特别是用于体外受精或用于卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的细胞培养基的无细胞因子的佐剂
阅读：1061发布：2020-06-04
专利汇可以提供特别是用于体外受精或用于卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的细胞培养基的无细胞因子的佐剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的主题是可以用作体外细胞培养的佐剂的组合物，其特征在于它们包含选自由锌盐、任一种立体异构形式的肌醇、肉 碱 或肉碱衍 生物 、褪黑 激素 或其类似物、任一种立体异构体形式或其衍生物形式的胱 氨 酸、半胱胺或半胱胺盐，以及优选氢化可的松P的皮质类固醇所组成的组的至少两种化合物，所述组合物不含细胞因子。本发明的主题还涉及使用这种培养基佐剂的 体外受精 方法和卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的成熟方法，以及用于进行这些方法的 试剂 盒 ，其包含上述冻干物和包含所述培养基的其他成分的 水 溶液。，下面是特别是用于体外受精或用于卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的细胞培养基的无细胞因子的佐剂专利的具体信息内容。
1.一种液体、粉末或冻干物形式的组合物，可选地在卵泡或精子解冻后，用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，其特征在于所述组合物包含：
·选自由以下组成的组的至少两种或至少三种化合物：
-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，
-肌醇，以任一立体异构形式优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇，或以其磷酸盐形式，最好是三磷酸肌醇，特别是以盐的形式，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或
肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素的可接受的盐或溶剂化物，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，乙酰胱氨酸胱氨酸衍生物，优选为乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选为乙酰半胱胺，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
·一种或多种选自皮质类固醇族化合物的化合物
以及，可选地，
·一种或多种能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且其中所述组合物不含细胞因子。
2.一种液体形式的组合物，可选地在卵泡或精子解冻后，用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，其特征在于所述组合物包含：
·选自由以下组成的组的至少两种或至少三种化合物：
-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，特别是浓度为0.1至3μg/mL，优选浓度为0.5至1.5μg/mL，以锌元素表示，
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇(myo-Inositol)，或其磷酸盐形式，优选为三磷酸肌醇，特别是盐形式，特别是浓度为1.8至18mg/mL，优选为5至10mg/mL，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是浓度为0.1至
2mg/mL，优选0.5至1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-11 -5
-褪黑激素或类似物，可接受的盐或褪黑激素溶剂化物，特别是浓度为10 至10 M，优选地10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，胱氨酸衍生物，优选乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选为乙酰半胱胺，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基本结构表示，
·一种或多种选自皮质类固醇族化合物的化合物
以及，可选地，
·一种或多种能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且所述组合物不含细胞因子。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述皮质类固醇族中的至少一种化合物优选选自：水溶性盐形式的氢化可的松，诸如氢化可的松半琥珀酸酯、氢化可的松琥珀-7 -
酸钠和氢化可的松磷酸钠，其中，在前述组合物中，氢化可的松的盐的浓度在5x10 M至10
6M的范围内，特别是7x10-7M，对于氢化可的松半琥珀酸酯为350ng/mL，以氢化可的松基本结构表示。
4.根据权利要求1、2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括至少一种选自以下盐的水合形式或无水形式的锌盐：氯化锌，硫酸锌，葡萄糖酸锌，吡啶甲酸锌，柠檬酸锌，乙酸锌，乳酸锌，硬脂酸锌，优选为诸如硫酸锌或氯化锌的水溶性盐。
5.根据权利要求1的组合物，其特征在于，所述组合物是冻干物的形式。
6.根据权利要1-5任一项所述的组合物作为效应佐剂用于制备培养基的用途，可选地在卵泡或精子解冻后，所述培养基用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，所述体外培养的培养基包含权利要求1-5中任一项的组合物，所述组合物与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液混合，所述成分特别地选自人或牛血清蛋白，可选地重组的人或牛血清蛋白，和/或无机盐，和/或诸如葡萄糖、丙酮酸盐、柠檬酸盐和乳酸盐的高能分子，和/或用于蛋白质生物合成的氨基酸，和/或用于核酸的生物合成的嘌呤和嘧啶碱基，和/或用于形成细胞膜的磷脂或胆固醇，和/或维生素，诸如包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素B12的B族维生素和/或维生素C和/或维生素E，和可选的胰岛素和/或特别是选自GM-CSF，IGF-1，IGF-
2，EGF，TGF或LIF，优选GM-CSF的一种或多种生长因子，和/或至少一种抗生素。
