技术领域
[0001] 本
发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码序列与应用。
背景技术
[0002] 随着后基因组时代的到来，反向遗传学成为人们研究特定基因功能的重要手段。动物
疾病模型的建立，是人们用来研究特定疾病的发病机理、药物靶点筛查和药物药性评价的必不可少的工具。其中，小鼠模型具有体型小、饲养管理方便、易于控制、生产繁殖快、使用成本低等优点，一直受到研究者的青睐。目前，小鼠经过长期的人工饲养和选择培育，已育成1000多种近交系和远交系。在如此众多的小鼠品系中，近交系小鼠由于其遗传上的高度一致性，利用近交系小鼠得到的数据往往可比性好、
精度高、数据均一、遗传稳定，因此广泛应用于医学研究。相对地，远交系小鼠因其繁殖
力强、成活率高，也是
生物学研究中重要的实验材料。
[0003] 近年来，基因打靶技术日益成熟，是研究者定向修饰基因组密码的重要工具，大大简化了细胞
水平、生物个体水平的基因功能研究。然而，传统的基因打靶技术依赖细胞内的同源重组过程，其自然发生的几率为百万分之一，导致基因打靶技术的效率低下；而且，打靶载体往往需要设计较长的同源臂，增加了实验的难度；再者，这项技术是建立在干细胞技术之上的，对干细胞技术要求较高。所以，传统的基因打靶技术存在效率低、费时费力、技术要求高等不足，其应用受到了很大的局限。
[0004] 近年来，新的基因靶向技术——锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)相继问世，极大地提高了基因编辑的效率。这三种不同的技术有着类似的作用方式，由可设计的蛋白(ZFNs和TALENs)或RNA(CRISPR/Cas9)特异地识别靶位点，引导相应的核酸酶在靶位点对DNA进行剪切，产生DNA双链断裂(DBS)。通常地，断裂的DNA会采用非同源末端连接(NHEJ)的方式对DNA进行修复，而这种修复往往会造成小
片段的缺失或者插入，因而导致靶基因的失活；另一种可能是，在有修复模板存在的情况下，DNA的修复会按照模板DNA进行。因此，这些能够很好地应用于基因失活、基因敲入、表观修饰等领域。其中，由于ZFNs的模
块性不强，设计一个剪切活性高、特异性好的ZFNs并不容易，且很多基因位点难以找到合适的ZFN靶点，因此大大限制了ZFNs的应用。CRISPR/Cas9技术虽然设计简单，但存在较高脱靶的可能性。相比而言，TALENs具有效率高、特异性强、细胞毒性低等优点，是建立基因敲除模型的理想方法。TALENs自2011年起开始兴起以来，已在家蚕、斑
马鱼、小鼠、
家畜以及人类细胞上得到了成功的应用，这些成功的案例说明TALENs具有很好的多物种适用性。
[0005] 大肠炎是一类比较常见的肠道疾病，其发病过程与遗传、环境以及精神压力等因素息息相关，目前其病因尚不完全清楚。因此，开发大肠炎动物模型，具有很好的应用前景。
[0006] 与大肠炎相关的基因较多。其中，ACE2蛋白通过调节小肠上皮细胞对食物中色
氨酸的吸收，进而影响抗菌肽的分泌以及肠道
微生物的平衡。一旦ACE2蛋白的功能发生变化，大肠中的微生物平衡会被打破，从而导致大肠验证的发生。
[0007] 目前，在近交系小鼠中，研究者已经采用传统的基因打靶方法，构建了几个品系的大肠炎小鼠模型，但是其效率低下，很难快速地得到大量的模型小鼠，以满足后续的疾病机理、药物毒理、药效评价等研究。并且，传统的打靶方法会引入标记基因。有研究表明，标记基因可能会对实验结果造成一定的影响，虽然这种说法尚无定论，但在构建模型的时候，应尽量避免标记基因的引入。
[0008] 因此，一种高效、无标记的模型构建方法需要被开发出来。同时，目前所有的大肠炎研究都集中于近交系小鼠，远交系小鼠模型的构建未见报道。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提出介导大肠炎相关基因Ace2的靶向敲除的一对转录激活子样效应因子核酸酶，其编码序列及其应用。本
申请的转录激活子样效应因子核酸酶能高效、特异地靶向敲除Ace2基因。
[0010] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] 第一方面，本发明提供一对多肽，其中一条多肽具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列，另一条多肽具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列。
[0012] 优选地，所述一对多肽各自具有特异性识别T(N)nA结构的核苷酸序列的功能，其中N为A，G，C或T中的任意一种
碱基，n为30至70之间的任一数字；
[0013] 进一步优选地，所述一对多肽中的其中一条多肽特异性识别如SEQ ID NO:3所述的核苷酸，或如SEQ ID NO:3所述的核苷酸经一个或多个、优选2个核苷酸取代所衍生的核苷酸，另一条多肽特异性识别如SEQ ID NO:4所述的核苷酸，或如SEQ ID NO:4所述的核苷酸经一个或多个、优选2个核苷酸取代所衍生的核苷酸。
