
Xa选自氨基酸残基S、A、G和D；
Xb选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
Xc选自非大体积的氨基酸残基；
Xd选自氨基酸残基S、I、T和V；
Xe选自氨基酸残基S、A、I和T；
Xf选自氨基酸残基S、T和V；
Xg选自非大体积氨基酸残基；
Xh选自氨基酸残基S、T和V；
Xi选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xg中的至少一个是T或V。
41.条目40的多肽，其中Xa是S。
42.条目40的多肽，其中Xa是A。
43.条目40的多肽，其中Xa是G。
44.条目40的多肽，其中Xa是D。
45.条目40的多肽，其中Xb是A。
46.条目40的多肽，其中Xb是V。
47.条目40的多肽，其中Xb是I。
48.条目40的多肽，其中Xb是T。
49.条目40的多肽，其中Xb是S。
50.条目40的多肽，其中Xc不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
51.条目40的多肽，其中Xd是S。
52.条目40的多肽，其中Xd是I。
53.条目40的多肽，其中Xd是T。
54.条目40的多肽，其中Xd是V。
55.条目40的多肽，其中Xe是S。
56.条目40的多肽，其中Xe是A。
57.条目40的多肽，其中Xe是I。
58.条目40的多肽，其中Xe是T。
59.条目40的多肽，其中Xf是S。
60.条目40的多肽，其中Xf是T。
61.条目40的多肽，其中Xf是V。
62.条目40的多肽，其中Xg不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
63.条目40的多肽，其中Xh是S。
64.条目40的多肽，其中Xh是T。
65.条目40的多肽，其中Xh是V。
66.条目40的多肽，其中Xi是S。
67.条目40的多肽，其中Xi是A。
68.条目40的多肽，其中Xi是G。
69.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少一个是T。
70.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少两个是T。
71.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少三个是T。
72.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的四个都是T。
73.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少一个是V。
74.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少两个是V。
75.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少三个是V。
76.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的四个都是V。
77.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和第二拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
78.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一和第二拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
79.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和第二拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
80.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90第一和第二拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
81.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端。
82.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的N-端。
83.条目40的多肽，进一步含有SEQ ID NO：90的第三拷贝，其与SEQID NO：90的第一和第二拷贝不重叠，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝含有序列：
Xaa-Xba-Xca-Xda-Xea-Xfa-Xga-Xha-Xia(SEQ ID NO：90)，
其中：
Xaa选自氨基酸残基S、A、G和D；
Xba选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
Xca选自非大体积的氨基酸残基；
Xda选自氨基酸残基S、I、T和V；
Xea选自氨基酸残基S、A、I和T；
Xfa选自氨基酸残基S、T和V；
Xga选自非大体积氨基酸残基；
Xha选自氨基酸残基S、T和V；
Xia选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xga中的至少一个是T或V。
84.条目83的多肽，其中Xaa是S。
85.条目83的多肽，其中Xaa是A。
86.条目83的多肽，其中Xaa是G。
87.条目83的多肽，其中Xaa是D。
88.条目83的多肽，其中Xba是A。
89.条目83的多肽，其中Xba是V。
90.条目83的多肽，其中Xba是I。
91.条目83的多肽，其中Xba是T。
92.条目83的多肽，其中Xba是S。
93.条目83的多肽，其中Xca不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
94.条目83的多肽，其中Xda是S。
95.条目83的多肽，其中Xda是I。
96.条目83的多肽，其中Xda是T。
97.条目83的多肽，其中Xda是V。
98.条目83的多肽，其中Xea是S。
99.条目83的多肽，其中Xea是A。
100.条目83的多肽，其中Xea是I。
101.条目83的多肽，其中Xea是T。
102.条目83的多肽，其中Xfa是S。
103.条目83的多肽，其中Xfa是T。
104.条目83的多肽，其中Xfa是V。
105.条目83的多肽，其中Xga不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
106.条目83的多肽，其中Xha是S。
107.条目83的多肽，其中Xha是T。
108.条目83的多肽，其中Xha是V。
109.条目83的多肽，其中Xia是S。
110.条目83的多肽，其中Xia是A。
111.条目83的多肽，其中Xia是G。
112.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少一个是T。
113.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少两个是T。
114.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少三个是T。
115.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的四个都是T。
116.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少一个是V。
117.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少两个是V。
118.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少三个是V。
119.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的四个都是V。
120.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的不同拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
121.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二和第三拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
122.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
123.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
124.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
125.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
126.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
127.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
128.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端。
129.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的N-端以及SEQ ID NO：90的第二拷贝的C-端。
130.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端以及SEQ ID NO：90的第一拷贝的C-端。
131.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第二拷贝的C-端。
132.条目83的多肽，进一步含有SEQ ID NO：90的第四拷贝，其与SEQID NO：90的第一、第二和第三拷贝不重叠，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝含有序列：
Xab-Xbb-Xcb-Xdb-Xeb-Xfb-Xgb-Xhb-Xib(SEQ ID NO：90)，
其中：
Xab选自氨基酸残基S、A、G和D；
Xbb选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
Xcb选自非大体积的氨基酸残基；
Xdb选自氨基酸残基S、I、T和V；
Xeb选自氨基酸残基S、A、I和T；
Xfb选自氨基酸残基S、T和V；
Xgb选自非大体积氨基酸残基；
Xhb选自氨基酸残基S、T和V；
Xib选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xgb中的至少一个是T或V。
133.条目83的多肽，其中Xab是S。
134.条目83的多肽，其中Xab是A。
135.条目83的多肽，其中Xab是G。
136.条目83的多肽，其中Xab是D。
137.条目83的多肽，其中Xbb是A。
138.条目83的多肽，其中Xbb是V。
139.条目83的多肽，其中Xbb是I。
140.条目83的多肽，其中Xbb是T。
141.条目83的多肽，其中Xbb是S。
142.条目83的多肽，其中Xcb不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
143.条目83的多肽，其中Xdb是S。
144.条目83的多肽，其中Xdb是I。
145.条目83的多肽，其中Xdb是T。
146.条目83的多肽，其中Xdb是V。
147.条目83的多肽，其中Xeb是S。
148.条目83的多肽，其中Xeb是A。
149.条目83的多肽，其中Xeb是I。
150.条目83的多肽，其中Xeb是T。
151.条目83的多肽，其中Xfb是S。
152.条目83的多肽，其中Xfb是T。
153.条目83的多肽，其中Xfb是V。
154.条目83的多肽，其中Xgb不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
155.条目83的多肽，其中Xhb是S。
156.条目83的多肽，其中Xhb是T。
157.条目83的多肽，其中Xhb是V。
158.条目83的多肽，其中Xib是S。
159.条目83的多肽，其中Xib是A。
160.条目83的多肽，其中Xib是G。
161.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少一个是T。
162.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少两个是T。
163.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少三个是T。
164.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的四个都是T。
165.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少一个是V。
166.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少两个是V。
167.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少三个是V。
168.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的四个都是V。
169.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和第四拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
170.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
171.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
172.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
173.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
174.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
175.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
176.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
177.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
178.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
179.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
180.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
181.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的N-端。
182.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的C-端。
183.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端。
184.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的C-端。
185.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第三拷贝的N-端。
186.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第三拷贝的C-端。
187.条目1至186任一项的多肽与载体相连。
188.条目187的多肽，其中所述载体包含亲合素基团，如链亲合素，其可选择地被生物素化。
189.条目1至186任一项所述的多肽，其与固体载体或半固体载体相连，例如通过共价结合。
190.条目1至186任一项所述的多肽可操作地与亲和标签融合，如组氨酸标记。
191.一种融合多肽，含有可操作地与N-端侧翼序列融合的条目1至186任一项所述的多肽。
192.一种融合多肽，含有可操作地与C-端侧翼序列融合的条目1至186任一项所述的多肽。
193.条目1至186任一项所述的多肽，其可操作地与信号肽融合。
194.条目1至186任一项所述的多肽，其可操作地与前区段(pro-region)融合。
195.条目1至186任一项所述的多肽，其可操作地与预前区段(pre-pro-region)融合。
196.条目1至186任一项所述的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被修饰，所述修饰优选地选自由体内或体外的化学衍生作用，如乙酰化作用或羧化作用，糖基化作用，例如由将多肽暴露于影响糖基化的酶所产生的糖基化作用，例如哺乳动物糖基化或者去糖基化酶；磷酸化作用，如导致磷酸化氨基酸残基的氨基酸残基修饰，如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。
197.条目1至186任一项的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被修饰，以便优选地提高对于蛋白质降解的抵抗力和稳定性，或者优化溶解性能，或者使多肽更适宜作为一种治疗剂。
198.条目197的多肽，含有除天然产生的L-氨基酸残基以外的氨基酸残基。
199.条目198的多肽，含有D-氨基酸残基。
200.条目198的多肽，含有非天然产生的合成氨基酸。
201.条目197的多肽，包含一个或多个阻断基团，优选地是化学取代基的形式，适用于在不良的降解条件下保护和/或稳定该多肽的N-和C-端。
202.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团包括保护基，其对多肽在体内的活性没有不利影响。
203.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团是由N-末端的烷基化或酰基化作用引入。
204.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团组选自N-端阻断基团，包括C1至C5分支或无分支的烷基和酰基，如甲酰基和乙酰基及其取代形式，如乙酰氨基甲基(Acm)。
205.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团选自N-端阻断基团，包括氨基酸的去氨基类似物，其与肽的N-端连接或者用于代替N-端氨基酸残基。
206.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团选自C-端阻断基团，其中C-端的羧基被纳入或者不纳入，例如酯、酮和氨基化合物，以及去羧酸化的氨基酸类似物。
207.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团选自C-端阻断基团，包括形成酯或酮的烷基，如低烷基(C1至C6)，如甲基、乙基和丙基；以及形成酰胺的氨基，如伯氨(-NH2)、单-和双-烷基氨基，如甲氨、乙氨、二甲氨、二乙氨、甲乙氨等。
208.条目201的多肽，其中N-端的游离氨基和末端的游离羧基可以完全从多肽中移去，以产生去氨基和去羧酸的形式，而基本不影响多肽的生物活性。
209.条目1至208任一项所述的多肽的酸式盐，所述盐可通过用无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、p-甲苯磺酸或水杨酸处理所述多肽而得，以提供该多肽的水溶性盐。
210.一种生产条目1至208任一项所述多肽的方法，所述方法包括步骤：提供编码所述多肽的多核苷酸，并在适宜的宿主生物中的体外或体内表达所述多核苷酸，从而生产条目1至208任一项所述的多肽。
211.编码条目1至208任一项所述多肽的多肽部分的多核苷酸。
212.含有条目211所述的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸可选择地被可操作地连接到调控序列，该调控序列控制所述多核苷酸在适宜宿主细胞中的表达。
213.一种重组或转基因宿主细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽、或者条目211所述的多核苷酸、或者条目212所述的表达载体。
214.一种生成重组或转基因宿主细胞的方法，所述方法包含步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述重组或转基因宿主细胞，从而生成一种产生所述多肽的重组或转基因宿主细胞。
215.含有条目213所述的宿主细胞的转基因哺乳动物生物体。
216.条目215的转基因哺乳动物生物体，其中所述哺乳动物宿主细胞是动物细胞，选自单系群两侧对称动物，包括属于后口动物(Deuterostomes)、蜕皮动物(Ecdysozoa)、扁虫动物(Platyzoa)、冠轮动物(Lophotrochozoa)的任意四个主要家系的哺乳动物细胞。
217.条目215的转基因哺乳动物生物体，其中所述哺乳动物宿主细胞是选自卵裂球细胞、卵细胞、胚胎干细胞、红血球、纤维原细胞、肝细胞、成肌细胞、肌小管、神经细胞、卵母细胞、成骨细胞、破骨细胞、精子细胞、T细胞和受精卵的动物细胞。
218.一种生成转基因哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述重组或转基因宿主细胞，并且可选地，在所述转基因哺乳动物的宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的转基因哺乳动物宿主细胞。
219.转基因鱼，含有条目1至208任一项所述的多肽，或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的表达载体。
220.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是鲑鱼。
221.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是比目鱼。
222.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是鳕鱼。
223.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是青鱼
224.含有条目213所述的宿主细胞的转基因植物。
225.条目224的转基因植物宿主细胞，其中所述宿主细胞是分类单元Embryophyta或Viridiplantae或Chlorobionta的植物细胞，优选地选自湖粉细胞、厚角组织细胞、内皮细胞、胚乳细胞、表皮细胞、叶肉细胞、分生组织细胞、栅栏细胞、薄壁细胞、韧皮部筛管细胞、花粉生成细胞、花粉营养细胞、厚壁组织细胞、管胞细胞、木质部导管细胞和受精卵细胞。
226.条目224的转基因植物，其中所述植物是马铃薯植物。
227.条目224的转基因植物，其中所述植物是番茄植物。
228.条目224的转基因植物，其中所述植物是葡萄藤。
229.条目224的转基因植物，其中所述植物是黄瓜植物。
230.条目224的转基因植物，其中所述植物是小麦。
231.条目224的转基因植物，其中所述植物是大麦。
232.条目224的转基因植物，其中所述植物是黑麦。
233.条目224的转基因植物，其中所述植物是燕麦。
234.条目224的转基因植物，其中所述植物是烟叶。
235.条目224的转基因植物，其中所述植物是柑橘类植物。
236.条目224的转基因植物，其中所述植物是苹果植物。
237.条目224的转基因植物，其中所述植物是草莓植物。
238.条目224的转基因植物，其中所述植物是树莓植物。
239.一种生成转基因植物的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述植物，并且可选地，在所述植物中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的转基因植物。
240.一种重组细菌宿主细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽，和/或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的载体。
241.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞选自革兰氏阳性细菌宿主细胞和革兰氏阴性细菌宿主细胞。
242.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌细胞是Lactobacillus菌株。
243.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌细胞是Streptococcus菌株。
244.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌细胞是Bifidobacterium菌株。
245.一种产生重组细菌细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述细菌细胞，并且可选地，在所述细菌细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的重组细菌细胞。
246.一种重组酵母细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽，和/或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的载体。
247.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞属于Saccharomyces、Scizosacchomyces或Pichia属。
248.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母是Saccharomycescerevisiae.
249.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母是Scizosacchomyces pompe.
250.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母是Pichiapastoris。
251.一种生成重组酵母细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述酵母细胞，并且可选地，在所述酵母细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的重组酵母细胞。
252.一种重组真菌细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽，和/或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的载体。
253.条目252的真菌宿主细胞，其中所述真菌属于Aspergillus属。
254.一种生成重组真菌细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述真菌细胞，并且可选地，在所述真菌细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的重组真菌细胞。
255.一种特异性针对条目1至208任一项所述多肽的抗体或其结合片段。
256.条目255的抗体，其中所述抗体是多克隆的。
257.条目255的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
258.条目255的抗体片段，其中所述抗体片段包含抗体的一部分，选自F(ab′)2、F(ab)2、Fab′和Fab。
259.条目255的抗体片段，其中所述抗体片段是与特异性抗原结合的合成或者基因工程化的多肽。
260.条目255的抗体片段，其中所述抗体片段选自：包含或由轻链可变区组成的抗体片段；包含或由“Fv”片段组成的抗体片段，Fv片段由可变区域的重链和轻链组成；包含或由重组单链多肽分子组成的抗体片段，重组单链多肽分子中的轻可变区和重可变区通过肽连接头连接(″scFv多肽″)，以及包含或由最小识别单元组成的抗体片段，最少识别单元组成模仿高变区的氨基酸残基。
261.条目255的抗体，其中所述抗体是重组多肽形式的嵌合抗体，其含有来自鼠抗体的可变区和互补决定区，而抗体分子的剩余部分来自人抗体。
262.条目255的抗体，其中所述抗体是重组多肽形式的人源化抗体，其中单克隆抗体的鼠互补决定区已经由小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链转移至人可变域。
263.条目255至262任一项所述的抗体，进一步包含或者连接可检测的分子或原子的形式的标记，所述标记可以与抗体基团偶联，从而产生更容易检测的基团。
264.条目263的抗体，其中标记选自螯合剂，光活性剂，放射性同位素，荧光剂和顺磁离子。
265.一种生成特异性针对条目1至208任一项所述多肽的多克隆抗体或其结合片段的方法，所述方法包括步骤：在引起抗体应答的条件下用条目1至208任一项所述的多肽免疫哺乳动物个体，识别与多肽特异性结合的抗体，并且可选地，从所述哺乳动物个体中分离所述抗体或其结合片段。
266.一种生成特异性针对条目1至208任一项所述多肽的单克隆抗体的方法，所述方法包括步骤：在引起抗体应答的条件下用条目1至208任一项所述的多肽免疫哺乳动物个体，制备产生特异性针对条目1至208任一项所述多肽的抗体的杂交瘤，并且识别与多肽特异性结合的抗体。
267.一种组合物，含有条目1至208任一项所述的多肽以及载体。
268.一种冰排斥面，含有条目1至208任一项所述的多肽或条目267所述的组合物。
269.包含条目268所述的冰排斥面的冷藏室。
270.包含条目268所述的冰排斥面的冷冻器。
271.包含条目268所述的冰排斥面的橱窗。
272.包含条目268所述的冰排斥面的风车翼。
273.包含条目268所述的冰排斥面的无线电检测和测距装置。
274.包含条目268所述的冰排斥面的汽车。
275.包含条目268所述的冰排斥面的热泵。
276.包含条目268所述的冰排斥面的帆船。
277.包含条目268所述的冰排斥面的路面。
278.一种转移液体源(例如水)的管，所述管包含条目268所述的冰排斥面。
279.条目278所述的管由塑料制成。
280.条目278所述的管由金属制成。
281.包含条目268所述的冰排斥面的屋顶结构。
282.包含条目268所述的冰排斥面的瓶子。
283.包含条目268所述的冰排斥面的罐头。
284.包含条目268所述的冰排斥面的天线装置。
285.包含条目268所述的冰排斥面的风档刮水器。
286.包含条目268所述的冰排斥面的橡胶轮胎。
287.包含条目268所述的冰排斥面的空调装置。
288.包含条目268所述的冰排斥面的铁轨。
289.包含条目268所述的冰排斥面的火车车轮。
290.包含条目268所述的冰排斥面的电缆。
291.一种冰晶核表面，含有条目1至208任一项所述的多肽或条目267所述的组合物。
292.包含条目291所述的冰晶核表面的冷藏室。
293.包含条目291所述的冰晶核表面的冷冻室。
294.包含条目291所述的冰晶核表面的橱窗。
295.包含条目291所述的冰晶核表面的风车翼。
296.包含条目291所述的冰晶核表面的无线电检测和测距装置。
297.包含条目291所述的冰晶核表面的汽车。
298.包含条目291所述的冰晶核表面的热泵。
299.包含条目291所述的冰晶核表面的帆船。
300.包含条目291所述的冰晶核表面的路面。
301.一种转移液体源(例如水)的管，所述管包含条目291所述的冰晶核表面。
302.条目301所述的管由塑料制成。
303.条目301所述的管由金属制成。
304.包含条目291所述的冰晶核表面的屋顶结构。
305.包含条目291所述的冰晶核表面的瓶子。
306.包含条目291所述的冰晶核表面的罐头。
307.包含条目291所述的冰晶核表面的天线装置。
308.包含条目291所述的冰晶核表面的风档刮水器。
309.包含条目291所述的冰晶核表面的橡胶轮胎
310.包含条目291所述的冰晶核表面的空调装置。
311.包含条目291所述的冰晶核表面的铁轨。
312.包含条目291所述的冰晶核表面的火车车轮。
313.包含条目291所述的冰晶核表面的电缆。
314.一种降低水性液体组合物的凝固点的方法，所述方法包括步骤：将条目1至209任一项所述的多肽与所述水性液体组合物接触，其中所述接触导致所述水性液体组合物的凝固点降低。
315.条目314的方法，其中所述液体组合物包括涂料组合物。
316.条目314的方法，其中所述液体组合物包括冷冻器中使用的防冻剂。
317.条目314的方法，其中所述液体组合物包括冷藏室中使用的防冻剂。
318.条目314的方法，其中所述液体组合物包括发动机中使用的防冻剂.
319.条目314的方法，其中所述液体组合物包括挡风玻璃清洗剂。
320.条目314的方法，其中所述液体组合物包括硅树脂。
321.条目314的方法，其中所述液体组合物包括涂料成分，如油漆、亮漆或清漆。
322.条目314的方法，其中所述液体组合物包括蜡。
323.条目314的方法，其中所述液体组合物包括油。
324.条目314的方法，其中所述液体组合物包括水泥。
325.条目314的方法，其中所述液体组合物包括混凝土。
326.条目314的方法，其中所述液体组合物包括肥皂。
327.条目314的方法，其中所述液体组合物包括锁中使用的防冻组合物。
328.一种减少或消除水性液体组合物再结晶的方法，所述方法包括步骤：在冻结之前将条目1至209任一项所述的多肽与水性液体组合物接触，由此减少或消除水性液体组合物的再结晶。
329.条目328的方法，其中所述液体组合物包括涂料组合物。
330.条目328的方法，其中所述液体组合物包括冷冻器中使用的防冻剂。
331.条目328的方法，其中所述液体组合物包括冷藏室中使用的防冻剂。
332.条目328的方法，其中所述液体组合物包括发动机中使用的防冻剂.
333.条目328的方法，其中所述液体组合物包括挡风玻璃清洗剂。
334.条目314的方法，其中所述液体组合物包括硅树脂。
335.条目328的方法，其中所述液体组合物包括亮漆。
336.条目328的方法，其中所述液体组合物包括蜡。
337.条目328的方法，其中所述液体组合物包括油。
338.条目328的方法，其中所述液体组合物包括水泥。
339.条目328的方法，其中所述液体组合物包括混凝土。
340.条目328的方法，其中所述液体组合物包括肥皂。
341.条目328的方法，其中所述液体组合物包括锁中使用的防冻组合物。
342.一种保存和/或降低生物样品或器官的凝固点的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽和生物样品或器官接触，由此可以在超冷条件或冻结条件下保存生物样品或器官。
343.条目342的方法，其中生物样品包括多肽。
344.条目342的方法，其中生物样品包括微粒或胶束。
345.条目342的方法，其中生物样品包括全血。
346.条目342的方法，其中生物样品包括血浆。
347.条目342的方法，其中生物样品包括血小板。
348.条目342的方法，其中生物样品包括红细胞。
349.条目342的方法，其中生物样品包括精液。
350.条目342的方法，其中生物样品包括配子。
351.条目342的方法，其中生物样品包括昆虫细胞的细胞培养物。
352.条目342的方法，其中生物样品包括哺乳动物细胞的细胞培养物。
353.条目352的方法，其中哺乳动物细胞是鼠细胞。
354.条目342的方法，其中哺乳动物细胞是人细胞。
355.条目342的方法，其中生物样品包括或者由器官组成。
356.条目355的方法，其中器官选自肾、肺、心脏、脾和肝。
357.一种抑制生物样品或器官在储存期间再结晶的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽与生物样品或器官接触，从而抑制再结晶，并可以在超冷条件或冷藏条件下储存生物样品或器官。
358.条目357的方法，其中生物样品包括多肽。
359.条目357的方法，其中生物样品包括微粒或胶束。
360.条目357的方法，其中生物样品包括全血。
361.条目357的方法，其中生物样品包括血浆。
362.条目357的方法，其中生物样品包括血小板。
363.条目357的方法，其中生物样品包括红细胞。
364.条目357的方法，其中生物样品包括精液。
365.条目357的方法，其中生物样品包括配子。
366.条目357的方法，其中生物样品包括昆虫细胞的细胞培养物。
367.条目357的方法，其中生物样品包括哺乳动物细胞的细胞培养物。
368.条目357的方法，其中哺乳动物细胞是鼠细胞。
369.条目357的方法，其中哺乳动物细胞是人细胞。
370.条目357的方法，其中生物样品包括或者由器官组成。
371.条目357的方法，其中器官选自肾、肺、心脏、脾和肝。
372.一种保存食用或饮用组合物(如食品)的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽与食品接触，从而可以改善或延长非冷冻态的食用或饮用组合物的储存，否则食品在该非冷冻态的温度下将成为冻结态。
373.条目372的方法，其中组合物选自牛奶、发酵奶、奶酪、碎肉、碎鱼、酸奶、雪酪、果子露、布丁、菜泥、果浆、生面团、冰牛奶、奶油、刨冰、碎冰、冰沙、冰淇淋、冰糕、面糊和肉。
374.一种减少或抑制食用或饮用组合物上的冰晶体再结晶的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽与食物接触，从而减少或抑制储存期间温度下组合物上形成的冰晶体的再结晶，否则将在该温度下形成冰晶体。
375.条目374的方法，其中组合物选自牛奶、发酵奶、奶酪、碎肉、碎鱼、酸奶、雪酪、果子露、布丁、菜泥、果浆、生面团、冰牛奶、奶油、刨冰、碎冰、冰沙、冰淇淋、冰糕、面糊和肉。
376.一种增加化妆品的耐寒性的方法，该化妆品能够用于个体的皮肤，所述方法包括将条目1至209任一项所述的多肽与化妆品接触的步骤，从而当应用于皮肤时增加化妆品的耐寒性。
377.一种增加产品的水分含量的方法，该产品能够吸水，所述方法包括接触条目1至209任一项所述的多肽的步骤，从而增加产品的水分含量。
378.一种通过手术限制肿瘤的方法，所述方法包括在所述肿瘤进行冷冻步骤前，将条目1至209任一项所述的多肽注射进肿瘤的步骤，从而增强对肿瘤的杀灭。
379.一种通过手术可控制地除去脂肪组织的方法，所述方法包括在除去脂肪组织前，将条目1至209任一项所述的多肽注射进脂肪组织的步骤。
380.一种抑制原油产品中包合物形成的方法，所述方法包括将条目1至209任一项所述的多肽添加至原油产品的步骤，从而抑制包合物形成。
381.一种在干燥期间或者在经受高或低渗透压期间稳定生物样品的方法，所述方法包括接触条目1至209任一项所述的多肽的步骤，从而在干燥期间或者在经受高或低渗透压期间，稳定生物样品。
382.条目381的方法，其中生物样品包括一种或多种多肽、微粒体、胶束、全血、血浆、血小板、红细胞、精液、配子。
383.条目381的方法，其中生物样品包括细胞培养物。
384.条目383的方法，其中细胞培养物包括一种或多种昆虫细胞、哺乳动物细胞、鼠细胞和人细胞。
385.一种从包含不同分子的组合物中纯化一种或多种分子的方法，所述方法包括在含有条目1至209任一项所述多肽的组合物存在的情况下，进行所述纯化的步骤，从而可以在低于包含不同分子的组合物的凝固点的温度下发生纯化。
386.条目385的方法，其中组合物的分子包括不同的分子，选自多肽、肽、氨基酸、糖、脂肪酸、DNA分子、RNA分子、磷脂、如线粒体、核糖体等细胞器、三磷酸腺苷。
387.一种改善待脱水的组合物的脱水的方法，所述方法包括将所述组合物与条目1至209任一项所述的多肽接触，以及使所述组合物脱水的步骤。
388.一种含有条目1至209所述多肽的组合物。
389.一种含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽均匀或不均匀地在表面分布。
390.一种含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽均匀或不均匀地分布在整个组合物中。
391.一种用于冷冻的含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽是在冷冻前加入。
392.一种用于冷冻的含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽在冷冻后加入。
393.含有条目1至209所述多肽的药物成分。
394.含有条目1至209所述多肽的表面，其中所述表面是冰排斥的。
395.含有条目1至209所述多肽的表面，其中所述表面是冰结合的。
396.含有条目1至209所述多肽的生物样品。
397.含有条目1至209所述多肽的食用组合物。
398.含有条目1至209所述多肽的液体组合物。
399.含有条目1至209所述多肽的固体组合物。
400.含有条目1至209所述多肽的固体组合物，其中多肽在表面分布。
401.含有条目1至209所述多肽的固体成分，其中多肽均匀或不均匀地分布在整个样品中。
现通过描述来自Rhagium mordax的抗冻蛋白的重组表达、纯化和特征，对本发明进行更详细的说明。
实施例
采用两种不同的方法鉴别和纯化来自R.mordax的抗冻多肽。
1)用Kristiansen等人(2005)发表的方法来纯化该抗冻多肽。
2)设计两种简并引物，以匹配R.Inquisitor AFP的N-端和C-端区(图1)。用它们在常规的RT-PCR反应中扩增R.mordax RNA的cDNA区，R.mordax RNA是从冬季采集的动物中分离。这种cDNA编码来自R.mordax推定的AFP’s的中心区。通过这种方法，得到多肽两种类型(族)的中心部分的序列(99-108aa)。
3)随后获得对9种同工型的全长AFP序列。通过使用Clontech SmartRACE cDNA扩增试剂盒，将特异性针对编码推定的AFP’s的cDNA各中心部分的引物与相关的5’端的扩增结合使用。一旦获得各cDNA的5’端，该序列将被用于获得全长克隆。这是通过在R.mordax RNA的RT-PCR反应中，用匹配各cDNA末端5’端的引物与匹配mRNA poly-A尾的引物相结合来完成的。
总之，获得了编码组I AFP’s的各种同工型的9种全长cDNA，并且推断出编码的多肽。
表达和纯化
源自Rhagium mordax RmAFP的抗冻蛋白(AFP)的六种同工型被克隆。图5显示一种野生型(wt)同工型RmAFP1的SDS-PAGE凝胶，以及缺失变体(Δ2-9，WC(Trp-Cys))。将RmAFP变体构建为缺失冰结合域，从RmAFP1的C-端开始每次缺失一个(Δ2-Δ9)(例如Δ4表示推定的冰结合域4-9缺失)，以及在C-端包含Trp和Cys残基的变体(WC)。将它们克隆到pGEX载体系统中(GE Healthcare)并在E.coli(菌株：Origami，BL21)中转化。这些蛋白表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，其在GST和RmAFP之间含有凝血酶裂解位点。然后，将细胞通过弗氏压碎器溶解，并且使用与琼脂糖珠共价连接的还原型谷胱甘肽，基于亲和色谱以及体积排阻色谱进行纯化谱。图5中的箭头表示AFP1的缺失衍生物的位置。
活性测定
利用纳米-升渗压计测试Rhagium mordax抗冻蛋白的野生型同工型及其变体的活性。结果显示在下表4中。将RmAFP变体构建为缺失冰结合域，从RmAFP1的C-端每次缺失一个；以及在C-端含有Trp和Cys残基的变体。THapp是热滞后，直接从分析中估计而不考虑AFP的浓度，被纯化或在个别测试中作为融合蛋白或冰部分(fractionation)；星号标记的TH除外，TH是通过TH vs冰部分图中的点，由直线外推法估计得出。n是测量的次数。尚不确定，但在进行中(N.D)。我们发现，Δ5-9和Δ4-9中可检测的活性表明含有4个和3个推定冰结合基团的AFP1的截断体分别保留了防止冰晶体生长的能力。缺失衍生物的特异性活性还没有被确定，目前尚不知道它们与wt蛋白相关的活性。
表4
RmAFP活性的目视检查
图6说明“冰生长-激增”的进展，其在热滞后冰点下发生于1)RmAFP1的溶液和2)粘鱼Zoarces viviparus(带有3AFP的丹麦鱼)的血清中。在两种情况下，在温度降低之前小冰晶可以在溶液中退火。当降低RmAFP溶液的温度时，在达到滞后冰点之前，初始的冰晶体(1A中的箭头处)不再生长和改变形状。在滞后冰点(1B)下冰晶体突然爆发，因为溶液在超冷的环境中冻结。请注意，在这种情况下，滞后冰点时的冰生长模式是菜花状(1B、1C)。这与2)(Z.viviparus血清)中看到的情形相反，2)中冷却时冰晶体缓慢变化形状，并变为带有六角形基面的双棱锥(2A)。在滞后冰点时，冰生长是针状的(2B)，并且溶液中所有的冰生长为针状体(2C)。总之，RmAFP能够抑制所有的冰生长或者冰晶体形状的变化(1)。这与鱼的抗冻蛋白溶液显著不同，鱼的抗冻肽蛋白溶液一般遵循(2)中看到的模式。
RmAFP1的物理化学性质-质谱(MALDI-ToF)
克隆和纯化的Rhagium mordax AFP1的分子测定如图7显示。纯化重组rRmAFP1由Alphalyse(Odense，丹麦)通过MALDI-ToF分析完成纯化重组rRmAFP1的质谱分析。rRmAFP1的分子测定给出平均值为12555Da。这个差异性可能是由于校正仪器时使用外标。
体积排阻色谱
本发明还研究了rRmAFP1的二聚化，结果如图8所示。在自然条件下rRmAFP表现为二聚体，因为当其穿过体积排阻柱时(Superdex 75，10/30，GEHealthcare)，它比相同Mw范围的其他蛋白具有更短的保留时间。当Superdex 75用牛血清白蛋白(68KDa，BSA)、胰蛋白(25KDa)和人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(13KDa)进行校正时，从rRmAFP1的SEC估算Mw为28KDa。这些显示在图8A中。同样，当在SDS PAGE中运行时，RmAFP也表现为二聚体，估计Mw为28KDa。第1泳道：牛血清白蛋白(BSA)；2：胰蛋白；3：RNAse A；4：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；5：溶菌酶；6：RmAFP1；7：谷胱甘肽S转移酶(GST)。这显示在图8B中。
圆二色光谱
在哥本哈根大学进行圆二色光谱(CD)。结果可见图9。根据图9A，远UV CD光谱显示重组蛋白具有确定的结构。图9B中显示的近UV CD光谱表明rRmAFP具有大量的β-片层结构。
差示扫描量热法
通过差示扫描量热法(DSC；Scal，Moscow，Russia)研究温度稳定性。结果如图10显示。RmAFP1的转变温度Tm估计为47.7℃。在6-100℃温度范围内进行第一次扫描，在6-70℃温度范围内进行随后的11次扫描。曲线的不对称形状表明了蛋白二聚体的分解，随后单体的展开。由11次扫描产生的整体曲线相似性显示RmAFP能够在连续加热/冷却循环中多次变性和复性，而没有任何物质的损失。较低的线显示了在缓冲控制器上进行的类似热循环的结果。随后分析进行了12次加热/冷却循环的样品的活性，并且给出0.94℃时的热滞后THapp，其与起始材料的活性没有区别。这些研究表明一种温和稳定的蛋白，却具有在变性后复原为生物活性分子的显著特征。
pH对活性和稳定性的影响
本发明还研究了pH对活性和稳定性的影响。图11显示在标示的pH值下预培养1h时，对RmAFP的稳定性的影响，稳定性显示为pH7.2时的TH。
本申请是2007年11月21日提交的美国临时申请No.61/003,979的正式申请，在此将该临时申请全部引入作为参考。上述临时申请或本申请中引用的所有专利和非专利文献均全部引入作为参考。
天牛科树皮甲虫松皮天牛(Rhagium inquisitor)和密毛皮花天牛(Rhagium mordax)，二者在它们的成年和幼年期都能经受低至-30℃的温度，并仍然在斯堪的那维亚北部树桩的树皮下过冬。这两个物种都属于被称作“逃避冻结者”的耐寒动物的类别，意味着它们能在极低的温度下生存，而在它们的组织中不形成冰。它们可以被视为能适应超冷(或过冷)条件很长的时间。
过冷状态对Cerambycid树皮甲虫可能是致命的，因为冰形成原则上会在亚稳态、超冷液体中出现，这是由于随机的成核现象或者由周围环境中的冰接种导致。Cerambycid树皮甲虫难能在这种冰形成中幸免于难。
因此，R.inquisitor和R.mordax二者都适应这种气候条件，并且它们能够在低温下生存更长的时间。这使得Cerambycid树皮甲虫作为抗冻多肽(AFP)源特别引人注意。
在R.inquisitor中，对低温的适应包括在血淋巴区域积累防冷冻的甘油，从体液中消除潜在的冰成核剂(产生更高可能性的超冷现象)，以及在冬季来临前合成大量抗冻多肽。目前，在R.inquisitor中发现的抗冻多肽的抗冻活性(7℃)被视为已知的最高值。
R.mordax幼虫能够在差不多像R.inquisitor一样冷的温度下生存-尽管积累的防冷冻化合物非常有限。根据目前优选的一种假设，Rhagium mordax忍受低温的能力几乎可以完全归因于冬季来临前的一种或多种抗冻多肽(AFP)的合成与积累。
意外地发现，本发明的抗冻多肽具有比目前已知的其他昆虫AFP明显较少数量的半胱氨酸残基。这个特征，与本发明的多肽具有比许多最新式昆虫抗冻多肽更少的重复序列这一事实一起，使它们成为异源宿主生物体中更好的表达候选者。
在目前优选的实施方式中，本发明的抗冻多肽及其显示抗冻活性的功能片段，优选地具有少于4个半胱氨酸残基，例如少于3个半胱氨酸残基，例如2个半胱氨酸残基。
正如以下清楚描述的那样，本发明的抗冻多肽具有多种不同的用途和工业应用领域。多肽或编码该多肽的基因，可以以各种不同的方式用于抑制冰晶体生长。多肽可被直接引入，或者将它们作为基因引入，该基因在适宜的表达信号控制下在宿主细胞中表达以产生多肽。
抗冻多肽的适宜浓度会根据用途而改变，但典型地是在约一亿分之一份至约一千分之一份(即，约1μg/l至约1mg/l)。
在本发明的一个方面，将多肽引入食用产品中，或使其与食用产品接触，以便在例如冷冻条件下，在可食用产品的生产和/或储存期间，减少或抑制冰晶体生长和/或形成。
意外地发现，本发明的多肽提供的冰结晶明显不同于在其他已知的抗冻多肽存在下获得的晶体。尤其发现，在本发明多肽的存在下，获得了小的球形结构的晶体，而已知的抗冻多肽，如US 6,914,043中提到的抗冻蛋白III型HPLC 12或US 6,312,733中提到的冰晶体生长抑制剂，提供了针骨状结构的晶体。
因此，本发明的一个主要的优势在于，当本发明的多肽掺入比如冰淇淋时，可以获得改进的口感，因为在生产和储存期间，冰淇淋中形成的晶体会有非常小的球形结构，相比之下当使用已知的上述III型抗冻多肽时，得到的是粗糙的针骨状晶体。
包括蔬菜在内的冰冻食用产品的质地、味道以及有用的保存期限，都可以因本发明多肽的作用而大大改善。例如，冰冻蔬菜，如芹菜、土豆、芦笋、豌豆、胡萝卜、豆类、西兰花、甜玉米、菠菜等的质地、味道和有用的保存期限都将得到改善。类似地，各种冰冻水果的质地、味道和有用的保存期限也将被增强，包括草莓、蓝莓、覆盆子、柑橘类水果、香蕉、葡萄、猕猴桃、桃子、菠萝、李子、樱桃、西红柿和芒果。
例如，引入到蔬菜和其他食用产品可通过将适当的多核苷酸引入目标生物的基因引入法来实现。多核苷酸的表达，无论组成性还是诱导性，在食品加工开始之前或在收获和加工开始之后，都产生足够高水平的本发明多肽，以有效地保护包括食品在内的食用产品，比如按质量计高达总植物多肽约0.1％。表达也可以建立在组织特异性基础上。例如，与水果中的成熟基因连接可能产生表达，甚至是在从产品植物中收获之后。
在本发明的一个重要方面，多肽可添加到食品中，人们希望该食品直到消费、甚至在消费期间都保持冻结-尤其是以冻结或冷冻态消费的食用产品。
许多冷冻食品都是为了在冻结或冷冻态下消费，例如冰淇淋、冷冻酸奶、冰牛奶、果子露、冰棍、冷冻奶油、冷冻奶油馅饼、冷冻布丁等。尤其是，大的冰晶体的形成贯穿整个冻融循环，使质地和口味受到不利的影响，这发生在大多数家用无霜冰箱中或持续保存于冷冻态时。这种冰晶体生长过程可通过使用本发明的多肽来减少甚至完全防止，或者至少是尽可能地减少。本发明的抗冻多肽可掺入到整个食用产品，和/或比如它们可以选择性地涂在食用产品的表面，这里是冷凝和冰晶体形成预计最容易发生的地方。
本发明的另一个重要方面涉及含有编码本发明多肽的多核苷酸的酵母，包括面包酵母。涉及该方面的方法包括用编码这些多肽的多核苷酸转化面团酵母的方法。当该多核苷酸掺入酵母和表达，并且在冷冻面团中使用这些酵母时，面团一解冻就会自然发酵，因为酵母生存能力在解冻时会保持很高。因为在这些抗冻多肽的存在下，保存期间积累的损害较少，还因为融化的样品会具有高活力的酵母细胞，所以冷冻态下有可能保存较长的时间，或者较小的面团样品都需要保存。
将抗冻多肽掺入冷冻的、发酵的食用产品的一种替换方式是让生物体负责发酵过程，在发酵食品时产生抗冻多肽。因此，本发明还包括制备冷冻发酵食用产品的方法。该方法包括步骤：a)将食品与能够分泌本发明多肽的微生物接触，其中该微生物能够使该食品发酵，以生产发酵食品，b)用微生物在发酵进行的条件下培养该食品，以便生产含有本发明抗冻多肽的发酵食品，所述多肽存在的量有效地抑制冰晶体生长和/或形成；和c)在优选低于-5℃的温度下冷冻该发酵食品，以便生产冷冻发酵食品。
本发明的另一个方面涉及将本发明的抗冻多肽引入指定要冷藏的生物细胞或其提取物中。例如，含有本发明抗冻多肽的细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞具有增强的细胞或组织生存能力，最小限度地或没有因为冷冻-融化过程而失去固有特性。亚细胞样品或细胞提取物可能对冷冻具有相似的敏感性，尤其是在长期保存时。典型的实例是体外多肽翻译系统、酶制备、以及含有敏感性膜组分的特定样品，如叶绿体或线粒体的膜制备。
具体地，当添加本发明的抗冻多肽时，包含细胞器的样品就可显示增强的抗冻害能力。当在该多肽的存在下冷冻时，动物软组织显示出较少的损害，并且当冷冻和随后解冻时，细胞完整性很重要或者是为了组织培养保藏所需要时，本发明多肽的添加对这些情况也是有利的。因此，指定要冷冻保存的样本，如细胞或组织保藏，通常都可在其中加入本发明的多肽。生物细胞类型中通常保存的是细菌、真菌(包括酵母)、尤其是高等真核细胞(如杂交瘤株及组织培养细胞系)的基因变体。
