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用于治疗癌症的化合物和其用途

阅读：10发布：2021-02-03

专利汇可以提供用于治疗癌症的化合物和其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及某些2,4?二取代的喹啉衍生物、涉及其疗法、以及涉及包含所述化合物的药物组合物。更具体地，本发明涉及用于治疗特征为过度活性的Ras和/或Rac或信号通路的癌症的某些2,4?取代的喹啉衍生物或包含所述化合物的药物组合物。，下面是用于治疗癌症的化合物和其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种组合物，包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇和(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
2.如权利要求1所述的组合物，包含大于90％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。
3.如权利要求2所述的组合物，包含大于95％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。
4.如权利要求3所述的组合物，包含大于99％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。
5.一种(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。
6.如权利要求1所述的组合物，包含大于90％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
7.如权利要求6所述的组合物，包含大于95％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
8.如权利要求7所述的组合物，包含大于99％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
9.一种(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
10.如权利要求1所述的组合物，包含小于0.5％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
11.如权利要求1所述的组合物，包含小于0.5％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。
12.如权利要求1所述的组合物，包含小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。
13.如权利要求1所述的组合物，包含小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](S)-哌啶-2-基甲醇。
14.一种药物组合物，包含权利要求1-13中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
15.一种治疗癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-13中任一项的组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症与改变的Ras/Rac活性有关。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症是胶质瘤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述成胶质细胞瘤选自原神经的成胶质细胞瘤、经典的成胶质细胞瘤和间叶细胞的成胶质细胞瘤。
20.权利要求1-13中任一项所述的组合物用于治疗癌症的用途。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述癌症与改变的Ras/Rac活性有关。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述癌症是胶质瘤。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述成胶质细胞瘤选自原神经的成胶质细胞瘤、经典的成胶质细胞瘤和间叶细胞的成胶质细胞瘤。
25.权利要求1-13中任一项所述的组合物在制造用于治疗癌症的药剂中的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症与改变的Ras/Rac活性有关。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述癌症是胶质瘤。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述成胶质细胞瘤选自原神经的成胶质细胞瘤、经典的成胶质细胞瘤和间叶细胞的成胶质细胞瘤。
30.一种包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，
用于治疗与如本文定义的改变的Ras/Rac活性有关的癌症，
其中
m是1或2；
q是0或1；
R1是H或C1-C3烷基；
R2选自C1-C6烷基；以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基、杂环基以及杂芳基，各自被一个或更多个基团R7任选地取代；
R3、R4以及R5独立地选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；或R3和R4，和它们附接于的相邻的原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；
R6是H或C1-C3烷基；
每个R7独立地选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烯基、卤素、烷基氨基以及NR8C(O)OR9；
R8是H或C1-C3烷基；并且
R9是C1-C6烷基；
条件是所述化合物不是甲氟喹。
31.如权利要求30所述的化合物，其中R2是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基。
32.如权利要求30所述的化合物，其中R2是苯基。
33.如权利要求30所述的化合物，其中m是2并且q是0。
34.如权利要求30所述的化合物，选自
以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。
35.如权利要求30所述的化合物，其中，所述化合物选自：
4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、
2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、
(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、
(2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、
(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、
(R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、
(S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、
(S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、以及
(R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇
以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。
36.如权利要求34或35所述的化合物，其中所述化合物选自前面提及的化合物的(R,S)异构体和(S,R)异构体或其外消旋混合物。
37.如权利要求34或35所述的化合物，其中所述化合物选自所述化合物的对映体地纯的(R,S)立体异构体或(S,R)立体异构体。
38.如用于权利要求30-37中任一项的用途的化合物，其中所述癌症是胶质瘤。
39.如权利要求38所述的化合物，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
40.如权利要求39所述的化合物，其中所述成胶质细胞瘤选自原神经的成胶质细胞瘤、经典的成胶质细胞瘤和间叶细胞的成胶质细胞瘤。
41.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的、权利要求30-37中任一项的化合物、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
42.包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物
在制造用于治疗如本文定义的、与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途，其中
m是1或2；
q是0或1；
R1是H或C1-C3烷基；
R2选自C1-C6烷基；以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基、杂环基或杂芳基，各自被一个或更多个基团R7任选地取代；
R3、R4以及R5独立地选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；或R3和R4，和它们附接于的相邻的原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；
R6是H或C1-C3烷基；
每个R7独立地选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烯基、卤素、烷基氨基以及NR8C(O)OR9；
R8是H或C1-C3烷基；并且
R9是C1-C6烷基，
条件是所述化合物不是甲氟喹。
43.如权利要求42所述的用途，其中R2是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基。
44.如权利要求42所述的用途，其中R2是苯基。
45.如权利要求42所述的用途，其中m是2并且q是0。
46.如权利要求42所述的用途，其中所述化合物选自：
以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。
47.如权利要求42所述的用途，其中所述化合物选自：
4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、
2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、
(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、
(2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、
(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、
(R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、
(S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、
(S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、和
(R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇
以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。
48.如权利要求46或47所述的用途，其中所述化合物选自前面提及的化合物的(R,S)异构体和(S,R)异构体或其外消旋混合物。
49.如权利要求46或47所述的用途，其中所述化合物选自所述化合物的对映体地纯的(R,S)立体异构体或(S,R)立体异构体。
50.如权利要求42-49中任一项所述的用途，其中所述癌症是胶质瘤。
51.如权利要求50所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
52.如权利要求51所述的用途，其中所述成胶质细胞瘤选自原神经的成胶质细胞瘤、经典的成胶质细胞瘤和间叶细胞的成胶质细胞瘤。
53.一种治疗癌症的方法，所述癌症与受试者中的改变的Ras/Rac活性有关，所述方法包括施用式(I)的化合物
包括其立体异构体和互变异构体，
其中
m是1或2；
q是0或1；
R1是H或C1-C3烷基；
R2选自C1-C6烷基；以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基、杂环基以及杂芳基，各自被一个或更多个基团R7任选地取代；
R3、R4以及R5独立地选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；或R3和R4，和它们附接于的相邻的原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；
R6是H或C1-C3烷基；
每个R7独立地选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烯基、卤素、烷基氨基以及NR8C(O)OR9；
R8是H或C1-C3烷基；并且
R9是C1-C6烷基；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，
条件是所述化合物不是甲氟喹。
54.如权利要求53所述的方法，其中R2是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基。
55.如权利要求53所述的方法，其中R2是苯基。
56.如权利要求53所述的方法，其中m是2并且q是0。
57.如权利要求53所述的方法，其中所述化合物选自：
以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。
58.如权利要求53所述的方法，其中所述化合物选自：
4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、
2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、
(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、
(2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、
(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、
(R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、
(S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、
(S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、和
(R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇
以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中所述化合物选自前面提及的化合物的(R,S)异构体和(S,R)异构体或其外消旋混合物。
60.如权利要求57或58所述的方法，其中所述化合物选自所述化合物的对映体地纯的(R,S)立体异构体或(S,R)立体异构体。
61.如权利要求53-60中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质瘤。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述成胶质细胞瘤选自原神经的成胶质细胞瘤、经典的成胶质细胞瘤和间叶细胞的成胶质细胞瘤。
64.一种用于向癌细胞选择性递送货物化合物、物质和/或分子的方法，所述方法包括a)将所述货物化合物、物质和/或分子共价地缀合至权利要求1-13的组合物或式(I)的化合物
包括其立体异构体和互变异构体，
其中
m是1或2；
q是0或1；
R1是H或C1-C3烷基；
R2选自C1-C6烷基；以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基、杂环基以及杂芳基，各自被一个或更多个基团R7任选地取代；
R3、R4以及R5独立地选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；或R3和R4，和它们附接于的相邻的原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；
R6是H或C1-C3烷基；
每个R7独立地选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烯基、卤素、烷基氨基以及NR8C(O)OR9；
R8是H或C1-C3烷基；并且
R9是C1-C6烷基；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，
以形成缀合物
以及
b)使所述缀合物暴露至癌细胞，使得所述缀合物接触所述癌细胞。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述式1的化合物不是甲氟喹。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述缀合物在体内或体外接触所述癌细胞。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述货物物质/化合物/分子是细胞毒性化合物。
68.如权利要求64所述的方法，其中所述货物是癌症治疗药物。
69.如权利要求64所述的方法，其中所述货物是用于癌细胞的选择性成像的成像分子。
70.如权利要求64所述的方法，其中所述货物具有在体内杀死胶质瘤细胞的能力。
71.权利要求68的缀合物用于癌症的治疗的用途。
72.如权利要求71所述的用途，其中所述癌症是胶质瘤。
73.如权利要求72所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
74.权利要求69的缀合物的用途，其中所述癌症是胶质瘤。
75.如权利要求74所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
76.一种用于评估用于治疗胶质瘤的测试化合物的筛选测定，所述筛选测定包括以下步骤：
a)通过以下防止斑马鱼胚胎的色素形成
i)在1细胞期用阻断胚胎的色素形成的发展的物质注射胚胎，
和/或
ii)将苯基硫脲(PTU)添加至待用于温育所述胚胎的温育器的水箱水，
b)将所述胚胎放置在温育器中并且允许所述斑马鱼胚胎生长持续受精后两天(2dpf)；
c)收集所述斑马鱼，并且将其麻醉；
d)将未标记的或染料标记的或转基因表达的癌细胞，例如来自脑肿瘤胶质瘤细胞的原发肿瘤的细胞，例如成胶质细胞瘤细胞，注射到所述胚胎的脑室中；
e)任选地除去错误地注射的胚胎；
f)允许所述斑马鱼从麻醉中恢复，例如持续约3-4小时；
g)将活的游动的斑马鱼分配到多孔板或类似的容器中；
h)以测试浓度将测试化合物添加至所述孔或容器；
i)定期地，例如每天，用包含所述相同药物浓度的水交换在所述孔或容器中的水箱水；
j)随时间监测所述斑马鱼以通过确定在所述斑马鱼脑中的胶质瘤(成胶质细胞瘤)细胞的增加或减少来确立在胶质瘤的治疗中评估的所述药物的效力。
77.如权利要求30、42、或53中任一项所述的化合物，选自，
5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物、
4-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺和4-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺的混合物、(R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、
(R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物。
78.如权利要求30、42、或53所述的化合物，选自，
5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物、
4-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺和4-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺的混合物、(R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、
(R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、
(R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、
(R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物。
79.如权利要求30、42、或53所述的化合物，选自

说明书全文

用于治疗癌症的化合物和其用途

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请根据35U.S.C.§119要求于2013年9月9日提交的瑞典申请SE1351041-7、于2013年9月9日提交的美国临时专利申请序号第61/875,420号、于2013年12月18日提交的美国临时专利申请序号第61/917,581号、和于2014年6月19日提交的美国临时专利申请序号第62/014,163号的优先权的权益，这些申请的全部公开内容通过引用并入本文。
发明领域

[0003] 本发明涉及某些2,4-二取代的喹啉衍生物、其在治疗中的用途、以及包含所述化合物的药物组合物。特别地，本发明涉及用于治疗癌症的某些2,4-二取代的喹啉衍生物和包含这些化合物的药物组合物。本发明还涉及用于鉴定此类化合物的测定。本发明还涉及用于化合物递送的癌细胞特异性非网格蛋白依赖性液泡化(cancer-cell specific non-clathrin-dependent vacuolization)的用途和/或成像方法。

[0004] 发明背景

[0005] 胶质瘤是一种在脑或脊柱中开始、由胶质细胞引起的肿瘤类型。大部分胶质瘤是颅内肿瘤，其每年影响约100,000个个体中的7个，这使得它是脑癌的最常见形式。胶质瘤通过细胞类型、通过等级、以及通过位置来分类。胶质瘤根据它们与其共享组织学特征的细胞的特定的类型被命名。胶质瘤的主要类型是室管膜瘤(室管膜细胞)、星形细胞瘤(星形细胞)、少突神经胶质瘤(少突细胞)以及混合的胶质瘤(包含来自不同类型的胶质的细胞)。胶质瘤还根据其等级被分类，所述等级通过肿瘤的病理评估被确定。根据WHO(世界卫生组织)，胶质瘤被分等级为从I至IV，其中I级是最低级疾病(least advanced disease)(最好的预后)并且IV级是最高级疾病(最差的预后)。I级胶质瘤(例如，血管中心性胶质瘤、毛细胞星形细胞瘤、乳突状胶质神经元肿瘤(PGNT)、垂体细胞瘤)相对地是良性的，具有慢的增殖速率并且治愈的可能性仅遵循手术切除。II级肿瘤(例如，少突神经胶质瘤、室外神经细胞瘤、少突星形细胞瘤以及星形细胞瘤)同样地缓慢地增殖，但不同于毛细胞星形细胞瘤，倾向于通过邻近组织的缓慢渗入而恶性进展并且可以进展成更高等级的恶性肿瘤。III级损伤(例如，间变性星形细胞瘤、间变性少突星形细胞瘤、以及间变性神经节神经胶质瘤)具有恶性肿瘤的组织学证据并且需要手术切除和随后的化学疗法两者。WHO IV级指定(例如，成胶质细胞瘤、胚胎性赘生物、胶质肉瘤)是与快速疾病进展和不变地致命性结果有关的高度恶性的、有丝分裂活性的肿瘤。胶质瘤还可以根据它们的位置被分类，它们是否在脑中的小脑幕膜之上或之下。肿瘤是幕上的(在小脑幕之上)、幕下的(在小脑幕之下)或脑桥的(位于脑干的脑桥中)。

[0006] 多形性成胶质细胞瘤(GBM或IV级星形细胞瘤)是最常见的且侵略性的胶质瘤并且特征是高增殖速率、侵略性的侵入力(aggressive invasiveness)以及耐放射疗法和耐化学疗法。尽管在包括导致存活率明显提高的化学辐照法(chemo-irradiation approach)的治疗策略方面的改进，然而由于肿瘤复发，中位存活时间仍旧限于约15个月。因此，需要新的疗法，并且理解支持肿瘤发展的生物学在发现提高患者存活率的新的有效治疗方面是很重要的。

[0007] 肿瘤发展包括躯体的突变，并且有时是遗传的突变，所述突变可以是造成癌症的、导致细胞的生物学方面的根本变化的在原癌基因中的功能获得性突变或在肿瘤抑制基因中的功能丧失性突变。这样的改变常常包括细胞周期的促有丝分裂信号或调节物的增强的转导、细胞凋亡、衰老、细胞粘附或DNA修复通路。数百个多形性成胶质细胞瘤(GBM)样品的基因组研究已经导致对GBM的基因组景观(genomic landscape)的全面的理解并且揭示在
常常被激活的核信号通路中的功能获得和功能丧失两者，包括具有EGFR/PI3K/PTEN/NF1/RAS改变的受体酪氨酸激酶(RTK/RAS)致癌通路；具有TP53/MDM2/MDM4/p14ARF变化的变化的p53通路；以及最后具有RB1/CDK4/p16INK4A/CDKN2B改变的细胞周期调节通路，大部分GBM肿瘤具有所有三个通路中的基因改变。结果是细胞增殖和提高的存活和侵入性质的燃料，同时使肿瘤细胞免受衰老、细胞凋亡以及细胞周期检查点的激活。一致地，恶性胶质瘤是在最侵略性的人类癌症中并且代表CNS中的恶性肿瘤的大多数。GBM基本上是不可治愈
的，即使当基于手术肿瘤切除和伴随的化学疗法和放射疗法的侵略性疗法(aggressive
therapy)被实施时并且由于疾病复发，仅3-5％的患者存活超过3年。

[0008] 尽管常常以小数目存在，但癌症干细胞(CSC)具有当被异种移植到动物中时引起肿瘤的能力，而剩余的非CSC肿瘤物质(tumor mass)最经常地不能引起肿瘤。被称为癌症干细胞的具有干/祖细胞特性的GBM细胞的小的群体可以播种(seed)新的肿瘤的生长并且被
认为是恶性肿瘤、转移以及肿瘤复发的主要驱动器，这促进对基于放射的疗法和化学疗法的抗性。在治疗胶质瘤中使用的当前金标准化学疗法是替莫唑胺(TMZ)，主要地以DNA复制为靶标的抗肿瘤药。TMZ与严重副作用和在靶向CSC中有限的效力相联系。引发肿瘤的CSC被认为是相对地不活动的，这可以有助于在以与细胞分裂有关的细胞内过程为靶标的当前治疗策略(例如，TMZ)之后的疾病复发。具有CSC性质的引发肿瘤的细胞已经在具有高的致瘤可能和低的增殖速率的成胶质细胞瘤中被鉴定并且呈现与正常的干细胞的某些表型相似
性，例如CD133基因表达和在神经干细胞中常常表达的其他基因。CSC已经被示出分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元，以及分散到脑的新的位置中。

[0009] 不同于其中通过遗传研究鉴定参与的基因产物已经导致一系列消除通过基因改变获得的功能的药物的癌症的若干其他形式，成胶质细胞瘤遗传学的复杂性和多样性已经阻止用于治疗性靶标的简单的策略。集中于消除在肿瘤发展下的变态特征的新的方法迄今为止仅仅具有有限的成功。

[0010] 在神经系统中的癌症是高度多样性的、不同细胞源的、不同遗传背景的，并且通过不同的机制在生命中的不同时间出现。神经学的肿瘤包括来自外周肿瘤的一切，例如各种神经板肿瘤(nerve sheet tumor)、神经纤维瘤(神经纤维肉瘤、多发性神经纤维瘤)、神经鞘瘤/施旺细胞瘤(schwannoma)(听神经瘤、成神经细胞瘤)、脊髓和脑肿瘤，例如脑膜瘤、血管外皮细胞瘤、原发性CNS淋巴瘤、室管膜瘤、脉络丛肿瘤、神经节瘤、成视网膜母细胞瘤、神经细胞瘤、髓母细胞瘤、髓质上皮瘤、胶质瘤、少突神经胶质瘤。

[0011] 在脑癌中，例如比如成胶质细胞瘤，PRC2活性被抑制，而不是被提高(Lewis,PW(2013)Science,240,857-861)。在胶质瘤中，对PRC2活性的RNAi介导的减弱或药理学抑制对细胞凋亡或BedU并入具有很小至没有影响，但改变基因表达(Natsume A,(2013)Cancer Res,73,4559；Chan,K.-M.等人(2013)Genes Dev.27,985-90)。这样降低的PRC2活性成为脱抑制的基础，脱抑制导致当被表达时是胶质瘤的已知驱动器的基因的升高的表达。此外，在胶质瘤细胞的基因组中的错位的PRC2还导致某些基因的增多的基因表达，包括已知的肿瘤抑制因子(Chan,K.-M.等人(2013)Genes Dev.27,985-90)。因此，在胶质瘤中的降低的PRC2活性将被预计供癌症以燃料。

[0012] 国际专利申请PCT/CA2012/050767(WO/2013/059944)公开了用于治疗与极度活跃的多梳2复合体(polycomb 2complex)(PRC2)有关的疾病(包括各种癌症疾病)的以下通式
的化合物提供的试验性数据是用于淋巴细胞系和乳腺癌细胞系。对于
任何类型的神经系统癌症没有证据被呈递。另外，胶质瘤不被认为是与极度活跃的多梳2复合体(PRC2)有关的疾病。

[0013] 另外，α-2-哌啶基-2-苯基-4-喹啉甲醇对禽疟(avian malaria)比没有2-苯基的对应的化合物是更有效的，表明包含不同2-芳基取代基的类似化合物的合成。Journal of the American Chemical Society(1946),68,2705-8。这些化合物中没有一个与癌症有任何关系。

[0014] 在霍乱弧菌(Vibrio cholera)中的生物膜形成的小分子抑制剂(包括2-(4-氯苯基)-喹啉-4-基)-(哌啶-2-基)甲醇和哌啶-2-基(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇)在Molecular BioSystems(2011),7(4),1176-1184、和Organic Letters(2013),15(6),
1234-1237中被公开。

[0015] 国际专利申请PCT/US2013/027276(WO/2013/126664)和Journal of Medicinal Chemistry(2012),55,3113-3121公开了化合物(2-(4-甲氧基苯基)喹啉-4-基)-(哌啶-2-
基)甲醇(NSC23925)的光学活性立体异构体反转人类癌症中的多药耐药的用途。该公开内容涉及以P-糖蛋白(Pgp)MDR1转运体复合物的功能为靶标与其他化学疗法剂组合并且没有要求保护化合物自身的抗肿瘤作用。

[0016] 对开发新颖的胶质瘤疗法存在持续的需求，所述新颖的胶质瘤疗法包括具有独特的作用机制的那些，可以改进用于胶质瘤癌症患者的当前非常差的预后。

[0017] 发明概述

[0018] 本发明涉及新的化合物，某些2,4-二取代的喹啉衍生物、涉及其在疗法中的用途、以及涉及包含所述化合物的药物组合物。更特别地，本发明涉及用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的某些2,4-取代的喹啉衍生物或包含所述化合物的药物组合物。还更特别地，本发明涉及用于治疗胶质瘤的某些2,4-二取代的喹啉衍生物或包含所述化合物的药物组合物。本发明还涉及用于鉴定此类化合物的测定。本发明旨在提供能够在对身体的其他细胞类型最小影响下，选择性地杀死肿瘤细胞的分子。

[0019] 引发肿瘤的癌细胞，与其他类干细胞类似，具有独特的分子特征，所述分子特征可以允许选择性靶向癌症，并且用于癌症的治疗，特别地与改变的Ras/Rac活性有关的癌症，例如胶质瘤，并且更特别地成胶质细胞瘤(本文还称为多形性成胶质细胞瘤、或GBM)。本发明涉及提供能够在对身体的其他细胞类型最小影响下，选择性地杀死肿瘤细胞和/或癌症干细胞的化合物。更特别地，本发明涉及2,4-二取代的喹啉衍生物的制备及其在治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症中的用途，所述与改变的Ras/Rac活性有关的癌症例如但不限于，胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、尿道癌、结肠直肠癌、唾液腺癌、前列腺癌、肠癌、皮肤癌、血液/淋巴恶性肿瘤、胶质瘤和宫颈癌。

[0020] 另外，本发明还涉及对具有改变的Ras/Rac活性和/或下游信号通路的癌症且特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞是选择性的新的非网格蛋白依赖性液泡化细胞死亡机制的用途。例如，选择性的液泡化可以被用于向癌细胞，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞选择性地递送期望的化合物或物质，或被用于递送用于癌细胞，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞的选择性成像的成像分子。本发明的化合物可以被用于在癌细胞，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞中实现此选择性液泡化、或诱导所述相同选择性液泡化机制的任何其他合适的化合物。此外，本发明还涉及用于鉴定在治疗癌症，特定地胶质瘤，特别地成胶质细胞瘤中有效的此类化合物和/或诱导所述癌症，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞特异性液泡化的化合物的新颖的斑马鱼筛选测定。

[0021] 本发明的一方面是式(I)的化合物

[0022]

[0023] 包括其立体异构体和互变异构体，其中

[0024] m是1、2或3；

[0025] q是0或1；

[0026] R1是H或C1-C3烷基；

[0027] R2选自C1-C6烷基；以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基、杂环基以及杂芳基，各自被一个或更多个基团R7任选地取代；

[0028] R3、R4以及R5独立地选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；或

[0029] R3和R4，和它们附接于的相邻的原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；

[0030] R6是H或C1-C3烷基；

[0031] 每个R7独立地选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烯基、卤素、烷基氨基以及NR8C(O)OR9；

[0032] R8选自H和C1-C3烷基；并且

[0033] R9是C1-C6烷基、杂芳族基(heteroaromatic)或苯基；

[0034] 或式(I)的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，它们用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症。例如，式I的化合物不是甲氟喹。例如，R2不是未被取代的吡啶基。

[0035] 例如，本发明涉及选自化合物S8、S9、S14、S16、S19、S20、S21、S22、以及S23的式I的化合物。

[0036] 例如，本发明涉及选自化合物S24、S25、S26、S27、S28、以及S29的式I的化合物。

[0037] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中m是1或2。

[0038] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中q是0。

[0039] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中m是2并且q是0。

[0040] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中R2是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基。

[0041] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中R2是苯基。

[0042] 本发明的另一方面是选自以下的化合物：

[0043] 4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、

[0044] 2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、

[0045] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、

[0046] (2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0047] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、

[0048] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、

[0049] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、

[0050] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、以及

[0051] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。

[0052] 又另一方面是选自以下的化合物：

[0053] 4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、

[0054] 2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、

[0055] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、

[0056] (2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0057] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、

[0058] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、

[0059] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、

[0060] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、以及

[0061] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇

[0062] 或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，它们用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症。

[0063] 又另一方面是选自以下的化合物：

[0064] 4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、

[0065] 2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、

[0066] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、

[0067] (2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0068] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、

[0069] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、

[0070] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、

[0071] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、以及

[0072] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇

[0073] 或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，它们用于治疗胶质瘤，并且特定地成胶质细胞瘤。

[0074] 另一方面是包含治疗有效量的选自以下的化合物的药物组合物：

[0075] 4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、

[0076] 2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、

[0077] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、

[0078] (2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0079] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、

