技术领域
[0001] 本
发明属于
辅助生殖技术领域，尤其是涉及一种优选精子的显微操作皿及精子优选方法。
背景技术
[0002] 人类在自然受精过程中，成熟精子进入女性生殖道，需要经历获能、超激活和顶体反应等生理过程，最终与卵细胞结合完成受精。孕
酮在女性生殖道内的分布呈浓度梯度。当精子进入生殖道，低浓度的孕酮能够快速诱导精子胞内
钙离子浓度上升，诱导精子获能，随着孕酮浓度增加，显著提高精子的前向运动和超激活运动，并且在其趋化性的引导下游向输卵管壶腹部，当精子与卵细胞相遇后，高浓度的孕酮能够诱发精子发生顶体反应，使得精卵融合，发生受精。孕酮在女性生殖道内的浓度梯度分布，能够在短时间内引起精子细胞内
信号通路的激活，有效调控精子的获能、超激活、趋化性等重要生理功能。
[0003] 辅助生殖技术中，筛选形态功能正常、无遗传
缺陷的精子是必须的步骤，目前，最常规、最广泛使用的精子优选技术是精子上游法、
密度梯度离心法等。其原理主要是基于正常精子与畸形精子、不活动精子及精液中的其他细胞成分在运
动能力、运动轨迹和
浮力密度等方面出现差异，在培养液或密度梯度溶液柱中运行的能力也有差异，目的是为了获得运动正常的精子。
[0004] 常规的ICSI技术是在倒置
显微镜放大200倍条件下，单纯依靠操作者肉眼观察精子的外部形态来选择受精的精子。由于精子筛选方法的局限，操作者只能经验性的依据精子活力和表面形态挑选精子，对优质精子的选择能力十分有限，所选出的所谓“正常”精子可能包含某些生理功能的缺陷，进而影响精卵受精过程和胚胎发育，可能会增加接受
治疗的患者子代遗传缺陷方面
风险，甚至可能导致ICSI结局失败。
[0005] 因此，发展一种选择性更强、安全、无创的精子优选技术对于提高辅助生殖成功率具有重要的现实意义。
发明内容
[0006] 本发明公开了一种优选精子的显微操作皿，利用该显微操作皿能够筛选出生理功能正常、无遗传缺陷的精子，并进行
体外受精操作。
[0007] 一种优选精子的显微操作皿，包括皿盘和皿盖，皿盘上表面凹设有样本池和优选通道，其中，优选通道包括第一通道、第二通道和第三通道，所述样本池通过第一通道与第二通道的中点连接，在第二通道的中点两侧分别设有若干个诱导室。所述的皿盘上表面还分有精子收集区、精子
制动区和显微注射区，第二通道的两头分别通过向上倾斜的第三通道与精子收集区连接，所述精子制动区和显微注射区在精子收集区附近。本发明的显微操作皿模拟精子在女性生殖道中的运动轨迹，利用膜连蛋白V对凋亡精子的分离以及诱导剂对精子功能的调控来优选精子，从而提高体外受精的受精率和优胚率。
[0008] 通过将第三通道设置成向上倾斜并与精子收集区连接，使得精子收集区位于皿盘上表面，显微注射针在精子收集区的
水平操作时与皿底没有夹
角，从而可以顺利的抓取经过优选的精子用于卵胞浆内单精子显微注射。第三通道可以整体都向上倾斜，或者由水平部和倾斜部组合而成，最终保证精子收集区与皿盘上表面齐平。
[0009] 本发明中，所述第一通道、第二通道和第三通道均为直线型通道。
[0010] 作为优选，所述优选通道的长度为25～35mm，所述优选通道的宽度为1.5～2.5mm。优选通道的长度为第一通道、第三通道以及一半的第二通道三者长度之和，如此长度相当于子宫与输卵管的长度之和，更好的模拟女性生殖道对精子的自然选择过程。
[0011] 所述样本池、第一通道和第二通道的深度均为2～3mm。
[0012] 在第二通道中点的两侧，所述诱导室均至少有两个，每个诱导室间隔2～3mm，进一步优选为3～5个，便于多设置几个诱导剂浓度，更好的诱导精子。
[0013] 所述的诱导室凹设在第二通道上，诱导室的长度为2.5～3.5mm，宽度为1.5～2.5mm，深度为1～2mm。由于诱导室凹设在第二通道上，使得诱导室中加入诱导剂后依旧不影响在第二通道上加入精子培养液，保证精子可以穿过诱导室游向精子收集区。