本发明另一方面涉及非专门针对食品领域的用途。目前，本发明多肽的一种非食品应用是保护农作物和植物免受严寒气候条件的侵袭。本发明的抗冻多肽可通过表达引入的基因来内部地掺入细胞质中，或者该多肽可外部地涂在植物上-如通过喷涂或其他方式。因此外部应用可通过将多肽直接涂在植物上或者通过外部沉积在分泌该多肽的植物上来实现。这些引入的相同替换方式也适用于其他用途。
另一种实施方式是将抗冻多肽引入包围器官、组织或其他生物样本的液体中。一种具体的用途是为了移植手术或为了保存目的转移到医院期间。本发明的抗冻多肽目前可短期或长期保存在零下温度下，从而使固有的代谢或消化减至最小，但冰晶体生长导致的细胞损伤显著减少。其他医学上重要的温度敏感性生物样品是血液和血液制品、治疗药物、多肽药物、生物检测试剂和疫苗。
本发明还提供含有本发明多肽的化妆品或皮肤病制剂。本发明的多肽在化妆品或局部皮肤病制剂中的应用可能提供有效的治疗，还能预防因寒冷引起的皮肤的结构性和细胞性损伤。伴随明显气候或天气引起的温度下降，寒冷损伤通过失去细胞酶的最适温度，导致细胞中或细胞外空间的细胞生理学发生变化，例如由寒冷、风和/或紫外线，引起皮肤损伤、皮肤发红或皮肤紧绷感以及感官敏感性增加、温度敏感性皮肤，由环境压力(由温度变化和紫外线、吸烟、烟雾、活性氧簇、自由基)引起的皮肤、嘴唇、鼻子和口腔中的黏膜以及外皮附属物的消极变化。
本发明还包括组合物及用途，其基于本发明的抗冻多肽与本领域技术人员熟知的现有技术的稳定剂、乳化剂和表面活性剂以及其他添加剂而成的混合物。这些化合物可用来抑制腐烂、抑制氧化、防止变色、抑制微生物生长、稳定乳液等。
从上述内容可以明白，本发明一方面涉及能够抑制和/或减少冰晶体形成的多肽，该冰晶体形成与物体或物质(包括食用产品)的冻结或超冷现象相关。超冷条件是使物质冷却到通常发生状态变化(即从水相变为冰)的温度以下，而未出现状态的变化。因此，液体冷却到它的冰点以下而未发生冻结就构成了超冷现象，并产生一种亚稳态。
本发明的多肽在整个说明书中可由抗冻多肽和简称的多肽互换表示。
在一个方面，提供的一种选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的多肽。除非另有说明，注释SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、以及其他类似的表示一系列序列识别数字的起始数和结尾数的注解，用在本文中时都表示所述序列识别数中的每个或各个，例如以上引用的实例中，指序列识别数SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的多肽，或者由SEQ ID NO：1至SEQID NO：8任一项组成的多肽或其具有抗冻活性的片段，或者与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8任一项或其片段具有至少约75％同源性的变体，都属于本发明的范围。具体地，本发明还公开了一种包含或者由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8任一项组成的多肽的片段，其具有至少20个氨基酸和冰结合位点以及抗冻活性。该片段优选地具有少于200个氨基酸，例如优选地少于150个氨基酸，例如优选地少于100个氨基酸，例如80个氨基酸，例如60个氨基酸。
本发明还涉及包括本发明的一个或多个“冰结合位点”(IBS)的多肽，例如包含SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：72的任意一个或多个的多肽-共64个特异性“冰结合位点”(IBS)，如图3所示。
本发明尤其涉及以下多肽：
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：16的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：24的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：32的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：40的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：48的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：56的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：64的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
一种多肽，含有选自SEQ ID NO：65至SEQ ID NO：72的4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
本发明还提供含有SEQ ID NO：73至80的一个或多个序列的多肽，例如含有4个或多个序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：80的所有序列-以保守的“冰结合域”(IBD)的形式。
SEQ ID NO：81至89涉及进一步的保守域，其可在本发明的多肽中单个地或以任意组合存在。
本发明还涉及通用冰结合域形式的SEQ ID NO：90，其可在本发明的多肽中多次出现，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、8次以上并优选地小于30次。相同的序列可以多次出现，或者SEQ ID NO：90的变种可以多次出现，如本文以下本发明的部分列举项目中所述。
下表1中列出了包含成对组合的冰结合域的多肽。列出共计64个不同组合-本文SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：80公开的8个冰结合域(IBD)的任意各个或每个成对和独立的组合形式。
本发明还涉及一种多肽，其含有选自SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：80的4个或更多序列，例如5个或更多序列，例如6个或更多序列，例如7个或所有序列。
另一方面，本发明提供了一种多肽，其含有序列SEQ ID NO：90的4个或更多个拷贝，例如5个或更多拷贝，例如6个或更多拷贝，例如7个或更多拷贝，例如8个或更多拷贝，并且优选少于20个拷贝。
如本文以上所述，本发明一方面涉及包含不同冰结合位点(IBD)的组合的多肽，所述组合包括任意组合的2个IBD的至少1种组合，例如至少2种组合，选自本文下方表1列出的64种成对冰结合域序列组合。所述多肽优选地具有少于20个由SEQ ID NO：90定义的通用冰结合域，例如少于15个通用冰结合域，例如少于12个通用冰结合域，例如少于10个通用冰结合域。
表1
IBD I IBD II BD III IBD IV IBD V IBD VI IBD VII IBD VIII
IBD I A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
IBD II B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8
IBD III C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
IBD IV D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
IBD V E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
IBD VI F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
IBD VII G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8
IBD VIII H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8
IBD：冰结合域
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的每个序列都包括一共8个IBD，在本文上表1中表示为I、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。在表1中，IBD I代表SEQ ID NO 73，IBD II代表SEQ ID NO 74，IBD III代表SEQ ID NO 75，IBD IV代表SEQ ID NO 76，IBD V代表SEQ ID NO 77，IBD VI代表SEQID NO 78，IBD VII代表SEQ ID NO 79，IBD VIII代表SEQ ID NO 80。
本文上表1列出的矩阵中出现的各个独立的字母/数字组合是相互交叉结合的，以产生本文下表2列出的组合。举例说明，组合A1A1来源于两个IBD I域与另两个IBD I域的组合，而组合B3A6来源于一个IBD II和一个IBD III与一个IBD I和一个IBD VI的组合。由此所得的多肽包含以下多肽冰结合域：IBD I、IBD II、IBD III和IBD VI。
因此，本发明进一步提供包含不同冰结合域(IBD)组合的多肽，所述组合包括至少1种组合，例如至少2种组合，例如任意4个IBD的组合中的3种组合，该4个IBD选自本文下表2显示的任意4个冰结合域序列的4096种组合，所述多肽优选地具有少于20个由SEQ ID NO：90限定的通用冰结合域，例如少于15个通用冰结合域，例如少于12个通用冰结合域，例如少于10个通用冰结合域。
为了进一步说明表2，组合来源于64×64矩阵，A1A1是两个IBD I域与另两个IBD I域的组合，而组合B3A6来源于一个IBD II和一个IBD III域与一个IBD I和一个IBD VI域的组合。因此后者包含以下多肽域：IBD I、IBDII、IBD III和IBD VI。
表2
A1A1 A7A6 B6A3 C4A8 D3A5 E2A2
A1A2 A7A7 B6A4 C5A1 D3A6 E2A3
A1A3 A7A8 B6A5 C5A2 D3A7 E2A4
A1A4 A8A1 B6A6 C5A3 D3A8 E2A5
A1A5 A8A2 B6A7 C5A4 D4A1 E2A6
A1A6 A8A3 B6A8 C5A5 D4A2 E2A7
A1A7 A8A4 B7A1 C5A6 D4A3 E2A8
A1A8 A8A5 B7A2 C5A7 D4A4 E3A1
A2A1 A8A6 B7A3 C5A8 D4A5 E3A2
A2A2 A8A7 B7A4 C6A1 D4A6 E3A3
A2A3 A8A8 B7A5 C6A2 D4A7 E3A4
A2A4 B1A1 B7A6 C6A3 D4A8 E3A5
A2A5 B1A2 B7A7 C6A4 D5A1 E3A6
A2A6 B1A3 B7A8 C6A5 D5A2 E3A7
A2A7 B1A4 B8A1 C6A6 D5A3 E3A8
A2A8 B1A5 B8A2 C6A7 D5A4 E4A1
A3A1 B1A6 B8A3 C6A8 D5A5 E4A2
A3A2 B1A7 B8A4 C7A1 D5A6 E4A3
A3A3 B1A8 B8A5 C7A2 D5A7 E4A4
A3A4 B2A1 B8A6 C7A3 D5A8 E4A5
A3A5 B2A2 B8A7 C7A4 D6A1 E4A6
A3A6 B2A3 B8A8 C7A5 D6A2 E4A7
A3A7 B2A4 C1A1 C7A6 D6A3 E4A8
A3A8 B2A5 C1A2 C7A7 D6A4 E5A1
A4A1 B2A6 C1A3 C7A8 D6A5 E5A2
A4A2 B2A7 C1A4 C8A1 D6A6 E5A3
A4A3 B2A8 C1A5 C8A2 D6A7 E5A4
A4A4 B3A1 C1A6 C8A3 D6A8 E5A5
A4A5 B3A2 C1A7 C8A4 D7A1 E5A6
A4A6 B3A3 C1A8 C8A5 D7A2 E5A7
A4A7 B3A4 C2A1 C8A6 D7A3 E5A8
A4A8 B3A5 C2A2 C8A7 D7A4 E6A1
A5A1 B3A6 C2A3 C8A8 D7A5 E6A2
A5A2 B3A7 C2A4 D1A1 D7A6 E6A3
A5A3 B3A8 C2A5 D1A2 D7A7 E6A4
A5A4 B4A1 C2A6 D1A3 D7A8 E6A5
A5A5 B4A2 C2A7 D1A4 D8A1 E6A6
A5A6 B4A3 C2A8 D1A5 D8A2 E6A7
A5A7 B4A4 C3A1 D1A6 D8A3 E6A8
A5A8 B4A5 C3A2 D1A7 D8A4 E7A1
A6A1 B4A6 C3A3 D1A8 D8A5 E7A2
A6A2 B4A7 C3A4 D2A1 D8A6 E7A3
A6A3 B4A8 C3A5 D2A2 D8A7 E7A4
A6A4 B5A1 C3A6 D2A3 D8A8 E7A5
A6A5 B5A2 C3A7 D2A4 E1A1 E7A6
A6A6 B5A3 C3A8 D2A5 E1A2 E7A7
A6A7 B5A4 C4A1 D2A6 E1A3 E7A8
A6A8 B5A5 C4A2 D2A7 E1A4 E8A1
A7A1 B5A6 C4A3 D2A8 E1A5 E8A2
A7A2 B5A7 C4A4 D3A1 E1A6 E8A3
A7A3 B5A8 C4A5 D3A2 E1A7 E8A4
A7A4 B6A1 C4A6 D3A3 E1A8 E8A5
A7A5 B6A2 C4A7 D3A4 E2A1 E8A6
E8A7 F7A4 G6A1 H4A6 A3B3 B1B8
E8A8 F7A5 G6A2 H4A7 A3B4 B2B1
F1A1 F7A6 G6A3 H4A8 A3B5 B2B2
F1A2 F7A7 G6A4 H5A1 A3B6 B2B3
F1A3 F7A8 G6A5 H5A2 A3B7 B2B4
F1A4 F8A1 G6A6 H5A3 A3B8 B2B5
F1A5 F8A2 G6A7 H5A4 A4B1 B2B6
F1A6 F8A3 G6A8 H5A5 A4B2 B2B7
F1A7 F8A4 G7A1 H5A6 A4B3 B2B8
F1A8 F8A5 G7A2 H5A7 A4B4 B3B1
F2A1 F8A6 G7A3 H5A8 A4B5 B3B2
F2A2 F8A7 G7A4 H6A1 A4B6 B3B3
F2A3 F8A8 G7A5 H6A2 A4B7 B3B4
F2A4 G1A1 G7A6 H6A3 A4B8 B3B5
F2A5 G1A2 G7A7 H6A4 A5B1 B3B6
F2A6 G1A3 G7A8 H6A5 A5B2 B3B7
F2A7 G1A4 G8A1 H6A6 A5B3 B3B8
F2A8 G1A5 G8A2 H6A7 A5B4 B4B1
F3A1 G1A6 G8A3 H6A8 A5B5 B4B2
F3A2 G1A7 G8A4 H7A1 A5B6 B4B3
F3A3 G1A8 G8A5 H7A2 A5B7 B4B4
F3A4 G2A1 G8A6 H7A3 A5B8 B4B5
F3A5 G2A2 G8A7 H7A4 A6B1 B4B6
F3A6 G2A3 G8A8 H7A5 A6B2 B4B7
F3A7 G2A4 H1A1 H7A6 A6B3 B4B8
F3A8 G2A5 H1A2 H7A7 A6B4 B5B1
F4A1 G2A6 H1A3 H7A8 A6B5 B5B2
F4A2 G2A7 H1A4 H8A1 A6B6 B5B3
F4A3 G2A8 H1A5 H8A2 A6B7 B5B4
F4A4 G3A1 H1A6 H8A3 A6B8 B5B5
F4A5 G3A2 H1A7 H8A4 A7B1 B5B6
F4A6 G3A3 H1A8 H8A5 A7B2 B5B7
F4A7 G3A4 H2A1 H8A6 A7B3 B5B8
F4A8 G3A5 H2A2 H8A7 A7B4 B6B1
F5A1 G3A6 H2A3 H8A8 A7B5 B6B2
F5A2 G3A7 H2A4 A1B1 A7B6 B6B3
F5A3 G3A8 H2A5 A1B2 A7B7 B6B4
F5A4 G4A1 H2A6 A1B3 A7B8 B6B5
F5A5 G4A2 H2A7 A1B4 A8B1 B6B6
F5A6 G4A3 H2A8 A1B5 A8B2 B6B7
F5A7 G4A4 H3A1 A1B6 A8B3 B6B8
F5A8 G4A5 H3A2 A1B7 A8B4 B7B1
F6A1 G4A6 H3A3 A1B8 A8B5 B7B2
F6A2 G4A7 H3A4 A2B1 A8B6 B7B3
F6A3 G4A8 H3A5 A2B2 A8B7 B7B4
F6A4 G5A1 H3A6 A2B3 A8B8 B7B5
F6A5 G5A2 H3A7 A2B4 B1B1 B7B6
F6A6 G5A3 H3A8 A2B5 B1B2 B7B7
F6A7 G5A4 H4A1 A2B6 B1B3 B7B8
F6A8 G5A5 H4A2 A2B7 B1B4 B8B1
F7A1 G5A6 H4A3 A2B8 B1B5 B8B2
F7A2 G5A7 H4A4 A3B1 B1B6 B8B3
F7A3 G5A8 H4A5 A3B2 B1B7 B8B4
B8B5 C7B2 D5B7 E4B4 F3B1 G1B6
B8B6 C7B3 D5B8 E4B5 F3B2 G1B7
B8B7 C7B4 D6B1 E4B6 F3B3 G1B8
B8B8 C7B5 D6B2 E4B7 F3B4 G2B1
C1B1 C7B6 D6B3 E4B8 F3B5 G2B2
C1B2 C7B7 D6B4 E5B1 F3B6 G2B3
C1B3 C7B8 D6B5 E5B2 F3B7 G2B4
C1B4 C8B1 D6B6 E5B3 F3B8 G2B5
C1B5 C8B2 D6B7 E5B4 F4B1 G2B6
C1B6 C8B3 D6B8 E5B5 F4B2 G2B7
C1B7 C8B4 D7B1 E5B6 F4B3 G2B8
C1B8 C8B5 D7B2 E5B7 F4B4 G3B1
C2B1 C8B6 D7B3 E5B8 F4B5 G3B2
C2B2 C8B7 D7B4 E6B1 F4B6 G3B3
C2B3 C8B8 D7B5 E6B2 F4B7 G3B4
C2B4 D1B1 D7B6 E6B3 F4B8 G3B5
C2B5 D1B2 D7B7 E6B4 F5B1 G3B6
C2B6 D1B3 D7B8 E6B5 F5B2 G3B7
C2B7 D1B4 D8B1 E6B6 F5B3 G3B8
C2B8 D1B5 D8B2 E6B7 F5B4 G4B1
C3B1 D1B6 D8B3 E6B8 F5B5 G4B2
C3B2 D1B7 D8B4 E7B1 F5B6 G4B3
C3B3 D1B8 D8B5 E7B2 F5B7 G4B4
C3B4 D2B1 D8B6 E7B3 F5B8 G4B5
C3B5 D2B2 D8B7 E7B4 F6B1 G4B6
C3B6 D2B3 D8B8 E7B5 F6B2 G4B7
C3B7 D2B4 E1B1 E7B6 F6B3 G4B8
C3B8 D2B5 E1B2 E7B7 F6B4 G5B1
C4B1 D2B6 E1B3 E7B8 F6B5 G5B2
C4B2 D2B7 E1B4 E8B1 F6B6 G5B3
C4B3 D2B8 E1B5 E8B2 F6B7 G5B4
C4B4 D3B1 E1B6 E8B3 F6B8 G5B5
C4B5 D3B2 E1B7 E8B4 F7B1 G5B6
C4B6 D3B3 E1B8 E8B5 F7B2 G5B7
C4B7 D3B4 E2B1 E8B6 F7B3 G5B8
C4B8 D3B5 E2B2 E8B7 F7B4 G6B1
C5B1 D3B6 E2B3 E8B8 F7B5 G6B2
C5B2 D3B7 E2B4 F1B1 F7B6 G6B3
C5B3 D3B8 E2B5 F1B2 F7B7 G6B4
C5B4 D4B1 E2B6 F1B3 F7B8 G6B5
C5B5 D4B2 E2B7 F1B4 F8B1 G6B6
C5B6 D4B3 E2B8 F1B5 F8B2 G6B7
C5B7 D4B4 E3B1 F1B6 F8B3 G6B8
C5B8 D4B5 E3B2 F1B7 F8B4 G7B1
C6B1 D4B6 E3B3 F1B8 F8B5 G7B2
C6B2 D4B7 E3B4 F2B1 F8B6 G7B3
C6B3 D4B8 E3B5 F2B2 F8B7 G7B4
C6B4 D5B1 E3B6 F2B3 F8B8 G7B5
C6B5 D5B2 E3B7 F2B4 G1B1 G7B6
C6B6 D5B3 E388 F2B5 G1B2 G7B7
C6B7 D5B4 E4B1 F2B6 G1B3 G7B8
C6B8 D5B5 E4B2 F2B7 G1B4 G8B1
C7B1 D5B6 E4B3 F2B8 G1B5 G8B2
G8B3 H6B8 A5C5 B4C2 C2C7 D1C4
G8B4 H7B1 A5C6 B4C3 C2C8 D1C5
G8B5 H7B2 A5C7 B4C4 C3C1 D1C6
G8B6 H7B3 A5C8 B4C5 C3C2 D1C7
G8B7 H7B4 A6C1 B4C6 C3C3 D1C8
G8B8 H7B5 A6C2 B4C7 C3C4 D2C1
H1B1 H7B6 A6C3 B4C8 C3C5 D2C2
H1B2 H7B7 A6C4 B5C1 C3C6 D2C3
H1B3 H7B8 A6C5 B5C2 C3C7 D2C4
H1B4 H8B1 A6C6 B5C3 C3C8 D2C5
H1B5 H8B2 A6C7 B5C4 C4C1 D2C6
H1B6 H8B3 A6C8 B5C5 C4C2 D2C7
H1B7 H8B4 A7C1 B5C6 C4C3 D2C8
H1B8 H8B5 A7C2 B5C7 C4C4 D3C1
H2B1 H8B6 A7C3 B5C8 C4C5 D3C2
H2B2 H8B7 A7C4 B6C1 C4C6 D3C3
H2B3 H8B8 A7C5 B6C2 C4C7 D3C4
H2B4 A1C1 A7C6 B6C3 C4C8 D3C5
H2B5 A1C2 A7C7 B6C4 C5C1 D3C6
H2B6 A1C3 A7C8 B6C5 C5C2 D3C7
H2B7 A1C4 A8C1 B6C6 C5C3 D3C8
H2B8 A1C5 A8C2 B6C7 C5C4 D4C1
H3B1 A1C6 A8C3 B6C8 C5C5 D4C2
H3B2 A1C7 A8C4 B7C1 C5C6 D4C3
H3B3 A1C8 A8C5 B7C2 C5C7 D4C4
H3B4 A2C1 A8C6 B7C3 C5C8 D4C5
H3B5 A2C2 A8C7 B7C4 C6C1 D4C6
H3B6 A2C3 A8C8 B7C5 C6C2 D4C7
H3B7 A2C4 B1C1 B7C6 C6C3 D4C8
H3B8 A2C5 B1C2 B7C7 C6C4 D5C1
H4B1 A2C6 B1C3 B7C8 C6C5 D5C2
H4B2 A2C7 B1C4 B8C1 C6C6 D5C3
H4B3 A2C8 B1C5 B8C2 C6C7 D5C4
H4B4 A3C1 B1C6 B8C3 C6C8 D5C5
H4B5 A3C2 B1C7 B8C4 C7C1 D5C6
H4B6 A3C3 B1C8 B8C5 C7C2 D5C7
H4B7 A3C4 B2C1 B8C6 C7C3 D5C8
H4B8 A3C5 B2C2 B8C7 C7C4 D6C1
H5B1 A3C6 B2C3 B8C8 C7C5 D6C2
H5B2 A3C7 B2C4 C1C1 C7C6 D6C3
H5B3 A3C8 B2C5 C1C2 C7C7 D6C4
H5B4 A4C1 B2C6 C1C3 C7C8 D6C5
H5B5 A4C2 B2C7 C1C4 C8C1 D6C6
H5B6 A4C3 B2C8 C1C5 C8C2 D6C7
H5B7 A4C4 B3C1 C1C6 C8C3 D6C8
H5B8 A4C5 B3C2 C1C7 C8C4 D7C1
H6B1 A4C6 B3C3 C1C8 C8C5 D7C2
H6B2 A4C7 B3C4 C2C1 C8C6 D7C3
H6B3 A4C8 B3C5 C2C2 C8C7 D7C4
H6B4 A5C1 B3C6 C2C3 C8C8 D7C5
H6B5 A5C2 B3C7 C2C4 D1C1 D7C6
H6B6 A5C3 B3C8 C2C5 D1C2 D7C7
H6B7 A5C4 B4C1 C2C6 D1C3 D7C8
D8C1 E6C6 F5C3 G3C8 H2C5 A1D2
D8C2 E6C7 F5C4 G4C1 H2C6 A1D3
D8C3 E6C8 F5C5 G4C2 H2C7 A1D4
D8C4 E7C1 F5C6 G4C3 H2C8 A1D5
D8C5 E7C2 F5C7 G4C4 H3C1 A1D6
D8C6 E7C3 F5C8 G4C5 H3C2 A1D7
D8C7 E7C4 F6C1 G4C6 H3C3 A1D8
D8C8 E7C5 F6C2 G4C7 H3C4 A2D1
E1C1 E7C6 F6C3 G4C8 H3C5 A2D2
E1C2 E7C7 F6C4 G5C1 H3C6 A2D3
E1C3 E7C8 F6C5 G5C2 H3C7 A2D4
E1C4 E8C1 F6C6 G5C3 H3C8 A2D5
E1C5 E8C2 F6C7 G5C4 H4C1 A2D6
E1C6 E8C3 F6C8 G5C5 H4C2 A2D7
E1C7 E8C4 F7C1 G5C6 H4C3 A2D8
E1C8 E8C5 F7C2 G5C7 H4C4 A3D1
E2C1 E8C6 F7C3 G5C8 H4C5 A3D2
E2C2 E8C7 F7C4 G6C1 H4C6 A3D3
E2C3 E8C8 F7C5 G6C2 H4C7 A3D4
E2C4 F1C1 F7C6 G6C3 H4C8 A3D5
E2C5 F1C2 F7C7 G6C4 H5C1 A3D6
E2C6 F1C3 F7C8 G6C5 H5C2 A3D7
E2C7 F1C4 F8C1 G6C6 H5C3 A3D8
E2C8 F1C5 F8C2 G6C7 H5C4 A4D1
E3C1 F1C6 F8C3 G6C8 H5C5 A4D2
E3C2 F1C7 F8C4 G7C1 H5C6 A4D3
E3C3 F1C8 F8C5 G7C2 H5C7 A4D4
E3C4 F2C1 F8C6 G7C3 H5C8 A4D5
E3C5 F2C2 F8C7 G7C4 H6C1 A4D6
E3C6 F2C3 F8C8 G7C5 H6C2 A4D7
E3C7 F2C4 G1C1 G7C6 H6C3 A4D8
E3C8 F2C5 G1C2 G7C7 H6C4 A5D1
E4C1 F2C6 G1C3 G7C8 H6C5 A5D2
E4C2 F2C7 G1C4 G8C1 H6C6 A5D3
E4C3 F2C8 G1C5 G8C2 H6C7 A5D4
E4C4 F3C1 G1C6 G8C3 H6C8 A5D5
E4C5 F3C2 G1C7 G8C4 H7C1 A5D6
E4C6 F3C3 G1C8 G8C5 H7C2 A5D7
E4C7 F3C4 G2C1 G8C6 H7C3 A5D8
E4C8 F3C5 G2C2 G8C7 H7C4 A6D1
E5C1 F3C6 G2C3 G8C8 H7C5 A6D2
E5C2 F3C7 G2C4 H1C1 H7C6 A6D3
E5C3 F3C8 G2C5 H1C2 H7C7 A6D4
E5C4 F4C1 G2C6 H1C3 H7C8 A6D5
E5C5 F4C2 G2C7 H1C4 H8C1 A6D6
E5C6 F4C3 G2C8 H1C5 H8C2 A6D7
E5C7 F4C4 G3C1 H1C6 H8C3 A6D8
E5C8 F4C5 G3C2 H1C7 H8C4 A7D1
E6C1 F4C6 G3C3 H1C8 H8C5 A7D2
E6C2 F4C7 G3C4 H2C1 H8C6 A7D3
E6C3 F4C8 G3C5 H2C2 H8C7 A7D4
E6C4 F5C1 G3C6 H2C3 H8C8 A7D5
E6C5 F5C2 G3C7 H2C4 A1D1 A7D6
A7D7 B6D4 C5D1 D3D6 E2D3 E8D8
A7D8 B6D5 C5D2 D3D7 E2D4 F1D1
A8D1 B6D6 C5D3 D3D8 E2D5 F1D2
A8D2 B6D7 C5D4 D4D1 E2D6 F1D3
A8D3 B6D8 C5D5 D4D2 E2D7 F1D4
A8D4 B7D1 C5D6 D4D3 E2D8 F1D5
A8D5 B7D2 C5D7 D4D4 E3D1 F1D6
A8D6 B7D3 C5D8 D4D5 E3D2 F1D7
A8D7 B7D4 C6D1 D4D6 E3D3 F1D8
A8D8 B7D5 C6D2 D4D7 E3D4 F2D1
B1D1 B7D6 C6D3 D4D8 E3D5 F2D2
B1D2 B7D7 C6D4 D5D1 E3D6 F2D3
B1D3 B7D8 C6D5 D5D2 E3D7 F2D4
B1D4 B8D1 C6D6 D5D3 E3D8 F2D5
B1D5 B8D2 C6D7 D5D4 E4D1 F2D6
B1D6 B8D3 C6D8 D5D5 E4D2 F2D7
B1D7 B8D4 C7D1 D5D6 E4D3 F2D8
B1D8 B8D5 C7D2 D5D7 E4D4 F3D1
B2D1 B8D6 C7D3 D5D8 E4D5 F3D2
B2D2 B8D7 C7D4 D6D1 E4D6 F3D3
B2D3 B8D8 C7D5 D6D2 E4D7 F3D4
B2D4 C1D1 C7D6 D6D3 E4D8 F3D5
B2D5 C1D2 C7D7 D6D4 E5D1 F3D6
B2D6 C1D3 C7D8 D6D5 E5D2 F3D7
B2D7 C1D4 C8D1 D6D6 E5D3 F3D8
B2D8 C1D5 C8D2 D6D7 E5D4 F4D1
B3D1 C1D6 C8D3 D6D8 E5D5 F4D2
B3D2 C1D7 C8D4 D7D1 E5D6 F4D3
B3D3 C1D8 C8D5 D7D2 E5D7 F4D4
B3D4 C2D1 C8D6 D7D3 E5D8 F4D5
B3D5 C2D2 C8D7 D7D4 E6D1 F4D6
B3D6 C2D3 C8D8 D7D5 E6D2 F4D7
B3D7 C2D4 D1D1 D7D6 E6D3 F4D8
B3D8 C2D5 D1D2 D7D7 E6D4 F5D1
B4D1 C2D6 D1D3 D7D8 E6D5 F5D2
B4D2 C2D7 D1D4 D8D1 E6D6 F5D3
B4D3 C2D8 D1D5 D8D2 E6D7 F5D4
B4D4 C3D1 D1D6 D8D3 E6D8 F5D5
B4D5 C3D2 D1D7 D8D4 E7D1 F5D6
B4D6 C3D3 D1D8 D8D5 E7D2 F5D7
B4D7 C3D4 D2D1 D8D6 E7D3 F5D8
B4D8 C3D5 D2D2 D8D7 E7D4 F6D1
B5D1 C3D6 D2D3 D8D8 E7D5 F6D2
B5D2 C3D7 D2D4 E1D1 E7D6 F6D3
B5D3 C3D8 D2D5 E1D2 E7D7 F6D4
B5D4 C4D1 D2D6 E1D3 E7D8 F6D5
B5D5 C4D2 D2D7 E1D4 E8D1 F6D6
B5D6 C4D3 D2D8 E1D5 E8D2 F6D7
B5D7 C4D4 D3D1 E1D6 E8D3 F6D8
B5D8 C4D5 D3D2 E1D7 E8D4 F7D1
B6D1 C4D6 D3D3 E1D8 E8D5 F7D2
B6D2 C4D7 D3D4 E2D1 E8D6 F7D3
B6D3 C4D8 D3D5 E2D2 E8D7 F7D4
F7D5 G6D2 H4D7 A3E4 B2E1 B8E6
F7D6 G6D3 H4D8 A3E5 B2E2 B8E7
F7D7 G6D4 H5D1 A3E6 B2E3 B8E8
F7D8 G6D5 H5D2 A3E7 B2E4 C1E1
F8D1 G6D6 H5D3 A3E8 B2E5 C1E2
F8D2 G6D7 H5D4 A4E1 B2E6 C1E3
F8D3 G6D8 H5D5 A4E2 B2E7 C1E4
F8D4 G7D1 H5D6 A4E3 B2E8 C1E5
F8D5 G7D2 H5D7 A4E4 B3E1 C1E6
F8D6 G7D3 H5D8 A4E5 B3E2 C1E7
F8D7 G7D4 H6D1 A4E6 B3E3 C1E8
F8D8 G7D5 H6D2 A4E7 B3E4 C2E1
G1D1 G7D6 H6D3 A4E8 B3E5 C2E2
G1D2 G7D7 H6D4 A5E1 B3E8 C2E3
G1D3 G7D8 H6D5 A5E2 B3E7 C2E4
G1D4 G8D1 H6D6 A5E3 B3E8 C2E5
G1D5 G8D2 H6D7 A5E4 B4E1 C2E6
G1D6 G8D3 H6D8 A5E5 B4E2 C2E7
G1D7 G8D4 H7D1 A5E6 B4E3 C2E8
G1D8 G8D5 H7D2 A5E7 B4E4 C3E1
G2D1 G8D6 H7D3 A5E8 B4E5 C3E2
G2D2 G8D7 H7D4 A6E1 B4E6 C3E3
G2D3 G8D8 H7D5 A6E2 B4E7 C3E4
G2D4 H1D1 H7D6 A6E3 B4E8 C3E5
G2D5 H1D2 H7D7 A6E4 B5E1 C3E6
G2D6 H1D3 H7D8 A6E5 B5E2 C3E7
G2D7 H1D4 H8D1 A6E6 B5E3 C3E8
G2D8 H1D5 H8D2 A6E7 B5E4 C4E1
G3D1 H1D6 H8D3 A6E8 B5E5 C4E2
G3D2 H1D7 H8D4 A7E1 B5E6 C4E3
G3D3 H1D8 H8D5 A7E2 B5E7 C4E4
G3D4 H2D1 H8D6 A7E3 B5E8 C4E5
G3D5 H2D2 H8D7 A7E4 B6E1 C4E6
G3D6 H2D3 H8D8 A7E5 B6E2 C4E7
G3D7 H2D4 A1E1 A7E6 B6E3 C4E8
G3D8 H2D5 A1E2 A7E7 B6E4 C5E1
G4D1 H2D6 A1E3 A7E8 B6E5 C5E2
G4D2 H2D7 A1E4 A8E1 B6E6 C5E3
G4D3 H2D8 A1E5 A8E2 B6E7 C5E4
G4D4 H3D1 A1E6 A8E3 B6E8 C5E5
G4D5 H3D2 A1E7 A8E4 B7E1 C5E6
G4D6 H3D3 A1E8 A8E5 B7E2 C5E7
G4D7 H3D4 A2E1 A8E6 B7E3 C5E8
G4D8 H3D5 A2E2 A8E7 B7E4 C6E1
G5D1 H3D6 A2E3 A8E8 B7E5 C6E2
G5D2 H3D7 A2E4 B1E1 B7E6 C6E3
G5D3 H3D8 A2E5 B1E2 B7E7 C6E4
G5D4 H4D1 A2E6 B1E3 B7E8 C6E5
G5D5 H4D2 A2E7 B1E4 B8E1 C6E6
G5D6 H4D3 A2E8 B1E5 B8E2 C6E7
G5D7 H4D4 A3E1 B1E6 B8E3 C6E8
G5D8 H4D5 A3E2 B1E7 B8E4 C7E1
G6D1 H4D6 A3E3 B1E8 B8E5 C7E2
C7E3 D5E8 E4E5 F3E2 G1E7 G8E4
C7E4 D6E1 E4E6 F3E3 G1E8 G8E5
C7E5 D6E2 E4E7 F3E4 G2E1 G8E6
C7E6 D6E3 E4E8 F3E5 G2E2 G8E7
C7E7 D6E4 E5E1 F3E6 G2E3 G8E8
C7E8 D6E5 E5E2 F3E7 G2E4 H1E1
C8E1 D6E6 E5E3 F3E8 G2E5 H1E2
C8E2 D6E7 E5E4 F4E1 G2E6 H1E3
C8E3 D6E8 E5E5 F4E2 G2E7 H1E4
C8E4 D7E1 E5E6 F4E3 G2E8 H1E5
C8E5 D7E2 E5E7 F4E4 G3E1 H1E6
C8E6 D7E3 E5E8 F4E5 G3E2 H1E7
C8E7 D7E4 E6E1 F4E6 G3E3 H1E8
C8E8 D7E5 E6E2 F4E7 G3E4 H2E1
D1E1 D7E6 E6E3 F4E8 G3E5 H2E2
D1E2 D7E7 E6E4 F5E1 G3E6 H2E3
D1E3 D7E8 E6E5 F5E2 G3E7 H2E4
D1E4 D8E1 E6E6 F5E3 G3E8 H2E5
D1E5 D8E2 E6E7 F5E4 G4E1 H2E6
D1E6 D8E3 E6E8 F5E5 G4E2 H2E7
D1E7 D8E4 E7E1 F5E6 G4E3 H2E8
D1E8 D8E5 E7E2 F5E7 G4E4 H3E1
D2E1 D8E6 E7E3 F5E8 G4E5 H3E2
D2E2 D8E7 E7E4 F6E1 G4E6 H3E3
D2E3 D8E8 E7E5 F6E2 G4E7 H3E4
D2E4 E1E1 E7E6 F6E3 G4E8 H3E5
D2E5 E1E2 E7E7 F6E4 G5E1 H3E6
D2E6 E1E3 E7E8 F6E5 G5E2 H3E7
D2E7 E1E4 E8E1 F6E6 G5E3 H3E8
D2E8 E1E5 E8E2 F6E7 G5E4 H4E1
D3E1 E1E6 E8E3 F6E8 G5E5 H4E2
D3E2 E1E7 E8E4 F7E1 G5E6 H4E3
D3E3 E1E8 E8E5 F7E2 G5E7 H4E4
D3E4 E2E1 E8E6 F7E3 G5E8 H4E5
D3E5 E2E2 E8E7 F7E4 G6E1 H4E6
D3E6 E2E3 E8E8 F7E5 G6E2 H4E7
D3E7 E2E4 F1E1 F7E6 G6E3 H4E8
D3E8 E2E5 F1E2 F7E7 G6E4 H5E1
D4E1 E2E6 F1E3 F7E8 G6E5 H5E2
D4E2 E2E7 F1E4 F8E1 G6E6 H5E3
D4E3 E2E8 F1E5 F8E2 G6E7 H5E4
D4E4 E3E1 F1E6 F8E3 G6E8 H5E5
D4E5 E3E2 F1E7 F8E4 G7E1 H5E6
D4E6 E3E3 F1E8 F8E5 G7E2 H5E7
D4E7 E3E4 F2E1 F8E6 G7E3 H5E8
D4E8 E3E5 F2E2 F8E7 G7E4 H6E1
D5E1 E3E6 F2E3 F8E8 G7E5 H6E2
D5E2 E3E7 F2E4 G1E1 G7E6 H6E3
D5E3 E3E8 F2E5 G1E2 G7E7 H6E4
D5E4 E4E1 F2E6 G1E3 G7E8 H6E5
D5E5 E4E2 F2E7 G1E4 G8E1 H6E6
D5E6 E4E3 F2E8 G1E5 G8E2 H6E7
D5E7 E4E4 F3E1 G1E6 G8E3 H6E8
H7E1 A5F6 B4F3 C2F8 D1F5 D8F2
H7E2 A5F7 B4F4 C3F1 D1F6 D8F3
H7E3 A5F8 B4F5 C3F2 D1F7 D8F4
H7E4 A6F1 B4F6 C3F3 D1F8 D8F5
H7E5 A6F2 B4F7 C3F4 D2F1 D8F6
H7E6 A6F3 B4F8 C3F5 D2F2 D8F7
H7E7 A6F4 B5F1 C3F6 D2F3 D8F8
H7E8 A6F5 B5F2 C3F7 D2F4 E1F1
H8E1 A6F6 B5F3 C3F8 D2F5 E1F2
H8E2 A6F7 B5F4 C4F1 D2F6 E1F3
H8E3 A6F8 B5F5 C4F2 D2F7 E1F4
H8E4 A7F1 B5F6 C4F3 D2F8 E1F5
H8E5 A7F2 B5F7 C4F4 D3F1 E1F6
H8E6 A7F3 B5F8 C4F5 D3F2 E1F7
H8E7 A7F4 B6F1 C4F6 D3F3 E1F8
H8E8 A7F5 B6F2 C4F7 D3F4 E2F1
A1F1 A7F6 B6F3 C4F8 D3F5 E2F2
A1F2 A7F7 B6F4 C5F1 D3F6 E2F3
A1F3 A7F8 B6F5 C5F2 D3F7 E2F4
A1F4 A8F1 B6F6 C5F3 D3F8 E2F5
A1F5 A8F2 B6F7 C5F4 D4F1 E2F6
A1F6 A8F3 B6F8 C5F5 D4F2 E2F7
A1F7 A8F4 B7F1 C5F6 D4F3 E2F8
A1F8 A8F5 B7F2 C5F7 D4F4 E3F1
A2F1 A8F6 B7F3 C5F8 D4F5 E3F2
A2F2 A8F7 B7F4 C6F1 D4F6 E3F3
A2F3 A8F8 B7F5 C6F2 D4F7 E3F4
A2F4 B1F1 B7F6 C6F3 D4F8 E3F5
A2F5 B1F2 B7F7 C6F4 D5F1 E3F6
A2F6 B1F3 B7F8 C6F5 D5F2 E3F7
A2F7 B1F4 B8F1 C6F6 D5F3 E3F8
A2F8 B1F5 B8F2 C6F7 D5F4 E4F1
A3F1 B1F6 B8F3 C6F8 D5F5 E4F2
A3F2 B1F7 B8F4 C7F1 D5F6 E4F3
A3F3 B1F8 B8F5 C7F2 D5F7 E4F4
A3F4 B2F1 B8F6 C7F3 D5F8 E4F5
A3F5 B2F2 B8F7 C7F4 D6F1 E4F6
A3F6 B2F3 B8F8 C7F5 D6F2 E4F7
A3F7 B2F4 C1F1 C7F6 D6F3 E4F8
A3F8 B2F5 C1F2 C7F7 D6F4 E5F1
A4F1 B2F6 C1F3 C7F8 D6F5 E5F2
A4F2 B2F7 C1F4 C8F1 D6F6 E5F3
A4F3 B2F8 C1F5 C8F2 D6F7 E5F4
A4F4 B3F1 C1F6 C8F3 D6F8 E5F5
A4F5 B3F2 C1F7 C8F4 D7F1 E5F6
A4F6 B3F3 C1F8 C8F5 D7F2 E5F7
A4F7 B3F4 C2F1 C8F6 D7F3 E5F8
A4F8 B3F5 C2F2 C8F7 D7F4 E6F1
A5F1 B3F6 C2F3 C8F8 D7F5 E6F2
A5F2 B3F7 C2F4 D1F1 D7F6 E6F3
A5F3 B3F8 C2F5 D1F2 D7F7 E6F4
A5F4 B4F1 C2F6 D1F3 D7F8 E6F5
A5F5 B4F2 C2F7 D1F4 D8F1 E6F6
E6F7 F5F4 G4F1 H2F6 A1G3 A7G8
E6F8 F5F5 G4F2 H2F7 A1G4 A8G1
E7F1 F5F6 G4F3 H2F8 A1G5 A8G2
E7F2 F5F7 G4F4 H3F1 A1G6 A8G3
E7F3 F5F8 G4F5 H3F2 A1G7 A8G4
E7F4 F6F1 G4F6 H3F3 A1G8 A8G5
E7F5 F6F2 G4F7 H3F4 A2G1 A8G6
E7F6 F6F3 G4F8 H3F5 A2G2 A8G7
E7F7 F6F4 G5F1 H3F6 A2G3 A8G8
E7F8 F6F5 G5F2 H3F7 A2G4 B1G1
E8F1 F6F6 G5F3 H3F8 A2G5 B1G2
E8F2 F6F7 G5F4 H4F1 A2G6 B1G3
E8F3 F6F8 G5F5 H4F2 A2G7 B1G4
E8F4 F7F1 G5F6 H4F3 A2G8 B1G5
E8F5 F7F2 G5F7 H4F4 A3G1 B1G6
E8F6 F7F3 G5F8 H4F5 A3G2 B1G7
E8F7 F7F4 G6F1 H4F6 A3G3 B1G8
E8F8 F7F5 G6F2 H4F7 A3G4 B2G1
F1F1 F7F6 G6F3 H4F8 A3G5 B2G2
F1F2 F7F7 G6F4 H5F1 A3G6 B2G3
F1F3 F7F8 G6F5 H5F2 A3G7 B2G4
F1F4 F8F1 G6F6 H5F3 A3G8 B2G5
F1F5 F8F2 G6F7 H5F4 A4G1 B2G6
F1F6 F8F3 G6F8 H5F5 A4G2 B2G7
F1F7 F8F4 G7F1 H5F6 A4G3 B2G8
F1F8 F8F5 G7F2 H5F7 A4G4 B3G1
F2F1 F8F6 G7F3 H5F8 A4G5 B3G2
F2F2 F8F7 G7F4 H6F1 A4G6 B3G3
F2F3 F8F8 G7F5 H6F2 A4G7 B3G4
F2F4 G1F1 G7F6 H6F3 A4G8 B3G5
F2F5 G1F2 G7F7 H6F4 A5G1 B3G6
F2F6 G1F3 G7F8 H6F5 A5G2 B3G7
F2F7 G1F4 G8F1 H6F6 A5G3 B3G8
F2F8 G1F5 G8F2 H6F7 A5G4 B4G1
F3F1 G1F6 G8F3 H6F8 A5G5 B4G2
F3F2 G1F7 G8F4 H7F1 A5G6 B4G3
F3F3 G1F8 G8F5 H7F2 A5G7 B4G4
F3F4 G2F1 G8F6 H7F3 A5G8 B4G5
F3F5 G2F2 G8F7 H7F4 A6G1 B4G6
F3F6 G2F3 G8F8 H7F5 A6G2 B4G7
F3F7 G2F4 H1F1 H7F6 A6G3 B4G8
F3F8 G2F5 H1F2 H7F7 A6G4 B5G1
F4F1 G2F6 H1F3 H7F8 A6G5 B5G2
F4F2 G2F7 H1F4 H8F1 A6G6 B5G3
F4F3 G2F8 H1F5 H8F2 A6G7 B5G4
F4F4 G3F1 H1F6 H8F3 A6G8 B5G5
F4F5 G3F2 H1F7 H8F4 A7G1 B5G6
F4F6 G3F3 H1F8 H8F5 A7G2 B5G7
F4F7 G3F4 H2F1 H8F6 A7G3 B5G8
F4F8 G3F5 H2F2 H8F7 A7G4 B6G1
F5F1 G3F6 H2F3 H8F8 A7G5 B6G2
F5F2 G3F7 H2F4 A1G1 A7G6 B6G3
F5F3 G3F8 H2F5 A1G2 A7G7 B6G4
B6G5 C5G2 D3G7 E2G4 F1G1 F7G6
B6G6 C5G3 D3G8 E2G5 F1G2 F7G7
B6G7 C5G4 D4G1 E2G6 F1G3 F7G8
B6G8 C5G5 D4G2 E2G7 F1G4 F8G1
B7G1 C5G6 D4G3 E2G8 F1G5 F8G2
B7G2 C5G7 D4G4 E3G1 F1G6 F8G3
B7G3 C5G8 D4G5 E3G2 F1G7 F8G4
B7G4 C6G1 D4G6 E3G3 F1G8 F8G5
B7G5 C6G2 D4G7 E3G4 F2G1 F8G6
B7G6 C6G3 D4G8 E3G5 F2G2 F8G7
B7G7 C6G4 D5G1 E3G6 F2G3 F8G8
B7G8 C6G5 D5G2 E3G7 F2G4 G1G1
B8G1 C6G6 D5G3 E3G8 F2G5 G1G2
B8G2 C6G7 D5G4 E4G1 F2G6 G1G3
B8G3 C6G8 D5G5 E4G2 F2G7 G1G4
B8G4 C7G1 D5G6 E4G3 F2G8 G1G5
B8G5 C7G2 D5G7 E4G4 F3G1 G1G6
B8G6 C7G3 D5G8 E4G5 F3G2 G1G7
B8G7 C7G4 D6G1 E4G6 F3G3 G1G8
B8G8 C7G5 D6G2 E4G7 F3G4 G2G1
C1G1 C7G6 D6G3 E4G8 F3G5 G2G2
C1G2 C7G7 D6G4 E5G1 F3G6 G2G3
C1G3 C7G8 D6G5 E5G2 F3G7 G2G4
C1G4 C8G1 D6G6 E5G3 F3G8 G2G5
C1G5 C8G2 D6G7 E5G4 F4G1 G2G6
C1G6 C8G3 D6G8 E5G5 F4G2 G2G7
C1G7 C8G4 D7G1 E5G6 F4G3 G2G8
C1G8 C8G5 D7G2 E5G7 F4G4 G3G1
C2G1 C8G6 D7G3 E5G8 F4G5 G3G2
C2G2 C8G7 D7G4 E6G1 F4G6 G3G3
C2G3 C8G8 D7G5 E6G2 F4G7 G3G4
C2G4 D1G1 D7G6 E6G3 F4G8 G3G5
C2G5 D1G2 D7G7 E6G4 F5G1 G3G6
C2G6 D1G3 D7G8 E6G5 F5G2 G3G7
C2G7 D1G4 D8G1 E6G6 F5G3 G3G8
C2G8 D1G5 D8G2 E6G7 F5G4 G4G1
C3G1 D1G6 D8G3 E6G8 F5G5 G4G2
C3G2 D1G7 D8G4 E7G1 F5G6 G4G3
C3G3 D1G8 D8G5 E7G2 F5G7 G4G4
C3G4 D2G1 D8G6 E7G3 F5G8 G4G5
C3G5 D2G2 D8G7 E7G4 F6G1 G4G6
C3G6 D2G3 D8G8 E7G5 F6G2 G4G7
C3G7 D2G4 E1G1 E7G6 F6G3 G4G8
C3G8 D2G5 E1G2 E7G7 F6G4 G5G1
C4G1 D2G6 E1G3 E7G8 F6G5 G5G2
C4G2 D2G7 E1G4 E8G1 F6G6 G5G3
C4G3 D2G8 E1G5 E8G2 F6G7 G5G4
C4G4 D3G1 E1G6 E8G3 F6G8 G5G5
C4G5 D3G2 E1G7 E8G4 F7G1 G5G6
C4G6 D3G3 E1G8 E8G5 F7G2 G5G7
C4G7 D3G4 E2G1 E8G6 F7G3 G5G8
C4G8 D3G5 E2G2 E8G7 F7G4 G6G1
C5G1 D3G6 E2G3 E8G8 F7G5 G6G2
G6G3 H4G8 A3H5 B2H2 B8H7 C7H4
G6G4 H5G1 A3H6 B2H3 B8H8 C7H5
G6G5 H5G2 A3H7 B2H4 C1H1 C7H6
G6G6 H5G3 A3H8 B2H5 C1H2 C7H7
G6G7 H5G4 A4H1 B2H6 C1H3 C7H8
G6G8 H5G5 A4H2 B2H7 C1H4 C8H1
G7G1 H5G6 A4H3 B2H8 C1H5 C8H2
G7G2 H5G7 A4H4 B3H1 G1H6 C8H3
G7G3 H5G8 A4H5 B3H2 C1H7 C8H4
G7G4 H6G1 A4H6 B3H3 C1H8 C8H5
G7G5 H6G2 A4H7 B3H4 C2H1 C8H6
G7G6 H6G3 A4H8 B3H5 C2H2 C8H7
G7G7 H6G4 A5H1 B3H6 C2H3 C8H8
G7G8 H6G5 A5H2 B3H7 C2H4 D1H1
G8G1 H6G6 A5H3 B3H8 C2H5 D1H2
G8G2 H6G7 A5H4 B4H1 C2H6 D1H3
G8G3 H6G8 A5H5 B4H2 C2H7 D1H4
G8G4 H7G1 A5H6 B4H3 C2H8 D1H5
G8G5 H7G2 A5H7 B4H4 C3H1 D1H6
G8G6 H7G3 A5H8 B4H5 C3H2 D1H7
G8G7 H7G4 A6H1 B4H6 C3H3 D1H8
G8G8 H7G5 A6H2 B4H7 C3H4 D2H1
H1G1 H7G6 A6H3 B4H8 C3H5 D2H2
H1G2 H7G7 A6H4 B5H1 C3H6 D2H3
H1G3 H7G8 A6H5 B5H2 C3H7 D2H4
H1G4 H8G1 A6H6 B5H3 C3H8 D2H5
H1G5 H8G2 A6H7 B5H4 C4H1 D2H6
H1G6 H8G3 A6H8 B5H5 C4H2 D2H7
H1G7 H8G4 A7H1 B5H6 C4H3 D2H8
H1G8 H8G5 A7H2 B5H7 C4H4 D3H1
H2G1 H8G6 A7H3 B5H8 C4H5 D3H2
H2G2 H8G7 A7H4 B6H1 C4H6 D3H3
H2G3 H8G8 A7H5 B6H2 C4H7 D3H4
H2G4 A1H1 A7H6 B6H3 C4H8 D3H5
H2G5 A1H2 A7H7 B6H4 C5H1 D3H6
H2G6 A1H3 A7H8 B6H5 C5H2 D3H7
H2G7 A1H4 A8H1 B6H6 C5H3 D3H8
H2G8 A1H5 A8H2 B6H7 C5H4 D4H1
H3G1 A1H6 A8H3 B6H8 C5H5 D4H2
H3G2 A1H7 A8H4 B7H1 C5H6 D4H3
H3G3 A1H8 A8H5 B7H2 C5H7 D4H4
H3G4 A2H1 A8H6 B7H3 C5H8 D4H5
H3G5 A2H2 A8H7 B7H4 C6H1 D4H6
H3G6 A2H3 A8H8 B7H5 C6H2 D4H7
H3G7 A2H4 B1H1 B7H6 C6H3 D4H8
H3G8 A2H5 B1H2 B7H7 C6H4 D5H1
H4G1 A2H6 B1H3 B7H8 C6H5 D5H2
H4G2 A2H7 B1H4 B8H1 C6H6 D5H3
H4G3 A2H8 B1H5 B8H2 C6H7 D5H4
H4G4 A3H1 B1H6 B8H3 C6H8 D5H5
H4G5 A3H2 B1H7 B8H4 C7H1 D5H6
H4G6 A3H3 B1H8 B8H5 C7H2 D5H7
H4G7 A3H4 B2H1 B8H6 C7H3 D5H8
D6H1 E3H8 F1H7 F7H6 G5H5 H3H4
D6H2 E4H1 F1H8 F7H7 G5H6 H3H5
D6H3 E4H2 F2H1 F7H8 G5H7 H3H6
D6H4 E4H3 F2H2 F8H1 G5H8 H3H7
D6H5 E4H4 F2H3 F8H2 G6H1 H3H8
D6H6 E4H5 F2H4 F8H3 G6H2 H4H1
D6H7 E4H6 F2H5 F8H4 G6H3 H4H2
D6H8 E4H7 F2H6 F8H5 G6H4 H4H3
D7H1 E4H8 F2H7 F8H6 G6H5 H4H4
D7H2 E5H1 F2H8 F8H7 G6H6 H4H5
D7H3 E5H2 F3H1 F8H8 G6H7 H4H6
D7H4 E5H3 F3H2 G1H1 G6H8 H4H7
D7H5 E5H4 F3H3 G1H2 G7H1 H4H8
D7H6 E5H5 F3H4 G1H3 G7H2 H5H1
D7H7 E5H6 F3H5 G1H4 G7H3 H5H2
D7H8 E5H7 F3H6 G1H5 G7H4 H5H3
D8H1 E5H8 F3H7 G1H6 G7H5 H5H4
D8H2 E6H1 F3H8 G1H7 G7H6 H5H5
D8H3 E6H2 F4H1 G1H8 G7H7 H5H6
D8H4 E6H3 F4H2 G2H1 G7H8 H5H7
D8H5 E6H4 F4H3 G2H2 G8H1 H5H8
D8H6 E6H5 F4H4 G2H3 G8H2 H6H1
D8H7 E6H6 F4H5 G2H4 G8H3 H6H2
