PAC1受体激动剂(MAXCAP)及其用途
[0002] 本申请要求2017年1月5日提交的USSN 62/442,906的权益和优先权，所述文献出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
[0004] 此项研究工作获得美国退伍军人事务部的支持，并且联邦政府对于本
发明享有一定的权利。
背景技术
[0005] 垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)是27或38个
氨基酸的肽。PACAP的一级序列与其最接近的
激素相关物VIP有68％相同。PACAP和VIP以相同的亲和
力结合VPAC1和VPAC2受体，但只有PACAP以1000倍的亲和力结合PAC1受体。PACAP和PAC1免疫
反应性在位于胃肠道肌肉层中的肌间神经节和神经
纤维中表现出类似的分布模式。人PACAP基因(ADCYAP1)
定位于
染色体18p11.32。PACAP的高亲和力受体PAC1R定位于人的染色体7p14。
[0006] PACAP广泛分布于脑和外周器官中，特别是内分泌胰腺、生殖腺、
呼吸道和泌尿生殖道中。PACAP受体的分子克隆已显示存在三种不同的受体亚型：PACAP特异性PAC1-R，其与几种转导系统偶联；以及PACAP/VIP-无差异VPAC1-R和VPAC2-R，它们主要与腺苷酸环化酶偶联。PAC1-R在脑、垂体和肾上腺中尤为丰富，而VPAC受体主要在
肺、肝和睾丸中表达。与PACAP及其受体的广泛分布一致，现已证明该肽发挥大量药理学作用和
生物学功能。
[0007] 已对几种N末端缩短的PACAP27或PACAP38肽至PACAP(9-27)或PACAP(9-38)用作PAC1受体拮抗剂进行了观察，但令人惊讶的是，较短的
片段是激动剂，虽然效力很低(Vandermeers等人(1992)Eur.J.Biochem.208:815-819。其他研究结果表明，PACAP27和PACAP38在用于与PAC1受体产生最大相互作用的4、5、9、11和13位氨基酸的要求方面有所不同(Schafer等人(1999)Regul.Pept.79:83-92)。C末端缩短的PACAP26至PACAP23是具有低效力的完全激动剂，其区分三种PACAP受体亚型，对VPAC1的亲和力最高，对PAC1的亲和力中等，对VPAC2的亲和力最低(Gourlet等人(1996)Regul.Pept.62:125-130.)。麦西迪兰(Maxadilan)是一种61个氨基酸的肽，其是有效的选择性PAC1受体激动剂，其25-41序列的缺失产生了一种强效(Ki＝3.9nM)PAC1受体拮抗剂(称为M65)(Uchida等人(1998)Ann.N.Y.Acad.Sci.865:253-258)。还证明麦西迪兰中24与42位之间缺失19个氨基酸产生了对PAC1受体具有结合力但无功能活性的肽(Moro等人(1999)J.Biol.Chem.274:23103-
23110)。这种被称为[d.24-42]-GS-麦西迪兰的肽是一种有效的PAC1受体拮抗剂，Ki～nM(同上)。不同于与VPAC1和VPAC2受体相互作用的PACAP6-38，[d.24-42]-GS-麦西迪兰似乎对PAC1受体具有高度特异性(同上)。
发明内容
[0008] 在研究PACAP、VIP及其PAC1、VPAC1和VPAC2受体对食欲/饱腹感调节、代谢综合征、
葡萄糖代谢、胰岛素抵抗、糖尿病前期综合征、2型糖尿病(T2D)、慢性
炎症、炎性肠病、
肥胖症和肝脂肪变性的作用的过程中，我们发现特异性地结合并激活PAC1受体的化合物显著增加饱腹感和瘦体量，同时抑制食欲、体脂量和肝脂肪积累、血糖
水平、慢性炎症，改善肝性脂肪变性、非酒精性脂肪性
肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和结肠炎。
[0009] 我们开发了新型特异性PAC1受体激动剂MAXCAP，其可被系统性地吸收以激活PAC1受体。通过鉴定PACAP1-27、PACAP1-38的天然序列的关键氨基酸残基以及纳入来自麦西迪兰肽的氨基酸序列来制备这些新型激动剂。麦西迪兰和PACAP没有结构同源性。在某些实施方案中，这些PAC1受体激动剂利用麦西迪兰肽或其片段(例如，麦西迪兰N末端片段(或其变体))特异性地和排他性地结合PAC1受体和PACAPC末端的片段以激活PAC1
信号传导。不受特定理论的束缚，认为这些PAC1激动剂比天然PACAP1-27和PACAP1-38更耐DPP-IV蛋白酶降解，因此具有更长的
半衰期。
[0010] 因此，本文设想的各种实施方案可包括但不限于以下中的一者或多者：
[0011] 实施方案1：一种PAC1受体激动剂，所述激动剂包含：
[0012] 结合PAC1受体的靶向序列，所述靶向序列连接至激活PAC1信号传导的肽，其中：
[0013] 所述靶向序列包含有效结合PAC1受体的麦西迪兰肽或其片段；并且
[0014] 所述激活PAC1信号传导的肽包含有效激活PAC1的PACAP1-38或其片段，其中所述PACAP1-38或其片段任选地包含氨基酸缺失、插入或取代。
[0015] 实施方案2：如实施方案1所述的PAC1受体激动剂，其中所述PACAP1-38包含在所述PACAP1-38的残基11与12之间的氨基酸插入。
[0016] 实施方案3：根据实施方案1-2中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述PAC1受体激动剂基本上不激活VPAC2受体或PAC2受体。
[0017] 实施方案4：根据实施方案1-2中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述PAC1受体激动剂不激活所述VPAC2受体或所述PAC2受体。
[0018] 实施方案5：根据实施方案1-4中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含在所述PACP1-38肽的残基11与12之间的氨基酸插入。
[0019] 实施方案6：如实施方案5所述的PAC1受体激动剂，其中所述插入是丝氨酸或苏氨酸。
[0020] 实施方案7：根据实施方案1-4中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽不包含在所述PACP肽的残基11与12之间的氨基酸插入。
[0021] 实施方案8：根据实施方案1-7中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含在所述PACP肽的残基12处的R至A突变。
[0022] 实施方案9：根据实施方案1-7中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含在所述PACP肽的残基12处的R至K突变。
[0023] 实施方案10：根据实施方案1-7中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含在所述PACP肽的残基15处的K至A突变。
[0024] 实施方案11：根据实施方案1-4中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含氨基酸序列HSDGIF。
[0025] 实施方案12：如实施方案11所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含氨基酸序列HSDGIFT。
[0026] 实施方案13：如实施方案12所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含氨基酸序列HSDGIFTDSYS RYRKQMAVKKYLAAVL。
[0027] 实施方案14：根据实施方案1-4中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVL。
[0028] 实施方案15：如实施方案7所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:95)、HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKN(SEQ ID NO:96)、HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVK(SEQ ID NO:97)、HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRV(SEQ ID NO:98)、HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQR(SEQ ID NO:
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[0029] 实施方案16：如实施方案5所述的PAC1受体激动剂，其中所述激活PAC1信号传导的肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:131)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:132)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKN(SEQ ID NO:133)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVK(SEQ ID NO:134)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRV(SEQ ID NO:135)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQR(SEQ ID NO:136)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQ(SEQ ID NO:137)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYK(SEQ ID NO:138)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRY(SEQ ID NO:139)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGKR(SEQ ID NO:140)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLGK(SEQ ID NO:141)、HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLG(SEQ ID NO:142)、
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HSDGIFTDSYSSRYR(SEQ ID NO:156)、HSDGIFTDSYSSRY(SEQ ID NO:157)、HSDGIFTDSYSSR(SEQ ID NO:158)和HSDGIFTDSYSS(SEQ ID NO:159)。
[0030] 实施方案17：根据实施方案1-16中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列包含氨基酸序列PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:4)，其中任选地具有一个、两个或三个氨基酸取代。
[0031] 实施方案18：根据实施方案1-16中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列包含氨基酸序列PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:4)。
[0032] 实施方案19：根据实施方案1-16中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列由氨基酸序列PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:4)组成。
[0033] 实施方案20：根据实施方案1-16中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：MKQILLISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:26)、KQILLISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:27)、QILLISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:28)、ILLISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:29)、LLISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:30)、LISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:31)、ISLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:32)、SLVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:33)、LVVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:34)、VVVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:35)、VVLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:36)、VLAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:37)、LAVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:38)、AVFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:39)、VFAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:40)、FAFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:41)、AFNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:42)、FNVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:43)、NVAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:44)、VAEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:45)、AEGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:46)、EGCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:47)、GCDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:48)、CDATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:49)、DATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:50)、ATCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:51)、TCQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:52)、CQFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:53)、QFRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:54)、FRKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:55)、RKAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:56)、KAIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:57)、AIDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:58)、IDDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:59)、DDCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQ ID NO:60)、DCQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQID NO:61)、CQKQAHHSNVLQTSVQTTATFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFSSGK(SEQID NO:
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[0034] 实施方案21：根据实施方案1-16中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列的所述氨基酸序列包含在对应于全长麦西迪兰肽的N45、K49、P43、D38、E50、K53和/或K55中的一者或多者的一个或多个
位置处的突变。
[0035] 实施方案22：如实施方案21所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列包含选自由以下组成的组的一个或多个突变：N45A、K49A、P43A、D38A、E50A、K53A和K55A。
[0036] 实施方案23：根据实施方案1-22中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段经化学方法缀合至所述靶向序列。
[0037] 实施方案24：如实施方案23所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段经化学方法缀合至所述靶向序列的氨基末端。
[0038] 实施方案25：如实施方案23所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段经化学方法缀合至所述靶向序列的羧基末端。
[0039] 实施方案26：根据实施方案23-25中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段通过包含聚乙二醇(PEG)的接头经化学方法缀合至所述靶向序列。
[0040] 实施方案27：根据实施方案23-25中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段通过包含人血清
白蛋白(HSA)的接头经化学方法缀合至所述靶向序列。
[0041] 实施方案28：根据实施方案23-25中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段通过表6中存在的非肽接头经化学方法缀合至所述靶向序列。
[0042] 实施方案29：根据实施方案1-22中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段直接地或通过氨基酸或通过肽接头连接至所述靶向序列，并且所述PAC1受体激动剂是融合肽。
[0043] 实施方案30：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段直接连接至所述靶向序列。
[0044] 实施方案31：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段通过氨基酸连接至所述靶向序列。
[0045] 实施方案32：如实施方案31所述的PAC1受体激动剂，其中所述氨基酸是选自由以下组成的组：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和脯氨酸(P)。
[0046] 实施方案33：如实施方案32所述的PAC1受体激动剂，其中所述氨基酸是丙氨酸。
[0047] 实施方案34：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段通过肽接头连接至所述靶向序列。
[0048] 实施方案35：如实施方案34所述的PAC1受体激动剂，其中所述接头的氨基酸序列包含选自由以下组成的组的序列：GG、PP、GGG、PPP、GGGG、GGGGS和SMDTSQL。
[0049] 实施方案36：如实施方案35所述的PAC1受体激动剂，其中所述肽接头的氨基酸序列包含序列SMDTSQL或由其组成。
[0050] 实施方案37：根据实施方案29-36中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段直接地或通过氨基酸或通过肽接头连接至所述靶向序列的氨基末端。
[0051] 实施方案38：根据实施方案29-36中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述麦西迪兰氨基酸序列的所述片段直接地或通过氨基酸或通过肽接头连接至所述靶向序列的羧基末端。
[0052] 实施方案39：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:5)或由其组成。
[0053] 实施方案40：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFAPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:6)或由其组成。
[0054] 实施方案41：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFT SMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:7)或由其组成。
[0055] 实施方案42：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFTPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:8)或由其组成。
[0056] 实施方案43：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSA PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:9)或由其组成。
[0057] 实施方案44：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSK PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:10)或由其组成。
[0058] 实施方案45：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSRYRA PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:11)或由其组成。
[0059] 实施方案46：如实施方案29所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂的氨基酸序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSRYRK PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK(SEQ ID NO:12)或由其组成。
[0060] 实施方案47：根据实施方案1-46中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述激动剂比天然PACAP1-27和/或PACAP1-38更耐DPP-IV蛋白酶降解。
[0061] 实施方案48：如实施方案1-47所述的PAC1受体激动剂，其中所述PAC1受体激动剂带有一个或多个保护基团。
[0062] 实施方案49：如实施方案48所述的PAC1受体激动剂，其中所述一个或多个保护基团独立地选自由以下组成的组：乙酰基、酰胺、3至20个
碳的烷基、Fmoc、Tboc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴-1-羧基、苄
氧基羰基、氧蒽基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三
甲苯-
2-磺酰基(Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶硫苯基(Npys)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2,6-二氯苄基(2,6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(Boc)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。
[0063] 实施方案50：如实施方案48所述的PAC1受体激动剂，其中所述构建体在羧基和/或氨基末端包含保护基团。
[0064] 实施方案51：如实施方案50所述的PAC1受体激动剂，其中羧基末端是酰胺化的。
[0065] 实施方案52：根据实施方案50-51中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中氨基末端是乙酰化的。
[0066] 实施方案53：根据实施方案1-52中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述PAC1受体激动剂用
聚合物官能化以延长血清半衰期。
[0067] 实施方案54：如实施方案53所述的PAC1受体激动剂，其中所述聚合物包括聚乙二醇和/或
纤维素或改性纤维素。
[0068] 实施方案55：根据实施方案1-54中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列和/或所述激活PAC1信号传导的肽是通过重组表达的。
[0069] 实施方案56：根据实施方案1-55中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述靶向序列和/或所述激活PAC1信号传导的肽是糖基化的。
[0070] 实施方案57：根据实施方案1-56中任一项所述的PAC1受体激动剂，其中所述PAC1受体激动剂当施用给
哺乳动物时，有效
[0071] 降低食欲和/或减轻肥胖症和/或减轻体重；和/或抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或
[0072] 改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或
预防2型糖尿病；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或
[0073] 减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或
[0074] 改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或
[0075] 改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或
[0076] 改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征。
[0077] 实施方案58：一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据实施方案1-57中任一项的PAC1受体激动剂。
[0078] 实施方案59：如实施方案58所述的组合物，其中所述组合物被配制成单位剂量制剂。
[0079] 实施方案60：根据实施方案58-59中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过选自由以下组成的组的形式施用：腹膜内施用、局部施用、口服施用、吸入施用、透皮施用、皮下贮库施用和直肠施用。
[0080] 实施方案61：一种在哺乳动物中执行以下中的一者或多者的方法：
[0081] 降低食欲和/或减轻肥胖症和/或减轻体重；和/或
[0082] 抑制脂肪生成和/或体脂肪积累；和/或
[0083] 减少和/或调节葡萄糖稳态；和/或
[0084] 改善或治愈糖尿病症状；和/或
[0085] 减轻或治愈炎性肠病；和/或
[0087] 改善系统性和器官特异性
自身免疫性疾病的症状，和/或
治疗系统性和器官特异性自身免疫性疾病；和/或
[0088] 减轻或治愈干眼综合征；和/或
[0089] 预防或减轻器官、组织和/或干细胞移植排斥；和/或
[0090] 改善子宫中的胚胎植入以进行
体外受精；和/或
[0091] 改善精子发生和/或男性不育症；和/或
[0092] 改善女性排卵和/或女性生育能力；和/或
[0093] 改善结缔组织炎的一种或多种症状；和/或
[0094] 减缓骨关节炎和/或类
风湿性关节炎和/或
银屑病性关节炎的进展；和/或
[0096] 改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或
[0097] 减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或NASH的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或NASH；和/或
[0098] 改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或
[0099] 改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；
[0100] 和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或
[0101] 改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或
[0102] 减缓肾性高血压和/或慢性肾病的进展，和/或预防和/或逆转肾性高血压和/或慢性肾病；和/或
[0103] 减缓表达PAC1受体的
肿瘤的进展，和/或抑制和/或逆转表达PAC1受体的肿瘤的生长；和/或
[0104] 减缓肥大细胞和/或嗜
碱性粒细胞脱粒和过敏介质释放的进展，和/或预防和/或逆转肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞脱粒和过敏介质释放；和/或
[0105] 改善囊性纤维化的症状，和/或治疗囊性纤维化；和/或
[0106] 改善
乳糜泻的症状，和/或治疗乳糜泻；和/或
[0107] 减缓精神分裂性障碍和偏执性
精神障碍的进展，和/或预防和/或逆转精神分裂性障碍和偏执性精神障碍；和/或
[0108] 减缓阿尔兹海默病的进展，和/或预防和/或逆转阿尔兹海默病；和/或
