一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法
阅读：300发布：2020-05-20
专利汇可以提供一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种精子体外获能液、用于 体外受精 的 试剂 盒 及 哺乳动物 体外受精方法。一种精子体外获能液，包括NaCl 110～140mmol、KCl 2.40～2.95mmol、NaHCO3 22.5～27.5mmol、 葡萄糖 4.8～6.0mmol、丙 酮 酸 钠0.22～0.30mmol、 牛 磺酸0.22～0.30mmol、肾上腺素0.04～0.06mmol、BSA 14～16mg/ml、MgCl2 0.4～0.6mmol、CaCl2 1.6～2.0mmol、DL-乳酸钠溶液8～12mmol，pH值为7.35±0.10。本发明精子体外获能液能够显著提高长爪沙鼠在体外受精效率，使用本发明方法后长爪沙鼠在体外受精效率大大提高，2细胞发育率达到65％以上，最高可以达到85％，取得了与显微注射方法相当甚至更高的体外受精率，使用方便，具有很好的应用前景。，下面是一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法专利的具体信息内容。
1.一种精子体外获能液，其特征在于，包括NaCl 110～140mmol、KCl 2.40～2.95mmol、NaHCO3 22.5～27.5mmol、葡萄糖4.8～6.0mmol、丙酮酸钠0.22～0.30mmol、牛磺酸0.22～
0.30mmol、肾上腺素0.04～0.06mmol、BSA 14～16mg/ml、MgCl2 0.4～0.6mmol、CaCl2 1.6～
2.0mmol、DL-乳酸钠溶液8～12mmol，pH值为7.35±0.10。
2.如权利要求1所述的精子体外获能液，其特征在于，还包括酚红及青霉素G、硫酸链霉素。
3.一种用于体外受精的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的体外获能液，还包括体外受精液，所述体外受精液包括：BSA28～32mg/ml，其余组分同体外获能液。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括矿物油、孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素。
5.如权利要求4所述的试剂盒在哺乳动物体外受精中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为长爪沙鼠。
7.一种哺乳动物体外受精方法，其特征在于，使用如权利要求3所述试剂盒，包括以下步骤：
(1)取体外获能液和体外受精液分别做获能液滴和受精液滴，并分别用矿物油覆盖液滴，平衡后备用；
(2)取精子放入平衡后的获能液滴中培养获能；
(3)取卵子放入平衡后的受精液滴中，然后取步骤(2)获能后的精子放入受精液滴中，培养受精。
8.如权利要求7所述的哺乳动物体外受精方法，其特征在于，所述获能液滴为250～350μL/滴，受精液滴为150～250μL/滴，平衡至少30min。
9.如权利要求7所述的哺乳动物体外受精方法，其特征在于，所述哺乳动物为长爪沙鼠，精子获能时间为4～5h。
10.如权利要求9所述的哺乳动物体外受精方法，其特征在于，取卵子的方法包括以下步骤：
(1)每只长爪沙鼠雌鼠使用40～60IU孕马血清促性腺激素和40～80IU绒毛膜促性腺激素先后进行超排，两者间隔96～100h；
(2)绒毛膜促性腺激素注射15～18h后处死雌鼠，取出输卵管内的卵丘团放入平衡后的受精液滴中。
一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体
外受精方法
技术领域
背景技术