7.一种培养基，可选地在卵泡或精子解冻后，所述培养基用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，所述用于体外培养的培养基是通过将根据权利要求1-5中任一项的液体、粉末或冻干物形式的组合物与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液相结合的方法而获得的，所述成分尤其选自权利要求
6所述的成分。
8.一种培养基，可选地在卵泡或精子解冻后，所述培养基用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎培养，所述培养基的特征在于，它们包含根据权利要求1-5任一项所述的组合物的组成成分，并组合有根据权利要求6限定的在体外受精或卵泡、精子或胚胎培养中常用的成分。
9.一种使哺乳动物的正在发育的卵泡成熟以使所述卵泡更特别是人卵泡中的卵母细胞成熟的体外方法，可选地在对先前冷冻的卵泡解冻之后，其特征在于，所述方法包括在根据权利要求8所述的培养基中体外培养取自雌性、更特别是取自女性的卵泡的步骤，有利地培养约24小时至48小时。
10.用于特别是在实施根据权利要求9所述的方法的情况下临时制备根据权利要求8所述的培养基的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
-根据权利要求1-5中任一项所述的液体，粉末或冻干物形式的组合物；
-在权利要求6中限定的包括在卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液。
特别是用于体外受精或用于卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的细
胞培养基的无细胞因子的佐剂
技术领域
[0001] 本发明的主题是一种组合物，其用作细胞培养基的佐剂或“增强剂”，可选地在卵泡或精子解冻之后，特别是用于正在发育的卵泡或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，以及用于体外受精(IVF)以及胚胎发育，并且通常用于包括人类的哺乳动物。
背景技术
[0002] 在现有技术中描述了用于卵泡或雄性生殖细胞系的细胞的体外培养，以及用于卵母细胞受精和胚胎发育的组合物。在这些例子的一些中，组合物包含一种或多种生长因子。
[0004] 在欧洲专利EP1 176 190中描述了用于卵泡或胚胎体外培养的组合物，其特征在于，它们包括至少两种生长因子和参与哺乳动物能量产生的皮质类固醇族的至少一种化合物的组合，以及在适当的情况下(即可选地)与至少一种能量代谢关键辅酶的组合，例如NAD/NADH和NADP/NADPH。
发明内容
[0005] 本发明是由发明人对组合物的论证而得出，所述组合物可用作佐剂，用于卵泡或雄性生殖细胞系的培养，用于卵母细胞的受精和胚胎的直到胚泡阶段的发育，并且当所述组合物与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液混合时，与目前市场上使用的组合物相比，能够提高产量，这些新的组合物的特征尤其在于它们不包括细胞因子。
[0006] 因此，本发明的主题是所有可能形式的组合物，特别是液体、粉末或冻干物形式的组合物，可选地在卵泡或精子解冻后，用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，所述组合物的特征在于它们包含：选自由以下组成的组的至少两种化合物：
-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，特别是浓度为0.1至3μg/mL，优选浓度为0.5至1.5μg/mL，以锌元素表示，
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇(myo-
inositol)，或其磷酸盐形式，优选为三磷酸肌醇，特别是盐形式，特别是浓度为1.8至18mg/mL，优选为5至10mg/mL，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是浓度为0.1至
2mg/mL，优选0.5至1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，特别是浓度为10-11至10-5M，优选10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，胱氨酸衍生物，优选乙酰胱氨酸(acetylcystine)，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选为乙酰半胱胺，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基本结构表示，
以及，可选地，
一种或多种选自皮质类固醇族化合物的化合物
和/或
一种或多种能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且所述组合物不含细胞因子。
-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，特别是浓度为0.1至3μg/mL，优选浓度为0.5至1.5μg/mL，以锌元素表示，
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇(myo-
inositol)，或其磷酸盐形式，优选为三磷酸肌醇，特别是盐形式，特别是浓度为1.8至18mg/mL，优选为5至10mg/mL，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是浓度为0.1至
2mg/mL，优选0.5至1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，特别是浓度为10-11至10-5M，优选10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，胱氨酸衍生物，优选乙酰胱氨酸(acetylcystine)，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选为乙酰半胱胺，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基本结构表示，
以及，可选地，
一种或多种选自皮质类固醇族化合物的化合物
和/或
一种或多种能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且所述组合物不含细胞因子。