[0080] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、

[0081] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、

[0082] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、以及

[0083] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

[0084] 另一方面是选自以下的化合物：

[0085] 5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物、

[0086] 4-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺和4-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺的混合物、

[0087] (R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0088] (R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0089] 或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，它们用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症。

[0090] 另一方面是包含治疗有效量的选自以下的化合物的药物组合物：

[0091] 5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物、

[0092] 4-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺和4-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺的混合物、

[0093] (R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0094] (R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0095] (R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0096] (R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0097] 或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

[0098] 特别地，本发明涉及所有前面提及的化合物的R,S异构体和/或S,R异构体用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的优选的用途。

[0099] 本发明的另外的方面涉及包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物用于治疗胶质瘤的用途。

[0100] 本发明的另外的方面涉及包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物用于治疗成胶质细胞瘤的用途。

[0101] 还另一方面是包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物在制造用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途。

[0102] 还另一方面是包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物在制造用于治疗胶质瘤的药剂中的用途。

[0103] 还另一方面是包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物在制造用于治疗成胶质细胞瘤的药剂中的用途。

[0104] 还另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac有关的癌症的方法，据此如本文以上定义的包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，优选地人类。

[0105] 还另一方面是用于治疗胶质瘤的方法，据此如本文以上定义的包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，优选地人类。

[0106] 还另一方面是用于治疗成胶质细胞瘤的方法，据此如本文以上定义的包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，优选地人类。

[0107] 本发明还提供(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇的组合物。组合物可以包含大于90％、大于
95％或大于99％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇。

[0108] 在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、和/或(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0109] 本发明还提供包含小于1％、小于0.7％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的手性地纯化的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0110] 本发明还提供(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的组合物。组合物可以包含大于90％、大于
95％或大于99％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0111] 在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、和/或(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。

[0112] 本发明还提供包含小于1％、小于0.7％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇的手性地纯化的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。

[0113] 本发明的另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物。

[0114] 本发明的另外的方面涉及(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗胶质瘤的用途。

[0115] 本发明的另外的方面涉及(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗成胶质细胞瘤的用途。

[0116] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途。

[0117] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗胶质瘤的药剂中的用途。

[0118] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗成胶质细胞瘤的药剂中的用途。

[0119] 还另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac有关的癌症的方法，据此(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0120] 还另一方面是用于治疗胶质瘤的方法，据此(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0121] 还另一方面是用于治疗成胶质细胞瘤的方法，据此(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0122] 本发明的另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物。

[0123] 本发明的另外的方面涉及(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗胶质瘤的用途。

[0124] 本发明的另外的方面涉及(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗成胶质细胞瘤的用途。

[0125] 还另一方面是(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途。

[0126] 还另一方面是(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗胶质瘤的药剂中的用途。

[0127] 还另一方面是(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗成胶质细胞瘤的药剂中的用途。

[0128] 还另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac有关的癌症的方法，据此(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0129] 还另一方面是用于治疗胶质瘤的方法，据此(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0130] 还另一方面是用于治疗成胶质细胞瘤的方法，据此(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0131] 本发明还提供包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇的药物组合物。药物组合物可以包含大于90％、大于95％或大于99％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，药物组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，药物组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇、(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、和/或(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0132] 本发明还提供包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的药物组合物。药物组合物可以包含大于90％、大于95％或大于99％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，药物组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，药物组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇、(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、和/或(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0133] 本发明还提供用于选择性地制备(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、和/或(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇的方法。

[0134] 例如，甲基化的(S)-L-哌啶酸的三苯甲基化提供通过从2,4-二溴喹啉产生的格氏试剂产生适于面选择性加成(face-selective addition)的手性的哌啶甲醛材料(piperidine carbaldehyde material)的可能性。然后，单分离的R,S异构体经受合适的4-氯苯基硼酸的Suzuki偶合，这在三苯甲基的伴随的脱保护之后产生期望的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0135] 例如，通过用亚硫酰氯随后是用甲醇或适于形成手性羧酸酯的其他试剂的处理将(S)-L-哌啶酸转化成对应的酯，例如(2S)-1-哌啶-2-羧酸甲酯，(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇在若干步骤中产生。然后，中间体酯用合适的保护基团，例如三苯甲基保护以形成氮保护的羧酸酯，例如(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-羧酸甲酯，其然后被转化成对应的醇，例如通过用合适的试剂，例如LiAlH4还原。然后，通过与合适的氧化剂，例如草酰氯反应(例如，斯文氧化反应(Swern oxidation))，将[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇转化成对应的醛，然后，获得的(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-甲醛与从合适的试剂，例如2,4-二溴喹啉原位产生的面选择性格氏试剂反应以产生单R,S异构体(R)-(2-溴喹啉-4-基)[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇。然后，此溴化合物经受与合适的苯基硼酸(例如，4-氯苯基硼酸)的Suzuki偶合以产生(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)-
1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇，其在除去N保护基(例如，三苯甲基)之后产生(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0136] 优选地，产生的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)-哌啶-2-基甲醇包含小于1％、小于0.7％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0137] 本发明对于具有导致在大部分人类癌症中观察到的增加的液泡化例如增加的Ras/Rac和/或下游信号通路的下调通路(de-regulated pathway)的癌症可以是有用的。特定地，癌症可以包括与升高的水平或Ras和/或Rac过度活性有关的所有类型的实体瘤和血液学癌症，例如在以下的组织中的癌症：肾上腺、自主神经节、胆道、骨骼、乳房、中枢神经系统、子宫颈、子宫内膜、造血组织/淋巴组织、肾、大肠、肝、肺、食管、卵巢、胰腺、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、上呼吸消化道(upper aerodigstive tract)、尿道(Ian A.Prior.,Paul D Lewis,Carla Mattos(2012)“A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.”Cancer Research 72,2457-2467)。

[0138] 更特定地，用于用本文描述的化合物和方法治疗的癌症可以包括关于胶质瘤类别的所有类型的胶质瘤，即室管膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤以及全部四个等级(等级I-IV)和在所有可能的位置中的混合的胶质瘤。优选地，胶质瘤的类型是星形细胞瘤。更优选地星形细胞瘤是成胶质细胞瘤，例如GBM。例如成胶质细胞瘤可以选自原神经的成胶质细胞瘤(proneural glioblastoma)、经典的成胶质细胞瘤(classical glioblastoma)和间叶细胞的成胶质细胞瘤(mesenchymal glioblastoma)。

[0139] 在一方面，本发明的化合物是用于组合疗法中。例如，用本发明的化合物治疗受试者还可以包括癌症的手术切除(surgical removal)。例如，用本发明的化合物组合治疗还可以包括施用放射疗法。例如，用本发明的化合物组合治疗还可以包括另外的抗癌剂的施用，和/或与本文描述的疗法组合。这样的组合疗法可以是同期的、相继的或交替的。

[0140] 本发明还涉及前面提及的化合物用于通过诱导的大胞饮(macropinocytosis)将诸如治疗性DNA、基因产物、细胞毒性剂、抗体、穿膜肽(cell penetrating peptide)、纳米颗粒或其他剂的物质递送到细胞中的用途。

[0141] 本发明还涉及上文定义的化合物用于将期望的分子或物质，特别地治疗剂递送至癌细胞，例如成胶质细胞瘤细胞的用途。这样的分子/物质包括治疗性DNA、基因产物、细胞毒性剂、抗体、穿膜肽、纳米颗粒或可以在体内杀死胶质瘤细胞的其他剂。此外，使用本发明的化合物将成像分子选择性地递送至胶质瘤细胞，例如成胶质细胞瘤细胞将给出实现癌细胞，例如成胶质细胞瘤细胞特异性成像的可能性。

[0142] 本发明的另外的方面是用于鉴定此类抗致癌化合物的筛选测定，以及用于鉴定抗脑肿瘤活性化合物的筛选工具。所述新颖的筛选测定在下文更详细地被描述。

[0143] 最后，本发明的一方面是用于在具有改变的Ras/Rac活性的癌细胞并且特定地胶质瘤细胞中选择性地调节大胞饮介导的细胞死亡的方法。

[0144] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另外清楚地指示，否则在本说明书中，单数形式也包括复数。虽然与本文描述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料可以被用于本发明的实践或测试中，但下文描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、以及其他参考文献通过引用被并入。本文列举的参考文献不被承认为要求保护的发明的现有技术。在发生抵触的情况下，本说明书(包括定义)将占主导。此外，材料、方法、以及实施例仅是说明性的并且不意图是限制性的。

[0145] 从以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将是明显的。

[0146] 附图简述

[0147] 图1描述了示出Vaquinol-1的作用和剂量响应曲线的图。(A,B)和(C-K)在分别用DMSO或Vacquinol-1治疗之后，GSC对细胞周期的作用：在活力测定(ATP)中，Vacquinol-1浓度对不同GSC密度(C)、用Vacquinol-1处理1天的GSC(D)、用TMZ处理1天的GSC(E)、用
Vacquinol-1处理1天的小鼠神经胶质(F)、用Vacquinol-1处理1天的成纤维细胞(G)、用
Vacquinol-1处理2天的GSC(H)、用Vacquinol-1处理3天的GSC(I)、用Vacquinol-1处理4天的GSC(J)、用Vacquinol-1处理4天的成纤维细胞(K)的剂量响应。

[0148] 图2是图示由Vacquinol-1诱导非凋亡死亡的柱状图，当相比于星形孢菌素(10mM)或DMSO时，在GSC的从5分钟至600分钟的5mM至30mM的Vacquinol-1处理之后，胱天蛋白酶测定(caspase assay)和胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的荧光定量。在X轴上的浓度是以微摩尔计。

[0149] 图3示出用Vacquinol-1处理持续如所指示的5分钟至26小时的GSC的蛋白印迹分析。将细胞提取物进行免疫印迹，用于磷-MKK4(P-MKK4)和在赖氨酸27处组蛋白H3三甲基化(H3K27me3)。

[0150] 图4示出小鼠脑的免疫组织化学染色图像(A,B)和在长度分布图(staple diagram)中的对应的统计分析(C,D)。用抗人类GFAP抗体在用DMSO或(A)或Vacquinol-1(B)处理的GSC异种移植的脑上的免疫组织化学染色。GFAP阳性(C)和坏死区(D)的定量也被示出。

[0151] 图5示出被分配为(R,S；S20)、(S,R；S21)、(S,S；S22)以及(R,R；S23)的Vacquinol-1(S10)的四个不同的异构体。在单独的异构体的立体选择性合成之后，观察到有区别的药理学活性，指示相比于R,R异构体和S,S异构体，R,S异构体和S,R异构体示出优越的体外活性(还参见表4)。

[0152] 图6A是示出外消旋Vacquinol-1(NSC13316)以及对映体地纯的(enantiomerically pure)Vacquinol-1RS和Vacquinol-1SR的比较的系统性(血浆)暴露的图并且图6B是示出在20mg/kg的单次口服施用之后的比较的脑暴露的图。

[0153] 图7A是针对人类成纤维细胞的Vacquinol-1RS(S20)细胞毒性和甲氟喹细胞毒性的比较的图；图7B是针对成胶质细胞瘤细胞(U3013)的Vacquinol-1RS(S20)细胞毒性和甲氟喹细胞毒性的比较的图。

[0154] 在附图中使用的缩写：GSC：胶质瘤干细胞，HFS：人类成纤维细胞，ESC：小鼠胚胎干细胞，TMZ：替莫唑胺，mGlia：小鼠胶质细胞，Vacq：Vacquinol-1，Sta:星形孢菌素，RLU：相对发光强度。

[0155] 发明详述

[0156] 关于本文提供的描述和方法学，现在将更详细地描述本发明的前述的和其他的方面。应该理解，本发明可以以不同的形式被具体体现并且不应该被理解为限于本文中陈述的实施方案。更确切地，这些实施方案被提供，使得本公开内容将是完全的和完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。

[0157] 在本发明的说明书中使用的术语在本文仅是为了描述特定的实施方案的目的并且不意图是本发明的限制。如在本发明的实施方案的描述中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图还包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。此外，如本文所使用的，“和/或”指的是并且涵盖有关的列出的条目中的一个或更多个的任一和所有可能的组合。此外，如本文所使用的术语“约”，当指的是可测量的值例如化合物的量、剂量、时间、温度、及类似值时，意指涵盖指定的量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的变化。当范围被采用时(例如，从x至y的范围)，其意指可测量的值是从约x至约y的范围、或其中的任何范围，例如约x1至约y1等等。还应将理解术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”当在本说明书中使用时，指定陈述的特征、整数、步骤、操作、要素、和/或组分的存在，但不排除一个或更多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。除非另外定义，否则本说明书中使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

[0158] 本发明涉及新的化合物，某些2,4-二取代的喹啉衍生物、涉及其在疗法中的用途、以及涉及包含所述化合物的药物组合物。更特别地，本发明涉及用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的某些2,4-取代的喹啉衍生物或包含所述化合物的药物组合物。还更特别地，本发明涉及用于治疗胶质瘤的某些2,4-二取代的喹啉衍生物或包含所述化合物的药物组合物。本发明还涉及用于鉴定此类化合物的测定。本发明旨在提供能够在对身体的其他细胞类型最小影响下，选择性地杀死肿瘤细胞的分子。

[0159] 以鉴定在对靶向治疗的开发负有责任的成胶质细胞瘤细胞和成胶质细胞瘤干细胞(GSC)中的细胞过程为目的，使用结构上多样的小分子的库进行表型筛选，产生喹啉衍生物NSC13316，其是可靠地损害成胶质细胞瘤细胞和GSC的活力、刺激大胞饮介导的细胞死亡的唯一命中分子(hit molecule)。NSC13316的合成化学的扩展产生一系列具有增强的效力的结构类似物，这些结构类似物由于它们在成胶质细胞瘤细胞和GSC中诱导独特的表型响应而被称为Vacquinol(表1)。Vacquinol以纳摩尔浓度刺激以下特征的非凋亡细胞死亡：膜起泡和起皱、细胞变圆、大量的大胞饮液泡积聚(massive macropinocytic vacuole
accumulation)、细胞质膜的ATP消耗和最后的破坏以及GBM的原神经的、间叶细胞的和经典的子类的成胶质细胞瘤细胞和GSC的细胞溶解，而对其他细胞类型没有影响。全基因组
shRNA筛选揭示Vacquinol迅速激活、并且取决于用于液泡诱导的MAP激酶MKK4并且发挥其细胞毒性作用。体内异种移植模型证明了对Vacquinol-1(表1，S10)的高耐受性(high
tolerance)和GBM肿瘤特异性，其在口服施用之后展示优越的体内药代动力学和脑暴露，并且明显地减弱在人类GBM的斑马鱼模型和小鼠模型中的肿瘤渗入和生长。

[0160] 本发明的Vacquinol(化合物)被示出诱导在成胶质细胞瘤细胞中的非网格蛋白依赖性液泡化。非网格蛋白依赖性胞吞(Clathrin-independent endocytosis)，例如比如大胞饮，导致在流体相中的流体、溶质、膜、配体、分子和颗粒的非特异性细胞吸收。此机制通过激活特异性信号通路被诱导，这导致胞质膜动力学的改变，例如由肌动蛋白动力学的变化造成的那些。此类型的胞吞是胞质膜褶皱的结果，这在塌陷时导致大的不规则地成形的流体填充的胞内液泡的形成。通过对此过程的靶向激活，流体吸收可以大量地被增加并且此过程与颗粒的非选择性吸收是平行的。

[0161] 如通过以下机制界定的，非网格蛋白依赖性胞吞与其他胞吞途径隔离。不同于胞吞和噬菌两者，非网格蛋白依赖性胞吞不通过协调活性的货物/受体分子的相互作用被调节。反而，酪氨酸激酶受体、整合素、GPCR或其他细胞表面受体的激活可以导致在细胞表面处的肌动蛋白聚合的选择性的但一般性的升高，这导致在其远端边缘处关闭以吞没细胞外流体的膜起皱(Haigler等人,1979；Mercer和Helenius,2012；Swanson,2008)。因此，当褶皱弯曲进入到在细胞表面膜处的开放的、类火山口形杯形物(crater-like cup)时，褶皱关闭之后是杯形物关闭，这将液泡与胞质膜分离。因此，此机制高度地受与细胞的细胞表面因子的相互作用以及受驱动此过程的信号通路的激活来调节。因此，细胞类型选择性可以是非常高的。此类型的液泡化的激活的结果是否则为不可渗透的细胞的透化。这通过许多病原体(即，原生动物、细菌和病毒)经此机制的入胞和抗原通过抗原呈递细胞(例如树突细胞)的捕获被例示(Mercer J.,Helenius A.(2012)Curr Opinion in Microbiology 15,490-499；Phey,Lim；Gleeson,PA.(2011),Immunology and Cell Biology 89,836-843)。在此类型的液泡化下的细胞内信号通路包括特定的蛋白，例如Na+/H+交换蛋白、Rho样GTP酶(例如，Rac或Cdc42)、p21激活的激酶I(PAK1)以及蛋白激酶和蛋白脂酶。大胞饮的过度刺激可以导致细胞质的液泡的大量的积聚和非凋亡死亡。细胞质的液泡化的起源、机制和结果取决于诱导物的性质以及其中液泡膨胀的细胞类型，而不同。液泡常常被清除，因此可以是可逆的。

[0162] 大胞饮需要Ras激活。多种癌症与在大鼠肉瘤(HRAS、KRAS、NRAS)基因中的突变有关，所述大鼠肉瘤基因编码Ras蛋白，所述Ras蛋白是在响应于生长刺激的多种细胞中用于细胞增殖、生长和分化的具有关键调节功能的小GTP酶。导致组成性活性的Ras的突变因此可以为不受控制的细胞生长、能动性(motily)和增殖提供燃料。一致地，导致过度活性的Ras的突变在约30％的所有人类癌症中被发现并且改变的Ras/Rac活性已经在大多数人类癌症中被报告，包括但不限于胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、尿道癌、肺癌、结肠直肠癌、唾液腺癌、前列腺癌、肠癌、皮肤癌、血液的/淋巴的恶性肿瘤以及宫颈癌。相信，Vacquinol的作用还扩展至其中存在过度活性的Ras或Ras/Rac通路的其他癌症类型。

[0163] 引发肿瘤的癌细胞，与其他类干细胞类似，具有独特的分子特征，该分子特征将开辟选择性靶向癌症，用于癌症的治疗，特定地与改变的Ras/Rac活性有关的癌症，例如胶质瘤，并且更特定地成胶质细胞瘤(本文还称为多形性成胶质细胞瘤、或GBM)。本发明涉及提供能够在对身体的其他细胞类型最小影响下，选择性地杀死肿瘤细胞和/或癌症干细胞的化合物。更特别地，本发明涉及2,4-二取代的喹啉衍生物的制备及其在治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症(例如但不限于，胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、尿道癌、结肠直肠癌、唾液腺癌、前列腺癌、肠癌、皮肤癌、血液/淋巴恶性肿瘤、胶质瘤和宫颈癌)中的用途。

[0164] 另外，本发明还涉及对具有改变的Ras/Rac活性和/或下游信号通路的癌症且特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞是选择性的新的非网格蛋白依赖性液泡化细胞死亡机制的用途。例如，选择性的液泡化可以被用于向癌细胞，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞选择性地递送期望的化合物或物质，或被用于递送用于癌细胞，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞的选择性成像的成像分子。本发明的化合物可以被用于在癌细胞，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞中实现此选择性液泡化、或诱导所述相同选择性液泡化机制的任何其他合适的化合物。此外，本发明还涉及用于鉴定在治疗癌症，特定地胶质瘤，特别地成胶质细胞瘤中有效的此类化合物和/或诱导所述癌症，特定地胶质瘤细胞，特别地成胶质细胞瘤细胞特异性液泡化的化合物的新颖的斑马鱼筛选测定。

[0165] 因此，本发明的一方面是式(I)的化合物

[0166]

[0167] 包括其立体异构体和互变异构体，其中

[0168] m是1、2或3；

[0169] q是0或1；

[0170] R1是H或C1-C3烷基；

[0171] R2选自C1-C6烷基；以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基、和杂环基或杂芳基，各自被一个或更多个基团R7任选地取代；

[0172] R3、R4以及R5独立地选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；或

[0173] R3和R4，和它们附接于的相邻的原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素和被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基；

[0174] R6是H或C1-C3烷基；

[0175] 每个R7独立地选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烯基、卤素、烷基氨基以及NR8C(O)OR9；

[0176] R8选自H和C1-C3烷基；并且

[0177] R9是C1-C6烷基、杂芳族基或苯基；

[0178] 或式(I)的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，它们用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症。

[0179] 例如，式I的化合物不是甲氟喹。例如，R2不是未被取代的吡啶基。

[0180] 例如，本发明涉及选自化合物S8、S9、S14、S16、S19、S20、S21、S22、S23的式I的化合物。

[0181] 例如，本发明涉及选自化合物S24、S25、S26、S27、S28、以及S29的式I的化合物。

[0182] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中m是1或2。

[0183] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中q是0。

[0184] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中m是2并且q是0。

[0185] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中R2是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基。

[0186] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中R2是苯基。

[0187] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中R2是杂芳基。

[0188] 在某些实施方案中，本发明的化合物是式I的化合物，其中R2不是未被取代的吡啶基。

[0189] 在某些实施方案中，本发明涉及选自以下的化合物的用途：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、以及S29。

[0190] 本发明的另外的方面涉及包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物用于治疗胶质瘤的用途。

[0191] 本发明的另外的方面涉及包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物用于治疗成胶质细胞瘤的用途。

[0192] 还另一方面是包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物在制造用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途。

[0193] 还另一方面是包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物在制造用于治疗胶质瘤的药剂中的用途。

[0194] 还另一方面是包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物在制造用于治疗成胶质细胞瘤的药剂中的用途。

[0195] 还另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac有关的癌症的方法，据此如本文以上定义的包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，优选地人类。

[0196] 还另一方面是用于治疗胶质瘤的方法，据此如本文以上定义的包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，优选地人类。

[0197] 还另一方面是用于治疗成胶质细胞瘤的方法，据此如本文以上定义的包括其立体异构体和互变异构体的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，优选地人类。

[0198] 根据本发明的某些实施方案，大体上所有的在本文描述的方法和用途中使用的本发明的组合物是RS对映异构体。仅小量的SR(或任何其他)-对映异构体存在。这是有利的，因为本发明的组合物的RS对映异构体比SR-对映异构体或外消旋的RS/SR混合物治疗上是更有效的。在特定的实施方案中，产生的本发明的组合物按重量计具有小于5％的SR对映异构体存在。在其他特定的实施方案中，产生的本发明的组合物按重量计具有小于4％、3％、
2％或1％的SR对映异构体存在。在优选的实施方案中，本发明的组合物按重量计具有小于
2％的SR对映异构体存在。在更优选的实施方案中，本发明的组合物按重量计具有小于1％的SR对映异构体存在。

[0199] 本发明还提供(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇的组合物。组合物可以包含大于90％、大于
95％或大于99％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0200] 在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、和/或(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0201] 本发明还提供包含小于1％、小于0.7％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的手性地纯化的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0202] 本发明还提供(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的组合物。组合物可以包含大于90％、大于
95％或大于99％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇。

[0203] 本发明还提供(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的组合物。组合物可以包含大于90％、大于
95％或大于99％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇。

[0204] 在某些实施方案中，组合物可以包含小于1％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、和/或(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0205] 本发明还提供包含小于1％、小于0.7％、小于0.5％或小于0.1％的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇的手性地纯化的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇。

[0206] 本发明的另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物。

[0207] 本发明的另外的方面涉及(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗胶质瘤的用途。

[0208] 本发明的另外的方面涉及(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗成胶质细胞瘤的用途。

[0209] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途。

[0210] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗胶质瘤的药剂中的用途。

[0211] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗成胶质细胞瘤的药剂中的用途。

[0212] 还另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac有关的癌症的方法，据此(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0213] 还另一方面是用于治疗胶质瘤的方法，据此(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0214] 还另一方面是用于治疗成胶质细胞瘤的方法，据此(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0215] 本发明的另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物。

[0216] 本发明的另外的方面涉及(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗胶质瘤的用途。

[0217] 本发明的另外的方面涉及(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基]
(2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物用于治疗成胶质细胞瘤的用途。

[0218] 还另一方面是(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症的药剂中的用途。

[0219] 还另一方面是(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗胶质瘤的药剂中的用途。

[0220] 还另一方面是(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物在制造用于治疗成胶质细胞瘤的药剂中的用途。

[0221] 还另一方面是用于治疗与改变的Ras/Rac有关的癌症的方法，据此(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0222] 还另一方面是用于治疗胶质瘤的方法，据此(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0223] 还另一方面是用于治疗成胶质细胞瘤的方法，据此(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物，或包含(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物的组合物被施用至需要这样的治疗的哺乳动物，例如人类。

[0224] 本发明还提供用于制备(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇和(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇的方法。合成可以是对例如León(León,B.等人(2013).Organic Letters,15(6),1234–7)的修改。

