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人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

阅读：1012发布：2020-12-28

专利汇可以提供人源化基因改造动物模型的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化OX-40基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。，下面是人源化基因改造动物模型的制备方法及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.导入人OX-40基因的非人动物或其子代的制备方法，其特征在于，导入人OX-40基因、使得该人OX-40基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的OX-40蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Ox-40基因的表达。
2.一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源OX-40基因，所述方法包括：
(a)构建含有人OX-40基因的载体，通过基因工程方法将所述人OX-40基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Ox-40基因缺失或使得内源/动物来源的Ox-40基因不具有功能；并且
(b)在所述非人动物体内表达人源OX-40基因。
3.一种制备基因修饰/改造的非人动物的方法，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的OX-40基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含内源/动物来源的Ox-40基因座，用人OX-40胞外域编码序列取代内源/动物来源的Ox-40胞外域编码序列的部分或全部。
4.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括OX-40基因，OX-40基因的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中OX-40基因的胞内参与信号传导的部分为动物来源，OX-40基因的胞外区域包含人OX-40基因的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Ox-40启动子后；
优选的，OX-40基因的跨膜区为动物来源。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，其中，动物来源的OX-40包括动物来源Ox-40基因的第1号外显子的部分序列、第5号外显子的部分序列、第6号外显子、第7号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或人OX-40基因部分为编码人类OX-40多肽的氨基酸的第1号外显子的部分或全部序列、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子的部分或全部序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，其中，动物来源的OX-40基因为啮齿类动物来源的Ox-40基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物为小鼠。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中，小鼠Ox-40的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：25中的全部或部分片段所示。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中，小鼠Ox-40的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：26中的全部或部分片段所示。
10.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其中，人OX-40基因的全部或部分片段的人OX-40mRNA序列如SEQ ID NO：27中的全部或部分片段所示。
11.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其中，人OX-40全部或部分片段的蛋白序列如SEQ ID NO：28中的全部或部分片段所示。
12.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其中，动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括小鼠来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，所述嵌合OX-40基因mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括动物来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，所述嵌合OX-40基因的嵌合mRNA序列如SEQ ID NO：31的全部或部分所示。
14.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括动物来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，编码所述嵌合OX-40基因的蛋白序列与SEQ ID NO：32所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括动物来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，所述嵌合OX-40基因的蛋白序列如SEQ ID NO：32的部分或全部所示。
16.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Ox-40的第1-5号外显子全部或部分序列替换为人源OX-40的第1-5号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-15任一项所示。
17.一种Ox-40敲除动物模型构建的方法，其特征在于，将动物体内的Ox-40的第1-5号外显子全部或部分敲除，使得内源Ox-40蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-15任一项所示。
18.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-15所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23所示，其中SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19为A组，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：24所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
19.一种Ox-40基因敲除动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：按照权利要求18所述的步骤1-4，获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Ox-40基因被敲除，获得Ox-
40基因敲除阳性小鼠；
第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Ox-40-/-小鼠；
优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：42-45所示。
20.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)，其选自Ox-40基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)，其选自Ox-40基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
21.一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向OX40基因，同时所述sgRNA在待改变的OX40基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则；优选的，所述sgRNA在小鼠Ox-40基因的靶位点分别位于小鼠Ox-40基因的第1外显子和第5外显子上。
更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的
3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-15任一项所示；
进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：11所示。
22.一种建立OX40基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)提供一种细胞，所述细胞包括权利要求20所述的靶向载体以及一种或多种靶位点的序列如1-15所示的sgRNA序列的体外转录产物，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
23.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在于，
(a)利用权利要求1-17、19或22任意一项所述方法获得动物模型；
(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
25.一种建立双人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)利用权利要求1-17、19或22任一项所述方法获得OX40基因基因改造人源化小鼠；
(b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与PD-1人源化小鼠交配得到OX40和PD-1双人源化小鼠模型。
27.根据权利要求1-17、19或22-26中任一项的方法产生的非人类哺乳动物或其后代。
28.一种非人类动物在制备荷瘤动物模型中的用途，其特征在于所述非人类动物通过权利要求1-17、19或22-26任一项所述的方法获得的。
29.来源于根据权利要求1-17、19或22-26任一项所述的方法获得的非人类动物或其后代或动物模型的组织或器官或肿瘤或其培养物。
30.一种嵌合OX-40蛋白，其特征在于，选自下列组中的一种：
a)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：27所示的序列的部分或全部所示；
b)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：27所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列杂交；
d)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：27所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
e)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列具有与SEQ ID NO：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
f)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列如SEQ ID NO：28部分或全部序列所示；
g)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：28所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：28所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
i)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：28所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
g)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列具有SEQ ID NO：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或
k)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列为SEQ ID NO：30所示的序列的部分或全部；
l)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
m)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列在严格条件下，与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列杂交；
n)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：30所示的序列差异不超过10、9、8、
7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
p)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列具有SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
q)嵌合OX-40的mRNA序列为SEQ ID NO：31所示的序列的部分或全部；
r)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的序列同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
s)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列杂交；
t)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
u)嵌合OX-40的mRNA序列具有与SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
v)嵌合OX-40的蛋白序列为SEQ ID NO：32的部分或全部；
w)嵌合OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：32所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
x)编码嵌合OX-40蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：32所示的蛋白的核苷酸序列杂交；
y)嵌合OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、
6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
z)嵌合OX-40的蛋白序列具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或
A1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO：29所示的序列的部分或全部；
B1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或至少99％；
C1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列杂交；
D1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
E1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO:29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
31.编码嵌合OX-40蛋白的基因，其特征在于，其中所述基因序列选自：
a)所述基因编码权利要求30中所述嵌合小鼠OX-40的蛋白序列；
b)嵌合OX-40的mRNA序列如SEQ ID NO：31所示；
c)嵌合OX-40的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：31所示的核苷酸杂交的基因序列；
d)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
和/或
e)编码嵌合OX-40的蛋白的基因序列，所述蛋白与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
f)编码嵌合OX-40的蛋白的基因序列，所述蛋白的序列与SEQ ID NO：32的差异不超过
10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基；
g)编码嵌合OX-40的蛋白的基因序列，所述蛋白具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
和/或
h)嵌合OX-40的基因序列如SEQ ID NO：29所示；
i)嵌合OX-40的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
j)嵌合OX-40的基因序列与SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
和/或
k)嵌合OX-40的基因序列如SEQ ID NO：30所示；
l)嵌合OX-40的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：30所示的核苷酸杂交的基因序列；
m)嵌合OX-40的基因序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
32.根据权利要求31所述的编码嵌合OX-40蛋白的基因，其特征在于，其中嵌合小鼠OX-
40DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：29。
33.人源化小鼠OX-40的基因组DNA，其特征在于，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与权利要求31-32任意一项所述的基因序列一致或互补。
34.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的用途。
35.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法获得非人类动物或其后代或动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
36.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法获得非人类动物或其后代或动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
37.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法获得非人类动物或其后代或动物模型在体内研究、人OX40信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究OX40基因功能研究、人源OX40抗体、针对人OX40靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。

说明书全文

人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化OX40基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

[0002] 通常，在人疾病的研究中期望使用人的细胞进行实验。特别是，在确认物种特异性的多个药物代谢酶、宿主局限的免疫反应等所参与的疾病的研究中，需要使用人源基因表达的模型。