[0109] 减缓神经肌肉萎缩的进展，和/或改善神经肌肉萎缩的症状，和/或逆转神经肌肉萎缩；和/或
[0110] 减缓神经麻痹的进展，和/或预防和/或逆转神经麻痹；和/或
[0111] 减缓神经损伤麻痹的进展，和/或改善神经损伤麻痹的症状；和/或
[0112] 减缓创伤性脑损伤的进展，和/或改善创伤性脑损伤的症状，和/或逆转创伤性脑损伤；和/或
[0113] 改善
创伤后应激障碍的症状，和/或逆转创伤后应激障碍；和/或
[0114] 改善神经性障碍的症状，和/或逆转神经性障碍；和/或
[0115] 改善哮喘综合征的症状，和/或减缓或逆转哮喘综合症；和/或
[0116] 改善慢性阻塞性肺病的症状，和/或减缓或逆转慢性阻塞性肺病；和/或
[0117] 改善淋巴组织增生性病症和/或骨髓增生性病症的症状，和/或减缓或逆转淋巴组织增生性病症和/或骨髓增生性病症；和/或
[0118] 改善血小板减少症的症状，和/或减缓或逆转血小板减少症；和/或
[0119] 改善多发性骨髓瘤的症状，和/或治疗多发性骨髓瘤；和/或
[0120] 改善急性或慢性肾病的症状，和/或减缓或逆转急性或慢性肾病；和/或
[0121] 治疗短暂的动脉狭窄和/或出血性休克；和/或
[0122] 治疗抗生素诱导的肾毒性；和/或
[0123] 改善多囊性肾病的症状，和/或治疗多囊性肾病；和/或
[0124] 改善高眼压症和/或
青光眼和/或
视网膜色素变性的症状，和/或逆转高眼压症和/或青光眼和/或视网膜色素变性；和/或
[0125] 改善组织和/或器官的缺血/
再灌注的症状，和/或预防组织和/或器官的缺血/再灌注；和/或
[0126] 改善慢性肺纤维化过程的症状，和/或预防慢性肺纤维化过程；和/或
[0127] 改善癌症和转移的症状，和/或逆转或减缓癌症和转移的进展；
[0128] 其中所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的根据实施方案1-57中任一项的一种或多种PAC1受体激动剂，和/或根据实施方案58-60中任一项的药物制剂。
[0129] 实施方案62：如实施方案61所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0130] 实施方案63：如实施方案61所述的方法，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
[0131] 实施方案64：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为临床肥胖。
[0132] 实施方案65：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为临床肥胖。
[0133] 实施方案66：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有2型糖尿病。
[0134] 实施方案67：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有动脉粥样硬化。
[0135] 实施方案68：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有脂肪性肝病(NAFLD)。
[0136] 实施方案69：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有NASH。
[0137] 实施方案70：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有肝脂肪变性(脂肪肝)。
[0138] 实施方案71：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有代谢综合征。
[0139] 实施方案72：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有胰岛素抵抗。
[0140] 实施方案73：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有糖尿病前期综合征。
[0141] 实施方案74：根据实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为患有肝脂肪变性。
[0142] 实施方案75：根据实施方案61-74中任一项所述的方法，其中所述PAC1受体激动剂和/或所述药物制剂与一种或多种二肽基肽酶-IV(DPP-IV)
抑制剂结合施用。
[0143] 实施方案76：如实施方案75所述的方法，其中所述二肽基肽酶-IV抑制剂是选自由以下组成的组：氨基甲基吡啶、NVP DPP728、PSN9301、异亮氨酸噻唑烷、登那列汀(denagliptin)、西他列汀(sitagliptin)、维格列汀(vidagliptin)、沙格列汀(saxgliptin)、阿格列汀(alogliptin)、NN-7201和ALS 2-0426。
[0144] 实施方案77：如实施方案75所述的方法，其中所述二肽基肽酶-IV抑制剂包括西他列汀。
[0145] 定义
[0146] 术语“多肽”、“肽”和“
蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些实施方案中，本文所述的靶向序列(结合PAC1受体)的长度范围为至多约60个氨基酸、或至多约50个氨基酸、或至多约40个氨基酸、或至多约38个氨基酸、或至多约30个氨基酸、或至多约27个氨基酸、或至多约25个氨基酸、或至多约20个氨基酸、或至多约15个氨基酸、或至多约10个氨基酸。在某些实施方案中，本文所述的麦西迪兰序列或包含麦西迪兰序列的序列(结合PAC1受体)的长度范围为至多61个氨基酸、或至多60个氨基酸、或至多约55个氨基酸、或至多约50个氨基酸、或至多约40个氨基酸、或至多约30个氨基酸、或至多约21个氨基酸、或至多约15个氨基酸。在某些实施方案中，本文所述的包含与激活PAC1受体的氨基酸序列连接的结合PAC1受体的序列的融合蛋白(例如MAXCAP化合物)的长度范围为或至多约120个氨基酸、或至多约110个氨基酸、或至多约100个氨基酸、或至多约99个氨基酸、或至多约90个氨基酸、或至多约80个氨基酸、或至多约
70个氨基酸、或至多约60个氨基酸、或至多约50个氨基酸。在某些实施方案中，构成PAC1受体激动剂的氨基酸残基是“L-型”氨基酸残基，然而，应认识到，在各种实施方案中，可并入“D”氨基酸。肽还包括其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。此外，该术语适用于通过肽键联或其他“修饰的键联”(例如，其中肽键被α-酯、β-酯、硫代酰胺、膦酰胺、氨基
甲酸铵、羟基化物等替换(参见，例如Spatola,(1983)Chem.Biochem.Amino Acids and Proteins 7:267-
357)，其中酰胺被饱和胺替换(参见例如Skiles等人，美国
专利No.4,496,542，其以引用的方式并入本文；和Kaltenbronn等人，(1990)第969-970页,Proc.11th Ameican Peptide Symposium,ESCOM Science Publishers,The Netherlands,and the like))接合的氨基酸。
[0147] 如本文所用的术语“残基”是指天然的、合成的或修饰的氨基酸。各种氨基酸类似物包括但不限于2-氨基
己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸(β-氨基丙酸)、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、
锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、正乙基甘氨酸、正乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、异亮氨酸、正甲基甘氨酸、肌氨酸、正甲基异亮氨酸、6-正甲基赖氨酸、正甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、
鸟氨酸等。这些修饰的氨基酸是例示性的，并非旨在进行限制。
[0148] 术语“融合蛋白”或“融合肽”是指蛋白质/肽构建体，其中通常在自然界中单独存在的两种或更多种蛋白质/肽(或其片段，或具有达(例如，大于80％、或大于90％、或大于约95％、或大于约98％、或大于约99％)的显著序列同一性的序列)直接地或通过氨基酸或通过肽接头连接，形成单个连续的肽/蛋白质。在各种实施方案中，融合蛋白可以经化学方法合成或通过重组表达。
[0149] β-肽由“β氨基酸”组成，其氨基与β碳键合而非与α碳键合(如在20种标准生物氨基酸中那样)。唯一常见的天然存在的β氨基酸是β-丙氨酸。
[0150] 拟肽或N-取代的甘氨酸是模拟肽的特定亚类。它们与其天然肽对应物密切相关，但化学性质不同，因为它们的
侧链沿着分子骨架附着在氮
原子上，而非附着在α-碳上(如在天然氨基酸中那样)。
[0151] 应用于本文的肽的术语“常规的”和“天然的”是指仅由以下天然存在的氨基酸构建的肽：Ala、Cys、Asp、Glu、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。如果本发明的化合物引发与天然存在的肽的生物活性和/或特异性相关的生物活性(例如抗
微生物活性)，则其“对应于”天然肽。引发的活性可以与天然肽的活性相同，或比之更大或更小。通常，如果N-取代的甘氨酸衍生物在亲水性、疏水性、极性等方面类似于原始氨基酸，当天然氨基酸被N-取代的甘氨酸衍生物替换时，这种拟肽将具有大体上对应的
单体序列。以下是例示性但非限制性的N-取代的甘氨酸替换：N-(1-甲基丙-1-基)甘氨酸取代异亮氨酸(Ile)，N-(丙-2-基)甘氨酸取代缬氨酸(Val)，N-苄基甘氨酸取代苯丙氨酸(Phe)，N-(2-羟乙基)甘氨酸取代丝氨酸(Ser)等。在某些实施方案中，取代不必是“精确的”。因此，例如，在某些实施方案中，N-(2-羟乙基)甘氨酸可以取代Ser、Thr、Cys和/或Met；N-(2-甲基丙-1-基)甘氨酸可以取代Val、Leu和/或Ile。在某些实施方案中，N-(2-羟乙基)甘氨酸可用于取代Thr和Ser，即使存在结构差异：N-(2-羟乙基)甘氨酸的侧链比Ser的侧链长一个亚甲基，且羟基取代位点与Thr不同。通常，可以使用N-羟烷基取代的甘氨酸取代任何极性氨基酸，使用N-苄基或N-芳烷基取代的甘氨酸替换任何芳族氨基酸(例如Phe、Trp等)，使用N-烷基取代的甘氨酸诸如N-丁基甘氨酸取代任何非极性氨基酸(例如Leu、Val、Ile等)，以及使用N-(氨基烷基)甘氨酸衍生物替换任何碱性极性氨基酸(例如Lys和Arg)。
[0152] 在本文提供氨基酸序列的情况下，还设想了序列的L-、D-或β氨基酸形式，以及反转、倒位和反转-倒位同种型。另外，设想了保守取代(例如，在结合PAC1受体的靶向序列和/或激活PAC1受体的麦西迪兰序列和/或包含这两个序列的融合蛋白中)。还设想了非蛋白质骨架，诸如PEG骨架、烷
烃骨架、乙烯桥接骨架、酯骨架和其他骨架。设想了长度范围为肽的约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸到全长减去一个氨基酸的所有片段，其中设想了片段保留至少50％，优选至少60％70％或80％，更优选至少90％、95％、98％、99％或至少100％的全长肽的活性(例如结合特异性和/或亲合力、抗微生物活性等)。
[0153] 在某些实施方案中，设想了包含本文所述任何序列的氨基酸的保守取代。在各种实施方案中，一个、两个、三个、四个或五个不同的残基被取代。术语“保守取代”用于反映不实质上改变分子的活性(例如抗微生物活性和/或特异性)的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代涉及用一个氨基酸取代另一个具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的氨基酸。某些保守取代包括“类似物取代”，其中标准氨基酸被与亲本残基差异极小的非标准(例如稀有的、合成的等)氨基酸替换。认为氨基酸类似物是从标准氨基酸合成得来而没有对亲本结构进行过多改变，是异构体，或者是
代谢物前体。此类“类似物取代”的实例包括但不限于：1)Lys-Orn；2)Leu-正亮氨酸；3)Lys-Lys[TFA]；4)Phe-Phe[Gly]；和5)δ-氨基丁基甘氨酸-ξ-氨基己基甘氨酸，其中Phe[gly]是指苯基甘氨酸(在R基团中具有H而不是CH3组分的Phe衍生物)，并且Lys[TFA]是指胺R基团上连接负电荷离子(例如TFA)的Lys。其他保守取代包括“功能性取代”，其中两个残基的一般化学相似，并且足以模拟或部分恢复天然肽的功能。强功能性取代包括但不限于：1)Gly/Ala；2)Arg/Lys；3)Ser/Tyr/Thr；4)Leu/Ile/Val；5)Asp/Glu；6)Gln/Asn；和7)Phe/Trp/Tyr，而其他功能性取代包括但不限于8)Gly/Ala/Pro；9)Tyr/His；10)Arg/Lys/His；11)Ser/Thr/Cys；12)Leu/Ile/Val/Met；和13)Met/Lys(疏水性条件下的特殊情况)。各种“宽泛保守取代”包括其中氨基酸替换来自相同生物化学或生物物理学分组的其他氨基酸。这是基本水平上的相似性，源自对原始20种天然氨基酸进行分类的努力。此类取代包括1)非极性侧链：Gly/Ala/Val/Leu/Ile/Met/Pro/Phe/Trp；和/或2)不带电荷的极性侧链：Ser/Thr/Asn/Gln/Tyr/Cys。在某些实施方案中，宽泛水平取代也可以作为
配对取代发生。例如，任何亲水性中性对[Ser，Thr，Gln，Asn，Tyr，Cys]+[Ser，Thr，Gln，Asn，Tyr，Cys]可以用带中性电荷对[Arg，Lys，His]+[Asp，Glu]替换。以下六组各自含有氨基酸，所述氨基酸在某些实施方案中是彼此的典型保守取代：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)，组氨酸(H)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，
色氨酸(W)。在本文公开氨基酸序列的情况下，还设想了包含上述保守取代中的一种或多种的氨基酸序列。
[0154] 在某些实施方案中，还设想了与本文所述任何序列具有至少80％、或至少85％或90％、或至少95％或98％序列同一性的结合PAC1受体的靶向序列和/或激活PAC1受体的序列和/或包含这两个序列的融合蛋白。术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以达到最大对应性，如使用以下序列比较
算法之一或通过目视检查测量时，两个或更多个序列相同或具有
指定百分比的相同的氨基酸残基。就本发明的肽而言，在肽的全长上测定序列同一性。对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指
定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列最佳比对可以例如通过Smith&Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的算法，通过Needleman&Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:2444的相似性搜索方法，通过运用计算机执行这些算法(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI的Wisconsin Genetics
软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查来进行。