[0007] 本发明的另一主题是所有可能形式的组合物，特别是液体、粉末或冻干物形式的组合物，可选地在卵泡或精子解冻后，用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，所述组合物的特征在于它们包含：选自由以下组成的组的至少两种化合物或至少三种化合物：
-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇，或其磷酸盐形式，最好是三磷酸肌醇，特别是盐形式，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，乙酰胱氨酸胱氨酸衍生物，优选乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选为乙酰半胱胺，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，一种或多种选自皮质类固醇族化合物的化合物
并且，可选地，
一种或多种能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且其中所述组合物不含细胞因子。
-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇，或其磷酸盐形式，最好是三磷酸肌醇，特别是盐形式，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，乙酰胱氨酸胱氨酸衍生物，优选乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选为乙酰半胱胺，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，一种或多种选自皮质类固醇族化合物的化合物
并且，可选地，
一种或多种能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且其中所述组合物不含细胞因子。
[0008] 本发明的组合物可以看作与佐剂、补充剂或“增强剂”相似。这些是当与其他成分组合时能够获得培养基的组合物。
[0009] 在本发明的组合物中，锌盐的浓度对应于每体积中的锌元素的量。
[0010] 优选地，锌盐在上述的本发明的组合物中的浓度是0.1μg/mL至3μg/mL，优选为0.5μg/mL至1.5μg/mL，以锌元素表示(以锌元素计量)。
[0011] 在本发明的前述组合物中的元素锌的浓度特别是0.1；0.2；0.3；0.4；0.5；0.6；0.7；0.8；0.9；1.0；1.1；1.2；1.3；1.4；1.5；2；2.5或3μg/mL。
[0012] 在本发明的组合物中，肌醇可以特别是以肌醇的磷酸酯衍生物为形式存在，例如肌醇单、二或三磷酸，或者以盐为形式存在。指示的肌醇浓度对应于每体积中肌醇的量。
[0013] 优选地，本发明前述组合物中的肌醇浓度为1.8mg/mL至18mg/mL，优选为5至10mg/mL。
[0014] 在本发明的前述组合物中肌醇的浓度特别是1.8；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17或18mg/mL。
[0015] 在本发明的组合物中，肉碱为左旋对映体形式，并且肉碱浓度对应于每体积的基本结构体(base)的量。
[0016] 优选地，本发明前述组合物中的肉碱的浓度为0.1mg/mL至2mg/mL，优选为0.5mg/mL至1mg/mL。
[0017] 本发明的前述组合物中的肉碱的浓度特别是0.1；0.2；0.3；0.4；0.5；0.6；0.7；0.8；0.9；1.0；1.1；1.2；1.3；1.4；1.5；1.6；1.7；1.8；1.9或2.0mg/mL。
[0018] 在本发明的组合物中，褪黑激素是褪黑激素的盐或溶剂化物的形式。
[0020] 溶剂化物的实例包括水合物和醇化物。
[0021] 褪黑激素类似物包括生物活性产品，所述生物活性产品的化学式源自褪黑激素。
[0022] 褪黑激素的类似物在例如WO 1989/001472，WO 2002/024181，EP 0820768，EP 1476152中也有描述。
[0023] 优选地，在本发明的组合物中，褪黑激素的浓度在10-11到10-5M之间，更优选地在10-10到10-6M之间，并且特别地在10-9到10-7M之间，浓度以褪黑激素的基本结构来表示。
[0024] 在本发明的上述组合物中表示为褪黑激素的浓度特别是约为10-11，5x10-11，10-10，5x10-10，10-9，5x10-9，10-8，5x10-8，10-7，5x10-7，10-6，5x10-6或10-5M。
[0025] 通过二硫键连接以形成胱氨酸分子的两个半胱氨酸分子中的每一个可以是右旋或左旋形式。
[0026] 可能的立体异构体可用于实施本发明。左旋胱氨酸形式是优选的形式。
[0027] 能够与诸如盐酸或硫酸的无机酸形成胱氨酸盐。
[0028] 在胱氨酸衍生物中，可以提及乙酰胱氨酸。
[0029] 优选地，在本发明的组合物中，胱氨酸的浓度是20至100μg/mL之间的胱氨酸，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示。
[0030] 在本发明的前述组合物中的胱氨酸的浓度特别是20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100μg/mL。
[0031] 能够与诸如盐酸或硫酸的无机酸形成半胱胺盐。
[0032] 在半胱胺衍生物中，可以提及乙酰半胱胺。
[0033] 优选地，在本发明的组合物中，半胱胺的浓度在1.5至15μg/m1之间，优选地在4至12μg/mL之间，以半胱胺基表示。
[0034] 本发明的前述组合物中的半胱胺的浓度特别是1.5；2；2.5；3；3.5；4；4.5；5；5.5；6；6.5；7；7.5；8；8.5；9；9.5；10；10.5；11；11.5；12；12.5；13；13.5；14；14.5或15μg/mL.[0035] 本发明更特别地涉及上述的可选地在卵泡或精子解冻之后用于体外培养正在发育中的卵泡以使所述卵泡中所含卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎培养的组合物。
[0036] 本发明的组合物为生长和分化细胞提供调节分子。
[0037] 因此，这些组合物能够使哺乳动物卵母细胞、特别是人类未成熟卵母细胞成熟，以及使雄性生殖细胞系的细胞成熟。它们也能够保证哺乳动物的胚胎、特别是人类胚胎直到胚泡阶段的发育，与较低的发育阶段相比，该阶段在子宫内的植入率更高。
[0038] 有利地，本发明的组合物包括以下浓度的活性成分：-特别是以氯化锌或硫酸锌为形式的锌的浓度大致为1μg/mL，以锌元素表示，
-特别是以顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇为形式的肌醇的浓度大致为5mg/mL，以肌醇表示，