[0003] 实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠，豚鼠，地鼠(仓鼠)，兔，犬，猴，猪，鱼等。然而，人类和动物的基因和蛋白质序列还是存在不少差异，许多人类蛋白质不能与动物的同源蛋白质结合而产生生物活性，导致许多临床试验的结果也与动物实验的结果不相符。大量的临床研究急需更好的动物模型。

[0004] 随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即，利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变基因体系的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化还可改进和提升细胞人源化小鼠模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。

[0005] 癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012年全球恶性肿瘤发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例为307万，死亡人数220万。近年，针对免疫检查点的抗体药物研发被认为是有望攻克各类癌症的潜在靶点。传统的药物研发中，都是采用体外药效筛选的方式，该筛选方法不能模拟体内环境，例如肿瘤微环境、基质细胞、胞外基质成分以及免疫细胞互动等，造成研发失败率较高。另外，鉴于人和动物的差异，使用常规实验动物进行体内药理药效检测结果，并不能反映真实的疾病状态和靶位点的识别互动，导致许多临床试验的结果与动物实验的结果相去甚远。因此，开发适合人源抗体筛选和评价的人源化动物模型，将可显著提高新药开发效率，并降低研发成本。

[0006] T细胞的活化过程除需要TCR识别MHC-肽复合物作为第一信号外，还必需协同刺激信号对其进行进一步充分活化。OX40是一类T细胞的共刺激因子，它属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一员，为I型跨膜蛋白。在特定的条件下，OX40能够激活细胞内PI3K-AKT信号以及NFAT信号。这些信号对于T细胞的增殖以及存活具有积极的意义。另一方面，OX40也能够调控T细胞的功能与分化方向。

[0007] OX40是迄今为止发现的唯一能建立外周耐受的共刺激分子，可以打破肿瘤的免疫耐受，恢复免疫监视。将OX40作为肿瘤免疫治疗的新靶点已经显示出积极作用，但由于激活性抗体因需结合的表位和状态刚好和相应配体一致，犹如钥匙开锁般匹配，才能激活下游信号通路，所以此类抗体的研发难度很高。目前大多数研究尚处于起步阶段，药物研发也都尚处于临床I期或II期。所以目前急需更深入的研究OX40协同刺激分子，为协同刺激分子在肿瘤免疫及其他免疫性疾病方面提供更有价值的线索。

[0008] WO2007/062245A公开了特异性结合OX40胞外域特定氨基酸序列中特定表位的分离或纯化的抗体。抗体包括结合哺乳动物OX40特定序列的人、人源化和嵌合抗体。抗体还包括具有OX40拮抗活性的那些抗体。抗体进一步包括具有OX40激动活性的那些抗体。

[0009] WO2013/038191A公开了特异性结合人CD134(OX40)的抗体。特异性结合人CD134的胞外结构域，包括人CD134上的非OX40配体(OX40L)结合结构域。抗人CD134抗体可用于癌症治疗。

[0010] 由此可见，OX40抗体在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使治疗失败最小化，本发明在世界范围内首次提供一种建立人源化OX40基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例OX40基因人源化小鼠。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达OX40蛋白，且表达的OX40蛋白能识别并结合抗人OX40抗体，该方法在肿瘤药物筛选方面有着广阔的应用前景。

发明内容

[0011] 发明概述

[0012] 为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物OX40基因的特定片段被人OX40基因特定片段替换，本申请发明人成果得到世界首例OX40基因人源化小鼠。成功制备OX40基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达OX40蛋白，可用于OX40基因功能研究、人源OX40抗体的筛选和评价。

[0013] 利用本发明制备的动物模型可用于针对人OX40靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究OX40蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。

[0014] 同时还得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1抗体动物模型)交配或直接进行基因编辑/修饰得到双人源动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。发明的详细说明[0015] 本发明涉及一种导入人OX-40基因的非人动物或其子代的制备方法，导入人OX-40基因、使得该人OX-40基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的OX-40蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Ox-40基因的表达。

[0016] 本发明涉及一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源OX-40基因，所述方法包括：

[0017] (a)构建含有人OX-40基因的载体，通过基因工程方法将所述人OX-40基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Ox-40基因缺失或使得内源/动物来源的Ox-40基因不具有功能；并且

[0018] (b)在所述非人动物体内表达人源OX-40基因。

[0019] 本发明涉及一种制备基因修饰/改造的非人动物的方法，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的OX-40基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含内源/动物来源的Ox-40基因座，用人OX-40胞外域编码序列取代内源/动物来源的Ox-40胞外域编码序列的部分或全部。

[0020] 本发明涉及一种人源化动物模型构建的方法，所述动物模型基因组中包括OX-40基因，OX-40基因的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中OX-40基因的胞内参与信号传导的部分为动物来源，OX-40基因的胞外区域包含人OX-40基因的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Ox-40启动子后；优选的，OX-40基因的跨膜区为动物来源。

[0021] 本发明还涉及一种人源化动物模型构建的方法，其中，动物来源的OX-40包括动物来源Ox-40基因的第1号外显子的部分序列、第5号外显子的部分序列、第6号外显子、第7号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或人OX-40基因部分为编码人类OX-40多肽的氨基酸的第1号外显子的部分或全部序列、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子的部分或全部序列。

[0022] 在本发明的一个实施例中涉及一种人源化动物模型构建的方法，其中，动物来源的OX-40基因为啮齿类动物来源的Ox-40基因；优选的，所述啮齿类动物为小鼠；更优选的，所述小鼠Ox-40的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：25中的全部或部分片段所示。

[0023] 在本发明的一个实施例中，小鼠Ox-40的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：26中的全部或部分片段所示。

[0024] 在本发明的另一个实施例中，人OX-40基因的全部或部分片段的人OX-40mRNA序列如SEQ ID NO：27中的全部或部分片段所示。

[0025] 优选的，所述人OX-40全部或部分片段的蛋白序列如SEQ ID NO：28中的全部或部分片段所示。

[0026] 本发明所述的方法，其中，动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括小鼠来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，所述嵌合OX-40基因mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。

[0027] 在本发明中，所述动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括动物来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，所述嵌合OX-40基因的嵌合mRNA序列如SEQ ID NO：31的全部或部分所示。

[0028] 在本发明的一个实施例中，所述动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括动物来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，编码所述嵌合OX-40基因的蛋白序列与SEQ ID NO：32所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。

[0029] 优选的，所述动物模型基因组中包括嵌合OX-40基因，所述嵌合OX-40基因包括动物来源的Ox-40基因部分和人源的OX-40基因部分，所述嵌合OX-40基因的蛋白序列如SEQ ID NO：32的部分或全部所示。

[0030] 本发明还涉及一种人源化动物模型构建的方法，将动物来源的Ox-40的第1-5号外显子全部或部分序列替换为人源OX-40的第1-5号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-15任一项所示；其中，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：11。

[0031] 本发明还涉及一种Ox-40敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Ox-40的第1-5号外显子全部或部分敲除，使得内源Ox-40蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-15任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：11。

[0032] 本发明还涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：

[0033] (1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-15所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

[0034] 优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：23所示，其中SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19为A组，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23为B组；

[0035] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：24所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