[0155] “麦西迪兰序列”或“麦西迪兰肽”是指全长麦西迪兰前体肽或其片段，或者指成熟的(61个氨基酸)麦西迪兰肽或其片段，并且包括其各种突变体(例如，包含1个、2个、3个或4个氨基酸缺失、插入或取代)。
[0156] “PACAP序列”或“PACAP肽”是指全长垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)序列或其能够激活PAC1受体的片段。在某些实施方案中，PACAP序列包含PACAP1-38或其片段(例如PACAP1-27)并且包括其各种突变体(例如，包含1个、2个、3个或4个氨基酸缺失、插入或取代)。
[0157] 如本文所用的“治疗”疾患或疾患的“治疗”可以指预防疾患，减缓疾患的发作或发展速度，降低疾患发展的风险，预防或延迟与疾患相关的症状的发展，减少或终止与疾患相关的症状，使疾患完全或部分消退，或它们的某些组合。
[0158] 术语“有效量”或“
治疗有效量”或“预防有效量”或“诊断有效量”是指本文所述的活性剂(例如PAC1受体激动剂(如MAXCAP)有效提供所需/预期的结果和/或生物活性的的量。因此，例如，在各种实施方案中，本文所述的PAC1受体激动剂的有效量是有效实现以下效果的量：降低食欲和/或减轻肥胖症和/或减轻体重；和/或抑制脂肪生成和/或体脂肪积累；和/或减少和/或调节葡萄糖稳态；和/或改善或治愈糖尿病症状；和/或减轻或治愈炎性肠病；和/或减轻或治愈慢性炎性疾病；和/或改善系统性和器官特异性自身免疫性疾病的症状，和/或治疗系统性和器官特异性自身免疫性疾病；和/或减轻或治愈干眼综合征；和/或预防或减轻器官、组织和干细胞移植排斥；和/或改善子宫中的胚胎植入以进行体外受精；和/或改善结缔组织炎(connectivitis)的一种或多种症状；和/或减缓骨关节炎和/或类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎的进展；和/或预防或逆转系统性高血压；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或NASH的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或NASH；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或减缓肾性高血压和/或慢性肾病的进展，和/或预防和/或逆转肾性高血压和/或慢性肾病；和/或减缓表达PAC1受体的肿瘤的进展，和/或抑制和/或逆转表达PAC1受体的肿瘤的生长；和/或减缓肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞脱粒和过敏介质释放的进展，和/或预防和/或逆转肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞脱粒和过敏介质释放；和/或改善囊性纤维化的症状，和/或治疗囊性纤维化；和/或改善乳糜泻的症状，和/或治疗乳糜泻；和/或减缓精神分裂性障碍和偏执性精神障碍的进展，和/或预防和/或逆转精神分裂性障碍和偏执性精神障碍；和/或减缓阿尔兹海默病的进展，和/或预防和/或逆转阿尔兹海默病；和/或减缓神经肌肉萎缩的进展，和/或改善神经肌肉萎缩的症状，和/或逆转神经肌肉萎缩；和/或减缓神经麻痹的进展，和/或预防和/或逆转神经麻痹；和/或减缓神经损伤麻痹的进展，和/或改善神经损伤麻痹的症状，和/或神经损伤麻痹；和/或减缓创伤性脑损伤的进展，和/或改善创伤性脑损伤的症状，和/或逆转创伤性脑损伤；和/或改善创伤后应激障碍的症状，和/或逆转创伤后应激障碍；和/或改善神经性障碍的症状，和/或逆转神经性障碍；和/或改善哮喘综合征的症状，和/或逆转哮喘综合征；和/或改善精子发生和/或男性不育症；和/或改善女性排卵和/或女性生育能力；和/或改善慢性阻塞性肺病的症状，和/或逆转慢性阻塞性肺病；和/或改善淋巴组织增生性病症和/或骨髓增生性病症的症状，和/或逆转淋巴组织增生性病症和/或骨髓增生性病症的症状；和/或改善血小板减少症的症状，和/或逆转血小板减少症；和/或改善多发性骨髓瘤的症状，和/或治疗多发性骨髓瘤；和/或改善急性或慢性肾病的症状，和/或逆转急性或慢性肾病；和/或短暂的动脉狭窄和/或出血性休克；和/或抗生素诱导的肾毒性；和/或改善多囊性肾病的症状，和/或治疗多囊性肾病；和/或改善高眼压症和/或青光眼和/或视网膜色素变性的症状，和/或逆转高眼压症和/或青光眼和/或视网膜色素变性；和/或改善组织和/或器官的缺血/再灌注的症状，和/或预防组织和/或器官的缺血/再灌注；和/或改善慢性肺纤维化过程的症状，和/或预防慢性肺纤维化过程；和/或改善癌症和转移的症状，和/或逆转癌症和转移，和/或与
放射性核素或
荧光示踪剂定位偶联以定位和或诊断和/或治疗癌症和转移。
[0159] “诊断有效量”是指当本文所述的一种或多种剂与可检测标记(例如不透射线标记、MRI标记、NMR标记、ar
放射性核素和荧光示踪剂偶联时有效定位和/或诊断疾病状态的量。
[0160] 当关于包含本文所述的PAC1受体激动剂的组合物使用时，术语“大体上由……组成”表示组合物的PAC1受体激活活性主要或完全由PAC1受体激动剂提供，而不是由组合物中存在的其他剂提供。在某些实施方案中，PAC1受体激动剂是组合物中唯一的活性剂。
[0161] 术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指这样的物质，其基本上或大体上不含如在其天然状态中发现的通常伴随它的组分。就肽而言，分离的(天然存在的)肽通常基本上不含在细胞、组织或生物体中与其相关的组分。术语分离的还表明肽不存在于
噬菌体展示、
酵母展示或其他肽文库中。
[0162] 在各种实施方案中，本文使用表1中所示的氨基酸缩写。
[0163] 表1.氨基酸缩写。
[0164]
[0165] 当提及结合使用本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)与本文所述的一种或多种其他药物(例如，一种或多种二肽基肽酶IV抑制剂、Exendin-4、GLP-1激动剂、CGRP、肾上腺髓质素、血清素、胰岛
淀粉样多肽、VIP和VPAC1拮抗剂、VPAC2激动剂等)时，短语“与...结合”或“与...组合”是指施用一种或多种PAC1受体激动剂和二肽基肽酶IV抑制剂(或其他药物)以使其在生物体上的生理活性至少存在一些时间上的重叠。
[0166] 因此，在各种实施方案中，PAC1受体激动剂和二肽基肽酶IV抑制剂可以同时和/或顺序地施用。在顺序施用时，在第二部分施用之前甚至可能存在一些明显延迟(例如，数分钟或甚至数小时或数天)，只要在施用第二施用剂时或当第二施用剂在生物体中产生活性时第一施用的药物/剂已对生物体施加了一些生理改变即可。
附图说明
[0167] 图1示出了与PACAP 1-38相比，MAXCAP 1和MAXCAP 4对cAMP的刺激。
[0168] 图2示出了MAXCAP 1和MAXCAP 4对食物摄取和胃饥饿素释放的影响。
[0169] 图3示出了MAXCAP 1和MAXCAP 4对RQ、VO2、VCO2和总
能量消耗(TEE)、粗略活动指数和平均运动速度的影响。
[0170] 图4示出了MAXCAP 1对体重、体脂和瘦体量组成的影响。
[0171] 图5示出了MAXCAP 1对肝硬化和NASH/NAFLD的影响。
[0172] 图6示出了MAXCAP 1对
肝细胞和脂肪细胞中脂肪形成的影响。
具体实施方式
[0173] PACAP和VIP是胃肠道神经肽，它们在胃肠道中以高亲和力结合其各自的受体PAC1和VPAC以调节消化过程生理机能。初步证据表明，PACAP在食欲的中枢调节中发挥作用。然而，尚未研究PACAP及其受体在食欲和
机体代谢调节中的外周作用，也尚未充分研究其在临床实践中在治疗化合物中的潜在用途。
[0174] 在各种实施方案中，本文提供了能够特异性地结合并激活PAC1受体的新型PAC1受体激动剂(也称为MAXCAP)。研究了各种MAXCAP在调节食欲、食物摄取、
摄食行为、体脂和瘦体量组成、血糖和肝脂肪变性中的作用。已证实外源性施用PAC1受体激动剂(MAXCAP)抑制食欲、降低血糖、减少体重和脂肪量、改善肥胖症、肝脂肪变性、NASH和NAFLD，所有这些都是肥胖症病症患者和2型糖尿病患者中常见的病状。
[0175] 因此，在各种实施方案中，本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)(和/或其药物制剂)设想用于以下中的一种或多种：
[0176] i)降低食欲和/或减轻肥胖症；和/或
[0177] ii)抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或
[0178] iii)改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或预防或逆转2型糖尿病；和/或
[0179] iv)改善动脉粥样硬化和/或高血压的一种或多种症状
[0180] v)减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或
[0181] vi)改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或
[0182] vii)改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或
[0183] viii)改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或
[0184] ix)改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或
[0185] x)改善肝脂肪变性；和/或
[0186] xi)改善和/或预防和/或逆转NASH和/或NAFLD。
[0187] 在各种实施方案中，提供PAC1受体激动剂(MAXCAP)本身以及包含PAC1受体激动剂的药物制剂。
[0188] PAC1受体激动剂(MAXCAP)。
[0189] 在各种实施方案中，提供了特异性PAC1受体激动剂MAXCAP，其可被系统性地吸收以激活PAC1受体。在某些例示性但非限制性的实施方案中，通过鉴定PACAP1-27的天然序列的关键氨基酸残基并通过纳入麦西迪兰肽的氨基酸序列来合成这些PAC1受体激动剂。认为麦西迪兰和PACAP没有结构同源性。
[0190] 在某些实施方案中，PAC1受体激动剂利用麦西迪兰肽或其片段作为“靶向序列”以特异性地结合PAC1受体。该靶向序列连接至用于激活PAC1信号传导的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)或其片段(例如PACAP N末端的一部分)。在某些实施方案中，PACAP片段包含PACAP1-38肽或PACAP1-27肽或其片段(任选地并入一个或多个突变或取代)或由其组成。作为参考，全长(61个氨基酸)麦西迪兰肽和PACAP1-27及PACAP1-38肽在表2中示出。
[0191] 表2.麦西迪兰肽、PACAP1-38和PACAP1-27的氨基酸序列。麦西迪兰序列中的箭头表示耐受突变的位点或突变增强活性的位点。PACAP序列中的箭头表示PACAP的残基11与12之间的位置。
[0192]
[0193] 在某些实施方案中，PACAP序列可以经化学方法缀合至麦西迪兰序列，而在其他实施方案中，这两个序列可以直接连接、通过氨基酸连接或通过肽接头连接以提供单个连续的融合蛋白。
[0194] 本文所述的构建体比天然PACAP1-27和PACAP1-38更耐DPP-IV蛋白酶降解，因此具有更长的半衰期。
[0195] 在某些实施方案中，靶向序列(例如麦西迪兰肽或其片段和/或其突变体)经化学方法缀合至激活PAC1信号传导的肽(例如PACAP或其片段，诸如PACAP1-38、PACAP1-27及其变体)。在某些实施方案中，靶向序列与激活PAC1信号传导的肽直接连接，或通过氨基酸连接，或通过肽接头连接。在这些情况下，肽可以作为融合肽经化学方法合成，或通过重组表达。
[0196] 已经作为融合蛋白制备并经历了广泛测试的例示性PAC1受体激动剂在表3中示出。
[0197] 表3.本文设想的PAC1受体激动剂(MAXCAP)的例示性但非限制性实例。粗体表示源自PACAP1-27的氨基酸序列。单下划线表示源自麦西迪兰的氨基酸序列(例如PGNSVFKECMKQKKKEFKAGK，SEQ ID NO:1)。双下划线表示氨基酸接头或肽接头。
[0198]
[0199] 表3中所示的PAC1受体激动剂(MAXCAP)，尤其是MAXCAP 1和MAXCAP 4，是例示性的而非限制性的。根据这些例示性融合蛋白，本领域技术人员可获得许多PAC1受体激动剂(例如，如下所述)。
[0200] 例如，如上所述，PAC1受体激动剂不必作为融合蛋白提供。相反，靶向序列(例如，麦西迪兰或其片段)和PACAP序列可以使
用例如同型或异型双官能接头经化学方法缀合。
[0201] 在某些实施方案中，靶向序列(例如麦西迪兰或其片段)可以连接至PACAP序列的氨基末端，而在其他实施方案中，靶向序列可以连接至PACAP序列的羧基末端。在某些实施方案中，多个靶向序列(例如，2个、3个、4个、5个或更多个)可以连接至单个PACAP序列。在某些实施方案中，多个PACAP序列(例如，2个、3个、4个、5个或更多个)可以连接至单个靶向序列(例如，麦西迪兰或其片段)。在某些实施方案中，多个靶向序列(例如，2个、3个、4个、5个或更多个)可以连接至多个PACAP序列(例如，2个、3个、4个、5个或更多个)。在某些实施方案中，麦西迪兰和/或PACAP序列是树枝状构建体的组分。
[0202] 在某些实施方案中，PAC1受体激动剂(MAXCAP)包含结合PAC1受体的靶向序列，所述靶向序列连接至激活PAC1信号传导的肽，其中所述靶向序列包含有效结合PAC1受体的麦西迪兰肽或其片段，并且所述激活PAC1信号传导的肽包含有效激活PAC1信号传导的(PACAP)或其片段或PACAP1-38或其片段，其中所述PACAP或其片段或PACAP1-38或其片段任选地在所述PACP1-38的残基11与12之间包含氨基酸插入。
[0203] 靶向序列。
[0204] 在各种实施方案中，本文设想的PAC1受体激动剂包含靶向肽，所述靶向肽包含结合(例如，特异性地结合)PAC1受体的氨基酸序列(或由其组成)。在各种实施方案中，靶向序列包含结合PAC1受体的麦西迪兰肽或其片段和/或类似物或同源物(或由其组成)。在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含全长麦西迪兰序列(前体序列)或其片段或由其组成。在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含有效结合PAC1受体的成熟麦西迪兰(61个氨基酸的肽)序列或其片段或由其组成。在某些实施方案中，麦西迪兰序列是麦西迪兰片段。例示性的麦西迪兰序列在表4中示出。
[0205] 表4.麦西迪兰序列的例示性但非限制性实例。箭头表示已知耐受突变的位点(参见，例如Reddy等人(2006)J.Biol.Chem.,281(24):16197-16201)。
[0206]
[0207]
[0208]
[0209] 在某些实施方案中，麦西迪兰片段包含表4中所示的片段，其具有对应于全长麦西迪兰肽的N45和/或K49、和/或P43、和/或D38、和/或E50、和/或K53、和/或K55的突变(参见，例如表4中的箭头)。在某些实施方案中，突变是对丙氨酸的突变、或对丝氨酸的突变、或对半胱氨酸的突变、或对苏氨酸的突变。在某些实施方案中，突变包含N45A突变。在某些实施方案中，突变包含K49A突变。在某些实施方案中，突变包含P43A突变。在某些实施方案中，突变包含E50A突变。在某些实施方案中，突变包含K53A突变。