D8H8 E6H7 F4H6 G2H5 G8H4 H6H3
E1H1 E6H8 F4H7 G2H6 G8H5 H6H4
E1H2 E7H1 F4H8 G2H7 G8H6 H6H5
E1H3 E7H2 F5H1 G2H8 G8H7 H6H6
E1H4 E7H3 F5H2 G3H1 G8H8 H6H7
E1H5 E7H4 F5H3 G3H2 H1H1 H6H8
E1H6 E7H5 F5H4 G3H3 H1H2 H7H1
E1H7 E7H6 F5H5 G3H4 H1H3 H7H2
E1H8 E7H7 F5H6 G3H5 H1H4 H7H3
E2H1 E7H8 F5H7 G3H6 H1H5 H7H4
E2H2 E8H1 F5H8 G3H7 H1H6 H7H5
E2H3 E8H2 F6H1 G3H8 H1H7 H7H6
E2H4 E8H3 F6H2 G4H1 H1H8 H7H7
E2H5 E8H4 F6H3 G4H2 H2H1 H7H8
E2H6 E8H5 F6H4 G4H3 H2H2 H8H1
E2H7 E8H6 F6H5 G4H4 H2H3 H8H2
E2H8 E8H7 F6H6 G4H5 H2H4 H8H3
E3H1 E8H8 F6H7 G4H6 H2H5 H8H4
E3H2 F1H1 F6H8 G4H7 H2H6 H8H5
E3H3 F1H2 F7H1 G4H8 H2H7 H8H6
E3H4 F1H3 F7H2 G5H1 H2H8 H8H7
E3H5 F1H4 F7H3 G5H2 H3H1 H8H8
E3H6 F1H5 F7H4 G5H3 H3H2
E3H7 F1H6 F7H5 G5H4 H3H3
上述多肽可以进一步含有选自SEQ ID NO：81至89的一个或多个序列。
本发明还提供一种组合物，包含本文以上限定的多个相同或不同的多肽和生理学上可接受的载体。该组合物可以是干燥组合物，并且该干燥组合物可以是冻干形式或喷雾干燥形式。
在进一步方面，本发明涉及一种具有冰结合活性并且能够减少或抑制冰晶体的生长和/或形成的多肽，
其中所述多肽含有序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)，
其中，X1选自氨基酸残基S、A、G和D；
X2选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
X3选自非大体积氨基酸残基；
X4选自氨基酸残基S、I、T和V；
X5选自氨基酸残基S、A、I和T；
X6选自氨基酸残基S、T和V；
X7选自非大体积氨基酸残基；
X8选自氨基酸残基S、T和V；
X9选自氨基酸残基S、A和G；并且
其中SEQ ID NO：1的X2、X4、X6和X8中至少一个残基是T或V；以及
其中该多肽的氨基酸残基的总数小于250。
序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)在本文中指通用“冰结合域”。所述域是直接参与冰结合还是仅间接地参与冰结合(即需要它来使多肽具有冰结合活性)对于该定义是不重要的。
本发明进一步涉及一种多肽，其包含多个通用“冰结合域”，例如具有与SEQ ID NO：90基本同源/一致的序列。在这方面，与SEQ ID NO：90基本同源应包括与SEQ ID NO：90的序列相比，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9仅一个或最多两个位置不同的任意序列。
此处使用的多个应该包括整数2、3、4、5、6、7、8、8、9，例如小于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，例如小于25，其中所述多个通用“冰结合域”中的任一个可以与SEQ ID NO：90相同或基本相同或基本同源。
本发明还涉及本发明多肽的修饰物和衍生物，其含有SEQ ID NO：90的一个或多个副本，并且可选择地进一步含有SEQ ID NO：90的一个或多个拷贝或与其基本相同或基本同源的序列。
术语“分离的多肽”表明本发明的多肽至少本质上没有受到与该多肽自然相关的细胞成分的污染。
本发明的多肽可以表达为融合多肽。这种融合多肽可以发挥很多功能，例如辅助多肽在活性构象中的纯化和/或生产。融合多肽的一个实例是本发明的多肽与亲和标签融合。融合多肽还可以形成本文定义的补体/抗补体对的一部分，但这个术语不是仅限于多肽。多肽的变化，如本文定义的剪接变体、等位基因变体、直系同源体和旁系同源体也属于本发明的范围。融合多肽的实例在下文将有更详细的描述。
本发明的多肽可以用可检测的标记物标记，例如荧光检测标记。这可以帮助实践者分离或鉴别本发明的多肽。
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸；多核苷酸构建体，如含有所述核苷酸的线性或环形形式的载体；用所述多核苷酸或含有所述核苷酸的载体转染的宿主细胞；以及含有所述宿主细胞的转基因生物。
除非另有说明，多核苷酸可以与“核酸”和“核酸分子”相互交换使用。原则上，本发明可以使用这种多肽或该多肽的补体，例如cDNA或“反义寡核苷酸”的形式。所述多肽可以是个别核苷酸的简并序列，只要该多核苷酸编码本发明的多肽。
该多核苷酸不需要包含从自然宿主生物中分离的天然基因的所有单个核苷酸。那些天然基因的任意截断，包括与天然基因有至少75％同源或相同的序列，例如至少80％同源或相同，例如至少85％同源或相同，例如至少90％同源或相同，例如至少91％同源或相同，例如至少92％同源或相同，例如至少93％同源或相同，例如至少94％同源或相同，例如至少95％同源或相同，例如至少96％同源或相同，例如至少97％同源或相同，例如至少98％同源或相同，例如至少99％同源或相同，例如至少99.5％同源或相同，都应被本发明涵盖。天然基因的任意此类功能性截断，包括它的能够在适当的宿主生物中表达的任意衍生或修饰，都应表示“结构基因”。
例如，当多核苷酸序列在克隆载体中克隆或者将表达载体引入宿主生物并表达时，就可以实现表达。表达适当地受到调控序列的指示，调控序列通常含有启动子，启动子可能又含有一些元件，例如核心启动子以及一个或多个调控元件，包括表达的增强子。
宿主生物通常是重组宿主，即非天然地具有待表达的多核苷酸序列的宿主、或非天然地含有可操作地连接天然表达信号的待表达的多核苷酸序列的宿主。当处于分泌信号序列之后时，本发明的多肽进行分泌-不管这种分泌是否需要发生。
为了清楚阐明，本发明的多肽将称为“分离的”多肽，以便与天然环境中的相同或相关的多肽进行区分。类似地，本文定义的术语“异源多核苷酸”表示一种多核苷酸或多核苷酸构建体，其不同于本发明多肽的天然形式。本发明的多肽在染色体上可以是整合或游离的。
本发明还提供特异性针对本发明多肽的抗体或其结合片段。该抗体可以通过任意现有方法来生产，并且该抗体可以是：例如裸抗体、抗体的结合片段、抗体成分、抗独特型抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
本发明的范围内还提供用于生产和使用a)本发明的多核苷酸、b)本发明的多肽、以及c)本发明的特异性针对所述多肽的抗体的方法。本发明的抗体可用于从大量多肽中识别或划分本文定义的“目标多肽”或“目标肽”。“目标肽”可以是本文定义的抗原肽。
在进一步方面，本发明提供含有本发明的多肽和/或抗体的固体载体，以及制备和使用这种固体载体的方法。
附图简要说明
图1说明了R.Inquisitor AFP的片段的氨基酸序列。推定的冰结合基序(motif)用黑框标示。正向(F)和反向(R)引物都提供了序列，多肽的部分的来源也已标示。该氨基酸序列具有代表或隐藏冰结合(IB)基序的域(一致的A/G-Q/R-G-T-A-T-T-T-A-T-G-X-A/G)，其重复X次并且被1-8个氨基酸残基隔开。
图2说明R.mordax.的AFPs 1-8的全长cDNA序列。划线的是推定的信号肽的编码序列。与这些cDNA对应的AFP(AFP 1-8)主要在它们的N-端部分有差异，其中AFP4似乎没有信号序列。这些AFP各自含有8个重复的氨基酸序列，核心一致的序列为T-A-T-T-T-A-T。这与R.inquisitor同样观察到的推定IB-基序部分相匹配(图1)，并且可以设想这代表R.mordax的IB基序、或至少是它的一部分。
图3：Rhagium mordax的AFP 1-8的全长氨基酸序列。这些序列分别表示为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8。推定的信号序列用下划线标示，并且推定的冰结合基序用框标示。
图4显示具有克隆到表达载体pET26B(+)的全长cDNA的E.coli细胞。IPTG可以用来诱导相关的AFP的合成。起初我们在E.coli中诱导AFP1的合成。结果表明E.coli中产生的AFP1赋予了E.coli细胞耐冻能力。
图5说明野生型(wt)同工型RmAFP1和缺失变体(Δ2-9，WC(Trp-Cys))的SDS-PAGE凝胶。RmAFP变体构建为RmAFP1(Δ2-Δ9)的C-端的冰结合域缺失，每次一个(例如Δ4表明推定的冰结合域4-9(见图2)已经缺失)，而在C-端(WC)含有Trp和Cys残基的变体。将这些克隆到pGEX载体系统(GE Healthcare)并在E.coli(菌株：Origami，BL21)中转化。蛋白质被表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，其在GST与RmAFP之间含有凝血酶裂解位点。
图6显示“冰生长-激增”的进展，其在滞后冰点时出现在1)RmAFP1的溶液中和2)粘鱼类Zoarces viviparous(带有3型AFP的丹麦鱼)的血清中。在这两种情况下，在温度降低前小的冰晶体可以在溶液中退火。当降低RmAFP溶液的温度时，最初的冰晶体(箭头1A)在滞后冰点到达前没有生长或改变形状。在滞后冰点(1B)时，冰晶体爆发，并且溶液因超冷的环境而冻结。请注意，在这种情况下，滞后冰点下的冰生长模式是菜花状(1B，1C)。这与冷却时冰晶体缓慢变形并变为带有六角基面(2A)的双棱锥的情形(见2)(Z.viviparus血清)形成对比。在滞后冰点下，冰生长是针骨状(2B)，并且所有的冰在溶液中以针骨状生长(2C)。
图7显示克隆和纯化的Rhagium mordax AFP1的分子量测定。
图8显示rRmAFP1的二聚化。A：在原生条件下，rRmAFP表现为二聚体，因为当它通过体积排阻柱(Superdex 75，10/30，GE Healthcare)时，它具有比其他相同Mw范围的蛋白更短的保留时间。当Superdex 75用牛血清白蛋白(68KDa，BSA)、胰蛋白酶(25KDa)和人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(13KDa)校准时，从SEC评估rRmAFP1的Mw为28KDa。B：类似地，RmAFP表现为二聚体，当在跑SDS PAGE时得到预估的28KDa的Mw。第一泳道1：牛血清白蛋白(BSA)；2：胰蛋白酶；3：RNAse A；4：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；5：溶菌酶；6：RmAFP1；7：谷胱甘肽S转移酶(GST)。
图9显示本发明的多肽的圆二色光谱(CD)。
图10显示在温度范围6-100℃中RmAFP1的温度稳定性，接着在温度范围6-70℃进行11次扫描。
图11显示pH对RmAFP1的活性和稳定性的影响。
定义
通过与冰晶体结合并抑制晶体生长，抗冻蛋白非依数性地降低了溶液的冻结温度，但该蛋白仅通过依数性效应改变溶液的融化温度。这种热滞后(冻结和融化温度之间的差异)是通过观察温度对单冰晶体生长的影响来确定。当冰晶体的面变成圆形时，发生融化；当冰晶体沿着其c-轴伸长时，发生冻结。
因此，术语“抗冻活性”指融化和冻结温度之间的分隔。它也指融点和冰点之间的差异。它进一步指在高于再结晶温度的温度下以小晶体为代价，抑制大晶体的形成。术语抗冻活性可以与热滞后互换使用。
本文使用的“核酸”或“核酸分子”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段、以及通过任意连接、裂解、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。多核苷酸分子可以由天然产生的核苷酸单体(例如DNA和RNA)、或天然产生的核苷酸的类似物(如天然产生的核苷酸的α-对映体形式)、或两者的结合来构成。修饰的核苷酸可以在糖基和/或嘧啶或嘌呤碱基基团中变化。例如，糖修饰包括用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者糖可以官能化为醚或酯、此外，整个糖基团可以用空间位阻和电子上类似的结构取代，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基基团修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶、或其他众所周知的杂环取代。多核苷酸单体可以通过磷酸二酯键或这些键的类似物来连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸盐(phosphoroselenoate)、phosphorodiselenoate、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽多核苷酸”，其包含天然形成的或修饰的与聚酰胺骨架相连的多核苷酸基。多核苷酸可以是单链或双链的。
术语“多核苷酸分子的补体”指与参考核苷酸序列相比具有互补核苷酸序列并且反转方向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
术语“简并核苷酸序列”表示与编码该多肽的参考多核苷酸分子相比，含有一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三连体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三连密码子各自编码Asp)。
术语“结构基因”指转录到信使RNA(mRNA)中的多核苷酸分子，然后被翻译成特定多肽性质的氨基酸序列。
“分离的多核苷酸分子”是没有被整合在生物基因组DNA中的多核苷酸分子。例如，编码从细胞基因组DNA中分离出来的生长因子的DNA分子就是一种分离的DNA分子。分离的多核苷酸分子的另一个实例是未整合到生物的基因组中的化学合成的多核苷酸分子。从具体物种中分离的多核苷酸分子小于来自该物种的染色体的完整DNA分子。
“核酸分子构建体”是单链或双链的多核苷酸分子，其通过人工干预进行修饰，以便含有以自然界不存在的排列方式进行组合和并列的多核苷酸的片段。
“线性DNA”表示具有游离5′端和3′端的非环状DNA分子。线性DNA可以由闭合的环状DNA分子(例如质粒)通过酶消化或物理中断来制备。
“互补DNA(cDNA)”是由mRNA模板通过逆转录酶形成的单链DNA分子。通常，采用与部分mRNA互补的引物来引发逆转录。本领域的技术人员也用术语“cDNA”表示由这种单链DNA分子与它的互补DNA链组成的双链。术语“cDNA”还表示由RNA模板合成的cDNA分子的克隆体。
“启动子”是引导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码区，接近结构基因的转录起始位点。在转录起始中发挥作用的启动子中的序列元件通常特点是有一致的核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化-特异性元件(DSE；McGehee et al.，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环磷酸腺反应元件(CRE)、血清反应元件(SRE；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))、糖皮质激素反应元件(GRE)、以及用于其他转录因子的结合位点，如CRE/ATF(O′Reilly et al.，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye et al.，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP反应元件结合多肽(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))以及八聚体因子(总体见Watson et al.，eds.，Molecular Biology of the Gene，4th ed.(The Benjamin/Cummings PublishingCompany，Inc.1987)和Lemaigre and Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))。如果启动子是诱导型启动子，则作为对诱导剂的响应，转录的速率增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录的速率不能通过诱导剂调控。阻抑型启动子也是已知的。
“核心启动子”含有启动子功能(包括TATA盒和开始转录)的基本核苷酸序列。通过这个定义，在缺乏特定序列的情况下，核心启动子可能具有或不具有检测活性，特定序列可增强该活性或赋予组织特异性活性。
“调控元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包括与细胞因子结合的核苷酸序列，使转录能够专门地或优选地在特定的细胞、组织或细胞器中进行。这些类型的调控元件通常与以“细胞-特异性”、“组织-特异性”或“细胞器-特异性”方式表达的基因有关。
“增强子”是一类可以增加转录效率的调控元件，不管增强子相对于转录起始位点的距离或方向如何。
“异源性DNA”指在给定的宿主细胞内非天然存在的DNA分子、或DNA分子群。特定宿主细胞的异源性DNA分子可能含有来源于宿主细胞物种的DNA(即内源性DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即外源性DNA)结合。例如，编码多肽的非宿主DNA片段可操作地与含有转录启动子的宿主DNA片段连接，则含有该非宿主DNA片段的DNA分子视为异源性DNA分子。反过来说，异源性DNA分子可以含有与外源性启动子可操作地连接的外源性基因。再举个例子，如果将DNA分子引入缺少野生型基因的突变细胞中，则含有源于野生型细胞的基因的DNA分子视为异源性DNA。
“多肽”是优选地仅通过肽键连接的氨基酸残基的聚合体，或天然产生或者合成产生。通过非宿主DNA分子的表达而产生的多肽是“异源性”肽或多肽。
“氨基酸残基”可以是与肽键或不同于肽键的键相连的天然或非天然的氨基酸残基。氨基酸残基可以是D-构型或L-构型。
“均聚物”是通过将几个相似的多肽添加到一原始多肽中而组成的多肽，由此将相同多肽的多个拷贝形成为一个较大的多肽。
“杂聚物”是通过将几个不同的多肽添加到一原始多肽中而组成的多肽，由此将不同多肽的多个拷贝形成为一个较大的多肽。
“非大体积氨基酸残基”优选地是天然氨基酸，不包括具有环状(脂肪族或芳香族)侧链的氨基酸，如Pro、Phe、Trp、Tyr和His，或者有长的或分支的脂肪族侧链的氨基酸，如Arg、Lys、Leu、Ile、Met和Val，或者更一般地说，大体积氨基酸具有至少含3个碳原子的侧链，这些碳原子连接并形成分支或无分支的侧链。目前“非大体积氨基酸”的优选实例包括Gly、Ala和Ser。
“本发明的多肽”是指本专利申请或在本专利申请权利要求基础上的授权专利的权利要求中引用的任意多肽。
“本发明的多核苷酸”或“本发明的核苷酸”是任意的编码“本发明的多肽”的多核苷酸，该多肽包括本专利申请或在本专利申请权利要求基础上的授权专利的权利要求中引用的任意多肽。
“整合的遗传元件”是通过人工操作将元件引入宿主细胞后，掺入宿主细胞染色体中的DNA片段。在本发明中，整合的基因元件最常见的是来源于经由电穿孔或其他技术引入细胞的线形质粒。整合的遗传元件从原始宿主细胞传给它的后代。
“克隆载体”是一种在宿主细胞中具有自主复制能力的多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、或噬菌体。克隆载体通常包含一个或少数限制性内切酶识别位点，其使多核苷酸分子以确定的方式插入，而不损失载体的重要生理功能；以及编码标记基因的核苷酸序列，该标记基因适用于识别和筛选用该克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄西林抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的多核苷酸分子。通常，表达载体包括转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常是位于控制启动子下游。所述基因被认为是“可操作地连接到”该启动子。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件和核心启动子可操作地连接。
“重组宿主”是含有异源性多核苷酸分子(如克隆载体或表达载体)的细胞。
“整合的转化体”是重组的宿主细胞，其中异源性DNA已经被整合到该细胞的基因组DNA中。
“融合多肽”是由含有至少两种基因的核苷酸序列的多核苷酸分子表达的杂交多肽。例如，融合多肽可以包括至少部分本发明的多肽与结合亲和基质的多肽相融合。这种融合多肽提供一种采用亲和层析来分离大量本发明的多肽的手段。
术语“分泌信号序列”表示编码一种肽(“分泌肽”)的DNA序列，其作为更大多肽的一个组成部分，指导更大的多肽通过细胞中合成的分泌途径。在运输穿过该分泌途径期间，该更大的多肽常常被分切以除去分泌肽。
“分离的多肽”是基本没有受到细胞成分，例如碳水化合物、脂质或其他与天然多肽有关的多肽类杂质污染的多肽。通常，制备分离的多肽包括高纯度形式的多肽，即至少约80％纯度，至少约90％纯度，至少约95％纯度，大于95％纯度，或大于99％纯度。一种显示特定多肽制剂含有分离的多肽的方式是：多肽制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶的考马斯亮蓝染色中显示单条带。然而，术语“分离的”不排除相同多肽以替换的物理形式出现，例如二聚体或替代的糖基化或衍生化的形式。
术语“氨基-末端”和“羧基-末端”在本文用于表示多肽中的位置。在上下文允许的情况下，这些术语是针对多肽的特定序列或部分使用，以表示接近或相对的位置。例如，位于多肽中参考序列羧基端的某一序列就是位于接近该参考序列的羧基端，但不一定是在整个多肽的羧基端。
术语“表达”指基因产品的生物合成。例如，以结构基因为例，表达包括将结构基因转录到mRNA以及将mRNA翻译成一个或多个多肽。
术语“剪接变体”在本文中用来表示从一种基因转录的RNA的替换形式。通过使用转录的RNA分子内的、或者较少见的是独立转录的RNA分子之间的替换剪接位点，剪接变异自然地产生。剪接变体可编码含有改变的氨基酸序列的多肽。术语剪接变体在本文中还用来表示由转录自一种基因的mRNA的剪接变体所编码的多肽。
术语“补体/抗补体对”表示在适当条件下形成非共价连接的稳定对的非同一的基团。例如，生物素和亲合素(或链亲合素)是补体/抗补体对的原型成员。其他示范性的补体/抗补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、正义/反义多核苷酸对，等等。当需要随后分离补体/抗补体对时，该补体/抗补体对优选地具有小于109M-1的结合亲和度。
“抗独特型抗体”是与免疫球蛋白的可变区域相结合的抗体。在本说明书中，抗独特型抗体与抗-抗体的可变区结合，因此，抗独特型抗体类似于本发明多肽的表位。
“抗体片段”是抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等。无论结构如何，抗体片段与完整抗体识别的相同抗原相结合。例如，抗-(本发明多肽)单克隆抗体片段结合本发明多肽的表位。
术语“抗体片段”还包括与特异性抗原结合的合成的或基因工程多肽，例如由轻链可变区组成的多肽，由轻链和重链的可变区、重组单链多肽分子组成的“Fv”片段，其中重链和轻链通过肽连接头(“scFv多肽”)相连，以及由类似于高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
“嵌合抗体”是一种重组多肽，其含有来自鼠抗体的可变域和互补决定区，而抗体分子的其余部分来自人抗体。
“人源化抗体”是一种重组多肽，其中单克隆抗体的鼠互补决定区已经从鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移至人可变域。
“检测标记”是一种分子或原子，其可以与抗体基团偶联以产生对诊断有用的分子。检测标记的实例包括螯合剂、光活性剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁离子或其他标记基团。
术语“亲和标签”在本文中用于表示可以连接到第二多肽上的多肽片段，以为第二多肽的纯化或检测做好准备，或者为第二多肽与底物的连接提供位点。原则上，抗体或其他特定结合剂可得的任意肽或多肽都可用作亲和标签。亲和标签包括聚组氨酸道、多肽A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smithand Johnson，Gene 67：31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204(1988))、链亲和素结合肽、或其他抗原表位或结合域。总体见Ford et al.，polypeptide Expression and Purification 2：95(1991)。编码亲和标签的DNA可从商业供应商获得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)。
“裸抗体”是一种与抗体片段形成对照的完整抗体，其不与治疗剂偶联。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体，如嵌合抗体和人源化抗体。
本文使用的术语“抗体成分”包括整个抗体和抗体片段。
“目标多肽”或“目标肽”是包括至少一个表位并且在靶细胞(如肿瘤细胞)或携带传染原抗原的细胞上表达的氨基酸序列。T细胞识别目标多肽或目标肽的主要组织相容性复合体分子提呈的表位，并通常溶解靶细胞或将其他免疫细胞吸收到靶细胞的位点，由此杀灭该靶细胞。
“抗原肽”是一种肽，它与主要组织相容性复合体分子结合以形成由T细胞识别的MHC-肽复合物，从而在提呈给T细胞时诱导细胞毒性淋巴细胞应答。因此，抗原肽能够结合适宜的主要组织相容性复合体分子并诱导细胞毒性T细胞应答，例如针对靶细胞的细胞溶解或特定细胞因子释放，该靶细胞结合或表达抗原。在I类或II类主要组织相容性复合体分子的背景下，抗原肽可以结合在抗原提呈细胞或靶细胞上。
在真核生物中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录以生成mRNA。多核苷酸分子可以设计为含有RNA聚合酶II模板，其中RNA转录具有与特定mRNA互补的序列。RNA转录称作“反义RNA”，编码该反义RNA的多核苷酸分子称为“反义基因”。反义RNA分子能够与mRNA分子结合，产生对mRNA翻译的抑制。
“特异性针对编码本发明多肽的多核苷酸的反义寡核苷酸”是指具有序列(a)能够用编码本发明多肽的部分基因形成稳定的三重体，或(b)能够用该基因的部分mRNA转录形成稳定的二重体的寡核苷酸。
术语“变异基因”指编码多肽的多核苷酸分子，该多肽具有本发明多肽修饰后的氨基酸序列。这些变体包括本发明基因的自然发生的多形性，以及含有本发明多肽的氨基酸序列的保守氨基酸替换的合成基因。另外的基因变异形式是含有本文所述核苷酸序列的插入或缺失的多核苷酸分子。本发明的变异基因可以通过确定该基因在严格条件下是否与本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子、或其补体进行杂交来鉴别。
此外，变异基因可以通过序列比对来鉴别。如果对齐时两个氨基酸序列的氨基酸残基相同达到最大的一致性，则两个氨基酸序列具有“100％氨基酸序列同一性”。类似地，如果对齐时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同达到最大的一致性，则两个核苷酸序列具有“100％核苷酸同一性”。序列比对可以通过标准软件程序来完成，例如由DNASTAR(Madison，Wis.)生产的LASERGENE生物信息学计算套件中包含的那种程序。其他的通过确定最佳比对来比较两个核苷酸或氨基酸序列的方法也是本领域技术人员熟知的(例如，见Peruski and Peruski，The Intemet and the New Biology：Tools for Genomicand Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)，Wu et al.(eds.)，″InformationSuperhighway and Computer Databases of polynucleotides and polypeptides，″Methods in Gene Biotechnology，pages 123-151(CRC Press，Inc.1997)，Bishop(ed.)，Guide to Human Genome Computing，2nd Edition(Academic Press，Inc.1998))。以下描述确定序列同一性的具体方法。
与识别变异基因的具体方法无关，变异基因编码一种多肽，该多肽的特征在于它能够与抗-(本发明的多肽)抗体特异性地结合。
术语“等位变体”在本文用于表示占据相同染色体位点的基因的任意两种或多种替换形式。等位变体通过突变自然地产生，并且可导致种群内的表型多态形。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没发生变化)，或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体在本文中也用于表示由基因的等位变体编码的多肽。
术语“直系同源体”表示一种多肽或来自一种物种的多肽，其功能性对应于一种多肽或来自不同物种的多肽。直系同源体之间的序列差异是物种形成的结果。
“旁系同源体”是由生物体制得的明显不同的、但结构上有关的多肽。旁系同源体被认为是通过基因复制产生。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌红蛋白互为旁系同源体。
由于标准分析方法的不精确性，聚合体的分子量和长度理解为近似值。当这些值表述为“约”X或“近似”X时，所称的X值应理解为精确到+/-20％，例如+/-10％，例如+/-5％。
发明详细说明
本发明在一种实施方式中提供分离的多肽，该多肽含有或者其组成为选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列，或者与所述序列任一项有至少75％同一性的序列，其中所述多肽能够减少或抑制冰晶体的形成和/或生长，或其片段能够减少或抑制冰晶体的形成和/或生长。
本发明还提供一种含有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸可以进一步含有表达信号，该表达信号能够在适当的宿主细胞中指导编码本发明多肽的核苷酸序列的表达。本发明还提供一种含有本发明的多核苷酸的载体，该多核苷酸能够表达本发明的多肽。一种分离的重组细胞，可以含有本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的多肽。
本发明还提供一种含有本发明的多肽的食用产品，其中该食用产品可以是冻结的，或者是冷冻甜食产品的形式，例如冰淇淋产品、或面包。
本发明提供的非食品应用的实例是含有本发明的多肽的固体载体材料。
本发明还涉及制备或使用本发明的多肽的方法，在一种实施方式中包括生产本发明的多肽的方法，所述方法包括步骤：
i)提供本发明的多核苷酸或本发明的载体，
ii)通过步骤i)中提供的多核苷酸的重组表达，提供适用于生产本发明的多肽的宿主细胞，
iii)生产本发明的多肽，以及可选地
iv)纯化和/或分离所述多肽。
当原位生产本发明的多肽时，本发明提供一种方法，包括步骤：
i)提供可发酵的起始原料，
ii)提供微生物，其能够使所述可发酵的食品起始原料发酵，并且发酵所述可发酵的食品起始原料时能够在适宜条件下产生本发明的多肽，
iii)在所述微生物的存在下发酵所述食品起始原料，由此产生发酵的食用产品，其中所述发酵的食用产品含有本发明的多肽。
在进一步的实施方式中，本发明提供以下方法：
一种减少或抑制冷冻食用产品中冰晶体形成的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此减少或抑制该冷冻食用产品中的冰晶体形成。
一种减少或抑制冷冻食用产品中冰晶体生长的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此减少或抑制该冷冻食用产品中的冰晶体生长。
一种在冷冻食用产品中构建冰晶体的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此在该冷冻食用产品中构建冰晶体。
一种调节冷冻食用产品的质地或感官性质的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
由此调节冷冻食用产品的质地或感官性质。
一种监测冷冻食用产品的生产或储存期间的冰晶体形成的方法，所述方法包括步骤：
i)提供冷冻的食用产品，或生产该产品所需要的一种或多种成分，和
ii)视情况而定，在生产该产品之前、之后或生产期间，使所述产品和/或所述成分与本发明的多肽接触，
iii)监测该冷冻食用产品的生产或储存期间的不同时间点的冰晶体形成。
一种在雌性个体中进行体外受精(IVF)处理的方法，所述方法包括步骤：从雌性个体中移取一个或多个卵细胞，可选择地连同包含卵泡液的生物样本一起移取；在本发明多肽的存在下，冷冻该一个或多个卵细胞，可选择地连同生物样本一起冷冻；使一个或多个移取的卵细胞在体外受精；以及将一个或多个受精的卵细胞植入该雌性个体中。
一种增加雌性个体怀孕的可能性或几率的方法，所述方法包括步骤：从雌性个体中移取一个或多个卵细胞，可选择地连同含有卵泡液的生物样本一起移取；在本发明多肽的存在下，冷冻该一个或多个卵细胞，可选择地连同该生物样本一起冷冻；使一个或多个移取的卵细胞在体外受精；以及将一个或多个受精的卵细胞植入该雌性个体中，其中在本发明多肽的存在下冷冻该一个或多个卵细胞减少了冰晶体在卵细胞上或者卵细胞存在的环境中的生长和/或形成，从而增加怀孕的可能性或机率。
该样本可以进一步包含颗粒黄体细胞或卵泡细胞，并且可选择地还有其他来自雌性个体卵巢的卵巢细胞。在一种实施方式中，该样本进一步包含来自卵细胞环境的冷冻细胞。
本发明在进一步实施方式中涉及一种多肽，其具有冰结合活性并且含有序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)的一个或多个拷贝，例如通用冰结合域SEQ ID NO：90的2、3、4、5、6、7、8、9或10个单独选择的拷贝，其中：
X1选自氨基酸残基S、A、G和D；
X2选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
X3选自非大体积氨基酸残基；
X4选自氨基酸残基S、I、T和V；
X5选自氨基酸残基S、A、I和T；
X6选自氨基酸残基S、T和V；
X7选自非大体积氨基酸残基；
X8选自氨基酸残基S、T和V；
X9选自氨基酸残基S、A和G；并且
其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中至少一个是T或V；和
其中该多肽的氨基酸残基的最大数目小于1000。
本发明多肽的氨基酸残基的最大数目优选小于500，例如小于400，例如小于300，例如小于250，例如小于240，例如小于230，例如小于220，例如小于210，例如小于200，例如小于190，例如小于180，例如小于150，例如小于140，例如小于130，例如小于120，例如小于110，例如小于100，例如小于95，例如小于90，例如小于85，例如小于80，例如小于75，例如小于70，例如小于65，例如小于60，例如小于55，例如小于50，例如小于45，例如小于40，例如小于30，例如小于20，例如小于15。
在与上述列举的限制大小的多肽进行功能性偶联中，本发明多肽的氨基酸残基的最小数目可以是10或更多，例如12或更多，例如14或更多，例如16或更多，例如18或更多，例如20或更多，例如22或更多，例如24或更多，例如26或更多，例如28或更多，例如30或更多，例如32或更多，例如34或更多，例如36或更多，例如38或更多，例如40或更多，例如42或更多，例如44或更多，例如46或更多，例如48或更多，例如50或更多，例如55或更多，例如60或更多，例如65或更多，例如70或更多，例如75或更多，例如80或更多，例如85或更多，例如90或更多，例如95或更多，例如100或更多，其中任意最大数或最小数是成对的，最大数目大于最小数目。
在一种实施方式中，本发明的多肽包含多个通用冰结合域，每个都含有序列SEQ ID NO：90或如本文其他地方所述的其变体或衍生物或修饰物，并且优选地最多具有250个氨基酸残基。
在一种实施方式中，本发明涉及一种包含第二序列的多肽序列，该序列是SEQ ID NO：90的另外的独立选择的拷贝的形式，其中SEQ ID NO：90的另外的拷贝与SEQ ID NO：90的第一拷贝不重叠。本发明在另一种实施方式中涉及一种另外含有SEQ ID NO：90的第三拷贝的多肽(即该多肽含有SEQ IDNO：90的三个独立选择的拷贝)，并且在进一步实施方式中，该多肽另外含有SEQ ID NO：90的第四拷贝(即该多肽包含SEQ ID NO：90的三个独立选择的拷贝)。SEQ ID NO：90的独立选择的拷贝可以是相同或不同的，正如本文其他地方所述。
SEQ ID NO：90的拷贝相互可以以任意序列存在，并且任意两个序列可以被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
本发明的多肽可以与载体连接，例如固体载体或半固体载体。该多肽可以共价或非共价地连接任意的这类载体，例如合意地陈列本发明多肽的材料的表面。
本发明进一步涉及与亲和标签融合的本发明的多肽。这类亲和标签的实例是文献已知的，并且可以选自以下实例，例如：His-tag、多肽A标记、亲合素/链亲合素、多肽G、谷胱甘肽S转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、绿色荧光多肽(GFP)、聚精氨酸、聚胱氨酸、c-myc、钙调素结合多肽、流感病毒血凝素、麦芽糖结合蛋白(MBP)(HA)。
本发明还包括其中一个或多个氨基酸残基被修饰的多肽，其中所述一个或多个修饰优选地选自体内或体外化学衍生作用，如乙酰化或羧基化；糖基化作用，例如将多肽暴露于酶中引起的糖基化作用，该酶影响糖基化作用，如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶；磷酸化作用，如产生磷酸化氨基酸残基的氨基酸残基的修饰，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。
本发明的多肽可以含有一个或多个氨基酸，独立地选自天然产生的L-氨基酸、天然产生的D-氨基酸以及非天然产生的合成氨基酸。
本发明还涉及引入了保护基团的本发明的多肽，以便保护和/或稳定该多肽的N-和/或C-端，避免遭受不需要的退化。这种保护基团可选自分支或未分支的烷基和酰基，例如甲酰或乙酰基，及其取代形式，例如乙酰氨甲基。
本发明进一步涉及本发明多肽的修饰物和衍生物，编码所述多肽的核苷酸，含有所述核苷酸的载体，用所述载体转化的宿主细胞以及含有所述细胞的转基因生物。
根据布达佩斯条约的专利保藏
以下菌株已经根据布达佩斯条约的规定于2007年6月4日保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。
Escherichia coli ALO3231
DSM 19401：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP 1的E.coli菌株JM109
Escherichia coli ALO3232
DSM 19402：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP2的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3233
DSM 19403：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP3的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3234
DSM 19404：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP4的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3235
DSM 19405：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP5的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3236
DSM 19406：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP6的E.coli菌株JM 109
Escherichia coli ALO3237
DSM 19407：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP7的E.coli菌株JM109
Escherichia coli ALO3238
DSM 19408：含有质粒pGEM-T-Easy-RmAFP8的E.coli菌株JM109
针对下述地区和国家就上述DSMZ保藏号作出以下声明。
EPO：本申请人特此要求，直至欧洲专利授权通知公布，或者直至本申请被驳回或撤回或视为撤回，自申请日起20年内，EPC细则28(3)规定的本生物材料向公众的公开只能通过向由请求人指定的专家提供样品的形式完成。
澳大利亚：本申请人据此声明，微生物样本的发放仅在专利授权之前、或者本申请失效、驳回或撤回之前有效，提供给对本申请无利害关系的技术人员(澳大利亚专利法条例3.25(3))。
加拿大：本申请人请求，直至在本申请的基础上授予加拿大专利或者本申请被驳回、或放弃且不再恢复、或撤回，专利委员会委员只能批准本申请提到的保藏生物材料的样品发放给委员指定的独立专家。
克罗地亚：本申请人特此要求，在本申请公开和专利授权之间，本样品仅根据请求提供给独立专家。
丹麦：本申请人特此要求，直至本申请已经(由丹麦专利局)向公众公开，或最终由丹麦专利局决定未向公众公开，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给本领域的专家。
芬兰：本申请人特此要求，直至本申请已经(由国家专利注册委员会)向公众公开，或最终由国家专利注册委员会决定未向公众公开，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给本领域的专家。
德国：本申请人特此要求，直至专利授权或者直至本申请被驳回或撤回，自申请日起20年内，样本只能发放给请求人指定的独立专家。
冰岛：本申请人特此要求，直至专利授权或者冰岛专利局关于本申请作出没有授权的最终决定，本申请提到的保藏生物材料的样品仅提供给本领域的专家。
挪威：本申请人特此要求，直至本申请已经(由挪威专利局)向公众公开，或最终由挪威专利局决定未向公众公开，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给本领域的专家。
新加坡：本申请人特此要求，本申请中提到的保藏的生物材料样品仅提供给专家。
西班牙：本申请人特此要求，直至西班牙专利授权通知公布，或者本申请被驳回或撤回，自本申请日起20年内，SPL45条规定的本申请保藏生物材料向公众的公开只能通过向独立专家发放样品的形式完成。
瑞典：本申请人特此要求，直至本申请已经(由瑞典专利局)向公众公开，或最终由瑞典专利局决定未向公众公开，本申请中提到的保藏生物材料的样品仅提供给本领域的专家。
英国：本申请人特此要求，本申请中提到的保藏生物材料的样品仅提供给专家。
序列同源性和同一性的确定
本发明一方面还提供一种分离的多肽，它与本发明多肽，如SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8的任一项或它们的直系同源体，具有基本相似的序列同一性。
术语“基本相似的序列同一性”在本文用于表示与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列、或它们的直系同源体具有至少70％序列同一性的多肽，例如至少72％，例如至少74％，例如至少76％，例如至少78％，例如至少80％，例如至少82％，例如至少84％，例如至少86％，例如至少88％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％，或者大于99％。
本发明还考虑到变异的多核苷酸分子，其可以用两种标准来识别：a)测定具有序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意氨基酸序列的多肽与上述(多核苷酸分子)之间的同一性或相似性，和b)在严格条件下进行杂交试验。例如，某些基因变体包含多核苷酸，该多核苷酸保持与本发明的多核苷酸如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意序列杂交，或者与这些多核苷酸的互补序列杂交，接着在严格的冲洗条件下冲洗，其中冲洗严格度相当于以0.5X～2X SSC，0.1％SDS在55℃～65℃下进行。或者，变异基因可以定性为多核苷酸分子，其保持与编码本发明多肽的多核苷酸如SEQ ID NO：1至SEQID NO：8的任意序列杂交，或者与这些多核苷酸的互补序列杂交，接着在严格的冲洗条件下冲洗，其中冲洗严格度相当于以0.1X～0.2X SSC，0.1％SDS在55℃～65℃下进行。
序列同一性的百分比可通过常规方法确定。例如，参见Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603(1986)和Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1992)。简言之，将两个氨基酸序列进行比对，用空位开放罚分10、空位延伸罚分1，以及Henikoff and Henikoff(同前)的″BLOSUM62″得分矩阵来优化比对评分。同一性百分数计算为：[(相同配对的总数)/较长序列长度×为了比对两序列而向该较长序列引入的空位数]×(100)
本领域的技术人员可以理解，许多建立的算法可以用来比对两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是合适的多肽比对方法，用于检查本文公开的氨基酸序列与推定的或变体的氨基酸序列共有的同源性水平。FASTA算法在Pearson and Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA85：2444(1988)和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)中都有描述。
简言之，FASTA首先通过识别查询序列(例如SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列)和测试序列共享的区域来定性序列相似度，这些区域具有最高的同源性密度(如果ktup变量是1)或者同源对(如果ktup＝2)，而不考虑保守氨基酸替代、插入或缺失。然后通过利用氨基酸替代矩阵比较所有成对的氨基酸的相似性，将有最高同一性密度的十个区重新打分，并且这些区域的末端被“修整”以便仅含有那些对最高评分作出贡献的残基。如果有几个区域的评分高于“临界”值(基于序列长度和ktup值，通过预定的公式计算)，然后检验修整的起始区以确定是否这些区可以接合以形成有差距的近似对齐。最后，用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法，将两个氨基酸序列的最高评分区对齐(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))，其允许有氨基酸插入和缺失。FASTA分析的优选参数是：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1，替代矩阵＝BLOSUM62。通过修改得分矩阵文件(″SMATRIX″)，可以将这些参数引入FASTA程序，正如Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2所解释的那样。
利用如上所公开的比率，FASTA还可以用于确定多核苷酸分子的序列同一性。对核苷酸序列比对来说，ktup值可以是在1至6之间，优选3至6，并且最优选为3。其他参数可以设定为：空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝1。
本发明多肽中的氨基酸残基的替代
本发明还针对与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意序列的氨基酸序列相比，具有一个或多个保守氨基酸替代的多肽以及编码具有一个或多个氨基酸替代的多肽的多核苷酸。也就是说，可以获得含有SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列的一个或多个氨基酸替代的变体。变体包括以下序列：其中烷基氨基酸替代烷基氨基酸，其中芳香族氨基酸替代芳香族氨基酸，其中含硫氨基酸替代含硫氨基酸，其中含羟基氨基酸替代含羟基氨基酸，其中酸性氨基酸替代酸性氨基酸，碱性氨基酸替代碱性氨基酸，或者其中二盐基一羧氨基酸替代二盐基一羧氨基酸。
例如，在常见氨基酸中，“保守的氨基酸替代”也可以通过以下各组中的氨基酸之间的替换来解释：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸，精氨酸和组氨酸。
BLOSUM62表是多肽序列片段的约2000局部多重比对得到的氨基酸替代矩阵，代表500多组相关多肽的高度保守区域(Henikoff and Henikoff，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：10915(1992))。相应地，BLOSUM62替代频率可用于限定可引入本发明氨基酸序列的保守氨基酸替代。虽然可能仅基于化学性质来设计氨基酸替代(如上所讨论)，“保守氨基酸替代”的表述优选地指大于-1的BLOSUM62值所表示的替代。例如，如果替代是以0、1、2，或3的BLOSUM62值为特征，则氨基酸替代是保守的。根据该系统，优选的保守氨基酸替代的特征是至少为1(如1、2或3)的BLOSUM62值，而更优选的保守氨基酸替代的特征是至少为2(如2或3)的BLOSUM62值。
例如，当氨基酸序列中的变化是由于一个或多个保守氨基酸替代引起时，具体的多肽变体的特征在于，与本文公开的相应氨基酸序列(即SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8的任意序列)有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的序列同源性。
氨基酸序列的变体，例如“保守氨基酸”变体，可以通过寡核苷酸指导的诱变、连接体扫描诱变，用聚合酶链反应的诱变等获得(见Ausubel(1995)，pages 810-822；和McPherson(ed.)，Directed Mutagenesis：A Practical Approach(IRL Press 1991))。
本发明的多肽还可以包括非自然产生的氨基酸残基。例如，非自然产生的氨基酸残基包括但不限于：反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基半胱乙酯、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酸、同型谷氨酸、哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-以及4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、戊氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
本领域中已知有几种方法可用于将非自然产生的氨基酸残基掺入多肽。例如，可以采用体外培养系统，其中无义突变可用化学氨基酰化抑制剂tRNA来抑制。合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域中已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译通常可在包含E.coli S30提取物和商业可得的酶和其他试剂的无细胞体系中进行。多肽可通过层析法纯化。例如，见Robertson et al.，J.Am.Chem.Soc.113：2722(1991)，Ellman et al.，MethodsEnzymol.202：301(1991)，Chung et al.，Science 259：806(1993)和Chung et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 90：10145(1993)。
多个氨基酸取代可用已知的诱变和筛选的方法来进行和测试，例如Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241：53(1988))或Bowie and Sauer(Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 86：2152(1989))公开的那些。简言之，这些作者公开了一些方法，用于同时使多肽中的两个或多个位置随机化，选择功能多肽，然后测序该诱变的多肽以确定每个位置的允许替代物的光谱。可以使用的其他方法包括噬菌体展示法(例如，Lowman et al.，Biochem.30：10832(1991)，Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,223,409，Huse，国际公布No.WO 92/06204和定位突变(Derbyshire et al.，Gene 46：145(1986)和Ner et al.，DNA 7：127，(1988))。
本发明公开的核苷酸和多肽序列的变体还可以通过DNA改组来生成，如Stemmer，Nature 370：389(1994)，Stemmer，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA91：10747(1994)和国际公布No.WO 97/20078所述。简言之，变体DNA分子是通过体外同源重组，通过亲代DNA的随机分裂接着用PCR重新装配而生成，得到随机引入的点突变。该技术可以用亲代DNA分子的家族，比如来自不同物种的等位基因变体或DNA分子来改造，以将另外的变异引入该过程。选择或筛选所需要的活性，接着进行额外的反复诱变和分析，通过选择所需要的变异，同时针对不利的变化进行选择，提供序列的快速“进化”。