[0036] (3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNA载体的双链；

[0037] (4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

[0038] 本发明还涉及一种Ox-40基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：

[0039] 第一步：按照上述所述的步骤1-4，获得sgRNA载体；

[0040] 第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；

[0041] 第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Ox-40基因被敲除，获得Ox-40基因敲除阳性小鼠；

[0042] 第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Ox-40-/-小鼠；

[0043] 优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：42-45所示。

[0044] 本发明涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)，其选自Ox40基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)，其选自Ox40基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。

[0045] 优选的，所述的靶向载体，其中，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)选自与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3待端同源的第二个DNA片段(3’臂)选自NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸。

[0046] 优选的，所述的靶向载体，其中，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)选自NCBI登录号为NC_000070.6的第156012720-156013963位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)选自NCBI登录号为NC_000070.6的第156016032-
156017196位核苷酸。

[0047] 优选的，所述的靶向载体，其中，a)与c)中选择的基因组核苷酸的长度为1.2kb。

[0048] 优选的，所述5’臂长度为1244bp；

[0049] 更优选的，3’臂长度为1165bp；

[0050] 优选的，所述的靶向载体，所述的待改变的转换区分别位于OX40基因第1外显子和第5外显子。

[0051] 优选的，所述的靶向载体，其中5’臂序列如SEQ ID NO：33所示。

[0052] 优选的，所述的靶向载体，其中3’臂序列如SEQ ID NO：39所示。

[0053] 优选的，所述的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。

[0054] 优选的，所述的靶向载体，其中期望的转换区来自人。

[0055] 优选的，所述的靶向载体，其中期望的转换区为人源OX40的核苷酸序列部分或全部，优选的所述核苷酸序列包括人源OX40 DNA序列的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子和第七外显子中的一个或多个。

[0056] 优选的，所述的靶向载体，其中所述人源OX40的核苷酸序列编码NCBI登录号NP_003318.1所示人源OX40蛋白的部分或全部序列。

[0057] 优选的，所述的靶向载体，其中期望的转换区序列如SEQ ID NO：36所示。

[0058] 本发明进一步涉及一种包含上述所述靶向载体的细胞。

[0059] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向OX40基因，同时所述sgRNA在待改变的OX40基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CNN-N(20)-3’的序列的排列规则；优选的，所述sgRNA在小鼠Ox40基因的靶位点分别位于小鼠Ox40基因的第1外显子和第5外显子上。

[0060] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：16所示，下游序列如SEQ ID NO：18所示，所述sgRNA序列识别5’端靶位点。

[0061] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：17所示，其由在SEQ ID NO：16的5’端加上TAGG得到，下游序列如SEQ ID NO：19所示，其由在SEQ ID NO：18的5’端加上AAAC得到，所述sgRNA序列识别5’端靶位点。

[0062] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：20所示，下游序列如SEQ ID NO：22所示，所述sgRNA序列识别3’端靶位点。

[0063] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：21所示，其由在SEQ ID NO：20的5’端加上TAGG得到，下游序列如SEQ ID NO：23所示，其由在SEQ ID NO：22的5’端加上AAAC得到，所述sgRNA序列识别3’端靶位点。

[0064] 本发明进一步涉及一种包含上述的sgRNA序列的构建体。

[0065] 本发明进一步涉及一种包含上述构建体的细胞。

[0066] 本发明还涉及一种Ox-40基因缺失细胞株，使用本发明中能够特异的靶向OX-40基因的sgRNA敲除第1-5外显子的部分或全部制备获得。

[0067] 本发明还涉及一种OX-40基因人源化细胞株，使用本发明中能够特异的靶向OX-40基因的sgRNA、以及所述的载体通过对第1-5号外显子的部分或全部进行替换制备获得。

[0068] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物细胞，其包括上述任一项的靶向载体以及一种或多种上述的sgRNA构建体的体外转录产物。

[0069] 本发明进一步涉及所述的细胞，该包括Cas9 mRNA或其体外转录产物。

[0070] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞中的基因是杂合的。

[0071] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞中的基因是纯合的。

[0072] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述非人类哺乳动物细胞是小鼠细胞。

[0073] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞为受精卵细胞。

[0074] 本发明进一步涉及一种建立OX40基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：

[0075] (a)提供根据前述任一项所述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；

[0076] (b)将所述细胞在培养液中进行培养；

[0077] (c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；

[0078] (d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。

[0079] 本发明进一步涉及所述的方法，其特征为使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行OX40基因人源化动物模型的建立。

[0080] 本发明进一步涉及所述的方法，为非人类哺乳动物是小鼠。

[0081] 本发明进一步涉及所述的方法，所述小鼠为C57BL/6小鼠。

[0082] 本发明进一步涉及所述的方法，步骤c中的非人类哺乳动物为假孕雌性。

[0083] 本发明进一步涉及一种建立双人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：

[0084] (a)利用前述的一种建立OX40基因人源化动物模型的方法获得OX40基因基因改造人源化小鼠；

[0085] (b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。

[0086] 本发明进一步涉及一种方法，步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与PD-1人源化小鼠交配得到OX40和PD-1双人源化小鼠模型。

[0087] 本发明还涉及一种制备多基因人源化动物模型的方法，

[0088] (a)利用本发明所述方法获得动物模型；

[0089] (b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。

[0090] 优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。

[0091] 本发明进一步涉及上述方法产生的非人类哺乳动物。

[0092] 本发明进一步涉及非人类哺乳动物，其基因组中含有人源基因。

[0093] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，其中非人类哺乳动物是啮齿动物。

[0094] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，其中非人类哺乳动物是小鼠。

[0095] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物表达人源化OX40基因编码的蛋白质。

[0096] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物的后代。

[0097] 本发明进一步涉及一种非人类动物在制备荷瘤动物模型中的用途，其通过包括本发明所述的方法制备获得。

[0098] 优选的，所述非人类动物是啮齿动物。

[0099] 进一步优选的，所述啮齿动物是小鼠。

[0100] 本发明进一步涉及一种来源于前述的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物的细胞或细胞系或原代细胞培养物。

[0101] 本发明进一步涉及一种来源于根据前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物的组织或器官或其培养物。

[0102] 本发明进一步涉及一种来源于前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物荷瘤后的瘤组织。

[0103] 本发明还涉及一种嵌合OX-40蛋白，选自下列组中的一种：

[0104] a)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：27所示的序列的部分或全部所示；b)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：27所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或至少99％；c)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列杂交；d)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：
27所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；e)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40蛋白的mRNA序列具有与SEQ ID NO：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或f)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列如SEQ ID NO：28部分或全部序列所示；g)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：28所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或至少99％；h)嵌合OX-40蛋白序列中编码人OX-40的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：28所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；i)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：28所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；g)嵌合OX-40蛋白序列中人OX-40的蛋白序列具有SEQ ID NO：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；或k)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列为SEQ ID NO：30所示的序列的部分或全部；

[0105] l)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；m)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列在严格条件下，与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列杂交；n)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；p)嵌合OX-40蛋白的核苷酸编码序列具有SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或q)嵌合OX-40的mRNA序列为SEQ ID NO：31所示的序列的部分或全部；r)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
s)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列杂交；t)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；u)嵌合OX-40的mRNA序列具有与SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或