[0225] 简略地，甲基化的(S)-L-哌啶酸的三苯甲基化提供通过从2,4-二溴喹啉产生的格氏试剂产生适于面选择性加成的手性的哌啶甲醛材料的可能性。然后，单分离的R,S异构体经受合适的4-氯苯基硼酸的Suzuki偶合，这在三苯甲基的伴随的脱保护之后产生期望的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0226] 例如，通过用亚硫酰氯随后是用甲醇或适于形成手性羧酸酯的其他试剂的处理将(S)-L-哌啶酸转化成对应的酯，例如(2S)-1-哌啶酸-2-羧酸甲酯，(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇在若干步骤中产生。然后，中间体酯用合适的保护基团，例如三苯甲基保护以形成氮保护的羧酸酯，例如(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-羧酸甲酯，其然后被转化成对应的醇，例如通过用合适的试剂，例如LiAlH4还原。

[0227] 然后，通过与合适的氧化剂，例如草酰氯反应(例如，斯文氧化反应)，将[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇转化成对应的醛，然后，获得的(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-甲醛与从合适的试剂，例如2,4-二溴喹啉原位产生的面选择性格氏试剂反应以产生单一R,S异构体(R)-(2-溴喹啉-4-基)[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇。然后，此溴化合物经受与合适的苯基硼酸(例如，4-氯苯基硼酸)的Suzuki偶合以产生(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇，其在除去N保护基(例如，三苯甲基)之后产生(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0228] 优选地，产生的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)-哌啶-2-基甲醇包含小于1％、小于0.7％、小于0.5％或小于0.1％的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0229] 如在图1中描述的，Vaquinol对GSC的周期的作用(图1A、1B)指示Vaqcuinol-1诱导培养的GSC的迅速的且选择性的死亡，并且指示Vacquinol-1最低限度地受细胞密度影响(图1C)。Vacquinol-1具有比TMZ大得多的效力(图1E)并且对于GSC是选择性的，因为mGlia和成纤维细胞以及其他细胞类型在比GSC高的浓度下展示毒性。此外，在其他细胞类型中的毒性不取决于引起GSC的死亡的液泡化。

[0230] 如在图2中所示出的，图示了由Vacquinol-1诱导的非凋亡死亡，其中相比于星形孢菌素(已知的凋亡诱导物，其导致迅速的且显著的凋亡死亡的升高)，由Vacquinol-1的胱天蛋白酶激活的不存在是明显的。

[0231] 图3示出用Vacquinol-1处理持续5分钟至26小时的GSC的蛋白印迹分析。这些数据指示P-MKK4的迅速的升高，但缺少H3K27me3的抑制作用。

[0232] 将人类GSC(100 000)移植到免疫缺陷的小鼠中并且任其发展到末期(6周)，这之后，Vacquinol-1(15μM,0.5μL/小时)通过输注被施用到脑中持续一周。在Vacquinol-1处理的小鼠中的肿瘤大小的显著的降低和坏死区的减弱在图4A、4B中被示出(小鼠脑的免疫组织化学染色图像)。通过统计分析的定量确证这些结果(图4C和4D，n＝6/组)。这些数据说明在小鼠中的成胶质细胞瘤的人类模型中肿瘤发展在末期的有效降低。用抗人类GFAP抗体在用DMSO(A)或Vacquinol-1(B)处理的GSC异种移植的脑上进行免疫组织化学染色。GFAP阳性(C)和坏死区(D)的定量。

[0233] 如在图5中所示出的，在Vacquinol-1的单独的异构体的立体选择性合成之后，观察到有区别的药理学活性，指示相比于R,R异构体和S,S异构体，R,S异构体和S,R异构体示出优越的体外活性。Vacquinol-1(外消旋的)、Vacquinol-1RS和Vacquinol-1SR的药代动力学在2mg/kg或20mg/kg的Vacquinol-1单次静脉内(i.v.)施用或经口(p.o)施用之后分别在NMRI(SR/RS)小鼠或BALB/c(Vrac)小鼠中确定。在给药(n＝3/时间点)之后，在以下标称的时间点从动物中取得血液样品和脑样品：15分钟、30分钟、和60分钟、以及2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、72小时以及144小时。Vacquinol-1的生物分析定量通过UPLC-MS/MS在血浆样品和脑样品中被分析。本文描述的数据说明Vacquinol-1RS相对对应的SR异构体或先前描述的立体异构体的混合物(Vacquinol-1,NSC13316)的优越的脑暴露，同时最小化化合物的系统性暴露。参见，实施例11，图6。不希望被理论所束缚，因为胶质瘤在病征上限于CNS，所以具有优先的脑暴露的化合物更可能在临床上是有效的，而具有较低的系统性副作用的风险。

[0234] 抗疟药喹啉甲醇甲氟喹

[0235] ((2,8-双(三氟甲基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇)，已经被提议通过激活凋亡和抑制自噬降低胶质瘤细胞活力(Geng,Y.等人(2010)Neuro-Oncology,12(5),473–81)。该研究指示甲氟喹在10微摩尔的浓度下导致约50％的U87胶质瘤细胞活力的降低，但未曾做出合适的剂量响应评估并且没有呈递指示该化合物在任何浓度下在体外杀死所有胶质瘤细胞的数据。相比之下，Vacquinol-1在比较的浓度下，通过可选的机制(大胞饮的过度激活)导致完全的细胞培养死亡。此外，Vacquinol-1的作用不是胱天蛋白酶(凋亡)依赖性的，也不导致自体吞噬泡的明显的积聚。因此，甲氟喹的胶质瘤毒性作用将扩展至化合物的
Vacquinol系列是预料不到的。在实施例12和图7中的数据说明，尽管两个化合物都呈现针对成纤维细胞的相当的细胞毒性，然而甲氟喹仅在恰好最高的测试浓度下杀死所有胶质瘤细胞。用于细胞死亡的比较的IC95值是Vacquinol-1RS＝8.9μM和甲氟喹＝25.2μM。因为所有癌细胞的完全的消耗是有效癌症治疗的决定性的构成要素，以便避免耐药性的发展和肿瘤复发，所以此数据示出Vacquinol-1RS的优越性是这方面。

[0236] 另外，虽然甲氟喹被示出在高的浓度下(>10μM)降低慢性淋巴细胞白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma)的活力，但没有数据呈递甲氟喹对神经学癌症的作用(US2003/0216426)。因为癌症在其病理生理学、病因学和遗传基础两者方面是高度可变的，所以从CLL和淋巴瘤至胶质瘤的治疗的扩展不是直观的或明显的。

[0237] 人类患者衍生的成胶质细胞瘤细胞至非网格蛋白依赖性液泡化的预料不到的选择性易损性(selective vulnerability)允许利用此选择性的本发明方法学。由于成胶质细胞瘤细胞和其他胶质瘤细胞之间的相似性，此机制可以在所有类型的胶质瘤细胞中存
在，使得Vacquinol诱导在所有类型的胶质瘤细胞以及具有异常的Ras/Rac活性的其他癌细胞中的液泡化。

[0238] 因此，新的系列的结构类似物(Vacquinol)已经被鉴定，其特异性地靶向癌细胞，而不影响其他细胞类型。本发明的化合物被示出诱导成胶质细胞瘤细胞中的非网格蛋白依赖性液泡化，导致通过非凋亡机制的细胞死亡。由于成胶质细胞瘤细胞和其他胶质瘤细胞之间的相似性，相信此机制在所有类型的胶质瘤细胞中存在，使得Vacquinol诱导在所有类型的胶质瘤细胞中的液泡化。由于大胞饮对过度活性的或过度表达的Ras/Rac的已知的依赖性，可行的是，此易损性还扩展至与Ras/Rac活性的改变有关的其他形式的癌症。这些类似物开辟了靶向癌症，特定地I-IV级胶质瘤，包括原神经的、经典的和间叶细胞的成胶质细胞瘤的新的治疗和疗法。此外，用于鉴定用于胶质瘤，例如成胶质细胞瘤的治疗的此类化合物/类似物的新的基于斑马鱼的测定作为本发明的部分被公开。参见例如，Kitambi等人,Cell 157,1-16,2014，其特定地通过引用以其整体并入本文。

[0239] 使用在胶质瘤细胞，例如成胶质细胞瘤细胞中诱导液泡化的本发明的化合物或其他类似的化合物，将某些期望的物质选择性地递送至胶质瘤细胞可以被实现。这些物质可以是用于疾病的治疗的治疗性物质，或它们可以是例如成像分子，例如用于胶质瘤细胞(例如成胶质细胞瘤)的选择性成像的对比分子(contrast molecule)。更详细地，这样的方法可以用于可以体内杀死胶质瘤细胞的治疗性DNA、基因产物、抗体、穿膜肽、纳米颗粒或其他剂的靶向递送。例如，本发明的化合物可以被用于改进否则为非选择性细胞毒性化合物(例如替莫唑胺)的选择性。因此，液泡化的选择性过程导致试验性或确定的治疗剂以肿瘤靶向的方式的递送以降低肿瘤大小或杀死肿瘤细胞或用于液泡化。

[0240] 本发明的可用性在下文被例示，其中例如一系列小的大分子可以通过此网格蛋白非依赖性液泡化来靶向细胞：

[0241] 本文描述的化合物可以有助于递送穿膜肽的效力。Kaplan,IM；Wadia,JS；Dowdy,SF.“Cationic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis.”JControl Release(2005),102,247-253；Jones AT,
“Macropinocytosis:searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides.”J Cell.Mol.Med(2007),11,670-684)。

[0242] 另外，本文描述的化合物可以介导完整的蛋白质(包括朊病毒蛋白)的吸收。Magzoub,M；Sandgren S；Lundberg,P；Wittrup A,等人“N-terminal peptides from
unprocessed prion proteins enter cells by macropinocytosis”Biochem Biophys,
Res Commun(2006),348,379-385.，Noguchi H,Bonner-Weir,S；Wei,FY,等人“BETA2/
NeuroD protein can be transduced into cells due to an arginine-and lysine-
rich sequence.”Diabetes 2005,54,2859-2866。Greenwood,KP；Daly,NL；Brown,DL；Stow JL；等人“The cyclic cystine knot miniprotein MCoTI-II is internalized into
cells by macropinocytosis”Int J Biochem Cell Biol(2007),39,2252-2264。Khelef,N；Gounon,P；Guiso,N；“Internalization of Bordetella pertussis adenylate
cyclase-haemolysin into endocytic vesicles contributes to macrophage
cytotoxicity.”Cell Microbiol(2001),3,721-730。Poussin,C；Foti,M；Carpentier,JL；
Pugin,J.“CD14-dependent endotoxin internalization via a macropinocytic
pathway.”J Biol.Chem.(1998),273,20285-20291。

[0243] 本文描述的化合物可以介导DNA至细胞的吸收。Wittrup A,Sandgren S,Lilja J,Bratt,Gustavsson,N.等人“Identification of proteins released by mammalian cells that mediate DNA internalization through proteoglycan-dependent
macropinocytosis.”J Biol.Chem(2007),282,27897-27904。

[0244] 本文描述的化合物可以靶向小分子荧光黄和高分子量右旋糖酐的细胞内吸收。Zandgren,KJ；Wilkinson,J；Miranda-Saksena,M；等人“A differential role for
macropinocytosis in mediating entry of the two forms of vaccinia virus into
dendritic cells.”PLoS Pathog.(2010),6(4),e1000866。Commisso,C；Davidson,SM；
Kamphorst,JJ:Grabocka,E.等人“Macropinocytosis of protein is an amino acid
supply route in Ras-transformed cells.”Nature(2013),497,633-637。

[0245] 本文描述的化合物还可以靶向设计的纳米颗粒和类病毒颗粒的吸收。Schmidt SM,Moran KA,Slosar JL.等人“Uptake of calcium phosphate nanoshells by
osteoblasts and their effect on growth and differentiation.”J Biomed Mater
Res A(2008),87,418-428。Buonaguro,L；Tornesello,ML；Tagliamonte,M；Gallo,RC；等人“Baculovirus-derived human immunodeficiency virus type 1virus-like particles activate dendritic cells and induce ex vivo T-cell responses.”J Virol(2006),
80,9134-9143。

[0246] 本文描述的化合物还可以在磁共振成像(MRI)、计算机断层成像术、X射线和正电子发射断层成像术(PET)以及可以在对比分子的靶向结合或吸收之后被改进的其他成像方法下是有用的。非网格蛋白依赖性胞吞(例如大胞饮)的非选择性吸收过程(Kerr,MC；Teasdale,RD；“Defining macropinocytosis.”Traffic(2009),10,364-371)开辟了基于例如在本发明中描述的诱导的液泡化的细胞选择性的靶向递送。

[0247] 因此，这代表用于从细胞外环境将一系列小的至大的大分子递送至细胞细胞质的关键机制。因此，通过将通路中的细胞外或细胞内组分选择性地靶向胶质瘤细胞(例如成胶质细胞瘤)来调节非网格蛋白依赖性液泡化可以导致递送在小的至大的分子范围内的治疗剂的靶向策略并且可以被用于体内胶质瘤组织和细胞的靶向液泡化。

[0248] 用于鉴定抗脑肿瘤活性的化合物的新颖的筛选工具是本发明的另外的方面。本发明的新颖的测定允许在体内机构(in vivosetup)中的此类化合物的迅速评估，据此，诸如化合物对斑马鱼和移植的细胞的急性/慢性毒性作用、移植的细胞增殖和细胞到脑实质中的迁移、化合物穿透到斑马鱼组织的特征，可以全部平行地被评估。这些特征使得本发明的异种移植模型是允许降低用于在啮齿模型中的随后评估的化合物数的强有力的工具。根据以下进行斑马鱼筛选测定：

[0249] 用MITFa吗啉代注射在1细胞期的斑马鱼胚胎(受精卵)(Lister,JA,等人“Nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-
crest-derived pigment cell fate.”Development.(1999),126(17):3757-67)以防止色素形成。色素形成可以被阻止以允许发育中的胚胎的任何表型的容易的可视化。这可以通过用MITFa吗啉代注射在1细胞期的胚胎或通过将0.003％的苯基硫脲(PTU)(0.003％的在
1L水箱水(tank water)中的1-苯基-2-硫脲＝60μg/ml最终浓度)添加至胚胎被实现。允许胚胎在温育器中生长持续两天，这之后收集胚胎并且使用三卡因麻醉并且嵌入在陪替氏培养皿中的琼脂糖(低熔)中。

[0250] 三卡因((3-氨基苯甲酸乙酯，还称为乙基3-氨基苯甲酸酯)以粉状形式购自Sigma(目录号A-5040)。其还可作为Finquel(料号C-FINQ-UE)购自Argent Chemical Laboratories,Inc。通过将以下组合在具有螺帽的玻璃瓶中制备用于麻醉鱼的三卡因溶
液：400mg三卡因粉末，97.9ml双蒸水(DD water)，～2.1ml 1M三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)(pH 9)。调整pH至～7。将此溶液储存在冰箱中(购买可能的最小量，因为三卡因会变老化)。
为了使用三卡因作为麻醉剂，将以下组合在250ml烧杯中：4.2ml三卡因溶液以及约100ml清洁的水箱水。

[0251] 嵌入之后，允许琼脂糖固化并且将10ml的新鲜的三卡因添加至陪替氏培养皿。将陪替氏培养皿放在显微镜下并且用胶质瘤细胞加载微量注射针，并且校准微量注射器的压力使得每次注射释放约20-50nl的具有约3000个细胞的流体。将细胞手动地注射到脑室中，然后在显微镜下观察胚胎并且将错误地注射的胚胎除去。将剩余的注射的胚胎取在新的板中，并且三卡因处理的水箱水被除去并用正常的水箱水替换，并且允许动物恢复持续3-4小时。在3-4小时之后，视觉检查动物以核实它们在游动，然后将动物分配到多孔板中(3个胚胎/96孔板(300μl体积每孔)，6个胚胎/6孔板(1ml体积每孔))。然后，以需要的浓度将药物添加至板。每天交换药物处理的水箱水并且手动地监测对鱼的作用。可以用胶质瘤干细胞、或胶质瘤细胞在3-4小时内注射约500个胚胎。因此，许多新的药物候选者可以通过此快速的且有效的新的筛选法评估对成胶质细胞瘤或胶质瘤的治疗。

[0252] 如本文描述的斑马鱼筛选测定已经被用于鉴定在胶质瘤，尤其难治的成胶质细胞瘤的选择性治疗中有效的化合物，并且本发明的一方面是这些化合物在这样的癌症的疗法中的用途。还已经被确定对于胶质瘤细胞选择性的新的液泡化机制，其可以被用于另外地易感形式的癌症和用于在例如疗法或成像方法中使用的期望的化合物/分子(例如，货物化合物)的选择性递送。

[0253] 为了本发明的目的，术语“烷基”，单独地或作为基团的部分，包括通式CnH2n+1的直链的或支链的烷基。

[0254] 术语“Cm-Cn烷基”，其中m和n两者是整数并且m>n，指的是具有从m个至n个碳原子的烷基。例如，C1-C6烷基包括甲基、乙基、正丙基和异丙基。

[0255] 为了本发明的目的，除非另外指定的或从上下文明显的，术语“卤素”指的是F、Cl、Br或I；优选地F、Cl和Br；特别地F和Cl。

[0256] 术语“烷氧基”指的是式-OR的基团，其中R是如本文定义的烷基部分。

[0257] 术语“烷基氨基”指的是式–RNHR1R2的基团，其中R、R1、R2是如本文定义的烷基部分。

[0258] 术语“碳环基”指的是在环中仅包含碳(C、CH或CH2)的环部分。

[0259] 术语“杂芳基”指的是在环中包含碳和一个或更多个选自N、O、或S的原子的环部分。

[0260] 术语“多环的”指的是例如，稠合的或桥接的环。

[0261] 不饱和的环部分可以是芳香族的或非芳香族的并且在环中包含一个或若干个双键或三键。

[0262] 术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可以发生但不必发生，并且该描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形没有发生的情况。

[0263] 在具有指定的构型的本发明的化合物中的任何手性中心采用熟知的Cahn-Ingold-Prelog优先规则被指示为R或S。此外，在任何结构式中，具有指定的构型(即，R或S)的手性中心可以使用指示至R的键是指向纸外并且朝向阅读者，并且指示至R的键指
向纸外并且远离阅读者而被指示。

[0264] 如本文所使用的，术语“化合物”指的是化合物自身，包括其立体异构体和互变异构体，以及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、复合物、酯、前体药物和/或前体药物的盐，除非在用于该化合物的具体的文字中另外指定的。除了当例如通过在给定的位置指示(R)构型或(S)构型另外指示时，本发明的化合物的所有立体异构体被预期呈掺合物或呈纯的形式或大体上纯的形式。因此，本发明的化合物可以以对映体形式或外消旋形式或非对映体形式或作为其混合物存在。用于制备的工艺可以使用外消旋物或对映体作为起始材料。当外消旋的或非对映体的产物被制备时，它们可以通过常规的方法被分离，所述常规的方法例如是色谱的或分级结晶。

[0265] 术语“溶剂化物”指的是例如由式(I)的化合物和溶剂形成的可变的化学计量的复合物。溶剂是药学上可接受的溶剂，例如水，其不应该干扰溶质的生物活性。

[0266] 本发明的某些化合物可以以互变异构形式存在，其也意图被涵盖在本发明的范围内。“互变异构体”指的是其结构在原子的布置方面明显地不同，但以容易且迅速的平衡存在的化合物。应理解，本发明的化合物可以被描述为不同的互变异构体。还应理解，当化合物具有互变异构形式时，所有互变异构形式意图是在本发明的范围内，并且化合物的命名不排除任何互变异构形式。

[0267] 本发明的化合物、盐和前体药物可以以若干互变异构形式存在，并且这样的互变异构形式被包括在本发明的范围内。互变异构体作为在溶液中的互变的集合的混合物存在。在固体形式中，通常一种互变异构体占优势。即使一种互变异构体可以被描述，然而本发明包括本发明化合物的所有互变异构体。

[0268] 如本文所使用的，术语“盐”例如药学上可接受的盐并且可以包括酸加成盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、以及酒石酸盐；碱金属阳离子，例如Na+、K+、Li+，碱土金属盐，例如Mg2+或Ca2+，或有机胺盐。

[0269] “药学上可接受的盐”意指在合理的医学判断的范围内是适于与人类和低等动物的组织接触，而没有过度毒性、刺激、变态响应等等，并且与合理的益处/危险比率相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1-19中详细地描述了药学上可接受的盐。盐可以在本发明的化合物的最终分离和纯化期间原位被制备，或通过使游离碱官能与合适的有机酸反应被单独地制
备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐(camphersulfonate)、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐、及类似盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁、及类似物，以及无毒的铵盐、季铵盐、以及胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺、及类似物。

[0270] 药学上可接受的盐包括与无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸形成的酸加成盐；或与有机酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基萘酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲磺酸、己二烯二酸、2-萘磺酸、丙酸、水杨酸、琥珀酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三甲基乙酸形成的酸加成盐；或当在母体化合物中存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子、碱土金属离子、或铵离子替换时，或与有机的或无机的碱配位时形成的盐。可接受的有机碱包括，例如二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺、以及氨丁三醇。可接受的无机碱包括，例如氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠以及氢氧化钠。

[0271] 为了本发明的目的，“药学上可接受的”意指其在制备大体上是安全的、无毒的、并且既不是生物上的也不另外是不合意的药物组合物中是有用的，并且包括对兽医的以及人类药学的用途可接受的那些。

[0272] 本文还提供的是药物组合物，其包含在具有至少一种药学上可接受的赋形剂例如佐剂、稀释剂或载体的掺合物中的治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。

[0273] 术语“有效量”指的是对被治疗的患者赋予治疗作用的化合物的量。作用可以是客观的(即，通过某些测试或标志物可测量的)或主观的(即，受试者给出作用的指示或感觉有作用)。

[0274] 用于配制如本文描述的和要求保护的根据本发明的化合物的药学上可接受的赋形剂是，例如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，它们对本领域技术人员熟知的。在配制如本文要求保护的和公开的化合物中有用的药物赋形剂在例如Remington:The Science and
Practice of Pharmacy,第19版,Mack Printing Company,Easton,Pennsylvania(1995)中被发现。

[0275] 如本文所使用的，术语“代谢物”意指本发明的化合物或呈现与本发明的所述化合物相似的体内活性的其药学上可接受的盐、多形体或溶剂化物的代谢的产物。

[0276] 如本文所使用的，术语“混合”意指组合、掺合、搅拌、振摇、涡旋或搅动。术语“搅拌”意指混合、振摇、搅动、或涡旋。术语“搅动”意指混合、振摇、搅拌、或涡旋。

[0277] 术语“前体药物”意图包括通过在受试者的体内的代谢过程或水解过程被转化成具有在本发明的范围内的式的活性剂的任何化合物。用于合适的前体药物的选择和制备的常规的程序在，例如Prodrugs,Sloane,K.B.,编辑；Marcel Dekker:New York,1992中被描述，其通过引用以其整体并入本文。本发明的化合物还可以被制备为前体药物，例如药学上可接受的前体药物。术语“前体药物(pro-drug)”和“前体药物(prodrug)”在本文被可交换地使用并且指的是在体内释放活性母体药物的任何化合物。因为已知前体药物提高药物的狠多合意的质量(例如，溶解度、生物利用度、制造等等)，所以本发明的化合物可以以前体药物的形式被递送。因此，本发明意图覆盖目前要求保护的化合物的前体药物、递送其的方法以及包含其的组合物。术语“前体药物”包括共价地连接至一个或更多个前体部分(pro-moiety)，例如氨基酸部分或其他水溶性部分的本发明的化合物。本发明的化合物可以通过水解的、氧化的、和/或酶促的释放机制从前体部分被释放。在实施方案中，本发明的前体药物组合物呈现提高的水溶性、改进的稳定性、以及改进的药代动力学概况的附加的益处。前体部分可以被选择以获得期望的前体药物特性。例如，前体部分，例如氨基酸部分或其他水溶性部分(例如磷酸盐)可以基于溶解度、稳定性、生物利用度、和/或体内递送或吸收被选择。术语“前体药物”还意图包括当这样的前体药物被施用至受试者时在体内释放本发明的活性母体药物的任何共价结合的载体。在本发明中的前体药物通过修饰在该化合物中存在的官能团来制备，所述修饰是以使得该修饰以常规的操纵或在体内被裂解成母体化合物的方式。前体药物包括本发明的化合物，其中羟基、氨基、巯基、羧基、或羰基被结合至可以在体内被裂解以分别形成游离的羟基、游离的氨基、游离的巯基、游离的羧基、或游离的羰基的任何基团。