本文公开的诱变方法可以和高通量自动化筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。可以将编码生物活性多肽或与特异性抗体结合的多肽的诱变DNA分子从宿主细胞中除去，并且用现有设备快速测序。这些方法可以快速确定所关注的多肽中个别氨基酸残基的重要性，并且可以适用于未知结构的多肽。
本发明多肽的片段
本发明还包括多肽的“功能性片段”以及编码这些功能性片段的本发明的多核苷酸分子。可以进行多核苷酸分子的常规缺失分析，以获得编码本发明的多肽的多核苷酸分子的功能性片段。例如，编码SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8的任意序列的DNA分子可以用Bal31核酸酶消化，以获得一系列嵌套缺失。然后将该片段在适当的阅读框内插入表达载体中，分离出表达的多肽并测试其与抗体特异性结合的能力。核酸外切酶消化的一种替换方式是用寡核苷酸指导的诱变来引入缺失或终止密码子，以详细说明特异性片段的产生。或者，本发明的基因的特定片段可以用聚合酶链反应合成。
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的片段优选地包含一个或多个冰结合位点，用本文其他地方所述的SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：72表示。本发明还提供了嵌合多肽和多肽片段。
以下片段：
GSYSCRAVGVDASTVTDVQGTCHAKATGPGAVASGTSVDGSTSTATATGSC来源于全长序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ NO 7和SEQID NO8，并且在C-末端含有替换的残基C，在N-末端含有GS。
用于识别功能域的方法是本领域技术人员熟知的。例如，对干扰素的一个或两个端点的截取研究已被Horisberger and Di Marco，Pharmac.Ther.66：507(1995)概括总结。此外，用于多肽的功能性分析的标准技术已经有描述，例如Treuter et al.，Molec.Gen.Genet.240：113(1993)，Content et al.，″Expressionand preliminary deletion analysis of the 42 kDa 25A synthetase induced by humaninterferon，″Biological Interferon Systems，Proceedings of ISIR-TNO Meeting onInterferon Systems，Cantell(ed.)，pages 65-72(Nijhoff 1987)，Herschman，″TheEGF Receptor，″Control of Animal Cell Proliferation，Vol.1，Boynton et al.，(eds.)pages 169 199(Academic Press 1985)，Coumailleau et al.，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga et al.，J.Biol.Chem.270：25291(1995)；Yamaguchi etal.，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)以及Meisel et al.，Plant Molec.Biol.30：1(1996)。
本发明还考虑了本发明多肽的功能性片段，其与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8任意序列的氨基酸序列相比有氨基酸变化。变体多肽可以通过用本文公开的具体氨基酸序列根据结构确定同一性的水平来识别。根据结构识别变体多肽的另一种替换方法是确定是否编码潜在变体多肽的多核苷酸分子能够与具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8任意序列的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
本发明还提供多肽片段或肽，其含有本文所述的本发明多肽的表位承载部分。这种片段或肽可含有“免疫表位”，这是当整个多肽用作免疫原时，引出抗体应答的多肽的一部分。免疫原的表位承载肽可以用标准方法识别(例如，见Geysen et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 81：3998(1983))。
与此相反，多肽片段或肽可含有“抗原表位”，其是抗体能够与之特异性结合的多肽分子的一个区域。某些表位包括线性或连续延伸的氨基酸，并且这种表位的抗原性不受变性剂的干扰。本领域知道，能够模拟多肽表位的相对短的合成肽可以用于刺激针对该多肽的抗体的产生(例如，见Sutcliffe etal.，Science 219：660(1983))。因此，本发明的抗原表位承载肽和多肽可用于产生与本文所述多肽相结合的抗体。
承载抗原表位的肽和多肽可以含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8任意序列的至少4至10个氨基酸，例如至少10至15个氨基酸，例如约15至约30个氨基酸。这种承载抗原表位的肽和多肽可以通过本文所述的将本发明的多肽裂解或者化学肽合成来生产。此外，表位可以通过随机肽库的噬菌体展示来选择(例如，见Lane and Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)，Corteseet al.，Curr.Opin.Biotechnol.7：616(1996))。用于识别表位以及由含上述表位的小肽生产抗体的标准方法已有描述，例如Mole，“Epitope Mapping”，Methods in Molecular Biology，Vol.10，Manson(ed.)，pages 105116(TheHumana Press，Inc.1992)，Price，“Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies”，Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，pages 6084(CambridgeUniversity Press 1995)，Coligan et al.(eds.)，Current Protocols in Immunology，pages 9.3.19.3.5和pages 9.4.19.4.11(John Wiley&Sons 1997)。
与本发明的变异基因的具体核苷酸序列无关，该基因编码一种多肽，该多肽的特征在于它能够与一抗体特异性结合，该抗体能够与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8的任意序列特异性结合。
含有本发明的抗冻多肽或冰结合位点或冰结合域的融合多肽
本发明还包括抗冻融合多肽。本发明的抗冻融合多肽可能针对特定的细胞区室或细胞外间隙，针对特定的细胞或特定的细胞类型。通过将指定或确定目标的多肽片段连接到细胞区室，抗冻片段可能针对特定的细胞器。肽不仅针对该细胞器，而且被其他肽片段包围时抗冻功能仍发挥作用。通过与抗体或者结合中具有细胞特异性的其他分子融合，冷冻时对细胞损伤的抗性可以赋予这些细胞类型。该技术在器官方面也是有用的。以下列出可以与本发明的多肽相结合的多肽：
融合到(蛋白质) 融合的优势
蛋白质A 检测性，分泌自GRAM-阳性菌，纯化，易于切开以产生游离态
β-半乳糖苷酶 通过酶分析法测定，Western Blots上的可检测性
β-内酰胺酶 Western Blots上的检测性，分泌至GRAM-阴性菌的外周胞质
氯霉素乙酰基转移酶 Western Blots上的检测性，在植物提取物中通过酶分析法测定
与病原相关的多肽 从双子叶植物中分泌
α-淀粉酶 从单子叶植物中分泌
植物血球凝集素 针对植物中的液泡
RuBPCASE小亚基 针对植物中的叶绿体
菜豆蛋白 在种子中积聚
乙醇脱氢酶 在酵母中表达
α-交配因子 从酵母中分泌
荧光素酶 通过光发射检测
因此，含有本发明多肽的融合多肽可用于在重组宿主中表达本发明的多肽，并分离表达的多肽。融合多肽的一种类型包括从重组宿主细胞中引导本发明的多肽的肽。为了将本发明的多肽引入真核宿主细胞的分泌途径，将分泌信号序列(也称作信号肽、引导序列、前导序列或前序列)设置在适宜的表达载体中。分泌信号序列可能来源于本发明的多肽，适宜的信号序列也可能源于另一分泌多肽或者重新合成。该分泌信号序列可操作地与编码本发明序列的基因连接，使得两个序列在恰当的阅读框中接合并定位，以引导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码所关注的多肽的核苷酸序列的5′，然而某些分泌信号序列可能位于所关注的核苷酸序列的其他位置(例如，见Welch et al.，U.S.Pat.No.5,037,743；Holland et al.，U.S.Pat.No.5,143,830)。
虽然本发明基因的分泌信号序列或由哺乳动物细胞产生的其他多肽(例如，U.S.Pat.No.5,641,655中所述的组织型纤溶酶原激活信号序)可用于在重组哺乳动物细胞中表达本发明的基因，但对于酵母细胞中表达来说，酵母信号序列是优选的。适宜的酵母信号序列的实例包括来源于酵母交配信息素α-因子(由MF-α基因编码)、转化酶(由SUC2基因编码)或酸性磷酸酶(由PHO5基因编码)的那些。例如，见Romanos et al.，″Expression ofCloned Genes in Yeast，″DNA Cloning 2：A Practical Approach，2.sup.nd Edition，Glover and Hames(eds.)，pages 123167(Oxford University Press 1995)。
在细菌细胞中，人们常常希望将异源性多肽表达为融合多肽以降低毒性，增加稳定性，以及提高表达多肽的回收。例如，本发明的多肽可以表达为含有谷胱甘肽S-转移酶多肽的融合多肽。谷胱甘肽S-转移酶融合多肽通常是水溶性的，并且易于在固定的谷胱甘肽柱上从E.coli溶解物中提纯。以类似的方式，本发明含有麦芽糖结合多肽的融合多肽可以用直连淀粉树脂柱分离，而含有截断的多肽A基因的C-末端的融合多肽可以用IgG-Sepharose纯化。已经建立的用于将异源性多肽在细菌细胞中表达为融合多肽的技术已有描述，例如Williams et al.，″Expression of Foreign polypeptides in E.coli UsingPlasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies，″DNA Cloning2：A Practical Approach，2.sup.nd Edition，Glover and Hames(Eds.)，pages 1558(Oxford University Press 1995)。此外，商用表达系统是可以购买的。例如，PINPOINT Xa多肽纯化系统(Promega Corporation；Madison，Wis.)提供一种分离融合多肽的方法，该融合多肽含有一种在用含亲合素的树脂表达期间被生物素化的多肽。
用于通过原核或真核细胞表达来分离异源性多肽的肽标签包括聚组氨酸标签(其对镍螯合树脂具有亲和力)、c-myc标签、钙调素结合多肽(用钙调素亲和层析法分离)、P物质、RYIRS标签(其与抗-RYIRS抗体结合)、Glu-Glu标签以及FLAG标签(其与抗-FLAG抗体结合)。例如，见Luo etal.，Arch.Biochem.Biophys.329：215(1996)，Morganti et al.，Biotechnol.Appl.Biochem.23：67(1996)和Zheng et al.，Gene 186：55(1997)。编码这些肽标记的多核苷酸分子是可购买的，例如购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，Mo.)。
另一种形式的融合多肽含有本发明的多肽和免疫球蛋白重链恒定区(通常为Fc片段)，其含有两个恒定区域和一个铰链区，但没有可变区。例如，Chang et al.，U.S.Pat.No.5,723,125描述了一种含人干扰素和人免疫球蛋白Fc片段的融合多肽。干扰素的C-端通过肽连接头基团连接到Fc片段的N-端。肽连接头的一个实例是主要含有T细胞惰性序列的肽，其属于免疫惰性。一种示范性的肽连接头具有氨基酸序列GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ IDNO：91)。在该融合多肽中，优选的Fc基团是人γ4链，它在溶液中是稳定的并且几乎或根本没有补体激活活性。因此，本发明考虑的融合多肽，其含有本发明的多肽或其片段，以及人Fc片段，其中本发明的多肽或其片段的C-端经由肽连接头连接到Fc片段的N-端。
在另一变种中，含有本发明多肽的融合多肽进一步含有IgG序列。本发明的多肽基团共价地连接IgG序列的氨基末端和信号肽，该信号肽共价地连接本发明多肽的氨基端，其中IgG序列包括或者由以下元件按下列顺序组成：铰链区、CH2域、以及CH3域。相应地，IgG没有CH1域。本发明的多肽基团显示出冰结合活性。生产含有抗体和非抗体部分的融合多肽的以上常用方法在LaRochelle et al.，EP 742830(WO 95/21258)中已有描述。
融合多肽可以通过本领域技术人员已知的方法通过制备融合多肽的各个组分并且将它们化学地偶联来制备。或者，编码该融合多肽的两组分的多核苷酸用已知技术在恰当的阅读框中生成，并且用本文描述的方法来表达。融合多肽的酶和化学裂解的通用方法已有描述，例如Ausubel(1995)，pages 1619-1625。
生产本发明的多肽及其片段的通用方法
本发明的抗冻多肽的合成可以两种形式进行，或者生物学的或者合成的。生物学方法是通过表达编码序列或基因的多核苷酸；合成方法是通过化学合成多肽。
优选的合成方法利用固相肽合成，例如由Merrifield开发的那种(J.Am.Chem.Soc.，(1963)85：2149-2156)。该方法尤其用于测试特定的组合物或配方的抗冻活性。
为了大规模生产，生物学表达通常是优选的。编码多核苷酸或基因可以是带有重组修饰的天然基因或者完全合成的序列，其是在适当的表达系统中表达。将天然序列片段插入适当的载体中的方法是本领域普通技术人员熟知的，见Maniatis or Wu，et al.(1987)Methods in Enzymology，Vol.153，AcademicPress，New York，N.Y。
合成的序列可以通过亚磷酰胺化学法合成，以制备该序列的特定部分(Beaucage and Carruthers，(1981)Tet.Letters，22：1859-1862)。可以合成重叠部分然后将其连接在一起以产生较大的基因。
最后，通过选择抗冻片段的特定序列，可以引入限制性酶切位点，其可以提供便利的片段，它们易于连在一起或插入以生成串联重复序列，对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
抗冻多肽的纯化可以用多肽纯化领域的普通技术人员已知的方法进行。标准纯化技术可以是细胞裂解液，或者培养基(如果该多肽被分泌)。典型的方法是柱色谱法、硫酸铵盐沉淀法、抗体亲和柱层析法及其他。天然产生的多肽(例如，在鱼中产生)，优选的纯化方法在DeVries et al.(1977)Biochem Biophys.Acta 495：388-392中已有描述。
优选地，抗冻多肽被纯化至基本同质，通常至少约70％至80％纯度，优选地约90-95％纯度，最优选99％或更纯。通常，该多肽基本上是无污染物的天然相关的鱼化合物(fish compounts)。
从以上所述清楚地看出，本发明的多肽，包括全长多肽、功能性片段以及融合多肽，能够方便地按以下常规技术在重组宿主细胞中生产。
为了表达本发明的基因，编码多肽的多核苷酸必须可操作地与调控序列连接，然后再引入宿主细胞内，该调控序列控制表达载体中的转录表达。除了转录调控序列，例如启动子和增强子，表达载体可以含有翻译调控序列和标记基因，标记基因适用于筛选携带表达载体的基因。
适用于在真核细胞中生产外源性多肽的表达载体通常含有(1)编码细菌复制起源和抗生素抗性标记的原核DNA元件，为表达载体在细菌宿主中的生长和选择做准备；(2)控制转录起始的真核DNA元件，如启动子；和(3)控制转录进展的DNA元件，如转录终止/聚腺苷化序列。
如上所讨论，表达载体还可以包括编码分泌序列的核苷酸序列，其指导异源性多肽进入宿主细胞的分泌途径。例如，表达载体可包含本发明的基因和来自所述基因或其他分泌基因的分泌序列。
通常用于细菌的载体的实例包括pET系列(Novagen)、pGEX系列(Ge Healthcare)、pBAD-系列(Invitrogen)。酵母中的载体的实例是用于毕赤酵母属的pPic(Invitrogen)、来自Kluyveromyces lactis的pKlac体系(New England biolabs)、S.cereviseae载体(Patel，O.，Fearnley，R.，andMacreadie，I..3002.Saccharomyces cerevisiae expression vectors with thrombin-cleavable N-and C-terminal 6x(His)tags.Biotechnol Lett.200325(4)：331-334)，以及用于S.cereviseae的pYes体系(Invitrogen)。
真菌中使用的载体的实例是pBAR系列(在Pall，M.L.and J.Brunelli.1993.A series of six compact fungal transformation vectors containing polylinkerswith unique restrictions sites.Fungal Genetics Newsletter 40：59-61中有描述)。基于pIEx质粒的系统(Merck)或基于杆状病毒的系统(Merck)是用于昆虫细胞的系统的两个实例。类似的产品可购买自其他公司。
昆虫细胞中使用的载体的实例包括四环素调控系统pTet和pTre、基于腺病毒的系统Adeno-X、基于逆转录酶病毒的系统Rethro-X(全部来自Clontech)以及pcDNA载体(Invitrogen)。此外，还有更多的实例并且在市场上有售。
本发明的多肽可在哺乳细胞中表达。适宜的哺乳动物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚胎肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL 8544，ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44[Chasin et al.，Som.Cell.Molec.Genet.12：5551986])、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40-转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)以及小鼠胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。
对于哺乳动物宿主来说，转录的和翻译的调控信号可来源于病毒源，例如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猴病毒等，其中调控信号与特定的具有高表达水平的基因相关。适宜的转录和翻译调控序列还可以从哺乳动物基因获得，例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。
转录调控序列包含足以指导RNA开始合成的启动子区。适宜的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer et al.，J.Molec.Appl.Genet.1：273(1982))、疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355(1982))、SV40早期启动子(Benoist et al.，Nature 290：304(1981))、劳氏肉瘤病毒启动子(Gorman et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 79：6777(1982))、巨细胞病毒启动子(Foecking et al.，Gene 45：101(1980))以及小鼠乳房肿瘤启动子(总体见Etcheverry，″Expression of Engineered polypeptides in Mammalian Cell Culture，″polypeptide Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 163181(John Wiley&Sons，Inc.1996))。
或者，如果该原核启动子被真核启动子调控，则原核启动子，如噬菌体T3RNA聚合酶启动子，可以用于控制哺乳动物细胞中的基因表达(Zhou etal.，Mol.Cell.Biol.10：4529(1990)，Kaufman et al.，Nucl.Acids Res.19：4485(1991))。
表达载体可以用各种标准技术引入宿主细胞中，包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的传递、电穿孔等。转染的细胞可以被选择和繁殖以提供含有该表达载体的重组宿主细胞，该表达载体稳定地整合在该宿主细胞基因组中。
用于将载体引入真核细胞中的技术以及用显性可选标记选择那些稳定的转化体的技术已有描述，例如Ausubel(1995)以及Murray(ed.)，Gene Transferand Expression Protocols(Humana Press 1991)。因此本发明的基因可在更高级的真核生物中表达，例如禽类、真菌、昆虫、酵母菌及植物细胞。
例如，一种稳定的可选标记是对抗生素新霉素提供抗性的基因。在这种情况下，选择是在新霉素类药物的存在下进行，例如G-418或诸如此类。选择体系还可用于增加所关注的基因的表达水平，一种称为“扩增”的过程。扩增是通过在低水平选择剂的存在下培养转染子，然后增加选择剂的量以筛选细胞，这些细胞产生高水平的引入基因的产物。
适宜的扩增可选标记是二氢叶酸还原酶，其对甲氨喋呤具有抗性。其他药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)也可以使用。或者，引入改变表型的标记物，例如绿色荧光多肽，或细胞表面多肽，如CD4、CD8、Class I MHC、胎盘碱性磷酸酶，都可用于从未转染的细胞中通过如FACS分选或磁珠分离技术等手段来分选转染细胞。
还可以利用病毒传递系统，通过培养的哺乳动物细胞来生产本发明的多肽。用于此目的的示范性病毒包括重组腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和腺-相关病毒(AAV)。腺病毒，一种双链DNA病毒，是目前研究的最好的基因，用于传递异源性多核苷酸的基因转移载体(参见Becker et al.，Meth.CellBiol.43：161(1994)和Douglas and Curiel，Science&Medicine 4：44(1997))。腺病毒系统的优势包括相对较大的DNA插入物的适应性，增长到高滴度的能力，感染广泛的哺乳动物细胞类型的能力，以及允许使用大量可得的含有不同启动子的载体的灵活性。
通过删除腺病毒基因组的一部分，可以容纳较大的异源性DNA插入物(高达7kb)。这些插入物可以通过直接连接或通过与共转染的质粒的同源重组来掺入病毒DNA中。一种选择是从病毒载体中删除基本的E1基因，这导致复制不能进行，除非由宿主细胞提供E1基因。例如感染腺病毒载体的人293细胞(ATCC No.CRL-1573、45504、45505)可以生长为粘附细胞或者在相对高细胞浓度下悬浮培养以生产大量多肽(见Garnier et al.，Cytotechnol.15：145(1994))。
生成转基因生物的方法是本领域已知的，参见表3：
细菌、酵母和真菌 简单地通过引入相关的表达质粒来获得转基因生物。本文其他地方
列出了此类方法。
昆虫 Li W，Jin L，An L.2003.Construction of targeting vector and expression
of green fluorescent polypeptide in the silkworm，Antheraea pernyi.
DNA Cell Biol.22：441-6.Yamao M，Katayama N，Nakazawa H，
Yamakawa M，Hayashi Y，Hara S，Kamei K，Mori H.1999.
Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus.Genes Dev.
13：511-6.Allen ML，Scholl PJ.2005.Quality of transgenic laboratory
strains of Cochliomyia hominivorax(Diptera：Calliphoridae).J Econ
Entomol.98：2301-6.
植物 见专利第47页(Horsch et al.，Science 227：1229(1985)，Klein et
al.，Biotechnology 10：268(1992)，以及Miki et al.，″Procedures for
Introducing Foreign DNA into Plants，″Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology，Glick et al.(eds.)，pages 6788(CRC
Press，1993).
鱼 Rembold M，Lahiri K，Foulkes NS，Wittbrodt J.2006.Transgenesis in
fish：efficient selection of transgenic fish by co-injection with a
fluorescent reporter construct.Nature Protocols 1：1133-9
Rahman MA，Mak R，Ayad H，Smith A，Maclean N.1998.Expression of
a novel piscine growth hormone gene results in growth enhancement in
transgenic tilapia(Oreochromis niloticus).Transgenic Res.7：357-69.
Uzbekova S，Chyb J，Ferriere F，BailhacheT，Prunet P，Alestrom P，
Breton B.2000.Transgenic rainbow trout expressed sGnRH-antisense
RNA under the control of sGnRH promoter of Atlantic salmon.
J Mol Endocrinol.25：337-50.
动物 Nagashima H，Fujimura T，Takahagi Y，Kurome M，Wako N，Ochiai T，
Esaki R，Kano K，Saito S，Okabe M，Murakami H.2003.Development of
efficient strategies for the production of genetically modified pigs.
Theriogenology.59：95-106
Lai L，Prather RS.2003.Creating genetically modified pigs by using
nuclear transfer.Reprod Biol Endocrinol.1：82
Hofmann A，Kessler B，Ewerling S，Weppert M，Vogg B，Ludwig H，
Stojkovic M，Boelhauve M，Brem G，Wolf E，Pfeifer A.2003.Efficient
transgenesis in farm animals by lentiviral vectors.EMBO Rep.4：1054-60.
DNA显微注射 (Gordon，J.W.and Ruddle，F.H.1981.Integration and stable germ line
transformation of genes injected into mouse pronuclei.Science
214：1244-1246)，
胚胎干细胞介导的 Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell line.
基因转移 Proc.Natl.Acad.Sci.83：9065-9069)
逆转录酶病毒介导 Jaenisch，R.1976.Germ line integration and Mendelian transmission of
的基因转移 the exogenous Moloney leukemia virus.Proc.Natl.Acad.Sci.73：1260-
1264)
杆状病毒系统提供有效的手段以将本发明克隆的基因引入昆虫细胞中。适宜的表达载体是基于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)，并且含有众所周知的启动子，如果蝇热休克多肽(hsp)70启动子、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒即刻早期基因启动子(ie-1)和延迟早期39K启动子、杆状病毒p10启动子以及果蝇金属硫蛋白启动子。
用于制备重组杆状病毒的第二种方法采用了Luckow描述的基于转座子的系统(Luckow，et al.，J.Virol.67：4566(1993))。使用转移载体的这种系统是以BAC-to-BAC试剂盒销售(Life Technologies，Rockville，Md.)。该系统使用含有Tn7转座子的转移载体，PFASTBAC(Live Technologies)，以将编码本发明多肽的DNA移动到保持在E.coli中的杆状病毒基因组内，成为一种大的称作“杆粒”的质粒。见Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，et al.，J.Gen.Virol.75：1551(1994)和Chazenbalk，andRapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。
此外，转移载体可以包括与DNA的框内融合，该DNA编码本发明的表达多肽的C-或N-端的表位标记，如Glu-Glu表位标记(Grussenmeyer et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.82：7952(1985))。使用本领域已知的技术，将含有本发明基因的转移载体转化到E.coli，并筛选杆粒，该杆粒含有指示重组杆状病毒的中断lacZ基因。然后用常规技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA。
该说明性的PFASTBAC载体可以在很大程度上被修饰。例如，多角体启动子可以被除去并用杆状病毒基本多肽启动子替代(也称作Pcor、p6.9或MP启动子)，其在杆状病毒感染中较早表达，并且显示对表达分泌多肽是有利的(例如，见Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，et al.，J.Gen.Virol.75：1551(1994)和Chazenbalk and Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995))。在这种转移载体构建体中，可以使用基本多肽启动子的短或长的形式。而且，可以构建转移载体，其用来自昆虫多肽的分泌信号序列代替本发明多肽的天然分泌信号序列。例如，来自蜕皮激素葡糖基转移酶(EGT)的分泌信号序列、蜜蜂蜂毒肽(Invitrogen Corporation；Carlsbad，Calif.)、或杆状病毒gp67(PharMingen：San Diego，Calif.)都可用于构建体中以代替天然分泌信号序列。
将重组病毒或杆粒用于转染宿主细胞。适宜的昆虫宿主细胞包括来源于IPLB-Sf-21的细胞系，一种草地夜蛾蛹卵巢细胞系，例如Sf9(ATCC CRL1711)、Sf21AE和Sf21(Invitrogen Corporation；San Diego，Calif.)，以及果蝇Schneider-2细胞、来源于粉纹夜蛾(T.ni)的HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)(U.S.Pat.No.5,300,435)。商业购买的无血清培养基可以用于培养和维持这些细胞。适宜的培养基是用于Sf9细胞的Sf900IITM(LifeTechnologies)或ESF 921TM(Expression Systems)；以及用于T.ni细胞的Ex-cellO405TM(JRH Biosciences，Lenexa，Kans.)或Express FiveOTM(LifeTechnologies)。当使用重组病毒时，细胞通常从约2～5×105细胞的接种密度生长到1～2×106细胞，届时在感染复数(MOI)为0.1至10，更典型地在接近3时，添加重组病毒保存株。
已建立的用于在杆状病毒系统中生产重组多肽的技术由Bailey et al.，″Manipulation of Baculovirus Vectors，″在Methods in Molecular B iology，Volume7：Gene Transfer and Expression Protocols，Murray(ed.)，pages 147168(TheHumana Press，Inc.1991)；Patel et al.，″The baculovirus expression system，″DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，pages 205244(Oxford University Press 1995)；Ausubel(1995)在pages 1637至1657；Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)，以及Lucknow，″Insect Cell Expression Technology，″在polypeptide Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 183218(John Wiley&Sons，Inc.1996)提供。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可以用于表达本文所描述的基因。在这方面尤其关注的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。适宜的在酵母中表达的启动子包括GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(乙醇脱氢酶)、AOX1(乙醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等的启动子。许多酵母克隆载体已经被设计出并且易于得到。这些载体包括基于YIp的载体，如YIp5；YRp载体，如YRp17；Yep载体，如YEp13；以及YCp载体，如YCp19。用外源DNA转化酿酒酵母细胞的方法以及由其生产重组多肽的方法已被公开，例如Kawasaki，U.S.Pat.No.4,599,311，Kawasaki et al.，U.S.Pat.No.4,931,373，Brake，U.S.Pat.No.4,870,008，Welch et al.，U.S.Pat.No.5,037,743，以及Murray et al.，U.S.Pat.No.4,845,075。通过可选标记确定的表型、常见的药物抗性或者在缺乏特定营养素(如，亮氨酸)时的生长能力，来选择转化细胞。在酿酒酵母中使用的适宜载体系统是Kawasaki等人(U.S.Pat.No.4,931,373)公开的POT1载体系统，其可以通过在含葡萄糖的培养基中的生长来选择转化细胞。酵母中使用的其他适宜的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(例如，见Kawasaki，U.S.Pat.No.4,599,311，Kingsman et al.，U.S.Pat.No.4,615,974和Bitter，U.S.Pat.No.4,977,092)和乙醇脱氢酶基因的那些。又见U.S.Pat.No.4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。适用于酵母的常用和/或商业可得的载体的其他实例是pPic系列(Invitrogen)，来自Kluyveromyces lactis的pKlac系统(New EnglandBiolabs)，以及用于S.cerevisae的S.cerevisae载体(Patel et al.，Biotechnology letters 2003 vol 25(4)：331-334)和pYes系统(Invitrogen)。在真菌中可以使用pBAR系列(Pall et al.，1993vol.40：59-61，Functional GeneticsNewsletter)。
其他酵母的转化系统都是本领域已知的，包括多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦牙糖念珠菌(Candida maltosa)。例如，见Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.132：3459(1986)和Cregg，U.S.Pat.No.4,882,279。根据McKnight et al.，U.S.Pat.No.4,935,349的方法，可使用曲霉细胞。Sumino et al.，U.S.Pat.No.5,162,228公开用于转化产黄头孢霉的方法。Lambowitz，U.S.Pat.No.4,486,533公开了用于转化脉孢菌属的方法。
例如，甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组多肽的用途被Raymond，U.S.Pat.No.5,716,808、Raymond，U.S.Pat.No.5,736,383、Raymond et al.，Yeast 14：1123(1998)以及国际公布No.WO 97/17450，WO 97/17451，WO 98/02536和WO 98/02565公开。在转化P.methanolica中使用的DNA分子通常被制备为双链、环状质粒，其可以在转化之前被线性化。对于在P.methanolica中生产多肽来说，质粒中的启动子和终止子可以是P.methanolica基因的那些，如P.methanolica乙醇利用基因(AUG1或AUG2)。其他有用的启动子包括二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的那些。为了促进DNA在宿主染色体中的整合，优选的是使质粒的整个表达片段位于宿主DNA序列两端的侧翼。在甲醇毕赤酵母中使用的适宜的可选标记是P.methanolica ADE2基因，其编码磷酸核糖-5-氨基咪唑羧化脢(AIRC；EC 4.1.1.21)，并且能够使ADE2宿主细胞在缺乏腺嘌呤的情况下生长。对于希望甲醇用量最小的大规模工业处理来说，有可能使用两种甲醇利用基因(AUG1和AUG2)都缺失的宿主细胞。对于分泌多肽的生产，可以使用缺少液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主细胞。可利用电穿孔来帮助将质粒引入P.methanolica细胞，该质粒含有编码所关注多肽的DNA。P.methanolica细胞可以通过电穿孔来转化，使用场强度为2.5至4.5kV/cm的指数衰减脉冲电场，优选约3.75kV/cm，时间常数为1至40毫秒，最优选约20毫秒。
表达载体也可以引入植物原生质体、完整的植物组织、或分离的植物细胞中。将表达载体引入植物组织的方法包括用根癌农杆菌、基因枪法介导的传递、DNA注入、电穿孔等直接侵染或共培养植物组织。例如，见Horsch etal.，Science 227：1229(1985)，Klein et al.，Biotechnology 10：268(1992)和Miki etal.，″Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，″Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Glick et al.(eds.)，pages 6788(CRC Press，1993)。
或者，本发明的基因可以在原核宿主细胞中表达。可以用于在原核细胞中表达本发明多肽的适宜的启动子是本领域技术人员所熟知的，包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR与PL启动子，E.coli的trp、recA、热击、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和lacZ启动子，B.subtilis的启动子，芽孢杆菌的噬菌体的启动子，链霉菌启动子，噬菌体λ的int启动子，pBR322的bla启动子，以及氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子在Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)，Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4th Ed.(Benjamin Cummins 1987)和Ausubel et al.(1995)中已有评论。
适宜的原核宿主包括E.coli和芽孢杆菌属。适宜的E.coli菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(例如，见Brown(ed.)，Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991))。适宜的芽孢杆菌属菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(例如，见Hardy，″Bacillus Cloning Methods，″DNACloning：A Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press 1985))。
当在细菌如E.coli中表达本发明的多肽时，该多肽可保留在细胞质中，通常为不溶性颗粒，或者可被细菌分泌序列引导至周质间隙。在前一种情况下，将细胞溶解，并且用如异硫氰酸胍或尿素来回收颗粒并使其变性。然后通过稀释该变性剂，例如通过透析尿素的溶液以及还原与氧化的谷胱甘肽的组合物，接着透析缓冲盐溶液，该变性的多肽可以被重折叠和二聚化。在后一种情况下，通过破坏细胞(例如，通过超声处理或渗透性冲击)以释放周质间隙的内容物并回收多肽，该多肽可以从周质间隙以可溶的和功能性的方式被回收，从而省却了变性和重折叠。
在原核宿主中表达多肽的方法是本领域技术人员熟知的(例如，见Williams et al.，″Expression of foreign polypeptides in E.coli using plasmidvectors and purification of specific polyclonal antibodies，″DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page 15(Oxford UniversityPress 1995)，Ward et al.，″Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，″Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995)和Georgiou，″Expression of polypeptides in Bacteria，″polypeptideEngineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，page 101(John Wiley&Sons，Inc.1996))。
将载体引入细菌、酵母、昆虫和植物细胞的标准方法已有提供，例如Ausubel(1995)。
表达和回收由哺乳动物细胞体系产生的外源多肽的一般方法已有提供，例如Etcheverry，″Expression of Engineered polypeptides in Mammalian CellCulture，″polypeptide Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 163(Wiley-Liss，Inc.1996)。回收由细菌体系产生的多肽的标准技术已有提供，例如Grisshammer et al.，″Purification of over-produced polypeptidesfrom E.coli cells，″DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，pages 5992(Oxford University Press 1995)。已建立的从杆状病毒体系中分离重组多肽的方法由Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(TheHumana Press，Inc.1995)公开。
另外，本发明的多肽可以通过专门的固相合成、部分固相法、片段缩合或经典溶液合成法来合成。这些合成方法是本领域技术人员熟知的(例如，见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963)，Stewart et al.，″Solid Phase PeptideSynthesis″(2nd Edition)，(Pierce Chemical Co.1984)，Bayer and Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3(1986)，Atherton et al.，Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach(IRL Press 1989)，Fields and Colowick，″Solid-Phase Peptide Synthesis，″Methods in Enzymology Volume 289(Academic Press 1997)和Lloyd-Williams etal.，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and polypeptides(CRCPress，Inc.1997))。化学合成总策略的变化，如“自然化学连接”和“表达多肽连接”都是标准的(例如，见Dawson et al.，Science 266：776(1994)，Hackeng etal.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 94：7845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.287：34(1997)，Muir et al，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95：6705(1998)和Severinov andMuir，J.Biol.Chem.273：16205(1998))。
本发明涉及含有本文所述的肽或多肽的组合物。这些组合物可以进一步包含载体。载体可以是常规的有机或无机载体。载体的实例包括水、缓冲液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。
本发明多肽的分离
就污染大分子，尤其是其他多肽和多核苷酸来说，本发明的多肽可以纯化到至少约80％纯度、至少约90％纯度、至少约95％纯度、甚至大于95％纯度，并且不含传染性和高热的物质。本发明的多肽还可以纯化到大于99.9％纯度的药学纯态。在特定制备中，纯的多肽基本没有其他多肽，尤其是其他动物源多肽。
分级分离和/或常规纯化方法可以用于从天然源中提纯获得本发明多肽的制剂，从重组宿主细胞中提纯获得本发明的重组多肽以及本发明的融合多肽。一般地，硫酸铵沉淀以及酸或离液剂提取可用于样本的分级分离。示范性的纯化步骤可包括羟磷灰石、体积排阻、FPLC和反相高效液相色谱法。适宜的色谱介质包括衍生右旋糖酐、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特色硅酸盐等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是优选的。示范性的色谱介质包括以苯基、丁基、辛基衍生的那些，如苯基-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，Pa.)、辛基-琼脂糖凝胶(Pharmacia)等；或聚丙烯树脂，如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适宜的固体载体包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等，它们在使用条件下是不溶的。这些载体可用反应基团修饰，使多肽被氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化合物基团连接起来。
偶联化学物质的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧活化、巯基活化、酰肼活化、以及碳二亚胺偶联化学物的羧基和氨基衍生物。这些及其他固体媒介是本领域熟知和广泛使用的，并且可以从商业供应商购得。多肽分离和纯化的具体方法的选择是常规设计方面的问题，并且在某种程度上是由所选载体的性质来确定。例如，见Affinity Chromatography：Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988)和Doonan，polypeptide Purification Protocols(The Humana Press 1996)。
本发明多肽的分离和纯化中的额外变化可以由本领域技术人员进行设计。例如，识别如下所得的本发明多肽及其片段的特异性抗体，可以用于通过免疫亲和纯化法来分离大量多肽。
本发明的多肽还可以通过采用特定属性来分离。例如，固定化金属离子吸附(IMAC)色谱可以用于纯化富组氨酸的多肽，包括那些含有聚组氨酸标记的多肽。简言之，凝胶首先带上二价金属离子以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。富组氨酸的多肽会根据所用的金属离子，以不同的亲和力吸附到该基质上，并且通过竞争性洗脱或使用强螯合剂来洗脱，降低pH。其他纯化方法包括用凝集素亲和色谱和离子交换色谱法纯化糖基化多肽(M.Deutscher，(ed.)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明另外的实施方式中，可以构建所关注多肽与亲和标签(如麦芽糖结合多肽、免疫球蛋白域)的融合物，以促进纯化。
如上所述，本发明的多肽及其片段还可以通过化学合成来制备。本发明的多肽可以是单体或多聚体；糖基化的或非糖基化的；聚乙二醇化的或非聚乙二醇化的；并且可包括或不包括最初的蛋氨酸氨基酸残基。
本发明多肽的特异性抗体的生产
本发明的冰结合多肽及其片段的抗体可以通过在适宜的宿主生物中将含有本发明基因的表达载体所产生的产物作为抗原来获得，或者通过使用从天然源中分离的或用任意常规固相合成法合成的本发明的多肽来获得，尤其有用的抗体与本发明的多肽“特异性结合”。如果抗体表现出以下两个性质中的至少一个，则该抗体视为特异性结合：(1)抗体以结合活性的阈值水平与本发明的多肽结合，和(2)抗体与那些和本文以下限定的本发明多肽相关的多肽没有明显地交叉反应。
至于第一个特征，如果抗体结合多肽、肽或表位的结合亲和度(Ka)为106M-1或更高，则抗体为特异性结合，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高。该抗体的结合亲和力可以被本领域的普通技术人员很容易地测定，例如通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660(1949))。至于第二个特征，例如，在标准的Western blot分析中，如果抗体检测到本发明的多肽，但没有检测到以相似或相同量加入的已知多肽，则抗体没有与相关的多肽分子显著地交叉反应。
本发明的抗体可以利用承载抗原表位的肽或多肽来生产。本发明的承载抗原表位的肽和多肽优选地含有任意SEQ ID NO：5至12中包含的至少4个，或15至约30个氨基酸序列。然而，包含本发明氨基端序列中较大部分的肽或多肽，如包含30至50个氨基酸，或任意长度的达到及包含本发明多肽的整个氨基酸序列，也可以用于诱导与本发明的多肽相结合的抗体。人们希望的是，选择表位承载肽的氨基酸序列，以提供在水性溶剂中的大的溶解性(即，该序列含有相对亲水的残基，而疏水的残基优选地被消除)。此外，也可能需要含有脯氨酸残基的氨基酸序列用于抗体生产。
例如，可用Jameson-Wolf法识别(Jameson and Wolf，CABIOS 4：181，(1988))，按照LASERGENE(DNASTAR；Madison，Wis.)的PROTEAN程序(3.14版)鉴定本发明多肽的潜在抗原位点。该分析中使用缺省参数。