[0106] v)嵌合OX-40的蛋白序列为SEQ ID NO：32的部分或全部；w)嵌合OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：32所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；x)编码嵌合OX-40蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：32所示的蛋白的核苷酸序列杂交；y)嵌合OX-40的蛋白序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；z)嵌合OX-40的蛋白序列具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；或A1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO：
29所示的序列的部分或全部；B1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列杂交；

[0107] D1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

[0108] E1)嵌合OX-40蛋白中编码嵌合OX-40蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO:29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

[0109] 同时，编码嵌合OX-40蛋白的基因，其中所述基因序列选自：

[0110] a)所述基因编码本发明所述嵌合小鼠OX-40的蛋白序列；b)嵌合OX-40的mRNA序列如SEQ ID NO：31所示；c)嵌合OX-40的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：31所示的核苷酸杂交的基因序列；d)嵌合OX-40的mRNA序列与SEQ ID NO：31所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
和/或e)编码嵌合OX-40的蛋白的基因序列，所述蛋白与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；f)编码嵌合OX-40的蛋白的基因序列，所述蛋白的序列与SEQ ID NO：32的差异不超过10、9、8、7、6、
5、4、3、2或1个氨基酸残基；和/或g)编码嵌合OX-40的蛋白的基因序列，所述蛋白具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。和/或h)嵌合OX-40的基因序列如SEQ ID NO：29所示；i)嵌合OX-40的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；j)嵌合OX-40的基因序列与SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；和/或k)嵌合OX-40的基因序列如SEQ ID NO：30所示；l)嵌合OX-40的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：30所示的核苷酸杂交的基因序列；m)嵌合OX-40的基因序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；

[0111] 本发明还涉及一种编码嵌合OX-40蛋白的基因，其中嵌合小鼠OX-40DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：29。

[0112] 本发明还涉及人源化小鼠OX-40的基因组DNA。

[0113] 本发明还涉及一种表达人源化小鼠OX-40嵌合蛋白的构建体。

[0114] 本发明还涉及一种包含所述构建体的细胞。

[0115] 本发明还涉及一种包含所述细胞的组织。

[0116] 以及能够特异的靶向OX-40基因的sgRNA序列在替换或敲除OX-40基因中的应用。

[0117] 本发明进一步涉及一段人源化小鼠OX40氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自：a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示；b)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性程度；c)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：32所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或至少99％；e)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；和/或f)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

[0118] 本发明进一步涉及一段人源化小鼠OX40的DNA序列，其中所述DNA序列选自：a)所述DNA编码本发明所述人源化小鼠OX40氨基酸序列；b)所述DNA序列如SEQ ID NO：36所示；c)所述DNA的CDS编码序列如SEQ ID NO：30所示；d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：30所示的核苷酸杂交的DNA序列；e)与序列32所示的核苷酸具有至少90％同一性程度的DNA序列；f)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸与SEQ ID NO：32所示的氨基酸具有至少90％的同一性程度；g)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸的SEQ ID NO：32所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸的序列与SEQ ID NO：32的差异不超过10、9、8、7、6、5、
4、3、2或1个氨基酸；和/或i)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；优选的，SEQ ID NO：36所示序列为人源化小鼠OX40DNA的非模板链，又被称为编码链或有义链。

[0119] 本发明进一步涉及一段人源化小鼠OX40的基因组DNA序列，其转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与所述的DNA序列一致或互补。

[0120] 本发明还涉及所述方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的用途。

[0121] 本发明还涉及所述获得非人动物或其后代在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。

[0122] 本发明还涉及所述的方法获得非人动物或其后代在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。

[0123] 本发明还涉及所述的方法获得非人动物或其后代在体内研究、人OX40信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究OX40基因功能研究、人源OX40抗体、针对人OX40靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。

[0124] 优选的用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括但不限于FVB/N受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。

[0125] 受精卵可以来源于任何非人类动物。优选受精卵细胞来源于啮齿类。可以通过DNA的微注射来向受精卵引入遗传构建体。例如，可以通过微注射后培养受精卵、将培养的受精卵转移到假孕的非人类动物中并生育非人类哺乳动物来产生上文所述方法的非人类哺乳动物。

[0126] 这里使用的术语“基因改造”描述人工引入并整合进生物的DNA产生的特定基因的蛋白质。

[0127] 这里使用的术语“基因改造动物”描述基因组中含有外源DNA的动物。此基因改造DNA可能整合在基因组的某处。

[0128] 本发明还提供由以上描述的任何方法所产生的非人类哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，提供非人类哺乳动物，所述基因改造动物基因组中含有编码人源OX40的DNA。

[0129] 在一个优选的实施方案中，非人类哺乳动物含有如图2所描述的遗传构建体。在另一实施方案中，提供表达基因改造人源OX40的非人类哺乳动物。在一个优选的实施方案中，组织特异性表达人源OX40蛋白。

[0130] 在另一实施方案中，基因改造动物中的人源OX40的表达是可控的，如通过加入特异的诱导物或阻遏物物质。

[0131] 非人类哺乳动物可以是任何本领域已知的、可以用于本发明方法的非人类动物。优选的非人类哺乳动物是哺乳动物，更优选的非人类哺乳动物是啮齿动物。本发明最优选的动物是小鼠。

[0132] 可以对上文描述的非人类哺乳动物进行遗传、分子和行为分析。本发明也涉及本发明提供的非人类哺乳动物与相同或其它基因型交配后产生的后代。

[0133] 本发明还提供来源于本发明提供的非人类哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。可以通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可以从非人类哺乳动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。可以通过多种方法检测含有编码人源OX40蛋白的DNA序列的遗传构建体的整合。对于本领域技术人员而言，显然存在许多可以用来检测外源DNA表达的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Southern印迹、原位杂交的mRNA定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量目的基因的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护、Southern印迹分析、RNA斑点(RNAdot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色、细胞流式检测和Western印迹分析来评估是否存在人源OX40蛋白质。

[0134] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress：1989)；DNACloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；
Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；
ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986) ；B .Perbal，
APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″ols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.18，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker ，eds .，AcademicPress，London ，1987) ；
HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，
1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。

[0135] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明

[0136] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

[0137] 图1：(A)5’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA1-sgRNA7)；(B)3’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA9-sgRNA16)，其中blank为空白，Con为阴性对照，PC为阳性对照；

[0138] 图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；

[0139] 图3：鼠Ox40与人OX40对比示意图；

[0140] 图4：人源化小鼠OX40基因示意图；

[0141] 图5：打靶策略示意图；

[0142] 图6：pClon-4G-OX40质粒酶切结果图，其中图6A为使用EcoRI+ScaI的酶切结果，图6B为使用HindIII+BglII的酶切结果，图中con代表阳性对照，M为Marker，编号1、3、8的质粒酶切结果符合预期；

[0143] 图7：鼠尾PCR鉴定结果，其中图7A为5’端引物的鉴定结果，图7B为3’端引物的鉴定结果，WT为野生型，+为阳性对照，编号为1、3、5、6、7为阳性小鼠；

[0144] 图8：F1代小鼠Southem blot结果，其中Marker为标记，WT为野生型，编号为6、7的小鼠无随机插入；

[0145] 图9：流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠和OX40人源化小鼠，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用抗鼠(图B、C)和抗人(图D、E)OX40荧光抗体进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析可见：与对照组相比，可在OX40人源化F1杂合鼠脾脏内，检测到表达人OX40蛋白的细胞；而在C57BL/6小鼠的脾脏内，未检测到表达人OX40蛋白的细胞；