-特别是以基本结构(base，或基团)或盐酸盐为形式的左旋肉碱的浓度约为0.6mg/mL，以肉碱基本结构(carnitine base，或肉碱基)表示，
-7
-褪黑激素基本结构(melatonin base，或褪黑激素基)的浓度大致为10 M,
-特别是以左旋胱氨酸且更特别是左旋胱氨酸盐酸盐为形式的胱氨酸的浓度大致为50μg/mL，以胱氨酸基本结构(cystine base，或胱氨酸基)表示，
-特别是以盐酸盐为形式的半胱胺的浓度大致为8μg/mL，以半胱胺基本结构
(cysteamine base，或半胱胺基)表示，
-特别是以顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇为形式的肌醇的浓度大致为5mg/mL，以肌醇表示，
-特别是以基本结构(base，或基团)或盐酸盐为形式的左旋肉碱的浓度约为0.6mg/mL，以肉碱基本结构(carnitine base，或肉碱基)表示，
-7
-褪黑激素基本结构(melatonin base，或褪黑激素基)的浓度大致为10 M,
-特别是以左旋胱氨酸且更特别是左旋胱氨酸盐酸盐为形式的胱氨酸的浓度大致为50μg/mL，以胱氨酸基本结构(cystine base，或胱氨酸基)表示，
-特别是以盐酸盐为形式的半胱胺的浓度大致为8μg/mL，以半胱胺基本结构
(cysteamine base，或半胱胺基)表示，
[0039] 有利地，根据本发明的组合物的特征在于它们包括选自由以下组成的组的至少三种化合物：-锌盐，优选为水溶性盐，例如氯化锌或硫酸锌，特别是浓度为0.1至3μg/mL，优选浓度为0.5至1.5μg/mL，以锌元素表示，
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇(myo-
Inositol)，或其磷酸盐形式，优选为三磷酸肌醇，特别是盐形式，特别是浓度为1.8至18mg/mL，优选为5至10mg/mL，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是浓度为0.1至
2mg/mL，优选0.5至1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，特别是浓度为10-11至10-5M，优选10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，胱氨酸衍生物，乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选乙酰半胱胺或半胱胺衍生物的盐，优选呈盐酸盐形式，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基表示。
-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇(myo-
Inositol)，或其磷酸盐形式，优选为三磷酸肌醇，特别是盐形式，特别是浓度为1.8至18mg/mL，优选为5至10mg/mL，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是浓度为0.1至
2mg/mL，优选0.5至1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，特别是浓度为10-11至10-5M，优选10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，胱氨酸衍生物，乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，半胱胺衍生物，优选乙酰半胱胺或半胱胺衍生物的盐，优选呈盐酸盐形式，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基表示。
[0040] 有利地，根据本发明的组合物的特征在于，它们包含在本申请中针对上述组中提及的每种化合物优选指出的量，即锌盐，可选地以磷酸盐为形式的顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇，可选地以盐酸盐为形式的左旋肉碱或乙酰肉碱，褪黑激素，可选地以盐酸盐为形式的左旋胱氨酸或乙酰胱氨酸，和以盐酸盐为形式的半胱胺或乙酰半胱胺。
[0041] 根据本发明的组合物的优选形式包括约1μg/mL的锌，5mg/mL的肌醇，0.6mg/mL的左旋肉碱基本结构，10-7M的褪黑激素基本结构，50μg/mL的左旋胱氨酸基本结构和可能的8μg/mL的半胱胺基本结构。
[0042] 本发明的主题还是上述用于体外培养的组合物，其包括至少一种皮质类固醇族的化合物，优选为水溶性盐形式的氢化可的松，如氢化可的松半琥珀酸酯或氢化可的松琥珀酸钠和氢化可的松磷酸钠。优选地，在上述组合物中，氢化可的松盐的浓度在5x 10-7M至10-6M的范围内，并且特别是7x 10-7M，即氢化可的松半琥珀酸酯的含量约为350ng/mL，以氢化可的松基本结构表示。
[0043] 本发明的主题还是上述用于体外培养的组合物，其包含至少一种选自以下盐的水合形式或无水形式的锌盐：氯化锌，硫酸锌，葡萄糖酸锌，吡啶甲酸锌，柠檬酸锌，乙酸锌，乳酸锌，硬脂酸锌，优选为诸如硫酸锌或氯化锌的水溶性盐。
[0044] 有利地，上述组合物包含上述能量代谢的关键辅酶，特别是在以下浓度下：-NAD/NADH的浓度大致为1μg/mL，
-NADP/NADPH的浓度大致为1μg/mL。
-NADP/NADPH的浓度大致为1μg/mL。
[0045] 本发明的主题还是上述用于体外培养的组合物，其包括选自由以下组成的组的至少两种化合物：-选自硫酸锌或氯化锌的锌的水溶性盐和/或顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇和/或褪黑激素和/或左旋肉碱或左旋肉碱盐酸盐和/或左旋胱氨酸或左旋胱氨酸盐酸盐和/或左旋半胱胺或左旋半胱胺盐酸盐以及
-氢化可的松半琥珀酸酯，和可选地
-NAD/NADH和/或NADP/NADPH。
-氢化可的松半琥珀酸酯，和可选地
-NAD/NADH和/或NADP/NADPH。
[0046] 本发明尤其涉及冻干物形式的上述定义的组合物，即其不同成分处于干燥状态并能够重新变为溶液状态同时保持其物理化学和生物性质的组合物形式。
[0047] 这样，本发明更特别地涉及一种上述的冻干物，包括：选自由以下组成的组的至少两种化合物：
-特别是处于0.1至3μg/mL浓度的锌盐，优选处于0.5至1.5μg/mL浓度，以锌元素表示，-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇，特别是处于
1.8至18mg/mL的浓度，优选处于5至10mg/mL的浓度，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的盐，特别是浓度为0.1至2mg/mL，优选0.5至