[0278] 前体药物的实例包括但不限于羟基官能团的酯(例如，乙酸酯、二烷基氨基乙酸酯、甲酸酯、磷酸酯、硫酸酯、以及苯甲酸酯衍生物)和氨基甲酸酯(例如，N,N-二甲基氨基羰基)、羧基官能团的酯基团(例如，乙基酯、吗啉乙醇酯)、N-酰基衍生物(例如，N-乙酰基)、N-曼尼希碱、席夫碱以及氨基官能团的烯胺酮类(enaminones)、在式I的化合物中的酮和醛官能团的肟、缩醛、缩酮和醇酯、及类似物，见Bundegaard,H."Design of Prodrugs"第1-92页,Elesevier,New York-Oxford(1985)。

[0279] 因为Vacquinol固有地包含2个手性中心，所以在表1中评估的化合物作为4个立体异构体存在，包括(R,S)异构体、(S,R)异构体、(R,R)异构体以及(S,S)异构体。在Vacquinol-1(表1，S10)的这些单独的立体异构体的手性分离和使用X射线晶体衍射和NMR分析指定绝对立体化学之后，发现(R,S)异构体和(S,R)异构体(表1，分别地S20和S21)呈现优于(S,S)异构体和(R,R)异构体(表1，分别地S22和S23)的活性(图5)。

[0280] 本发明的化合物可以根据本文公开的合成路线或应用从参考文献中已知的合成方法被制备。

[0281] 在式(I)的化合物中，

[0282]

[0283] 如本文中以上定义的，m是1或2，并且q是0或1。

[0284] 在某些实施方案中，q是0，即本发明的化合物可以通过式(Ia)表示

[0285]

[0286] 在其他实施方案中，q是1，即本发明的化合物可以通过式(Ib)表示

[0287]

[0288] 在某些实施方案中，m是1，即本发明的化合物可以通过式(Ic)表示

[0289]

[0290] 在其他实施方案中，m是2，即本发明的化合物可以通过式(Id)表示

[0291]

[0292] 在某些特定的实施方案中，q是0并且m是2。

[0293] 在式(I)的化合物中，R1是H或C1-C3烷基。在某些实施方案中，R1是H或甲基。

[0294] 在某些实施方案中，R1是C1-C3烷基，例如R1是甲基。

[0295] 在其他实施方案中，R1是H，即本发明的化合物可以通过式(Ie)表示

[0296]

[0297] 在一个优选的实施方案中，-OR1是合适的前体药物酯、磷酸酯、磺酸酯、水合物、缩醛、半缩醛或在细胞内被裂解的任何其他的可水解的或可酶解(enzymatically hydrolysable)的基团。

[0298] 例如，R1可以是C1-C6烷基-C(O)-，例如乙酰基、丙酰基、或丁酰基；或R1可以是苯甲酰基、或形成合适的羧酸酯的任何其他部分；或对应的磷酸酯、或磺酸酯。

[0299] 在某些其他特定的实施方案中，q是0，m是2并且R1是H。

[0300] 在式(I)的化合物中，R2选自C1-C6烷基，以及C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基，它们被一个或更多个基团R7任选地取代。

[0301] 在某些实施方案中，R2选自被一个或更多个基团R7任选地取代的C1-C6烷基、C3-C10饱和的、单环或多环的碳环基；以及被一个或更多个基团R7任选地取代的苯基。

[0302] 当R2是被一个或更多个基团R7任选地取代的C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基时，所述环基，例如可以是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基，例如C6-C10桥接的或非桥接的环烷基，例如环己基和八氢-1H-2,5-亚甲基茚基；或苯基。

[0303] 在某些其他实施方案中，R2是被一个或更多个基团R7任选地取代的C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基，例如R2是C6-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基，例如C6-C10非桥接的或桥接的环烷基，例如环己基和八氢-1H-2,5-亚甲基茚基；或苯基。

[0304] 在某些实施方案中，R2是被一个或更多个基团R7任选地取代的C3-C10饱和的、单环或多环的碳环基，例如R2是C6-C10饱和的、单环或多环的碳环基，例如C6-C10非桥接的或桥接的环烷基，例如环己基和八氢-1H-2,5-亚甲基茚基；或苯基。

[0305] 在某些实施方案中，R2是被一个或更多个基团R7，例如1个、2个或3个基团R7任选地取代的苯基，即本发明的化合物可以通过式(If)表示

[0306]

[0307] 其中s是从0至5、或从0至4、或从0至3、或从0至2的整数，例如s是0或1。在某些实施方案中，s是0。在某些实施方案中，s是1。在某些实施方案中，s是2。

[0308] 在式(Ih)的化合物的某些实施方案中，s是至少1并且至少一个基团R7是在对位。在式(Ih)的化合物的某些实施方案中，s是1并且R7是在对位。

[0309]以及

[0310] 在式(I)的化合物中，R3、R4以及R5独立地选自H、卤素例如F和Cl、以及被一个或更多个卤素任选地取代的C1-C6烷基例如C1-C3烷基，例如甲基；或R3和R4，和其被附接于的相邻原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素例如F和Cl、以及C1-C6烷基，例如C1-C3烷基。

[0311] 在某些实施方案中，R3、R4以及R5独立地选自H、卤素例如F和Cl、以及C1-C6烷基例如C1-C3烷基，例如甲基。

[0312] 在某些实施方案中，R3、R4以及R5独立地选自H和卤素，例如选自H、F和Cl，或H和Cl。

[0313] 在某些其他实施方案中，R3、R4以及R5独立地选自H和C1-C6烷基，例如C1-C3烷基，例如甲基。

[0314] 在又其他实施方案中，R3、R4以及R5独立地选自H、和C1-C6烷基，例如C1-C3烷基，例如甲基。

[0315] 在又其他实施方案中，R3和R4，和其被附接于的相邻原子一起形成苯环，并且R5选自H、卤素例如F和Cl、以及C1-C6烷基例如C1-C3烷基；例如R3和R4，和其被附接于的相邻原子一起形成苯环，并且R5是H。

[0316] 在某些实施方案中，R3是如本文以上定义的，但不同于H。例如R3不同于H，并且R4和R5两者都是H。

[0317] 在某些实施方案中，R4是如本文以上定义的，但不同于H。例如R4不同于H，并且R3和R5两者都是H。

[0318] 在某些实施方案中，R5是如本文以上定义的，但不同于H。例如R5不同于H，并且R3和R4两者都是H。

[0319] 在某些实施方案中，R3和R5两者都不同于H。例如R3和R5是如本文以上定义的，但不同于H，并且R4是H。

[0320] 在某些其他实施方案中，R3、R4和R5全部是H。

[0321] 在式(I)中，部分R6是H或C1-C3烷基，例如甲基。在某些实施方案中，R6是H。

[0322] 如本文以上所注明的，当R2是C3-C10不饱和的或饱和的、单环或多环的碳环基时，所述环基可以被一个或更多个基团R7取代。每个这样的基团R7独立地选自C1-C6烷氧基，例如C1-C3烷氧基，例如甲氧基；以及卤素，例如F和Cl，特别地Cl；以及NR8C(O)OR9。

[0323] 在某些其他实施方案中，至少一个R7是卤素，例如F或Cl，特别地Cl。

[0324] 当R7是NR8C(O)OR9时，R8选自H和C1-C3烷基，特别地H；并且R9是C1-C6烷基。在某些实施方案中，R8是H，并且R9是C3-C6烷基，例如叔丁基。

[0325] 从上文中，似乎式(I)的化合物可以关于各种特征而不同。这样的特征涉及整数q和m，以及R1、R2、R3、R4、R5和R6的身份。预期的是，除非另外指示的或从上下文中清楚地明显的，式(I)的化合物的不同的特征可以独立地且自由地被组合以产生在本发明的范围内的许多实施方案，这些实施方案全部被式(I)覆盖。

[0326] 用于治疗与改变的Ras/Rac活性有关的癌症，特别地胶质瘤，例如成胶质细胞瘤的本发明的化合物的实例是：

[0327] (2-苯基苯并[h]喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0328] (6,8-二氯-2-((2R,3aS,5R)-八氢-1H-2,5-亚甲基茚-2-基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0329] (2-((4-氯苯基)氨基)-6-甲基喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0330] (8-氯-2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0331] (6,8-二氯-2-苯基喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0332] (2-(3-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇

[0333] (2-(3,4-二氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0334] 4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯、

[0335] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0336] (7-氯-2-苯基喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0337] (2-(2,4-二氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0338] (6-氯-2-苯基喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0339] (2-(4-乙炔基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0340] 2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉、

[0341] (2-(4-甲氧基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0342] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(吡咯烷-2-基)甲醇、

[0343] (6,8-二氯-2-(三氟甲基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0344] (2-环己基喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇、

[0345] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇、

[0346] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、

[0347] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇、

[0348] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、以及

[0349] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇

[0350] 或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物。

[0351] 本发明的化合物的实例包括5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物、

[0352] 4-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺和4-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺的混合物、

[0353] (R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0354] (R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物。

[0355] 本发明的化合物的实例包括5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物、

[0356] 4-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺和4-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-N,N-二丙基苯甲酰胺的混合物、

[0357] (R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0358] (R)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0359] (R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(4-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-基)甲醇的混合物、

[0360] (R)-((R)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇和(S)-((S)-哌啶-2-基)(2-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹啉-4-基)甲醇的混合物。

[0361] 另外被包括在本发明的范围内的是本发明的化合物的立体异构体和互变异构体。

[0362] 本发明的优选的实施方案是前面提及的化合物的(R,S)和(S,R)外消旋异构体的用途。

[0363] 更优选的是前面提及的化合物的(R,S)或(S,R)单对映体的用途。

[0364] 特别是(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇的(R,S)或(S,R)单异构体的用途，即选自以下的化合物：

[0365] (R)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((S)-哌啶-2-基)甲醇、

[0366] (S)-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)((R)-哌啶-2-基)甲醇。

[0367] 本发明的化合物可以通过任何合适的手段被施用，例如口服地，例如以片剂、丸剂、糖衣丸剂、含水的或油性的悬浮液或溶液、酏剂、糖浆剂、胶囊、粒剂或粉末的形式；舌下地；面颊地(buccally)；肠胃外地，例如通过比如，皮下的、静脉内的、肌肉内的、胸骨内的注射或输注技术(例如，作为无菌的可注射的含水或非水的溶液或悬浮液)。对于肠胃外的施用，肠胃外地可接受的水性的或油性的悬浮液、乳液或溶液被使用，其是无热原的并且具有必要的pH、等张性、同渗质量摩尔浓度以及稳定性。本领域技术人员完全能够制备合适的制剂并且大量的方法在参考文献中被描述。还在科学文献[例如，Langer,Science 249:1527-1533(1990)]中发现药物递送的方法的简要回顾。

[0368] 施用本发明的化合物的可能的方法的其他实例是鼻腔施用，包括施用至鼻粘膜，例如通过吸入喷雾剂(inhalation spray)；或直肠地，例如以栓剂的形式；以包含无毒的、药学上可接受的媒介物或稀释剂的剂量单位制剂。

[0369] 优选地，本发明的化合物以被优化用于递送至被治疗的受试者的脑的方式被肠胃外地施用。在一个实施方案中，化合物被配制用于腹膜内施用。在一个优选的实施方案中，化合物被配制用于脑室内施用。

[0370] 本发明化合物还可以以适于立即释放或缓释的形式被施用。立即释放或缓释可以通过使用包含本发明化合物的合适的药物组合物来实现，或特定地在缓释的情况下，通过使用诸如皮下植入物或渗透泵的装置来实现。本发明的化合物还可以被脂质体地施用(administer liposomally)。载体或其他材料的精确的性质将取决于施用的途径并且本领域技术人员完全能够制备合适的溶液并且大量的方法在参考文献中被描述。

[0371] 用于口服施用的示例性组合物包括悬浮液，其可以包含，例如用于赋予体积的微晶纤维素、作为悬浮剂的海藻酸或海藻酸钠、作为粘度增强剂的甲基纤维素、以及增甜剂或增香剂例如本领域技术人员已知的那些；以及立即释放片剂，其可以包含，例如微晶纤维素、磷酸氢钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、粘合剂、增充剂、崩解剂、稀释剂以及润滑剂，例如本领域技术人员已知的那些。本发明的化合物还可以通过舌下的和/或面颊的施用被递送通过口腔。模制的片剂、压制的片剂或冷冻干燥的片剂是可以被使用的示例性的形式。示例性组合物包括将本发明化合物与快速溶解的稀释剂，例如甘露醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精一起配制的那些。还被包括在这样的制剂中的可以是高分子量赋形剂，例如纤维素(微晶粉末纤维素)或聚乙二醇(PEG)。此类制剂还可以包括帮助粘膜粘附的赋形剂，例如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)，以及控制释放的剂，例如聚丙烯酸共聚物(例如，卡波姆934)。润滑剂、助滑剂、调味剂、着色剂以及稳定剂还可以为了容易制造和使用被添加。

[0372] 用于鼻用气雾剂或吸入施用的示例性组合物包括在盐水中的溶液，其可以包含，例如苄醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、和/或其他增溶剂或分散剂，例如本领域已知的那些。

[0373] 用于肠胃外施用的示例性组合物包括可注射的溶液、乳液或悬浮液，其可以包含，例如合适的无毒的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等渗氯化钠溶液、油或其他合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，包括合成的甘油单酯或甘油二酯、以及脂肪酸，包括油酸、或乳浮(Cremaphor)。

[0374] 用于直肠施用的示例性组合物包括栓剂，其可以包含，例如合适的非刺激性赋形剂，例如可可油、合成的甘油酯或聚乙二醇，所述栓剂在常温下是固体，但在直肠腔中液化和/或溶解以释放药物。

[0375] 在本发明的上下文中，向哺乳动物，特定地人类施用的剂量应该足以在哺乳动物中经过合理的时间范围实现治疗反应。本领域技术人员将认识到剂量将取决于多种因素，包括特定的化合物的效力、患者的年龄、状况和体重、被治疗的状况的程度、治疗医师的建议、以及被选择用于施用的治疗药物或治疗药物的组合，以及疾病的阶段和严重程度。剂量还将通过施用的途径(施用形式)、时间和频率来确定。用于成年人类的本发明的口服剂量，当用于指示的作用时，将在约0.01mg每kg的体重每天(mg/kg/天)至约100mg/kg/天、优选地0.01mg每kg的体重每天(mg/kg/天)至20mg/kg/天、并且最优选地0.1mg/kg/天至约10mg/
kg/天之间的范围。对于口服施用，组合物优选地以在包含0.5毫克至1000毫克的活性成分用于症状调整的剂量的片剂形式或以离散单元提供的外观的其他形式被提供至待治疗的
患者，例如0.5mg、1.0mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg、15.0mg、25.0mg、50.0mg、100mg、200mg、
400mg、500mg、600mg以及800mg。

[0376] 肠胃外地，尤其脑室内地或腹膜内地，在恒速输注期间，最优选的剂量将在约0.001mg/kg/小时至约10mg/kg/小时范围内。有利地，本发明的化合物可以以单剂量形式被施用，例如每天一次或更少、或以两次、三次或四次每天的分开的剂量施用的总每天剂量。

[0377] 本发明的化合物还可以与在治疗胶质瘤，例如成胶质细胞瘤中有用的至少一种第二治疗剂组合地被使用或被施用。治疗剂可以在相同的制剂中或分开的制剂中用于同时地或相继地施用。本发明的化合物还可以在组合治疗中被使用或与另外的疗法，例如手术和/或辐照和/或其他治疗策略(包括化学疗法)组合地被施用。

[0378] 如本文所使用的，术语“化合物”指的是式(I)的化合物自身，以及其药学上可接受的盐、水合物、复合物、酯、前体药物和/或前体药物的盐，除非在用于该化合物的特定权利要求中另外指定的。在一个优选的实施方案中，R1是合适的前体药物酯、磷酸酯、磺酸酯、水合物、缩醛、半缩醛或在细胞内被裂解的任何其他的可水解的或可酶解解的基团。

[0379] 为了本发明的目的，术语“与改变的Ras/Rac活性有关的癌症”应该被理解成包括与在Ras和/或Rac中的突变或Ras和/或Rac的异常活性有关的所有类型的癌症，例如在以下的组织中的癌症：肾上腺、自主神经节、胆道、骨骼、乳房、中枢神经系统、子宫颈、子宫内膜、造血组织/淋巴组织、肾、大肠、肝、肺、食管、卵巢、胰腺、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、上呼吸消化道、尿道[Ian A.Prior.,Paul D Lewis,Carla Mattos(2012)A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.Cancer Research 72,2457-2467]。

[0380] 为了本发明的目的，术语“胶质瘤”应该被理解成包括所有类型的胶质瘤，即室管膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤以及混合的胶质瘤；所有等级的胶质瘤，I-IV级胶质瘤肿瘤；以及在所有位置中，幕上的、幕下的以及脑桥的。“成胶质细胞瘤”应该被理解为与多形性成胶质细胞瘤(GBM)同义的或IV级星形细胞瘤。

[0381] 术语“胞吞”指的是细胞通过吞没分子(例如，蛋白质)而吸收所述分子的能量使用过程。胞吞包括网格蛋白介导的胞吞。非网格蛋白依赖性胞吞的实例包括，例如：小窝(Caveola)、大胞饮和噬菌。本发明特定地涉及与小窝无关的类型的非网格蛋白依赖性胞吞，例如大胞饮。

[0382] 术语“液泡化”指的是在所有动物细胞中存在的膜结合细胞器(membrane-bound organelle)。液泡事实上是用包含无机的和有机的分子(包括在溶液中的酶)的水填充的封闭的隔室，但在某些情况下其可以包含已经被吞没的固体。液泡可以通过多膜囊泡的融合以形成大的囊泡或在细胞质膜从胞吞在细胞内被形成。液泡不具有基本的形状或大小；其结构根据细胞的需要而不同。

[0383] 术语“癌症干细胞”指的是可以在动物模型中或在患者中形成新的肿瘤的癌症/肿瘤细胞，并且被用作引发/诱导肿瘤的细胞的同义词。关于成胶质细胞瘤，所述癌细胞表示成胶质细胞瘤癌症干细胞。

[0384] 如整个说明书和权利要求书所使用的术语“治疗”涵盖预防性治疗、姑息性治疗或治愈性治疗。因此。术语“治疗(treating)”(或治疗(treatment))不仅仅涵盖治疗(treating)(或治疗(treatment))患者以减轻患者的疾病或状况的病征和症状、或以缓解罹患疾病或紊乱的患者的状况，而且涵盖预防地治疗无症状的患者以阻止疾病或状况的发病或进展。在一个实施方案中，治疗是减轻患者的疾病或状况的病征和症状、或是缓解罹患疾病或紊乱的患者的状况或是阻止疾病或状况的进展。

[0385] 如本文所使用的，“治疗(treating)”“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”描述为了战胜疾病、状况、或紊乱的目的对患者的管理和照料并且包括本发明的化合物的施用以缓解疾病、状况或紊乱的症状或并发症，或以消除疾病、状况或紊乱。术语“治疗(treat)”还可以包括体外细胞或动物模型的处理(treatment)。

[0386] 术语“患者”包括哺乳动物(包括人类)患者(或“受试者”)。如本文所使用的，“受试者”与“需要其的受试者”是可交换的，两者指的是具有其中病毒感染起作用的紊乱的受试者、或相对于普通群体具有发展癌症的增大的危险的受试者。“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是，例如人类或合适的非人类哺乳动物，例如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。在一个实施方案中，哺乳动物是人类。

[0387] 本发明的一方面是包含以下的组合产品：

[0388] (A)如在上文中定义的本发明的化合物；以及

[0389] (B)在治疗成胶质细胞瘤中有用的第二治疗剂，其中本发明的化合物(A)和第二治疗剂(B)中的每个被配制在具有药学上可接受的赋形剂的掺合物中。这样的组合产品提供用于本发明的化合物连同第二治疗剂的施用，并且因此可以被呈现为分开的制剂，其中至少一个这样的制剂包含本发明的化合物并且至少一个包含第二治疗剂，或可以被呈现(即，被配制)为组合的剂型(即，作为包含本发明的化合物和另一个治疗剂的单一制剂被呈现)。

[0390] 本发明的一方面是药物制剂，其包含如在上文中定义的本发明的化合物和第二治疗剂，以及药学上可接受的赋形剂，例如佐剂、稀释剂或载体。

[0391] 本发明的还另一方面包含以下的部分的试剂盒：

[0392] (a)药物制剂，其包含在具有药学上可接受的赋形剂，例如佐剂、稀释剂或载体的掺合物中的如在上文中定义的本发明的化合物；以及

[0393] (b)药物制剂，其包含在具有药学上可接受的赋形剂，例如佐剂、稀释剂或载体的掺合物中的第二治疗剂；

[0394] 其中每个组分(a)和(b)都以适于连同另一个施用的形式被提供。

[0395] 如上文定义的本发明的化合物可以被用于将期望的化合物、物质和/分子选择性地递送至体内或体外的胶质瘤细胞。这些期望的物质/化合物/分子可以是例如用于选择性杀死胶质瘤细胞的治疗性化合物、或用于胶质瘤细胞的选择性成像的成像分子，例如对比分子。治疗性化合物可以是细胞毒性化合物、治疗性DNA、抗体、基因产物、纳米颗粒或具有在体内杀死胶质瘤细胞的能力的其他剂。

[0396] 本发明的一方面因此是上文定义的化合物(I)用于期望的化合物、物质或分子，例如细胞毒性化合物、治疗性DNA、抗体、基因产物、纳米颗粒或具有在体内杀死胶质瘤细胞的能力的其他剂的胶质瘤细胞选择性递送的用途。

[0397] 本发明的另外的方面是上文定义的选择性递送用于治疗胶质瘤，例如成胶质细胞瘤的用途。

[0398] 另一方面是上文定义的化合物(I)用于成像分子，例如对比分子或对比剂的胶质瘤细胞选择性递送以用于胶质瘤细胞的成像的用途。

[0399] 本发明的另外的方面是用于评估测试化合物用于治疗脑癌的能力的斑马鱼筛选测定，所述斑马鱼筛选测定包括以下步骤：

[0400] a)防止斑马鱼胚胎的色素形成；

[0401] b)在容器中将胚胎温育持续受精后两天(2dpf)；

[0402] c)将斑马鱼麻醉；

[0403] d)将未标记的或染料标记的或转基因表达的脑癌细胞或细胞注射到胚胎的脑室中；

[0404] e)允许斑马鱼从麻醉中恢复；

[0405] f)将活的游动的斑马鱼分配到具有多室的容器中；

[0406] g)将测试化合物添加至至少一个容器室；

[0407] h)随时间监测斑马鱼以通过确定在斑马鱼脑中的细胞的增加或减少来确立测试化合物的效力。

[0408] 例如，脑癌是胶质瘤。

[0409] 例如，癌细胞是未标记的或染料标记的(例如，细胞示踪剂)或转基因表达的(例如，GFP/RFP或荧光素酶或强力霉素/四环素或他莫昔芬可诱导的构造)癌细胞或来自脑肿瘤胶质瘤细胞的原发性肿瘤的细胞，例如成胶质细胞瘤细胞。

[0410] 例如，麻醉用三卡因来完成。

[0411] 例如，色素形成通过用阻断胚胎的色素形成的发展的物质，例如吗啉代类，诸如抗MITFa mRNA的吗啉代注射在1细胞期的胚胎，或通过将胚胎暴露至苯基硫脲而被阻止。

[0412] 例如，许多测试化合物在一次中但将所述许多测试化合物中的一个添加至在容器中包含斑马鱼胚胎的室而被测定。

[0413] 本发明的另外的方面是用于评估化合物用于治疗胶质瘤，例如成胶质细胞瘤的治疗潜力/效力的斑马鱼筛选测定，所述斑马鱼筛选测定包括以下步骤：

[0414] i)通过以下防止斑马鱼胚胎的色素形成

[0415] i)用阻断胚胎的色素形成的发展的物质，例如吗啉代，诸如抗MITFa mRNA的吗啉代，注射在1细胞期的胚胎，

[0416] 和/或

[0417] ii)向待用于温育胚胎的温育器的水箱水添加苯基硫脲(PTU)

[0418] j)将斑马鱼胚胎放在温育水箱中并且允许胚胎在温育器中生长持续受精后两天(2dpf)

[0419] k)收集斑马鱼，例如在陪替氏培养皿或类似的容器中，并且通过使用例如嵌入在陪替氏培养皿或类似物中的琼脂糖(低熔)中的三卡因使其麻醉

[0420] l)将未标记的或染料标记的(例如，细胞示踪剂)或转基因表达的(例如，GFP/RFP或荧光素酶或强力霉素/四环素或他莫昔芬可诱导的构造)癌细胞或来自脑肿瘤胶质瘤细胞的原发性肿瘤的细胞，例如成胶质细胞瘤细胞注射到胚胎的脑室中