[0146] 图10：流式分析结果，其中，取2只野生型C57BL/6小鼠和1只B-hOX40纯合子，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用抗鼠Ox40抗体mOx40APC(图a、b、c)和抗人OX40抗体hOX40 PE(图d、e、f)，进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析可见：与对照组(图a、d)相比，可在B-hOX40纯合子小鼠脾脏内检测到表达人OX40蛋白的细胞(图f)；而在C57BL/6小鼠的脾脏内，未检测到表达人OX40蛋白的细胞(图d、e)；

[0147] 图11：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为B-hOX40纯合子小鼠；GAPDH为内参对照；

[0148] 图12：实验动物体重，将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hOX40小鼠体内，并利用抗人OX40抗体(OX40 agonist full humanAb)进行抗肿瘤药效试验，G1溶剂对照组和G2抗人OX40抗体治疗组的实验动物平均体重增长无明显差异；

[0149] 图13：实验动物荷瘤体积，将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hOX40小鼠体内，并利用抗人OX40抗体(OX40agonist full humanAb)进行抗肿瘤药效试验，G2治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组，且具有显著差异；

[0150] 图14：实验动物体重，将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hOX40小鼠体内，并利用抗人OX40抗体AB-a或AB-b进行抗肿瘤药效试验，对照组G1和治疗组G2、G3的实验动物平均体重增长无显著差异；

[0151] 图15：实验动物荷瘤体积，将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hOX40小鼠体内，并利用抗人OX40抗体AB-a或Ab-b进行抗肿瘤药效试验，G2、G3治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组，且具有明显差异，表明抗人OX40抗体AB-a和Ab-b均具有一定的抗肿瘤能力；而使用AB-a抗体治疗(G2)的小鼠肿瘤体积明显大于Ab-b治疗组(G3)，表明在相同的给药剂量和频次下，抗人OX40抗体AB-a抗体药效不如AB-b抗体；

[0152] 图16：鼠尾PCR鉴定结果，其中，+为B-hOX40小鼠杂合子，-为野生型(图A、B)；-/-为PD-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为PD-1基因人源化小鼠杂合子，WT为野生型(图C、D)；图A、B的结果表明编号为174-189的小鼠为OX40基因纯合子、图C、D的结果表明编号为174-189的小鼠为PD-1纯合子，综合两组结果表明，编号为174-189的16只小鼠为双基因纯合子；

[0153] 图17：流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠和双重人源化OX40/PD-1纯合子，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用鼠源OX40抗体mOX40 APC(图A、B、C)或人源OX40抗体hOX40 PE(图D、E、F)和鼠源T细胞表面抗体mTcR抗对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，可在双重人源化OX40/PD-1纯合子的杂合鼠脾脏内，表达人OX40蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人OX40蛋白的细胞；

[0154] 图18：流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠和双重人源化OX40/PD-1纯合子，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用鼠源PD-1抗体mPD-1 PE(图A、B、C)或人源PD-1抗体hPD-1 FITC(图D、E、F)和鼠源T细胞表面抗体mTcR抗对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，可在双重人源化OX40/PD-1纯合子的杂合鼠脾脏内，表达人PD-1蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达PD-1蛋白的细胞；

[0155] 图19：Ox40基因敲除小鼠PCR鉴定结果，其中M为Marker，WT为野生型，编号为1-10的小鼠为Ox40基因敲除小鼠；

[0156] 图20：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。

具体实施方式

[0157] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0158] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

[0159] Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

[0160] 大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；

[0161] EcoRI，ScaI，HindIII，BglII，BamHI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3122M，R3104M R0144M，R3136M；

[0162] 卡那霉素购自Amresco，货号为0408；

[0163] Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

[0164] AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；

[0165] UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；

[0166] C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

[0167] 逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；

[0168] 小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；

[0169] 鼠CD3抗体来源BD，货号为563123；

[0170] mTcRβPerCP来源Biolegend，货号为109228；

[0171] mPD-1_PE来源Biolegend，货号为109104；

[0172] mOx40 APC来源Biolegend，货号为119414；

[0173] hOX40 PE来源Biolegend，货号为350004；

[0174] hPD-1 FITC来源Biolegend，货号为329904。

[0175] 实施例1 pT7-OX-6、pT7-OX-12的构建

[0176] 靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。

[0177] 以小鼠为例，设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA9-sgRNA16)的向导RNA序列。根据Ox40基因的功能和序列特征，5’端靶位点和3’端靶位点分别位于小鼠Ox40基因的第二外显子和第五外显子上，各sgRNA在Ox40上的靶位点序列如下：

[0178] sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5'-GTTAAACATACCTACCCCAGTGG-3’[0179] sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5'-CGACAGCACTTGTGACCACTGGG-3’[0180] sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5'-TCAAAGCCAGGCTACTCACCTGG-3’[0181] sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5'-TGCTGTCGTGAGTGCCAGCCAGG-3’[0182] sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5'-TGCCAGCCAGGTGAGTAGCCTGG-3’[0183] sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5'-AGCCAGGCTACTCACCTGGCTGG-3’[0184] sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5'-GCACTTGTGACCACTGGGGTAGG-3’[0185] sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5'-TTGGCCTGAATGTAGGGCGCTGG-3’[0186] sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5'-AGACCCAGCGCCCTACATTCAGG-3’[0187] sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5'-ACAGTGGTTGGCCTGAATGTAGG-3’[0188] sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5'-GACTGTGGTGGATTGGACAGTGG-3’[0189] sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5'-CTGTCCAATCCACCACAGTCTGG-3’[0190] sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5'-TGGGCCAGACTGTGGTGGATTGG-3’[0191] sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5'-AATCCACCACAGTCTGGCCCAGG-3’[0192] sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5'-GAGGGCAACTCAGAAGTCCTGGG-3’[0193] 利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1。从中优先选择2个(分别是sgRNA-1和sgRNA-12)进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸，退火后以酶切连接(BbsI)的方式，将其分别连接至pT7-sgRNA质粒，获得表达载体pT7-OX-1和pT7-OX-12。

[0194] 表1 sgRNA-1和sgRNA-12对应的上、下游序列列表

[0195]

[0196] 连接反应为：

[0197] 表2 连接反应体系

[0198]双链片段 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA载体 1μL(10 ng)
T4 DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H2O 补至10μL

[0199] 反应条件：室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。

[0200] 随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-OX-1和pT7-OX-12进行后续实验。

[0201] pT7-sgRNA质粒来源：pT7-sgRNA载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源Takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

[0202] 含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：24)：

[0203]gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc

[0204] 实施例2载体pClon-4G-OX40的构建

[0205] 将小鼠Ox40基因(Gene ID：22163)第1号外显子至第5号外显子的主要部分(基于NCBI登录号为NM_011659.2→NP_035789.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：25所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：26所示)用人OX40基因(Gene ID：7293)相应片段替换(基于NCBI登录号为NM_003327.3→NP_003318.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：27所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：28所示)，其中，鼠Ox40与人OX40对比示意图见图3，最终得到的改造后的人源化小鼠OX40基因示意图见图4，人源化小鼠OX40基因DNA序列(嵌合OX40基因DNA)如SEQ ID NO：29所示：