[0014] 第二方面，本发明提供一对多核苷酸1，其选自以下组：
[0015] (1)编码如第一方面所述一对多肽的一对多核苷酸；
[0016] (2)分别具有如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列或与其具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列或与其具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的核苷酸序列。
[0017] 第三方面，本发明提供一对融合蛋白，其由第一方面所述的一对多肽分别与DNA切割元件的两个
单体或两个亚基融合而成，所述DNA切割元件需要两个单体或两个亚基的聚集以行使DNA切割功能。所述一对融合蛋白即为本发明所述的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，下文分别称为TALEN-L和TALEN-R。
[0018] 作为优选，所述一对融合蛋白分别具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列具有≥90％、优选≥95％、更优选≥98％、最优选≥99％同源性的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有≥90％、优选≥95％、更优选≥98％、最优选≥99％同源性的氨基酸序列。
[0019] 第四方面，本发明提供一对多核苷酸2，其选自以下组：
[0020] (1)编码如第三方面所述一对融合蛋白的一对多核苷酸；
[0021] (2)分别具有如SEQ ID NO:9所示核苷酸序列或与其具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:10所示核苷酸序列或与其具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的核苷酸序列。
[0022] 第五方面，本发明提供一种包含如第四方面所述一对多核苷酸2中的任意一条多核苷酸的载体；优选地，其中在所述多核苷酸的上游还包括编码核
定位信号的核苷酸序列。
[0023] 第六方面，本发明提供一种用如第五方面所述载体转化的宿主细胞。
[0024] 第七方面，本发明提供一种如第三方面所述一对融合蛋白或如第四方面所述一对多核苷酸2在对小鼠的Ace2基因靶向敲除中的应用。
[0025] 第八方面，本发明提供一种小鼠大肠炎模型的构建方法，其包括：将如第三方面所述一对融合蛋白或如第四方面所述一对多核苷酸2或分别含有如第四方面所述一对多核苷酸2的载体转入小鼠的受精卵；
[0026] 优选地，分别将如第四方面所述一对多核苷酸2体外转录成相应的mRNA，之后将所述mRNA注射小鼠的受精卵；进一步优选地，其中，如第四方面所述的一对多核苷酸2的各自的上游还包括编码核定位信号的核苷酸序列，以将核定位信号引入转录后的mRNA中。
[0027] 在一个优选的实施方案中，本发明分别将如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列转录成相应的mRNA，并在体外转录的过程中引入核定位信号NLS，之后将mRNA注射小鼠的受精卵，这避免了DNA序列在小鼠基因组中的整合；mRNA在细胞内翻译成蛋白后，通过核定位信号NLS进入细胞核，然后识别特异的目的序列，紧接着核酸酶FokI发生剪切。
[0028] 第九方面，本发明提供了一种
试剂盒，其包括如第一方面所述的一对多肽，或如第二方面所述的一对多核苷酸1，或如第三方面所述的一对融合蛋白，或如第四方面所述的一对多核苷酸2，或如第五方面所述的载体，或如第六方面所述的转化的宿主细胞。本发明的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)能够高效地造成目的基因——大肠炎相关基因Ace2的失活，从而快速获得小鼠大肠炎模型，而且传代稳定，为大肠炎的研究提供良好的遗传资源。
附图说明
[0029] 图1是小鼠Ace2基因的结构图以及本发明转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)的结合位点。灰色方框为基因的非编码区，黑色方框为基因的编码区。
[0030] 图2为本发明
实施例中注射所述TALEN mRNA后得到的小鼠的RFLP-DraI鉴定结果。
[0031] 图3为本发明实施例中注射所述TALEN mRNA后获得的小鼠的基因组序列的改变。其中，红色字体部分为所述TALEN-L和TALEN-R在Ace2基因上的结合位点，“♂”和“♀”分别表示公鼠和母鼠，“△”和“+”分别表示碱基的缺失和插入，其后的数字表示缺失、插入的碱基数，“移码”表示移码突变。