1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，特别是浓度为10-11至10-5M，优选10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，乙酰胱氨酸胱氨酸衍生物优选乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，和/或
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，优选为乙酰半胱胺的半胱胺衍生物，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基本结构表示，
和
-以上定义的皮质类固醇族的至少一种化合物，例如氢化可的松半琥珀酸酯，
-并且可选地在适当的情况下，或至少一种以上定义的能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且组合物为冻干形式，其特征在于所述组合物不含细胞因子。
-特别是处于0.1至3μg/mL浓度的锌盐，优选处于0.5至1.5μg/mL浓度，以锌元素表示，-以任一立体异构为形式的肌醇，优选为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇，特别是处于
1.8至18mg/mL的浓度，优选处于5至10mg/mL的浓度，以肌醇表示，
-以立体异构体中的一种为形式的肉碱，优选左旋肉碱，肉碱的优选为盐酸盐的盐，肉碱衍生物，优选为乙酰肉碱，或肉碱衍生物的盐，特别是浓度为0.1至2mg/mL，优选0.5至
1mg/mL，以肉碱基本结构表示，
-褪黑激素或类似物，褪黑激素可接受的盐或溶剂化物，特别是浓度为10-11至10-5M，优选10-10至10-6M，特别是10-9至10-7M，以褪黑激素基本结构表示，
-以立体异构体中的一种为形式的胱氨酸，优选左旋胱氨酸，胱氨酸的优选为盐酸盐的盐，乙酰胱氨酸胱氨酸衍生物优选乙酰胱氨酸，或胱氨酸衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是胱氨酸的浓度为20至100μg/mL，优选35至60μg/mL，以胱氨酸基本结构表示，和/或
-半胱胺，半胱胺盐，优选盐酸盐，优选为乙酰半胱胺的半胱胺衍生物，或半胱胺衍生物的优选为盐酸盐形式的盐，特别是半胱胺的浓度为1.5至15μg/mL，优选为4至12μg/mL，以半胱胺基本结构表示，
和
-以上定义的皮质类固醇族的至少一种化合物，例如氢化可的松半琥珀酸酯，
-并且可选地在适当的情况下，或至少一种以上定义的能量代谢的关键辅酶，例如NAD/NADH和NADP/NADPH，
并且组合物为冻干形式，其特征在于所述组合物不含细胞因子。
[0048] 本发明的主题还是上述组合物或冻干物作为效应佐剂的应用，可选地在解冻卵泡或雄性配子之后，用于制备培养基，该培养基用于体外培养正在发育的卵泡来使所述卵泡中所含的卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎培养，所述体外培养基包括上述定义的组合物，并混合或组合有包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液。所述成分是本领域技术人员已知的。它们可能尤其选自人或牛血清蛋白，可选的重组的人或牛血清蛋白，和/或诸如KCl、NaCl、MgSO4、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4的无机盐，和/或诸如葡萄糖、丙酮酸、柠檬酸和乳酸的高能分子，和/或用于蛋白质生物合成的氨基酸，和/或用于核酸的生物合成的嘌呤和嘧啶碱基，和/或用于形成细胞膜的磷脂或胆固醇，和/或维生素，诸如包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素B12的B族维生素和/或维生素C和/或维生素E，和可选地胰岛素和/或可选地有助于培养基的制备过程的至少一种其他物质，特别是一种或多种特别是选自GM-CSF，IGF-1，IGF-2，EGF，TGF或LIF的生长因子，优选GM-CSF，和/或至少一种抗生素。
[0049] 在下文中，表述“混合”是指在将本发明的组合物倒入包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液中仅形成作为最终培养基的一种溶液；而表述“组合”是指两种制剂，即本发明的组合物和水溶液一起存在于例如试剂盒中，但是在使用之前不会被混合。
[0050] 本发明还涉及制备上述用于体外培养的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括使根据本发明的作为佐剂、补充剂或“增强剂”的组合物(如果以粉末或冻干粉形式存在，则在将本发明的所述组合物溶于合适的液体后，如果合适的话)与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分(如上定义)的溶液混合的步骤。
[0051] 合适的液体可以是例如蒸馏水，生理盐水，重组或非重组的牛或人血清蛋白，这些不同成分的混合物或常用的培养基。
[0052] 本发明还涉及一种培养基，可选地在卵泡或精子解冻后，用于体外培养正在发育中的卵泡以使所述卵泡中所含卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎发育，所述用于体外培养的培养基是通过将液体、粉末或冻干物形式的本发明的组合物与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液结合的方法获得的，上文中指出了所述成分的非限制性列表。
[0053] 如在上述改进中所显示的，根据本发明的组合物主要是佐剂或“补充剂”或“增强剂”，其原则上不旨在单独用作培养基。它们主要旨在与包括在体外受精中常用的成分的水溶液混合。这些成分的非详尽列表已在前文中指出。
[0054] 这些水溶液可由用于体外培养的培养基构成，该培养基可以照原样使用，但添加根据本发明的佐剂、补充剂或“增强剂”能够改善性能。因此，这些水溶液可以是商业培养基，例如以诸如G1，G2，EmbryoGen，BlastoGen，Ferticult和HTF的名称销售的那些。
[0055] 包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液也可能是本领域生物学家制备的潜在培养基，添加根据本发明的佐剂、补充剂或“增强剂”可以如上所述以及如以下具体实施方式部分所述改善性能和效率。