[0002] 长爪沙鼠(Mongolian gerbil，Meriones unguiculatus)是研究神经学、寄生虫学、病毒学、 细菌学、内分泌学、遗传学、血液学、脂类、糖代谢、肿瘤学、药理学、放射生物学、生殖 和毒理学的良好模型动物，具有很高的科研价值和应用前景。采用传统的保种方法，消耗大 量人力物力资源，而且自然灾害、意外微生物污染都可能使这些宝贵品系毁于一旦，特殊的 表型在繁育过程中也可能由于遗传漂变而丧失，因此对其胚胎进行冷冻保存是未来沙鼠资源 保种的主要方式，这就需要有大量的胚胎，体外受精正是获得大量胚胎的有效途径。因为长 爪沙鼠精子与胚胎体外培养的特殊性，相关研究一直进展缓慢,迄今为止，仍未找到适合于长 爪沙鼠精子体外获能、体外受精和胚胎体外发育的培养液。
[0003] 目前长爪沙鼠胚胎来源主要是超排后体内受精，体外受精技术国内未见报道。Mochida K 等(Mochida K,Matsuda J,Ponce RH,et al.In vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection in the mongolian gerbil(Meriones
unguiculatus)[J].BIOCELL,2004,28(2):189.)比较 沙鼠的体外受精和显微注射的效果，其体外受精率11％，后来选择显微注射，提高为63％， 但是显微注射需要昂贵的仪器。
Naoko Kimura等(Kimura N,Sasaki M,Totsukawa K. Development of Mongolian gerbil embryos in chemically defined medium[J].Bull Yamagiwa Univ Agric Sci,2005,14(4):195-200.)沙鼠体外受精率最高为29.8％，
unguiculatus)[J].BIOCELL,2004,28(2):189.)比较 沙鼠的体外受精和显微注射的效果，其体外受精率11％，后来选择显微注射，提高为63％， 但是显微注射需要昂贵的仪器。
Naoko Kimura等(Kimura N,Sasaki M,Totsukawa K. Development of Mongolian gerbil embryos in chemically defined medium[J].Bull Yamagiwa Univ Agric Sci,2005,14(4):195-200.)沙鼠体外受精率最高为29.8％，
发明内容
[0005] 一种精子体外获能液，包括NaCl 110～140mmol、KCl 2.40～2.95mmol、NaHCO3 22.5～27.5mmol、葡萄糖4.8～6.0mmol、丙酮酸钠0.22～0.30mmol、牛磺酸0.22～
0.30mmol、肾 上腺素0.04～0.06mmol、BSA 14～16mg/ml、MgCl2 0.4～0.6mmol、CaCl2 1.6～2.0mmol、DL-乳 酸钠溶液8～12mmol，pH值为7.35±0.10。
0.30mmol、肾 上腺素0.04～0.06mmol、BSA 14～16mg/ml、MgCl2 0.4～0.6mmol、CaCl2 1.6～2.0mmol、DL-乳 酸钠溶液8～12mmol，pH值为7.35±0.10。
[0006] 最优选的浓度下，体外获能液，组成成分为：NaCl 124.8mmol、KCl 2.68mmol、NaHCO3 25mmol、葡萄糖5.5mmol、丙酮酸钠0.25mmol、牛磺酸0.25mmol、肾上腺素0.05mmol、BSA 15mg/ml、MgCl2 0.5mmol、CaCl2 1.8mmol、DL-乳酸钠溶液10mmol，pH值为7.35±0.10。
[0007] 所述的精子体外获能液，还包括酚红及青霉素G、硫酸链霉素。酚红为pH指示剂，如 果受精卵发育较多较快，培养基pH会降低，使用的浓度为常规使用浓度，比如体积比0.5％。 青霉素G、硫酸链霉素为抗生素，用于抑制细菌等微生物的生长，使用浓度为常规浓度即可， 比如青霉素G 7.5mg/100mL、硫酸链霉素5mg/100mL。当然也可以使用其他合适的pH指示 剂和抗生素。
[0008] 本发明还提供了一种用于体外受精的试剂盒，包括所述的体外获能液，还包括体外受精 液，所述体外受精液包括：BSA 28～32mg/ml，其余组分同体外获能液。
[0010] 本发明还提供了所述的试剂盒在哺乳动物体外受精中的应用。