[0032] 图4显示本发明实施例制备的大肠炎模型小鼠因腹泻引起的体重减轻；其中，“野生型,对照”表示野生型小鼠饲喂普通
饮用水，“Ace2敲除,对照”表示Ace2基因敲除小鼠饲喂普通饮用水，“野生型,DSS”表示野生型小鼠饲喂添加DSS的饮用水，“Ace2敲除,DSS”表示Ace2基因敲除小鼠饲喂添加DSS的饮用水。“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
[0033] 图5为本发明实施例制备的大肠炎模型小鼠的结肠长度；其中，“野生型,对照”表示野生型小鼠饲喂普通饮用水，“Ace2敲除,对照”表示Ace2基因敲除小鼠饲喂普通饮用水，“野生型,DSS”表示野生型小鼠饲喂添加DSS的饮用水，“Ace2敲除,DSS”表示Ace2基因敲除小鼠饲喂添加DSS的饮用水。“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。
[0034] 图6-1、6-2、6-3、6-4分别为本发明实施例中的“野生型,对照”组、“Ace2敲除,对照”组、“野生型,DSS”组和“Ace2敲除,DSS”组小鼠的结肠病理切片；其中，带“*”
位置表示炎性细胞的浸润；“WT,control”表示野生型小鼠饲喂普通饮用水，“Ace2敲除,对照”表示Ace2基因敲除小鼠饲喂普通饮用水，“野生型,DSS”表示野生型小鼠饲喂添加DSS的饮用水，“Ace2敲除,DSS”表示Ace2基因敲除小鼠饲喂添加DSS的饮用水。
具体实施方式
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细阐述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
[0036] 实施例中使用的昆明小鼠，购自广东省医学实验动物中心。
[0037] 实施例1、小鼠Ace2基因的序列分析及TALEN打靶位点的设计
[0038] NCBI
数据库显示，小鼠Ace2基因(基因ID：70008)全长49,077bp，其编码由19外显子组成的mRNA，进一步地编码由805个氨基酸残基组成的
蛋白质，基因结构如图1所示。
[0039] 根据小鼠Ace2基因的结构特点，本实施例中以第二外显子为TALEN打靶位点，并选择TALEN在小鼠Ace2基因上的识别位点为5’-TCACCGAGGAAAATGCCAAGACATTTTTAAACAACTTTAATCAGGAAGCTGA-3’，其中下划线部分分别为TALEN-L和TALEN-R识别位点，即SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
[0040] 按照可变模块NI识别A碱基、NG识别T碱基、NN识别G碱基、HD识别C碱基的原则，按照Golden Gate的方法，设计特异性识别上述两个位点的多肽(分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)，以及编码上述多肽的核苷酸序列(分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示)，并在它们的上游设置T3启动子的序列和编码核定位信号NLS的核苷酸序列，在其下游设置编码核酸酶FokI的核苷酸序列。
[0041] 从上游到下游依次包含T3启动子、编码NLS的核苷酸序列、如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示核苷酸序列和编码FokI的核苷酸序列的总的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，它们分别对应于序列中的71-90位核苷酸序列、118-138位核苷酸序列、139-2319位核苷酸序列和2320-3084位核苷酸序列；如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列分别编码带有核定位信号NLS的TALEN-L和TALEN-R的核苷酸序列。
[0042] 分别将SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列采用AflII和XhoI内切酶同时进行酶切，回收酶切片段用作体外转录的模板。体外转录采用mMESSAGE mMACHINE T3试剂盒(Life technologies，美国)进行，体外转录的条件为：100ng模板在37℃、1u转录酶的条件下孵育2小时。然后，将反应液用polyA tailing试剂盒(Epicentre,美国)进行加A反应，反应条件为：37℃孵育1小时。再然后，向反应液中加入1u的DnaseI，37℃孵育15分钟用以消化模板DNA。最后，转录制得的mRNA采用
苯酚-氯仿的方法进行抽提，mRNA置于-80℃备用。
[0043] 实施例2、Ace2基因敲除小鼠的制备