[0210] 在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含肽或由其组成，所述肽结合(例如，特异性地结合)PAC1受体并且显示与前述麦西迪兰序列中的一者或多者具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的序列同一性。在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含肽或由其组成，所述肽结合PAC1受体并且基本上不结合VPAC1受体和/或VPAC2受体并且显示与前述麦西迪兰序列中的一者或多者具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的序列同一性。
[0211] 在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含全部“L”氨基酸。在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含一个或多个选择的“D”氨基酸，使得麦西迪兰序列保留激活PAC1受体的能力。
[0212] 在某些实施方案中，麦西迪兰序列包含β肽和/或模拟肽。
[0213] 在某些实施方案中，设想了结合PAC1受体但不是麦西迪兰肽的部分。例如，美国专利公布No：2016/0039939描述了与PAC1受体信号传导结合的抗PAC1
抗体和抗体片段。
[0214] 应认识到，上述靶向序列是例示性的，并且使用本文提供的教导，本领域技术人员可获得许多其他PAC1结合序列。
[0215] PAC1激活肽(PACAP及其片段)。
[0216] 在各种实施方案中，包含本文设想的PAC1受体激动剂的靶向序列包含PAC1激活剂(例如，激活PAC1受体的氨基酸序列(例如PACAP或其片段))。例示性但非限制性的PAC1激活序列包括垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)或其片段(例如，PACAP1-38或其片段和/或PACAP1-27或其片段)。在某些实施方案中，PAC1激活剂序列包含PACAP或PACAP片段的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个)氨基酸插入和/或一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个)保守氨基酸取代。PAC1激活序列的例示性但非限制性实5例在表5中示出。
[0217] 表5.包含PACAP的片段的PAC1激活序列的例示性实例。应认识到，当丝氨酸显示为插入时，该残基可以被苏氨酸或其他保守取代替换。在某些实施方案中，12位的R可以被A或K取代，或者PAC1激活序列可以由HSDGIFTDSYS(SEQ ID NO:40)组成，并且R或K用作接头。在某些实施方案中，15位的K可以被A取代，或者PAC1激活序列可以由序列HSDGIFTDSYSRYR(SEQ ID NO:35)组成，并且A可以用作接头。
[0218]
[0219]
[0220] 在某些实施方案中，PAC1激活序列包含氨基酸序列HSDGIF(SEQ ID NO:45)或由其组成。在某些实施方案中，PAC1激活序列包含氨基酸序列HSDGIFT(SEQ ID NO:44)或由其组成。在某些实施方案中，PAC1激活序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL(SEQ ID NO:21)或由其组成。在某些实施方案中，PAC1激活序列包含氨基酸序列HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVL(SEQ ID NO:58)或由其组成。
[0221] 在某些实施方案中，PAC1激活序列包含肽或由其组成，所述肽激活PAC1受体并且显示与前述PAC1受体激活序列中的一者或多者具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％的序列同一性。
[0222] 在某些实施方案中，PAC1激活序列包含全部“L”氨基酸。在某些实施方案中，靶向序列包含一个或多个选择的“D”氨基酸，使得靶向序列保留结合PAC1受体的能力。
[0223] 在某些实施方案中，PAC1激活序列包含β肽和/或模拟肽。
[0224] 应认识到，上述PAC1激活序列是例示性的，并且使用本文提供的教导，本领域技术人员可获得许多其他PAC1激活序列。
[0225] 制备PAC1受体激动剂(MAXCAP)。
[0226] 可以使用标准化学肽合成技术经化学方法合成本文所述的靶向序列(例如，麦西迪兰肽或其片段)和/或激活PAC1受体的序列(例如，PACAP序列或其片段)和/或融合蛋白，或者特别是当肽不包含“D”氨基酸残基时，可以通过重组表达肽。在通过重组表达“D”多肽的情况下，可以将宿主生物体(例如细菌、
植物、
真菌细胞等)在仅向生物体提供D形式的一种或多种氨基酸的环境中培养。在这种系统中通过重组表达的肽然后并入那些D氨基酸。
[0227] 在某些实施方案中，可以使用识别D-氨基酸的修饰的氨基酰基-tRNA合成酶将D氨基酸并入通过重组表达的肽中。
[0228] 在某些实施方案中，通过本领域技术人员已知的多种
流体相或固相肽合成技术中的任一种经化学方法合成肽。固相合成是用于化学合成本发明的多肽的优选方法，在固相合成中将序列的C末端氨基酸连接至不溶性支持物，随后在序列中依次添加剩余的氨基酸顺序。用于固相合成的技术是本领域技术人员熟知的，并且例如在以下中描述：Barany和Merrifield(1963)Solid-Phase Peptide Synthesis；The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷:Special Methods in Peptide Synthesis,第A部分,第3-284页；Merrifield等人(1963)J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156；和Stewart等人(1984)Solid Phase Peptide Synthesis,第2版.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill。
[0229] 在一个实施方案中，可以使用二苯甲基胺
树脂(benzhyderylamine resin)(Beckman Bioproducts，0.59mmol NH2/g树脂)作为固体支持物通过固相肽合成程序合成肽。COOH末端氨基酸(例如叔丁基羰基-Phe)通过4-(氧甲基)苯乙酰基连接至固体支持物。
这是比常规苄基酯键联更稳定的键联，但是成品肽仍然可以通过氢化裂解。使用甲酸作为氢供体的转移氢化可用于此目的。
[0230] 应注意，在肽，特别是包含D氨基酸的肽的化学合成中，除了所需的全长产物外，合成通常还产生许多截短的肽。因此，通常使用例如HPLC来纯化肽。
[0231] 可以通过在化学合成中简单地使用适当衍生的氨基酸残基在肽的一个或多个位置中并入D-氨基酸、β氨基酸、非天然氨基酸等。用于固相肽合成的修饰残基可从许多供应商处商购获得(参见，例如Advanced Chem Tech,Louisville；Nova Biochem,San Diego；Sigma,St Louis；Bachem California Inc.,Torrance等)。根据需要，可以完全省略D-型氨基酸和/或以其他方式修饰的氨基酸或将其并入肽中的任何位置。因此，例如，在某些实施方案中，肽可包含单个修饰的酸，而在其他实施方案中，肽包含至少两个，通常至少三个，更通常至少四个，最通常至少五个，优选至少六个，更优选至少七个或甚至全部的修饰的氨基酸。在某些实施方案中，大体上每个氨基酸都是D-型氨基酸。
[0232] 如上所述，构成本文所述的PAC1受体激动剂和/或PAC1受体激动剂融合蛋白的肽还可以通过重组表达。因此，在某些实施方案中，使用重组表达系统合成本文所述的靶向序列和/或麦西迪兰序列和/或融合肽。通常，这包括产生编码所需肽或融合蛋白的DNA序列，将该DNA置于特定启动子控制下的表达盒中，在宿主中表达肽或融合蛋白，分离表达的肽或融合蛋白，以及在需要时使肽或融合蛋白复性。
[0233] 可以通过如上所述的任何合适的方法制备编码本文所述的肽或融合蛋白的DNA，所述方法包括例如克隆和限制适当的序列或直接化学合成。
[0234] 可以将该核酸容易地连接到含有适当的表达控制序列(例如启动子、增强子等)并且任选地含有一个或多个选择性标记物(例如抗生素抗性基因)的适当载体中。
[0235] 编码本文所述的肽或融合蛋白的核酸序列可在多种宿主细胞中表达，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、其他细菌宿主、酵母、真菌和各种高等真核细胞诸如昆虫细胞(例如SF3)、COS、CHO和HeLa细胞系以及骨髓瘤细胞系。重组蛋白基因通常将可操作地连接至每个宿主的适当表达控制序列。对于大肠杆菌，表达控制序列可包括启动子(诸如T7、trp或λ启动子)、核糖体结合位点和优选的转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可包括启动子且经常包括增强子(例如，源自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子)和聚腺苷
酸化序列，并且可包括剪接供体和受体序列。
[0236] 可以通过众所周知的方法将质粒转移到所选择的宿主细胞中，如对于大肠杆菌使用氯化
钙转化，对于哺乳动物细胞使用
磷酸钙处理或电穿孔。由质粒转化的细胞可以根据质粒上包含的基因(诸如amp、gpt、neo和hyg基因)所赋予的对抗生素的抗性来选择。
[0237] 表达后，重组肽或融合蛋白可以根据本领域的标准程序来纯化，这些程序包括
硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法、凝胶
电泳等(通常参见R.Scopes,(1982)Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.；Deutscher(1990)Methods in Enzymology第182卷:Guide to Protein Purification.,Academic Press,Inc.N.Y.)。优选至少约90％至
95％均质性的基本上纯的组合物，98％至99％或更高的均质性是最优选的。
[0238] 本领域技术人员将认识到，在化学合成、生物表达或纯化后，肽或融合蛋白可具有与所需天然构象基本上不同的构象。在这种情况下，可能需要使肽或融合蛋白变性并还原，然后使分子重新折叠成优选的构象。使蛋白质还原并变性以及诱导重新折叠的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如Debinski等人(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585；和Buchner等人,(1992)
Anal.Biochem.,205:263-270)。例如，Debinski等人描述了在胍-DTE中包含体蛋白的变性和还原。然后使蛋白质在含有氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。
[0239] 技术人员将认识到，可以对肽和/或融合蛋白进行修饰而不减弱其生物活性。可以进行一些修饰以促进靶向序列和/或麦西迪兰序列的克隆、表达或并入到融合蛋白中。这些修饰是本领域技术人员熟知的，并且包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一末端放置额外的氨基酸(例如poly His)以产生适宜定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
[0240] 将PAC1受体靶向序列连接至PAC1受体激活序列。
[0241] 化学缀合。
[0242] 在某些实施方案中，结合PAC1受体的靶向序列(例如麦西迪兰序列)经化学方法缀合至有效激活PAC1的序列(例如PACAP序列)。在某些实施方案中，通过经由天然存在的反应性基团将靶向序列直接缀合至麦西迪兰肽或可以将靶向序列和/或麦西迪兰肽官能化以提供这样的反应性基团来制备此类化学缀合物。
[0243] 在某些实施方案中，结合PAC1受体的靶向序列通过一种或多种连接剂经化学方法缀合至有效激活PAC1的序列。因此，在各种实施方案中，结合PAC1受体的靶向序列和PAC1激活剂序列可以通过单一连接剂或多种连接剂缀合。例如，靶向序列和PAC1激活剂序列可以通过单一多官能(例如，双官能、三官能或四官能)连接剂或一对互补连接剂缀合。在另一个实施方案中，靶向序列和PAC1激活剂序列通过两种、三种或更多种连接剂缀合。合适的连接剂包括但不限于例如官能团、亲和剂、稳定基团以及它们的组合。
[0244] 在某些实施方案中，连接剂是官能团或包括官能团。官能团包括包含一个反应性基团的单官能接头，以及包含两个或更多个能够与两个或更多个不同功能靶标形成键的反应性基团的多官能交联剂。在一些实施方案中，多官能交联剂是包含两个或更多个不同反应性基团的异双官能交联剂。
[0245] 合适的反应性基团包括但不限于硫醇(-SH)、
羧酸根(COOH)、羧基(-COOH)、羰基、胺(NH2)、羟基(-OH)、
醛(-CHO)、醇(ROH)、
酮(R2CO)、活性氢、酯、巯基(SH)、磷酸根(-PO3)或光反应性部分。胺反应性基团包括但不限于例如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、亚氨酸酯、碳二亚胺和酸酐。硫醇反应性基团包括但不限于例如卤代乙酰基和烷基卤衍生物、
马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂和硫醇-二硫化物交换
试剂。羧酸根反应性基团包括但不限于例如重氮烷烃和重氮乙酰基化合物，诸如羰基二咪唑和碳二亚胺。羟基反应性基团包括但不限于例如环氧化物和环氧乙烷、羰基二咪唑、用高碘酸盐氧化、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、酶促氧化、烷基卤素和异氰酸酯。醛和酮反应性基团包括但不限于例如用于席夫碱形成或还原胺化的肼衍生物。活性氢反应性基团包括但不限于例如用于曼尼希缩合和碘化反应的重氮衍生物。光反应性基团包括但不限于例如芳基叠氮化物和卤代芳基叠氮化物、二苯甲酮、重氮化合物和双吖丙啶衍生物。
[0246] 用于形成嵌合部分的其他合适的反应性基团和反应类别包括生物缀合化学领域中众所周知的那些。目前可使用反应性
螯合物的有利反应类别是在相对温和的条件下进行的那些反应。这些反应包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)，以及碳-碳和碳-杂原子多重键加成(例如迈克尔反应、狄尔斯阿尔德加成)。这些和其他有用的反应在例如(1985)年3月Advanced OrganicChemistry,第3版,John Wiley&Sons,New York,Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego；和Feeney等人(1982)Modification of Proteins；Advances in Chemistry Series,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C中有所讨论。
[0247] 如本文所用的“接头”或“连接剂”是用于连接两个或更多个分子的分子。在某些实施方案中，接头通常能够与两个分子(例如靶向序列和麦西迪兰序列)形成共价键。合适的接头是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在某些实施方案中，接头可以通过其侧基连接组成氨基酸(例如，通过二硫键联连接半胱氨酸)。然而，在某些实施方案中，接头将连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
[0248] 可使用双官能接头形成所需的缀合物，所述双官能接头中的一个官能团在一个分子(例如靶向肽)上起反应，另外一个官能团在另一个分子(例如麦西迪兰肽)上起反应。或者，可以进行衍生化以提供官能团。因此，例如，在肽上产生游离巯基的程序也是已知的(参见美国专利No.4,659,839)。