[0421] m)任选地除去错误地注射的胚胎

[0422] n)用在陪替氏培养皿或容器中的正常水箱水替换含麻醉药的水箱水，例如三卡因处理的水箱水

[0423] o)允许斑马鱼恢复，例如持续约3-4小时

[0424] p)将活的游动的斑马鱼分配到多孔板或类似的容器中

[0425] q)以需要的浓度将化合物添加至孔或容器

[0426] r)定期地，例如每天，用包含所述相同药物浓度的水交换在孔或容器中的水箱水[0427] s)随时间监测斑马鱼以通过确定在斑马鱼脑中的胶质瘤(成胶质细胞瘤)细胞的增加或减少，例如通过视觉地监测斑马鱼来确立在胶质瘤的治疗中评估的药物的效力。

[0428] 在某些实施方案中，缀合物是被连接至货物化合物或与货物化合物接触的本文描述的化合物。

[0429] 在某些实施方案中，缀合物是被连接至货物化合物或与货物化合物接触的式(I)的化合物。

[0430] 在某些实施方案中，缀合物是被连接至货物化合物或与货物化合物接触的选自表1的化合物。

[0431] 在本文称为S1至S29的化合物的式在本文以下表1中被示出。

[0432] 表1

[0433]

[0434]

[0435]

[0436]

[0437]

[0438]

[0439] *由NCI/DTP开放的化学品库(NCI/DTP Open Chemical Repository)提供的化合物。

[0440] 术语“约(about)”在本文被用于意指近似地(approximately)、在附近(in the region of)、粗略地(roughly)或大约(around)。当术语“约”与数字范围共同使用时，其通过将边界扩展到高于和低于陈述的数值而修改该范围。通常，术语“约”在本文被用于将数值修改到高于和低于陈述的值20％的变化。

[0441] 如在本公开内容中所使用的，无论在权利要求的连接词(transitional phrase)中或主体中，术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”应被解释为具有开放式的含义。即，该术语应当与措辞“具有至少”或“包括至少”被同义地解释。当在工艺的情况下被使用时，术语“包括(comprising)”意指该工艺包括至少列举的步骤，但可以包括另外的步骤。
当在分子、化合物、或组合物的情况下被使用时，术语“包括(comprising)”意指该化合物或组合物包括至少列举的特征或组分，但还可以包括另外的特征或组分。

[0442] 在本文使用的所有百分比和比率，除非另外指示的，否则是按重量计。本发明的其他特征和优点从不同的实施例中是明显的。提供的实施例例证在实践本发明中有用的不同的组分和方法学。实施例不限制要求保护的发明。基于本公开内容，技术人员可以识别和使用用于实践本发明的其他组分和方法学。实施例

[0443] 除非另外注明的，否则所有溶剂和试剂购自商业来源并且不另外纯化或表征而使用。使用烘箱干燥的玻璃器皿在氮气或氩气氛围下进行所有涉及空气敏感的或湿敏感的试剂的反应。四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、以及二乙醚通过在钠金属上回流被干燥并且按照需要被新鲜蒸馏。除非另外指示的，否则所有反应在环境温度(18-25℃)下进行。微波辅助的反应在BIOTAGE,型号:Initiator Exp.EU 355301,011594-50X中进行。反应被磁力搅拌并且通过使用来自Merck的TLC 硅胶60F 254铝板的薄层色谱法监测并且用254nm UV光和茚三酮碳(ninhydrin char)分析。用来自Merck的硅胶(60-120目，pH＝6.5-7.5)进行快速色谱法(flash chromatography)。使用碱性的或酸性的洗脱方案在Gilson 305HPLC系统上进行制备型HPLC。为了在碱性条件下纯化，Gilson 305HPLC系统配备有Xbridge C18(5μm,30mm x 75mm)柱，并且使用乙腈和包含50mM NH4HCO3(pH 10)的H2O的梯度体系洗脱化合物。为了酸性纯化，Gilson 305HPLC系统配备有ACE 5C8(5μm,30mm x 150mm)柱，并且使用乙腈和包含0.1％TFA的H2O的梯度体系洗脱化合物。使用内部氘锁定(internal deuterium lock)在环境温度下在Bruker Avance-III 500MHz系统上使用Topspin-3 软件或在Bruker Avance-I DPX 400MHz系统上使用Topspin-1软件记录质子核磁共振(1H NMR)光谱。所有化合物被纯化至≥95％的纯度，如通过LCMS或HPLC/UPLC确定的。如果化合物的峰面积是>95％的UV和LCMS/UPLC色谱图的总峰面积并且如果MS光谱产生预期的m/z和同位素比，则认为化合物是纯的。

[0444] 以下化合物由NCI/DTP开放的化学品库来提供：NSC13480(S1)、NSC305787(S2)、NSC157571(S3)、NSC4377(S4)、NSC305758(S5)、NSC14224(S6)、NSC2450(S7)、NSC13316(S10)、NSC16001(S11)、NSC23924(S12)、NSC13097(S13)、NSC23925(S15)、NSC322661(S17)、以及NSC13466(S18)。用于另外地制备根据式(I)的化合物的三种一般方法在实施例1、2和9中被说明。新颖的化合物S8、S9、S14、S16、S20、S21、S22、和S23、S24、S25、S27、S29以及化合物S26和S28(由León,B.等人Org.Lett.2013,15,1234-1237描述的)如在实施例3至9中描述的被制备。S20的立体选择性合成在实施例10中被呈递。

[0445] 实施例1Vacquinol-1(S10,NSC13316)的合成.一般方法A.

[0446]

[0447] 反应条件：(a)(4-氯苯基)苯乙酮,KOH,EtOH,51％；(b)MeOH,H2SO4,57％；(c)8,NaNH2,苯,14％；(d)HCl,NaOH,63％；(e)Br2,HBr,68％；(f)Na2CO3,EtOH,55％；(g)EtOH,NaBH4,66％。6-苯甲酰氨基己酸甲酯(8)的合成：(h)SOCl2,MeOH,99％；(i)苯甲酸,EDCI,HOBt,DIPEA,63％。

[0448] 2-(4-氯苯基)喹啉-4-羧酸(中间体1).将4-氯苯乙酮(47.0g,244mol)以一次加入的方式添加至靛红(30.0g,204mmol)在500mL乙醇中的搅拌的溶液。以若干部分的方式添加氢氧化钾片(22.8g,408mmol)并且将反应加热至回流持续14小时。反应用1升水稀释并且用乙酸乙酯(3×300mL)洗涤。水层在冰浴中冷却并且用冰醋酸酸化。将沉淀的产物过滤，用冷的、稀醋酸洗涤并且在真空中干燥以给出分析纯的中间体1(29.5g,51％)。TLC：30％EtOAc/己烷类(Rf:0.2)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.59(d,J＝8.6Hz,1H),8.37(s,1H),8.23(d,J＝
8.5Hz,2H),8.11(d,J＝8.5Hz,1H),7.82(t,J＝7.7Hz,1H),7.68(t,J＝7.7Hz,1H),7.57(d,J＝8.3Hz,2H)。LC-MS(ESI+):m/z 284.5[M+H]+。

[0449] 2-(4-氯苯基)喹啉-4-羧酸甲酯(中间体2).将浓硫酸(0.45mL)添加至1(500mg,1.76mmol)在MeOH(10mL)中的搅拌的溶液。将反应混合物加热至回流持续6小时。反应混合物用饱和的NaHCO3溶液(20mL)稀释并且用EtOAc(2×20mL)萃取。合并的有机萃取物用水
(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以提供粗料，通过硅胶柱色谱法
1
(10％EtOAc/己烷类)纯化粗料以提供作为灰白色固体的中间体2(402mg,76％)。H NMR
(400MHz,CDCl3)：δ8.73(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(s,1H),8.26-8.14(m,3H),7.78(t,J＝
6.8Hz,1H),7.63(t,J＝7.2Hz,1H),7.50(d,J＝6.8Hz,2H),4.07(s,3H)。LC-MS(ESI+)：m/z
298.3[M+H]+。

[0450] 6-苯甲酰氨基-2-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-羰基)己酸甲酯(中间体3).在室温下，将中间体2(10.0g,0.03mol)添加至氨基钠(3.10g,0.08mol)在苯(100mL)中的溶液。搅拌反应混合物持续10分钟并且添加6-苯甲酰氨基己酸甲酯(中间体8,9.6g,0.038mol)。在90℃下搅拌反应混合物持续24小时。将反应混合物蒸发至干并且用水稀释。粗化合物用EtOAc萃取。有机层经硫酸钠干燥并且在减压下蒸发以给出中间体3。(2.04g,13.9％)。TLC：40％EtOAc/己烷类(Rf:0.1)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.58(s,1H),8.49–8.29(m,3H),8.19–8.04(m,2H),7.90–7.75(m,3H),7.74–7.55(m,3H),7.47(m,3H),4.96(m,1H),3.92(m,1H),
3.2-3.4(m,4H),1.97(m,2H),1.62(m,2H),1.44(m,2H)。LC-MS(ESI+)：m/z 516[M+H]+(78％纯度)。

[0451] 6-氨基-1-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)己-1-酮(中间体4).将中间体3(10g,0.019mol)悬浮在6N HCl(100mL)中并且在110℃下回流持续48小时。反应通过LCMS来监测起始材料至产物的完全转化。使用10％的含水氢氧化钠将反应混合物的pH调整至10-12并且粗产物用氯仿萃取。有机层经硫酸钠干燥并且在减压下蒸发以给出作为粗品(63％纯度)的中间体4(3.94g)，中间体4在下一步骤中直接使用。TLC：30％EtOAc/己烷类(Rf:0.3)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35–7.84(m,4H),7.74(s,1H),7.65–7.33(m,4H),4.00(s,1H),3.18–
2.78(m,1H),1.90(d,J＝74.6Hz,2H),1.38–0.69(m,5H)。LC-MS(ESI+)：m/z 353[M+H]+。

[0452] 6-氨基-2-溴-1-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)己-1-酮氢溴酸盐(中间体5).将中间体4(3.0g,8.5mmol)溶解在氯仿(50mL)中并且添加氢溴酸(47％水溶液,20mL)。允许反应混合物在室温下搅拌持续30分钟。在减压下除去溶剂并且将悬浮液加热至90℃，这之后将溴(1.35g,8.52mmol)经20分钟添加至反应混合物。将反应混合物冷却至室温并且用水(50mL)稀释。将获得的固体过滤并且用若干部分二乙醚洗涤。获得的粗中间体5(2.47g,68.3％)被
1
用于下一步而不进一步纯化。TLC：30％EtOAc/己烷类(Rf:0.1)H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ
8.62(s,1H),8.42(d,J＝8.3Hz,2H),8.18(d,J＝8.2Hz,1H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.89
(m,1H),7.70(m,5H),6.01(m,1H),2.86(m,2H),2.27(m,1H),2.08(m,1H),1.87–1.47(m,
4H)。LC-MS(ESI+)：m/z 433[M+H]+(52.6％纯度)。

[0453] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇(中间体6).将粗6-氨基-2-溴-1-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)己-1-酮氢溴酸盐(中间体5,2.50g,5.81mmol)溶解在乙醇(60mL)中并且向其添加15％碳酸钠溶液(20mL)。搅拌反应持续1小时。TLC示出起始材料的完全转化。
将反应混合物通过布氏漏斗过滤并且在减压下蒸发乙醇层。通过使用在己烷中的15％乙酸乙酯的、具有100-200目硅胶的柱色谱法纯化粗化合物以产生中间体6(1.1g,55％)。TLC：
30％EtOAc/己烷类(Rf:0.5)1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.19(d,J＝8.3Hz,2H),8.15(d,J＝
8.3Hz,1H),7.91(s,1H),7.85–7.75(m,2H),7.60(d,J＝7.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.3Hz,2H),
5.31(m,1H),3.28(m,2H),2.24(m,2H),1.87(m,2H),1.30(m,2H)。LC-MS(ESI+)：m/z 352[M+H]+(99.4％纯度)。

[0454] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇(S10,Vacquinol-1，NSC13316).在氮气氛下，将中间体6(3.0g,8.5mmol)溶解在乙醇中。将反应混合物冷却至0℃并且分批地将硼氢化钠(108mg,17.1mmol)添加至反应混合物。反应在0℃下搅拌持续60分钟并且通过TLC监测。反应用水(5mL)猝灭并且在减压下蒸发溶剂。将粗品在乙酸乙酯和水之间分配并且有机层用水洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。通过使用在己烷中的15％乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱法纯化粗化合物以给出期望的产物S10(NSC13316)(2.06g,66.3％)。TLC：30％EtOAc/己烷类(Rf:0.2)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(m,3H),8.15(d,J＝6.1Hz,
1H),8.09(d,J＝8.6Hz,1H),7.77(t,J＝7.7Hz,1H),7.62(d,J＝8.3Hz,3H),5.73(m,1H),
5.33–5.03(m,1H),3.46–3.20(m,1H),3.07–2.76(m,2H),2.42(m,1H),1.77–0.98(m,6H)。
+ +
LC-MS(ESI )：m/z 353[M+H](99.4％纯度)。

[0455] 6-氨基己酸甲酯(中间体7).在0℃下，将亚硫酰氯(47.6g,0.40mol)在氮气氛下逐滴地添加至6-氨基己酸(50.0g,0.38mol)在干燥的甲醇(650mL)中的搅拌的溶液。搅拌反应混合物持续10分钟并且然后在90℃下回流持续3小时。在反应完成之后，将溶剂蒸发至干并且获得白色固体。用己烷洗涤获得的固体以给出69g的期望的中间体7。(收率：99％)。TLC:10％MeOH/DCM(Rf:0.2)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,3H),3.66–3.50(s,3H),2.72(m,
2H),2.29(t,J＝7.3Hz,2H),1.54(m,4H),1.30(m,2H)。LC-MS(ESI+)：m/z 146[M+H]+(100％纯度)。

[0456] 6-苯甲酰氨基己酸甲酯(中间体8).将N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(19.05g,0.122mol)、羟基苯并三唑(16.47g,0.122mol)和二异丙基乙基胺(31.72g,
0.245mol)添加至6-氨基己酸甲酯(中间体7,17.8g,0.098mol)在DMF(150mL)中的溶液。搅拌反应混合物持续10分钟并且添加苯甲酸(10g,0.08mol)。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后用水稀释并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层合并，经无水硫酸钠干燥并且在减压下蒸发以提供期望的中间体8。(12.76g,62.5％)。TLC：10％MeOH/DCM(Rf:0.5)1H NMR
(400MHz,DMSO-d6)δ8.42(d,J＝6.0Hz,1H),7.83(d,J＝7.3Hz,2H),7.47(m,3H),3.57(s,
3H),3.24(m,2H),2.30(t,J＝7.4Hz,2H),1.54(m,4H),1.30(m,2H)。LC-MS(ESI+)：m/z 250[M+H]+(66％纯度)。

[0457] 实施例2.Vacquinol-1(S10,NSC13316)的合成.一般方法B.

[0458]

[0459] 反应条件：(a)N-Boc-哌啶,仲-BuLi,TMEDA,THF,27％；(b)NaBH4,EtOH,72％；(c)HCl,Et2O,MeOH,80％。

[0460] 2-(2-苯基喹啉-4-羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体9)将TMEDA(2mL)和仲丁基锂(在环己烷中1.4M,5mL,7.06mmol)逐滴地添加至冷却至0℃的、哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.0g,
5.4mmol)在干燥的THF(30mL)中的搅拌的溶液中并且搅拌持续2小时。将化合物2(1.42g,
5.43mmol)在干燥的THF(30mL)中的溶液添加至反应混合物并且在0℃下搅拌继续另外的2
小时。将反应混合物缓慢地加温至RT并且搅拌持续3小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后；反应混合物用饱和的氯化铵溶液(40mL)猝灭并且用EtOAc(2×40mL)萃取。合并的有机萃取物用水(40mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以获得粗的残余物。粗料通过硅胶柱色谱法(5％EtOAc/己烷类)纯化以提供作为黄色固体的中间体9
(600mg,27％)。TLC：5％EtOAc/己烷类(Rf:0.4)1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.3-8.15(m,5H),
7.94-7.81(m,1H),7.68-7.61(m,1H),7.60-7.55(m,2H),5.72-5.68(m,1H),4.02-3.92(m,
+
1H),3.05-2.97(m,1H),2.18-2.05(m,2H),1.78-1.65(m,4H),1.38(s,9H)。LC-MS(ESI ):m/z 451[M+1]在5.21保留时间(87.19％纯度)；HPLC纯度：81.76％。

[0461] 2-((2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体10).将NaBH4(72mg,1.92mmol)添加至冷却至0℃的、中间体9(400mg,0.96mmol)在EtOH(8mL)中的搅拌的溶液并且反应搅拌持续2小时。在起始材料的完全消耗之后，反应用水(20mL)稀释并且用EtOAc(2×20mL)萃取。合并的有机萃取物用水(20mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以获得粗料，该粗料通过硅胶柱色谱法(硅胶，15％EtOAc/己烷类)纯化以提供作为灰白色固体的中间体10(外消旋的)(180mg,72％)。TLC：30％EtOAc/己烷类(Rf:
0.25)。1H NMR(400MHz,CD3OD):(外消旋的)δ8.6-8.35(m,1H),8.15-8.05(m,4H),7.81-7.72(m,1H),7.75-7.51(m,3H),5.8-5.6(m,1H),4.7-4.55(m,1H),4.11-3.95(m,1H),3.44-3.15(m,1H),1.95-1.41(m,6H),1.34(s,9H)。LC-MS(ESI+)：m/z 453.5[M+H]+。UPLC纯度：28.03％和68.16％(外消旋的)

[0462] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇盐酸盐(S10,NSC13316).将在乙醚(0.17mL,3.53mmol)中的4M HCl(0.17mL,3.53mmol)在0℃下添加至冷却至0℃的、中间体10(80mg,0.17mmol)在MeOH(2mL)中的搅拌的溶液。将反应混合物加温至室温并且搅拌持续4小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后；挥发物在减压下蒸发并且粗料用乙醚(2x 10mL)磨碎以提供作为灰白色固体的化合物S10(Vacquinol-1,NSC13316)(50mg,
80％)。TLC：40％EtOAc/己烷类(Rf:0.1)1H NMR(400MHz,CD3OD-d4):(外消旋的)δ8.56-8.45(m,2H),8.39(d,J＝8.8Hz,1H),8.20-8.12(m,3H),8.02-7.94(m,1H),7.77-7.74(m,2H),
6.05-5.7(m,1H),3.73-3.64(m,1H),3.48-3.40(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.99-2.94(m,
1H),1.90-1.80(m,4H),1.52-1.29(m,2H)。LC-MS：(外消旋的)54.37％在4.2保留时间,
43.27％在4.37保留时间；353.3(M+1)UPLC(纯度)：(外消旋的)64.25％+33.21％。LC-MS(ESI+)：m/z 353[M+H]+。

[0463] 实施例3.S14的合成

[0464]

[0465] 反应条件：(a)NaBH4,EtOH,72％；(b)NaH,MeI,DMF,63％；(c)HCl,二氧六环,36％。

[0466] 2-((2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体10)如在实施例2中描述的被制备。

[0467] 2-((2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(甲氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体11).将氢化钠(18.5mg,0.46mmol)在惰性气氛下添加至冷却至0℃的、中间体10(140mg,0.31mmol)在DMF(1mL)中的搅拌的溶液并且搅拌持续10分钟。将甲基碘(0.023mL,0.371mmol)添加至缓慢加温至室温的反应混合物并且搅拌持续1小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后；反应混合物用水(10mL)稀释并且用EtOAc(2×25mL)萃取。合并的有机萃取物用水
(50mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩。粗料通过硅胶柱色谱法(5-10％
EtOAc/己烷类)纯化以提供作为无色的稠的浆料的中间体11(90mg,62.5％)。不另外纯化被使用TLC：1:3EtOAc:己烷(Rf:0.6)LC-MS(ESI+):(外消旋的)m/z 467.6[M+H]+。HPLC(纯度)：
(外消旋的)61.37％纯度在16.51保留时间和32.75％纯度在16.14保留时间。

[0468] 2-(4-氯苯基)-4-(甲氧基(哌啶-2-基)甲基)喹啉盐酸盐(S14).将在二氧六环(0.2mL,0.77mmol)中的4N HCl在惰性气氛下逐滴地添加至冷却至0℃的中间体11(90mg,
0.19mmol)在MeOH(2mL)中的搅拌的溶液并且搅拌持续16小时。反应的进程通过TLC来监测。
在起始材料的完全消耗之后，挥发物在真空中蒸发以获得粗料，该粗料通过制备型HPLC-MS纯化以提供作为无色胶粘的固体的S14(25mg,36％)。TLC：1:3EtOAc:己烷类(Rf:0.1)1H NMR(400MHz,CD3OD)(外消旋的)：δ8.30(d,J＝8.8Hz,1H),8.23-8.18(m,1H),8.13(d,J＝
8.8Hz,1H),8.09(s,1H),8.01(s,1H),7.88-7.84(m,1H),7.71-7.68(m,1H),7.58(d,J＝
8.4Hz,2H),5.40-5.07(m,1H)3.70-3.52(m,1H),3.47-3.44(m,1H),3.38(s,3H),3.06-2.99(m,1H),1.91-1.60(m,4H),1.50-1.29(m,2H)。LC-MS(ESI+)：(外消旋的)m/z 367.3[M+H]+。
HPLC(纯度)：(外消旋的)63.41％在15.64保留时间和35.68％在16.78保留时间。

[0469] 实施例4.S19的合成

[0470]

[0471] 反应条件：(a)HCl,二氧六环,34％；(b)甲醛,Na(OAc)3BH,DCM,55％；(c)NaBH4,EtOH,25％。

[0472] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲酮(中间体26).将在1,4-二氧六环(0.17mL)中的4N HCl添加至冷却至0℃的、中间体9(150mg,0.33mmol)在CH2Cl2(5mL)中的搅拌的溶液。将反应混合物缓慢地加温至室温并且搅拌持续2小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后，挥发物在减压下蒸发并且残余物用乙醚(2×10mL)磨碎以获得粗料。粗残余物通过涉及质量的纯化(mass-directed purification)来纯化以提供作为灰白色固
体的中间体26(40mg,34％)。TLC：20％EtOAc/己烷类(Rf:0.3)1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ8.37(s,1H),8.31(d,J＝6.8Hz,2H),8.29-8.20(m,2H),7.91-7.86(m,1H),7.73-7.69(m,1H),
7.61-7.58(m,2H),5.26-5.23(m,1H),3.64-3.61(m,1H),3.21-3.20(m,1H),2.14-2.09(m,
1H),1.99-1.91(m,2H),1.78-1.64(m,3H)。LC-MS：98.29％；351(M+1)；(柱；X-Bridge C-18(50×3.0mm,3.5μm)；保留时间3.51min；在水中的0.05％TFA:ACN；0.80ml/分钟)。UPLC(纯度)：96.23％。

[0473] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲酮(中间体12).将含水甲醛(37％,0.1mL,1.20mmol)添加至冷却至0℃的、中间体26(140mg,0.40mmol)在二氯甲烷
(10mL)中的搅拌的溶液并且搅拌持续20分钟。添加NaBH(OAc)3(169mg,0.80mmol)并且搅拌继续持续2小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后；反应混合物用水(10mL)稀释并且用DCM(2×10mL)萃取。合并的有机萃取物用水(10mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以获得粗的残余物。粗料通过硅胶柱色谱法(15-20％EtOAc/己烷类)纯化以提供作为无色的稠的浆料的中间体12(80mg,55％)。TLC：40％EtOAc/己烷类(Rf:0.5)。1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ8.29-8.28(m,2H),8.20-8.13(m,2H),7.84(d,J＝7.5Hz,1H),7.69(d,J＝7.5Hz,1H),7.67-7.58(m,3H),4.55(m,1H),3.35(s,3H),2.60(m,2H),1.88-1.85(m,3H),
1.81-1.78(m,3H),1.57-1.53(m,2H)。LC-MS(ESI+)：m/z365[M+H]+74.13％(纯度)在4.53保留时间；UPLC纯度：77.47％

[0474] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(1-甲基哌啶-2-基)甲醇(S19).将NaBH4(17mg,0.44mmol)添加至冷却至0℃的中间体12(80mg,0.21mmol)在EtOH(2mL)中的搅拌的溶液并
且反应搅拌持续1小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后；反应混合物用水
(10mL)稀释并且用EtOAc(2×10mL)萃取。合并的有机萃取物用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以获得粗料，该粗料通过制备型HPLC纯化以提供作为灰白色的固体的中间体S19(20mg,25％)。TLC：40％EtOAc/己烷类(Rf:0.1)1H NMR(400MHz,CD3OD)：(外消旋的)δ8.26(s,1H),8.22-8.17(m,3H),8.20-8.18(m,1H),8.13-
8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),7.73(t,J＝8.0Hz,1H),7.59(d,J＝6.8Hz,
2H),6.20-6.18(m,1H),3.72-3.68(m,1H),3.54-3.51(m,1H),3.25(s,3H),3.22-3.21(m,
1H),1.93-1.72(m,4H),1.33-1.26(m,1H),1.16-1.13(m,1H)。LC-MS(ESI+)：m/z 367.4[M+H]+。UPLC纯度：(外消旋的)78.21％在1.99保留时间和17.75％在2.02保留时间。