[0044] 将实施例1制备的mRNA按照TALEN-L和TALEN-R各50ng/uL的终浓度混合到一起，将
混合液注射到昆明小鼠受精卵的
细胞质中，注射量为1pL至50pL。之后，将存活的受精卵移植回代孕小鼠的子宫中。经过约21天的怀孕期，共出生49只小鼠。取小鼠的尾尖，采用苯酚-氯仿的方法，提取DNA。小鼠打靶是否成功采用RFLP-DraI来确定，具体为：
[0045] 采用如下引物，序列为：
[0046] ACE2-F:5’-CTTCTCAGTGCCCAACCCA-3’
[0047] ACE2-R:5’-GGATCAGAGCTACAGAGGCAGT-3’
[0048] 以小鼠DNA为模板，进行PCR扩增，得到432bp的扩增产物，该产物包括TALEN-L和TALEN-R所识别的序列，以及处于二者之间的DraI内切酶识别位点。
[0049] 将PCR产物用DraI内切酶进行酶切，若PCR产物能够被完全切开，则判定该小鼠为野生型小鼠；若PCR产物不能被切开，则说明酶切位点被TALEN所破坏，判定该小鼠为双等位基因敲除小鼠；若PCR产物能够部分被切开，则说明小鼠基因组中的一条等位基因被破坏，判定该小鼠为单等位基因敲除小鼠。经检测，PCR产物的酶切结果如图2所示，由图2可见，49只小鼠中有28只为基因敲除小鼠，敲除效率为57％。
[0050] 进一步地，将PCR产物连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α。采用上述RFLP-DraI的方法，对所得到的细菌克隆进行鉴定。然后，每只小鼠挑取6个敲除克隆，进行Sanger测序。测序结果如图3所示，由图3可见，测序结果与RFLP-DraI结果一致。特别地，移码突变的个体被认为是最终成功敲除的小鼠。需要特别指出的是，某些小鼠个体，如8#、22#、23#、24#和38#，具有较多的基因型，被认为是基因嵌合型小鼠。
[0051] 实施例3、大肠炎小鼠模型的建立
[0052] 从实施例2制备的Ace2基因敲除小鼠中挑选双等位基因敲除的公鼠，随机分为两个组，每组6只小鼠：将其中一组小鼠饲喂普通饮用水，记为“Ace2敲除，对照”；另外一组饲喂加入5％葡聚糖
硫酸钠(DSS)的饮用水，记为“Ace2敲除,DSS”。同时，选取与敲除鼠相同周龄的昆明公鼠，随机分为两个组，每组6只小鼠：将其中一组小鼠饲喂普通饮用水，记为“野生型,对照”；另外一组饲喂加入5％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水，记为“野生型,DSS”。在饲喂的过程中，小鼠出现腹泻的现象。并且，随着饲喂时间的延长，腹泻程度也加剧，甚至出现便血的情况。
[0053] 为了评价小鼠的腹泻程度，每天称量每只小鼠的体重，以(Wti-Wt0)/Wt0*100％来计算小鼠在实验第i天的体重损失，结果如图4所示。图4结果表明，“Ace2敲除,DSS”组小鼠的体重损失较其它组多(P<0.05)，表明该组小鼠的腹泻程度较为严重。
[0054] 在经过7天饲喂实验后，处死小鼠，取小鼠结肠测量其长度，结果如图5所示。同样地，图5结果显示，“Ace2敲除,DSS”组小鼠的结肠较其它组小鼠的结肠明显缩短(P<0.01)。
[0055] 另一方面，为了观察小鼠结肠的病理变化，取结肠包埋于
石蜡，将其切成5μm厚的薄片，石蜡切片经苏木素-伊红
染色，具体为：切片经脱蜡(二
甲苯I15分钟；二甲苯II10分钟)，水化(无水酒精I1-2分钟；无水酒精II1-2分钟；95％酒精1-2分钟；80％酒精1-2分钟；
自来水冲洗片刻)，染色(蒸馏水冲洗片刻；苏木素染色10-15分钟；自来水冲洗片刻；1％
盐酸分化0.5-1分钟；流水冲洗；0.5％伊红复染2-5分钟；自来水冲洗片刻；95％酒精I1-2分钟；95％酒精II1-2分钟；无水酒精I1-2分钟；无水酒精II1-2分钟)，透明(二甲苯I5-10分钟；二甲苯II5-10分钟)。
显微镜下观察切片上的病变情况。
[0056] 结果如图6所示，图6显示：“Ace2敲除,DSS”组小鼠的结肠中存在大量的炎性细胞的浸润(图中“↓”所示区域)，以及肠粘膜结构的严重破坏。相较而言，“野生型,DSS”组小鼠的病理表征要轻得多。
[0057] 这些结果表明，利用本发明的TALEN敲除小鼠的Ace2基因，使得小鼠对DSS诱导造成的肠道损伤变得敏感，与野生型小鼠相比，表现出更为严重的肠道
炎症反应，包括严重腹泻、结肠缩短、结肠组织中大量炎性细胞的浸润以及肠粘膜结构的严重破坏。进一步说明，本发明的TALEN可用于高效构建小鼠大肠炎模型，其在昆明小鼠中取得了成功。
[0058] 最后需要说明的是，以上实施例仅用说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优化的实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附
权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