[0014] 作为优选，所述第三通道的倾斜角度为10～30度，进一步优选，倾斜角度为20度。如此倾斜角度的第三通道进一步增加了对精子的选择性，可以挑选出活力更好的精子。
[0015] 作为优选，所述精子制动区和显微注射区位于两个第三通道之间，其中，所述精子制动区靠近第二通道。这样的分布设置，更有利于制动和显微注射的操作。
[0016] 本发明还公开了一种利用所述显微操作皿的精子优选方法包括：
[0017] (1)第一通道用膜连蛋白V进行预处理，4℃保存待用。
[0018] (2)在诱导室中分别加入不同浓度的诱导剂，使诱导室内诱导剂的浓度从第二通道的中点至第三通道依次变大；
[0019] (3)向样本池、优选通道和精子收集区内加入精子培养液，并
覆盖矿物油，盖上皿盖，放入37℃、5％二
氧化
碳培养箱内平衡30min；
[0020] (4)将适量精子样本加入样本池，盖上皿盖，放入37℃、5％二氧化碳培养箱内30～60min，使生理功能和受精能力正常的精子游到精子收集区；
[0021] (5)在精子制动区加入高
粘度的精子
制动液，在倒置显微镜下用显微注射针从收集区吸取精子，移至精子制动区制动精子；
[0022] (6)将制动后的精子移至显微注射区，在显微注射区完成卵胞浆内单精子显微注射操作。
[0023] 其中，作为优选，所述的诱导剂为孕酮或其衍
生物的琼脂培养基。
[0024] 步骤(1)中，第一通道用膜连蛋白V进行预处理的具体过程为：用血清
白蛋白37℃孵育30-60min，用PBS缓冲液洗涤，用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester，SPDP)室温下孵育1小时。再在室温下加二硫苏糖醇孵育1小时清除二硫基。然后用含有SPDP(1mg/ml)的
醋酸钠缓冲液(PH 4.5，50mM)室温孵育1小时后，用醋酸钠缓冲液洗涤，再与含膜连蛋白V(100μg/ml)的PBS缓冲液孵育2-3小时，最后用含1mM二硫苏糖醇的PBS洗涤，晾干，4℃保存待用。
[0025] 精子凋亡是影响精卵受精成功率的一个重要因素。膜连蛋白V(Annexin V)是检测精子凋亡的灵敏指标之一。精子凋亡时，精子膜上磷脂酰丝
氨酸由胞膜内侧翻向外侧，而膜连蛋白V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度的亲和力。利用精子膜外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与膜连蛋白V结合的特征可区分凋亡精子。精子细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻要早于细胞核的变化，故膜连蛋白V还以更早地检测到凋亡精子，凋亡精子与膜连蛋白V共价结合而被
吸附住，正常精子自由通过，因此，可以快速、有效去除凋亡精子。
[0026] 孕酮琼脂培养基通过人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液配置。人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液的成份为：氯化
钾5.06mM、
氯化钠90mM、
氯化钙1.8mM、
碳酸氢钠25.3mM、
硫酸镁1.01mM、
磷酸二氢钾1.17mM。不同浓度的孕酮琼脂培养基的配置过程如下：
[0027] 用人输卵管液无机盐成分等渗溶液配制2％的琼脂，灭菌后，等琼脂冷却至56℃左右，量取一定体积琼脂分别置于若干个不同试管，并配成含5.00μM和10.00μM等不同梯度的孕酮琼脂培养基，混匀，并迅速将不同浓度琼脂培养基分别注满不同的诱导室。等琼脂冷却
凝固，并加盖置4℃保存。
[0028] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0029] 1、本显微操作皿模拟精子在女性生殖道中的运动轨迹，利用膜连蛋白V对凋亡精子的作用以及孕酮对精子功能的调控来优选精子。由于凋亡精子和膜连蛋白V发生共价结合而被吸附住，故有效去除了凋亡精子。孕酮对精子功能的影响涉及到精子细胞内信号通路的激活，而这一过程是否顺利又可反映精子各项功能是否正常发挥，因此，本显微操作皿可筛选分离出生理结构和功能均为正常的精子。