[0475] 实施例5.S16的合成

[0476]

[0477] 反应条件：(a)N-Boc-吡咯烷,仲-BuLi,TMEDA,THF,27％；(b)NaBH4,EtOH,85％；(c)HCl,MeOH,91％。

[0478] 2-(2-(4-氯苯基)喹啉-4-羰基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体13).将TMEDA(1mL,催化剂)，随后是仲-BuLi(在环己烷中的1.4M,2.73mL,3.82mmol)添加至冷却至-78℃的吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(500mg,2.94mmol)在干燥的THF(10mL)中的搅拌的溶液并且搅拌持续2小时。保持温度在-78℃下，将2(873mg,2.94mmol)在干燥的THF(5mL)中的溶液添加至反应混合物，并且继续持续另外的1小时。将反应混合物缓慢地加温至室温，搅拌持续2小时(通过TLC监测)并且用饱和的NH4Cl溶液(20mL)猝灭。反应混合物用EtOAc(2×25mL)萃取，并且合并的有机萃取物用水(20mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以获得粗料。粗的残余物通过硅胶柱色谱法(10％EtOAc/己烷类)纯化以提供作为无色的稠的浆料的中间
体13(350mg,27％)。TLC：5％EtOAc/己烷类(Rf:0.4)1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ8.31-8.16(m,
5H),7.86-7.81(m,1H),7.69-7.63(m,1H),7.59-7.56(m,2H),5.44-5.41(m,1H),3.65-3.49(m,2H),2.36-2.20(m,1H),2.01-1.98(m,3H),1.28(s,9H)。LC-MS:m/z 437.5[M+H]+在4.87保留时间(95.27％纯度)。UPLC纯度：95.51％

[0479] 2-((2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体14).将NaBH4(34.6mg,0.44mmol)分批地添加至冷却至0℃的、13(200mg,0.45mmol)在EtOH(5mL)中的搅拌的溶液并且搅拌持续1小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后；反应用水(15mL)稀释并且用EtOAc(2×15mL)萃取。合并的有机萃取物用水(15mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩以获得粗的残余物。粗料通过硅胶柱色谱法(20％EtOAc/己烷类)纯化以提供作为灰白色固体的中间体14(170mg,85％)。TLC：30％EtOAc/己烷类(Rf:
0.4)。1H NMR(400MHz,CD3OD)：(外消旋的)δ8.19-8.10(m,5H),7.78-7.75(m,1H),7.56-7.55(m,3H),6.08-5.82(m,1H),4.44-4.43(m,1H),3.60-3.40(m,1H),3.21-3.15(m,1H),2.25-
2.23(m,2H),2.12-2.11(m,2H),1.45(s,9H。LC-MS：(外消旋的)62.59％在4.68保留时间,
36.11％在4.87保留时间；439.5[M+H]+。HPLC纯度:(外消旋的)67.22％在12.53保留时间，
31.72％在13.20保留时间。

[0480] (2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇盐酸盐(S16).将在乙醚(0.38mL,1.55mmol)中的2M HCl添加至冷却至0℃的、中间体14(170mg,0.38mmol)在MeOH(4mL)中的搅拌的溶液。将反应混合物加温至室温并且搅拌持续16小时(通过TLC监测)。在起始材料的完全消耗之后，挥发物在减压下蒸发并且粗的残余物用乙醚(2×10mL)磨碎以提供作为灰
白色固体的S16(120mg,91％)。TLC:60％EtOAc/己烷类(Rf:0.2)1H NMR(400MHz,CD3OD):(外消旋的)δ8.64-8.58(m,1H),8.55(s,1H),8.46(d,J＝8.8Hz,1H),8.23-8.16(m,3H),8.08-
8.02(m,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,2H),6.22-6.21(m,1H),6.03-6.02(m,1H),4.22-4.20(m,
1H),4.05-4.04(m,1H),3.43-3.39(m,1H),3.26-3.20(m,1H),2.33-2.11(m,3H),1.95-1.93(m,1H),1.60-1.5(m,1H)。LC-MS：(外消旋的)56.61％在3.84保留时间，42.80％在3.98保留时间；339.2(M+1)；(柱；X-Bridge C-18(50×3.0mm,3.5μm)；5mM NH4OAc:ACN；0.80ml/分钟)；UPLC(纯度)：(外消旋的)65.82％在1.87保留时间，32.19％在1.93保留时间。

[0481] 实施例6.S9的合成

[0482]

[0483] a反应条件：(a)i)iPrMgCl-LiCl,THF；ii)2-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯,58％；(b)TFA,DCM,99％；(c)(4-(((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)甲基)苯基)硼酸,Pd(PPh3)4,Cs2CO3,二氧六环,37％。

[0484] 2-((2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体24).将2,4-二溴喹啉(500mg,1.74mmol)溶解在干燥的THF(6mL)中。在室温下缓慢地逐滴地添加i-PrMgCl
LiCl(1.47mL,1.3M,1.9mmol)，随后是N-boc哌啶-2-甲醛(483.1mg,2.27mmol)的添加。混合物搅拌持续4小时，通过LC-MS分析来检查镁试剂的消耗。在反应完成之后，添加饱和NH4Cl溶液并且混合物用EtOAc萃取三次。蒸发溶剂并且产物通过快速柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/
4)纯化并且在庚烷中磨碎以产生作为白色固体的中间体24(474mg,58％)。1H NMR(CDCl3,
400MHz):δ8.22(dd,J＝8.5,0.9Hz,1H),7.97(dd,J＝8.6,0.8Hz,1H),7.62-7.73(m,2H),
7.55(ddd,J＝8.3,6.9,1.4Hz,1H),5.66(t,J＝4.5Hz,1H),4.31(q,J＝5.1Hz,1H),3.83(d,J＝13.1Hz,1H),3.71(br.s.,1H),3.19(ddd,J＝14.3,13.1,4.0Hz,1H),1.87-1.98(m,1H),
1.77(tt,J＝9.5,4.5Hz,1H),1.59(tt,J＝8.1,4.0Hz,1H),1.42-1.54(m,2H),1.21-
1.41ppm(m,10H)。

[0485] (2-溴喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇(中间体25).将中间体24(50mg,0.12mmol)溶解在5mL DCM中并且添加100微升的TFA。在5小时之后，反应用饱和的Na2CO3(pH≈11)猝灭并且轻轻倒出有机层。水层用DCM萃取3次并且残余物在减压下浓缩以产生作为白色粉末的粗中间体25，粗中间体25在以下步骤中直接使用，而不另外纯化或表征。

[0486] 4-(4-(羟基(哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(S9).烧瓶装载有在1,4-二氧六环(790μL)中的中间体25(38.1mg,0.12mmol)、(4-(((叔丁氧羰基)-(甲基)氨基)甲基)苯基)硼酸(35.6mg,0.13mmol)、Pd(PPh3)4(13.7mg,0.012mmol)。将烧瓶脱气三次。向混合物添加Cs2CO3(77mg,0.24mmol)在H2O(500μL)中的溶液。将烧瓶再次脱气三次。反应混合物在75℃下搅拌持续1小时。在被冷却至室温之后，添加水并且水层用EtOAc萃取三次。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并且在减压下浓缩。粗品通过反相柱色谱法纯化以给出作为白色固体的20.0mg(37％)的S9。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.21(s,1H),
8.13-8.20(m,3H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.66-7.77(m,1H),7.45-7.56(m,1H),7.38
(br.s.,2H),5.48(d,J＝3.3Hz,1H),4.50(br.s.,2H),3.00-3.12(m,2H),2.75-2.98(m,
3H),2.69(td,J＝12.1,2.7Hz,1H),1.45-1.80(m,13H),1.04-1.44ppm(m,3H)。13C NMR
(CDCl3,101MHz):δ156.7,148.9,148.5,148.4,147.4,139.5,138.8,130.7,129.3,127.8,
126.1,125.0,124.7,123.0,116.5,79.8,72.7,61.2,46.9,41.0,28.5,26.1,25.1,
24.3ppm。

[0487] 实施例7.S20的S22的立体选择性合成.

[0488] (S)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-2-羧酸

[0489]

[0490] a)(2S)-2-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]哌啶-1-羧酸叔丁酯：

[0491]

[0492] 将(S)-(L)-N-Boc-哌啶酸(0.5g,2.2mmol)溶解在DMF(2.4ml)中，在22℃下添加二异丙基乙胺(2.2mL,4.4mmol)随后是HATU(1.2g,3.3mmol)。反应混合物搅拌持续5分钟。添加N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(0.3g,3.3mmol)并且在室温下搅拌反应混合物持续1小时。溶液用EtOAc(20mL)稀释并且倾入到1M HCl(20ml)中。有机相被分离并且用饱和的碳酸氢钠水溶液(25mL)和盐水(25mL)洗涤。溶液经MgSO4干燥，过滤并且然后在真空中蒸发。获得的无色的油用在硅胶上的、使用20％的在庚烷中的乙酸乙酯洗脱的色谱法分离。级分被收集，蒸发并且在真空下干燥持续24小时。产生作为无色的油的标题化合物(546mg,92％)。HPLC-MS(API-ES)对于C13H24N2O4[M+H]+的精确质量要求m/z 273.1814，实测m/z 273。

[0493] b)(2S)-2-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯：

[0494]

[0495] 将LiAlH4(在THF中的1M,3.0mL,3.0mmol)分批地添加至(2S)-2-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(525mg,1.93mmol)在四氢呋喃(10mL)中的0℃溶液。然后，反应混合物在室温下搅拌持续30分钟。将反应混合物冷却至0℃并且通过逐滴地添加含水的
5％KHSO4(10mL)小心地猝灭。然后，混合物用EtOAc(2×15mL)萃取。合并有机萃取物，用饱和的含水的NaHCO3和饱和的含水的NaCl洗涤。然后，EtOAc经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。产生作为无色的油的标题化合物(392mg,1.84mmol,95％收率)。HPLC-MS(API-ES)C11H19NO3[M+H]+的精确质量要求m/z 214.1443，实测m/z 214。

[0496] c)(2S)-2-[(R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯和(2S)-2-[(S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯

[0497]

[0498] 将2,4-二溴喹啉(0.45g,1.6mmol)溶解在干燥的四氢呋喃中。在0℃下，缓慢地逐滴地添加i-PrMgCl LiCl复合物在四氢呋喃(1.5mL,1.9mmol)中的1.3M溶液。反应混合物在室温下搅拌持续30分钟。在室温下将在干燥的THF中溶解的醛(2S)-2-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯(vacqmg015)(1.6mmol)添加至反应混合物并且在室温下搅拌持续4小时。(HPLC分析指示至产物的55％转化率，非对映异构的D1/D2比率约1.0:1.3)。在反应完成之后，添加饱和的NH4Cl溶液并且混合物用EtOAc(3x20mL)萃取。有机相被分离并且用盐水(25mL)洗涤。溶液经MgSO4干燥，过滤并且然后在真空中蒸发。(粗品680mg)获得的无色的油用在硅胶上的、使用乙酸乙酯于庚烷中(1:3)洗脱的色谱法分离。收集级分10-17(10mL)并且在真空下干燥以给出作为白色固体的(2S)-2-[(R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(139mg,21％)。HPLC-MS(API-ES)对于C20H26BrN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z 421.1127，实测m/z 421。收集级分20-30(10mL)并且在真空下干燥以给出作为白色固体的(2S)-2-
[(S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(162mg,25％)。HPLC-MS(API-ES)对于C20H26BrN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z 421.1127，实测m/z 421。

[0499] d)(2S)-2-[(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯和(2S)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉--4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯

[0500]

[0501] 在N2下,将(2S)-2-[(R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸酯(139mg,0.33mmol)和硼酸(62mg,0.4mmol)溶解在DMF(1.7mL)中,在氮气氛下添加PdCl2(dppf)
(2.7mg,0.03mmol)和2M K2CO3(0.49mL,1.0mmol)并且反应在90℃下加热过夜。(HPLC-MS指示99％转化率)。通过硅胶快速柱色谱法(EtOAc:庚烷1:3)纯化并且在真空下干燥。2(S)-[2-(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯。(111mg,74％)作为白色固体。HPLC-MS(API-ES)对于C26H29ClN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z453.1945，实测m/z
453。

[0502] 使用相同的程序，从(2S)-2-[(S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸酯开始产生(2S)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯。产生的(2S)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(65mg,37％)
作为白色固体。HPLC-MS(API-ES)对于C26H29ClN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z 453.1945，实测m/z 453。

[0503] e)(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇(S20)和(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇(S22)

[0504]

[0505] 将(2S)-2-[(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(109mg,0.24mmol)溶解在MeOH(1mL)中并且冷却至0℃。添加在Et2O中的HCl 1M(1.45mL,
1.45mmol)并且允许溶液加温至室温过夜。过滤形成的沉淀并且在真空下干燥，给出粗产物(具有HPLC纯度85％的68mg)。将粗料溶解在乙腈(2mL)和氨水25％(1mL)中并且通过制备型HPLC(MeCN:NH3/NH4HCO3(50mM)5％至35％)纯化。收集级分并且在真空下干燥，给出作为白色固体的S20(42.5mg,50％收率)。HPLC-MS(API-ES)对于C21H21ClN2O[M+H]+的精确质量要求m/z 353.1421，实测m/z 353。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.19(d,J＝8.21Hz,1H),8.16(d,J＝8.53Hz,2H),8.10(s,1H),7.94(d,J＝8.53Hz,1H),7.66-7.77(m,1H),7.51-7.56(m,1H),
7.49(d,J＝8.53Hz,2H),5.45(d,J＝3.47Hz,1H),3.06-3.21(m,2H),2.74(dt,J＝2.69,
11.93Hz,1H),1.72(d,J＝12.64Hz,1H),1.57(d,J＝13.27Hz,1H),1.29-1.46(m,2H),1.06-
1.22(m,2H)13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ155.7,148.3,147.2,138.1,135.5,130.6,129.3,
128.9,128.9,126.3,124.7,122.7,116.0,72.5,59.9,46.9,26.0,25.0,23.9

[0506] 使用相同的程序，从(2S)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯开始产生(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2S)哌啶-2-基甲醇(S22)。将粗料溶解在乙腈(2mL)和氨水25％(1ml)中并且通过制备型HPLC(MeCN:NH3/NH4HCO3(50mM)5％至
35％)纯化。收集级分并且在真空下干燥，给出作为白色固体的S22(28.5mg,54％收率)。
+ 1
HPLC-MS(API-ES)对于C21H21ClN2O[M+H]的精确质量要求m/z 353.1421，实测m/z 353。H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.18-8.22(m,1H),8.14-8.18(m,2H),8.02(s,1H),7.95(dd,J＝
0.63,8.53Hz,1H),7.74(ddd,J＝1.26,7.03,8.45Hz,1H),7.55(ddd,J＝1.42,6.95,
8.37Hz,1H),7.48-7.52(m,2H),5.26(d,J＝4.42Hz,1H),3.08(d,J＝12.00Hz,1H),2.90-
2.98(m,1H),2.56(dt,J＝2.69,11.77Hz,1H),1.76-1.85(m,1H),1.50-1.64(m,3H),1.42
(td,J＝3.67,12.24Hz,1H),1.21-1.35(m,1H)。13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ155.6,149.0,
148.4,137.9,135.6,130.6,129.5,129.0,128.8,126.4,125.0,122.9,115.7,72.5,61.0,
46.2,29.4,25.9,24.2

[0507] 实施例8.S21的S23的立体选择性合成.

[0508] (R)-1-(叔丁氧羰基)哌啶-2-羧酸

[0509]

[0510] a)(2R)-2-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]哌啶-1-羧酸叔丁酯：

[0511]

[0512] 将(R)-(D)-N-Boc-哌啶酸(0.5g,2.2mmol)溶解在DMF(2.4ml)中，在22℃下添加二异丙基乙胺(2.2mL,4.4mmol)随后是HATU(1.2g,3.3mmol)。反应混合物搅拌持续5分钟。添加N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(0.3g,3.3mmol)并且在室温下搅拌反应混合物持续1小时。溶液用EtOAc(20mL)稀释并且倾入到1M HCl(20ml)中。有机相被分离并且用饱和的碳酸氢钠水溶液(25ml)和盐水(25ml)洗涤。溶液经MgSO4干燥，过滤并且然后在真空中蒸发。获得的无色的油用在硅胶上的、使用20％的在庚烷中的乙酸乙酯洗脱的色谱法分离。级分被收集，蒸发并且在真空下干燥持续24小时。产生作为无色的油的标题化合物(546mg,92％)。HPLC-MS(API-ES)对于C13H24N2O4[M+H]+的精确质量要求m/z 273.1814，实测m/z 273。

[0513] b)(2R)-2-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯：

[0514]

[0515] 将LiAlH4(在THF中的1M,2.6mL,2.64mmol)分批地添加至(2R)-2-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(480mg,1.76mmol)在四氢呋喃(10mL)中的0℃溶液。然后，反应混合物在室温下搅拌持续30分钟。将反应混合物冷却至0℃并且通过逐滴地添加含水的5％KHSO4(10mL)小心地猝灭。然后混合物用EtOAc(2×15mL)萃取。合并有机萃取物，用饱和的含水的NaHCO3和饱和的含水的NaCl洗涤。然后，EtOAc经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。产生作为无色的油的标题化合物(273mg,73％收率)。

[0516] c)(2R)-2-[(S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯和(2R)-2-[(R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯

[0517]

[0518] 将2,4-二溴喹啉(0.37g,1.28mmol)溶解在干燥的四氢呋喃中。在0℃下，缓慢地逐滴地添加i-PrMgCl LiCl复合物在四氢呋喃(1.3mL,1.66mmol)中的1.3M溶液。反应混合物在室温下搅拌持续30分钟。在室温下将在干燥的THF中溶解的(2R)-2-甲酰基哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.27g,1.28mmol)添加至反应混合物并且在室温下搅拌持续4小时。(HPLC分析指示至产物的99％转化率，非对映异构的D3/D4比率约1.0:1.3)。在反应完成之后，添加饱和的NH4Cl溶液并且混合物用EtOAc(3x20mL)萃取。分离有机相并且用盐水(25mL)洗涤。溶液经MgSO4干燥，过滤并且然后在真空中蒸发。(粗品产量680mg)。获得的无色的油用在硅胶上的、使用乙酸乙酯于庚烷中(1:3)洗脱的色谱法分离。收集级分14-22(10mL)并且在真空下干燥以给出作为白色固体的(2R)-2-[(S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁+酯(156mg,29％)。HPLC-MS(API-ES)对于C20H26BrN2O3[M+H]的精确质量要求m/z 421.1127，实测m/z 421。收集级分28-38(10mL)并且在真空下干燥以给出作为白色固体的(2R)-2-
[(R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(150mg,28％)。HPLC-MS(API-ES)对于C20H26BrN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z 421.1127，实测m/z 421。

[0519] d)(2R)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯和(2R)-2-[(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉--4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯

[0520]

[0521] 在N2下,将(2R)-2-[(S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(156mg,0.37mmol)和4-氯苯基硼酸(69mg,0.44mmol)溶解在2-甲基四氢呋喃(1.9mL)中,在氮气氛下添加PdCl2(dppf)(3.0mg,0.04mmol)和2M K2CO3(0.74mL,1.48mmol)并且反应在90℃下加热过夜。(HPLC-MS指示99％转化率)。通过硅胶快速柱色谱法(EtOAc:庚烷1:3)纯化并且在真空下干燥。产生作为白色固体的化合物(2R)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(141mg,84％)。HPLC-MS(API-ES)对于C26H29ClN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z 453.1945，实测m/z 453。

[0522] 使用相同的程序，从(2R)-2-[(R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸酯开始产生(2R)-2-[(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯。通过硅胶快速柱色谱法(EtOAc:庚烷1:3)纯化并且在真空下干燥。产生作为白色固体的(2R)-2-[(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(150mg,93％)。HPLC-MS(API-ES)对于C26H29ClN2O3[M+H]+的精确质量要求m/z 453.1945，实测m/z 453。

[0523] e)(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇(S21)和(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇(S23)

[0524]

[0525] 将(2R)-2-[(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(156mg,0.34mmol)溶解在MeOH(1.7mL)中并且冷却至0℃。添加在Et2O中的HCl 1M(1.7mL,
1.72mmol)并且允许溶液加温至室温过夜。过滤形成的沉淀并且在真空下干燥，给出粗产物(具有HPLC纯度85％的68mg)。将粗料溶解在乙腈(2mL)和氨水25％(1mL)中并且通过制备型HPLC(MeCN:NH3/NH4HCO3(50mM)5％至35％)纯化。收集级分并且在真空下干燥,给出作为白色固体的(S)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2R)-哌啶-2-基甲醇(S21)(82mg,67％收率)。
HPLC-MS(API-ES)对于C21H21ClN2O[M+H]+的精确质量要求m/z 353.1421，实测m/z 353。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.19(dd,J＝1.11,8.69Hz,1H),8.13-8.17(m,2H),8.10(s,1H),7.93(dd,J＝0.63,8.53Hz,1H),7.72(ddd,J＝1.26,7.03,8.45Hz,1H),7.50-7.54(m,1H),7.46-
7.50(m,2H),5.44(d,J＝3.47Hz,1H),3.15(td,J＝1.86,11.77Hz,1H),3.10(td,J＝3.00,
11.37Hz,1H),2.73(dt,J＝2.84,12.00Hz,1H),1.67-1.76(m,1H),1.53-1.61(m,1H),1.29-
1.44(m,2H),1.06-1.21(m,2H)。13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ155.7,148.3,147.3,138.1,
135.5,130.6,129.3,128.9,128.9,126.3,124.7,122.7,116.0,72.5,59.9,46.9,26.0,
25.0,23.9

[0526] 使用相同的程序，从(2R)-2-[(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基]哌啶-1-羧酸叔丁酯开始产生(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)](2R)哌啶-2-基甲醇(S23)。将粗料溶解在乙腈(2mL)和氨水25％(1mL)中并且通过制备型HPLC(MeCN:NH3/NH4HCO3(50mM)5％至
35％)纯化。收集级分并且在真空下干燥，给出作为白色固体的标题化合物(55mg,48％收率)。HPLC-MS(API-ES)对于C21H21ClN2O[M+H]+的精确质量要求m/z353.1421，实测m/z 353。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.19(dd,J＝0.95,8.53Hz,1H),8.10-8.16(m,2H),7.99(s,1H),
7.93(dd,J＝0.95,8.53Hz,1H),7.73(ddd,J＝1.26,6.79,8.37Hz,1H),7.50-7.55(m,1H),
7.46-7.50(m,2H),5.23(d,J＝4.74Hz,1H),3.06(d,J＝11.69Hz,1H),2.91(td,J＝5.17,
8.29Hz,1H),2.56(dt,J＝2.84,11.85Hz,1H),1.77(td,J＝1.58,12.95Hz,1H),1.48-1.62
(m,3H),1.34-1.48(m,1H),1.19-1.33(m,1H)。13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ155.6,149.1,
148.4,137.9,135.6,130.6,129.5,129.0,128.8,126.4,125.0,122.9,115.8,72.5,61.1,
46.3,29.3,25.8,24.2

[0527] 本领域技术人员可以找到用于公开的物质的合成的可选的路线。上文呈递的非限制性实施例绝不意图限制本发明的范围。S10、S20、S21、S22以及S23的制备还可以如在实施例7和8中使用N-Boc-2-哌啶基醛，或任选地用本领域技术人员已知的其他保护基团保护被实现。

[0528] 对于本领域技术人员，S10、S20、S21、S22以及S23的制备还可以如在实施例7和8中使用对应的2-哌啶基酯、Weinreb酰胺或其他活化的羧酸衍生物，随后是获得的酮的还原来实现。

[0529] 手性色谱法

[0530] S20、S21、S22以及S23的立体选择性分离还可以使用制备型手性色谱法来实现。不意图限制本发明的范围，在一个实施例中，使用以下一般方法分别纯化多达50mg的S20、S21、S22以及S23：

[0531] 分析系统(非手性法)：LC05

[0532] 柱：Kromasil 100-5SIL,4.6x 250mm

[0533] 流动相A：庚烷+0.1％二乙胺(DEA)，流动相B：乙醇+0.1％DEA

[0534] 等度法(isocratic method)：流动相A/B 80/20+DEA

[0535] 温度：35℃，注射体积：25μL，流量：1mL/分钟，UV：265nm

[0536] 分析系统(手性法)：LC05

[0537] 柱：ChiralPak AD-H,4.6x 250mm,5μm

[0538] 流动相A：庚烷+0.1％DEA，流动相B：乙醇+0.1％DEA

[0539] 等度法：流动相A/B 70/30+DEA

[0540] 温度：35℃，注射体积：5μL，流量：1mL/分钟，UV：265nm

[0541] 分析系统(手性法)：LC05

[0542] 柱：ChiralPak OD-H,4.6x 250mm,5μm

[0543] 流动相A：庚烷+0.1％DEA，流动相B：乙醇+0.1％DEA

[0544] 等度法：流动相A/B 90/10+DEA

[0545] 温度：22℃，注射体积：5μL，流量：1mL/分钟，UV：265nm

[0546] 制备型非手性法(Knauer)：LC07

[0547] 柱：Kromasil Silica 10mm(100A)50x 190mm

[0548] 流动相A：庚烷，流动相B：乙醇+0.2％DEA

[0549] 等度体系：庚烷/乙醇+0.2％DEA 50/50

[0550] 温度：室温，注射体积：0.5-10mL，流量：100mL/分钟，UV：265nm

[0551] 半制备型手性法：LC02半制备型手性法：LC02

[0552] 样品：14S0074och 14S0075 样品：14S0090och 14S0091

[0553] 柱：AD-H,4.6x 250mm,5μm 柱：OD-H,4.6x 250mm,5μm

[0554] 流动相A：庚烷流动相A：庚烷

[0555] 流动相B：乙醇+0.2％DEA 流动相B：乙醇+0.2％DEA

[0556]

[0557] UV：265nmUV：265nm

[0558] 注射体积：1mL 注射体积：0.5mL

[0559] 温度：35℃ 温度：22℃

[0560] S20、S21、S22以及S23的立体选择性分离还可以使用对本领域技术人员已知的手性结晶法来实现。

[0561] 实施例9.