[0206]TGTTAAACATacatatcctagcaacgaccggtgctgccacgagtgcaggccaggtgaggcctcaggaggggtcgccacgcacgggcactccagggactgggggctggggcagggatgggccagccaggaggctggtcctggggagggggcgggtgaggggccggccaagcctggcagaggagccgcctgggggggtccacgggcgcaagcctggggcctgaccgctgcctgacgccggcctctgctgcaggcaacgggatggtgagccgctgcagccgctcccagaacacggtgtgccgtccgtgcgggccgggcttctacaacgacgtggtcagctccaagccgtgcaagccctgcacgtggtgtaacctcagtgagctcccacctggccccacagccccacccagcacagggggcggcagcctggcacccacattcccacgcagcagcatggggctcccacagccgcagaaacgaacctcaaaccacagcggggtctgctccgccacaggggtccttcgaggagctgaggcgtctcccaggggcaccccctctccctccgggggcccagactcggcccaggccacgtggagtcggggagaccacgctggccatgtggcctggccttgctggcctgagcagtgaggctggggggttgggccatggagaccctgccgcaggcggggctggcggctggaggcggtggaggggtagggaagggtggctggggctgccacggaaccagccccaggttgtggccaggaagggagggcccaggagcctcgggggctgcaggggctccaagtctcaggggaggccgcagacccctgcccacggccctctgtgtggtggggaggccaacctgtcctccagtgcccacgcttcctgaggaccctgtccacagcccccacctgaccacccccccatccggcccctgctcaggaagtgggagtgagcggaagcagctgtgcacggccacacaggacacagtctgccgctgccgggcgggcacccagcccctggacagctacaagcctggagttggtgagctcggtggctgcggccggcggttgggggtgtgcatagcggctgtctgtgacgcagatgggccgtgggccgcagggacctggccccaccggtgcctcctctggcatcctcaagaccgagctcccgggtcagggcccacgggtgggatgtgggcagggagggcttccagaggccaaacccaccacccagccatggggggcaagtgcctgccccacaggctctgccccatgtccccagcacccggggcctgtgggcagcccctgaccaccctatctttgttgcagactgtgccccctgccctccagggcacttctccccaggcgacaaccaggcctgcaagccctggaccaagtgaggggcctggccaggggctgggaggggctgggggggggttggggtggttaggagggcggaggagctggggagctgggaggggctgggggggcaggtggggtgggggcagttttgggggaaggggaggtgctggtggccctgggggcctggctatgtggctggacctggttggggagcaggaagctgctgcctgggggcagcctttccctgtgggtggagctgggtgtgtgggaccctcaccctccgcagctgggaggccctgggggcacaggacagggaggtgctggtggggggtgtagatgtgggagaagggtgtgtggccttggaggcccctgtggggggcacgtggggctgggcagcgtccttggctgtcactggcctggtgtctgtggtagatgctgcctgtggctggccagcgtggaccctgttatccccaccgcatctcccgggtcccagggggtttctggcctgagcaacacctcctgttccccaacagctgcaccttggctgggaagcacaccctgcagccggccagcaatagctcggacgcaatctgtgaggacagggaccccccagccacgcagccccaggagacccagggccccccggccaggcccatcactgtccagcccactgaagcctggcccagaACTTCTGAGTTGCC

[0207] SEQ ID NO：29仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人源OX40基因序列片段。

[0208] 改造后的人源化小鼠OX40的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示。

[0209] SEQ ID NO：30为改造后的人源化小鼠OX40的CDS区，其中斜体下划线区域为人源OX40基因序列片段。

[0210]atgtatgtgtgggttcagcagcccacagcccttctgctgctgggactcacacttggagttacagcaaggcggctcaactgtgttaaacatacatatcctagcaacgaccggtgctgccacgagtgcaggccaggcaacgggatggtgagccgctgcagccgctcccagaacacggtgtgccgtccgtgcgggccgggcttctacaacgacgtggtcagctccaagccgtgcaagccctgcacgtggtgtaacctcagaagtgggagtgagcggaagcagctgtgcacggccacacaggacacagtctgccgctgccgggcgggcacccagcccctggacagctacaagcctggagttgactgtgccccctgccctccagggcacttctccccaggcgacaaccaggcctgcaagccctggaccaactgcaccttggctgggaagcacaccctgcagccggccagcaatagctcggacgcaatctgtgaggacagggaccccccagccacgcagccccaggagacccagggccccccggccaggcccatcactgtccagcccactgaagcctggcccagaacttctgagttgccctctccacccaccttggtgactcctgagggccctgcatttgctgttctcctaggcctgggcctgggcctgctggctcccttgactgtcctgctggccttgtacctgctccggaaggcttggagattgcctaacactcccaaaccttgttggggaaacagcttcaggaccccgatccaggaggaacacacagacgcacactttactctggccaagatctga

[0211] SEQ ID NO：31改造后的人源化小鼠OX40的mRNA序列，其中斜体下划线区域为人源OX40基因序列片段。

[0212]ccaaagcacttcttagcttatcatgggactctgcatacgcctgtgccaaatacacaggaacacgttcacataccttcttgcctgtccgcctactcttcttgccccacctccatagttcttatagccacaccctgcaaggaaaaaccccagactcctgtgaaggcagaaagcagacaaggatgtatgtgtgggttcagcagcccacagcccttctgctgctgggactcacacttggagttacagcaaggcggctcaactgtgttaaacatacatatcctagcaacgaccggtgctgccacgagtgcaggccaggcaacgggatggtgagccgctgcagccgctcccagaacacggtgtgccgtccgtgcgggccgggcttctacaacgacgtggtcagctccaagccgtgcaagccctgcacgtggtgtaacctcagaagtgggagtgagcggaagcagctgtgcacggccacacaggacacagtctgccgctgccgggcgggcacccagcccctggacagctacaagcctggagttgactgtgccccctgccctccagggcacttctccccaggcgacaaccaggcctgcaagccctggaccaactgcaccttggctgggaagcacaccctgcagccggccagcaatagctcggacgcaatctgtgaggacagggaccccccagccacgcagccccaggagacccagggccccccggccaggcccatcactgtccagcccactgaagcctggcccagaacttctgagttgccctctccacccaccttggtgactcctgagggccctgcatttgctgttctcctaggcctgggcctgggcctgctggctcccttgactgtcctgctggccttgtacctgctccggaaggcttggagattgcctaacactcccaaaccttgttggggaaacagcttcaggaccccgatccaggaggaacacacagacgcacactttactctggccaagatctgagcattactacaggagtggattttatggggcacggacaacccatatcctgatgcctgccagtaccctccacaccgttctaggtgctgggctggctctgggctttcctatgtatgctatgcatactacctgcctggtggtgctcctaataaacatgcta[0213] SEQ ID NO：32为改造后的人源化小鼠OX40编码的蛋白序列，

[0214] Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu LeuAla Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile

[0215] 发明人进一步设计了图5所示的打靶策略和包含5’同源臂、人OX40基因片段、3’同源臂的载体。过程如下：

[0216] 1、设计5’端同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：

[0217] 5’端同源臂(如SEQ ID NO：33所示)，为NC_000070.6的第156012720-156013963位核苷酸。

[0218] 上游引物(SEQ ID NO：34)：

[0219] F：

[0220] 5’-TTTAAGAAGGAGATATACATGAATGTGTAGTAAAGGCACTGCCCCC-3’