[0030] 2、本发明是在实施ICSI技术之前对精子进行的进一步优化筛选，既不破坏精子的形态、结构和活力，又能区分出生理结构和功能均为正常的精子，通过设置精子收集区、精子制动区和显微注射区，使得筛选的精子可即刻用于ICSI显微操作。
[0031] 3、本发明将膜连蛋白V和孕酮直接包被成固相固定在操作皿中，省略了操作者每次使用前包被的过程，大大节约了操作时间，提高工作效率。
[0032] 4、本发明的装置结构简单，成本低廉，实用性强，对精子筛选具有安全、有效和非侵入性等特点，可常规用于临床ICSI显微操作，因而本发明具有非常大的实用价值和应用前景。
附图说明
[0033] 图1为本发明优选精子的的显微操作皿的俯视图；
[0034] 图2为本发明优选精子的显微操作皿的诱导室横截面图；
[0035] 图3为本发明优选精子的显微操作皿的第三通道横截面图；
[0036] 图4为本发明优选精子的显微操作皿的第一通道上膜连蛋白V优选精子示意图。
具体实施方式
[0037] 下面结合附图和
实施例对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
[0038] 实施例1
[0039] 本实施例一种优选精子的显微操作皿，采用透明、硬度强、耐高温、耐
腐蚀、无毒无热原的高分子材料制成。如图1所示，显微操作皿包括：皿盘和皿盖，皿盘上表面凹设有样本池1、第一通道21、第二通道22，样本1通过第一通道21与第二通道22的中点连接，在第二通道22的中点两侧分别设有两个诱导室3，皿盘上表面还分有精子收集区4、精子制动区5和显微注射区6，第二通道22的两头分别通过向上倾斜的第三通道23与精子收集区4连接，精子制动区5和显微注射区6在精子收集区4附近。
[0040] 本实施例中，皿盘的直径为60mm，高度10mm，皿底厚4mm。样本池1的深度为2mm，直径为5mm；第一通道21、第二通道22与样本池1的深度一样，均为2mm。第一通道21、第二通道22和第三通道23的宽度均为2mm。第一通道21、第三通道23以及一半的第二通道22三者长度之和为30mm，如此长度相当于子宫与输卵管的长度之和，更好的模拟女性生殖道对精子的自然选择过程。
[0041] 如图2所示，诱导室3凹设在第二通道22上，诱导室的长度为3mm，宽度为2mm，深度为1mm。相邻的两个诱导室3间隔3mm，分别铺设不同浓度的孕酮或其衍生物固相诱导剂。
[0042] 如图3所示，在诱导室3与精子收集区4之间的第三通道23为一段倾斜平面，第三通道底面与皿底呈10～30度夹角，最终精子收集区4与皿盘上表面平行，目的是显微注射针在精子收集区的水平角度与皿底没有夹角，从而可以顺利的抓取经过优选的精子用于卵胞浆内单精子显微注射。
[0043] 如图4所示，第一通道21的底面和侧面用于包被膜连蛋白V，凋亡精子与膜连蛋白V共价结合而被吸附住，正常精子自由通过；因此，可以更早地检测到凋亡精子，并快速、有效地去除凋亡精子。
[0044] 1、试验准备
[0045] 在第一通道用膜连蛋白V进行预处理：用5％血清白蛋白37℃孵育30-60min，用PBS缓冲液洗涤5次，每次5分钟，用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester，SPDP)室温下孵育1小时。再在室温下加二硫苏糖醇孵育1小时清除二硫基。然后，用PBS缓冲液洗涤后，用含有1mg/ml的SPDP醋酸钠缓冲液(PH4.5，50mM)室温孵育1小时，再用醋酸钠缓冲液洗涤，再与含100μg/ml膜连蛋白V的PBS缓冲液孵育2-3小时，最后用含1mM二硫苏糖醇的PBS洗涤，晾干4℃保存待用。