[0249] 在某些实施方案中，连接剂是异双官能交联剂，其包含两个或更多个不同的反应性基团，这些反应性基团形成的杂环可与肽相互作用。例如，异双官能交联剂诸如半胱氨酸可包含胺反应性基团，并且硫醇反应性基团可与衍生化肽上的醛相互作用。适用于异双官能交联剂的反应性基团的其他组合包括例如胺和巯基反应性基团；羰基和巯基反应性基团；胺和光反应性基团；巯基和光反应性基团；羰基和光反应性基团；羧酸根和光反应性基团；以及精氨酸和光反应性基团。在一个实施方案中，异双官能交联剂是SMCC。
[0250] 用于将各种分子连接至肽或蛋白质的许多程序和接头分子是已知的(参见，例如欧洲专利申请No.188,256；美国专利No.4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784、4,680,338、4,569,789和4,589,071；以及Borlinghaus等人(1987)Cancer Res.47:4071-
4075)。本文在
实施例2和3中提供了例示性的连接方案。
[0251] 融合蛋白。
[0252] 在某些实施方案中，PAC1受体(PAC1r)靶向序列(例如麦西迪兰肽)和激活PAC1的序列(例如，作为PACAP肽)直接地或通过氨基酸或通过接头连接在一起以形成单链融合蛋白/肽。在某些实施方案中，这种融合蛋白/肽可以容易地经化学方法合成或通过重组表达为融合蛋白(即，嵌合融合蛋白)。
[0253] 在某些实施方案中，使用重组DNA方法合成嵌合融合蛋白。例如，如上所述，通常这包括产生编码融合蛋白的DNA序列，将该DNA置于特定启动子控制下的表达盒中，在宿主中表达蛋白质，分离表达的蛋白质，以及在需要时使蛋白质复性。
[0254] 虽然靶向序列和效应子(PAC1激活剂)可以直接连接在一起，但是技术人员将理解它们可以被由一个或多个氨基酸组成的肽间隔子/接头分开。通常，除了连接蛋白质或保持它们之间的一些最小距离或其他空间关系之外，间隔子将不具有特定的生物活性。然而，可以选择间隔子的组成氨基酸以影响分子的某些特性，诸如折叠、净电荷或疏水性。
[0255] 在某些实施方案中，靶向序列和PAC1激活剂通过单个氨基酸诸如A、C、P或G连接。在某些实施方案中，靶向序列和麦西迪兰序列通过单个丙氨酸连接。
[0256] 在某些实施方案中，使用肽接头连接靶向序列和PAC1激活剂序列。在各种实施方案中，肽接头相对较短，例如少于约15个氨基酸、或少于约13个氨基酸、或少于约10个氨基酸、或少于约8个氨基酸、或少于约5个氨基酸或约3个氨基酸或更少。合适的例示性接头包括但不限于包含序列SMDTSQL(SEQ ID NO:86)、PSGSP((SEQ ID NO:75)、ASASA(SEQ ID NO:76)或GGG(SEQ ID NO:77)或由它们组成的接头。在某些实施方案中，可以使用更长的接头诸如(GGGGS)3(SEQ ID NO:78)。在某些实施方案中，接头包含序列SMDTSQL(SEQ ID NO:86)或由其组成。各种例示性肽氨基酸接头、肽接头和其他接头在表6中示出。
[0257] 表6.例示性氨基酸接头、肽接头和非肽接头。
[0258]
[0259]
[0260] (所有基于氨基酸的接头可以是L形式、D形式、L形式和D形式的组合、β形式等)[0261] 保护团体。
[0262] 虽然本文所述的各种肽(例如，结合PAC1受体的靶向序列(例如麦西迪兰或其片段)，和/或有效激活PAC1的序列(例如，PACAP或其片段)，和/或包含这两者的融合蛋白)可显示没有保护基团。然而，在某些实施方案中，它们可以带有一个、两个、三个、四个或更多个保护基团。在各种实施方案中，保护基团可以与肽的C末端和/或N末端和/或与构成肽的一个或多个内部残基偶联(例如，组成氨基酸上的一个或多个R-基团可以被封闭)。因此，例如，在某些实施方案中，本文所述的任何肽可以带有例如保护氨基末端的乙酰基和/或保护羧基末端的酰胺基。这种受保护的肽的例示性实例包括但不限于：
[0263] HSDGIFTDSYSSRYRKQMAVKKYLAAVLPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK*
[0264] (SEQ ID NO:93)；
[0265] HSDGIFAPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK*
[0266] (SEQ ID NO:94)；
[0267] HSDGIFTSMDTSQLPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK*
[0268] (SEQ ID NO:95)；和
[0269] HSDGIFTPGNSVFKECMKQKKKEFKAGK*
[0270] (SEQ ID NO:96)；
[0271] 其中星号表示酰胺化的羧基末端。当然，该保护基团可以被消除和/或被本文所述的另一种保护基团取代。
[0272] 不受特定理论的束缚，认为添加保护基团，特别是添加到羧基末端以及在某些实施方案中添加到氨基末端可以改善肽的
稳定性和功效。
[0273] 大量保护基团适于此目的。此类基团包括但不限于乙酰基、酰胺基和烷基，其中乙酰基和烷基特别适于N末端保护，而酰胺基特别适于羧基末端保护。在某些实施方案中，保护基团包括但不限于如
脂肪酸中的烷基链、丙酰基、甲酰基等。某些合适的羧基保护基团包括形成酰胺、酯和醚的保护基团。在一个实施方案中，乙酰基用于保护氨基末端，而酰胺基用于保护羧基末端。在某些实施方案中，封闭基团包括各种长度的烷基，例如具有下式的基团：CH3-(CH2)n-CO-，其中n的范围为约1至约20，或约1至约16或18，或约3至约13，或约3至约10。
[0274] 在某些实施方案中，C末端上的酸基团可以用醇、醛或酮基团封闭，并且/或者N末端残基可以具有天然酰胺基，或者用酰基、羧酸、醇、醛或酮基团封闭。
[0275] 其他保护基团包括但不限于Fmoc、叔丁氧基羰基(t-BOC)、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴-1-羧基、苄氧基羰基、氧蒽基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶硫苯基(Npys)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2,6-二氯苄基(2,6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙酰基(Ac)和三氟乙酰基(TFA)。
[0276] 保护/封闭基团以及将这些基团偶联至构成本发明肽的适当残基的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如Greene等人(1991)Protective Groups in Organic Synthesis,第2版,John Wiley&Sons,Inc.Somerset,N.J.)。在例示性实施方案中，例如，当肽在树脂上时在合成期间使用乙酸酐完成乙酰化。通过选择适于合成的树脂可以实现酰胺保护。例如，可以使用rink酰胺树脂。合成完成后，酸性双官能氨基酸诸如Asp和Glu以及碱性氨基酸Lys、Tyr羟基上的半永久性保护基团都同时被去除。使用酸处理从这种树脂释放的肽，其n末端被保护为乙酰基，羧基被保护为NH2，同时所有其他保护基团都被去除。
[0277] 在本文公开氨基酸序列的情况下，还设想了包含一个或多个例如如上所述的保护基团(或例如在boc或fmoc肽合成中用于氨基酸的任何其他可商购的保护基团)的氨基酸序列。
[0278] 鉴定/验证活性PAC1受体激动剂。
[0279] 可以使用本文提供的实施例中所示的体外和/或体内筛选测定鉴定和/或验证活性PAC1受体激动剂(MAXCAP)。例如，可以针对以下对PAC1受体激动剂(MAXCAP)进行筛选：以与天然PACAP1-38或PACAP1-27类似的剂量依赖性方式进行的，对PAC1受体的放射性配体结合2+
抑制，刺激cAMP刺激，细胞内基质磷酸化和Ca 释放。在某些实施方案中，可以针对PAC1受体激动剂(MAXCAP)抑制食欲和食物摄取和/或诱导饱腹感和/或抑制胃饥饿素释放的能力对它们进行筛选。在某些实施方案中，可以在体内评估PAC1受体激动剂(MAXCAP)通过降低RQ、VO2、VCO2、总能量消耗来抑制能量消耗的能力以鉴定优选的临床候选物。还可以针对PAC1受体激动剂(MAXCAP)对脂肪生成、脂肪肝、NAFLD和/或NASH的作用对它们进行筛选。
[0280] PAC1受体激动剂(MAXCAP)的用途。
[0281] 如上文所指出，认为本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)可用于：降低食欲和/或减轻肥胖症；和/或抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或预防或逆转2型糖尿病；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或改善肝脂肪变性；和/或改善和/或预防和/或逆转NASH和/或NALD；和/或降低食欲和/或减轻肥胖症和/或减轻体重；和/或抑制脂肪生成和/或体脂肪积累；和/或减少和/或调节葡萄糖稳态；和/或改善或治愈糖尿病症状；和/或减轻或治愈炎性肠病；和/或减轻或治愈慢性炎性疾病；和/或改善系统性和器官特异性自身免疫性疾病的症状，和/或治疗系统性和器官特异性自身免疫性疾病；和/或减轻或治愈干眼综合征；和/或预防或减轻器官、组织和干细胞移植排斥；和/或改善子宫中的胚胎植入以进行体外受精；和/或改善结缔组织炎(connectivitis)的一种或多种症状；和/或减缓骨关节炎和/或类风湿性关节炎和/或银屑病性关节炎的进展；和/或预防或逆转系统性高血压；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或NASH的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或NASH；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或减缓肾性高血压和/或慢性肾病的进展，和/或预防和/或逆转肾性高血压和/或慢性肾病；和/或减缓表达PAC1受体的肿瘤的进展，和/或抑制和/或逆转表达PAC1受体的肿瘤的生长；和/或减缓肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞脱粒和过敏介质释放的进展，和/或预防和/或逆转肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞脱粒和过敏介质释放；和/或改善囊性纤维化的症状，和/或治疗囊性纤维化；和/或改善乳糜泻的症状，和/或治疗乳糜泻；和/或减缓精神分裂性障碍和偏执性精神障碍的进展，和/或预防和/或逆转精神分裂性障碍和偏执性精神障碍；和/或减缓阿尔兹海默病的进展，和/或预防和/或逆转阿尔兹海默病；和/或减缓神经肌肉萎缩的进展，和/或改善神经肌肉萎缩的症状，和/或逆转神经肌肉萎缩；和/或减缓神经麻痹的进展，和/或预防和/或逆转神经麻痹；和/或减缓神经损伤麻痹的进展，和/或改善神经损伤麻痹的症状，和/或神经损伤麻痹；和/或减缓创伤性脑损伤的进展，和/或改善创伤性脑损伤的症状，和/或逆转创伤性脑损伤；和/或改善创伤后应激障碍的症状，和/或逆转创伤后应激障碍；和/或改善神经性障碍的症状，和/或逆转神经性障碍；和/或改善哮喘综合征的症状，和/或逆转哮喘综合征；和/或改善慢性阻塞性肺病的症状，和/或逆转慢性阻塞性肺病；和/或改善淋巴组织增生性病症和/或骨髓增生性病症的症状，和/或逆转淋巴组织增生性病症和/或骨髓增生性病症的症状；和/或改善血小板减少症的症状，和/或逆转血小板减少症；和/或改善多发性骨髓瘤的症状，和/或治疗多发性骨髓瘤；和/或改善急性或慢性肾病的症状，和/或逆转急性或慢性肾病；和/或短暂的动脉狭窄和/或出血性休克；和/或抗生素诱导的肾毒性；和/或改善多囊性肾病的症状，和/或治疗多囊性肾病；和/或改善高眼压症和/或青光眼和/或视网膜色素变性的症状，和/或逆转高眼压症和/或青光眼和/或视网膜色素变性；和/或改善组织和/或器官的缺血/再灌注的症状，和/或预防组织和/或器官的缺血/再灌注；和/或改善慢性肺纤维化过程的症状，和/或预防慢性肺纤维化过程；和/或改善癌症和转移的症状，和/或逆转癌症和转移，和/或与放射性核素或荧光示踪剂定位偶联以定位和或诊断和/或治疗癌症和转移。
[0282] 认为本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)是第一种靶向食欲/饱腹感控制新途径且具有比任何现有药理学靶标更有效且更长期的作用的化合物。此外，在本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)之前，迄今为止市场上没有临床有效的抵抗食欲、脂肪生成、2型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖症以及抑制脂肪累积的药理学靶标。本文所述的MAXCAP在饮食诱导的肥胖小鼠模型中引起食欲、体脂肪积累和体重减少的显著降低。另外，MAXCAP的一个特别突出的效果是在小鼠模型中治疗肝脂肪变性、NAFLD和NASH。目前，没有有效的方法或药理学靶标可治疗这些病症。
[0283] 通常，如上文所指出，将本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)施用给有需要的受试者(例如，诊断患有代谢综合征、II型糖尿病、肥胖症、NASH/NLD等的受试者)。
[0284] 在某些实施方案中，本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)与一种或多种二肽基肽酶IV抑制剂结合施用。认为这种施用尤其可以增加PAC1受体激动剂的有效半衰期和/或提供关于所需效果的协同活性(如上所述)。
[0285] 二肽基肽酶IV抑制剂是本领域技术人员熟知的。此类抑制剂包括但不限于氨基甲基吡啶(R1438，Roche)、NVP DPP728(Novartis)、PSN9301(Prosidion)、异亮氨酸噻唑烷(P32/92，Probiodrug)、登那列汀(GSK823093C，Glaxo Smithkline)、西他列汀(januvia，MK-0431，Merck)、维格列汀(galvus，LAF237，Novartis)、沙格列汀(BMS-477118，Bristol-Meyers，Squibb)、阿格列汀(SYR-322，Takeda)、NN-7201(novoNordisk)和ALS 2-0426(Alantos)。
[0286] 在某些实施方案中，本文所述的MAXCAP与Exendin-4、GLP-1激动剂、CGRP、肾上腺髓质素、血清素、胰岛淀粉样多肽、VIP和VPAC1拮抗剂和/或VPAC2激动剂结合施用。
[0287] IV.施用和制剂。
[0288] A)药物制剂。
[0289] 在某些实施方案中，将本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)施用给有需要的哺乳动物。在各种实施方案中，可以施用组合物以降低食欲和/或减轻肥胖症；和/或抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或预防或逆转2型糖尿病；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或改善肝脂肪变性；和/或改善和/或预防和/或逆转NASH和/或NAFLD。
[0290] 这些PAC1受体激动剂(MAXCAP)可以以“天然”形式施用，或者如果需要，可以以盐、酯、酰胺、前药、衍生物等形式施用，条件是该盐、酯、酰胺、前药或衍生物在药理学上是合适的，即在本方发明的一种或多种方法中是有效的。活性剂的盐、酯、酰胺、前药和其他衍生物可以使用合成