通过将用于多肽结构预测的六个主要子程序相结合，Jameson-Wolf法预测了潜在的抗原决定簇。简言之，首先，用Hopp-Woods方法(Hopp et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 78：3824(1981))识别代表最大的局部亲水区域的氨基酸序列(参数：平均7个残基)。在第二步，用Emini的方法(Emini et al.，J.Virology 55：836(1985))计算表面概率(参数：表面判定阈值(0.6)＝1)。第三，用Karplus-Schultz法(Karplus and Schultz，Naturwissenschaften 72：212(1985))预测主链灵活性(参数：灵活性阈值(0.2)＝1)。在分析的第四和第五步中，将二级结构预测应用到该数据中，用Chou-Fasman法预测多肽结构和多肽构象的原则(Chou，″Prediction of polypeptide Structural Classesfrom Amino Acid Composition，″Prediction of polypeptide Structure and thePrinciples of polypeptide Conformation，Fasman(ed.)，pages 549586(PlenumPress 1990)和Garnier-Robson，Garnier et al.，J.Mol.Biol.120：97(1978))(Chou-Fasman参数：构象表＝64种多肽；α区阈值＝103；β区阈值＝105；Garnier-Robson参数：α和β决定常数＝0)。在第六个子程序中，将弹性参数和亲水性/溶解可接触性因素结合起来以确定表面轮廓值，指定为“抗原指数”。最后，将峰值扩大功能应用于该抗原指数，其扩展主要表面峰，使各个峰值增加20、40、60或80％，以说明相对内部区域而言，来自表面区域的移动性的额外自由能。然而，该计算并不适用于任何保留在螺旋区的主要峰，因为螺旋区往往不太灵活。
针对重组多肽或从天然源分离的多肽的多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的方法制备，例如，见Green et al.，″Production of Polyclonal Antisera，″Immunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages 1to 5(Humana Press 1992)和Williams et al.，″Expression of foreign polypeptides in E.coli using plasmidvectors and purification of specific polyclonal antibodies，″在DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page 15(Oxford UniversityPress 1995)。可以通过使用佐剂来增加多肽的免疫原性，如铝(氢氧化铝)或Freund′s完全或不完全佐剂。用于免疫的多肽还包括融合多肽，例如，本发明的多肽或其部分与免疫球蛋白多肽，或者与麦芽糖结合蛋白的融合物。该多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样”，则这个部分可有利地接合或连接到用于免疫的大分子载体上(钥孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)。
虽然多克隆抗体典型地出现在动物，如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中，但特异性针对本发明多肽的抗体也可能来源于非人灵长类动物抗体。例如，在狒狒中培养对诊断和治疗有用的抗体的通用技术可以在Goldenberg et al.，国际专利公布No.WO 91/11465和Losman et al。Int.J.Cancer 46：310(1990)中找到。
此外，可以生成特异性针对本发明多肽的单克隆抗体。特异性抗原的鼠类单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法来获得(例如，见Kohler etal.，Nature 256：495(1975)，Coligan et al.(eds.)，Current Protocols in Immunology，Vol.1，pages 2.5.12.6.7(John Wiley&Sons 1991)[″Coligan″]，Picksley et al.，″Production of monoclonal antibodies against polypeptides expressed in E.coli，″在DNA Cloning 2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page 93(Oxford University Press 1995))。
简言之，单克隆抗体可以通过以下方法获得：用含有基因产品的组合物注射小鼠，通过抽取血清样品证实抗体产品的存在，摘除脾脏以获得B淋巴细胞，将该B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆体，培养产生抗原抗体的该克隆体，并从杂交瘤培养物中分离该抗体。
另外，特异性针对本发明多肽的抗体可来源于人单克隆抗体。人单克隆抗体获取自转基因小鼠，该小鼠经工程设计以产生对抗原激发作出应答的特异性人抗体。在这项技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入小鼠品系中，该品系来源于含有靶向断裂的内源性重链和轻链基因座的胚胎干细胞系。转基因小鼠可以合成特异性针对人抗原的人抗体，并且该小鼠可以用于生产人类分泌抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法已有描述，例如Green et al.，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg et al.，Nature 368：856(1994)和Taylor et al.，Int.Immun.6：579(1994)。
单克隆抗体可以通过各种完善技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这些分离技术包括蛋白-A琼脂糖凝胶的亲和色谱法，体积排阻色谱法，和离子交换色谱法(例如，见Coligan，pages 2.7.12.7.12和pages 2.9.12.9.3；Baines etal.，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)，″Methods in Molecular Biology，Vol.10，pages 79104(The Humana Press，Inc.1992))。
对于具体应用来说，可能需要制备特异性针对本发明多肽的抗体片段。例如，这种抗体片段可以通过抗体的蛋白酶水解来获得。抗体片段可以通过常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶进行抗体的酶裂解来生产，以提供一种表示F(ab′)2的5S片段。该片段可以进一步用巯基还原剂裂解，以生产3.5S Fab′单价片段。可选择地，该裂解反应可以用双硫键裂解产生的硫氢基的保护基来进行。作为替代方案，使用胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法已有描述，例如Goldenberg，U.S.Pat.No.4,331,647；Nisonoff et al.，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)和Edelman et al.Coligan，二者均见Methods in Enzymology Vol.1，(AcademicPress 1967)。
裂解抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步裂解，或其他酶、化学或基因技术也可使用，只要该片段与完整抗体识别的抗原相结合。
例如，Fv片段包括VH和VL链的结合。该结合可以是非共价的，正如Inbar et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659(1972)所述。或者，不同的链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质如戊二醛连接(例如，见Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992))。
Fv片段可包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)可以通过构建包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL域的DNA序列的结构基因来制备。将该结构基因插入表达载体，接着将其引入宿主细胞，如E.coli。该重组宿主细胞合成单一的多肽链，用连接肽桥接这两个V域。用于生产scFvs的方法已有描述，例如Whitlow et al.，Methods：A Companionto Methods in Enzymology 2：97(1991)(又见，Bird et al.，Science 242：423(1988)，Ladner等，美国专利No.4,946,778，Pack et al.，Bio/Technology 11：1271(1993)和Sandhu，上文)。
例如，scFV可以通过在体外将淋巴细胞暴露于多肽中，并在噬菌体或类似载体中选择抗体展示库(如，通过使用固定的或标记的多肽或肽)来获得。编码有潜在多肽结合域的多肽的基因可以通过筛选展示在噬菌体(噬菌体展示)或细菌(如E.coli)上的随机肽库来获得。编码该多肽的核苷酸序列可以以多种方式获得，例如通过随机突变和随机多核苷酸合成。这些随机肽展示库可用于筛选与已知目标相互作用的肽，该目标可以是多肽或多肽，例如配体或受体，生物的或合成的大分子，或有机或无机物。用于创建和筛选这些随机肽展示库的技术是本领域已知的(Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,223,409，Ladner et al.，U.S.Pat.No.4,946,778，Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,403,484，Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,571,698，和Kay et al.，Phage Display ofPeptides and polypeptides(Academic Press，Inc.1996))，并且随机肽展示库和用于筛选这些库的试剂盒都是商业可得的，例如购自CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，Calif.)，Invitrogen Inc.(San Diego，Calif.)，NewEngland Biolabs，Inc.(Beverly，Mass.)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，N.J.)。随机肽展示库可用本文公开的序列筛选，以识别与其相结合的多肽。
抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码感兴趣的抗体CDR的基因来获得。例如，这些基因可利用聚合酶链反应制备，由抗体生成细胞的RNA合成可变区(例如，见Larrick et al.，Methods：A Companion to Methods in Enzymology2：106(1991)，Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application，Ritter etal.(eds.)，page 166(Cambridge University Press 1995)和Ward et al.，″GeneticManipulation and Expression of Antibodies，″在Monoclonal Antibodies：Principlesand Applications，Birch et al.，(eds.)，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995))。
或者，特异性针对本发明多肽的抗体可来源于“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体可以通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补决定区转入人可变区来生产。然后人抗体的典型残基在小鼠对应物的框架区内被取代。来源于人源化单克隆抗体的抗体成分的应用排除了与小鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问题。用于克隆小鼠免疫球蛋白可变域的通用技术已有描述，例如Orlandi et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)。用于生产人源化单克隆抗体的技术已有描述，例如Jones et al.，Nature 321：522(1986)，Carter et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，Singer et al.，J.Immun.150：2844(1993)，Sudhir(ed.)，Antibody Engineering Protocols(Humana Press，Inc.1995)，Kelley，″Engineering Therapeutic Antibodies，″polypeptide Engineering：Principles andPractice，Cleland et al.(eds.)，pages 399434(John Wiley&Sons，Inc.1996)以及Queen et al.，U.S.Pat.No.5,693,762(1997)。
通过采用标准技术，用特异性针对本发明多肽的抗体或抗体片段免疫动物，可以制备多克隆抗独特型抗体。例如，见Green et al.，″Production ofPolyclonal Antisera，″Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols，Manson(ed.)，pages 1-12(Humana Press 1992)。又见Coligan，pages 241-247。或者，单克隆抗独特型抗体可以用特异性针对本发明多肽的抗体或抗体片段作为免疫源，用如上所述的技术来制备。另一种替代方案，可以用上述技术制备人源化抗独特型抗体或非人灵长类动物抗独特型抗体。用于生产抗独特型抗体的方法已有描述，例如Irie，U.S.Pat.No.5,208,146，Greene，et.al.，U.S.Pat.No.5,637,677和Varthakavi and Minocha，J.Gen.Virol.77：1875(1996)。
宿主细胞及其相关用途
含有本发明多肽的宿主细胞可以举例为动物细胞、哺乳动物宿主细胞、昆虫细胞、鱼细胞、真菌细胞、酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。
天然的或合成的编码本发明抗冻多肽的核酸片段可并入多核苷酸结构中，该结构能够引入最终的靶向表达细胞中和/或在最终的靶向表达细胞中表达。通常，该多核苷酸构建体适合在单细胞或多细胞宿主(例如酵母或细菌)中复制，但也可用于引入和整合在培养的哺乳动物或其他真核细胞系的基因组中，尤其是植物。制备的用于引入细菌或酵母的多核苷酸构建体包括：被宿主识别的复制体系，编码所需要的抗冻多肽产物的多核苷酸片段，与编码抗冻多肽的多核苷酸序列的5′端相连的转录及翻译起始调控序列，以及与该序列的3′端相连的转录及翻译终止调控序列。转录调控序列包括被宿主识别的异源启动子。方便地，可采用现成可用的表达载体，其包含复制体系、转录及翻译调控序列、以及抗冻多肽编码序列的插入位点。
该基因将包含任意的含有抗冻多肽的编码序列的多核苷酸片段。通常，该基因包含所述编码序列加上上游和下游相关序列，尤其是任意的增强子、启动子、核糖体结合位点或转录起始标记。下游片段对信息聚腺苷酸化和处理而言也可能很重要，因此在通常情况下都考虑在内。
将基因引入细胞或细胞组中进行表达是通常将多肽引到关注的样本内的另一种方法。转化的终产物也应纳入作为本发明的产物，并且术语“转化细胞”包括实际转化的细胞以及该细胞的所有子代。在典型的情况下，最终生物包含的每个细胞中都含有该基因。标准转化程序适用于细菌(Maniatis)、真菌(Sherman et al.(1986)，在Laboratory Course Manual for Methods in YeastGenetics CSH)、植物(van den Elzen et al.(1985)Plant Mol.Biol.，5：149-154)和动物(Hanahan，(1988)Ann.Rev.Genetics，22：479-519)。
酵母和真菌宿主细胞
适用于本发明的酵母宿主细胞的非限制性实例包括来自酵母菌科家族的酵母，包括Saccharomyces和Candida属的成员。优选的实例包括但不限于：脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、酿酒酵母(Saccharomycescervisae)、乳酸酵母(Saccharomyces lactis)、伪热带念珠菌(Candidapseudotropicalis)。
细菌
细菌细胞可用作本发明的宿主细胞，用于生产本发明的多肽。
细菌，如乳酸杆菌以及许多酵母菌和霉菌，在发酵食品，如奶酪、酱菜、酱油、泡菜、醋、酒和酸奶的制备中已经使用了几千年。
本发明的抗冻多肽可用于保持制备那些食品所用的微生物的生存能力，并用于制备益生元和益生菌食用组合物，包括动物饲料组合物和供人类消费的食品。
与本发明相关且适合作为本发明宿主细胞的优选的细菌实例有大肠杆菌(Escherichia coli)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、柠胶链球菌(Leuconostoc citrovorum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、德氏乳酸杆菌属保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus.casei)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
细菌还可以作为杀虫剂的替代品用在生物虫害控制计划中。本发明在一种实施方式中尤其适用于这种用途，并且提供含有本发明多肽及产生本发明多肽的重组微生物，其能够用作环保的生物杀虫剂。一个实例是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，一种革兰氏阳性土壤细菌。
适合本发明使用的细菌宿主细胞的进一步非限制性的实例包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。优选的细菌细胞也可以选自革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性球菌和革兰氏阴性杆菌。适合本发明使用的细菌宿主细胞的实例包括但不限于选自以下属的细菌：Acaricomes、Acetitomaculum、Acetivibrio、Acetobacter、Acetobacterium、Acetobacteroides、Acetohalobium、Acetomicrobium、Acetomonas、Acetonema、Achromobacter、Acidaminobacter、Acidaminococcus、Acidicaldus、Acidimicrobium、Acidiphilium、Acidithiobacillus、Acidobacterium、Acidocaldus、Acidocella、Acidomonas、Acidovorax、Acinetobacter、Acrocarpospora、Actinacidiphilus、Actinoacidiphilus、Actinoalloteichus、Actinobacillus、Actinobaculum、Actinobifida、Actinobispora、Actinocatenispora、Actinocorallia、Actinokineospora、Actinomadura、Actinomyces、Actinoplanes、Actinopolyspora、Actinopycnidium、Actinospica、Actinosporangium、Actinostreptospora、Actinosynnema、Actinotalea、Actinotelluria、Adhaeribacter、Aequorivita、Aerobacter、Aerococcus、Aerococcus-like Organism、Aeromicrobium、Aeromonas、Aestuariibacter、Afipia、Agarbacterium、Aggregatibacter、Agitococcus、Agreia、Agrobacterium、Agrococcus、Agromonas、Agromyces、Ahrensia、Albidovulum、Alcaligenes、Alcanivorax、Algibacter、Algicola、Algoriphagus、Alicycliphilus、Alicyclobacillus、Alishewanella、Alistipes、Alkalibacillus、Alkalibacter、Alkalibacterium 、Alkalilimnicola 、Alkalispirillum、Alkanindiges、Allisonella、Allobaculum、Allochromatium、Allofustis、Alteromonas、Alysiella、Aminobacter、Aminobacterium、Aminomonas、Ammonifex、Ammoniphilus、Amoebobacter、Amorphosporangium、Amphibacillus、Ampullariella、Amycolata、Amycolatopsis、Anaeroarcus、Anaerobacter、Anaerobaculum、Anaerobiospirillum、Anaerobranca、Anaerocellum、Anaerococcus、Anaerofilum、Anaerofustis、Anaerolinea、Anaeromusa、Anaerophaga、Anaeroplasma、Anaerosinus、Anaerostipes、Anaerotruncus、Anaerovibrio、Anaerovirgula、Anaerovorax、Ancalomicrobium、Ancylobacter、Aneurinibacillus、Angiococcus、Angulomicrobium、Anoxybacillus、Antarctobacter、Aquabacter、Aquabacterium、Aquamicrobium、Aquaspirillum、Aquicella、Aquifex、Aquiflexum、Aquimarina、Aquimonas、Arcanobacterium、Archangium、Arcicella、Arcobacter、Arenibacter、Arhodomonas、Arizona、Arsenicicoccus、Arsenophonus、Arthrobacter、Asanoa、Asiosporangium、Asticcacaulis、Astrosporangium、Atopobium、Atopococcus、Atopostipes、Aurantimonas、Aureobacterium、Avibacterium、Axonoporis、Azoarcus、Azohydromonas、Azomonas、Azorhizobium、Azorhizophilus、Azospira、Azospirillum、Azotobacter Bacillus、Bacteriovorax、Bacterium、Bacteroides、Balnearium、Balneatrix、Barnesiella、Bartonella、Bdellovibrio、Beggiatoa、Beijerinckia、Belliella、Belnapia、Beneckea、Bergeriella、Betabacterium、Beutenbergia、Bifidobacterium、Bilophila、Blastobacter、Blastochloris、Blastococcus、Blastomonas、Blastopirellula、Bogoriella、Bordetella、Borrelia、Bosea、Brachybacterium、Brachymonas、Brachyspira、Brackiella、Bradyrhizobium、Branhamella、Brenneria、Brevibacillus、Brevibacterium、Brevigemma、Brevundimonas、Brochothrix、Brucella、Bryantella、Budvicia、Bulleidia、Burkholderia、Buttiauxella、Butyribacterium、Butyrivibrio、Byssovorax、Caenibacterium、Caldanaerobacter、Caldicellulosiruptor、Caldilinea 、Caldithrix、Caldocellum、Caloramator、Caloranaerobacter、Caminibacillus、Caminibacter、Caminicella、Campylobacter、Capnocytophaga、Carbophilus、Carboxydocella、Carboxydothermus、Cardiobacterium、Carnobacterium、Caryophanon、Caseobacter、Castellaniella、Cat Scratch Disease Bacillus、Catellatospora、Catellibacterium、Catellicoccus、Catenibacterium、Catenococcus、Catenulispora、Catenuloplanes、Catenulospora、Caulobacter、Cdc Enteric Group 36/37、Cdc Group Vd、Cedecea、Cellulomonas、Cellulophaga、Cellulosimicrobium、Cellvibrio、Centipeda、Cerasibacillus、Chainia、Chelatobacter、Chelatococcus、Chitinibacter、Chitinimonas、Chitinophaga、Chlorobaculum、Chlorobium、Chloroflexus、Chondrococcus、Chondromyces、Chromatium、Chromobacterium、Chromohalobacter、Chryseobacterium、Chryseomonas、Chrysiogenes、Citreicella、Citricoccus、Citrobacter、Clavibacter、Clavisporangium、Clo Group Type 2、Clostridium、Cobetia、Cohnella、Collimonas、Collinsella、Colwellia、Comamonas、Conchiformibius、Conexibacter、Coprothermobacter、Corallococcus、Coriobacterium、Corynebacterium、Couchioplanes、Crossiella、Cryobacterium、Cryptanaerobacter、Cryptobacterium、Cryptosporangium、Cupriavidus、Curtobacterium、Curvibacter、Cyclobacterium、Cystobacter、Cytophaga、Dactylosporangium、Dechloromonas、Dechlorosoma、Deefgea、Deferribacter、Defluvibacter、Dehalobacter、Dehalospirillum、Deinococcus、Deleya、Delftia、Demetria、Dendrosporobacter、Denitrovibrio、Dermabacter、Dermacoccus、Dermatophilus、Derxia、Desemzia、Desulfacinum、Desulfarculus、Desulfatibacillum、Desulfitobacterium、Desulfoarculus、Desulfobacca、Desulfobacter、Desulfobacterium、Desulfobacula、Desulfobulbus、Desulfocapsa、Desulfocella、Desulfococcus、Desulfofaba、Desulfofrigus、Desulfofustis、Desulfohalobium、Desulfomicrobium、Desulfomonile、Desulfonatronovibrio、Desulfonatronum、Desulfonauticus、Desulfonema、Desulfonispora、Desulfopila、Desulforegula、Desulforhabdus、Desulforhopalus、Desulfosarcina、Desulfospira、Desulfosporosinus、Desulfotalea、Desulfothermus、Desulfotignum、Desulfotomaculum、Desulfovermiculus、Desulfovibrio、Desulfovirga、Desulfovirgula、Desulfurella、Desulfurobacterium、Desulfuromonas、Desulfuromusa、Dethiosulfovibrio、Devosia、Dialister、Diaphorobacter、Dichelobacter、Dichotomicrobium、Dickeya、Dictyoglomus、Dietzia、Diplococcus、Dokdoa、Dokdonella、Dokdonia、Dolosicoccus、Donghaeana、Dorea、Duganella、Dyadobacter、Dyella、Eberthella、Ectothiorhodospira、Edwardsiella、Eggerthella、Eikenella、Elizabethkingia、Elytrosporangium、Empedobacter、Enhygromyxa、Ensifer、Enterobacter、Enterococcus、Enterovibrio、Epilithonimonas、Eremococcus、Erwinia、Erysipelothrix、Erythrobacter、Erythromicrobium、Escherichia、Ethanoligenens、Eubacterium、Ewingella、Excellospora、Exiguobacterium、、Faecalibacterium、Faenia、Falcivibrio、Fastidiosipila、Ferribacter、Ferrimonas、Ferrobacillus、Fervidobacterium、Filibacter、Filifactor、Filobacillus、Filomicrobium、Finegoldia、Flammeovirga、Flavimonas、Flavobacterium、Flectobacillus、Flexibacter、Flexistipes、Flexithrix、Fluoribacter、Fluviicola、Formivibrio、Francisella、Frankia、Frateuria、Friedmanniella、Frigoribacterium、Fulvimarina、Fulvimonas、Fusibacter、Fusobacterium、Gaetbulibacter、Gaffkya、Gallibacterium、Gallicola、Garciella、Gardnerella、Gariaella、Gelidibacter、Gemella、Gemmata、Gemmatimonas、Gemmobacter、Geoalkalibacter、Geobacillus、Geobacter、Geodermatophilus、Geopsychrobacter、Georgenia、Geosinus、Geospirillum、Geothermobacter、Geothrix、Geovibrio、Giesbergeria、Gillisia、Glaciecola、Globicatella、Gluconacetobacter、Gluconoacetobacter、Gluconobacter、Glycomyces、Goodfellowia、Gordona、Gordonia、Gracilibacillus、Gracilibacter、Granulicatella、Granulobacter、Grimontia、Group Ii D、Guggenheimella、Gulosibacter、Haemophilus、Hafnia、Hahella、Halanaerobacter、Halanaerobium、Haliangium、Haliscomenobacter、Haloactinomyces、Haloanaerobacter、Haloanaerobium、Halobacillus、Halobacteroides、Halocella、Halochromatium、Halococcus、Halolactibacillus、Halomonas、Halonatronum、Halorhodospira、Halothermothrix、Halothiobacillus、Helcococcus、Helicobacter、Heliobacillus、Heliobacterium、Heliophilum、Heliorestis、Herbaspirillum、Herbidospora、Herminiimonas、Herpetosiphon、Hespellia、Hippea、Hirschia、Hoeflea、Holdemania、Holophaga、Hongiella、Hordeomyces、Hyalangium、Hydrocarboniphaga、Hydrogenivirga、Hydrogenobacter、Hydrogenobaculum、Hydrogenomonas、Hydrogenophaga、Hydrogenophilus、Hydrogenothermophilus、Hydrogenothermus、Hydrogenovibrio、Hylemonella、Hymenobacter、Hyphomicrobium、Hyphomonas、Idiomarina、Ignatzschineria、Ignavigranum、Ilyobacter、Inflabilis、Inquilinus、Intrasporangium、Iodobacter、Isobaculum、Isochromatium、Isoptericola、Jahnia、Janibacter、Jannaschia、Janthinobacterium、Jensenia、Jeotgalibacillus、Jeotgalicoccus、Jiangella、Jonesia、、Kangiella、Kerstersia、Kibdellosporangium、Kibdelosporangium、Kineococcus、Kineosphaera、Kineosporia、Kingella、Kitasatoa、Kitasatospora、Kitasatosporia、Klebsiella、Kluyvera、Knoellia、Kocuria、Kofleria、Koserella、Kozakia、Kribbella、Ktedobacter、Ktedonobacter、Kurthia、Kutzneria、Kytococcus、Labrys、Laceyella、Lachnobacterium、Lachnospira、Lactobacillus、Lactobacterium、Lactococcus、Lactonifactor、Lamprocystis、Lampropedia、Laribacter、Lautropia、Leadbetterella、Lebetimonas、Lechevalieria、Leclercia、Leeuwenhoekiella、Legionella、Leifsonia、Leisingera、Leminorella、Lentibacillus、Lentzea、Leptospirillum、Leptothrix、Leptotrichia、Leucobacter、Leuconostoc、Leucothrix、Levilinea、Levinea、Limnobacter、List、Listeria、Listonella、Loktanella、Lonepinella、Longispora、Lophomonas、Luteibacter、Luteimonas、Luteococcus、Lysobacter、Macrococcus、Macromonas、Magnetospirillum、Mahella、Malikia、Malonomonas、Manjusharmella、Mannheimia、Maribacter、Maricaulis、Marichromatium、Marinibacillus、Marinilabilia、Marinilactibacillus、Marinithermus、Marinitoga、Marinobacter、Marinobacterium、Marinococcus、Marinomonas、Marinospirillum、Marinovum、Marmoricola、Massilia、Mechercharimyces、Mechercharomyces、Megamonas、Megasphaera、Meiothermus、Melittangium、Mesonia、Mesophilobacter、Mesorhizobium、Methanomonas、Methylobacillus、Methylobacter、Methylobacterium、Methylocapsa、Methylocella、Methylocystis、Methylomicrobium、Methylomonas、Methylophaga、Methylophilus、Methylopila、Methylosarcina、Methylotenera、Methylovorus、Microbacterium、Microbispora、Microbulbifer、Microcella、Micrococcus、Microcyclus、Microechinospora、Microellobosporia、Microlunatus、Micromonas、Micromonospora、Micropolyspora、Micropruina、Microscilla、Microstreptospora、Microtetraspora、Microvirgula、Millisia、Mima、Mitsuokella、Mobiluncus、Modestobacter、Moellerella、Mogibacterium、Moorella、Moraxella、Moraxella (Branhamella)、Moraxella(Moraxella)、Morganella、Moritella、Muricauda、Muricoccus、Myceligenerans、Mycetocola、Mycobacterium、Mycoplana、Myroides、Myxobacter、Myxococcus、、Nakamurella、Nannocystis、Natroniella、Natronincola、Nautilia、Naxibacter、Neisseria、Nereida、Nesterenkonia、Nevskia、Nicoletella、Nih Group 12、Nitratifractor、Nitratireductor、Nitratiruptor、Nitrobacter、Nocardia、Nocardioides、Nocardiopsis、Nonomuraea、Novosphingobium、Obesumbacterium、Oceanibulbus、Oceanicaulis、Oceanicola、Oceanimonas、Oceanithermus、Oceanobacillus、Oceanobacter、Oceanomonas、Oceanospirillum、Ochrobactrum、Octadecabacter、Odontomyces、Oenococcus、Oerskovia、Oleiphilus、Oleispira、Oligella、Oligotropha、Olsenella、Opitutus、Orenia、Oribacterium、Ornithinicoccus、Ornithinimicrobium、Ornithobacterium、Oryzihumus、OttoWia、Oxalicibacterium、Oxalobacter、Oxalophagus、Oxobacter、Paenibacillus、Paludibacter、Pandoraea、Pannonibacter、Pantoea、Papillibacter、Parabacteroides、Paracoccus、Paracolobactrum、Paralactobacillus、Paraliobacillus、Parascardovia、Parasporobacterium、Parvibaculum、Parvimonas、Parvopolyspora、Pasteurella、Pasteuri a、Patulibacter、Paucibacter、Paucimonas、Paucisalibacillus、Pectinatus、Pectobacterium、Pediococcus、Pedobacter、Pelczaria、Pelobacter、Pelodictyon、Pelomonas、Pelosinus、Pelospora、Pelotomaculum、Peptococcus、Peptoniphilus、Peptostreptococcus、Peredibacter、Persephonella、Persicivirga、Persicobacter、Petrimonas、Petrobacter、Petrotoga、Phaeobacter、Phaeospirillum、Phascolarctobacterium、Phenylobacterium、Phocoenobacter、Photobacterium、Photorhabdus、Phyllobacterium、Phytomonas、Pigmentiphaga、Pilimelia、Pimelobacter、Pirellula、Planctomyces、Planifilum、Planobispora、Planococcus、Planomicrobium、Planomonospora、Planosporangium、Planotetraspora、Plantibacter、Pleomorphomonas、Plesiocystis、Plesiomonas、Podangium、Polaribacter、Polaromonas、Polyangium、Polymorphospora、Pontibacillus、Porphyrobacter、Porphyromonas、Pragia、Prauserella、Prevotella、Proactinomyces、Promicromonospora、Promyxobacterium、Propionibacterium、Propionicimonas、Propioniferax、Propionigenium、Propionimicrobium、Propionispira、Propionispora、Propionivibrio、Prosthecobacter、Prosthecochloris、Prosthecomicrobium、Protaminobacter、polyPeptideiphilum、Proteus、Providencia、Pseudaminobacter、Pseudoalteromonas、Pseudoamycolata、Pseudobutyrivibrio、Pseudoclavibacter、Pseudomonas、Pseudonocardia、Pseudoramibacter、Pseudorhodobacter、Pseudospirillum、Pseudoxanthomonas、Psychrobacter、Psychroflexus、Psychromonas、Psychroserpens、Pullulanibacillus、Pusillimonas、Pyxicoccus、Quadrisphaera Rahnella、Ralstonia、Ramibacterium、Ramlibacter、Raoultella、Rarobacter、Rathayibacter、Reinekea、Renibacterium、Renobacter、Rhabdochromatium、Rheinheimera、Rhizobacter、Rhizobium、Rhizomonas、Rhodanobacter、Rhodobacter、Rhodobium、Rhodoblastus、Rhodocista、Rhodococcus、Rhodocyclus、Rhodoferax、Rhodomicrobium、Rhodonellum、Rhodopila、Rhodopirellula、Rhodoplanes、Rhodopseudomonas、Rhodospirillum、Rhodothalassium、Rhodothermus、Rhodovibrio、Rhodovulum、Riemerella、Rikenella、Robiginitalea、Roseateles、Roseburia、Roseiflexus、Roseinatronobacter、Roseobacter、Roseococcus、Roseospira、Roseospirillum、Roseovarius、Rothia、Rubritepida、Rubrivivax、Rubrobacter、Ruegeria、Ruminobacter、Ruminococcus、Runella、、Saccharibacter、Saccharococcus、Saccharomonospora、Saccharophagus、Saccharopolyspora、Saccharothrix、Sagittula、Salana、Salegentibacter、Salinibacter、Salinibacterium、Salinicoccus、Salinimonas、Salinispora、Salinivibrio、Salinospora、Salipiger、Salmonella、Samsonia、Sanguibacter、Saprospira、Sarcina、Sarraceniospora、Scardovia、Schlegelella、Schwartzia、Sebekia、Sedimentibacter、Sedimenticola、Segniliparus、Seinonella、Sejongia、Selenomonas、Seliberia、Serinicoccus、Serratia、Shewanella、Shigella、Shinella、Shuttleworthia、Silanimonas、Silvimonas、Simonsiella、Simplicispira、Simsoniella、Sinococcus、Sinorhizobium、Skermania、Slackia、Smaragdicoccus、Smithella、Sodalis、Soehngenia、Sorangium、Sphaerobacter、Sphaerophorus、Sphaerosporangium、Sphaerotilus、Sphingobacterium、Sphingobium、Sphingomonas、Sphingopyxis、Sphingosinicella、Spirilliplanes、Spirillospora、Spirillum、Spirochaeta、Spirosoma、Sporacetigenium、Sporanaerobacter、Sporichthya、Sporobacter、Sporobacterium、Sporocytophaga、Sporohalobacter、Sporolactobacillus、Sporomusa、Sporosarcina、Sporotalea、Sporotomaculum、Stackebrandtia、Staleya、Staphylococcus、Stappia、Starkeya、Stella、Stenotrophomonas、Sterolibacterium、Stigmatella、Streptacidiphilus、Streptimonospora、Streptoallomorpha、Streptoalloteichus、Streptobacillus、Streptobacterium、Streptococcus、Streptomonospora、Streptomyces、Streptomycetoides、Streptomycoides、Streptosporangium、Streptoverticillium、Subdoligranulum、Subtercola、Succiniclasticum、Succinimonas、Succinispira、Succinivibrio、Sulfitobacter、Sulfobacillus、Sulfuricurvum、Sulfurihydrogenibium、Sulfurimonas、Sulfurospirillum、Sutterella、Suttonella、Syntrophobacter、Syntrophobotulus、Syntrophococcus、Syntrophomonas、Syntrophothermus、Syntrophus、、Tatlockia、Tatumella、Taxeobacter、Taylorella、Teichococcus、Telluria、Tenacibaculum、Tepidanaerobacter、Tepidibacter、Tepidimicrobium、Tepidimonas、Tepidiphilus、Terasakiella、Terrabacter、Terracoccus、Terribacillus、Terrimonas、Tessaracoccus、Tetragenococcus、Tetrasphaera、Tetrathiobacter、Thalassobacillus、Thalassobacter、Thalassobius、Thalassolituus、Thalassomonas、Thalassospira、Thauera、Thaxtera、Thermacetogenium、Thermaerobacter、Thermanaeromonas、Thermanaerovibrio、Thermicanus、Thermincola、Thermithiobacillus、Thermoactinomyces、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium、Thermoanaerobium、Thermoanaerolinea、Thermobacterium、Thermobacteroides、Thermobifida、Thermobispora、Thermobrachium、Thermochromatium、Thermocrinis、Thermocrispum、Thermodesulfatator、Thermodesulfobacterium、Thermodesulfobium、Thermodesulforhabdus、Thermodesulfovibrio、Thermoflavimicrobium、Thermohydrogenium、Thermolithobacter、Thermomicrobium、Thermomonas、Thermomonospora、Thermonema、Thermonospora、Thermopolyspora、Thermosediminibacter、Thermosiculum、Thermosinus、Thermosipho、Thermosyntropha、Thermotoga、Thermovenabulum、Thermovibrio、Thermovirga、Thermus、Thetysia、Thialkalimicrobium、Thialkalivibrio、Thioalkalimicrobium、Thioalkalivibrio、Thiobaca、Thiobacius、Thiobacter、Thiocapsa、Thiococcus、Thiocystis、Thiodictyon、Thiohalocapsa、Thiolamprovum、Thiomicrospira、Thiomonas、Thiopedia、Thioreductor、Thiorhodoccocus、Thiorhodococcus、Thiorhodovibrio、Thiosphaera、Thiothrix、Thorsellia、Tindallia、Tissierella、Tolumonas、Trabulsiella、Treponema、Trichococcus、Trichotomospora、Truepera、Tsukamurella、Tuberibacillus、Turicella、Turicibacter、、Unclassified、Ureibacillus、Uruburuella、、Vagococcus、Varibaculum、Variovorax、Veillonella、Verrucomicrobium、Verrucosispora、Vibrio、Victivallis、Virgibacillus、Virgisporangium、Vitreoscilla、Vogesella、Volcaniella、Volucribacter、Vulcanibacillus、Vulcanithermus、、Waksmania、Wautersia、Weeksella、Weissella、Williamsia、Wolinella、Woodsholea、Xanthobacter、Xanthomonas、Xenophilus、Xenorhabdus、Xylanibacter、Xylanibacterium、Xylanimicrobium、Xylanimonas、Xylella、Xylophilus、Yania、Yersinia、Yokenella、、Zavarzinia、Zimmermannella、Zobellia、Zoogloea、Zooshikella、Zymobacter、Zymobacterium、Zymomonas 以及Zymophilus。