[0221] 下游引物(SEQ ID NO：35)：

[0222] R：

[0223] 5’-GTTGCTAGGATATGTATGTTTAACACAGTTGAGCCGCCTTGC-3’

[0224] 2、设计期望的转换区的引物及相关序列，具体为：

[0225] 人DNA片段(如SEQ ID NO：36所示)，与NCBI登录号为NC_000001.11的第1211985-1214025位核苷酸序列相比，有以下一些位置的序列不同：3C→A，6C→T，9C→T。

[0226] 上游引物(SEQ ID NO：37)：

[0227] F：5’-GTGTTAAACATACATATCCTAGCAACGACCGGTGCTGCCA-3’

[0228] 下游引物(SEQ ID NO：38)：

[0229] R：5’-CTCAGAAGTTCTGGGCCAGGCTTCAGTGGGCTGGACAGTGA-3’

[0230] 3、设计同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：3’同源臂(如SEQ ID NO：39所示)，为NC 000070.6的第156016032-156017196位核苷酸。。

[0231] 上游引物(SEQ ID NO：40)：

[0232] F：5’-CCACTGAAGCCTGGCCCAGAACTTCTGAGTTGCCCTCTCCACCCAC-3’下游引物(SEQ ID NO：41)：

[0233] R：5’-GTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGACCTCGGTACTTAGGCTCTGC-3’

[0234] 以C57BL/6小鼠DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段(SEQ ID NO：33)和3’端同源臂片段(SEQ ID NO：39)，以人DNA为模板PCR扩增获得人DNA片段(SEQ ID NO：36)，通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-
4G-OX40。

[0235] 实施例3载体pClon-4G-OX40的验证

[0236] 随机挑选10个pClon-4G-OX40克隆，使用2组酶进行酶切验证，其中，EcoRI+ScaI应出现4657bp+3296bp，HindIII+BglII应出现4223bp+3116bp+614bp，酶切结果参见图6，表明质粒编号1、3、8的质粒酶切验证正确结果符合预期。编号1和3的质粒经测序公司测序验证正确，选择质粒3进行后续实验。

[0237] 实施例4显微注射及胚胎移植

[0238] 取小鼠的原核期受精卵，如C57BL/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的Cas9mRNA、pClon-4G-OX40质粒和pT7-OX-1、pT7-OX-12质粒的体外转录产物，使用体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录，注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。将得到的免疫节点人源化小鼠命名为B-hOX-40。

[0239] 实施例5基因改造人源化小鼠的鉴定

[0240] 1、基因型鉴定

[0241] 对得到的小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置PCR-1位于5’同源臂左侧，PCR-4位于3’同源臂右侧，PCR-2和PCR-3均位于人源化片段上，

[0242] 具体序列如下：

[0243] 5’端引物：

[0244] PCR-1(SEQ ID NO：42)：5’-ATTTCCAGCCCCAGTCCTATTCCCT-3’；

[0245] PCR-2(SEQ ID NO：43)：5’-CTCGGTCTTGAGGATGCCAGAGGAG-3’

[0246] 3’端引物：

[0247] PCR-3(SEQ ID NO：44)：5’-CTCAGGAGGGGTCGCCACG-3’；

[0248] PCR-4(SEQ ID NO：45)：5’-CTCACCATTCATGTGGCTGGAGAGAAA-3’

[0249] 如果重组载体插入正确，则5’端和3’端应各有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为2604bp，3’端引物产物长度应为3251bp。PCR反应体系及条件见表3、4。

[0250] 表3 PCR反应体系(20μL体系)

[0251]10×缓冲液 2μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
H2O 补充到20μL

[0252] 表4 PCR扩增反应条件

[0253]

[0254]

[0255] 8只小鼠中共有5只经鉴定为阳性小鼠，具体编号为1、3、5、6、7。小鼠的PCR鉴定结果见图7。

[0256] 进一步的，应用Southern blot方法对PCR确认为阳性的5只小鼠进行验证。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BamHI、NcoI酶消化基因组、转膜和杂交。探针P1、P2分别位于5’同源臂外侧及人源化片段上。探针合成引物如下：

[0257] P1-F(SEQ ID NO：46)：5’-tcttccctgcagtttttaggggcag-3’

[0258] P1-R(SEQ ID NO：47)：5’-agtccccagtcctctcatggaaaca-3’

[0259] P2-F(SEQ ID NO：48)：5’-gtgagcgagtttactcagttggcct-3’

[0260] P2-R(SEQ ID NO：49)：5’-ctagtgccagtcacagactcacagc-3’

[0261] 野生型C56BL/6小鼠经P1、P2探针杂交分别产生12.2kb和8.2kb的条带，制备成功的基因工程纯合子小鼠则分别产生18.1kb和7.2kb大小的条带，杂合子小鼠分别产生12.2kb+18.1kb和8.2kb+7.2kb大小的条带，不会有其它杂交条带产生。

[0262] 实验结果显示杂交条带大小均与预期相符，证实有2只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入，编号分别为6、7。Southern blot检测结果见图8。

[0263] 这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hOX40人源化基因工程小鼠。

[0264] 2、蛋白表达鉴定

[0265] 选取1只上述经PCR鉴定为人源化的杂合子小鼠，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射15μg鼠CD3抗体，24h后再腹腔注射15μg鼠CD3抗体。第39h时取脾脏，用注射器尾部对脾脏进行研磨，过70μm脾脏细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次。用鼠源CD3抗体先对胞外蛋白进行染色，之后利用人源OX40抗体对胞外蛋白进行染色，PBS清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果(见图9)显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，可用荧光标记的抗人OX40抗体检测到人源化小鼠脾脏内表达人OX40蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人OX40蛋白的细胞。表明本方法制备得到的OX40基因改造人源化小鼠可以表达人OX40蛋白，并被抗人抗体识别。该模型小鼠可用于抗人OX40抗体的筛选和检测。

[0266] 将基因型鉴定为阳性的杂合子小鼠互相交配，可得到B-hOX40人源化基因工程小鼠纯合子。选取1只B-hOX40纯合子小鼠(4-6周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。

[0267] FACS检测：用鼠源Ox40抗体mOx40APC和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ及人源OX40抗体hOX40PE和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图10显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，鼠源Ox40抗体可以检测到C57BL/6小鼠活化脾脏细胞内表达鼠Ox40蛋白的细胞(图10b)；而在B-hOX40纯合子的脾脏内未检测到表达鼠Ox40蛋白的细胞(图10c)，人源OX40抗体可以检测到B-hOX40纯合子脾脏内表达人OX40蛋白的细胞(图10f)；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人OX40蛋白的细胞(图10e)。

[0268] RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和B-hOX40纯合子脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA；

[0269] 利用引物：

[0270] mOX40RT-PCR F4：5’-GTCATCCGTGTGAGACTGGC-3’(SEQ ID NO：50)

[0271] mOX40 RT-PCR R4：5’-CCAGACTGTGGTGGATTGGA-3’(SEQ ID NO：51)

[0272] 扩增大小为401bp的鼠Ox40片段；

[0273] 利用引物

[0274] hOX40 RT-PCR F1：5’-GCCCTGCACGTGGTGTAACC-3’(SEQ ID NO：52)