有机化学领域技术人员已知的标准程序来制备，并描述于例如(1992)年3月Advanced Organic Chemistry；Reactions,Mechanismsand Structure,第4版N.Y.Wiley-Interscience中。
[0291] 配制此类衍生物的方法是本领域技术人员已知的。例如，多种递送剂的二硫化物盐描述于PCT公布WO 2000/059863中，该公布以引用的方式并入本文。类似地，治疗性肽、拟肽(或其他模拟物)等的酸性盐可以使用通常涉及与合适酸的反应的常规方法从游离碱制备。通常，将药物的碱形式溶解在极性
有机溶剂诸如甲醇或
乙醇中，并向其中添加酸。通过添加极性较小的溶剂，所得的盐要么沉淀要么可以从溶液中析出。用于制备
酸加成盐的合适的酸包括但不限于
有机酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙
酮酸、
草酸、苹果酸、
丙二酸、
琥珀酸、马来酸、富马酸、
酒石酸、
柠檬酸、
苯甲酸、
肉桂酸、
扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、
对甲苯磺酸、水杨酸等；以及
无机酸，例如
盐酸、
氢溴酸、硫酸、
硝酸、磷酸等。通过用合适的碱处理，可以将酸加成盐再转
化成游离碱。本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)的某些特别优选的酸加成盐包括卤化物盐，如可以使用盐酸或氢溴酸制备。反之，使用药学上可接受的碱性诸如氢氧化钠、氢氧化
钾、
氢氧化铵、氢
氧化钙、三甲胺等以类似方式制备本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)的碱性盐。在某些实施方案中，碱性盐包括碱金属盐，例如钠盐和
铜盐。
[0292] 为了制备碱性药物的盐形式，抗衡离子的pKa优选比药物的pKa低至少约2个pH。类似地，为了制备酸性药物的盐形式，抗衡离子的pKa优选比药物的pKa高至少约2个pH。这允许抗衡离子使溶液的pH达到低于pHmax的水平以达到盐平台，在该平台处盐的
溶解度优于游离酸或碱的溶解度。活性药物成分(API)和酸或碱中可电离基团的pKa单位的差异的一般规则意在使质子转移在能量上有利。当API和抗衡离子的pKa没有显著差异时，可形成固体复合物，但固体复合物可在水性环境中快速歧化(即，分解成药物和抗衡离子的各个实体)。
[0293] 优选地，抗衡离子是药学上可接受的抗衡离子。合适的阴离子盐形式包括但不限于乙酸盐、苯
甲酸盐、苄基化物、酒石酸氢盐、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基
硫酸盐、富马酸盐、
葡萄糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴、甲基硫酸盐、粘酸盐、
萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(pamoate/embonate)、
磷酸盐和二磷酸盐、水杨酸盐和二水杨酸盐、
硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘、戊酸盐等；而合适的阳离子盐形式包括但不限于
铝、苄星青霉素、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、氨丁三醇、锌等。
[0294] 在各种实施方案中，酯的制备通常涉及存在于活性剂的分子结构内的羟基和/或羧基的官能化。在某些实施方案中，酯通常是游离醇基的酰基取代的衍生物，即衍生自式RCOOH的羧酸的部分，其中R是烷基，并且优选是低级烷基。如果需要，可以通过使用常规的氢解或
水解程序将酯再转化为游离酸。
[0295] 还可以使用本领域技术人员已知的或相关文献中描述的技术制备酰胺。例如，可以使用合适的胺反应物由酯制备酰胺，或者可以通过与氨或低级烷基胺反应由酸酐或酰氯制备酰胺。
[0296] 在各种实施方案中，如本文所述，本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)可用于肠胃外、局部、口服、鼻(或以其他方式吸入)、直肠或定位施用，如通过
气溶胶或透皮预防和/或治疗处理来施用。取决于施用方法，组合物可以以多种单位剂型施用。合适的单位剂型包括但不限于散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、栓剂、贴剂、鼻喷剂、注射剂、可植入缓释制剂、脂质复合物等。
[0297] 本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)还可以与药学上可接受的载体(赋形剂)组合以形成药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的载体包括由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是用于人类的那些。“载体”是指例如与本发明的活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助剂或媒介物。
[0298] 药学上可接受的载体可含有一种或多种生理学上可接受的化合物，这些化合物用于例如使组合物稳定或增加或减少活性剂的吸收。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物(诸如葡萄糖、
蔗糖或葡聚糖)、抗
氧化剂(诸如
抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、保护和摄取增强剂(诸如脂质)、降低活性剂的清除或水解的组合物、或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。
[0299] 其他生理学上可接受的化合物，特别是用于制备片剂、胶囊剂、软胶囊(gel cap)等的化合物包括但不限于粘结剂、稀释剂/填充剂、崩解剂、
润滑剂、悬浮剂等。
[0300] 在某些实施方案中，要制备口服剂型(例如片剂)，将例如赋形剂(例如乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇等)、任选的崩解剂(例如碳酸钙、
羧甲基纤维素钙、乙醇酸淀粉钠、交聚维酮等)、粘结剂(例如α-淀粉、阿拉伯树胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、环糊精等)和任选的润滑剂(例如滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等)添加到活性组分(例如活性肽)中并压制所得组合物。必要时例如通过用于掩盖
味道或用于肠溶或持续释放的已知方法包被压制产品。合适的包被材料包括但不限于乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚氧乙二醇、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和Eudragit(Rohm&Haas，德国；甲基
丙烯酸-丙烯酸共聚物)。
[0301] 其他生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或特别适用于防止微生物生长或作用的
防腐剂。各种防腐剂是众所周知的，包括例如
苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员将理解，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如活性剂的施用途径和活性剂的特定生理化学特征。
[0302] 在某些实施方案中，赋形剂是无菌的并且通常不含不合需要的物质。可以通过常规的、众所周知的灭菌技术对这些组合物灭菌。对于各种口服剂型的赋形剂(诸如片剂和胶囊剂)，不需要灭菌。USP/NF标准通常就足够了。
[0303] 在某些治疗应用中，将本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)施用，例如局部施用或施用给有需要的患者以便降低食欲和/或减轻肥胖症；和/或抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或预防或逆转2型糖尿病；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或改善肝脂肪变性；和/或改善和/或预防和/或逆转NASH和/或NALD。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的量将取决于疾病的严重程度和患者的一般
健康状态。可以根据患者所需要和耐受的剂量和
频率给予组合物的单次或多次施用。在任何情况下，组合物应提供足够量的本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)以有效治疗患者(例如，改善患者的一种或多种症状)。
[0304] PAC1受体激动剂(MAXCAP)的浓度可以广泛变化，并且将主要基于活性成分的活性、体重等根据所选择的特定施用模式和患者的需求来选择。然而，通常将选择浓度以提供约0.1或1mg/kg/天至约50mg/kg/天且有时更高的剂量范围。典型的剂量范围为约3mg/kg/天至约3.5mg/kg/天、或约3.5mg/kg/天至约7.2mg/kg/天、或约7.2mg/kg/天至约11.0mg/kg/天、或约11.0mg/kg/天至约15.0mg/kg/天。在某些实施方案中，剂量范围为约10mg/kg/天至约50mg/kg/天。在某些实施方案中，剂量范围为约20mg至约50mg，每日口服一次、两次、三次或四次。应理解，可以改变这样的剂量以优化特定受试者或受试者组中的治疗和/或预防方案。
[0305] 在某些实施方案中，将本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)施用于
口腔。这可以通过使用锭剂、气溶胶喷剂、漱口水、包被拭子等容易地实现。
[0306] 在某些实施方案中，根据本领域技术人员熟知的标准方法系统性地施用(例如口服，或作为注射剂)本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)。在其他优选的实施方案中，所述剂还可以使用常规的透皮药物递送系统，即透皮“贴剂”通过
皮肤递送，其中活性剂通常包含在用作贴附于皮肤上的药物递送装置的层合结构内。在这种结构中，药物组合物通常包含在上部背衬层下面的层或“贮器”中。应理解，本上下文中的术语“贮器”是指最终可用于递送至皮肤表面的一定量的“活性成分”。因此，例如，“贮器”可以包括在贴剂背衬层上的
粘合剂中，或者在本领域技术人员已知的任何各种不同的基质制剂中的活性成分。贴剂可以包含单个贮器，或者它可以包含多个贮器。
[0307] 在一个实施方案中，贮器包含用于在药物递送期间将系统贴附于皮肤上的药学上可接受的触压粘合剂材料的聚合物基质。合适的皮肤触压粘合剂材料的实例包括但不限于聚乙烯、聚
硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。或者，含药物的贮器和皮肤触压粘合剂作为单独且不同的层存在，其中粘合剂位于贮器下面，在这种情况下，贮器可以是如上所述的聚合物基质，或者它可以是液体或水凝胶贮器，或者可能采取其他一些形式。这些层合物中用作装置上表面的背衬层优选用作“贴剂”的主要结构元件，并为装置提供大部分柔韧性。选择用于背衬层的材料优选是活性剂和存在的任何其他物质基本上不可透过的材料。
[0308] 如上所述，还设想了各种颊面和舌下制剂。
[0309] 在某些实施方案中，本文所述的一种或多种PAC1受体激动剂(MAXCAP)可以作为“浓缩物”提供，例如，提供在储存容器中(例如，以预先测量的体积)准备稀释，或者提供在可溶性胶囊中，用于添加到一定量的水、酒精、过氧化氢或其他稀释剂中。
[0310] 虽然本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)的用途是就在人类中使用而描述的，但它们也适用于动物，例如兽医用途。因此，某些优选的生物体包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、马、猫、猪、
有蹄类动物、兔类动物等。
[0312] 在某些实施方案中，本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)被配制在纳米乳剂中。纳米乳剂包括但不限于水包油(O/W)纳米乳剂和油包水(W/O)纳米乳剂。纳米乳剂可定义为平均液滴直径范围为约20至约1000nm的乳剂。通常，平均液滴尺寸在约20nm或50nm与约
500nm之间。术语亚微米乳剂(SME)和微乳剂用作同义词。
[0313] 例示性的水包油(O/W)纳米乳剂包括但不限于：
[0314]
表面活性剂胶束--由小分子表面活性剂或
洗涤剂组成的胶束(例如SDS/PBS/2-丙醇)，其主要适用于疏水性肽。
[0315] 聚合物胶束--由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂组成的胶束(例如Pluronic L64/PBS/2-丙醇)，其主要适用于疏水性肽；
[0316] 掺混胶束：胶束，其中有多于一种表面活性剂组分或其中一种液相(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束的形成(例如辛酸/PBS/EtOH)，其主要适用于疏水性肽；
[0317] 整合肽胶束--掺混胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，形成胶束的组成部分(例如两亲性肽/PBS/矿物油)，其适用于两亲性肽；以及
[0318] 皮克林(Pickering)(固相)乳剂--乳剂，其中肽与固体纳米颗粒的外部缔合(例如聚苯乙烯纳米颗粒/PBS/无油相)，其适用于两亲性肽。
[0319] 例示性的油包水(W/O)纳米乳剂包括但不限于：
[0320] 表面活性剂胶束--由小分子表面活性剂或洗涤剂组成的胶束(例如二辛基磺基琥珀酸盐/PBS/2-丙醇、肉豆蔻酸异丙酯/PBS/2-丙醇等)，其主要适用于亲水性肽；
[0321] 聚合物胶束--由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂组成的胶束(例如L121/PBS/2-丙醇)，其主要适用于亲水性肽；
[0322] 掺混胶束：胶束，其中有多于一种表面活性剂组分或其中一种液相(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束的形成(例如癸酸/辛酸甘油二酯/PBS/EtOH)，其主要适用于亲水性肽；
[0323] 整合肽胶束--掺混胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，形成胶束的组成部分(例如两亲性肽/PBS/聚丙二醇)，其适用于两亲性肽；以及
[0324] 皮克林(固相)乳剂--乳剂，其中肽与固体纳米颗粒的外部缔合(例如壳聚糖纳米颗粒/无水相/矿物油)，其适用于两亲性肽。
[0325] 如上文所指出，在某些实施方案中，纳米乳剂包含一种或多种表面活性剂或洗涤剂。在一些实施方案中，表面活性剂是非阴离子洗涤剂(例如，聚山梨醇酯表面活性剂、聚氧乙烯醚等)。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于诸如 和系列化合物的表面活性剂。
[0326] 在某些实施方案中，乳剂还包含一种或多种含阳离子卤素的化合物，这些化合物包括但不限于十六烷基氯化吡啶鎓。在更进一步的实施方案中，组合物还包含一种或多种增加组合物与微生物的相互作用的化合物(“相互作用促进剂”)(例如螯合剂，如缓冲液中的
乙二胺四乙酸或亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸)。