[0011] 所述哺乳动物为长爪沙鼠。
[0012] 本发明还提供了一种哺乳动物体外受精方法，使用所述试剂盒，包括以下步骤：
[0013] (1)取体外获能液和体外受精液分别做获能液滴和受精液滴，并分别用矿物油覆盖液滴， 平衡后备用；
[0014] (2)取精子放入平衡后的获能液滴中培养获能；
[0015] (3)取卵子放入平衡后的受精液滴中，然后取步骤(2)获能后的精子放入受精液滴中， 培养受精。
[0016] 所述获能液滴为250～350μL/滴，受精液滴为150～250μL/滴，平衡至少30min。
[0017] 所述哺乳动物为长爪沙鼠，精子获能时间为4～5h。
[0018] 取卵子的方法包括以下步骤：
[0019] (1)每只长爪沙鼠雌鼠使用40～60IU孕马血清促性腺激素和40～80IU绒毛膜促性腺激 素先后进行超排，两者间隔96～100h；
[0020] (2)绒毛膜促性腺激素注射15～18h后处死雌鼠，取出输卵管内的卵丘团放入平衡后的 受精液滴中。
[0021] 本发明精子体外获能液能够显著提高长爪沙鼠在体外受精效率，使用本发明方法后长爪 沙鼠在体外受精效率大大提高，2细胞发育率达到65％以上，最高可以达到85％，取得了与 显微注射方法相当甚至更高的体外受精率，使用方便，具有很好的应用前景。附图说明
[0022] 图1为利用计算机辅助分析技术对长爪沙鼠精子在体外获能液中不同时间运动参数分析 结果图，其中图A为精子超激活前，图B为精子超激活后。
[0024] 图3为长爪沙鼠发情周期阴道涂片分析结果图，其中图A为发情间期，图B为发情前期， 图C为发情期，图D为发情后期。
[0025] 图4为长爪沙鼠体外受精8-9小时雄原核和雌原核显微观察图，其中图A为低倍镜下图， 图B为高倍镜下图。
[0026] 图5为长爪沙鼠体外受精后2细胞发育率结果显微观察图，其中图A～D为4个重复，2 细胞发育率分别为65％、71％、73％和85％。
具体实施方式
[0027] 实验动物：
[0028] 清洁级雌性长爪沙鼠，2～3月龄，雄性长爪沙鼠5月龄，由浙江省实验动物中心提供 【SCXK(浙)2008-0033】，实验在浙江省实验动物中心进行【SYXK(浙)2008-0113】，并按实验 动物使用的3R原则给予人道的关怀。动物饲养设施光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00 黑暗。长爪沙鼠饲喂辐照料，饮用超滤水，笼器具、垫料等均经121℃高压灭菌，饲养环境 温度20～25℃，湿度40％～60％。
[0029] 主要试剂和药品：
[0030] 体外获能液，组成成分为：NaCl 124.8mmol、KCl 2.68mmol、NaHCO3 25mmol、葡萄糖 5.5mmol、丙酮酸钠0.25mmol、牛磺酸0.25mmol、肾上腺素0.05mmol、BSA 15mg/ml、MgCl2 0.5mmol、CaCl2 1.8mmol、DL-乳酸钠溶液10mmol，pH值为7.35±0.10。使用时加入0.5％体 积比的酚红，以及抗生素(青霉素G 7.5mg/100mL、硫酸链霉素5mg/100mL)。
[0031] 体外受精液，组成成分除BSA加倍外(BSA 30mg/ml)，其余同体外获能液。
[0032] M2培养基(M7167，Sigma)。
[0033] 矿物油：石蜡油(lotD357A，SAGE)。
[0034] 孕马血清促性腺激素(PMSG，宁波第二激素厂)。
[0035] 绒毛膜促性腺激素(HCG，宁波第二激素厂)。
[0036] 仪器：
[0037] CO2培养箱(Thermo)，计算机辅助精液分析系统(CASA，Microptic，Barcelona，Spain)， 解剖显微镜(Leica，S8APO)，洗卵管(自制)，35mm培养皿(Corning，USA)，100mm培 养皿(Corning，USA)。
[0038] 实施例1
[0039] 采用计算机辅助精液分析(CASA)系统分析长爪沙鼠精子在不同的培养液中，不同培 养时间的运动参数，旨在探讨长爪沙鼠精子发生超激活的时间，筛选适合长爪沙鼠的获能培 养液。共筛选4种获能培养液，其中HTF为SAGE辅助生殖细胞培养基(Quinns Fertilization Medium，美国SAGE公司)，使用时添加10％体积比的血清