[0056] 本发明更尤其涉及一种培养基，可选地在卵泡或精子解冻后，用于正在发育中的卵泡的体外培养，或用于所述卵泡中所含卵母细胞的成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞的成熟，用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎培养，所述培养基的特征在于，它们包含如上定义的本发明的组合物的组成成分，并组合或混合有前述限定的在体外受精或卵泡、精子或胚胎培养中常用的上述成分。
[0057] 本发明的主题还是一种使哺乳动物的正在发育的卵泡成熟使所述卵泡(更特别是人卵泡)中的卵母细胞成熟的方法，在适当的情况下在对先前冷冻的卵泡解冻之后，其特征在于，所述方法包括在根据本发明的如上定义的培养基中体外培养取自于雌性、更特别是取自于女性的卵泡的步骤，有利地培养约24小时至48小时。
[0058] 本发明还涉及一种用于哺乳动物、更特别的是人的雄性生殖细胞系的细胞的成熟的方法，在适当的情况下在对先前冷冻的细胞解冻之后，其特征在于，所述方法包括在根据本发明的如上定义的培养基中体外培养所述细胞的步骤，特别是培养数天，有利地是1至5天。
[0059] 本发明的主题还是一种在适当的情况下在对先前冷冻的精子解冻之后，通过精子使卵母细胞体外受精、特别是人类来源的精子和卵母细胞体外受精的方法，其特征在于，所述方法包括在根据本发明的如上定义的培养基中体外培养上述卵母细胞和精子的步骤，有利地培养约1天至约2天。
[0060] 本发明还涉及一种用于发育哺乳动物的胚胎、特别是人类胚胎的方法，其特征在于，所述方法包括在根据本发明的如上定义的培养基中体外培养所述胚胎的步骤，优选地在体外受精后的5至6天内进行体外培养，有利地获得胚泡阶段的胚胎。
[0061] 以非限制性方式，本发明特别涉及如上所定义的方法，其中哺乳动物可以选自灵长类动物，包括人，绵羊，牛，猪以及正在消亡的动物物种。
[0062] 有利地，本发明的组合物能够在可选地卵泡或精子解冻之后同时用于卵泡或雄性生殖细胞系的细胞的成熟，用于卵母细胞的体外受精以及用于由所述受精产生的胚胎的成熟，特别是直到胚泡阶段。
[0063] 本发明的主题也涉及一种尤其是在实施上述方法的情况下用于临时制备根据本发明的以上定义的培养基的试剂盒(或工具包)，该试剂盒包括：-根据本发明的组合物，可选地以冻干物的形式，和
-如上定义的包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液，特别是市售培养基。
-如上定义的包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的水溶液，特别是市售培养基。
[0064] 将通过以下对根据本发明制备的培养基的实施例的详细描述来进一步说明本发明。
[0065] 正像如上定义的水溶液，由根据本发明的组合物制备的培养基可以主要包括选自以下的化合物：诸如KCl、NaCl、MgSO4、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4的无机盐；必需氨基酸以及诸如谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸、半胱氨酸和谷氨酰胺的其他氨基酸；诸如葡萄糖、丙酮酸、乳酸、乙酸盐的糖和代谢衍生物；特别是维生素B族和维生素C的维生素；嘌呤和嘧啶碱基；白蛋白；磷脂；胆固醇；胰岛素和/或至少一种有助于该过程的物质，特别是生长因子；诸如青霉素G、链霉素、庆大霉素或其他氨基糖苷的抗生素。
[0066] 能够以各种形式(液体，粉末或冻干物)存在的本发明，能够在调节之前，与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的液体溶液混合，因此，该溶液本身可以是即用型的培养基。从混合物得到的改进的培养基将旨在于在可选地卵泡或精子解冻之后用于培养正在发育的卵泡来使卵母细胞成熟，或用于雄性生殖细胞系的细胞成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎培养。根据本发明的组合物也可以临时与包括在体外受精或卵泡、精子或胚胎的培养中常用的成分的液体溶液混合。由此得到的溶液即为培养基。
具体实施方式
[0067] 下文描述了可用于制备培养基的本发明的效应佐剂的组合物配方，可选地在卵泡或精子解冻之后，所述培养基用于体外培养正在发育的卵泡来使卵泡中的卵母细胞成熟，或用于所述雄性生殖细胞系的细胞的成熟，或用于通过精子使卵母细胞体外受精，或用于胚胎的培养。
[0068] 在以下的所有实验中，活性成分最终以以下浓度使用：-以元素表示的锌＝1μg/mL
-以分子表示的肌醇＝5mg/mL
-以基本结构表示的左旋肉碱＝0.6mg/mL
-以基本结构表示的褪黑激素＝10-7M
-以基本结构表示的胱氨酸＝50μg/mL
-以基本结构表示的半胱胺＝8μg/mL
-以基本结构表示的氢化可的松＝7x10-7M
-以分子表示的肌醇＝5mg/mL
-以基本结构表示的左旋肉碱＝0.6mg/mL
-以基本结构表示的褪黑激素＝10-7M
-以基本结构表示的胱氨酸＝50μg/mL
-以基本结构表示的半胱胺＝8μg/mL
-以基本结构表示的氢化可的松＝7x10-7M
[0069] 我们选择预先制备浓度比上述浓度高10倍的组合物。因此，在实施用于其应用的方法时，应将这些溶液在普通培养基中按十分之一的比例临时稀释。
[0070] 所有操作均在无菌原料和无菌培养基中进行。组合物1
[0071] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐和褪黑激素的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素和10-6M的褪黑激素。
[0072] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物2
[0073] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐、肌醇和褪黑激素的组合物混合而临-6时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素、50mg的肌醇和10 M的褪黑激素。
[0074] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物3
[0075] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐、肌醇、褪黑激素和胱氨酸的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素、50mg的肌醇、10-6M的褪黑激素和0.5mg的胱氨酸基本结构。
[0076] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物4