[0562] 5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物的合成一般方法C.

[0563] (R)-2-((S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯和

[0564] (S)-2-((R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体27)的混合物以及(R)-2-((R)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯、

[0565] (S)-2-((S)-(2-溴喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体28)的混合物：

[0566] 将2,4-二溴喹啉(502mg,1.76mmol)溶解在干燥的THF(4.5mL)中。在室温下在N2气*氛下逐滴地添加i-PrMgClLiCl(1.47mL,在THF中1.3M,1.91mmol)，随后添加2-甲酰基哌
啶-1-羧酸叔丁酯(486mg,2.28mmol)的溶液。反应混合物在室温下搅拌持续24小时。添加NH4Cl(饱和水溶液)，并且混合物用EtOAc萃取四次。合并的有机溶液用盐水洗涤两次并且干燥(MgSO4)。溶剂的蒸发给出粗产物(1.02g)，该粗产物通过快速色谱法(EtOAc/异己烷
10:90至30:70的梯度)纯化以给出中间体27和28。

[0567] 中间体27：级分34-60，205mg，28％，白色固体。MS(ESI+)m/z 421[M+H]+。

[0568] 中间体28：级分70-90，212mg，29％，白色固体。MS(ESI+)m/z 421[M+H]+。

[0569] 中间体27和28的相对立体化学分别通过比较在化合物S20-S23的合成中的相同的中间体的相对保留顺序来确定。

[0570] 将中间体27(21mg,0.050mmol)、3-氰基-4-甲基苯基硼酸(10mg,0.062mmol)、Pd(dppf)Cl2*CH2Cl2(2.7mg,0.003mmol)和DIPEA(40μL,0.230mmol)在含水的二氧六环
(0.55mL,10％H2O)中的溶液在80℃下在N2气氛下加热持续15小时。反应混合物用MeCN稀释，过滤并且通过使用碱性条件的制备型反相HPLC纯化。合并纯的级分并且将溶剂在减压下除去，给出(S)-2-((R)-(2-(3-氰基-4-甲基苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯和(R)-2-((S)-(2-(3-氰基-4-甲基苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的混合物(8.5mg)。MS(ESI+)m/z 458[M+H]+。

[0571] 将(S)-2-((R)-(2-(3-氰基-4-甲基苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯和(R)-2-((S)-(2-(3-氰基-4-甲基苯基)喹啉-4-基)(羟基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的混合物(8.5mg)溶解在CH2Cl2(0.5mL)中。添加在Et2O中的1M HCl(1.0mL,1.0mmol)并且反应混合物在室温下搅拌持续24小时。通过蒸发除去溶剂，给出作为HCl盐的5-(4-((R)-羟基((S)-哌啶-2-基)甲基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈和5-(4-((S)-羟基((R)-哌啶-2-基)甲
1
基)喹啉-2-基)-2-甲基苯甲腈的混合物(白色固体，8.2mg，两步内收率42％)。H NMR
(400MHz,甲醇-d4)δppm 8.65(d,J＝7.9Hz,1H)8.50(s,2H)8.44(d,J＝8.5Hz,1H)8.33(d,J＝7.9Hz,1H)8.16-8.26(m,1H)7.99-8.11(m,1H)7.81(d,J＝7.9Hz,1H)6.11(s,1H)3.73(d,J＝11.4Hz,1H)3.47(d,J＝11.1Hz,1H)3.19(t,J＝12.3Hz,1H)2.72(s,3H)1.58-1.97(m,
+ +
4H)1.23-1.49(m,2H)。MS(ESI )m/z 358[M+H]。

[0572] 化合物S25-S29根据在实施例9中说明的一般方法C和表2来制备。

[0573] 表2.化合物S25-S29的合成细节和分析数据。

[0574]

[0575]

[0576] *对于化合物S26的制备，N-tBOC保护的中间体和S26分别通过使用酸性条件的制备型反相HPLC来纯化，给出作为白色固体的S26的三氟乙酸盐。

[0577] 实施例10.Vacquinol-1RS(S20)的立体选择性合成

[0578]

[0579] 根据以下方案，基于León(León,B.等人(2013).Organic Letters,15(6),1234–7)的修改设计Vacquinol-1RS的立体选择性合成。

[0580] 简略地，甲基化的(S)-L-哌啶酸的三苯甲基化提供通过从2,4-二溴喹啉产生的格氏试剂产生适于面选择性加成的手性的哌啶甲醛材料的可能性。然后，单分离的R,S异构体经受合适的4-氯苯基硼酸的Suzuki偶合，这在三苯甲基的伴随的脱保护之后产生期望的(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。

[0581] (2S)-哌啶-2-羧酸甲酯

[0582] 将(S)-(L)-哌啶酸(1.5g,11.61mmol)在N2下添加至甲醇(11.6mL)。将亚硫酰氯(1.69mL,23.23mmol)在-10℃下缓慢地添加至此溶液。允许反应混合物加温至室温并且搅拌持续18小时。将反应混合物蒸发并且与甲苯共蒸发并且在真空下干燥。粗品在下一步中使用。

[0583] (2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-羧酸甲酯.

[0584] 将(2S)-哌啶-2-羧酸甲酯(1.66g,11.59mmol)溶解在CH2Cl2(13mL)中，然后添加Et3N(4.85mL,34.78mmol)。将三苯甲基溴(3.75g,11.59mmol)添加至此溶液，反应混合物在室温下搅拌持续18小时。反应用NH4Cl/28％NH3(6mL,2:1)水解。使溶液在Et2O(20mL)和H2O(20mL)之间分配。分离层并且水层用Et2O(3×30mL)萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。残余物通过快速色谱法(1:2:97,Et3N:EtOAc:庚烷)被纯化成作为白色+
泡沫的标题化合物(2.21g,50％)。HPLC-MS(API-ES)对于C26H27NO2[M+H]的精确质量要求m/z 386.2120，实测m/z。

[0585] [(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇.

[0586] 将THF(10mL)添加至配备有搅拌棒(N2)和冷凝器的烘箱干燥的3颈瓶(100mL)。将LiAlH4(0.47g,12.6mmol)添加至此溶液并且允许搅拌以形成悬浮液。将(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-羧酸甲酯(2.2g,8.42mmol)添加至此悬浮液。允许反应溶液在室温下搅拌持续3小时。(在30分钟后变成稠的悬浮液并且添加10ml THF)。然后，反应混合物用NaOH(1mL,
1M)、和H2O(2mL)谨慎地猝灭。溶液明显地变得更稠并且更难以搅拌。然后添加MgSO4并且用
300mL的二氯甲烷使溶液通过硅藻土的垫。然后，将其在真空中浓缩。残余物通过快速色谱法(1:1:98,Et3N:MeOH:CH2Cl2)被纯化成作为白色泡沫的标题化合物(1.7g,99％)。HPLC-MS(API-ES)对于C25H27NO[M+H]+的精确质量要求m/z358.2170，实测m/z 116[M-Tr+H]+。

[0587] (2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-甲醛.

[0588] 将CH2Cl2(5.7mL)添加至配备有搅拌棒(N2)的烘箱干燥的烧瓶(100mL)并且然后被带至-78℃。将(COCl)2(0.61mL,7.13mmol)缓慢地添加至此溶液。接着，逐滴地添加DMSO(0.84mL,11.9mmol)在CH2Cl2(3.3mL)中的溶液。允许其搅拌持续10分钟并且然后添加[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇(1.7g,4.76mmol)在CH2Cl2(4.28mL)中的溶液。允许悬浮液搅拌持续1.5小时并且然后添加Et3N(2.65mL,19.0mmol)并且允许搅拌持续另外的
1.5小时。然后移除-78℃浴并且添加NH4Cl/28％NH3(20mL,2:1)并且使溶液在CH2Cl2(30mL)和H2O(30mL)之间分配。分离层并且水层用CH2Cl2(3×70mL)萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。通过快速色谱法(1:9:90,Et3N:EtOAc:庚烷)纯化残余物以提供作为白色固体的标题化合物(1.54g,91％)。HPLC-MS(API-ES)对于C25H25NO[M+H]+的精确+
质量要求m/z 355.1936，实测m/z 114[M-Tr+H]。

[0589] (S)-(2-溴喹啉-4-基)[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇.

[0590] 将2,4-二溴喹啉(1.61g,5.63mmol)溶解在干燥的四氢呋喃中。在0℃下，缓慢地、逐滴地添加i-PrMgCl LiCl复合物在四氢呋喃(6.6mL,8.66mmol)中的1.3M溶液。反应混合物在室温下搅拌持续30分钟。在室温下将在干燥的THF中溶解的(2R)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-甲醛(1.54g,4.33mmol)添加至反应混合物并且在室温下搅拌持续4小时。在反应完成之后，添加NH4Cl(饱和)/NH3(28％)溶液并且混合物用DCM(3x 20mL)萃取。分离有机相并且用盐水(25mL)洗涤。溶液经MgSO4干燥，过滤并且然后在真空中蒸发。获得的油用在硅胶上的、使用TEA:乙酸乙酯:庚烷(1:10:90)洗脱的色谱法分离。收集级分并且在真空下干燥，给出作为白色固体的标题化合物(1.188mg,49％)。对于C34H32BrN2O[M+H]+的精确质量要求m/z563.1698，HPLC-MS(API-ES)(ACE C8 10-90％MeCN 1.5分钟(0.1％TFA pH 2)(API-ES)
C15H18ClN2O[M+H]+要求m/z 321.0602，实测m/z 321，(在酸性条件下除去三苯甲基基团)。

[0591] (R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)][(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基]甲醇：在N2下，将(R)-(2-溴喹啉-4-基)[(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基甲醇(613mg,1.1mmol)和4-氯苯基硼酸(180mg,1.1mmol)溶解在2-MeTHF(5.5mL)中,在氮气氛下添加PdCl2(dppf)
(71mg,0.09mmol)和2M K2CO3(2.2mL,4.4mmol)并且反应在90℃下加热过夜。过滤并且在真空下干燥，给出标题化合物(650mg,99％)。HPLC-MS(API-ES)对于C40H35ClN2O[M+H]+的精确质量要求m/z 594.2437，实测m/z 353(在酸性条件下除去三苯甲基基团)。

[0592] (R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇：

[0593] 将(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基)][(2S)-1-(三苯基甲基)哌啶-2-基)甲醇(810mg,1.36mmol)溶解在Et2O(46mL)中，随后添加5M HCl(5,7mL)。在室温下搅拌持续4小时之后。使溶液在Et2O(60mL)和H2O(60mL)之间分配。水层用Et2O(3×50mL)萃取。然后，水层用6M NaOH碱化，并且然后用CH2Cl2(50mL)萃取。CH2Cl2层用MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。通过快速色谱法(Et3N:MeOH:CH2Cl2,1:1:98)产生(264mg,55％)(R)-[2-(4-氯苯基)喹啉-4-基](2S)-哌啶-2-基甲醇。材料通过制备型HPLC(MeCN:TFA 0.1％在H2O中5％至90％)纯化。收集级分并且在真空下浓缩，将pH调整至pH 13并且水相用CH2Cl2 3x 50ml萃取。
CH2Cl2相被Na2SO4干燥并且蒸发，给出作为白色固体的标题化合物(280mg,0.80mmol,60％收率)。HPLC-MS(API-ES)对于C21H21ClN2O[M+H]+的精确质量要求m/z353.1421，实测m/z
353。

[0594] 实施例11.Vacquinol-1立体异构体的药代动力学评估

[0595] 由于Vacquinol-1RS和Vacquinol-1SR相对先前研究的异构体混合物(Vacquinol-1(外消旋的),NSC13316)的优越的体外效力，合意的是通过非隔室分析(non-
compartmental analysis)研究Vacquinol-1的单独的异构体(RS和SR)相对所有四个异构
体(RS/SR/RR/SS,NSC13316)的立体异构体混合物的体内药代动力学参数。

[0596] Vacquinol-1(外消旋的)、Vacquinol-1RS和Vacquinol-1SR的药代动力学在2mg/kg或20mg/kg的Vacquinol-1单次静脉内(i.v.)施用或经口(p.o)施用之后分别在NMRI(SR/RS)小鼠或BALB/c(Vrac)小鼠中确定。在给药(n＝3/时间点)之后，在以下标称的时间点从动物中取得血液样品和脑样品：15分钟、30分钟、和60分钟、以及2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、72小时以及144小时。Vacquinol-1的生物分析定量通过UPLC-MS/MS在血浆样品和脑样品中被分析。

[0597] 通过从复合(平均)概况的非隔室分析(NCA)计算药代动力学。标称的取样时间和剂量水平已经被用于NCA计算。

[0598] 表3.在将2(i.v.)mg/kg或20(p.o.)mg/kg外消旋的Vacquinol-1(Vrac)、Vacquinol-1RS(RS)和Vacquinol-1SR(SR)施用至小鼠之后的总结的药代动力学参数。

[0599]

[0600] 用Vrac、RS和SR给药的所有动物被系统地暴露至测试化合物。血浆浓度和脑浓度是可检测的并且分析直到144小时，除了以2mg/kg i.v.施用的异构体SR是可检测的直到72小时。观察到在i.v.施用和p.o.施用之后两者，相比于SR或Vrac，RS的在脑组织中的C最大是显著更高的。在口服给药之后，RS的相对的脑/血浆暴露比率(AUC最后(脑)/AUC最后(血浆))是1.6，而SR仅是0.9并且Vrac是0.6。C最大暴露比率(C最大(脑)/C最大(血浆)与此发现一致，得到RS是2.2，SR是0.7并且Vrac是0.6。

[0601] 所有给药的化合物的多阶段消除曲线可以在i.v.施用之后被看到，并且在i.v.施用或p.o.施用之后消除半衰期是在52小时和96小时之间。参见，图6A和6B。此数据示出Vacquinol-1RS相对对应的SR异构体或先前描述的立体异构体的混合物(Vacquinol-1,
NSC13316)的优越的脑暴露，同时最小化化合物的系统性暴露。

[0602] 实施例12.与甲氟喹比较

[0603] 使用标准方法评估Vacquinol-1RS(S20)和甲氟喹关于它们针对成胶质细胞瘤细胞(U3013)和人类成纤维细胞的相对细胞毒性。用于细胞死亡的比较的IC95值是IC95
(Vacquinol-1RS)＝8.9μM和IC95(甲氟喹)＝25.2μM。参见，图7A和7B。所述IC96值根据在下文题为“体外癌细胞和CSC活力测定”的部分中描述的方法来确定。

[0604] 实施例13.药理学测定

[0605] 前面提及的化合物S1-S23选择性地调节癌细胞，例如胶质瘤癌症的能力使用本领域已知的测定或通过新颖的体外和体内测定来确定。本文描述的化合物的生物活性根据以下测定被测试。

[0606] 体外表型选择性筛选法

[0607] 为了鉴定容许胶质瘤癌细胞或胶质瘤干细胞(GSC)的靶向治疗的途径，进行表型筛选以鉴定对胶质瘤癌细胞或GSC有活性，而不影响胚胎干细胞或人类成纤维细胞的化合物。附着的GSC培养物从根据Pollard等人(Pollard SM,(2009)Cell Stem Cell,4,568-
580)的多形性成胶质细胞瘤的两种情况(指定为U3013MG和U3047MG)独立地产生并且使用
用于在鬼笔环肽染色之后观察到的表型变化的NIH多样性集II的1364个化合物来筛选、再筛选和确证。在两天之后237个化合物示出作用并且63个化合物示出对GSC的选择性作用。
确证该63个化合物对U3013MG GSC和U3047MG GSC有活性以及对七个其他确定的GSC培养物U3024MG、U3017MG、U3031MG、U3037MG、U3086MG、U3054MG、U3065MG有活性。微阵列分析确定了与以下子类一致的分布：原神经的，U3013MG、U3047MG、U3065MG；间叶细胞的，U3024MG、U3037MG、U3054MG；经典的，U3017MG、U3031MG、U3086MG。通过在U3013MG GSC和人类成纤维细胞中的细胞毒性、凋亡和细胞活力的定量以及通过FACS的细胞周期分析，该63个化合物在恢复测定中被检查。通过在不同浓度下的化合物的两天的温育随后是没有化合物的再两天，进行恢复测定。尽管25个化合物具有可逆的作用并且38个化合物具有永久的作用，然而仅三个化合物(包括S10)在引起急性作用的相同的浓度下具有不可逆的作用。

[0608] 选择性和效力分析

[0609] 为了评估化合物对由GSC以及其他细胞类型组成的混合的培养物的选择性，开发了基于悬滴法的混合的培养程序。用细胞示踪剂红色荧光染料标记U3013MG GSC并且用细胞示踪剂绿色荧光染料标记成纤维细胞用于共培养以评估对在混合的培养物集中的胶质
瘤细胞(成胶质细胞瘤)的选择性作用。细胞在化合物不存在下组织成层。包含在对GSC致命的浓度下的命中(hit)的培养物未能组织并且大部分导致GSC的明显的损失，并且在用化合物温育一天之后对人类成纤维细胞没有作用或有很小作用。为了测量毒性，增加被施用至
10dpf的水的17个前面提及的命中的浓度揭示，尽管六个命中(包括S10)没有发挥斑马鱼发育的任何作用，然而在剩余的命中的存在下，胚胎死亡、腐败或展示卵黄囊肿(yolk
edema)。这些数据表明在其他细胞的存在下，S10选择性地且有效地杀死胶质瘤癌细胞，特别地成胶质细胞瘤癌细胞、或胶质瘤/成胶质细胞瘤癌症干细胞，提供比当前疗法优越的选择性。

[0610] 斑马鱼体内效力测定

[0611] 用于在斑马鱼中的GBM的异种移植模型被开发以测试17个命中预防体内肿瘤形成的能力。将用细胞示踪剂红色标记的三千个U3013MG GSC颅内地注射到48-52hpf幼体的脑室中。将17个命中的每个以鉴定的最低有效体外细胞毒性的浓度施用至卵水(egg water)并且10天后评估肿瘤发展。此测定允许在体内设置中的化合物的迅速评估，诸如化合物对斑马鱼和移植细胞的急性/慢性毒性作用、移植细胞增殖和细胞到脑实质中的迁移、到斑马鱼组织中的化合物渗透的特征全部平行地被评估。这些特征使得此异种移植模型是强有力的工具并且降低可以在啮齿动物中进行评估的化合物的数目。进行此试验的容易性和迅速性还指示使用此测定作为用于鉴定抗脑肿瘤活性的化合物的强有力的筛选工具的可能性。
在此测定中，S10明显地降低肿瘤大小。基于这些分析，进一步的研究集中于化合物S10，由于S10的喹啉-醇骨架(scaffold)，我们将其命名为Vacquinol-1。S10处理的GSC展示高的细胞毒性，导致如通过ATP消耗测量的活力的完全丧失，并且选择性地靶向在与人类成纤维细胞的混合的共培养物中的GSC。S10不影响ESC、人类成纤维细胞或骨肉瘤细胞，但迅速地降低在S和G2/M细胞周期阶段中的细胞的比例。使用最近建立的、基于在离体成年斑马鱼心脏中的心搏的频谱分析的模型评估心血管毒性。(Kitambi等人(2012)BMC Physiol.12,3)。除了展示心脏毒性的四个命中之外，对于剩余的化合物(包括S10)观察到小的作用或没有作用。此数据表明S10很好地被耐受并且在体内是有效的，在斑马鱼中没有可观察到的心脏毒性并且在体内肿瘤环境中选择性地杀死胶质瘤/成胶质细胞瘤癌细胞或胶质瘤/成胶质细
胞瘤癌症干细胞。

[0612] 体外癌细胞和CSC活力测定

[0613] 实施例S1-S23选择性地诱导在胶质瘤/成胶质细胞瘤癌细胞或胶质瘤/成胶质细胞瘤癌症干细胞中的细胞毒性的能力在使用CellTiterGlo试剂(Promega)的存在下，通过定量在胶质瘤干细胞系U3013中的ATP产生来确定。将细胞暴露至在1nM至50μM范围内的系列稀释液中的化合物持续24小时并且关于阴性对照(dmso，没有细胞死亡)和阳性对照(星形孢菌素，全部细胞死亡)评估活力。通常，被评估的化合物的效力范围(EC50)是在0.5-20μM范围内(表4)。当相比于由替莫唑胺(用于治疗胶质瘤/成胶质细胞瘤的常用的药物)示出的
139μM的50％中位效力浓度(EC50)，使用3000个细胞/cm2在剂量响应测定中在S10的存在下，GSC的活力的评估示出在24小时之后2.36μM的EC50)。S10的EC50在温育的第2天、第3天和第4天保持基本上类似。成纤维细胞在24小时之后的EC50是18.7μM并且在更长的暴露下展示轻微地减弱(在96小时时是23μM)。外消旋的S10的单独的异构体(S21-S23)被评估以便确定单独的异构体的对映异构体选择性的药理学(enantiospecific pharmacology)。同时S20和S21示出相对于S10相等的或提高的效力，异构体S22和S23示出明显地减弱的活性。

[0614] 表4.体外效力(活力)

[0615]

[0616]

[0617] 这些数据说明被评估的化合物S1-S23示出针对胶质瘤/成胶质细胞瘤癌细胞的强有力的细胞毒性作用并且提供相对当前标准治疗(TMZ)的明显的改进。此外，示出的是相比于S,S异构体和R,R异构体(即，分别地S22和S23)，S10的R,S立体异构体和S,R立体异构体(即，分别地S20和S21)示出明显地提高的针对胶质瘤癌细胞的效力。

[0618] 细胞毒性的多参数表型分析

[0619] 凋亡的显著特征是与呼吸链的去耦(decoupling)有关的ATP的迅速的损失。因此，GSC的死亡在凋亡抑制剂Q-VAD的存在下被检查。通过FACS分析用于活的和死亡的细胞的门控(gating)揭示，S10施用(7.5μM，7小时温育)导致死亡的细胞的显著的和明显的增加，与星形孢菌素类似(1μM，7小时温育)。然而，Q-VAD仅适度地救护S10处理的细胞在第3小时和第7小时免于死亡。当相比于媒介物(DMSO)处理的培养物时，对在具有7.5μM或15μM的S10的培养物中是活性的裂解的胱天蛋白酶3的染色不展示任何增加的免疫反应性细胞数，尽管多柔比星(10μM)引起阳性细胞的明显的增多。在以从5-30μM增加的浓度添加S10之后，在第2分钟、第15分钟、第30分钟、第60分钟、第120分钟、第240分钟、第360分钟和第600分钟测量胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7酶活性。不同于在60分钟内引起迅速升高的活性的星形孢菌
素，相对于DMSO对照，S10在任何浓度下或时间点对胱天蛋白酶活性都没有作用。因此，通过S10的ATP的迅速消耗导致我们检查线粒体。在线粒体和内质网中的四甲基若丹明乙酯
(TMRE)的积聚被其膜电位驱动。TMRE并入线粒体中基本上不受S10影响。这些结果示出，S10诱导的GSC死亡通过非凋亡机制发生并且不涉及活性线粒体的破坏。使用以ATP施用作为阳性对照的比率计钙成像，发现胞质钙流量(cytosolic calcium flux)不被S10影响。