(SAGE公司)；IVF 为商品化的体外受精以及分裂培养液(Vitrolife公司，货号503938)；“体外获能液”表示本发 明配方的体外获能液；“体外受精液”表示本发明配方的体外受精液。
(SAGE公司)；IVF 为商品化的体外受精以及分裂培养液(Vitrolife公司，货号503938)；“体外获能液”表示本发 明配方的体外获能液；“体外受精液”表示本发明配方的体外受精液。
[0040] 长爪沙鼠精子的采集：乙醚麻醉6只长爪沙鼠，打开长爪沙鼠腹腔，暴露附睾，在灭菌 滤纸上剔除其周围结缔组织、脂肪和血液后，用1mL注射器穿刺附睾尾部，挤压后精子团涌 出，刮取精子，加入到培养液中，在5％CO2培养箱37℃孵育。
[0041] 在5％CO2培养箱37℃分别孵育0h、2h、4h、6h，0h为对照组，采用计算机辅助精液分析 系统(CASA)检测不同孵育时间的长爪沙鼠精子运动参数。
[0044] 表1不同孵育时间长爪沙鼠精子在不同培养液中的平均曲线速度。
[0045]
[0046] 表2不同孵育时间长爪沙鼠精子在不同培养液中的平均直线速度。
[0047]
[0048] 表3不同孵育时间长爪沙鼠精子在不同培养液中的平均运动路径速度。
[0049]
[0050]
[0051] 结果如表1～3所示，本试验通过CASA技术测定的不同获能时间长爪沙鼠精子各运动参数 将长爪沙鼠精子发生超激活的时间界定为4～6h。
[0052] 精子发生超激活运动时，呈现出一种非常“强有力”的运动方式，表现为鞭打的振幅增加， 频率降低，运动轨迹高度不对称，运动轨道呈“鞭打状”、“小圆圈”、“8字型”或“星状螺旋型”。 这种强有力的运动使得具有这种运动模式的精子能够在受精的时候穿过输卵管壶腹部。
[0053] 本实施例采用CASA技术研究长爪沙鼠精子超激活运动模式及参数的改变，推测多种成 分参与了精子超激活运动的调节，为进一步研究超激活运动的作用机制及调控机制打下基础。 精子运动速度参数有VCL(平均曲线速度)、VSL(平均直线速度)和VAP(运动路径速度)， 由于VCL、VSL和VAP均为速度参数值(单位：μm/s)，且VCL、VSL和VAP之间均具有高 度相关性，VSL和VAP是直线速度和平均路径速度，都是VCL综合后的指标，它们都是以精 子头部为参照物，测定其在单位时问内精子头部移动距离或相对位移，用来反映精子运动能 力的参数，在临床诊断中只观察一种参数的变化即可，选用VCL这一参数。
[0054] 随着培养时间的增加，在HTF中反应精子运动参数的指标VCL、VAP和VSL没有显著性 差异(P>0.05)，说明长爪沙鼠精子在HTF培养液中运动方式没有发生剧烈变化，提示没有 获能，该培养液不适合用作获能培养液，或者长爪沙鼠精子在HTF获能时间至少大于6h。
[0055] 在IVF中随着培养时间的增加，长爪沙鼠精子运动参数的指标VCL数值先上升后下降，2h 与0h，4h与0h有统计学差异(P<0.05)，4h和0h有统计学差异(P<0.05)，其他各组没有统 计学差异。
[0056] 在本发明配方的体外获能液中随着培养时间的增加，长爪沙鼠精子运动参数的指标VCL 数值先上升后下降，4h与0h有统计学差异(P<0.05)，6h和0h有统计学差异(P<0.05)，其 他各组没有统计学差异。
[0057] 随着培养时间的增加，在本发明配方的体外受精液中，反应精子运动参数的指标VCL、 VAP和VSL没有显著性差异(P>0.05)，说明长爪沙鼠在自配的受精液培养液中运动方式没 有发生剧烈变化，只是维持较高的运动速度，提示该培养液不适合用作获能培养用。
[0058] 实施例2
[0059] 1.1液滴平衡
[0060] 取体外获能液和体外受精液在35mm培养皿中分别作获能液滴(300μL/滴)和受精液滴(200μL/滴)，用矿物油4ml(本发明使用石蜡油，下同。)覆盖所有液滴，在使用前30min 平衡。
[0061] 1.2精子的获取、培养及长爪沙鼠精子获能时间确定