含有本发明多肽的植物
当气候条件不是作物生产的最佳条件时，本发明的多核苷酸和多肽在植物宿主细胞和其他转基因生物中的应用可以防止有价值的作物的损失。具体地，本发明提供新颖和创新的转基因植物和作物，它们能够经受现有植物和作物难以忍受的气候条件。本发明的包含多核苷酸并生产本发明的多肽的植物宿主细胞形式的作物实例是：葡萄、油籽植物、如油菜籽、谷物(燕麦、大麦、黑麦等)，柑橘类水果和甘蔗。
本发明还涉及含有本发明多肽的转基因水果和蔬菜。含有本发明多肽的转基因水果和蔬菜能够经受更低的温度，比如在储存和/或运输期间。实例包括草莓、蓝莓、覆盆子、柑橘类水果、香蕉、葡萄、猕猴桃、桃子、菠萝、李子、樱桃、西红柿和芒果。
含有本发明多肽的花
本发明涉及的冷冻花包括郁金香、玫瑰、百合等。
鱼
适用于本发明的鱼的实例为长鳍金枪鱼(Thunnus alalunga)、剑齿鲽鱼(Atheresthes stomias)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)、大西洋刀鱼(Trichiurus lepturus)、大西洋鲑鱼(Salmo salar)、大西洋狼鱼(Anarhichas lupus)、多须石首鱼(Pogonias cromis)、乌鲳(Parastromateus niger)、黑脊比目鱼(Sole，Pleuronectes americanus)、黑鳍鲨(Carcharhinus limbatus)、鲶鱼(Ictalurus furcatus)、蓝蟹(Callinectes sapidus)、枪鱼(Makaira nigricans)、岩鱼(Sebastesauriculatus)、河豚(Sphoeroides annulatus)、鲉鱼(Scorpaena guttata)、红鲈(Semicossyphus pulcher)、岩鱼(Sebastes pinniger)、鲷鱼(Lutjanuspurpureus)、鲶鱼(Ictalurus punctatus)、岩鱼(Sebastes goodei，Sebastesnebulosus)、奇努克(Oncorhynchus tshawytscha)、鲭鱼(Scomberjaponicas)、银鲑鱼(银，中红)(Oncorhynchus kisutch)、长尾鲨(Alopiasvulpinus)、石斑鱼(Epinephelus fulva)、单鳍鳕(Brosme brosme)、鲯鳅鱼(Coryphaena hippurus)、鳎鱼(Microstomus pacificus)、鳎鱼(Pleuronectes vetulus)、玉梭鱼(Lepidocybium flavobrunneum)、海鲂(Zeus faber)、大洋鲈(Sebastes norvegicus)、鲷鱼(Lutianus griseus)、鳎鱼(比目鱼)(Glyptocephalus cynoglossus)、梭鱼(Sphyraenabarracuda)、黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)、金枪鱼(Euthynnusaffinis)、鲷鱼(Lutjanus synagris)、蛇鳕(Ophiodon elongates)、遮目鱼(Chanos chanos)、罗非鱼(Tilapia mossambica)、尼罗罗非鱼(Tilapianilotica)、河豚(Sphoeroides maculates)、方头鱼(Caulolatilusprinceps)、油鱼(Ruvettus pretiosus)、橙连鳍鲑(Hoplostethusatlanticus)、梭鱼(Sphyraena argentea)、松鱼(Sarda chiliensis)、鳕鱼(太平洋鳕，Gadus macrocephalus)、杰克鱼(Caranx caninus)、杰克鱼(Selene peruviana)、大洋鲈(Sebastes alutus)、鲭鱼(Scomberscombrus)、马鲛鱼(Scomberomorus sierra)、鲷鱼(Lutjanus peru)、巴塔哥尼亚齿鱼(Dissostichus eleginoides)、鳎鱼(比目鱼，Eopsetta jordanl)、粉红鲑(弓背)、(Oncorhynchus gorbuscha)、青鳕(Pollachius virens)、岩鱼(Sebastes maliger)、鳟鱼、虹鳟(钢头)(Oncorhynchus mykiss)、红鼓鱼(雄鲑)(Sciaenops ocellatus)、棘鬣鱼(Chrysophrys auratus)、鲷鱼(Lutjanus campechanus)、岩鱼(Sebastes proriger)、鳎鱼(比目鱼，Errexzachirus)、笛鲷(Lutjanus apodus)、红鲈(Archosargusprobatocephalus)、鲨鱼、灰鲭鲨(Isurus oxyrinchus)、鲷鱼(Lutjanusvivanus)、平鱼(Pampus argenteus)、岩鱼(Sebastes brevispinis)、鲣鱼(Katsuwonus pelamis)、刺足鱼(Siganusjavus)、白花鱼或石首鱼(Roncador stearnsi)、比目鱼(Platichthys stellatus)、枪鱼(Tetrapturusaudax)、鲈鱼(Morone chrysops x saxatilis)、旗鱼(Xiphias gladius)、鲤鱼(Barbodes schwanefeldl)、青鳕(阿拉斯加青鳕，Theragrachalcogramma)、海鳕(Urophycis tenuis)、岩鱼(Sebastes entomelas)、比目鱼(Scophthalmus aquosus)、石首鱼(黄鱼、Pseudosciaenamanchurica)、岩鱼(Sebastes ruberrimus)、金枪鱼(Thunnus albacores)、黄条纹鲹(Selaroides leptolepis)、黄尾鱼(Seriola lalandel)、比目鱼(Limanda ferruginea)、岩鱼(Sebastes flavidus)和鲷鱼(Ocyuruschrysurus)、红点鲑(Salvelinus alpines)、多宝鱼、格林兰鲽(Reinhartdiushippoglossoides)、大比目鱼(Hippoglossus hippoglossus)。
冷冻的食品和食用产品
冷冻食品(包括冷冻蔬菜)的再结晶导致这类食品的口味和质地变差。本发明的抗冻多肽可以用于处理冷冻食品或待冷冻的食品，以防止发生再结晶。用本发明处理的食品实例包括但不限于：冰淇淋、冷冻酸奶、汤、布丁、雪酪、雪糕、冷冻甜点如奶油冻、布丁等，以及其他需冷冻的液体或半液体。冷冻蔬菜，如芹菜、土豆、芦笋、豌豆、胡萝卜、豆子、花椰菜、甜玉米、菠菜、绿豆等也都属于本发明的考虑范围。
本发明的多肽还可影响乳糖晶体的形成。因此，在不受任意具体理论的约束的情况下，可以认为本发明的多肽抑制乳糖晶体的结晶和/或生长。众所周知，在冰淇淋冷冻期间，所有物质(包括乳糖)的含量都越来越浓缩。液态水的含量除外，它是递减的。当乳糖的含量达到一定水平时，乳糖晶体开始结晶。这种结晶是一个缓慢的过程，其发生在-20℃。通常，冰淇淋储存在约-20℃。然而，在许多情况下，冰淇淋并非储存在稳定和恒定的温度下，但温度在约-20℃波动。因此，在温度高于-20℃的期间，乳糖的晶体将会生长并且形成新晶体。所以，冰淇淋的口感会变得更粗糙，而大多数人觉得这种口感不太好。现在意外地发现，当本发明的多肽在冰淇淋冷冻之前加到冰淇淋中时，明显地减少了乳糖晶体的形成，并且在约-20℃储存时明显防止了新晶体的形成。因此，储存的冰淇淋产品的质量明显提高。
本发明的冷冻食用产品的实例在本文以下有更详细的描述。
含有本发明多肽的冷冻发酵产品
冷冻或冷藏食品是目前发达国家人类饮食中的主要部分。因此食品科学家已经和正在进行广泛研究，以确保为消费者提供高质量的产品。对于冷冻蔬菜及冷冻甜食(如冰淇淋和酸奶)来说尤其如此。
冷冻甜食，如冰淇淋或酸奶，通常是在冷冻状态下食用。因此，对消费者来说，冷冻产品的质地及其口味都很重要。质地在很大程度上是由冰晶体的大小决定的。这些冷冻甜食的程序耗费了相当多的精力和费用来保证产品有爽滑的质地。然而，在冷冻储存期间，冰晶体会生长并因此变粗糙和破坏这种质地。冰晶体在冷冻储存期间的生长称作再结晶。当冷冻储存条件不够理想时，这个问题尤其常见，例如运输或在现代无霜家用冰箱储存期间。在零上温度(即0℃以上)、甚至在持久的冷冻温度下，由于冰再结晶过程，冷冻食品会在相对短时间后就变得不可口，甚至不适合人食用。
将抗冻多肽掺入冷冻发酵食品的理想方法是让生物负责发酵过程，在发酵食品时产生抗冻多肽。
因此，本发明包括制备冷冻发酵食品的方法。该方法包括步骤：(a)使食品与能够分泌本发明多肽的微生物接触，其中该微生物能够发酵该食品，以产生发酵食品，(b)在发酵进行的条件下用微生物培养该食品，使得产生具有抗冻多肽的发酵食品，抗冻多肽是以有效抑制该产品再结晶的量存在；和(c)在-5℃下冷冻该发酵食品，以便产生冷冻的发酵食品。
在一种实施方式中，该食品可以是奶制品(如牛奶)，其可以发酵来生产酸奶、脱脂奶或奶酪。
本发明的微生物通常是细菌(即保加利亚乳杆菌、乳酪链球菌、乳链球菌、两岐双岐杆菌、长双歧杆菌)，还可以是真菌，如酵母菌(即脆壁酵母、酿酒酵母、乳酸酵母及其他)。根据本发明，这些微生物经基因工程处理，使得它们能够分泌本发明的多肽。
在最优选的实施方式中，本发明包括：用能够发酵牛奶产生酸奶并且能够分泌抗冻多肽的细菌物种保加利亚乳杆菌和乳链球菌培养牛奶，这些细菌物种能够发酵牛奶以生产酸奶并且能够分泌抗冻多肽；在生产酸奶的条件下培养该细菌和牛奶；以及在低于-5℃的温度下冷冻酸奶，以生产冷冻酸奶。
本发明还提供一种包含酸奶和微生物的组合物，其中微生物含有编码本发明的多肽的基因。
本文使用的“发酵”指食品中的碳水化合物或多肽通过使用微生物而发生的化学转化。在该过程中，碳水化合物通常转化为乳酸。
本文使用的“发酵食品”指通过用包括微生物发酵的工艺制备的食用产品。
本文使用的“酸奶”指通过微生物的作用，由乳酸发酵的牛奶生产的奶制品。
本文使用的“重组产生的多肽”指用重组DNA技术生产的多肽。重组DNA技术是众所周知的，其特征在于将非天然连接的至少两个DNA片段连接起来(例如，细菌启动子和多肽编码序列)。
参考序列可能比全长的天然形成的多肽或多核苷酸序列短，但对多肽来说至少为12个残基长，而对多核苷酸来说为至少36个碱基长。
本发明还提供通过加入微生物制备冷冻发酵食品的方法，该微生物能够发酵食品以生产发酵的食品，并且还能分泌本发明的多肽。分泌本发明的多肽并使食品发酵的微生物的应用相对于影响冰晶体形成和冻结温度的其他方法而言具有几个优势。例如，该方法避免了在加入到食品中之前纯化本发明多肽的花费需要，此外，这会消除纯化过程以及与外来微生物相关的发热引起的任意可能的污染。而且，因为本发明的多肽是通过发酵本发明提出的微生物而分泌得到，所以该过程需要的步骤比其他方法少。
本发明的食品通常是牛奶，但也可以使用其他的食品，这些食品可以发酵以生产食用发酵食品。实例包括卷心菜(可发酵来生产泡菜)、黄瓜(可发酵来生产腌菜)以及大豆(可发酵来生产味噌和其他食品)。
在本发明的一个步骤中，将食品与能发酵该食品的微生物接触或混合。食品发酵中可用的微生物的实例是众所周知的(例如，见van de Guchte，1992，FEMS Microbiology Reviews，88：73-92)。
在优选的实施方式中，食品是奶类(例如来自奶牛(即牛)、母羊、母马或山羊)。根据选择的细菌和孵化的条件，微生物(通常为细菌)对奶制品的发酵作用产生酸奶、酪乳或某些奶酪。在最优选的实施方式中，本发明的方法用于由奶类生产酸奶。酸奶在世界各地有各种不同的名称。以下列出常见的酸奶品种的名称和原产国：
产品名称 原产地
Jugurt/Eyran/Ayran 土耳其等
Busa 土耳其斯坦
Kissel Mleka 尔干半岛
Urgotnic 尔干山脉
Leban/Laban 黎巴嫩/阿拉伯国家
Zabady(Zabbady) 埃及/苏丹
Mast/Dough 伊朗/阿富汗
Roba 伊拉克
Dahi/Dadhi/Dahee 印度
Mazun/Matzoon/Matsun/Matsoni 美尼亚
Katyk 外高加索
Tiaourti 希腊
Cieddu 意大利
Mezzoradu 西西里岛
Gioddu 撒丁岛
Biokys 捷克斯洛伐克
Karmdinka 波兰
Tarho 匈牙利
Tykmaelk/Ymer 匈牙利
Villi(Fiili) 芬兰
Filmjolk/Fillbunke/Surmelk/Taettemjolk/Tettemelk 斯堪的那维亚
Iogurte 巴西/葡萄牙
Proghurt 智利
Skyr 冰岛
Gruzovina 南斯拉夫
Kefir/Donskaya/Varentes (前)苏联
Kurunga/Koumiss/Ryazhenka/Guslyanka
Tarag 蒙古
Shosim/Sho/Thara 尼泊尔
生产酸奶的方法可以在Nakazawa and Hosono，1992年编的Functions ofFermented Milk中找到，由Elsevier Applied Science出版，London-New York，p.32，将其在此纳入作为参考。在美国，酸奶是由奶牛的全脂或脱脂奶生产。奶被标准化为10.5-11.5％固体物，加热至90℃以上(30至60分钟)，以破坏任意污染微生物，然后再冷却。然后将该物质用1∶1比例的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合培养物接种。通常需要这两种生物的结合作用以获得产品中所需要的风味和酸。在其他情况下，还可以使用其他高发酵细菌，包括保加利亚细菌、L.jugarti、L.acidophilus、双歧杆菌属酵母和乳酸真菌。以下列出的是用于牛奶发酵以生产酸奶的细菌和其他生物的实例：
种属 习性 发酵 主要物种
Streptococcusa 球菌链 同型 S.cremoris，lactis，thermophilus
Leuconostocb 球菌对 异型 L.citrovorum，mesenteroides
Lactobacillusc 杆状 同型 L.acidophilus，bulgaricus，casei，jugurti，lactis
Bifidobacterium 杆状 异型 B.bifidum，breve，longum
其他：
酵母(Torulopsis holmil；Saccharomyces fragilis，cerevisiae，lactis；Candida pseudotropicalis等)
真菌(Geotrichum candidum)
醋酸菌(Acetobacter aceti，rasens)
a目前的Lactococcus lactis subsp.cremoris，Lac，lactis subsp.lactis和S.thermophilus。
b目前的L.mesenteroides subsp.cremoris和L.mesenteroides subsp.mesenteroides。
c目前的L.acidophilus，L.delbrueckii subsp.bulgaricus，L.casei subsp.casei，L.helveticusbiovar.Jugurti和L.delbrueckii subsp.lactis。
可以对这些微生物进行基因工程设计(即，采用重组DNA技术)，以便它们能够分泌本发明的多肽。
已经建立了改造能够表达和分泌异源性多肽的细菌和真菌的方法(例如，见Maniatis et al.(1982)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Berger and Kimmel，Guide to MolecularCloning Techniques，Methods in Enzymology 152(Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif.)；Simon et al.，1986，Appl.Environ.Microbiol.52：394-395；vonWright et a.，1985，Appl.Environ.Microbiol.50：1100-1102，将其全部引入作为参考)。
能够表达和分泌AFP的微生物的生产可以用普通技术人员知道的各种方法完成。编码AFP的DNA序列优选地被可操纵地连接(即，被定位以确保其功能)到操纵子，其使DNA转录(成为RNA转录本)并在微生物中翻译成多肽。用于细菌和真菌的启动子都是本领域众所周知的。优选用于在乳酸菌中表达的操纵子包括S.thermophilus的乳糖操纵子、L.lactic的lacABCDFEGX操纵子，因为它们已经成功地用于驱动宿主中的外源基因表达(例如，见Simons et al.，1993，J.Bact.175：5186-5175；Mollet et al.，1993，J.Bact.175：4315-4324)。
本发明的多肽可表达为融合多肽，以便增强稳定性或其他有益性质。此外，通过修改编码多肽的基因可以修饰本发明的多肽。一般地，基因的修饰可以用各种众所周知的技术完成，例如定向诱变(例如，见Gillman and Smith，1979，Gene 8：81-97and Roberts et al.，1987，Nature 328：731-734)。
本发明的微生物能够分泌本发明的多肽。因此，本发明的多肽优选与信号肽序列连结。适宜的信号肽序列包括选自L.lactis ssp lactis MG 1363的usp45基因以及L.lactis ssp cremoris SK11细胞壁相关的蛋白酶基因(vanAsseldonk et al.，1990，Gene 95：155-160；De vos et al.，1989，J.Dairy Sci.72：3398-3405)。对于细菌，如L.lactis来说，优选的是usp45信号肽，因为它来自同样的宿主。在一种优选的实施方式中，本发明的多肽基因与转录终止序列连接，以确保本发明多肽的转录在宿主系统中正确终止。
用质粒如pUC19、pNZ18和pDBN183作为载体，构建包含上述元件的基因构建体(Solaiman et al.，1992，Plasmid，28：25-36)。用同源重组技术，将该基因构建体并入乳酸菌物种的基因组中(Mollet et al.，1993，J.Bact.，175：4315-4324)。乳酸菌和E.coli菌株可以按照Maniatis et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，上文和Chagnand et al.，1992，Can.J.Microbiol.38：67-74的推荐来保存。
含有本发明多肽的微生物可以通过任意常规方法应用到食品中。在产品，如牛奶中，细菌或者真菌可以在初始与待发酵和冷冻的食品混合。本领域的技术人员知道，有时用不同微生物的混合物来生产所需的产品。例如，在制备酸奶时，通常一起使用S.thermophilus和L.bulgaricus。
添加到食品中的FAE微生物的数量取决于该微生物和食品的性质。一般而言，乳酸FAE启动细菌(1010-1011/ml)以1-5％培养进入杀菌并冷却的牛奶中，使得这种比例使本发明多肽在产品中为合适的量。产品中AFP的量应该是有效防止和抑制冰再结晶的量(1-100mg/L奶)。这可以按照Knight etal.(1988)Cryobiology，vol.25，pp.55-60的描述用急冷分析法来确定。
该方法的另一个步骤中，发酵食品是用传统的冷冻机操作进行冷冻，如气流冷冻机(-20至40℃)或接触平板冻结机(-300到40℃)或真空冷冻干燥机。对普通技术人员来说显而易见的是，上述实施方式可能有多种变化。
含有本发明的多肽的冰淇淋
另一方面，本发明提供了一种含有本发明多肽的冰淇淋产品。该冰淇淋产品还可以含有伴随本发明多肽的乳化体系。该乳化体系可以是技术人员知道的任意体系。然而，特别优选的是包含1，2-丙二醇的单酯和脂肪酸的体系，如US 2005/0163902或WO 2008/064675中描述的那些。
在按本文以下描述生产的冰淇淋中，本发明的多肽可以作为纯化多肽添加，在冰淇淋的生产期间与其他成分混合，或者本发明的多肽可以作为用于发酵牛奶的微生物的分泌物存在。
以下是一种制备本发明的冰淇淋的方法。
在第一步中，将食品中间体与上述乳化剂体系接触。
本文使用的术语“食品中间体”表示适合制备冰淇淋的成分的混合物。适于制备冰淇淋的成分可包括水、脂肪，如乳脂或植物油、非脂性乳固体(MSNF)、甜味剂、稳定剂、香料和色素。此外，本发明的多肽可能已经存在于乳固体中，或者可以作为单独的成分加到混合物中。
优选地，食品中间体包含脂肪。优选地脂肪是高月桂酸脂肪或乳脂。术语“高月桂酸脂肪”是指其中主要脂肪酸为月桂酸的脂肪。高月桂酸脂肪，如棕榈仁油硬化和硬化椰子油是β′稳定性的。因此，食物中间体优选地包含β′稳定性脂肪。
在第一步接触步骤之后，将选择的成分混合在一起。通常先将液体成分混合，随后添加干燥成分。液体成分可以是冷的或者可加热至约60℃。混合要求快速搅动以便掺入粉末，并且通常使用高速混合机。
如果使用黄油/乳脂油或植物脂肪，理想的应该是单独融化，并在40℃添加混合中，或者通过计量泵的方式在匀浆器的入口处经由静止混合器混合。
该混合物随后被巴氏灭菌。进行巴氏灭菌是为了消灭致病细菌和变质生物，如嗜冷生物。巴氏灭菌有三个不同的阶段：巴氏灭菌、均化和冷却。
进行混合物的匀化是为了通过将脂肪球的尺寸分解或降低到小于1μm，而形成脂肪乳剂。
巴氏灭菌可以通过连续巴氏灭菌或者分批巴氏灭菌来进行。
目前用的最常见的巴氏灭菌原理是连续巴氏灭菌，其中通常将冰淇淋混合物在平板热交换器中于80-90℃温度范围加热最少16秒。通常在一个大绝缘物料罐中混合成份，随后在高温短时(HTST)热交换器中进行连续巴氏灭菌。为了成份的增溶，有时可能需要预热至30℃至40℃。HTST系统配备有加热段、冷却段和再生段。
分批巴氏灭菌是一种老方法，其中所有的混合物成份在配备有热水套的桶内缓慢加热。为避免在罐的底部和侧面沉积污垢，加热过程必须温和，在混合物和加热介质之间有低的温度差(ΔT)。当ΔT必须较低并且混合体积/罐表面的比率通常较高时，这必然要花费几分钟时间以使混合物加热至60℃的温度。为了提高热从罐表面至混合物的转移，需要有效的搅拌混合物。分批巴氏灭菌的能量消耗非常高，与连续巴氏灭菌不同，其不存在热回收。
巴氏灭菌后，混合物通过高压方式均化。均化通常在约80℃的温度下进行，并且在温度为65-75℃下，均化压力可以是90巴(1300psi)至250巴(3600psi)。分批灌通常一前一后地运作，使得一个在保压时其他的在准备。自动计时器和阀门确保满足合适的保压时间。
匀化可以在巴氏灭菌之前或之后进行。
接着通过使混合物通过热交换器(板或双重或三重管)，将该混合物冷却至冷藏温度(4℃)。
混合物冷却至约为4℃的老化温度。然后，混合物老化最少4小时，但优选隔夜。这留出时间使脂肪结晶，并使多肽和多糖充分水合。
在老化之后，混合物被吸入调味罐，其中添加了任意液体调味料、果酱或色素。然后该混合物进入动态冻结过程，其冷冻部分水并搅动空气进入该冷冻混合物中。冷冻可以通过连续冷冻过程或分批冷冻/搅动进行。
连续冻结可以在桶式冷冻机中进行。桶式冷冻机是一种刮板式、管状热交换器，其上套有沸腾致冷剂，如氨或氟利昂。该混合物被泵入桶式冷冻机，并在约30秒至3分钟内从另一末端排出。就分批冷冻机来说，这一过程需要10至15分钟。当混合物从另一末端排出时，其中约50％的水被冻结。桶式冷冻机内部有转动叶片，其保持冰从冷冻机的表面刮离。在机器内部也有搅拌装置，其有助于搅动混合物并掺入空气。
冰淇淋含有大量的空气，通常高达其体积的一半。这使得产品具有轻质的性质。空气含量被称为膨胀率(overrun)。
当冰淇淋吸取的水约一半冻结时，可以向该半冻结浆体中加入颗粒物，如果粒、坚果或饼干。然后将冰淇淋包装并置于-30℃至-40℃的气流冷冻机中，在此将大部分残留水冻结。
硬化包括在气流冷冻机中静态(安静、无声)冻结包装好的产品。冻结速度最好应该是快速的，因此冻结技术包含带有加强的对流(带压缩风机的冻结管)或加强的传导(平板冻结机)的低温(-40℃)。
除了传统的硬化过程，冰淇淋可以从冰淇淋冷冻中泵入低温挤压机中(单或双螺杆挤压机)，将冰淇淋的温度调低到-12℃至-18℃。在填充或者挤压之后，冰淇淋可直接送入冷藏器中。
硬化的冰淇淋应该在低于-25℃储存。低于约-25℃，冰淇淋长时间保存相当稳定，不存在快速冰晶生长的危害。
如前所述，本发明的过程包括将食品中间体与乳化剂体系接触的步骤。
在一种优选的实施方式中，该过程包括将乳化剂体系溶解在水中的步骤。在该实施方式中，乳化剂体系可溶解在水中，然后食品中间体再与水接触。
在一种优选的实施方式中，该过程包括将乳化剂体系溶解在脂肪中的步骤。在该实施方式中，乳化剂体系可溶解在脂肪中，然后食品中间体再与脂肪接触。
在一种优选的实施方式中，该过程包括动态冻结步骤。
本文定义的术语“动态冻结步骤”是指使食品中间体经受冻结条件，同时搅拌该食品中间体。这与静态冻结步骤是相反的，静态冻结步骤中食品中间体经受冻结条件，同时保持静止。
在一种优选的实施方式中，该过程包括冻结步骤。
在一种优选的实施方式中，该步骤包括以低于-4℃的冷冻机回火温度进行冻结的步骤。回火温度优选为约-4℃至-7℃，优选约-5℃至-7℃，更优选约-5℃至-6℃，更优选约-6℃。回火温度是指离开冷冻机时的冰淇淋的温度。
含有本发明多肽的充气食品
本发明还提供一种含有本发明多肽的充气食品。冰淇淋、果子露、雪酪和冷冻酸奶可以作为食品的实例，可定性为充气产品。
术语“充气(的)”是指气体被有目的地掺入混合物中，例如通过机械手段。气体可以是任意气体，但是在食品方面优选地是食品级气体，如空气、氮气、氧化亚氮或二氧化碳。本发明的充气食品包含大量气泡，其中至少65％的气泡的具有低于20μm的直径。优选至少75％，更优选至少80％的气泡具有低于20μm的直径。优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少75％的气泡具有低于10μm的直径。
充气量通常称作“膨胀率”。在本发明中，％膨胀率是根据充气产品的体积和未充气混合物的体积进行定义：
膨胀率是在大气压力下测定。产品中存在的膨胀率的量会根据所需产品的性质而变化。
优选地食品具有至少20％的膨胀率，更优选至少50％，最优选最少80％。优选地食品具有最多400％的膨胀率，更优选最多200％，最优选最多120％。
充气食品可由本领域已知的任意方法制备。例如，使用预充气途径，这是从未充气混合物开始生产含大量小气泡的充气食品的过程。
在预充气途径中，包含本发明多肽并可选地含有其他成分的混合物(即，水溶液和/或悬浮液)进行充气步骤。该充气步骤必须有足够高的“强度”，以便产生大量的非常小的气泡(直径小于20μm)。充气过程的强度取决于很多因素，最重要的是充气步骤中能量损耗的速率，混合物和气泡在充气步骤中经历的流动的性质，以及混合物的粘度和温度。此外，充气步骤应该足够长，以便达到理想的充气程度(即，膨胀率)。
机械充气装置通常以切割混合物的转子为基础。能量消耗的速率是该装置转速的函数。一般而言，需要高速的能量消耗(因此高转速)以产生小气泡(例如，见：″Chemical Engineering for the Food Industry″，Fryer，Pyle andRielly，Blackie，London，1997)。
充气步骤的有效性还取决于充气装置中流动的性质。一般通过初始掺入相对大的气泡，随后分裂成较小的气泡来实现充气。人们已经知道，与简单的剪切流相比，拉伸流或伸长流对分裂气泡特别有效(见Rallinson，J.M.Ann.Rev.Fluid Mech.16，pp 45-66，1984)。适宜的可以提供至少一部分拉伸流的高剪切充气过程及装置包括：在转子-定子装置中连续振荡，如Oakes混合器(E.T.Oakes Corp)、Megatron混合器(Kinematica AG)、Mondo混合器(Haas-Mondomix BV)或Silverson混合器(Silverson Machines Inc)；气体注入后接着在连续流体装置中进行混合和分散，如刮面式换热器；分批振荡包含气体的表面夹带，例如用Hobart whisk混合器(Hobart UK)、KenwoodChef混合器(Kenwood Ltd)、Ultra-Turrax混合器(IKA Werke GmbH&Co.KG)或电动手持式混合器，如Breville kitchen手持搅拌器。
充气步骤的有效性还取决于混合物的粘度和/或温度。通过增加混合物的粘度和/或降低温度，充气装置对气泡尺寸减小的影响被增强。此外，充气步骤的效果还取决于混合物的配方。
尽管充气步骤的效果取决于所用的工艺和装置以及正充气的混合物的具体细节，通过考虑上述因素，本领域技术人员通过考虑上述因素，在具体情况下确定合适的工艺条件也属于本发明的范围。具体地，可以通过增加消耗的能量和/或通过增加拉伸流部分和/或增加混合物的粘度和/或通过降低混合物的温度，都可以增加非常小的气泡的比例。
例如，如果终产品是冷冻充气产品，如冰淇淋或雪酪，充气混合物可选择地在充气期间和/或之后进行冷冻。冷冻可以与充气同步进行，比如在刮面式换热器中。同步冻结和充气可以有助于形成非常小的气泡，因为冰形成时混合物的粘度增加。优选的是冻结在充气后进行，使得很少或者没有进一步掺入气体。
通过随后的冷冻操作可以进一步增加冰含量，例如低温挤压，将充气的混合物置于模具中，该模具浸在冷液体浴中，如盐水或乙二醇；将部分充气混合物直接滴入低温液体浴中，如液体氮气，或者将包含充气混合物的容器置于冷环境中，如冷冻机、气流冷冻器或冷藏库中。随后的冻结步骤优选地是在低剪切或零剪切下进行，使得很少或者没有进一步掺入气体。
除了本发明的多肽，本发明的充气食品(以及制备它们的混合物)可包含食品中常规存在的其他成分，如脂肪、奶或奶油；油或脂肪，特别是乳化相的形式；糖、盐、水果和/或蔬菜原料、提取物、果汁、增稠剂，如多糖、稳定剂、色素、调味剂，化学乳化剂，如单甘油酯；酸和防腐剂。优选的食品包括冰淇淋、雪酪、慕斯、生奶油、充气饮料，如奶昔和沙冰、低脂肪的糊状食品(如脂肪含量0-60wt％)、调料和调味汁。优选地，食品是冷冻或冷藏的充气甜食，如冰淇淋、冰糕或慕斯。
本发明冷冻充气甜食包含本发明的多肽，并可选地有一种或多种本发明多肽以外的抗冻多肽。在充气产品中，抗冻多肽的总量通常为至少约0.0001wt％，更优选至少0.0005wt％，最优选至少0.001wt％。抗冻多肽可以很低的浓度使用，因此优选地甜食含有小于0.05wt％的抗冻多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％。抗冻多肽可以单独使用，或者与本领域已知的其他抗冻多肽联合使用。
冷冻充气产品可选择地包含包衣，如巧克力层、或糖皮和/或内含物，如坚果、水果、太妃糖或巧克力片。在这种情况下，冷冻充气甜食中的脂肪含量不包括存在于包衣或内含物中的脂肪。
在一种实施方式中，冷冻充气甜食包含3wt％或更少的脂肪。优选2wt％或更少，更优选1wt％或更少。在优选的实施方式中，甜食是无脂肪的，意思是甜食基本上不包含脂肪(即，低于0.1wt％)。
包含本发明的多肽以及疏水蛋白和表面活性剂的充气食品
本发明还提供一种包含本发明的多肽以及疏水蛋白和表面活性剂的冷冻充气食品，如甜食。优选地，该充气食品包含大量气泡，其中至少65％的气泡具有低于20μm的直径。
冷冻充气甜食中存在的疏水蛋白的量一般会随甜食配方和气相的体积而变化。通常，甜食含有至少0.001wt％的疏水蛋白，更优选至少0.005或0.01wt％。通常，甜食含有低于1wt％的疏水蛋白。疏水蛋白可以是单一源或多源的形式，例如，疏水蛋白可以是两种或多种不同疏水蛋白多肽的混合物。
疏水蛋白是以可以稳定气相的形式和量添加。术语“添加”是指疏水蛋白有意地引入甜食中，目的在于利用其稳定泡沫的性质。所以，当存在或添加含有真菌污染物的成分，其可能含有疏水蛋白多肽时，这并不构成本发明上下文所指的添加疏水蛋白。
疏水蛋白通常以一种形式添加到甜食中，使得它能够在气-液表面自我组装。
疏水蛋白通常以分离的形式添加到本发明的甜食中。通常至少部分被纯化，比如基于固体重量，至少10％的纯度。“以分离的形式添加”是指疏水蛋白不是作为天然产生的有机体被添加，例如天然地表达疏水蛋白的蘑菇。相反，疏水蛋白通常提取自天然产生源，或者通过在宿主有机体中重组表达来获得。
在一种实施方式中，疏水蛋白是以单体、二聚体和/或寡聚体(即，由10个或更少的单体单元组成)添加到甜食中。优选地，添加的疏水蛋白的至少50wt％是这些形式中的至少一种，更优选至少75％、80％、85％或90wt％。一旦加入，疏水蛋白通常将在气体、液体界面进行组装，因此单体、二聚体和寡聚体的量预计将减少。
本文使用的术语“表面活性剂”(或“表面活化剂”)表示降低介质的表面张力的物质，其中该物质溶解于介质中，并因此积极吸附在液/气界面。
该术语包括通过在液体表面自发扩散，降低液体表面张力的难溶性物质。在本发明上下文中，术语“表面活性剂”不包括疏水蛋白。
术语“表面活性剂”不包括可能以非常低的量存在于其他(非表面活性)成分中的微量表面活性成分，例如稳定剂，如果胶、刺槐豆胶和瓜尔豆胶。在这种情况下，表面活性剂的量通常低于食品重量的0.05％。
表面活性剂通常是充气食品中使用的成分，因为它对口味和/或质地有有益作用。这种表面活性剂包括(但不限于)：
乳多肽：如酪蛋白，乳清(及其多肽片段)、酪蛋白钠、酪蛋白钙和水解乳清多肽；
其他多肽，如明胶、鸡蛋多肽、大豆多肽；
饱和或不饱和脂肪酸的单甘油酯和双甘油酯，如单甘油棕榈酸酯；
六元醇(通常为山梨醇)、乙二醇、乙二醇酯、聚甘油酯、山梨醇酐酯、硬脂酰乳酸、醋酸酯、乳酸酯、柠檬酸酯、乙酰单酸甘油乙酯、双乙酰酒石酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐酯(如聚山梨醇酯80)的聚氧乙烯衍生物；
非-离子表面活性剂，如烷基聚(环氧乙烷)、脂肪醇和蔗糖酯；
磷脂、磷脂类(如卵磷脂)混合物；以及上述任意混合物。
优选地，表面活性剂的量是产品重量的至少0.05％，更优选至少0.1％。优选地，表面活性剂为多肽，更优选乳多肽，并且是以食品重量的至少0.5％的量存在，更优选至少1％。优选地，表面活性剂是以食品重量的最多20％的量存在，更优选最多10％，最优选最多5％。
本发明的充气食品可以用“预充气”途径来生产(上述公开了进一步的细节)，这是一种从含有疏水蛋白和表面活性剂的未充气混合物开始，生产含大量小气泡的充气食品的过程。另一种途径称作“后添加”，提供了一种在充气之后添加表面活性剂的过程。
后添加途径提供一种方式，其中疏水蛋白的量可以增加，这与气泡形成时的表面活性剂的量有关，但充气发生之后添加表面活性剂时，它在终产品中保持不变。由此，将包含疏水蛋白而不含表面活性剂的混合物充气；随后将含有表面活性剂的第二混合物与该充气混合物合并。第二混合物经配方设计，使得合并的混合物具有令人满意的终产品配方。混合步骤可以用于改善合并混合物的均匀性。混合步骤优选在相对低剪切和短时间下进行，使得很少或几乎没有掺入气体(即，混合步骤膨胀率增加不超过10％)。适宜的混合装置包括：静态混合器；直列式动态混合器，如螺丝钻、搅拌机或加果机；分批混合装置，如搅拌容器。在批处理中，第二(含表面活性剂的)混合物通常会在接近处理周期的末尾时注入。该混合步骤可以以连续过程进行，比如在刮面式换热器中，或者螺旋挤压机中，在产物快要排出的时刻，将第二混合物注入刮面式换热器或者螺旋挤压机的桶内。
例如，假如成品是冷冻充气产品，如冰淇淋或雪酪，充气混合物可选择地可以在充气之前和/或之后进行冷冻。冷冻可以与充气同步进行，比如在刮面式换热器中。同步冷冻和充气可以有助于形成小气泡，因为当冰形成时混合物粘度增加。当冷冻在充气之后进行时，优选地是这样进行，使得很少或没有进一步掺入气体。当表面活性剂在充气之后加入时(即，后加入途径)，冷冻可以在混合步骤之前和/或混合期间进行。表面活性剂流可在混合之前变冷或部分冷冻。
含有本发明多肽的冷冻水甜食
冷冻水甜食通常相对较小，例如平均体积小于1ml，更优选小于0.5ml。举例来说，5mm至10mm直径的珠的体积会在约0.065ml至约0.5ml。通常离散的冷冻甜食具有最小的平均体积，使得各甜食能够容易地被消费者区分。例如，离散的冷冻甜食优选地具有至少约0.02ml的最小平均体积。
离散冷冻水甜食可以制成任意形状，比如立方体或球体。优选的是，冷冻甜食基本上是球体。
冷冻水甜食可以是复合产品的形式，其中该产品的至少一部分或区域，比如核或层，不含有本发明的多肽。这种情况的一个实例是含有冰淇淋核的产品，该冰淇淋核不含本发明的多肽，涂上一层含有本发明多肽的水冰。优选地，基本上复合甜食的外层含有本发明的多肽，即会接触到其他离散的冷冻甜食的区域。可以理解的是，对于复合产品来说，加到甜食中的本发明多肽的wt％量的计算仅与含有本发明多肽的甜食组分有关，而与完整的产品无关。
冷冻水甜食可以是充气或未充气的。未充气是指膨胀率小于20％的冷冻甜食，优选小于10％。未充气的冷冻甜食不进行有意的步骤，比如振荡以增加气体含量。然而，可以理解的是，在未充气冷冻甜食的制备期间，低水平的气体，如空气，可能掺入该产品中。
水冰甜食通常含有糖、水、色素、果酸或其他酸化剂，水果或水果调味剂和稳定剂。优选地，总固体含量为至少6wt％，更优选至少8wt％，或至少10、12、15或20wt％，并且可高达约35wt％。优选地总固体含量小于35wt％，更优选小于25wt％。水冰可以是充气或未充气的。如果充气，膨胀率通常小于约50％，比如约25％至30％。在一种实施方式中，本发明的水冰甜食是未充气的。
水冰甜食优选地包含低于2wt％的人造甜味剂，更优选小于1wt％。在高度优选的实施方式中，水冰甜食中不存在人造甜味剂，如阿斯巴甜或安赛蜜。
本发明的冷冻水甜食通常包含一种或多种稳定剂，例如选自树胶、琼脂、藻酸盐及其衍生物、明胶、果胶、卵磷脂、羧甲基纤维素钠、卡拉胶和红藻胶的一种或多种稳定剂。优选使用稳定剂的混合物，如树胶和卡拉胶的混合物。在优选的实施方式中，冷冻甜食包含0.1-1wt％的稳定剂。
本发明冷冻水甜食通常包含至少约0.0005wt％的本发明多肽。本发明多肽可以以非常低的浓度使用，因此甜食优选地包含小于0.05wt％的本发明多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％。
本发明冷冻水甜食可以用本领域内已知的多种技术来生产。例如，通过将液体混合物分配滴加至液氮的冷藏室内制备自由流动的珠子(见WO96/29896)。通过模制技术可以生产其他形状，例如通过将液体预混合料引入冷却的模具中。模制产品可包含复杂的形状，并且具有高度的表面定义。
含冰淇淋的产品及类似产品不需要进行低于-20℃至-25℃的冷硬化步骤，不过视需要也可以用到该步骤，尤其当产品是具有不含本发明多肽的层或核心的复合产品。
本发明冷冻水甜食产品可以包装在容器中作为独立的单元向消费者出售。这种容器的体积通常为100ml至1000ml，例如200ml至500ml。
然而，该产品也可以包装在较大的容器中用于零售目的，在零售条件下将产品分散到较小的容器中，比如在快餐店，或者作为混合选择模式，此时消费者可以从本发明具有不同形状、味道和/或颜色的冷冻甜食中进行选择。例如这些较大的容器具有大于约1000ml的体积，如至少2000ml或5000ml。
含有本发明多肽的离散冷冻乳制品甜食
本发明还提供冷冻甜食产品，包含多种离散未充气的乳制品冷冻甜食，它们能够直接接触产品中的其他离散冷冻甜食。
冰甜食是用于以冷冻状态(即，在食品温度小于0℃的条件下，并且优选地在食品包含大量冰的条件下)消费的甜味加工食品。本发明的冰甜食包含1-8wt％的脂肪，并且总固体含量为10-25wt％。脂肪和总固体的这些量，与水溶性充气气体以及本发明的多肽一起，使产品具有令人满意的质地和外观。典型的水冰配方(不含脂肪)和标准冰淇淋配方(总固体含量至少约30wt％)不属于离散冷冻乳制品甜食的定义。
本发明的冰甜食优选地包含2-6wt％，更优选2.5-5wt％的脂肪。脂肪可以来自任意适宜的来源，如乳脂、椰子油、棕榈油、可可油、葵花籽油、橄榄油或菜油、及其混合物或馏分。
冰甜食总固体含量是甜食的干重，即除去水之外的所有成分的总重，表示为总重量的百分比。它是按照Ice Cream，6th Edition，p 296中的描述来测定。本发明的冰甜食具有的总固体含量为冰甜食的10-25wt％。总固体含量优选地为至少12％，更优选至少15％，最优选至少18％。总固体量优选地最多为24％，更优选最多22％。
本发明的冰甜食含有冰。因为总固体含量是10-25wt％，水含量相应地为90-75wt％。在-18℃的温度下，大部分而不是全部的水被冻结。
本发明的冰甜食通常包含至少约0.0001wt％的本发明多肽，更优选至少0.0005wt％。本发明的多肽可以在非常低的浓度下使用，因此优选地甜食包含低于0.05wt％的本发明多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％，更优选0.005-0.01wt％。
充气剂是指因为其具有的表面活性和/或粘度而有助于形成小气泡并且抵制气泡合并和分离的任意成分。充气剂应理解为不包含充气的气体。充气剂优选地是多肽基充气剂，例如水解的乳多肽，如HygelTM和HyfoamaTM(购自Kerry Biosciences)；或者水解的大豆多肽，如Versawhip(购自KerryBiosciences)，和D-100TM(购自Gunter Industries)。或者，充气剂可以是非蛋白基的，例如单甘油酯，如Myverol 18-04K(由植物油制备的经蒸馏的95％单甘油酯，购自Quest International)，或聚甘油酯，如PGE 55(脂肪酸的聚甘油脂，购自Danisco)。甜食中的充气剂的量为至少0.1wt％，优选至少0.15wt％。
优选地，充气剂的量小于0.5wt％，优选小于0.4wt％，更优选小于0.25wt％。
本发明的冰甜食可包含稳定剂。稳定剂包括多肽，如明胶；植物压出物，如阿拉伯树胶、茄替胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶；种子胶，如刺槐豆胶、瓜尔豆胶、塔拉胶、洋车前子种子胶、温悖种子胶或罗望子种子胶；魔芋甘露聚糖；海藻提取物，如琼脂、海藻酸、卡拉胶或红藻胶；果胶，如低甲氧基或高甲氧基型果胶；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、甲基纤维素和甲基乙基纤维素、或羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；以及微生物胶，如葡聚糖、黄原胶或β-1，3-葡聚糖。稳定剂可以是单一稳定剂，或者两种或多种稳定剂的混合物。优选地，稳定剂是刺槐豆胶。稳定剂的量优选为最多0.3wt％，更优选最多为0.25wt％。例如，稳定剂的量通常为0-0.2wt％。
本发明的冰甜食可包含多肽(除任意的多肽基充气剂之外)，优选地是至少1wt％的量，更优选至少1.5wt％。包含至少上述量多肽的冰甜食被认为是乳冰型产品，与大量不含多肽的冰甜食相比更吸引众多消费者。优选地，多肽含量小于8wt％，更优选小于6wt％，最优选小于3wt％。用于本发明的适宜的多肽包括乳多肽、蛋多肽和胶质以及蔬菜多肽，如大豆多肽。尤其优选的是乳多肽，因为它们有更好的味道和热稳定性。乳多肽的适宜来源包括牛奶、浓缩奶、奶粉、乳清、乳清粉和乳清多肽浓缩分离物。
本发明的冰甜食通常包含糖，如蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、玉米糖浆、糖醇；它们还可包括其他成分，如色素和调味品。
冰甜食优选地具有至少20％的膨胀率，更优选至少40％，最优选至少60％。优选地，膨胀率为最多150％，更优选最多120％，最优选最多120％。
“混合物”指充气前(或融化的冰甜食除气后)的未充气混合物。膨胀率是在大气压力下测定。
本发明的冰甜食可构成整个产品或可为复合产品的一个组分。在复合产品中，本发明的冰甜食提供的质地和外观与产品其他组分形成对照。优选地，这种复合产品包含冰甜食作为其结构中的离散元素。例如，相对软的冰淇淋核可以包覆一层冰甜食，以提供包围冰淇淋核的硬质酥脆层。另一个实例是掺入冰甜食作为内含物。或者，冰甜食可以在至少一个表面上设置有比如冰衣、未充气的水冰或巧克力的连续或部分包衣。在复合产品中，总固体和脂肪、充气剂、冰结构多肽、稳定剂以及多肽含量的测定仅考虑冰甜食，而不考虑复合产品其他组分。
含有本发明多肽的离散冷冻乳制品甜食可用本领域已知的任意适宜的方法来制备，然而，离散乳制品甜食优选地通过以下方法制备，包含步骤：
(a)制备成分的混合物；然后
(b)巴氏杀菌并匀化该混合物；然后
(c)添加本发明的多肽；
(d)同时使该混合物冷冻并用充气气体对该混合物充气，充气气体含有至少50％体积的二氧化碳、氧化亚氮或其混合物，以生产冰甜食(例如在冰淇淋冷冻机中)；
(e)冷加工硬化该冰甜食，其中步骤(c)可以在步骤(b)期间或之前、之后进行。
混合物用气体充气，该气体含有至少约50％体积的二氧化碳、氧化亚氮或其混合物，优选至少约70％，更优选100％。充气气体的剩余部分通常为含氮气的气体，如空气。充气气体最优选地是100％二氧化碳。
冷冻后，得到的冰甜食可以在冷硬化步骤之前，比如通过挤压，随后切割或模制来成型。冰甜食优选地是在4℃至-1.5℃的温度下挤压，更优选-2.5℃至-1.5℃。相对高的挤压温度产生相当好的泡沫状外观。
冷硬化步骤优选地在约-25℃或更低的温度下进行，例如通过鼓风冷冻。在冷硬化之后，冰甜食优选地储存在-25℃至-10℃温度下，通常约-18℃。
含有本发明多肽的低脂肪乳制品
本发明还提供冷冻的低脂肪乳制品。冷冻乳制品甜食是通常含有乳或乳固体的甜食，如冰淇淋、奶冰、冷冻酸奶和果子露。术语“乳”包括乳替代品，如大豆乳，但优选的是哺乳动物的奶。冷冻乳制品甜食优选地是冰淇淋或奶冰。
本发明的低脂肪产品优选包含3wt％或更少的脂肪，优选2wt％或更少，更优选小于2wt％，或1wt％或更少。在一种实施方式中，该产品是不含脂肪的，意思是该产品中基本不含脂肪(即低于0.1wt％)。当产品包覆有非乳成分，如巧克力或糖皮层时，该产品脂肪量的测定应该排除包衣。
含乳的冷冻甜食优选包含至少约3wt％的无脂乳固体(MSNF)，更优选约5wt％至约25wt％的MSNF。
稳定剂可存在于本发明的冷冻产品中，但应该注意的是，本发明多肽的稳定作用在某些情况下可以代替稳定剂。然而，在某些产品配方中，比如含有低于1wt％脂肪的极低脂肪产品，除了本发明的多肽之外，仍可能需要大量的稳定剂，以产生令人满意的产品稳定性。然而，所得产品较以前的产品有所改进。因为本发明的多肽降低或改善了稳定剂对质地和味道的不良效果。
适宜的稳定剂包括藻酸盐、明胶、阿拉伯树胶、瓜尔豆胶、刺梧桐树胶、刺槐豆胶、卡拉胶及其盐、黄树胶、微晶纤维素、纤维素醚或其混合物。按重量计，稳定剂的量优选地为1.5％或更少，更优选1％或更少，如0.1-0.8wt％。
在一种实施方式中，产品包含至少0.5wt％的稳定剂，如至少0.7wt％的稳定剂。这种产品中的脂肪水平优选地为小于2wt％或1wt％。在另一种实施方式中，产品包含小于0.5wt％的稳定剂。这种产品中的脂肪水平优选地为至少1wt％或更多，更优选至少2wt％。
本发明的冷冻甜食通常包含至少约0.0001wt％的本发明的多肽。更优选至少0.0005wt％。本发明的多肽可以在非常低的浓度下使用，因此甜食优选地包含小于0.05wt％的本发明的多肽。优选的范围是约0.001-0.01wt％，更优选0.005-0.01wt％。
冷冻甜食可以是充气或未充气的，优选充气。未充气是指冷冻甜食具有小于20％的膨胀率，优选小于10％。未充气的冷冻甜食不进行有意的步骤，如振荡以增加气体含量。然而，可以理解的是，在未充气冷冻甜食的制备期间，低水平的气体，如空气，可能掺入该产品中。充气产品中存在的膨胀率的量会根据所需的产品性质而变化。例如，冰淇淋中膨胀率的量通常为70-100％，甜食如慕斯中的膨胀率可以高达200-250wt％，而奶冰中的膨胀率为25-30％。充气冷冻甜食优选地具有30％至200％的膨胀率，更优选50％至150％。
本发明的冷冻甜食可以用本领域内已知的各种技术来制备。产品通常静止或者使用搅拌冷冻，比如在刮面式换热器中。产品可以是模制的。产品可以包含复杂形状，并具有高度的表面定义，因为本发明多肽的添加保持了这种形状和结构的稳定性。
本发明的多肽可以在产品冷冻之前、期间或之后添加。如果在冷冻之后添加，则这将在产品仍可塑时进行，以便本发明的多肽可以被混合，例如在从刮面式换热器挤压后以及在硬化之前。
冰淇淋产品及其类似品可以进行可选的低于-20℃至-25℃的冷硬化步骤。
本发明还包括用于生产本发明的低脂肪冷冻甜食产品的组合物，该组合物包含本发明的多肽，优选至少0.005wt％的本发明多肽。这种组合物包括液体预混合物和干燥混合物，比如粉末，其中向干燥混合物中添加水液，比如奶或水。
设计用于在微波中解冻的冷冻食品，所述食品含有本发明的多肽
冷冻是用于贮存食品的非常常见的技术。除了某些明显的例外，冷冻食品通常在使用之前或者进一步处理之前解冻(如，烹饪)。通过将冷冻食品置于室温下圆满地完成解冻。然而，即使在家用规模上，完成令人满意的解冻所耗费的时间长也是相当大的。在工业规模上，解冻还通过对冷冻食品应用传导或对流热来完成。然而，需要完成这种解冻的设备对于消费者不容易获得。
微波炉正日益广泛地用于工业和家庭背景。它们其中的一个用途是解冻冷冻食品。微波解冻比在室温下解冻更快速。它也具有许多缺点：
■冷冻食品的低热扩散需要使用脉冲微波，以允许建立温度平衡；
■液体水比冰更容易吸收微波能量，往往导致“热点”及不平衡的解冻。
■与大小和形状相关的食品的几何学必须是适宜的；
■因为必须只用间歇的微波脉冲，解冻食品的时间是相当可观的。
已经发现，如果将含有中间相的水、乳化剂以及本发明多肽的组合物掺入食品中，以及如果至少水的量是作为未冻结水存在于冷冻食品中，则获得了改进的食品。
此处词汇“中间相”同时包括层状结构和传统的中间相，即片状、立方体、六角形(1和2)，L2和L1也分散的中间相，即脂质体、立方晶和六角相。此外，它包括形成胶束，该胶束也会形成这类表面。
已经发现，通过应用直接的微波能量可以均匀并快速地解冻上述冷冻食品，而没有必要使用间歇或脉冲微波。
可以相信的是，本发明系统保持冷冻食品中存在的部分未冻结水的能力是因为组合物形成中间相的能力。中间相是一种结构，其中极性乳化剂和水根据它们的极性排列在清晰的结构中。乳化剂的极性端基与水相接触。相信存在许多不同的中间相结构。与乳化剂的极性端基接近的水是以一种免于冻结的方式进行组织排列。
本发明组合物中水与乳化剂的比率取决于使用的乳化剂，以及组合物的具体应用。已经发现，对于任意具体的乳化剂/水系统，低于0℃存在的液体水的量(“未冻结水”)往往随水的比例增加直至最大值。达到该最大点时，基本上系统内所有的水被认为是未冻结的。超过该点时，存在的水的固定量是未冻结的，与冻结相平衡。
优选地，当存在于-15℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
优选地，当存在于-20℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
优选地，当存在于约-25℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
优选地，当存在于约-40℃或者更低温度下的冷冻食品中时，本发明的组合物包含至少一定量的未冻结水。
当存在于冷冻产品中时，本发明的组合物优选包含一定量的未冻结水，该未冻结水在低于0℃温度下是热力学稳定的。
优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少0.1％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少1％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少2％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少3％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少5％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的至少10％的量存在。
优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多99.9％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多50％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多40％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多30％的量存在。优选地，水组分是以基于组合物总重量的最多25％的量存在。
优选地，水组分是以基于组合物总重量的0.1-99.9％之间的量存在。更优选地，水组分是以基于组合物总重量的1-25％之间的量存在。
优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少0.1％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少50％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少60％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少70％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少80％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少99.0％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的至少99.9％的量存在。
优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至99.9％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至99％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至97％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至95％的量存在。优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的多至90％的量存在。
优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的0.1-99.9％之间的量存在。更优选地，乳化剂是以基于组合物总重量的75-90％之间的量存在。