[0046] 配制人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液，其成份：
氯化钾5.06mM、氯化钠90mM、氯化钙1.8mM、碳酸氢钠25.3mM、
硫酸镁1.01mM、磷酸二氢钾1.17mM。
[0047] 配置不同浓度的孕酮琼脂培养基。用人输卵管液无机盐成分等渗溶液配制2％的琼脂，灭菌后，等琼脂冷却至56℃左右，量取一定体积琼脂分别置于2个不同试管，并配成含5.00μM和10.00μM等不同梯度的孕酮琼脂培养基，混匀，并迅速将不同浓度琼脂培养基分别注满诱导室小室3。等琼脂冷却凝固，并加盖置4℃保存。使用前，样本池1、第一通道21、第二通道22、第三通道23、诱导室3和精子收集区4均加上精子体外培养基，并覆盖矿物油，盖上皿盖，放入37℃，5℃二氧化碳培养箱内平衡30min。
[0048] 2、优选精子对比
[0049] 收集常规检测正常的人精液标本30份，每份分成两份，一份经密度梯度离心法收集精子，过程如下：吸取1ml左右上层分离液加入15ml尖底离心管底部，然后吸取1ml左右下层分离液小心置于离心管底部，保持与上层液分层。精液采集
液化后，取1.5ml从顶部小心加入。300g离心10分钟。吸取离心管底部精子沉淀团转移至新的预先加有2ml精子体外培养基的离心管，混匀300g离心5分钟。去上清，再用2ml精子体外培养基稀释混匀，300g离心5分钟，去上清，加适量培养基调整精子浓度。
[0050] 另一份经密度梯度离心后取适量加在本发明的样本池1，盖上皿盖，放入二氧化碳培养箱内30～60min，倒置显微镜下观察收集区4的精子活力，并吸取和收集精子。
[0051] 两种方法收集的精子进行活力、形态学和DNA碎片评估比较，得到结果如表1所示。
[0052] 表1
[0053]指标 密度梯度法 本发明装置
密度(×106) 86.6±4.8 36.9±9.7
前向运动精子(％) 71.6±8.8 94.9±3.8
正常形态(％) 11.4±3.1 20.2±3.5
DNA碎片(％) 16.4±6.7 2.9±0.9
[0054] 根据两种方法处理后各个指标对比，可以看出，本发明显微操作皿收集的精子在前向运动精子、正常形态和DNA碎片等指标显著优于密度梯度法，表明本发明装置较密度梯度法对优质精子的选择性更强。
[0055] 实施例2
[0056] 实验组用本发明优选精子的显微操作皿，试验准备与实施例1第1部分相同。
[0057] 取适量精子标本缓慢轻柔地加在样本池1，盖上皿盖，放入二氧化碳培养箱内30～60min，生理功能和受精能力正常的精子便游到精子收集区4。精子收集区4中的精子可即刻用于胞浆内单精子显微注射。即用显微穿刺针在精子收集区4吸取1个精子，移至精子制动区5制动精子，再移至显微注射区6。用显微固定针在显微注射区6固定卵子，使其极体处于6点或12点
位置将精子注射到卵子里完成体外受精。实验组共完成112个成熟卵的显微注射，受精95个，受精率84.8％，卵裂93个，卵裂率97.9％，优质胚胎44个，优胚率47.3％。
[0058] 对照组用普通显微操作皿(市售Falcon 1006培养皿)，操作者在倒置显微镜下经验性的选择活力好和外观形态正常的精子进行制动，用显微固定针固定卵子，使其极体处于6点或12点位置将精子注射到卵子里完成体外受精。对照组共完成125个成熟卵的显微注射，受精91个，受精率72.8％，卵裂90个，卵裂率98.9％，优质胚胎37个，优胚率41.1％。
[0059] 上述结果显示，实验组和对照组在卵裂率和优胚率无显著差异，但实验组的受精率显著高于对照组，这说明本发明装置增强了单精子显微注射操作过程中对精子的选择性，可显著提高体外受精的受精率。
[0060] 以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何
修改、补充和等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。