[0062] 早上8:00，取4月龄有繁育能力的雄鼠，颈椎脱臼处死，腹部75％酒精消毒，打开腹腔， 取附睾尾，用眼科剪将附睾尾周围的脂肪剥离，在灭菌滤纸上去除血迹和脂肪，用拇指和食 指轻轻挤压附睾尾，同时用1mL注射器针头刺破附睾尾，待破口处涌出乳白色的精子团后用 1mL注射器针头挑出约30μL精子团，置于预先平衡好的液滴中，在5％CO2、饱和湿度100％、 37℃培养箱中培养0、2.5、4.5、5.5h。
[0063] 沙鼠精子获能前运动轨迹呈之字形，获能后运动轨迹呈8字形，超激活前后的运动轨迹 见图1。除了观察运动方式外，用金霉素荧光染色法技术对沙鼠精子获能状态进行了观察， CTC染色后所有精子尾部均染上黄绿色荧光，未获能精子顶体完整，整个精子头部呈强烈的 黄绿色荧光(图2A)，获能后荧光显著减弱甚至消失(图2B)。
[0064] 采用计算机辅助精子质量分析系统对长爪沙鼠精子在自配的获能液中不同时间精子运动 参数进行测量，精子运动参数包括：
[0065] 直线运动速度VSL(straight-line velocity，μm/s)是在观察时间内精子从运动起点到运动 终点的直线距离对观察时间的比；
[0066] 曲线速度VCL(curvilinear-velocity，μm/s)是精子在观察时间内所经过的实际运动轨迹 距离总和对观察时间的比；
[0067] 平均运动路径速度VAP(average path velocity，μm/s)是精子在观察时间内的平均轨迹 距离总和和对观察时间的比；
[0068] 直线性LIN(linearity，LIN＝VSL/VCL，)表征精子实际所走路径的曲折程度，值越大表 示路径越直，值越小表示越弯，并且取值范围在0-1之间；
[0069] 前向性STR(straightness，STR＝VSL/VAP)，表征精子向前运动的程度，值越大表示精 子前向能力越好，值越小表示精子可能在原地打转，取值范围在0-1之间；
[0070] 侧摆幅度ALH(lateral amplitude，μm)：精子在运动过程中实际运动轨迹相对其平均移 动轨迹的偏移幅度；
[0071] 鞭打频率BCF(beat cross frequency)精子曲线运动轨迹越过其平均路径轨迹的次数对观 察时间的平均。
[0072] 照相速度60帧/秒，数据为6帧连续照片的平均值。
[0073] 计算机辅助分析系统(CASA)结果表明，沙鼠精子获能时间为4～5.5h，平均曲线速度 (VCL)最快，为(300.2±9.19)μm/s，因此把长爪沙鼠获能时间确定为4～5h，结果见表4。
[0074] 表4利用计算机辅助分析系统对长爪沙鼠精子在体外获能液中不同时间运动参数分析。
[0075]
[0076] 1.3卵子的超排与获取
[0077] 第0天下午5点取雌鼠于腹腔注射PMSG，剂量为每只40IU，第4天下午8点取雌鼠于 腹腔注射HCG，剂量为每只40IU，HCG注射后16h，将雌鼠用颈椎脱臼法处死，75％乙醇 消毒腹部，打开腹腔，取出输卵管置于液滴培育皿的矿物油内，显微镜下划破输卵管膨大部， 收集卵丘团于液滴内。
[0078] 超数排卵时一般不考虑其性周期，每只用40IU的激素进行超排，二次激素间隔在 96～100h，每只沙鼠平均采卵数约20枚。
[0079] 如果考虑性周期，数据表明，在发情后期进行超排效果较好，见表5。在激素间隔为96h 条件下，孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素剂量分别为60IU和80IU，选用5月龄长 爪沙鼠，在孕马血清促性腺激素注射前做了阴道涂片来判断激素注射时动物的发情状况，长 爪沙鼠发情周期判定标准见图3。
[0080] 表5 5月龄长爪沙鼠不同性周期超排结果。
[0081]
[0082]
[0083] 1.4体外受精
[0084] 取8μL精子加入受精皿内，37℃培养箱中受精8～9h。体外受精后8～9h在清洗胚胎时可 以看到雄原核和雌原核，见图4。
[0085] 1.5受精结果检查
[0086] 受精培养8～9h后将卵子移出，置于体外受精液中洗3遍，移入预先平衡的发育液(发育 液使用常用的mKSOM培养液，其中BSA浓度增加为4mg/mL)中继续培养48h后观察2细 胞发育率。结果如图5所示，实验重复4次，2细胞发育率分别为65％、71％、73％和85％。
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