优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少0.001％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少0.01％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少0.1％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少1％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少5％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的至少10％的量存在。
优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多90％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多50％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多25％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多15％的量存在。优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的最多10％的量存在。
优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的0.001-90％之间的量存在。更优选地，本发明的多肽是以基于组合物总重量的0.01-10％之间的量存在。
在一个优选的方面，组合物包含低于25％w/w的油。更优选地，组合物包含低于10％w/w的油。更优选地，组合物包含低于5％w/w的油。更优选地，组合物包含低于1％w/w的油。更优选地，组合物包含低于0.1％w/w的油。最优选地，组合物基本不包含油。
其余组分也可存在于本发明的组合物中，只要它们在冷冻食品中存在时不影响保留至少一部分未冻结水的能力。
进行结合技术的一个实例是混合。将水与本发明的多肽和乳化剂混合可通过本领域技术人员显而易见的任意一种方法来实现。在电动混合器中混合就是一个实例。
如果组合物中存在除本发明的多肽、乳化剂和水以外的成分，那么这些成分可以在任意合适的阶段掺入。
优选地，食品包含足够量的组合物，以便食品中作为整体形式存在的未冻结水的量使均匀和快速的微波解冻成为可能。实际上，这相当于食品中作为整体存在的未冻结水的量为至少0.1％w/w。
用量水平取决于具体的食品、应用以及在冷冻后需要多少水来保持食品质地。
总产品的低至约0.1％的非冻结水的量使产品在微波炉中加热时快速并均匀地解冻。这种炉解冻使产品具有改进的结构性质。为得到本发明0.1％的未冻水，需要用大约0.20％的PGE。准确的乳化剂的量取决于乳化剂的性质，并且可由本领域技术人员快速确定。例如，0.14％的MO90或0.14％的PGE O70(Danisco，Denmark)会产生相同的效果。
优选地，食品包含至少0.1％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.2％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.3％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.4％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含至少0.5％w/w的本发明的组合物。
优选地，食品包含小于10％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含小于5％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含小于4％w/w的本发明的组合物。优选地，食品包含小于3％w/w的本发明的组合物。
优选地，食品包含0.1-5％w/w的本发明的组合物，更优选0.5-3％w/w。
本发明组合物的应用模式取决于所讨论食品的性质。例如，如果食品在室温下是液体或者半液体，则该组合物可以简单地通过将其与食品混合而掺入。
在本发明的某些实施方式中，水、本发明的多肽和乳化剂可以分别添加到食品中。本发明的多肽和乳化剂可以在加水之后加入。或者，水可在加入本发明的多肽和乳化剂之后加入。
优选的是，本发明的多肽、乳化剂和水在添加到食品之前合并。
或者，该组合物可以在食品制备工艺的任意时刻掺入。例如，组合物可以喷在食品的表面。组合物可以注入食品中(如，就禽、肉或鱼而言)。
技术人员可以判断何时最佳实现这种纳入。
优选地，食品选自低脂肪涂布的蛋黄酱、酸奶、面包馅料、人造黄油、重组水果、果酱、水果配料、水果馅、奶粉(ripple)、水果酱、炖水果、咖啡奶精、即时水果甜食、甜食(如棉花糖)，土豆基食品(如炸土豆条、炸薯条和炸丸子)，配制的餐食(如砂锅和炖菜)，以及精制食品(如调料，包括沙拉调料；番茄酱、油酱汁和汤)。该食品可以是饮料类、生的，经过处理或巴氏灭菌的食品，包括生肉、熟肉、生的家禽产品、熟的家禽产品、生的海鲜产品、熟的海鲜产品、[生或熟肉、禽和海鲜产品]、腊肠、香肠、易于吃掉的餐食、通心粉酱、巴氏灭菌的汤、腌泡汁、水油包乳剂、油包水乳剂、涂抹干酪、加工奶酪、乳制品甜食、调味乳、奶油、发酵乳制品、奶酪、黄油、炼乳制品、涂抹干酪、巴氏灭菌鸡蛋液、冰淇淋混合物、大豆制品、巴氏灭菌液体蛋、糕点产品、水果产品，以及带有脂肪基或含水填料的食品。食品可以是焙烤食品，如面包、蛋糕、精面包和生面团。
本发明的化妆品和皮肤病治疗的组合物
本发明还提供一种化妆品或皮肤科制剂，其包含本发明多肽-可选择地联合有一种或多种选自抗冻多肽或抗冻糖蛋白的另外多肽。
这种制剂可仅包含本发明的多肽，或者该制剂可包含至少一种另外的抗冻多肽。而且，该组合物可包含至少一种抗冻糖蛋白以及本发明的多肽。
在制备时，本发明的多肽在制剂中可以基于该制剂的总重量的0.0001％至50％重量的浓度存在，例如0.001％至50％重量，例如0.1％至10％重量，例如0.1％至1％重量的浓度。
在一些情况下，当选自抗冻多肽和抗冻糖蛋白的一种或多种另外多肽与本发明的多肽一起也存在于该制剂中时，多肽的总量是基于该制剂总重量的0.0001％至50％重量，例如0.001％至50％重量，例如0.1％至10％重量，例如0.1％至1％重量的浓度。
优选地，所述至少一种另外的抗冻多肽可包含至少一种选自AFP 1、AFP 2、AFP 3和AFP 4的多肽，例如，至少一种AFP 1型多肽，该多肽是由pseudopluronectes americanus、myoxocephalus scorpius、myoxocephalusaenaeus和/或myoxocephalus scorpiodes合成；至少一种AFP2型多肽，该多肽是由hemitripterus americanus、osmerus mordax和/或clupea harengusharengus合成；至少一种AFP3型多肽，该多肽是由macrozoarcesamericanus、rhigophila dearbomi lycodes polaris和/或“狼鱼”合成；和/或至少一种AFP 4型多肽，该多肽是由myoxocephalus octodecimspinosis合成。优选地，所述至少一种抗冻糖蛋白可包含至少一种多肽，该多肽是由rematomasborgrevinki、dissostichus mawsoni、boreogadus saida和/或gadus morhua合成。
本发明的一个方面，将制剂中一种或多种多肽的至少一部分装入胶囊。
本发明还提供一种化妆品或者皮肤科制剂，其包含本发明的多肽以及一种或多种选自抗冻多肽或抗冻糖蛋白的多肽，该多肽由pseudopluronectesamericanus、myoxocephalus scorpius、myoxocephalus aenaeus、myoxocephalusscorpiodes、hemitripterus americanus、osmerus mordax、clupea harengusharengus、macrozoarces americanus、rhigophila dearborni、lycodes polaris、anarhichas lupus、myoxocephalus octodecimspinosis、trematomas borgrevinki、dissostichus mawsoni、boreogadus saida和gadus morhua中的至少一种合成。
优选地，本发明的多肽在所述化妆品和皮肤科制剂中的总量是基于所述制剂的总重量的0.001％至50％重量，例如，浓度为0.1％至10％的重量。优选地，多肽在化妆品或皮肤科制剂中的总量可以是基于所述制剂的总重量的0.001％至50％重量，例如浓度为0.1％至10％的重量。
本发明还提供一种化妆品或皮肤科产品，它是o/w型乳膏、w/o型乳膏、w/o/w型乳膏、o型乳膏、w/o型乳剂、水分散剂、凝胶状乳霜、w/o型棒或o型棒，并且它包含本发明的制剂，包括其各种形式。
本发明还提供一种治疗或预防不良皮肤状况的方法。该方法包括将本发明的多肽以及可选地一种或多种多肽施予至少部分皮肤，所述一种或多种多肽选自抗冻多肽和抗冻糖蛋白。
一方面，不良皮肤状况包括皮肤炎症、色素失调、外在和内在的皮肤老化的症状和/或紫外线辐射造成的皮肤损伤。
在化妆品和皮肤科制剂的技术领域，术语“抗冻多肽”用于描述使机体即使在极端的条件下仍能保持重要的细胞结构功能活性的多肽。考虑到它们的功能，“抗冻多肽”从这种意义上讲还代表细胞水平上的“防冻保护化合物”。
本领域的技术人员不能预见到的是，本发明的制剂比现有技术的制剂更好地预防皮肤由于寒冷造成的结构和细胞损坏，更好地维持或恢复皮肤的阻隔性能，更好地对抗皮肤的干燥行为，更好地对抗皮肤变色行为，更好地克服发炎的皮肤状况，更好地对抗皮肤老化，以及更好地保护皮肤对抗周围环境的影响。
本发明的多肽可选地与另外的抗冻多肽(AFP)和/或抗冻糖蛋白(AFGP)一起使用，或者带有有效量的、可选地与另外的AFP和/或AFGP一起的本发明多肽的化妆品或局部皮肤科制剂，不但使有效的治疗成为可能，而且能预防皮肤由于寒冷造成的结构和细胞损伤，这种损伤伴随明显的气候和天气引起的温度下降，通过损失细胞酶的最佳温度引起细胞内和细胞外间隙的生理学变化、皮肤损害、皮肤发红和皮肤紧绷感、以及增加的感官敏感度，例如由寒冷、风和/或紫外线引起的温度敏感皮肤，由环境压力引起的(由温度变化和紫外线、吸烟、烟雾、活性氧簇、自由基引起)皮肤、嘴唇、鼻和口腔粘膜以及外皮的附着物的负面变化。
本发明的多肽可选地与另外的AFP和/或AFGP一起使用，或者带有有效量的、可选地与另外的AFP和/或AFGP一起的本发明多肽的化妆品或局部皮肤科制剂的使用，有效地治疗及预防缺陷的、敏感的或活动力低下的皮肤状况，或者显示皮肤过早老化的外皮附属物(如皱纹、老年性角化症、毛细血管扩张)或环境(吸烟、烟雾、活性氧簇、自由基)引起的外皮附属物的缺陷、敏感或活动力低下状况，尤其是光引起的皮肤和外皮附属物的负面变化，光引起的皮肤损伤，色素失调，敏感、刺激及瘙痒的皮肤，干燥的皮肤状况以及角质层屏障的紊乱，脱发及为了促进头发生长，皮肤老化的迹象，如皱纹、减少的皮肤再生，炎症皮肤状况和异位性湿疹、脂溢性湿疹、多形性光照性皮肤病、牛皮癣、白斑病，用以舒缓过敏或者刺激性皮肤，以刺激胶原、透明质酸和弹性蛋白的合成，健康皮肤正常的透明质酸和糖胺多糖的变化，以刺激皮肤神经酰胺的合成，以刺激细胞内DNA的合成，尤其是对于有缺陷或活动低下的皮肤状况，以增加细胞更新和皮肤再生，以增加皮肤自身保护和修复机制(比如，功能失调的酶、DNA、脂质和多肽)，缺陷、敏感或者活动低下的皮肤状况或缺陷、敏感或者活动低下的皮肤附属物中的细胞-细胞交流的减少，健康皮肤的神经酰胺、脂质和能量机制的变化，脂质和多肽过氧化反应的变化，生理性经皮水分散失的变化，皮肤保湿度的下降，皮肤水分含量正常的渗透调节和下降，天然保湿因子含量的变化，DNA损伤以及内源性DNA修复机制的下降，金属蛋白酶和/或其他蛋白酶的激活，或这些酶对应的内源性抑制剂的抑制，健康皮肤的结缔组织翻译后修饰的偏差，在头发和发区形成头皮屑，皮肤的脆性，丧失弹性和皮肤疲劳，正常角化细胞增殖的增加，减少皮肤和头发的天然再生和结构的下降，用在局部应用的激光和磨蚀处理的前处理和后处理中，比如，以减少皮肤皱纹和疤痕，以抵消形成的皮肤刺激并促进损伤皮肤的再生过程。
因此，本发明的多肽，可选地与另外的AFP和/或AFGP的共同使用，用于预防和治疗炎症皮肤状况-和异位性湿疹-和/或倾向于敏感和干燥的皮肤情况中的皮肤保护，也属于本发明的范围。
因此，该化妆品或皮肤科制剂的用途，用于生产化妆品和护肤品制剂，用于治疗和/或预防色素失调也属于本发明的范围。
因此，该制剂的用于生产化妆品或皮肤科制剂的用途，用于治疗和/或预防内部和/或外部皮肤老化症状以及用于治疗和预防紫外线辐射对皮肤的不良影响也属于本发明的范围。
因此，本发明的多肽，可选地与另外的AFP和/或AFGP的共同使用，用于生产化妆品或皮肤科制剂，以便增加神经酰胺生物的合成也是本发明的一个方面。
此外，AFP和/或AFGP在制备化妆品或皮肤科制剂以便增强皮肤屏障功能中的应用，也是本发明的另一个方面。
基于制剂的重量，本发明的化妆品或皮肤科制剂优选地包含基于该制剂的总重量的0.0001％至50％重量的本发明的多肽，尤其优选0.01％至10％重量，可选择地，本发明的多肽与另外的AFP和/或AFGP或所述AFP和/或AFGP的两种或多种的组合一起使用。
根据本发明，常规抗氧剂可以用于本发明的包含活性物质结合物的制剂。
有益的是，抗氧剂选自氨基酸(如甘氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸、β-丙氨酸)及其衍生物；咪唑类(如咪唑丙烯酸)及其衍生物；肽类，如D，L-肌肽，D-肌肽，L-肌肽及其衍生物(如鹅肌肽)；类胡萝卜素、胡萝卜素(如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素)及其衍生物；硫辛酸及其衍生物(如二氢硫辛酸)；金硫葡萄糖、丙基硫尿嘧啶和其他硫醇(如硫氧还蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺和糖基、N-乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊烷基、丁基和十二烷基、榈酰基、油烯基、γ-吲哚基、胆甾醇和甘油基酯)及其盐；硫代二丙酸月桂酯、二硫代丙酸二硬脂酰酯、硫二丙酸及其衍生物(酯、醚、肽、脂质、核苷酸、核苷和盐)和以非常低耐受剂量(如pmol-μmol/kg)的亚砜亚胺化合物(如丁硫氨酸亚砜亚胺、巯基丁氨酸亚砜亚胺、五-、六-和七-硫堇亚砜亚胺)；还有(金属)螯合剂(如α-羟基脂肪酸、棕榈酸、植酸、乳铁蛋白)；α-羟基酸(如柠檬酸、乳酸和苹果酸)、腐殖酸、胆汁酸、胆汁提取物、胆红素、胆绿素、EDTA、EGTA及其衍生物；不饱和脂肪酸及其衍生物(如γ-亚麻酸、亚油酸、油酸)；叶酸及其衍生物；丙氨酸二乙酸、类黄酮、多酚、儿茶酚、维生素C及其衍生物(如抗坏血酸棕榈酸酯、Mg-抗坏血酸磷酸酯、抗坏血酸醋酸酯)；维生素E及其衍生物(如维生素E醋酸酯)；以及安息香树脂的苯甲酸松脂、芸香亭酸及其衍生物；阿魏酸及其衍生物；丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、去甲二氢愈创木脂酸、去甲二氢愈创木酸、三羟基苯丁酮、尿酸及其衍生物；甘露糖及其衍生物；锌及其衍生物(如ZnO、ZnSO4)；硒及其衍生物(如硒代蛋氨酸)；芪类及其衍生物(如二苯乙烯氧化物、反式二苯乙烯氧化物)以及上述提及的本发明适用的活性成分的衍生物(盐、酯、醚、糖、核苷酸、核苷、肽和脂质)。
制剂中抗氧化剂(一种或多种化合物)的量优选地为基于制剂总重量的0.001％至30％的重量，尤其优选0.05％至20％的重量，尤其优选1％至10％的重量。
此外，有益的是将本发明活性成分用熔蜡封装，就像所称的固体脂质纳米微粒一样。熔蜡可选自但不限于蜡酯、甘油三酯蜡或烃蜡。而且，有益的是将本发明的活性成分封装在聚合物中，比如封装在基于高度交联聚甲基丙烯酸树脂和/或纤维三醋酸酯的颗粒中和/或作为芯/壳颗粒，该颗粒带有由聚甲醛、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚酯、胶质和聚烯烃制成。
用本发明的活性成分或者以本发明使用的活性成分作为有效内容物的化妆品或局部皮肤科制剂进行的预防或化妆品或皮肤科治疗，可以以常规的方式完成，即通过将本发明使用的活性成分或者以本发明使用的活性成分作为有效内容物的化妆品或局部皮肤科制剂施予皮肤疫区。
本发明使用的活性成分可以有利地掺入常规化妆品和皮肤科制剂中，它们可以呈现不同的形式。例如，它们可以是溶液、油包水(W/O)型或水包油(O/W)型的乳剂、或者复合乳剂，如水包油包水(W/O/W)型或油包水包油型(O/W/O)、水分散剂或油分散剂、凝胶、Pickering乳液、固体棒或喷雾剂。
为了本发明的目的，本发明的乳剂，比如乳霜、洗液、护肤乳的形式是有益的，并且可包含可能包括脂肪、油、蜡和/或其他油性物质和水，以及这类配方常规使用的一种或多种乳化剂。
为了本发明的目的，还可能有益地将本发明使用的活性成分掺入水体系或表面活性剂制剂中，用于清洁或处理皮肤和头发。
当然，本领域的技术人员可以意识到，要求严格的化妆品组分在不含常规的辅剂和添加剂时是难以想象的。辅剂和添加剂的实例包括增洁剂、填料、香料、染料、乳化剂、附加的有效成分，如维生素或多肽、光保护剂、稳定剂、杀虫剂、乙醇、水、盐，以及抗微生物的、蛋白分解的或促角质层分离的活性物质等。
相应的要求通过必要的变更可适用于药品制剂配方。
用于本发明目的的局部药用成分通常包括有效浓度的一种或多种药物。为简单起见，为明确区别化妆品和药物应用以及相应的产品，可参考德意志联邦共和国的法律规定(如化妆品指令、食品和药品法案)。
在这一方面，同样有益的是将本发明使用的活性成分作为添加剂添加到用于其他目的的已经包含其他活性成分的制剂中。
因此，为了本发明的目的，化妆品或局部皮肤科组分可以根据其配方用作护肤霜、洁肤乳、防晒乳液、营养霜、日霜或晚霜、护唇膏、鼻喷雾剂等。在某些情况下，可能有益的是将本发明的组合物用作药物配方的基础。
为了本发明的目的，同样有益的是提供一种化妆品和皮肤科制剂，它们的主要目的不是防晒，但是仍然含有一定量的UV防护物质。因此，如UVA和/或UVB过滤物通常包含在日霜或者面膜产品中。同时UV防护物质，视需要还有抗氧剂和防腐剂，都能有效保护制剂防止其变质。此外，遮光剂的形式的化妆品和皮肤科制剂也是有利的。
因此，本发明的制剂，除本发明的一种或多种活性成分组合外，优选地可额外地包含至少一种UVA过滤物质和/或UVB过滤物质。尽管不是必须的，该配方也可以选择性地包含一种或多种有机和/或无机色素作为UV过滤物质，该物质可以存在于水相和/或油相中。
优选的无机色素是在水中不溶或难溶的金属氧化物和/其他金属化合物，尤其是二氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)、氧化铁(如Fe2O3)、氧化锆(ZrO2)、氧化硅(SiO2)、氧化锰(如MnO)、氧化铝(Al2O3)、铈(如Ce2O3)、相应金属的混合氧化物，以及这些氧化物的混合物。
根据本发明，这些色素可以有利地进行表面处理(“包衣”)，比如，由此形成或保留了这些色素的亲水或疏水性质。这种表面处理可以包括通过已知的方法为色素本身提供一个薄的疏水层。
根据本发明，例如以辛基硅醇包衣的二氧化钛色素是有利的。适宜的二氧化钛颗粒可购自Degussa公司，商品名为T805。此外，以硬脂酸铝包衣的TiO2色素是尤其有利的，例如购自TAYCA公司，商品名MT100T。
无机色素进一步有利的包衣包括二甲基亚砜(又叫DMSO)，用三甲基硅氧基单元进行末端保护的完全甲基化的、线性硅氧烷聚合物的混合物。为了本发明的目的，尤其有利的色素是以这种方法包衣的氧化锌色素。
另一个优点是用二甲基聚硅氧烷(尤其是平均链长为200至350个二甲基硅氧烷单位的二甲基聚硅氧烷)和硅胶的混合物包衣的无机色素，硅胶也称作二甲基硅油。尤其有利的是无机色素已经另外用氧化铝或水合氧化铝(也叫矾土，CAS No.：1333-84-2)包衣。尤其有利的是被二甲基硅油和氧化铝包衣的氧化钛，该包衣也可能包含水。它的一个实例是购自merk公司、商品名为Eusolex T2000的二氧化钛。
为了本发明的目的，一种有利的有机色素包括2，2′-次甲基双-(6-(2H-苯并三氮唑-2-基)-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚)[INCI：双辛基三氮唑]，其可购自CIBA Chemikalien GmbH公司，商品名为Tinosorb(R)M。
有利的是，本发明的制剂含有吸收UVA和/或UVB范围内的UV辐射的物质，例如，该过滤物质的总量是基于制剂总重量的0.1％重量至30％重量，优选0.5-20％重量，尤其是1.0-15％的重量，以便提供保护头发或皮肤抵御整个范围紫外线辐射的化妆品制剂。它们也可以用作头发或皮肤的遮光剂。
为了本发明的目的，进一步有利的UVA过滤物质包括二苯甲酰甲烷衍生物，尤其是4-(叔丁基)-4′-甲氧基二苯酰甲烷(CAS No.70356-09-1)，由Givaudan公司销售，商品名1789以及由merk公司销售，商品名9020。
进一步有利的UVA过滤物质包括亚苯基-1，4-二-(2-苯并咪唑)-3，3′，5，5′-四磺酸及其盐，尤其是相应的钠盐、钾盐或三乙醇铵盐；尤其是亚苯基-1，4-二(2-苯并咪唑)-3，3′，5，5′-四磺酸二钠盐，INCI名为Bisimidazylate，可以购自Haarmann&Reimer公司，商品名Neo Heliopan AP。
1，4-二(2-氧代-10-硫-3-bornylidenemethyl)苯及其盐(尤其是相应的10-硫酸根合化合物，尤其是相应的钠盐、钾盐或三乙醇铵盐)也是有利的，它也被称为苯基-1，4-二(2-氧-3-bornylidenemethyl-10-磺酸。
为了本发明的目的，有利的UV过滤物质也是所谓的宽带过滤器，即同时吸收UVA和UVB辐射的过滤物质。
例如，有利的宽带过滤器或者UVB过滤物质包括bis-resorcinyltriazine衍生物。尤其优选的是2，4-二{[4-(2-乙基己氧基)-2-羟基苯基}-6-(4-甲氧基苯基)-1，3，5-三嗪(INCI：Aniso Triazine)，可购自CIBA-Chemikalien GmbH，商品名S。
为了本发明的目的，尤其有利的制剂的特征是具有高或很高的UVA保护，优选包含几种UVA和/或宽带过滤物，尤其是单独或者相互任意结合的二苯甲酰甲烷衍生物[如，4-(叔丁基)-4′甲氧基二苯甲酰甲烷]、苯并三唑衍生物[如，2，2′亚甲基-二-(6-(2H-苯并三氮唑-2-基)-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚]、亚苯基-1，4-二(2-苯并咪唑基)-3，3′，5，5′-四磺酸和/或其盐、1，4-二(2-氧代-10-硫基-3-bornylidenemethyl)苯和/或其盐，和/或2，4-二{[4-(2-乙基己氧基)-2-羟基苯基}-6-(4-甲氧苯基)-1，3，5-三嗪。
本发明有利地使用的另一种光保护过滤物质是乙基己基-2-腈基-3，3-二苯基丙烯酸酯(氰双苯丙烯酸辛酯)，其可购自BASF公司，商品名N539。
另外相当有利的是，在本发明的制剂中使用聚合物束或聚合物UV过滤物质，尤其是WO-A-92/20690中描述的那些。
此外，还可能有利的是将进一步的UVA和/或UVB过滤物纳入本发明的化妆品或皮肤科制剂中，例如某些水杨酸衍生物，如4-异丙基苄基水杨酸酯、2-乙基己基水杨酸酯(-辛基水杨酸盐)以及原膜散酯。
当然，上述列出的可以用于本发明目的的UV过滤物并不是对本发明的限制。
本发明的制剂有利地包含可以吸收UVA和/或UVB范围中的UV辐射的物质。例如，它们是基于制剂的总重量的0.1％重量至30％重量，优选0.5％至20％重量，尤其是1.0％至15％重量，以便制备可获得的化妆品制剂，其可以保护头发或皮肤免受整个范围的紫外线辐射。它们还可以用作头发和皮肤的遮光剂。
本发明的化妆品和皮肤科制剂可以包括化妆品活性成分，这种制剂中常规使用的辅助剂和添加剂，例如抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、香料、消泡剂、染料、着色颜料、增稠剂、表面活性剂、乳化剂、润肤剂、保湿剂和/或润湿剂、脂肪、油、蜡和其他常规的化妆品或皮肤科制剂组分，如醇、多元醇、聚合物、泡沫稳定剂、电解质、有机溶剂或有机硅衍生物。
如果本发明的化妆品或皮肤科制剂是以溶液或乳剂或分散剂的形式存在，则以下可用作溶剂：水或水溶液；油，如癸酸或辛酸的甘油三酯，优选蓖麻油；脂肪、蜡以及其他天然和合成脂质，优选脂肪酸与低碳(C)数的醇形成的酯，例如异丙醇、丙二醇或甘油，或脂肪醇与低碳数的烷酸或与脂肪酸形成的酯；低碳数的醇、二元醇或多元醇及其醚，优选乙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、乙二醇、乙二醇单乙醚或单丁醚、丙二醇单甲醚或单乙醚或单丁醚、二乙二醇单乙醚或单乙醚，以及类似产品。
尤其可使用上述溶剂的混合物。在醇溶剂的情况下，水可以是进一步的组分。
本发明的乳化剂、油凝胶或水-或酯-分散剂的油相有利地选自饱和和/或不饱和、分支和/或无分支的链长度为3至30个碳原子的烷基羧酸与饱和和/或不饱和、分支和/或无分支的链长度为3至30个碳原子的醇所形成的酯，选自芳香羧酸与饱和和/或不饱和、分支和/或无分支的链长度为3至30个碳原子形成的酯。在这种情况下，这种酯油可有利地选自肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、油酸异丙酯、硬脂酸正丁酯、月桂酸正己酯、油酸正癸酯、硬脂酸异辛酯、硬脂酸异壬酯、异壬酸异壬酯、2-乙基己基棕榈酸酯、2-乙基己基月桂酸酯、2-己基癸醇硬脂酸酯、2-辛基十二醇棕榈酸酯、油酸油酯、芥酸油酯、瓢儿菜醇油酸酯、瓢儿菜醇芥酸酯，以及这些酯的合成、半合成和天然的混合物，如霍霍巴油。
而且，油相可有利地选自分支和无分支的烃和烃蜡、硅油、二烷基醚；饱和或不饱和的、分支或无分支的醇和脂肪酸甘油三酯，即，饱和和/或不饱和的、分支和/或不分支的链长度为8至24，尤其为12至18个碳原子的烷基羧酸的甘油三酯。例如，脂肪酸甘油三酯可有利地选自合成、半合成和天然的油，如橄榄油、葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕榈油、椰子油、棕榈仁油等。
这种油和蜡组分的任意混合物也可有利地用于本发明。如果合适，也可能有利地使用蜡，如十六酸鲸蜡酯，作为油相的唯一脂质组分。
油相可有利地选自2-乙基己基异硬脂酸酯、辛基十二烷醇、异十三烷醇异壬酸酯、异二十烷、2-乙基己基椰油酸、C12-15烷基安息香酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、二辛基醚。
尤其有利的混合物是C12-15烷基安息香酸酯与2-乙基己基椰油酸的混合物、C12-15烷基安息香酸酯和异十三烷醇异壬酸酯的混合物、以及C12-15烷基安息香酸酯、2-乙基己基椰油酸和异十三烷醇异壬酸酯的混合物。
在碳氢化合物中，液体石蜡、角鲨烷和角鲨烯可有利地用于本发明。
油相可进一步有利地包括环状或线性硅油、或者完全由这些油组成，但优选的是除了硅油之外，使用额外含量的其他油相组分。
环二甲基硅酮(八甲基环四硅氧烷)可有利地作为硅油用于本发明。然而，其他硅油也可有利地用于本发明，例如六甲基环丙硅氧烷、聚二甲硅氧烷和聚甲基苯基硅醚。
此外尤其有利的混合物是环二甲基硅酮与异十三醇异壬酸酯的混合物以及环二甲基硅酮与2-乙基己基异硬脂酸酯的混合物。
如果合适，本发明的制剂的水相可有利地包括：低碳数的醇、二醇或聚醇、及其醚，优选乙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、乙二醇、乙二醇单乙醚或单丁醚、丙二醇单甲醚、单乙醚或单丁醚、二乙二醇单甲醚或单乙醚，及其类似产品；还有低碳数的醇，如乙醇、异丙醇、1，2-丙二醇、甘油；尤其，一种或多种增稠剂，其可有利地选自二氧化硅、铝硅酸盐、多糖及其衍生物，例如透明质酸、黄原胶、羟丙基甲基纤维素，尤其有利地选自聚丙烯酸酯，优选地选自称作Carbopol的聚丙烯酸，如型号980、981、1382、2984和5984Carbopol；它们在每种情况下均单独或者结合使用。
本发明可使用的凝胶通常包括低碳数的醇，如乙醇、异丙醇、1，2-丙二醇，甘油和水，或者在增稠剂存在的情况下包括上述油类。就油-酒精凝胶而言，增稠剂优选地为二氧化硅或者铝硅酸盐，就水-酒精或酒精凝胶而言，增稠剂优选地为聚丙烯酸酯。
例如，固体棒可包括天然或合成的蜡、脂肪醇或脂肪酸酯。
适用于本发明的化妆棒的常规基本材料包括液体油(如液体石蜡、蓖麻油、豆蔻酸异丙酯)、半固体组分(如凡士林、羊毛脂)、固体组分(如蜂蜡、纯白地蜡和微结晶蜡或地蜡)以及高熔点的蜡(如巴西棕榈蜡和小烛石)。
适用于本发明的化妆品和/或皮肤科制剂的推进剂是常规已知的易挥发的液化推进剂，其可由喷雾剂容器喷出，例如碳氢化合物(丙烷、丁烷、异丁烷)，它们可以单独或者相互混合使用。加压空气也可以被有利地使用。
当然，本领域的技术人员熟知，有些无毒推进剂原则上以气雾剂的形式适用于本发明；然而，建议不要使用这些物质，尤其是氟代烃和氟氯烃(FCHC)，因为它们对环境或者其他相关情况产生不良作用。
本发明的化妆品制剂可采用凝胶的形式，其不仅包含本发明的有效量的活性成分以及常规使用的溶剂，优选地为水，而且包含有机增稠剂，如阿拉伯胶、黄原胶；海藻酸钠；纤维素衍生物，优选甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素；或者无机增稠剂，如铝硅酸盐，如膨润土；或者聚二乙醇与聚二乙醇硬脂酸酯或聚二乙醇二硬脂酸酯的混合物。凝胶包括增稠剂，例如为0.1％至30％重量，优选0.5％至15％重量。
对本发明的目的尤其有益的是，本发明的化妆品或皮肤科制剂包含进一步的活性成分，尤其是天然活性物质和/或其衍生物，如α-硫辛酸、八氢番茄红素、D-生物素、辅酶Q10、α-葡萄糖芦丁、肉碱、肌肽、渗透调节物质、三叶草提取物、啤酒花提取物或啤酒花-麦芽提取物。
活性成分(一种或多种物质)的浓度有利地是基于制剂总重量的0.0001％至30％的重量。本发明的化妆品或皮肤科制剂可以本领域已知的任意方法制备。
器官和组织样品的处理
用包含本发明抗冻多肽的组合物灌注器官或组织样品，使得有可能在较低的温度下储存这类器官和组织样品、或其他生物材料，从而防止样品变质或降解，而所述组织、器官、细胞或其他生物材料不会产生冻伤的风险。在许多情况下，对器官和生物组织的损害主要不是由所讨论的器官或组织产生的冷冻状态引起，而是由可能发生的再结晶引起的。
生物材料、器官和组织样品的实例包括但不限于：例如，含有一种或多种多肽的样品；含有一种或多种微粒体或微团的样品，该微粒体或微团含有一种或多种多肽；包含全血的样品；包含血浆的样品；包含血小板的样品；包含红血细胞的样品；包含精液的样品，包含配子的样品。
组织培养样品可以包括任意形式的生物细胞，包括哺乳动物细胞，如动物和人体细胞，鼠细胞和昆虫细胞。例如，待处理的器官可以是肾、肺、心脏、脾脏或肝脏。因此，本发明提供一种用于抑制器官或生物样品的再结晶的方法，所述方法包括步骤：在多肽能防止器官或生物样品再结晶的条件下，将器官或生物样品与本发明的多肽接触。
本发明还提供一种用于改善器官或生物样品保存的方法，所述方法包括步骤：在多肽能接触所讨论的器官或生物样品的条件下，将器官或生物样品与本发明的多肽接触，从而这种待储存的器官或生物样品与未处理的器官或生物样品相比能够在亚冷冻温度下储存。
近来开发了一种基于玻璃化的新方法。然而，该方法遇到的实际情况是，配子、胚胎或干细胞解冻期间发生了松弛，这意味着有冰晶体形成。在解冻过程中，这些冰晶体由于再结晶而生长。我们认为，如果配子、胚胎或干细胞所在的溶剂中存在本发明的一种或多种多肽，则在玻璃化过程中，晶体形成以及晶体生长将显著减少甚至可被防止。
本发明多肽的进一步冷冻保护用途将在下文更详细地公开。
在一个单独的方面，本发明涉及一种保护细胞及其膜免受暴露于非生理条件时所遭遇的损害的方法。例如，温度不正常，包括高温、低温和零下温度。在不包含冰形成的广泛条件下，包括高于冻结范围的温度和在玻璃化条件下低于冻结范围的温度，观察到细胞存活率提高。迄今为止，这些多肽的唯一已知的性质是它们能够与冰晶体相互作用。在冰晶体形成的条件下进一步发现，多肽与人体细胞一起以它们在源生物体中天然产生的浓度使用，导致细胞的损害加重而不是减轻，但是当使用低浓度时，损害缓解并且存活率提高。这样，多肽在细胞悬浮液、组织和整个器官的保存和改善中提供了有益作用。我们进一步发现，多肽具有阻断哺乳动物细胞膜的离子通道的能力，从而在治疗病情方面提供进一步的用途。
本发明利用了已识别但未使用的抗冻多肽的性质以及它们与细胞和细胞膜相互作用的能力。这种与细胞膜的相互作用发生在广泛的结构中，如细胞悬浮液中的个别细胞，组织和器官中的相连的细胞团，以及遍布血管系统的细胞结构。这种相互作用是有利的，为细胞膜以及包含这些膜的结构提供了各种益处，包括改善细胞活性和存活率，延长功能性、稳定性以及细胞和细胞组织的结构完整性，降低在不利条件下对膜和细胞结构损害的发生率，以及控制离子跨细胞膜的运输。
相互作用的不同类型与这些多肽对冰晶增殖的已知作用是不相关的，因为这些相互作用的有益作用是在根本没有冰晶形成的条件下观察到的，除了它们在冰晶存在的情况下出现以外。例如，从低温至远高于生理温度的温度范围内观察到这些益处。本发明因此延伸到涉及生理条件和非生理条件的情形，以及涉及存在冰晶体的和完全不存在冰晶体的情形。在非生理条件下观察到了对活细胞和细胞膜的有益作用，因此非生理条件包括：(i)温热条件，由高于水的正常冰点(0℃)且低于细胞的生理温度的温度定义，因此不可能形成冰晶体；(ii)玻璃化条件，由玻璃形成(或玻璃相变)时或低于玻璃形成的温度定义，例如从150K降至约4K；或者由玻璃化剂的存在定义，该玻璃化剂促进玻璃化并抑制结晶化；(iii)冷冻条件，如从水的正常冰点降至约4K，其允许冰晶体形成；(iv)过热条件，由高于细胞生理温度的温度定义，例如从生理温度上升至高于生理温度约10℃的温度范围；以及(v)由化学环境定义的条件，其不同于细胞的生理化学环境，例如非生理pH条件和生理化学组成的其他变化，以及与非生理温度条件相结合的那些条件。
本发明目标的适用性扩展到非正常的生理条件，例如与细胞膜的不稳定性相关的疾病，以及与细胞内和细胞外间隙之间的离子不平衡、导致跨细胞膜的离子转运不正常相关的疾病。这种行为的意外性质通过一次发现而变得显著，即，离子通道的阻断得以实现，如上皮细胞的钙离子和钾离子，而未干扰细胞的其他代谢功能，包括ATP离子泵以及与碳酰胆碱的相互作用。进一步，本发明提供了对正常生理条件下的细胞的益处，比如通过使用那些设计用于恢复、保存或修复表皮组织的化妆品或药物。
本发明对广泛的肝脏细胞具有适应性，包括动物细胞和植物细胞。然而，与本发明相关的尤其不寻常和有意义的发现在于抗冻多肽在处理和保存哺乳动物细胞、组织和器官中的用途。在它们的天然形式下，这些多肽仅存在于非哺乳动物物种中。这些物种和哺乳动物在细胞和细胞膜，以及在血液和细胞质组成方面的差异，使得当前发现的益处是令人惊讶和意料不到的。因此，当哺乳动物细胞、组织和器官和生物体暴露在不同于哺乳动物正常生理条件下时，将本发明用于它们将具有特别的意义和用途。本发明适用的细胞的实例是哺乳动物卵母细胞、肝细胞、红细胞和白细胞，以及各种类型的植物细胞。组织和器官的实例是肝脏、心脏和肾脏的组织，以及器官自身。生物体的实例是胚胎、自给自立的整个动物、植物种子和整棵植物。
本发明产生的额外益处是多方面的，其中包括在冻结至低温期间不再需要维持快速冷却速率，在比已知的细胞冻结剂明显较低的浓度下多肽具有提高溶液粘度的能力，以及多肽保存冷冻食物的能力。从下面的描述可以明显看出本发明的其他优点、益处以及用途。
在低温储藏的技术领域，以下使用的术语定义如下：
细胞、组织、器官或生物体的“异常”或“非生理条件”是指不同于正常生理条件的条件。异常或非生理条件包括但不限于：温度显著高于或低于健康生物体的正常生理温度，其中健康有机体的细胞、组织或器官是与生俱来的，或者为生物体本身；二氧化碳、氧气、无机盐或有机化合物的量超过或低于正常；pH值显著高于或低于正常生物体的pH，以及这些条件的结合。
“抗冻多肽”(anti-freeze polypeptides，AFPS)、“抗冻糖蛋白”和“抗冻糖肽”(AFGP)指在一些动物的体液中发现的大分子，其具有普遍已知的性质，即它们非依数性地降低水的冰点。抗冻多肽、多肽、糖蛋白和糖肽也称为“热滞多肽”，因为比起任意依数性质的多肽所产生的程度来说，发生冻结的温度在更大程度上降低。然而在融化被削弱期间，冰融化的温度明显较低，仅与依数行为一致。
“低温温度”(cryogenic temperature)指低于0℃的温度。
“冷冻”是指从液相水到固相水的转变。
“过热的”是指高于细胞、组织、器官或生物体的正常生理温度，如从生理温度轻微上升高出生理温度约20℃，优选高出约10℃，更优选高出约5℃。
“低温的”是指低于细胞、组织、器官或微生物的正常生理温度，但是并没有低到足以引起相转变为固相。
“分离的和纯化的”指分子种类，它们是从天然产生的有机体中提取，并通过常规的实验室技术来浓缩，如色谱法，优选浓缩至至少约85％的浓度，更优选至少约95％。本发明进一步延伸到另一类分子，它们具有的分子结构与前述天然产生的分子形式相同、高度相似或者同源，并且它们可通过化学手段或通过DNA重组技术来合成。
“哺乳动物”和该术语通常用在生物学上一样，指猪、牛、兔、马和人等。
“极地鱼类”是指冷血水生动物，尤其是脊椎动物，它们生活在地球极地区域的水中，包括北极和南极圈内的区域。尤其与本发明相关的极地鱼类是那些在满是冰的水中仍能生活的鱼类。
“针骨”和“针骨状”是指冰晶体和冰晶体生长，其中晶体增殖的主要方向是沿C-轴，即与基平面垂直，以形成针状的晶体。
“能生存的”指在正常生理条件下或者返回到正常生理条件下能够生存、能够存活和发展，或在正常的有利于发芽的条件下能够发芽。
“玻璃化”指在低温下固化，以这种方式形成玻璃相，即非晶态固体，与结晶的冰形成对照。
“外观玻璃化”是指在显微镜下通过目视观察确定的玻璃化。一般通过向材料中引入任意一种防冷冻剂或“玻璃化”剂，包括多元醇，如甘油和丙二醇，或者引入其他化合物，如二甲基亚砜，来实现生物材料的玻璃化。玻璃化试剂的引入常常伴有相对高的冷却速率。每种情况下的最佳速率随系统的组分和热动力学而变化。对于无组织的小细胞，如卵子、精子和胚胎，以及器官而言，大多数情况下的典型冷却速度一般是在约100℃/min至约2,000℃/min的范围内下降，优选约200℃/min至约1,750℃/min，更优选700℃/min至约1,750℃/min。通常使用的是约1500℃/min的速率。
在本发明的实践中，本发明的抗冻多肽一般是以液体溶液的形式使用，优选水相溶液。本发明的抗冻多肽可以单独使用或者与其他多肽联合使用。当联合使用多肽时，最便捷的是使用源物种中天然出现的生理组合的多肽，即多肽种类的混合物和比例与从鱼类、昆虫或其他生物体的液体中提取发现的相同；但从液体的其他组分中分离，并且再次溶解于不同的溶剂或溶液中，可能总浓度不同于该混合物在自然环境中存在的浓度。然而，在某些情况下，通过分馏源混合物中的多肽，并以最佳的方式选择和重组馏分，可以使活性和有效性得到改善。
在本发明使用的液体溶液中，本发明抗冻多肽的浓度可能有很大不同，但在某些情况下，改善的结果是在一定浓度范围内和一定情况下获得的，该浓度必须限制在一定范围，以避免多肽自身产生的损害。然而一般而言，多肽的使用浓度为约0.01mg/mL至约80mg/mL，优选约0.1mg/mL至约60mg/mL，更优选约1mg/mL至约40mg/mL，最优选约1mg/mL至约20mg/mL。当与人体细胞使用时，尤其是在低于细胞的生理温度时，优选的浓度是约0.1mg/mL至约40mg/mL，更优选约0.1mg/mL至约3mg/mL。当多肽用于在温度低于组织的生理温度时保护该组织时，优选的浓度是约0.1mg/mL至约50mg/mL，而且当组织是人体组织时，优选的浓度是约0.1mg/mL至约3mg/mL。在温度一般低于细胞的生理温度但高于细胞的冻结温度，或者低于细胞的冻结温度但是在玻璃化剂或其他非肽类防冷冻剂存在时，多肽用于保护该细胞时，优选的浓度是约0.01mg/mL至约60mg/mL，更优选的浓度范围从约1mg/mL至约40mg/mL。当多肽用于阻断跨细胞膜的离子通道时，优选的浓度是至少约0.01mg/mL，更优选至少约0.1mg/mL，最优选约0.5mg/mL至约40mg/mL。当溶液包含不同抗冻多肽的混合物时，抗冻多肽的所有浓度都表示为单个抗冻多肽浓度的总和。
用于本发明的抗冻多肽的水溶液可进一步含有任意的各种盐、糖、离子和其他营养素的混合物，它们被包含在本领域已知的电解质溶液中，用于保存生物制剂，这包括组织培养基、器官灌注液等。电解质溶液尤其用于增强多肽的生物相容性。本领域已知的许多电解质溶液的实例是：生理盐水，其中NaCl浓度为0.9％或0.95％Ringer′s注射液(U.S.)，列于Facts andComparisons，p.50，Lippincott Publishing Co.，St.Louis，Mo.(1981.10)，哺乳动物Ringer′s溶液(U.K.&Canada)，列于Best and Taylor，Basis of Medical Practice，6th ed.，Baltimore(1950)，乳酸盐Ringer′s溶液(U.S.)，列于Facts andComparisons，p.50，Lippincott Publishing Co.，St.Louis，Mo.(1981.10)，乳酸盐Ringer′s溶液(Hartmann)，列于Hartmann，A.F.，J.Am.Med.Assoc.103：1349-1354(1934)，醋酸Ringer′s溶液，列于Fox，C.L.，et al.，J.Am.Med.Assoc.148：825-833(1952)，Locke′s溶液，列于Locke，F.S.，Zbl.Physiol.8：166(1894)；14：670(1900)；15：490(1901)，Tyrode′s溶液，列于Tyrode，M.J.，Arch.Int.Pharmacodyn.20：205(1910)，Krebs Henseleit溶液，列于Krebs，H.A.，et al.，Hoppe-Seyle′s Z.Physiol.Chem.210：33-66(1932)，Krebs Ringer磷酸盐溶液，列于Krebs，H.A.，Hoppe-Seyle′s Z.Physiol.Chem.217：193(1933)，Krebs血清替代溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta 4：249-269(1950)，Krebs改进的Ringer II溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta 4：249-269(1950)，Krebs改进的Ringer III溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta 4：249-269(1950)，含有牛血清白蛋白和红细胞的Krebs肝脏灌注液，列于Hem，R.，et al.，Biochem.J.101：284(1966)，Schimassek肝脏灌注液，列于Schimassek，H.，et al.，Biochem.Z.336，440(1963)，Krebs肾脏灌注液，列于Nishiitsutsuji-Uwo，J.，et al.，Biochem.J.103：852-862(1967)，Hepatocyte孵化液，列于Crow，K.E.，et al.，Biochem.J.172：29-36(1978)，Bahlman肾脏灌注液，列于Bahlman，J.，et al.，Am.J.Physiol.212：77(1967)，Fulgraff肾脏灌注液，列于Fulgraff，et al.，Arch.Int.Pharmacodyn.172：49(1972)。
对于任意具体应用来说，电解质溶液的最佳选择会随着应用而变化，例如即将用抗冻多肽处理或保护的细胞的形式(是否该细胞存在为细胞悬浮液、组织或器官)，产生该细胞的动物的形式，以及细胞已经或将要暴露的条件。
在本发明的涉及玻璃化条件的实施方式中，抗冻多肽与玻璃化剂联合使用，当冷却至冰点以下的温度时，玻璃化剂在细胞内和细胞外液体的固化期间防止或抑制冰晶体的形成。各种的玻璃化剂是本领域已知的，可以单独使用或者与其他玻璃化剂或生物相容性溶质一起使用。玻璃化剂的实例是甘油、二甲亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、蔗糖、丙二醇、丁二醇和羧甲基纤维素。多元醇是一类有用的玻璃化剂。突出的实例是甘油、乙二醇、丙二醇、丁二醇和丁三醇。玻璃化剂的浓度可能变化很大，取决于体系中其他组分的浓度、冷却速率和达到的最低温度。一般而言，以约5％至约35％重量的浓度可以获得最好的结果。玻璃化一般以快速冷冻速率进行，例如超过100℃/min的速率，优选超过1,000℃/min。
在涉及使用非肽类防冻剂，不一定避免冰晶体的形成的实施方式中，也需要进行许多相同的考虑。以上列出的作为玻璃化剂实例的试剂在类似浓度范围内也起着防冻剂的作用。
抗冻多肽对细胞和/或细胞膜的有益作用是通过将多肽与细胞接触实现，并且在暴露于其他有害条件时的整个或大部分期间保持这种接触而实现的。当细胞是细胞悬浮液的形式，简单地向悬浮液中添加这种多肽就实现了这种接触。当细胞是组织或器官的形式，通过将组织或器官浸入多肽溶液中来实现接触。当细胞是含有血管系统的组织或器官的形式，通过将多肽溶液注满该血管系统来实现接触，并且一旦注满，在整个储藏、保存或暴露在有害条件期间都使多肽保持在血管系统中。灌注的方法是生理学和外科程序的技术人员熟知的。
可以从本发明抗冻多肽处理中受益的细胞包括各种类型。实例是卵细胞、胚胎、白细胞、红细胞、血小板、胰岛和肝细胞。可以从本发明受益的器官也是广泛的。实例包括：肝、肾、心、脑、肺、胰、脾、卵巢和胃。可以从本发明受益的组织包括这些器官的任意组织，以及皮肤组织、骨髓组织、角膜组织以及其他各种组织。本发明一般适用于哺乳动物，并且在人类细胞、组织和器官方面尤其具有意义和效用。
本发明的抗冻多肽在抑制跨膜离子转运中的作用可延伸到各种离子，尤其是Ca++、K+和Na+离子，以及这些离子的两种或多种的结合。
由于过度的离子运输是一种伴随低温的生理效应，本发明抗冻多肽抑制离子转运的能力可能与该多肽在低温条件下增强细胞活力的能力相关。因此，为实现该离子转运的抑制作用所施予的多肽的量和浓度一般与低温暴露下用于增强活力时所用的量相似。
多肽抑制离子跨膜转运的能力也使该多肽可用于治疗存在过量跨膜离子转运的疾病和异常生理状况。这种疾病和状况的实例是囊性纤维变性、Kartagener综合症、尿崩症、糖尿病、抗利尿激素异常。用于该作用的多肽的施予可通过注射、血管注射、局部应用以及其他手段来实现。其他手段是用其他药物和治疗剂治疗或处理这些疾病和状况时，通常使用的手段。而且，得到有益结果时的浓度一般与上述提及的浓度相同，并且用药的剂量或频率由所处理的状况已进展的程度以及观察到的对处理的反应来决定。
含有本发明多肽的抗冻多肽的应用还延伸到该多肽在具有细胞结构的食物储藏中的应用。尤其适用该应用的食物是肉类和肉制品，但对其他类型的食品也是有益的。对于本发明的该目的，肉类和肉制品包括鲜肉和禽肉，以及冷冻的、罐装的和干的肉和家禽肉。在运输或储藏期间，冷冻避免变质的许多这种食物往往失去饱满性、新鲜感和其他有助于味道、口感和一般诉求的品质。通过用本发明的多肽溶液处理这些食物，可以保存这些品质。处理模式对一种类型的食物和另一种会有变化，但是一般来说涉及溶液中食物与多肽的平衡，无论是通过浸没、灌注，还是任意其他类型的吸收或实现延长接触的其他手段。上述涉及本发明其他用途方面的溶液类型、浸没和灌注方法在此处也是适用的。
含有本发明多肽的流体
本发明提供了本发明的抗冻多肽作为流体和液体(如制冷剂)以及许多不同类型水溶液的添加剂的用途，以便防止制冷剂或水溶液的冻结。这种防止溶液冻结的特征在许多不同的技术领域中都是有益的。
与本发明多肽连接的载体和固体载体
本发明的多肽可以与载体连接，如固体载体或半固体载体。多肽可以共价或非共价地连接到任意载体，例如理想地展示本发明多肽的材料的表面。本发明的表面和固体载体可以含有本发明的一种或多种多肽，或其展示抗冻活性的功能片段，它们可直接或间接地连接到表面，如固体或半固体载体上。
连接原则上包括用于将多肽共价或非共价连接在表面的所有现有先进技术，例如通过接头残基直接包封笼状结构中的多肽，其保留多肽与表面的反应接触；或者将本发明多肽与固体或半固体载体接触的其他方式。
可利用多种技术将多肽连接到固体或半固体载体。多肽与固体表面的连接已有公开，例如Cordek et al.1999，Anal.Chem.，71：1529-1533，Blasi et al.2005，Enzyme and Microbial Tech.，36：818-823；Parrado et al.(1995)，Proc.Chem.，30(8)：735-741；Yakovleva et al.(2003)，Biosensors and Bioelectronics，19：21-34；Cao，L.，Carrier-bound Immobilized Enzymes.Principles，Applications andDesign，Wiley-VCH，2005；Immobilization of Enzymes and Cells(Methods inBiotechnology)，Birkerstaff，G.F.，eds.，Humana Press，1997。其他技术也可以采用，并且是技术人员所熟知的。
在本发明的一个方面，提供了一种包含本发明的一种或多种多肽的包衣组合物。包衣组合物可以进一步包含一种或多种其他成分，包括色素和树脂，下文将更详细地说明。
应集中注意的是生物分子(包括多肽)在由溶胶凝胶形成的硅酸盐玻璃中的固定化(Eggers et al.，Protein Sci.2001，10，250-261)。该过程包括水解醇盐以产生溶胶，其然后再进行缩聚作用形成凝胶。在溶胶-凝胶转变期间，生物分子被包封在凝胶中而固定。溶胶-凝胶材料比传统用于生物分子包封的有机聚合物更具优势，因为这些材料具有增加的机械强度、化学稳定性、生物兼容性以及对微生物攻击的抵抗力。
本发明多肽的溶胶-凝胶包封可以使用基于多元醇硅酸盐和多元醇硅氧烷的前体来完成，尤其是来自甘油的那些。聚甘油硅酸盐(PGS)可以制备并用于多肽的溶胶-凝胶生物包封，该方式以高度生物相容性以及温和的包封条件而著称，并且可能使硅石内的多肽再生且有效隔离。
以上公开的方法可以延伸至金属硅酸盐、烷基硅氧烷、功能化的硅氧烷，以及各种复合溶胶-凝胶，从而可以构建体理化学上多样的含有本发明抗冻多肽的生物掺杂聚合物。
本发明的杂合材料优选地显示与游离抗冻多肽相近的活力，以及表征溶胶-凝胶生物陶瓷的高度稳定性和坚固性。
在本发明的一个方面，使用本领域普通技术人员熟知的溶胶-凝胶工艺，将本发明的多肽连接到固体或半固体载体。这种溶胶-凝胶工艺是常规的，并且通常产生一种溶胶-凝胶玻璃，这是由透明的无定性硅胶或硅酸盐材料产生，通过在粘度增加的情况下在胶体亚微米颗粒的网络中形成相互连接，直至该网络变得完全坚硬而制成，其密度约为玻璃的一半。因此，含有本发明一种或多种多肽的溶胶-凝胶玻璃也请求保护。其中特别参考Gill andBallesteros，J.Am.Chem.Soc.1998，120，8587-8598。溶液聚合以形成交联颗粒的溶胶已被如US 5,863,996公开，可以将其与本发明结合使用。
根据本发明的另一方面，包衣组合物优选地包含与本发明多肽相容的树脂，即在形成包衣组合物的一部分时，允许所述多肽发挥抗冻活性。树脂是本领域众所周知的，多肽相容的树脂在现有技术中也已公开。例如，见WO01/72911和US 5,998,200。
本发明还提供一种包含具有三维纳米结构的介孔气凝胶的组合物，该气凝胶含有本发明的多肽。三维纳米结构优选包含一种包封抗冻多肽生物复合超级结构的胶态金属，该胶态金属在其中被纳米胶合。因此，本发明还提供一种制备带有胶态金属的三维纳米结构的介孔气凝胶的方法，其中包封抗冻多肽生物复合物的胶态金属被纳米胶化，所述方法包括步骤：通过将本发明所述一种或多种抗冻多肽与所述的胶态金属混合，形成包封抗冻多肽生物复合物的金属；通过将催化剂和醇盐(如硅醇盐)混合，形成溶胶，如硅溶胶；通过将所述溶胶(如硅溶胶)与所述生物复合材料混合并使所述溶胶变化至凝胶，形成凝胶；以及用CO2提取并超临界干燥所述胶体，以形成所述气凝胶，其中包封抗冻多肽生物复合物超级结构的金属被纳米胶化。在一种实施方式中，介孔气凝胶是介孔二氧化硅气凝胶，参考US2004/0209338。
本发明的多肽在抑制气体水合物的形成中的用途
本发明的多肽还可以用于抑制海洋中的气体水合物的形成。众所周知，气体水合物是冰状结晶分子复合物，它由水与适宜大小的“寄生(guest)”气体分子的混合物形成。水分子(寄主，host)根据氢键形成带有几个空隙腔体的格状结构。寄生的气体分子可以占据格状腔体，并且当最小量的腔体被填满时，晶体结构将变得稳定，甚至在明显高于水冰的熔点的温度时，形成固体气体水合物。当气体水合物分离(融化)时，晶格分解成液态水(或者，在低于水的冰点条件下变成冰)，并且释放出气体。商业上，气体可以用于能源生产。然而，在该气体以非控制的方式逸出的情况下，该现象不代表环境风险。这可能存在于地球不时干裂的地区。
众所周知，关于气体水合物形成的问题也出现在海洋底部的管道中。然而，因为本发明多肽的抑制冰晶体形成的性质，可以相信的是所述多肽的存在可以抑制气体水合物的形成，因为这些水合物与冰晶体的结构非常相似。
下文公开本发明所选择的条目：
1、一种含有多个连续相连的氨基酸残基的多肽，所述多肽包括序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：90)，其中
X1选自氨基酸残基S、A、G和D；
X2选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
X3选自非大体积的氨基酸残基；
X4选自氨基酸残基S、I、T和V；
X5选自氨基酸残基S、A、I和T；
X6选自氨基酸残基S、T和V；
X7选自非大体积氨基酸残基；
X8选自氨基酸残基S、T和V；
X9选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少一个是T或V；
其中多肽的氨基酸残基的总数小于250；和
其中多肽具有冰结合能力。
2.条目1的多肽，其中X1是S。
3.条目1的多肽，其中X1是A。
4.条目1的多肽，其中X1是G。
5.条目1的多肽，其中X1是D。
6.条目1的多肽，其中X2是A。
7.条目1的多肽，其中X2是V。
8.条目1的多肽，其中X2是I。
9.条目1的多肽，其中X2是T。
10.条目1的多肽，其中X2是S。
11.条目1的多肽，其中X3不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
12.条目1的多肽，其中X4是S。
13.条目1的多肽，其中X4是I。
14.条目1的多肽，其中X4是T。
15.条目1的多肽，其中X4是V。
16.条目1的多肽，其中X5是S。
17.条目1的多肽，其中X5是A。
18.条目1的多肽，其中X5是I。
19.条目1的多肽，其中X5是T。
20.条目1的多肽，其中X6是S。
21.条目1的多肽，其中X6是T。
22.条目1的多肽，其中X6是V。
23.条目1的多肽，其中X7不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