[0327] 在一些实施方案中，纳米乳剂还包含乳化剂以帮助形成乳剂。乳化剂包括在油/水界面聚集形成一种连续膜的化合物，所述化合物防止两个相邻液滴之间发生直接
接触。本发明的某些实施方案表征了水包油乳剂组合物，所述水包油乳剂组合物可以容易地用水稀释至所需浓度而不损害其抗病原特性。
[0328] 除了分散在水相中的离散油滴之外，某些水包油乳剂还可以含有其他脂质结构，诸如小脂质囊泡(例如，通常由几个基本上同心的脂质双层组成的脂质球，所述脂质双层通过水相层彼此隔开)、胶束(例如，呈50-200个分子的小簇的两亲性分子，它们排列成使得极性头部基团朝向水相向外朝向，而非极性尾部远离水相向内隐蔽)或层状相(脂质分散体，其中每个颗粒由平行的两亲性双层组成，所述两亲性双层由水
薄膜隔开)。
[0329] 这些脂质结构是因疏水力而形成，疏水力驱使非极性残基(例如长烃链)远离水。上述脂质制备物通常可描述为表面活性剂脂质制备物(SLP)。SLP对粘膜的毒性极小，并且被认为在小肠内代谢(参见，例如Hamouda等人,(1998)J.Infect.Disease 180:1939)。
[0330] 在某些实施方案中，乳剂包含分布在水相中的不连续油相、包含醇和/或甘油的第一组分，以及包含表面活性剂或含卤素化合物的第二组分。水相可包括任何类型的水相，包括但不限于水(例如去离子水、蒸馏水、
自来水)和溶液(例如磷酸盐缓冲盐水溶液，或其他缓冲体系)。油相可包括任何类型的油，包括但不限于
植物油(例如
大豆油、
鳄梨油、
亚麻籽油、
椰子油、
棉籽油、
角鲨烯油、
橄榄油、芥花油、玉米油、
菜籽油、红花油和葵花油)、
动物油(例如鱼油)、香料油、水不溶性维生素、矿物油和机油。在某些实施方案中，油相包含30-90vol％的水包油乳剂(即，占最终乳剂总体积的30％-90％)，更优选为50％-80％。
[0331] 在某些实施方案中，当存在醇时，醇是乙醇。
[0332] 虽然本发明不受表面活性剂性质的限制，但在一些优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯表面活性剂(例如TWEEN TWEEN TWEEN 和TWEEN )、苯氧基聚乙氧基乙醇(例如 X-100、X-301、X-165、X-102和X-200，以及 )
或十二烷基硫酸钠等。
[0333] 在某些实施方案中，存在含卤素的组分。含卤素化合物的性质，在一些优选实施方案中，含卤素化合物包括氯化物盐(例如NaCl、KCl等)、十六烷基卤化吡啶鎓、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化膦、十二烷基三甲基卤化铵、十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基氯化吡啶鎓、十六烷基三甲基
氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、十六烷基溴化吡啶鎓、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化膦、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵等
[0334] 在某些实施方案中，乳剂包含季铵化合物。季铵化合物包括但不限于N-烷基二甲基苄基铵糖精盐；1,3,5-三嗪-1,3,5(2H,4H,6H)-三乙醇；1-癸铵，N-癸基-N,N-二甲基-，氯化物(或)二癸基二甲基氯化铵；2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基(cresosxy))乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；烷基1或3苄基-1-(2-羟乙基)-2-氯化咪唑啉鎓；烷基双(2-羟乙基)苄基氯化铵；烷基去甲基苄基氯化铵；烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵(100％C12)；烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵(50％C14，40％C12，10％C16)；烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵(55％C14，23％C12，20％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(41％C14，28％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(47％C12，18％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(55％C16，20％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(58％C14，28％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(60％C14，25％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C11，23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C12，23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(65％C12，25％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12，24％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12，25％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(90％C14，5％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(93％C14，4％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(95％C16，5％C18)；烷基二甲基苄基氯化铵(和)二癸基二甲基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(如在脂肪酸中)；烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C18)；烷基二甲基苄基和二烷基二甲基氯化铵；烷基二甲基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14，5％C16，5％C12)；烷基二甲基乙基溴化铵(如在大豆的脂肪酸中的混合的烷基和烯基)；烷基二甲基乙基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C14)；烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C12，30％C14，17％C16，3％C18)；烷基三甲基氯化铵(58％C18，40％C16，1％C14，1％C12)；烷基三甲基氯化铵(90％C18，10％C16)；烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵(C12-18)；二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基甲基苄基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二异癸基二甲基氯化铵；二辛基二甲基氯化铵；十二烷基双(2-羟乙基)辛基氢氯化铵；十二烷基二甲基苄基氯化铵；十二烷基氨甲酰基甲基二甲基苄基氯化铵；十七烷基羟乙基氯化咪唑啉鎓；六氢-1,3,5-三(2-羟乙基)-s-三嗪；肉豆蔻基二甲基苄基氯化铵(myristalkonium chloride)(和)Quaternium 14；N,N-二甲基-2-羟基丙基氯化铵聚合物；正烷基二甲基苄基氯化铵；正烷基二甲基乙基苄基氯化铵；正十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物；辛基癸基二甲基氯化铵；辛基十二烷基二甲基氯化铵；辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵；氧二亚乙基双(烷基二甲基氯化铵)；季铵化合物，二椰油烷基二甲基氯化物；三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵；三甲氧基甲硅烷基季铵盐、三甲基十二烷基苄基氯化铵；正十二烷基二甲基乙基苄基氯化铵；正十六烷基二甲基苄基氯化铵；正十四烷基二甲基苄基氯化铵；正十四烷基二甲基乙基苄基氯化铵；和正十八烷基二甲基苄基氯化铵。
[0335] 纳米乳剂制剂及其制备方法是本领域技术人员熟知的，并且描述于例如美国专利No：7,476,393、7,468,402、7,314,624、6,998,426、6,902,737、6,689,371、6,541,018、6,464,990、6,461,625、6,419,946、6,413,527、6,375,960、6,335,022、6,274,150、6,120,
778、6,039,936、5,925,341、5,753,241、5,698,219和5,152,923以及Fanun等人(2009)Microemulsions:Properties and Applications(Surfactant Science),CRC Press,Boca Ratan Fl中。
[0336] VI.药盒。
[0337] 在另一个实施方案中，本发明提供药盒以降低食欲和/或减轻肥胖症；和/或抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或预防或逆转2型糖尿病；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或改善肝脂肪变性；和/或改善和/或预防和/或逆转NASH和/或NAFLD。
[0338] 药盒通常包括含有一种或多种本文所述的PAC1受体激动剂(MAXCAP)的容器。在某些实施方案中，PAC1受体激动剂可以提供在单位剂量制剂(例如栓剂、片剂、囊片、贴剂等)中和/或可以任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
[0339] 另外，药盒任选地包括提供用于实施本文所述的方法或使用“治疗剂”或“预防剂”的指导(即方案)的标记和/或说明性材料。某些说明性材料描述了本发明的一种或多种活性剂用于治疗性地或预防性地实现以下目的的用途：降低食欲和/或减轻肥胖症；和/或抑制脂肪生成和/或脂肪积累；和/或改善2型糖尿病的一种或多种症状，或减缓2型糖尿病的进展，或预防或逆转2型糖尿病；和/或改善动脉粥样硬化的一种或多种症状；和/或减缓非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展，或预防或逆转非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；和/或改善肝脂肪变性(脂肪肝)的一种或多种症状，和/或减缓和/或预防和/或逆转肝脂肪变性(脂肪肝)；和/或改善代谢综合征的一种或多种症状，和/或减缓代谢综合征的进展，和/或预防和/或逆转代谢综合征；和/或改善胰岛素抵抗的一种或多种症状，和/或减缓胰岛素抵抗的进展，和/或预防和/或逆转胰岛素抵抗；和/或改善糖尿病前期综合征的一种或多种症状，和/或减缓糖尿病前期综合征的进展，和/或预防和/或逆转糖尿病前期综合征；和/或改善肝脂肪变性；和/或改善和/或预防和/或逆转NASH和/或NAFLLD。任选地，说明性材料还可以教导优选的剂量/
治疗方案、禁忌症等。
[0340] 虽然说明性材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本发明设想了能够存储这些说明并将它们传送给最终使用者的任何介质。此类介质包括但不限于
电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。此类介质可以包括提供这些说明性材料的互联网
网站的地址。
[0341] 实施例
[0342] 提供以下实施例以说明，但不限制要求保护的本发明。
[0343] 实施例1
[0344] PAC1受体激动剂的制备和评估。
[0345] 我们将PAC1受体稳定
转染到N|H3T3细胞系中。将含有人PAC1插入物的pCDL-SRd/Neo质粒在氨苄青霉素抗性基因内在其Aat ll限制性位点线性化，并使用电穿孔仪稳定转染到NIH/3T3
成纤维细胞中，所述电穿孔仪设定为475V，1毫秒，对含有20μg载体、Wt cDNA和500μg/ml鲑鱼精子的0.25ml溶液中的2x 107个细胞实行4次脉冲。使用遗传霉素选择克隆。
使10个克隆进行放射性配体结合。选择对腺苷酸环化酶表现出最高功效且表现出放射性配体结合抑制的克隆用于进一步研究。
[0346] MAXCAP 1(SEQ ID NO:2)和MAXCAP 4(SEQ ID NO:3)均以类似于天然PACAP1-38和PACAP1-27的剂量依赖性方式刺激CAMP(参见，例如图1和表7)。
[0347] 表7.与PACAP相比，maxcap 1和maxcap 4的环AMP刺激。
[0348]
[0349] 我们已经证明，这些新设计的作为PAC1特异性激动剂的“MAXCAP”化合物抑制食欲和食物摄取，并且通过抑制胃饥饿素释放诱导饱腹感(参见图2)。我们利用Promethion代谢笼系统在12小时(黑暗/光照周期)期间测量24小时总食物摄取量。
[0350] 我们已经证明，这些作为PAC1特异性激动剂的新型MAXCAP化合物抑制能量消耗，方式为降低RQ、VO2、VCO2和总能量消耗、总活动指数、粗略活动指数、精细活动指数以及平均运动速度(参见图3)。在注射后的大部分黑暗阶段内RQ指数处于0.6区域，即酮症状态，燃烧脂肪量。我们利用Promethion代谢笼系统来收集我们的结果。
[0351] 我们已经证明，这些作为PAC1特异性激动剂的新型MAXCAP化合物是潜在的抗肥胖症靶标(参见例如图4)。我们将这些MAXCAP化合物注射到DIO WT小鼠中以测量体重并分析体脂和瘦体量组成。
[0352] 我们已经证明，这些作为PAC1特异性激动剂的新型MAXCAP化合物可以潜在地治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和肝纤维化。我们将这些MAXCAP化合物注射到DIO WT小鼠中并测量肝中的肝脂肪(参见例如图5)。如通过苏木精和伊红(H&E)染色分析的，媒介物处理的DlO小鼠具有显著的肝硬化和肝脂肪组成，促成NASH/NAFLD诊断，然而PACAP处理使得肝硬化和NASH/NAFLD显著减少。
[0353] 我们已经证明，这些作为PAC1特异性激动剂的新型MAXCAP化合物是肝细胞和脂肪细胞中脂肪生成的抑制剂(参见例如图6)。将NIH 3T3-L1前脂肪细胞在4.5mg/mL葡萄糖，50mM地塞米松，40.5mM IBMX和150mg/mL胰岛素分化培养基中分化2周。每天施加PACAP1-27以剂量依赖性方式分化细胞。通过Oil Red 0染色
可视化脂质积累。通过ImageJ
图像处理软件进行定量。比例尺，200μm。在20倍放大率下观看图像。每组N＝3-4。a.u.，任意单位。与阳性对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
[0354] 应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且这些实施例和实施方案的各种
修改或改变将能被本领域技术人员联想到，且包括在本申请的精神和界限以及所附
权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文。