[0275] hOX40 RT-PCR R1：5’-ACAGTGATGGGCCTGGCCGG-3’(SEQ ID NO：53)

[0276] 扩增大小为321bp的人OX40片段。

[0277] PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。

[0278] 实验结果显示，见图11，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Ox40的mRNA表达，B-hOX4纯合子小鼠活化细胞中可检测到人OX40的mRNA表达。

[0279] 实施例6抗人OX40抗体体内效果验证

[0280] 在包含人源OX40基因的小鼠(如，本方法制备的B-hOX40小鼠)皮下植入5×105个小鼠结肠癌细胞MC38，在肿瘤体积达到约100mm3(第0天)将其随机分为对照组或治疗组(n＝5只/组)，对照组(G1)注射等体积的空白溶剂，治疗组(G2)腹腔注射3mg/kg的抗人OX40抗体(OX40 agonist full humanAb)，在第0、3、6、9、12和15天进行注射。每周用卡尺测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束试验。

[0281] 整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重均出现增长。治疗组和对照组小鼠体重(图12)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤体积测量结果上看(图13)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小，可见在使用抗人OX40抗体(OX40 agonist full humanAb)治疗后，明显的抑制了小鼠体内的肿瘤生长。

[0282] 表5中列出了实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后12天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后22天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition Value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。

[0283] 表5 小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异

[0284]

[0285] 从表5可见，对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点(分组后22天)时均存活且体重增长良好，治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对抗人OX40抗体(OX40 agonist full humanAb)耐受良好。对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为2754mm3，而治疗组平均肿瘤体积为934 mm3，治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，且与对照组的肿瘤体积相比具有显著差异(p＜0.05)，TGITV为69.1％。由此证明按照所述的给药方式，抗人OX40抗体(OX40 agonist full humanAb)在B-hOX40小鼠体内对肿瘤具有明显的抑制作用(TGITV＞60％)，具有较好的治疗和抑制肿瘤生长能力，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。

[0286] 实施例7抗人OX40调节剂的筛选

[0287] 以上实施例已证实抗人OX40抗体(OX40 agonist full humanAb)对B-hOX40小鼠模型小鼠体内的肿瘤生长有明显的抑制作用，可被用于体内评估靶向OX40药物的有效性，以及评估靶向OX40的治疗效果。本实施例将选择多个抗人OX40抗体，以进一步的验证B-hOX40小鼠可作为体内研究的活体替代模型，用于人OX40信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。

[0288] 与实施例6类似，在包含人源OX40基因的小鼠(如，本方法制备的B-hOX40小鼠)皮下植入5×105个小鼠结肠癌细胞MC38，在肿瘤体积达到约100mm3(第0天)将其随机分为对照组或治疗组(n＝5只/组)，对照组(G1)注射等体积的空白溶剂，治疗组(G2、G3)随机选择抗人OX40抗体AB-a或AB-b中的1种，在第0、3、7、10、14和17天进行腹腔注射，给药剂量均为3mg/kg。每周用卡尺测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到
3000mm3时执行安乐死结束试验。

[0289] 整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重均出现增长。治疗组和对照组小鼠体重(图14)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤体积测量结果上看(图15)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积均呈现不同程度的缩小，可见在使用抗人OX40抗体AB-a或AB-b治疗后，明显的抑制了小鼠体内的肿瘤生长。

[0290] 表6中列出了实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后14天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后24天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition Value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)

[0291] 表6 小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异

[0292]

[0293]

[0294] 从表6可见，对照组和所有治疗组的所有小鼠在实验终点(分组后24天)时均存活且体重增长良好，所有治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对抗人OX40抗体AB-a和AB-b耐受良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为4739mm3，AB-a抗体治疗组(G2)为2150mm3，AB-b抗体治疗组(G3)为1059mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，且与对照组的肿瘤体积相比均具有明显差异，TGITV分别为56.0％和79.7％。表明在相同的给药剂量和频次下，抗人AB-a抗体与抗人AB-b抗体在体内都具有抑制肿瘤生长上的效果(TGITV＞60％)，但抗人AB-a抗体药效不如抗人AB-b抗体(TGITV值G2＜G3)。本实验证明了B-hOX40小鼠可用于筛选靶向人OX40的调节剂(如，抗体)及体内药效检测。

[0295] 实施例8双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定

[0296] B-hOX40动物模型还可以用于制备双人源化或多人源化动物模型。如，前述实施例4中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞或对B-hOX40小鼠的受精卵细胞进行注射来完成基因编辑，可以进一步得到OX40人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的B-hOX40动物模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到OX40人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。

[0297] 以双重人源化OX40/PD-1小鼠的生成为例，由于小鼠Ox40与Pd-1基因位于不同染色体上，选择B-hOX40杂合子小鼠与B-hPD-1纯合子小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选和交配，最终得到双重人源化OX40/PD-1小鼠。

[0298] 分别使用4对引物对双重人源化OX40/PD-1小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表7，反应体系和条件见表8、9。多只双重人源化OX40/PD-1小鼠的鉴定结果见图16，其中图16A、16B表明编号为174-189的小鼠为OX40基因纯合子小鼠、图16C、16D表明编号为174-189的小鼠为PD-1纯合子小鼠，综合两组结果表明，编号为174-189的16只小鼠为双基因纯合子。

[0299] 表7 引物序列

[0300]

[0301] 表8 PCR反应体系(20μL)如下：

[0302]2×Master Mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
ddH2O 补至20μL

[0303] 表9 PCR扩增反应条件

[0304]

[0305] 进一步的对双重人源化OX40/PD-1小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化OX40/PD-1纯合子(6周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后脱颈安乐死取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，然后用鼠源OX40抗体mOX40 APC(图17A、17B、17C)或人源OX40抗体hOX40 PE(图17D、17E、17F)，或鼠源PD-1抗体mPD-1 PE(图18A、18B、18C)或人源PD-1抗体hPD-1 FITC(图18D、
18E、18F)，和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。

[0306] 流式分析结果如图17、18所示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，用人源OX40抗体和人源PD-1抗体可以检测到人源化OX40/PD-1纯合子小鼠脾脏内表达人OX40和PD-1蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人OX40或PD-1蛋白的细胞。

[0307] 实施例9基因敲除小鼠的鉴定

[0308] 在制备OX40基因人源化小鼠模型的同时，可得到Ox40蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：

[0309] 5’-CCCAGACTCCTGTGAAGGCAGAAAG-3’(SEQ ID NO：61)

[0310] 5’-AGGAGGTAGGCTTTACTGAGCCCAA-3’(SEQ ID NO：62)

[0311] PCR反应体系及条件见表8、表9。在该PCR条件下，基因敲除小鼠应有1条PCR条带，产物长度约为403bp，野生型小鼠应无条带。PCR结果参见图19，编号1-10的小鼠均为Ox40基因敲除小鼠。

[0312] 实施例10基于胚胎干细胞的制备方法

[0313] 采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得OX40基因人源化小鼠。

[0314] 根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠OX40基因示意图(图4)，发明人设计了图20所示的打靶策略，图20中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Ox40基因的1至5号外显子全部或部分用人OX40基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(4131bp)、3’同源臂(5472bp)和人源化基因片段(2041bp)的重组载体，并在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到OX40基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例5一致。

[0315] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0316] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0317] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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