[0077] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐、肌醇、褪黑激素、胱氨酸和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素、50mg的肌醇、10-6M的褪黑激素、0.5mg的胱氨酸基本结构和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0078] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物5
[0079] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐、肌醇、褪黑激素、胱氨酸、半胱胺和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素、50mg的肌醇、10-6M的褪黑激素、0.5mg的胱氨酸基本结构、80μg的半胱胺基本结构和6mg的肉碱基本结构。
[0080] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物6
[0081] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐、肌醇和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素、50mg的肌醇和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0082] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物7
[0083] 通过将一种培养基与根据本发明的包含肌醇、褪黑激素和胱氨酸的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含50mg肌醇、10-6M的褪黑激素和0.5mg的胱氨酸基本结构。
[0084] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物8
[0085] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐、肌醇、褪黑激素和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素、50mg肌醇、10-6M的褪黑激素和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0086] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物9
[0087] 通过将一种培养基与根据本发明的包含肌醇、褪黑激素、胱氨酸和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含50mg的肌醇、10-6M的褪黑激素、0.5mg的胱氨酸基本结构和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0088] 在实施方法，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物10
[0089] 通过将一种培养基与根据本发明的包含氢化可的松盐、锌盐和褪黑激素的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含7x10-6M的氢化可的松、10μg的锌元素和10-6M的褪黑激素。
[0090] 在实现方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物11
[0091] 通过将一种培养基与根据本发明的包含氢化可的松盐、锌盐、肌醇和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含7x10-6M的氢化可的松、10μg的锌元素、50mg的肌醇和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0092] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物12
[0093] 通过将一种培养基与根据本发明的包含氢化可的松盐、锌盐和肌醇的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含7x10-6M的氢化可的松、10μg的锌元素和50mg的肌醇。
[0094] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物13
[0095] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐和肌醇的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素和50mg的肌醇。
[0096] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物14
[0097] 通过将一种培养基与根据本发明的包含氢化可的松盐、锌盐和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含7x10-6M的氢化可的松、10μg的锌元素和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0098] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物15
[0099] 通过将一种培养基与根据本发明的包含锌盐和肉碱的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含10μg的锌元素和6mg的左旋肉碱基本结构。
[0100] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物16
[0101] 通过将一种培养基与根据本发明的包含氢化可的松盐、肌醇和胱氨酸的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含7x10-6M的氢化可的松、50mg肌醇和0.5mg的胱氨酸基本结构。
[0102] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。组合物17
[0103] 通过将一种培养基与根据本发明的包含肌醇和胱氨酸的组合物混合而临时制备的溶液分配在1mL烧瓶中，使得每个烧瓶包含50mg肌醇和0.5mg的胱氨酸基本结构。
[0104] 在实施方法时，该溶液应在培养基中按十分之一的比例稀释。
[0106] 根据卵母细胞成熟的阶段，在补充了两种或更多种物质的常规的体外成熟的培养基中培养“生发泡阶段的卵母细胞”或“中期I阶段的卵母细胞”。测试1a)生发泡(VG)阶段的卵母细胞