24.条目1的多肽，其中X8是S。
25.条目1的多肽，其中X8是T。
26.条目1的多肽，其中X8是V。
27.条目1的多肽，其中X9是S。
28.条目1的多肽，其中X9是A。
29.条目1的多肽，其中X9是G。
30.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少一个是T。
31.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少两个是T。
32.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少三个是T。
33.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的四个都是T。
34.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少一个是V。
35.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少两个是V。
36.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的至少三个是V。
37.条目1的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基X2、X4、X6和X8中的四个都是V。
38.条目1的多肽，其中所述多肽的氨基酸残基的最大数量少于240，例如少于230，例如少于220，例如少于210，例如少于200，例如少于190，例如少于180，例如少于150，例如少于140，例如少于130，例如少于120，例如少于110，例如少于100，例如少于95，例如少于90，例如少于85，例如少于80，例如少于75，例如少于70，例如少于65，例如少于60，例如少于55，例如少于50，例如少于45，例如少于40，例如少于30，例如少于20，例如少于15。
39.条目1的多肽，其中所述多肽的氨基酸残基的最小数量为10或更多，例如12或更多，例如14或更多，例如16或更多，例如18或更多，例如20或更多，例如22或更多，例如24或更多，例如26或更多，例如28或更多，例如30或更多，例如32或更多，例如34或更多，例如36或更多，例如38或更多，例如40或更多，例如42或更多，例如44或更多，例如46或更多，例如48或更多，例如50或更多，例如55或更多，例如60或更多，例如65或更多，例如70或更多，例如75或更多，例如80或更多，例如85或更多，例如90或更多，例如95或更多，例如100或更多。
40.条目1的多肽，进一步含有SEQ ID NO：90第二拷贝，其与SEQ IDNO：90第一拷贝不重叠，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝含有序列：
Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-Xf-Xg-Xh-Xi(SEQ ID NO：90)，
其中：
Xa选自氨基酸残基S、A、G和D；
Xb选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
Xc选自非大体积的氨基酸残基；
Xd选自氨基酸残基S、I、T和V；
Xe选自氨基酸残基S、A、I和T；
Xf选自氨基酸残基S、T和V；
Xg选自非大体积氨基酸残基；
Xh选自氨基酸残基S、T和V；
Xi选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xg中的至少一个是T或V。
41.条目40的多肽，其中Xa是S。
42.条目40的多肽，其中Xa是A。
43.条目40的多肽，其中Xa是G。
44.条目40的多肽，其中Xa是D。
45.条目40的多肽，其中Xb是A。
46.条目40的多肽，其中Xb是V。
47.条目40的多肽，其中Xb是I。
48.条目40的多肽，其中Xb是T。
49.条目40的多肽，其中Xb是S。
50.条目40的多肽，其中Xc不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
51.条目40的多肽，其中Xd是S。
52.条目40的多肽，其中Xd是I。
53.条目40的多肽，其中Xd是T。
54.条目40的多肽，其中Xd是V。
55.条目40的多肽，其中Xe是S。
56.条目40的多肽，其中Xe是A。
57.条目40的多肽，其中Xe是I。
58.条目40的多肽，其中Xe是T。
59.条目40的多肽，其中Xf是S。
60.条目40的多肽，其中Xf是T。
61.条目40的多肽，其中Xf是V。
62.条目40的多肽，其中Xg不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
63.条目40的多肽，其中Xh是S。
64.条目40的多肽，其中Xh是T。
65.条目40的多肽，其中Xh是V。
66.条目40的多肽，其中Xi是S。
67.条目40的多肽，其中Xi是A。
68.条目40的多肽，其中Xi是G。
69.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少一个是T。
70.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少两个是T。
71.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少三个是T。
72.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的四个都是T。
73.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少一个是V。
74.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少两个是V。
75.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少三个是V。
76.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xb、Xd、Xf和Xh中的四个都是V。
77.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和第二拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
78.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一和第二拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
79.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和第二拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
80.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90第一和第二拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
81.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端。
82.条目40的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的N-端。
83.条目40的多肽，进一步含有SEQ ID NO：90的第三拷贝，其与SEQID NO：90的第一和第二拷贝不重叠，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝含有序列：
Xaa-Xba-Xca-Xda-Xea-Xfa-Xga-Xha-Xia(SEQ ID NO：90)，
其中：
Xaa选自氨基酸残基S、A、G和D；
Xba选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
Xca选自非大体积的氨基酸残基；
Xda选自氨基酸残基S、I、T和V；
Xea选自氨基酸残基S、A、I和T；
Xfa选自氨基酸残基S、T和V；
Xga选自非大体积氨基酸残基；
Xha选自氨基酸残基S、T和V；
Xia选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xga中的至少一个是T或V。
84.条目83的多肽，其中Xaa是S。
85.条目83的多肽，其中Xaa是A。
86.条目83的多肽，其中Xaa是G。
87.条目83的多肽，其中Xaa是D。
88.条目83的多肽，其中Xba是A。
89.条目83的多肽，其中Xba是V。
90.条目83的多肽，其中Xba是I。
91.条目83的多肽，其中Xba是T。
92.条目83的多肽，其中Xba是S。
93.条目83的多肽，其中Xca不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
94.条目83的多肽，其中Xda是S。
95.条目83的多肽，其中Xda是I。
96.条目83的多肽，其中Xda是T。
97.条目83的多肽，其中Xda是V。
98.条目83的多肽，其中Xea是S。
99.条目83的多肽，其中Xea是A。
100.条目83的多肽，其中Xea是I。
101.条目83的多肽，其中Xea是T。
102.条目83的多肽，其中Xfa是S。
103.条目83的多肽，其中Xfa是T。
104.条目83的多肽，其中Xfa是V。
105.条目83的多肽，其中Xga不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
106.条目83的多肽，其中Xha是S。
107.条目83的多肽，其中Xha是T。
108.条目83的多肽，其中Xha是V。
109.条目83的多肽，其中Xia是S。
110.条目83的多肽，其中Xia是A。
111.条目83的多肽，其中Xia是G。
112.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少一个是T。
113.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少两个是T。
114.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少三个是T。
115.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的四个都是T。
116.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少一个是V。
117.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少两个是V。
118.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的至少三个是V。
119.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xba、Xda、Xfa和Xha中的四个都是V。
120.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的不同拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
121.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二和第三拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
122.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
123.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
124.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
125.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
126.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
127.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第三拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
128.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端。
129.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的N-端以及SEQ ID NO：90的第二拷贝的C-端。
130.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端以及SEQ ID NO：90的第一拷贝的C-端。
131.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第二拷贝的C-端。
132.条目83的多肽，进一步含有SEQ ID NO：90的第四拷贝，其与SEQID NO：90的第一、第二和第三拷贝不重叠，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝含有序列：
Xab-Xbb-Xcb-Xdb-Xeb-Xfb-Xgb-Xhb-Xib(SEQ ID NO：90)，
其中：
Xab选自氨基酸残基S、A、G和D；
Xbb选自氨基酸残基A、V、I、T和S；
Xcb选自非大体积的氨基酸残基；
Xdb选自氨基酸残基S、I、T和V；
Xeb选自氨基酸残基S、A、I和T；
Xfb选自氨基酸残基S、T和V；
Xgb选自非大体积氨基酸残基；
Xhb选自氨基酸残基S、T和V；
Xib选自氨基酸残基S、A和G；
其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xgb中的至少一个是T或V。
133.条目83的多肽，其中Xab是S。
134.条目83的多肽，其中Xab是A。
135.条目83的多肽，其中Xab是G。
136.条目83的多肽，其中Xab是D。
137.条目83的多肽，其中Xbb是A。
138.条目83的多肽，其中Xbb是V。
139.条目83的多肽，其中Xbb是I。
140.条目83的多肽，其中Xbb是T。
141.条目83的多肽，其中Xbb是S。
142.条目83的多肽，其中Xcb不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
143.条目83的多肽，其中Xdb是S。
144.条目83的多肽，其中Xdb是I。
145.条目83的多肽，其中Xdb是T。
146.条目83的多肽，其中Xdb是V。
147.条目83的多肽，其中Xeb是S。
148.条目83的多肽，其中Xeb是A。
149.条目83的多肽，其中Xeb是I。
150.条目83的多肽，其中Xeb是T。
151.条目83的多肽，其中Xfb是S。
152.条目83的多肽，其中Xfb是T。
153.条目83的多肽，其中Xfb是V。
154.条目83的多肽，其中Xgb不包含环状脂肪侧链或者芳香侧链。
155.条目83的多肽，其中Xhb是S。
156.条目83的多肽，其中Xhb是T。
157.条目83的多肽，其中Xhb是V。
158.条目83的多肽，其中Xib是S。
159.条目83的多肽，其中Xib是A。
160.条目83的多肽，其中Xib是G。
161.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少一个是T。
162.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少两个是T。
163.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少三个是T。
164.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的四个都是T。
165.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少一个是V。
166.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少两个是V。
167.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少三个是V。
168.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的残基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的四个都是V。
169.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和第四拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
170.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
171.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被一个或多个氨基酸残基隔开。
172.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
173.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
174.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被2个氨基酸残基隔开，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基，例如10个氨基酸残基，例如11个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基，例如14个氨基酸残基，例如15个氨基酸残基，例如16个氨基酸残基，例如17个氨基酸残基，例如18个氨基酸残基，例如19个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，例如21个氨基酸残基，例如22个氨基酸残基，例如23个氨基酸残基，例如24个氨基酸残基，例如25个氨基酸残基，例如26个氨基酸残基，例如27个氨基酸残基，例如28个氨基酸残基，例如29个氨基酸残基，例如30个氨基酸残基。
175.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
176.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
177.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被至少2个氨基酸残基隔开，例如至少3个氨基酸残基，例如至少4个氨基酸残基，例如至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少21个氨基酸残基，例如至少22个氨基酸残基，例如至少23个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如至少30个氨基酸残基。
178.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第一拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
179.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第二拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
180.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第三拷贝和SEQ ID NO：90的第四拷贝被少于100个氨基酸残基隔开，例如少于95个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60个氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基，例如少于45个氨基酸残基，例如少于40个氨基酸残基，例如少于35个氨基酸残基，例如少于30个氨基酸残基，例如少于25个氨基酸残基，例如少于24个氨基酸残基，例如少于23个氨基酸残基，例如少于22个氨基酸残基，例如少于21个氨基酸残基，例如少于20个氨基酸残基，例如少于19个氨基酸残基，例如少于18个氨基酸残基，例如少于17个氨基酸残基，例如少于16个氨基酸残基，例如少于15个氨基酸残基，例如少于14个氨基酸残基，例如少于13个氨基酸残基，例如少于12个氨基酸残基，例如少于11个氨基酸残基，例如少于10个氨基酸残基，例如少于9个氨基酸残基，例如少于8个氨基酸残基，例如少于7个氨基酸残基，例如少于6个氨基酸残基，例如少于5个氨基酸残基。
181.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的N-端。
182.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第一拷贝的C-端。
183.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的N-端。
184.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第二拷贝的C-端。
185.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第三拷贝的N-端。
186.条目83的多肽，其中SEQ ID NO：90的第四拷贝位于SEQ ID NO：90的第三拷贝的C-端。
187.条目1至186任一项的多肽与载体相连。
188.条目187的多肽，其中所述载体包含亲合素基团，如链亲合素，其可选择地被生物素化。
189.条目1至186任一项所述的多肽，其与固体载体或半固体载体相连，例如通过共价结合。
190.条目1至186任一项所述的多肽可操作地与亲和标签融合，如组氨酸标记。
191.一种融合多肽，含有可操作地与N-端侧翼序列融合的条目1至186任一项所述的多肽。
192.一种融合多肽，含有可操作地与C-端侧翼序列融合的条目1至186任一项所述的多肽。
193.条目1至186任一项所述的多肽，其可操作地与信号肽融合。
194.条目1至186任一项所述的多肽，其可操作地与前区段(pro-region)融合。
195.条目1至186任一项所述的多肽，其可操作地与预前区段(pre-pro-region)融合。
196.条目1至186任一项所述的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被修饰，所述修饰优选地选自由体内或体外的化学衍生作用，如乙酰化作用或羧化作用，糖基化作用，例如由将多肽暴露于影响糖基化的酶所产生的糖基化作用，例如哺乳动物糖基化或者去糖基化酶；磷酸化作用，如导致磷酸化氨基酸残基的氨基酸残基修饰，如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。
197.条目1至186任一项的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被修饰，以便优选地提高对于蛋白质降解的抵抗力和稳定性，或者优化溶解性能，或者使多肽更适宜作为一种治疗剂。
198.条目197的多肽，含有除天然产生的L-氨基酸残基以外的氨基酸残基。
199.条目198的多肽，含有D-氨基酸残基。
200.条目198的多肽，含有非天然产生的合成氨基酸。
201.条目197的多肽，包含一个或多个阻断基团，优选地是化学取代基的形式，适用于在不良的降解条件下保护和/或稳定该多肽的N-和C-端。
202.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团包括保护基，其对多肽在体内的活性没有不利影响。
203.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团是由N-末端的烷基化或酰基化作用引入。
204.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团组选自N-端阻断基团，包括C1至C5分支或无分支的烷基和酰基，如甲酰基和乙酰基及其取代形式，如乙酰氨基甲基(Acm)。
205.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团选自N-端阻断基团，包括氨基酸的去氨基类似物，其与肽的N-端连接或者用于代替N-端氨基酸残基。
206.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团选自C-端阻断基团，其中C-端的羧基被纳入或者不纳入，例如酯、酮和氨基化合物，以及去羧酸化的氨基酸类似物。
207.条目201的多肽，其中所述一个或多个阻断基团选自C-端阻断基团，包括形成酯或酮的烷基，如低烷基(C1至C6)，如甲基、乙基和丙基；以及形成酰胺的氨基，如伯氨(-NH2)、单-和双-烷基氨基，如甲氨、乙氨、二甲氨、二乙氨、甲乙氨等。
208.条目201的多肽，其中N-端的游离氨基和末端的游离羧基可以完全从多肽中移去，以产生去氨基和去羧酸的形式，而基本不影响多肽的生物活性。
209.条目1至208任一项所述的多肽的酸式盐，所述盐可通过用无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、p-甲苯磺酸或水杨酸处理所述多肽而得，以提供该多肽的水溶性盐。
210.一种生产条目1至208任一项所述多肽的方法，所述方法包括步骤：提供编码所述多肽的多核苷酸，并在适宜的宿主生物中的体外或体内表达所述多核苷酸，从而生产条目1至208任一项所述的多肽。
211.编码条目1至208任一项所述多肽的多肽部分的多核苷酸。
212.含有条目211所述的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸可选择地被可操作地连接到调控序列，该调控序列控制所述多核苷酸在适宜宿主细胞中的表达。
213.一种重组或转基因宿主细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽、或者条目211所述的多核苷酸、或者条目212所述的表达载体。
214.一种生成重组或转基因宿主细胞的方法，所述方法包含步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述重组或转基因宿主细胞，从而生成一种产生所述多肽的重组或转基因宿主细胞。
215.含有条目213所述的宿主细胞的转基因哺乳动物生物体。
216.条目215的转基因哺乳动物生物体，其中所述哺乳动物宿主细胞是动物细胞，选自单系群两侧对称动物，包括属于后口动物(Deuterostomes)、蜕皮动物(Ecdysozoa)、扁虫动物(Platyzoa)、冠轮动物(Lophotrochozoa)的任意四个主要家系的哺乳动物细胞。
217.条目215的转基因哺乳动物生物体，其中所述哺乳动物宿主细胞是选自卵裂球细胞、卵细胞、胚胎干细胞、红血球、纤维原细胞、肝细胞、成肌细胞、肌小管、神经细胞、卵母细胞、成骨细胞、破骨细胞、精子细胞、T细胞和受精卵的动物细胞。
218.一种生成转基因哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述重组或转基因宿主细胞，并且可选地，在所述转基因哺乳动物的宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的转基因哺乳动物宿主细胞。
219.转基因鱼，含有条目1至208任一项所述的多肽，或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的表达载体。
220.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是鲑鱼。
221.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是比目鱼。
222.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是鳕鱼。
223.条目219的转基因鱼，其中所述鱼是青鱼
224.含有条目213所述的宿主细胞的转基因植物。
225.条目224的转基因植物宿主细胞，其中所述宿主细胞是分类单元Embryophyta或Viridiplantae或Chlorobionta的植物细胞，优选地选自湖粉细胞、厚角组织细胞、内皮细胞、胚乳细胞、表皮细胞、叶肉细胞、分生组织细胞、栅栏细胞、薄壁细胞、韧皮部筛管细胞、花粉生成细胞、花粉营养细胞、厚壁组织细胞、管胞细胞、木质部导管细胞和受精卵细胞。
226.条目224的转基因植物，其中所述植物是马铃薯植物。
227.条目224的转基因植物，其中所述植物是番茄植物。
228.条目224的转基因植物，其中所述植物是葡萄藤。
229.条目224的转基因植物，其中所述植物是黄瓜植物。
230.条目224的转基因植物，其中所述植物是小麦。
231.条目224的转基因植物，其中所述植物是大麦。
232.条目224的转基因植物，其中所述植物是黑麦。
233.条目224的转基因植物，其中所述植物是燕麦。
234.条目224的转基因植物，其中所述植物是烟叶。
235.条目224的转基因植物，其中所述植物是柑橘类植物。
236.条目224的转基因植物，其中所述植物是苹果植物。
237.条目224的转基因植物，其中所述植物是草莓植物。
238.条目224的转基因植物，其中所述植物是树莓植物。
239.一种生成转基因植物的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述植物，并且可选地，在所述植物中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的转基因植物。
240.一种重组细菌宿主细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽，和/或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的载体。
241.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞选自革兰氏阳性细菌宿主细胞和革兰氏阴性细菌宿主细胞。
242.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌细胞是Lactobacillus菌株。
243.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌细胞是Streptococcus菌株。
244.条目240的细菌宿主细胞，其中所述细菌细胞是Bifidobacterium菌株。
245.一种产生重组细菌细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述细菌细胞，并且可选地，在所述细菌细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的重组细菌细胞。
246.一种重组酵母细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽，和/或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的载体。
247.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞属于Saccharomyces、Scizosacchomyces或Pichia属。
248.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母是Saccharomycescerevisiae.
249.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母是Scizosacchomyces pompe.
250.条目246的酵母宿主细胞，其中所述酵母是Pichiapastoris。
251.一种生成重组酵母细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述酵母细胞，并且可选地，在所述酵母细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的重组酵母细胞。
252.一种重组真菌细胞，含有条目1至208任一项所述的多肽，和/或条目211所述的多核苷酸，和/或条目212所述的载体。
253.条目252的真菌宿主细胞，其中所述真菌属于Aspergillus属。
254.一种生成重组真菌细胞的方法，所述方法包括步骤：提供编码条目1至208任一项所述多肽的多核苷酸，将所述多核苷酸引入所述真菌细胞，并且可选地，在所述真菌细胞中表达所述多核苷酸，从而生成一种产生所述多肽的重组真菌细胞。
255.一种特异性针对条目1至208任一项所述多肽的抗体或其结合片段。
256.条目255的抗体，其中所述抗体是多克隆的。
257.条目255的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
258.条目255的抗体片段，其中所述抗体片段包含抗体的一部分，选自F(ab′)2、F(ab)2、Fab′和Fab。
259.条目255的抗体片段，其中所述抗体片段是与特异性抗原结合的合成或者基因工程化的多肽。
260.条目255的抗体片段，其中所述抗体片段选自：包含或由轻链可变区组成的抗体片段；包含或由“Fv”片段组成的抗体片段，Fv片段由可变区域的重链和轻链组成；包含或由重组单链多肽分子组成的抗体片段，重组单链多肽分子中的轻可变区和重可变区通过肽连接头连接(″scFv多肽″)，以及包含或由最小识别单元组成的抗体片段，最少识别单元组成模仿高变区的氨基酸残基。
261.条目255的抗体，其中所述抗体是重组多肽形式的嵌合抗体，其含有来自鼠抗体的可变区和互补决定区，而抗体分子的剩余部分来自人抗体。
262.条目255的抗体，其中所述抗体是重组多肽形式的人源化抗体，其中单克隆抗体的鼠互补决定区已经由小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链转移至人可变域。
263.条目255至262任一项所述的抗体，进一步包含或者连接可检测的分子或原子的形式的标记，所述标记可以与抗体基团偶联，从而产生更容易检测的基团。
264.条目263的抗体，其中标记选自螯合剂，光活性剂，放射性同位素，荧光剂和顺磁离子。
265.一种生成特异性针对条目1至208任一项所述多肽的多克隆抗体或其结合片段的方法，所述方法包括步骤：在引起抗体应答的条件下用条目1至208任一项所述的多肽免疫哺乳动物个体，识别与多肽特异性结合的抗体，并且可选地，从所述哺乳动物个体中分离所述抗体或其结合片段。
266.一种生成特异性针对条目1至208任一项所述多肽的单克隆抗体的方法，所述方法包括步骤：在引起抗体应答的条件下用条目1至208任一项所述的多肽免疫哺乳动物个体，制备产生特异性针对条目1至208任一项所述多肽的抗体的杂交瘤，并且识别与多肽特异性结合的抗体。
267.一种组合物，含有条目1至208任一项所述的多肽以及载体。
268.一种冰排斥面，含有条目1至208任一项所述的多肽或条目267所述的组合物。
269.包含条目268所述的冰排斥面的冷藏室。
270.包含条目268所述的冰排斥面的冷冻器。
271.包含条目268所述的冰排斥面的橱窗。
272.包含条目268所述的冰排斥面的风车翼。
273.包含条目268所述的冰排斥面的无线电检测和测距装置。
274.包含条目268所述的冰排斥面的汽车。
275.包含条目268所述的冰排斥面的热泵。
276.包含条目268所述的冰排斥面的帆船。
277.包含条目268所述的冰排斥面的路面。
278.一种转移液体源(例如水)的管，所述管包含条目268所述的冰排斥面。
279.条目278所述的管由塑料制成。
280.条目278所述的管由金属制成。
281.包含条目268所述的冰排斥面的屋顶结构。
282.包含条目268所述的冰排斥面的瓶子。
283.包含条目268所述的冰排斥面的罐头。
284.包含条目268所述的冰排斥面的天线装置。
285.包含条目268所述的冰排斥面的风档刮水器。
286.包含条目268所述的冰排斥面的橡胶轮胎。
287.包含条目268所述的冰排斥面的空调装置。
288.包含条目268所述的冰排斥面的铁轨。
289.包含条目268所述的冰排斥面的火车车轮。
290.包含条目268所述的冰排斥面的电缆。
291.一种冰晶核表面，含有条目1至208任一项所述的多肽或条目267所述的组合物。
292.包含条目291所述的冰晶核表面的冷藏室。
293.包含条目291所述的冰晶核表面的冷冻室。
294.包含条目291所述的冰晶核表面的橱窗。
295.包含条目291所述的冰晶核表面的风车翼。
296.包含条目291所述的冰晶核表面的无线电检测和测距装置。
297.包含条目291所述的冰晶核表面的汽车。
298.包含条目291所述的冰晶核表面的热泵。
299.包含条目291所述的冰晶核表面的帆船。
300.包含条目291所述的冰晶核表面的路面。
301.一种转移液体源(例如水)的管，所述管包含条目291所述的冰晶核表面。
302.条目301所述的管由塑料制成。
303.条目301所述的管由金属制成。
304.包含条目291所述的冰晶核表面的屋顶结构。
305.包含条目291所述的冰晶核表面的瓶子。
306.包含条目291所述的冰晶核表面的罐头。
307.包含条目291所述的冰晶核表面的天线装置。
308.包含条目291所述的冰晶核表面的风档刮水器。
309.包含条目291所述的冰晶核表面的橡胶轮胎
310.包含条目291所述的冰晶核表面的空调装置。
311.包含条目291所述的冰晶核表面的铁轨。
312.包含条目291所述的冰晶核表面的火车车轮。
313.包含条目291所述的冰晶核表面的电缆。
314.一种降低水性液体组合物的凝固点的方法，所述方法包括步骤：将条目1至209任一项所述的多肽与所述水性液体组合物接触，其中所述接触导致所述水性液体组合物的凝固点降低。
315.条目314的方法，其中所述液体组合物包括涂料组合物。
316.条目314的方法，其中所述液体组合物包括冷冻器中使用的防冻剂。
317.条目314的方法，其中所述液体组合物包括冷藏室中使用的防冻剂。
318.条目314的方法，其中所述液体组合物包括发动机中使用的防冻剂.
319.条目314的方法，其中所述液体组合物包括挡风玻璃清洗剂。
320.条目314的方法，其中所述液体组合物包括硅树脂。
321.条目314的方法，其中所述液体组合物包括涂料成分，如油漆、亮漆或清漆。
322.条目314的方法，其中所述液体组合物包括蜡。
323.条目314的方法，其中所述液体组合物包括油。
324.条目314的方法，其中所述液体组合物包括水泥。
325.条目314的方法，其中所述液体组合物包括混凝土。
326.条目314的方法，其中所述液体组合物包括肥皂。
327.条目314的方法，其中所述液体组合物包括锁中使用的防冻组合物。
328.一种减少或消除水性液体组合物再结晶的方法，所述方法包括步骤：在冻结之前将条目1至209任一项所述的多肽与水性液体组合物接触，由此减少或消除水性液体组合物的再结晶。
329.条目328的方法，其中所述液体组合物包括涂料组合物。
330.条目328的方法，其中所述液体组合物包括冷冻器中使用的防冻剂。
331.条目328的方法，其中所述液体组合物包括冷藏室中使用的防冻剂。
332.条目328的方法，其中所述液体组合物包括发动机中使用的防冻剂.
333.条目328的方法，其中所述液体组合物包括挡风玻璃清洗剂。
334.条目314的方法，其中所述液体组合物包括硅树脂。
335.条目328的方法，其中所述液体组合物包括亮漆。
336.条目328的方法，其中所述液体组合物包括蜡。
337.条目328的方法，其中所述液体组合物包括油。
338.条目328的方法，其中所述液体组合物包括水泥。
339.条目328的方法，其中所述液体组合物包括混凝土。
340.条目328的方法，其中所述液体组合物包括肥皂。
341.条目328的方法，其中所述液体组合物包括锁中使用的防冻组合物。
342.一种保存和/或降低生物样品或器官的凝固点的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽和生物样品或器官接触，由此可以在超冷条件或冻结条件下保存生物样品或器官。
343.条目342的方法，其中生物样品包括多肽。
344.条目342的方法，其中生物样品包括微粒或胶束。
345.条目342的方法，其中生物样品包括全血。
346.条目342的方法，其中生物样品包括血浆。
347.条目342的方法，其中生物样品包括血小板。
348.条目342的方法，其中生物样品包括红细胞。
349.条目342的方法，其中生物样品包括精液。
350.条目342的方法，其中生物样品包括配子。
351.条目342的方法，其中生物样品包括昆虫细胞的细胞培养物。
352.条目342的方法，其中生物样品包括哺乳动物细胞的细胞培养物。
353.条目352的方法，其中哺乳动物细胞是鼠细胞。
354.条目342的方法，其中哺乳动物细胞是人细胞。
355.条目342的方法，其中生物样品包括或者由器官组成。
356.条目355的方法，其中器官选自肾、肺、心脏、脾和肝。
357.一种抑制生物样品或器官在储存期间再结晶的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽与生物样品或器官接触，从而抑制再结晶，并可以在超冷条件或冷藏条件下储存生物样品或器官。
358.条目357的方法，其中生物样品包括多肽。
359.条目357的方法，其中生物样品包括微粒或胶束。
360.条目357的方法，其中生物样品包括全血。
361.条目357的方法，其中生物样品包括血浆。
362.条目357的方法，其中生物样品包括血小板。
363.条目357的方法，其中生物样品包括红细胞。
364.条目357的方法，其中生物样品包括精液。
365.条目357的方法，其中生物样品包括配子。
366.条目357的方法，其中生物样品包括昆虫细胞的细胞培养物。
367.条目357的方法，其中生物样品包括哺乳动物细胞的细胞培养物。
368.条目357的方法，其中哺乳动物细胞是鼠细胞。
369.条目357的方法，其中哺乳动物细胞是人细胞。
370.条目357的方法，其中生物样品包括或者由器官组成。
371.条目357的方法，其中器官选自肾、肺、心脏、脾和肝。
372.一种保存食用或饮用组合物(如食品)的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽与食品接触，从而可以改善或延长非冷冻态的食用或饮用组合物的储存，否则食品在该非冷冻态的温度下将成为冻结态。
373.条目372的方法，其中组合物选自牛奶、发酵奶、奶酪、碎肉、碎鱼、酸奶、雪酪、果子露、布丁、菜泥、果浆、生面团、冰牛奶、奶油、刨冰、碎冰、冰沙、冰淇淋、冰糕、面糊和肉。
374.一种减少或抑制食用或饮用组合物上的冰晶体再结晶的方法，通过将条目1至209任一项所述的多肽与食物接触，从而减少或抑制储存期间温度下组合物上形成的冰晶体的再结晶，否则将在该温度下形成冰晶体。
375.条目374的方法，其中组合物选自牛奶、发酵奶、奶酪、碎肉、碎鱼、酸奶、雪酪、果子露、布丁、菜泥、果浆、生面团、冰牛奶、奶油、刨冰、碎冰、冰沙、冰淇淋、冰糕、面糊和肉。
376.一种增加化妆品的耐寒性的方法，该化妆品能够用于个体的皮肤，所述方法包括将条目1至209任一项所述的多肽与化妆品接触的步骤，从而当应用于皮肤时增加化妆品的耐寒性。
377.一种增加产品的水分含量的方法，该产品能够吸水，所述方法包括接触条目1至209任一项所述的多肽的步骤，从而增加产品的水分含量。
378.一种通过手术限制肿瘤的方法，所述方法包括在所述肿瘤进行冷冻步骤前，将条目1至209任一项所述的多肽注射进肿瘤的步骤，从而增强对肿瘤的杀灭。
379.一种通过手术可控制地除去脂肪组织的方法，所述方法包括在除去脂肪组织前，将条目1至209任一项所述的多肽注射进脂肪组织的步骤。
380.一种抑制原油产品中包合物形成的方法，所述方法包括将条目1至209任一项所述的多肽添加至原油产品的步骤，从而抑制包合物形成。
381.一种在干燥期间或者在经受高或低渗透压期间稳定生物样品的方法，所述方法包括接触条目1至209任一项所述的多肽的步骤，从而在干燥期间或者在经受高或低渗透压期间，稳定生物样品。
382.条目381的方法，其中生物样品包括一种或多种多肽、微粒体、胶束、全血、血浆、血小板、红细胞、精液、配子。
383.条目381的方法，其中生物样品包括细胞培养物。
384.条目383的方法，其中细胞培养物包括一种或多种昆虫细胞、哺乳动物细胞、鼠细胞和人细胞。
385.一种从包含不同分子的组合物中纯化一种或多种分子的方法，所述方法包括在含有条目1至209任一项所述多肽的组合物存在的情况下，进行所述纯化的步骤，从而可以在低于包含不同分子的组合物的凝固点的温度下发生纯化。
386.条目385的方法，其中组合物的分子包括不同的分子，选自多肽、肽、氨基酸、糖、脂肪酸、DNA分子、RNA分子、磷脂、如线粒体、核糖体等细胞器、三磷酸腺苷。
387.一种改善待脱水的组合物的脱水的方法，所述方法包括将所述组合物与条目1至209任一项所述的多肽接触，以及使所述组合物脱水的步骤。
388.一种含有条目1至209所述多肽的组合物。
389.一种含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽均匀或不均匀地在表面分布。
390.一种含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽均匀或不均匀地分布在整个组合物中。
391.一种用于冷冻的含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽是在冷冻前加入。
392.一种用于冷冻的含有条目1至209所述多肽的组合物，其中多肽在冷冻后加入。
393.含有条目1至209所述多肽的药物成分。
394.含有条目1至209所述多肽的表面，其中所述表面是冰排斥的。
395.含有条目1至209所述多肽的表面，其中所述表面是冰结合的。
396.含有条目1至209所述多肽的生物样品。
397.含有条目1至209所述多肽的食用组合物。
398.含有条目1至209所述多肽的液体组合物。
399.含有条目1至209所述多肽的固体组合物。
400.含有条目1至209所述多肽的固体组合物，其中多肽在表面分布。
401.含有条目1至209所述多肽的固体成分，其中多肽均匀或不均匀地分布在整个样品中。
现通过描述来自Rhagium mordax的抗冻蛋白的重组表达、纯化和特征，对本发明进行更详细的说明。
实施例
采用两种不同的方法鉴别和纯化来自R.mordax的抗冻多肽。
1)用Kristiansen等人(2005)发表的方法来纯化该抗冻多肽。
2)设计两种简并引物，以匹配R.Inquisitor AFP的N-端和C-端区(图1)。用它们在常规的RT-PCR反应中扩增R.mordax RNA的cDNA区，R.mordax RNA是从冬季采集的动物中分离。这种cDNA编码来自R.mordax推定的AFP’s的中心区。通过这种方法，得到多肽两种类型(族)的中心部分的序列(99-108aa)。
3)随后获得对9种同工型的全长AFP序列。通过使用Clontech SmartRACE cDNA扩增试剂盒，将特异性针对编码推定的AFP’s的cDNA各中心部分的引物与相关的5’端的扩增结合使用。一旦获得各cDNA的5’端，该序列将被用于获得全长克隆。这是通过在R.mordax RNA的RT-PCR反应中，用匹配各cDNA末端5’端的引物与匹配mRNA poly-A尾的引物相结合来完成的。
总之，获得了编码组I AFP’s的各种同工型的9种全长cDNA，并且推断出编码的多肽。
表达和纯化
源自Rhagium mordax RmAFP的抗冻蛋白(AFP)的六种同工型被克隆。图5显示一种野生型(wt)同工型RmAFP1的SDS-PAGE凝胶，以及缺失变体(Δ2-9，WC(Trp-Cys))。将RmAFP变体构建为缺失冰结合域，从RmAFP1的C-端开始每次缺失一个(Δ2-Δ9)(例如Δ4表示推定的冰结合域4-9缺失)，以及在C-端包含Trp和Cys残基的变体(WC)。将它们克隆到pGEX载体系统中(GE Healthcare)并在E.coli(菌株：Origami，BL21)中转化。这些蛋白表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，其在GST和RmAFP之间含有凝血酶裂解位点。然后，将细胞通过弗氏压碎器溶解，并且使用与琼脂糖珠共价连接的还原型谷胱甘肽，基于亲和色谱以及体积排阻色谱进行纯化谱。图5中的箭头表示AFP1的缺失衍生物的位置。
活性测定
利用纳米-升渗压计测试Rhagium mordax抗冻蛋白的野生型同工型及其变体的活性。结果显示在下表4中。将RmAFP变体构建为缺失冰结合域，从RmAFP1的C-端每次缺失一个；以及在C-端含有Trp和Cys残基的变体。THapp是热滞后，直接从分析中估计而不考虑AFP的浓度，被纯化或在个别测试中作为融合蛋白或冰部分(fractionation)；星号标记的TH除外，TH是通过TH vs冰部分图中的点，由直线外推法估计得出。n是测量的次数。尚不确定，但在进行中(N.D)。我们发现，Δ5-9和Δ4-9中可检测的活性表明含有4个和3个推定冰结合基团的AFP1的截断体分别保留了防止冰晶体生长的能力。缺失衍生物的特异性活性还没有被确定，目前尚不知道它们与wt蛋白相关的活性。
表4
RmAFP活性的目视检查
图6说明“冰生长-激增”的进展，其在热滞后冰点下发生于1)RmAFP1的溶液和2)粘鱼Zoarces viviparus(带有3AFP的丹麦鱼)的血清中。在两种情况下，在温度降低之前小冰晶可以在溶液中退火。当降低RmAFP溶液的温度时，在达到滞后冰点之前，初始的冰晶体(1A中的箭头处)不再生长和改变形状。在滞后冰点(1B)下冰晶体突然爆发，因为溶液在超冷的环境中冻结。请注意，在这种情况下，滞后冰点时的冰生长模式是菜花状(1B、1C)。这与2)(Z.viviparus血清)中看到的情形相反，2)中冷却时冰晶体缓慢变化形状，并变为带有六角形基面的双棱锥(2A)。在滞后冰点时，冰生长是针状的(2B)，并且溶液中所有的冰生长为针状体(2C)。总之，RmAFP能够抑制所有的冰生长或者冰晶体形状的变化(1)。这与鱼的抗冻蛋白溶液显著不同，鱼的抗冻肽蛋白溶液一般遵循(2)中看到的模式。
RmAFP1的物理化学性质-质谱(MALDI-ToF)
克隆和纯化的Rhagium mordax AFP1的分子测定如图7显示。纯化重组rRmAFP1由Alphalyse(Odense，丹麦)通过MALDI-ToF分析完成纯化重组rRmAFP1的质谱分析。rRmAFP1的分子测定给出平均值为12555Da。这个差异性可能是由于校正仪器时使用外标。
体积排阻色谱
本发明还研究了rRmAFP1的二聚化，结果如图8所示。在自然条件下rRmAFP表现为二聚体，因为当其穿过体积排阻柱时(Superdex 75，10/30，GEHealthcare)，它比相同Mw范围的其他蛋白具有更短的保留时间。当Superdex 75用牛血清白蛋白(68KDa，BSA)、胰蛋白(25KDa)和人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(13KDa)进行校正时，从rRmAFP1的SEC估算Mw为28KDa。这些显示在图8A中。同样，当在SDS PAGE中运行时，RmAFP也表现为二聚体，估计Mw为28KDa。第1泳道：牛血清白蛋白(BSA)；2：胰蛋白；3：RNAse A；4：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；5：溶菌酶；6：RmAFP1；7：谷胱甘肽S转移酶(GST)。这显示在图8B中。
圆二色光谱
在哥本哈根大学进行圆二色光谱(CD)。结果可见图9。根据图9A，远UV CD光谱显示重组蛋白具有确定的结构。图9B中显示的近UV CD光谱表明rRmAFP具有大量的β-片层结构。
差示扫描量热法
通过差示扫描量热法(DSC；Scal，Moscow，Russia)研究温度稳定性。结果如图10显示。RmAFP1的转变温度Tm估计为47.7℃。在6-100℃温度范围内进行第一次扫描，在6-70℃温度范围内进行随后的11次扫描。曲线的不对称形状表明了蛋白二聚体的分解，随后单体的展开。由11次扫描产生的整体曲线相似性显示RmAFP能够在连续加热/冷却循环中多次变性和复性，而没有任何物质的损失。较低的线显示了在缓冲控制器上进行的类似热循环的结果。随后分析进行了12次加热/冷却循环的样品的活性，并且给出0.94℃时的热滞后THapp，其与起始材料的活性没有区别。这些研究表明一种温和稳定的蛋白，却具有在变性后复原为生物活性分子的显著特征。
pH对活性和稳定性的影响
本发明还研究了pH对活性和稳定性的影响。图11显示在标示的pH值下预培养1h时，对RmAFP的稳定性的影响，稳定性显示为pH7.2时的TH。
本申请是2007年11月21日提交的美国临时申请No.61/003,979的正式申请，在此将该临时申请全部引入作为参考。上述临时申请或本申请中引用的所有专利和非专利文献均全部引入作为参考。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 体外受精及胚胎移植信息核对方法 | 2020-05-19 | 839 |
| 牛体外受精胚胎培养的方法 | 2020-05-15 | 617 |
| 体外受精培养筛及体外受精方法 | 2020-05-11 | 996 |
| 用于体外受精的组合物 | 2020-05-12 | 401 |
| 一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法 | 2020-05-20 | 300 |
| 幼畜卵母细胞体外两次受精方法 | 2020-05-18 | 607 |
| 一种牛体外受精囊胚双重染色的方法 | 2020-05-18 | 441 |
| 牛体外受精胚胎培养液和培养方法 | 2020-05-19 | 593 |
| 体外受精培养筛 | 2020-05-13 | 476 |
| 一种体外受精皿 | 2020-05-13 | 105 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