[0107] 确定进化到中期I(MI)或中期II(MII)阶段的VG卵母细胞的数量。
[0108] 在该实验中，使用了10组。组1(控制组)，VG卵母细胞放置在仅包含培养基的孔中。
组2，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素和锌的组合物的孔中。
组3，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌和肌醇的组合物的孔中。
组4，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌、肌醇和胱氨酸的组合物的孔中。
组5，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌、肌醇、胱氨酸、半胱胺和肉碱的组合物的孔中。
组6，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌和氢化可的松的组合物的孔中。
组7，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌和肌醇的组合物的孔中。
组8，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌、肌醇和氢化可的松的组合物的孔中。
组9，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌和肉碱的组合物的孔中。
组10，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌、肉碱和氢化可的松的组合物的孔中。
组2，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素和锌的组合物的孔中。
组3，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌和肌醇的组合物的孔中。
组4，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌、肌醇和胱氨酸的组合物的孔中。
组5，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌、肌醇、胱氨酸、半胱胺和肉碱的组合物的孔中。
组6，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含褪黑激素、锌和氢化可的松的组合物的孔中。
组7，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌和肌醇的组合物的孔中。
组8，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌、肌醇和氢化可的松的组合物的孔中。
组9，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌和肉碱的组合物的孔中。
组10，VG卵母细胞放置在包含培养基和根据本发明的包含锌、肉碱和氢化可的松的组合物的孔中。
[0109] 将不同组的卵母细胞放在同一烘箱中在37℃下、在包含5％的CO2的气氛中培养。结果
[0110] 证实，相对于仅在培养基中培养的VG卵母细胞，根据本发明的包含诸如氢化可的松、锌、肌醇、肉碱、褪黑激素、胱氨酸和/或半胱胺的物质的组合物的添加使得VG卵母细胞在培养24小时和48小时结束时MI和MII阶段的成熟得到改善。测试1b)中期I阶段的卵母细胞
[0111] 在该实验中，确定进化到MII的卵母细胞的数量。通过选择MI阶段的卵母细胞，使用与上述相同的方案。结果
[0112] 证实，根据本发明的组合物的添加使得MI卵母细胞进化到MII阶段的成熟在根据本发明的包含诸如氢化可的松、锌、肌醇、肉碱、褪黑激素、胱氨酸和/或半胱胺的物质的组合物的存在下得到改善。
[0113] 在两个提及的实验中，还证实了与不存在氢化可的松相比，氢化可的松的添加使得卵母细胞成熟得到改善。测试2)体外受精
[0114] 为了评估包含在根据本发明的组合物中的各种物质(氢化可的松、锌、肌醇、左旋肉碱、褪黑激素、胱氨酸和半胱胺)对于体外受精的影响，各实验在哺乳动物中进行。
[0115] 为此，选择最成熟的卵和最好的精子以促进受精，并评估培养48小时后形成的胚胎数量。
[0116] 如同体外成熟的评估，在该试验中使用了10组。
[0117] 在每个组中，将成熟的卵母细胞放置在存在有约106只有活力的精子、根据先前的相同的方案加入有根据本发明的包含如氢化可的松、锌、肌醇、肉碱、褪黑激素、胱氨酸和/或半胱胺的物质的组合物的培养基中。结果
[0118] 证实，相对于存在于只有培养基中的卵子的组，将根据本发明的包含诸如氢化可的松、锌、肌醇、肉碱、褪黑激素、胱氨酸和/或半胱胺的物质的组合物添加到培养基中会提高受精卵的百分比。
[0119] 还证实了与不存在氢化可的松相比，氢化可的松的添加使得受精结果得到改善。测试3)早期胚胎发育
[0120] 为了评估根据本发明的包含诸如氢化可的松、锌、肌醇、肉碱、褪黑激素、胱氨酸和/或半胱胺的物质的组合物对早期胚胎发育的影响，可以使用小鼠CF-1株，因为在普通培养基中进化到胚泡阶段的胚胎数量很少。该模型可以评估这些物质对早期胚胎发育的有益作用。
[0121] 在该实验中，使用相同的方案在不同条件下培养10组胚胎。结果
[0122] 证实，相对于仅包含培养基的组，根据本发明的包含诸如氢化可的松、锌、肌醇、肉碱、褪黑激素、胱氨酸和/或半胱胺的物质的组合物的添加使得胚胎在不同阶段的发育得到改善。
[0123] 还证实了与不存在氢化可的松相比，氢化可的松的添加使得早期胚胎发育得到改善。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 体外受精及胚胎移植信息核对方法 | 2020-05-19 | 839 |
| 牛体外受精胚胎培养的方法 | 2020-05-15 | 617 |
| 体外受精培养筛及体外受精方法 | 2020-05-11 | 996 |
| 用于体外受精的组合物 | 2020-05-12 | 401 |
| 一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法 | 2020-05-20 | 300 |
| 幼畜卵母细胞体外两次受精方法 | 2020-05-18 | 607 |
| 一种牛体外受精囊胚双重染色的方法 | 2020-05-18 | 441 |
| 牛体外受精胚胎培养液和培养方法 | 2020-05-19 | 593 |
| 体外受精培养筛 | 2020-05-13 | 476 |
| 一种体外受精皿 | 2020-05-13 | 105 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