[0620] 为了检查死亡是否涉及自噬体的形成，以抗确定的自噬体标志物抗体(微管有关的蛋白轻链3(LC3))进行S10刺激的细胞的免疫荧光染色。S10施用不导致免疫反应性的任何增强并且保持类似于对照细胞，仅具有小的点状结构(punctate structure)。这表明在胶质瘤/成胶质细胞瘤细胞中，自噬细胞活性可能不被S10提高或抑制。关于S10处理的GSC的扫描电子显微镜学揭示细胞的迅速变圆(rounding)和膜内陷的外观在细胞表面膜上弯
曲成类火山口形杯形物，指示类胞吞活性。一致地，以高的放大率的活体细胞成像揭示球形突出物，泡的形成，在将细胞暴露至S10的几秒内出现。采用标准的相差光学器件(phase contrast optics)，活体成像揭示在S10暴露(15μM)的几分钟内，细胞变圆和大量膜褶皱的形成以及通过胞质膜的破裂的细胞的最后死亡，这之前是胞质膜的显著的收缩，随后是不受控制的膨胀，导致其破裂。采用Nomarski(干涉对比)光学器件的活体成像示出细胞内液泡的迅速形成和在3.5μM下的S10之后10分钟内的膜内陷，以及液泡形成的剂量依赖性升高。液泡大小和数目随时间增加并且导致用大的液泡取代细胞质并且最后细胞破裂。这些结果确证由S10诱导的类胞吞活性。

[0621] 使用细胞成像，不同大小的大的液泡被清楚地观察到是透明的，由大胞饮造成的液泡的特性。大胞饮的另一个独特的特征是在膜起皱期间被捕集在胞质膜的伸出物下的流体的大的非选择性内在化(Schmidt等人(2011)EMBO J,30,3647-3661；Watts和Marsh(1992)J Cell Sci,103,1-8)。因此，细胞外相流体示踪剂的迅速并入是大胞饮的特点。在S10的存在下，将荧光黄(LY)添加至培养基导致在20分钟内示踪剂并入大部分或所有细胞内，在液泡内具有示踪剂的外观。LY的内在化在非刺激的GSC中偶尔地被观察到，但相比于S10处理的细胞以非常低的速率。流体相示踪剂还可以进入早期网格蛋白包覆的核内体，同时大胞饮是网格蛋白依赖性过程。大胞饮类型的网格蛋白依赖性胞吞对液泡型H+-ATP酶的特定抑制剂，巴弗洛霉素A1(Baf-A)是敏感的(Bhanot等人(2010)Mol Cancer Res,8,1358-
1374；Kaul等人(2007)Cell Signal,19,1034-1043；Overmeyer等人(2011)Mol Cancer,10,
69)。以100nM的Baf-A对GSC的短期(1小时)温育单独地对LY的吸收没有作用，但完全地废除S10诱导的LY吸收。

[0622] 大胞饮还对由渥曼青霉素扰动PI3K的活性(Lehner等人(2000)Curr Biol,10,839-842)、由dynasore扰动发动蛋白的活性(Gold等人(2010)PloS One,5,e11360)和由细胞松弛素D扰动肌动蛋白的活性是敏感的，其全部完全阻止在GSC中的S10诱导的LY吸收。

[0623] 在7.5μM浓度下暴露至S10持续6小时的GSC上进行的透射电镜(TEM)定量地确证在细胞中诱导大量的液泡化。网格蛋白包覆的核内体在尺寸上是规则的并且被双层膜束缚。在GSC中观察到的大量的液泡是大的，几乎空的并且被单层膜束缚，并且展示不存在胞质包衣，与大胞饮体(macropinosome)一致的特征(Overmeyer等人(2008)Mol Cancer Res,6,
965-977)。由S10诱导的透明的液泡不同于溶酶体、自溶酶体和晚期胞内体，其通常包含电子密集的细胞器残迹或降解的细胞质组分(Dunn(1990)J Cell Biol,110,1935-1945；
Overmeyer等人(2008)Mol Cancer Res,6,965-977)。溶胀的内质网和线粒体以及核膜的弯曲的双层结构偶尔地被观察到，表明液泡的偶尔的异常的膜融合。在即将裂解的细胞中，液泡通常已经膨胀至其中许多细胞质膜被破坏的点。大胞饮体展示在从约0.5-5.0μm的范围内的不同的大小，与通过TEM定量的S10诱导的液泡(7.5μM浓度，6小时)的范围一致。虽然是透明的液泡并且从溶酶体中分离，但大胞饮液泡募集晚期核内体和溶酶体标志物LAMP1
(Overmeyer等人(2008)Mol Cancer Res,6,965-977)。一致地，在刺激6小时之后，S10(7.5μM)导致在GSC中的LAMP1免疫荧光的迅速的和显著的升高，这还偶尔地与膜突出物有关。

[0624] 这些结果共同地提供通过S10引发大量的大胞饮，导致灾难性的液泡化，导致类坏死细胞死亡的证据。

[0625] 用于鉴定有牵连的细胞通路的shRNA筛选

[0626] 使用具有shRNA库的全基因筛选来鉴定用于S10诱导的大胞饮的通路。该方法基于消耗通路中的关键因素将致使GSC折射S10诱导的死亡的理念。覆盖15377个基因的由82500shRNA组成的三种不同的DECIPHER混合的慢病毒shRNA库被用于转导U3013MG GSC，所述慢病毒shRNA库被分成人类模块1(Human Module 1)(与各种信号通路有关的基因)、人类模块2(Human Module 2)(与疾病有关的基因)和人类模块3(Human Module 3)(与细胞表
面、细胞外和DNA结合有关的基因)。四天后，添加14μM S10持续一天，这之后，细胞在标准培养基中被培养持续五个月。其后存活的细胞被分离并且进一步扩增。存活的细胞展示显著地不同的细胞外观并且已经失去其具有突出物的细长的形态并且代替地是小的且圆的。关于GSC活力，获得的耐S10的GSC展示14.3±1.16μM的EC50，与成纤维细胞类似(18.7±0.06μM的EC50)。从耐性的GSC制备的DNA的测序揭示MAP2K4shRNA病毒的存在的显著的富集。用于激活由MAP2K4编码的MKK4的磷酸化的GSC的荧光染色和蛋白印迹分析揭示通过S10的迅速且
显著的激活。磷酸化MKK4在S10暴露的5分钟内升高并且保持在相似的刺激水平下持续至少
26小时。通过五个独立的shRNA废除MAP2K4活性导致S10处理的GSC的EC50活力值的显著的升高。对磷酸化MKK4的免疫染色揭示在S10处理的细胞中的点状的细胞质染色。这些结果鉴定MKK4的激活作为在执行S10诱导的GSC死亡的信号通路中的重要的节点。MKK4其后被确证为用于S10诱导的大胞饮的需要的蛋白质。因此，MAP2K4的敲除之后S10未能诱导液泡化以及LY并入，与用骨肉瘤细胞看到的类似，表明对死亡的抗性与由S10诱导的大胞饮体的有缺陷的形成有关。因此，对大胞饮敏感和在GSC中死亡的显著特征需要MKK4活性。

[0627] SAR分析

[0628] 在标准11点剂量响应测定中测试化合物，该测定通过基于发光的ATP定量测量活力，揭示对于效力重要的关键区域化学特征和立体化学特征(见表1和表2)。

[0629] 实施例14.通过S10减弱体内肿瘤生长和渗入

[0630] 在静脉内施用、腹膜内施用和经口施用之后，血浆暴露和脑暴露的体内药代动力学分析揭示长的半衰期和优越的生物利用度。斑马鱼异种移植成胶质细胞瘤模型被开发用于对S10抑制肿瘤发展的效力的定量分析和用于细胞在宿主脑中的渗入的定量。将荧光标记的U3013MG GSC颅内地注射到48-52hpf斑马鱼幼体的脑室中。在一周内，GSC迅速地扩增并且在脑室中形成肿瘤细胞团并且开始渗入脑中。发展中的肿瘤通过染色人类核抗原被确证是人类源的。GSC嫁接的斑马鱼用应用于水族馆水的S10(15μM)处理持续10天。肿瘤的大小通过面积、荧光水平和渗入的定量来确定，所述定量是通过测量渗入细胞与原始肿瘤团的平均距离。S10治疗的动物示出肿瘤生长的显著的减弱。此外，到脑实质中的细胞迁移被减少，指示对肿瘤渗入的作用。

[0631] S10减弱肿瘤进展的能力接着在用于人类GBM的小鼠模型中被检查。Nod/SCID小鼠接受100 000个U3013M GSC的颅内注射并且允许获得的肿瘤发育持续7天。所有小鼠呈现有渗入到宿主脑中的大的且高度地血管化的肿瘤并且常常展示明显地在脑的解剖期间观察到的大面积的坏死。肿瘤的组织病理学分析示出多形性成胶质细胞瘤的若干特征，包括假栅栏坏死(pseudopalisading necrosis)的面积、有丝分裂细胞和广泛的微血管增殖。肿瘤对于人类神经上皮干细胞蛋白(hNestin)和人类GFAP(hGFAP)是高度免疫反应性的。在细胞被嫁接之后6周，通过渗透性微泵，将S10(15μM,0.5μL/小时)或媒介物(DMSO)施用到原始细胞沉积的位置。在治疗一周之后，收集动物用于组织学分析。虽然在S10施用的开始时是癌症的晚期，但相比于媒介物，通过坏死的脑组织的损失在用S10治疗的动物中显著地且明显地被降低并且肿瘤是不变地较小的。一致地，在S10治疗的动物中肿瘤渗入和hGFAP的面积和hNestin免疫反应性明显地降低。在S10治疗的小鼠中的肿瘤没有用清晰的边界被限制，指示S10在肿瘤团内和在边界附近两者处使肿瘤生长停止并且降低剩余的成胶质细胞瘤细胞的密度。在一周S10施用之后，在肿瘤细胞团中观察到大量的LAMP1染色，并且大部分细胞或所有细胞展示免疫反应性，而接受媒介物的小鼠缺乏LAMP1。这些结果示出S10激活与体外类似的体内通路，此通路的激活对于GBM是选择性的，因为在宿主脑中没有观察到染色，并且S10当被施用以减弱肿瘤生长时具有该能力。

[0632] S10口服和体内腹膜内注射的生物利用度被研究。在静脉内施用、腹膜内施用和经口施用之后，血浆暴露和脑暴露的体内药代动力学生物分析揭示长的半衰期(t1/2＝20小时)和优越的生物利用度(F＝69％)。在第二递送方案中，治疗经口进行(20mg/kg)每天两次持续五天。治疗在GBM的末期开始，即U3013M GSC的嫁接之后六周，并且对从治疗开始的时间的中位存活率和危险比率(Hazard ratio)打分。当相比于在DMSO治疗的动物(在0.2109-0.9557之间的95％CI比率)中的7天(n＝9个动物)时，S10治疗的动物示出12天的中位存活率(n＝9个动物)。两个存活率曲线的比较指示2.293的危险比率，指示在未治疗的组中的死亡率大于S10治疗的组的两倍。

[0633] 这些结果指示S10在体内被良好地耐受，具有有利的药代动力学概况，并且在小鼠异种移植模型中延长预期寿命，即使在GBM的末期。

[0634] 细胞培养

[0635] 采用先前描述的方法学(Sun 2008)，GSC在用N2、B27、EGF、和FGF-2(20ng/ml)补充的无血清培养基中生长。在使用之前，培养板用层粘连蛋白(Sigma)以10ug/ml预涂覆持续3小时并且使用TrypLE Express(Invitrogen)将汇合的细胞分成1:3至1:5。将人类肉骨瘤细胞系和成纤维细胞系在用10％FBS(Invitrogen,USA)补充的DMEM培养基(Invitrogen,USA)中培养，如先前描述的(Bruserud等人(2005)J Cancer Res Clin Oncol,131,377-384；Hovatta等人(2003)Hum Reprod,18,1404-1409)。将R1mESC在用在悬浮液中的N2补充物、
0.4mM 2-巯基乙醇、5mM HEPES(全部来自Invitrogen)、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和1,000U/ml ESGRO(Chemicon)补充的DMEM/F12中培养，如先前描述的(Andang等人(2008)Nature,451,460-464)。细胞用胰蛋白酶化(Tryple ETM Express 1x,Gibco)分离。对于试验，mESC在0.2％明胶涂覆的板上生长。对于原发性小鼠胶质细胞培养，在P0阶段的新生小鼠被采取并且脑组织按照公布的方案被解剖和培养(Tamashiro等人(2012)J Vis Exp,
e3814)。

[0636] 动物保养(Animal Maintenance)和组织收集

[0637] 所有动物工作根据国家指南和当地伦理委员会Stockholms 进行。使野生型C57雄性小鼠和NOD-SCID小鼠(Charles Rivers)宽敞地居住并且试验根据批准的方案进行。输注和固定如先前描述的进行(Deferrari等人(2003)Diabetes Metab Res Rev,19,101-114；Phiel等人(2003)Nature,423,435-439)。将脑从输注的小鼠解剖出并且转移到4％的在PBS中的PFA，在4℃下过夜。将野生型斑马鱼保持在28.5℃下并且在喂养、照料和集蛋的标准条件下。胚胎通过自然交配收集并且根据Kimmel等人(Kimmel等人(1995)Dev Dyn,203,253-310)分级。将胚胎分级为受精后若干小时(hpf)和受精后若干天内
(dpf)，收集的胚胎首先使用0.1％三卡因麻醉，保持在冰上并且在不同的阶段固定在4％多聚甲醛中过夜，然后用包含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲的盐水(PBSTw)洗涤。

[0638] 小分子筛选设置和表型分析

[0639] 使用用于Excel的JChem(ChemAxon)软件于电脑中进行(in silico)分析NCI多样性集II小分子库以鉴定和分组用于生物测试的有关有责任的化学和结构相容性的1364个
小分子。然后，鉴定的子集作为来自NCI/DTP开放的化学库(http://dtp.nci.nih.gov/)的
10mM DMSO储备溶液被获得。对于初级筛选，96孔透明底部的微量滴定板(Corning)在用于在GSC上筛选之前3小时用层粘连蛋白(Sigma)预涂覆，或在用于mESC之前3小时用0.2％明胶(Sigma)涂覆，或在用于成纤维细胞、骨肉瘤或原发性小鼠胶质细胞之前30分钟用无菌
1XPBS(Invitrogen)洗涤一次。在筛选之前，将层粘连蛋白或明胶或PBS从96孔板中除去并且将细胞稀释至在100μl的各自的培养基每孔中10,000个细胞的量。将细胞分散到每个孔并且温育过夜。在板的外部环境的孔不进行筛选并且用作每条道的对照。初级筛选在两个浓度(5μM和30μM)下的GSC(U3013和U3047)、成纤维细胞和mESC上进行。将化合物手动地用移液器移取到每个孔中并且将GSC或成纤维细胞或骨肉瘤或小鼠胶质细胞温育持续24小
时，这之后，使用4％多聚甲醛(PFA)将细胞固定。对于mESC筛选，细胞生长持续4天并且允许形成集落。根据制造商说明书，固定的细胞用PBS洗涤两次并且用在PBS中的鬼笔环肽和
DAPI溶液温育持续30分钟。在温育之后，细胞用PBS洗涤两次并且使用具有CCD照相机的
Zeiss Axiovert倒置显微镜成像。然后，将图像分成三类，正常的(与未治疗的或DMSO治疗的相似)、松散的或融合的(细胞在形状上是更变形虫状的并且形成聚集物)和微小的(具有被破坏的细胞质和/或显著降低的尺寸的死亡细胞)。对代表每一类的选择的孔进行共聚焦成像。对于mESC，在有或没有化合物的4天培养之后、采用上文的设置获得集落的亮视场像(brightfield image)。将mESC的图像分成活的(表型上正常的ESC集落)或死的(是死的或未能形成集落的单个mESC细胞)。从初级筛选，测试的每个分子的作用被存档并且在GSC
(U3013,U3047)之间以及采用mESC和成纤维细胞之间比较以鉴定仅影响GSC的化合物。然
后，将鉴定的化合物暴露至一系列其他GSC系(U3013、U3047、U3024、U3031、U3037、U3086、U3054、U3065)并且将作用存档。

[0640] 对于用大胞饮的各种抑制剂的治疗，首先用抑制剂预温育GSC持续30分钟并且然后添加S10并且温育持续约5小时，这之后，添加荧光黄(LY)并且温育持续20分钟。然后，洗去培养基并且替换新鲜的培养基并且将板进行成像。对具有LY的细胞的百分数进行打分并且用那些数据绘图。

[0641] 多参数测定

[0642] 为了测量GSC/成纤维细胞/mGlia中的细胞活力、细胞毒性和凋亡，细胞采用上文描述的程序在384孔微量滴定板中生长。总计10,000个细胞被分布在每个孔并且在45μl的其各自的生长培养基中温育过夜。然后，将测试化合物转移到孔中至50μl的最终体积并且将板分别地另外温育持续24小时、48小时、72小时或96小时。根据制造商的说明书，使用发光细胞活力测定(Promega)、CytoTox-Glo细胞毒性测定和胱天蛋白酶-Glo 9测定测量细胞活力、细胞毒性和凋亡。为了测量胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的时间依赖性释放，准备96孔PP微量滴定化合物板(NUNC)以给出20μl/孔的在每排的柱1-11中的
100％DMSO中的从3mM-500μM的化合物的连续的11个点剂量响应稀释液。阴性对照(100％DMSO)和阳性对照(1mM的在DMSO中的星形孢菌素)分别被放置在柱12的排1-4和5-8中。使用FlexDrop(Perkin Elmer)用180μl的生长培养基/孔稀释板，并且在增加的时间点(5分钟、
15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、240分钟、360分钟、600分钟)以一式四份地将5μl的获得的化合物溶液转移至具有在45μl培养基每孔中生长至70％汇合率(confluency)的GSC的
384孔黑色透明底部的微量滴定板，如上文描述的，使用具有96孔移液头的CyBiWell(CyBio系统)，随后是温育。在最后一次的化合物添加之后，将板从温育器中移出，并且根据制造商的建议，将新鲜地制备的胱天蛋白酶Glo(Promega)试剂添加至板的每个孔。使用Victor3FA(Perkin Elmer)微量滴定板读数器测量发光并且使用GraphPad Prism(v6.02)软件相对于对照定量所释放的胱天蛋白酶3/7的水平。

[0643] 为了确定GSC活力的化合物剂量响应抑制作用和确定液泡化的诱导，如上文描述的，准备96孔PP(NUNC)化合物板，产生在柱1-11(10μl/孔)中的100％DMSO中的从10mM至
0.17μM的每个化合物的系列稀释液。阴性对照(100％DMSO)和阳性对照(10mM的在100％
DMSO中的S10)分别被放置在柱12的排1-4和5-8中。孔用190μl的对应的生长培养基稀释，并且5μl的每个孔的化合物溶液一式四份地转移至包含在45μl生长培养基中的在70％汇合率下的GSC的无菌384孔黑色透明底部的板(BD Falcon)的孔。将板温育持续24小时，这之后，将板从温育器中移出并且使用Operetta成像系统(PerkinElmer)在37℃和5％CO2下在亮视场中使每个孔成像以确定在每个浓度下的液泡积聚。然后，允许板冷却至室温并且每个孔用25μl新鲜的CellTiterGlo(Promega)试剂处理。将板振摇持续15分钟并且使用Victor3(Perkin Elmer)微量滴定板读数器测量发光。总发光相对于对照被归一化，并且使用
GraphPad Prism(v6.02)软件进行曲线拟合。

[0644] 为了进行混合的培养物测定，在使用之前一小时，按照每个制造商的说明书，用细胞示踪剂红色(Invitrogen)或细胞示踪剂绿色(Invitrogen)分别地标记细胞。然后，标记的细胞用PBS洗涤两次并且重悬在其各自的培养基中。将总计2000个细胞(1000个标记为红色且1000个标记为绿色)用移液器移取至在陪替氏培养皿的盖上测量最终体积为50μl的培养基(有或没有化合物)的一滴上。然后，将盖小心地翻转至包含20ml的PBS的10cm陪替氏培养皿上。将板温育过夜，这之后，使用50μl的8％PFA固定细胞以制得4％PFA的最终浓度。将固定的细胞立即转移到玻璃底的陪替氏培养皿(Corning)中并且立即进行共聚焦成像。

[0645] 为了进行稀释和恢复测定，将GSC分离并且分布到关于筛选的96孔板中。添加从初级筛选产生表型的化合物并且将板温育持续两天。记录产生的表型，这之后，将包含化合物的培养基除去，细胞用PBS洗涤两次并且添加没有化合物的新鲜的生长培养基并且将板温育持续2天。其后，将细胞固定并且如上文描述的，用鬼笔环肽和DAPI染色并且记录表型。对于基于FACS的细胞周期概况，GSC生长至70％汇合率并且暴露至DMSO或在指示的浓度下的化合物过夜，随后是分离和在1ml的PBS中重悬。然后，将细胞在75％乙醇中固定过夜并且在PBS中再水化，这之后，如早期描述的(Andang等人(2008)Nature,451,460-464)，进行碘化丙啶(PI)(Roche)染色。使用CellQuest Pro软件在FACScan设备上进行流式细胞法并且用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR,USA)分析。凋亡和死亡的GSC的百分数通过用Annexin V和碘化丙啶(PI)(Roche)双重染色来定量并且通过流式细胞法获得数据。GSC用DMSO、S10和星形孢菌素处理并且在处理之后胰蛋白酶化，然后悬浮在100μl温育缓冲剂、2μl Annexin V和2μl PI中，并且在室温下保持在暗处持续10分钟。细胞在一小时内通过流式细胞法被分析。使用CellQuest Pro软件在FACScan设备上进行流式细胞法并且用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR,USA)分析。

[0646] 通过用Fura-2/AM(Molecular Probes,Leiden,The Netherlands)加载细胞进行比率计钙成像(ratiometric calcium imaging)和定量并且根据(Usoskin等人(2010)
PNAS,107,16336-16341)进行Ca2+成像，除了最终Fura-2/AM浓度是1μM并且试验在Kerbs缓冲剂中在37℃下运行之外。计算DR/Ro＝(R-Ro)/Ro以测量细胞响应，其中R是F340/F380比率并且Ro是在每个刺激开始之前的基线比率(刺激之前的三个数据点的平均值)。Ca2+采集速率在刺激期间是在0.1-0.2Hz和1Hz之间。化合物以对GSC是致死的最小浓度被手动地应用。因此，化合物以4-5分钟间隔被应用持续1-2分钟。在每个板上测试四个至五个化合物，随后是ATP刺激，作为在每个试验结束时的阳性对照。当响应于给定的刺激时，如果在刺激过程期间最大响应DR最大/Ro超过0.2，则细胞被计数。通常，在一个显微镜场内记录100个至150个细胞。

[0647] 通过用荧光黄(Invitrogen,1mg/ml在PBS中)温育持续20分钟、用PBS两次洗涤并且成像，在用化合物处理持续6小时的细胞中监测细胞外流体吸收。可选择地，在化合物添加之前15分钟添加荧光黄并且在洗涤和成像之前在化合物的存在下，细胞温育持续4-6小时。使用共聚焦显微镜、倒置荧光显微镜或Operetta(PerkinElmer)细胞成像系统获得图像。为了使在细胞中的活性的线粒体和内质网可视化，根据由制造商供应的指导，分别使用TMRE染色(Invitrogen)(用于使活性的线粒体膜电位可视化)和ER示踪剂(Invitrogen)。

[0648] 体内和离体毒性测试

[0649] 使用斑马鱼模型评估来自筛选的高级的命中(advanced hit)的发育毒性和心脏毒性。对于发育毒性试验，将在一细胞期的斑马鱼胚胎分布到96孔板中(在200μl的卵水中3个胚胎每孔)并且暴露至作为对照的DMSO或各种浓度的化合物。卵水(有或没有化合物)每6小时被替换并且允许胚胎生长持续三天。每天监测胚胎并且在记录表型之前，允许生长持续5天。对于心脏毒性测定，成年心脏的离体培养物根据我们先前公布的程序(Kitambi等人(2012)BMC Physiol.12,3)进行。来自雄性斑马鱼的成年心脏被暴露至化合物并且对心搏的作用被记录并且使用开发的方法分析(Kitambi等人(2012)BMC Physiol.12,3)。

[0650] 切片

[0651] 为了制备冷冻的冷切片，将后固定处理的小鼠脑或斑马鱼胚胎转移至在PBS中的30％蔗糖中并且在4℃下温育持续2天，这之后，蔗糖溶液用低温冷冻的培养基替换并且在4℃下温育持续1天。然后，将在低温冷冻的培养基中的组织冷冻成块并且在恒冷箱上以14μm切片。在预涂覆的玻璃载片上收集切片，如早期描述的(Hewitson等人(2010)Methods Mol Biol,611,3-18；Kitambi和Hauptmann(2007)Gene Expr Patterns,7,521-528)。对于石蜡切片，使用别处描述的标准方案(Hewitson等人(2010)Methods Mol Biol,611,3-18)固定分离的脑并且加工用于石蜡包埋。使用显微镜用薄片切片机(Ultracut E,Reichert Jung)制备六μm薄的切片。对于塑料切片的制备，如先前描述的(Kitambi和Malicki(2008)Dev Dyn,237,3870-3881)，将斑马鱼胚胎固定在4％PFA中，在乙醇的50％、75％、85％、和95％的水溶液中各脱水15分钟，并且包埋在JB4树脂(Polysciences,Inc)中。使用显微镜用薄片切片机(Ultracut E,Reichert Jung)制备5μm厚的切片并且用固定在显微镜(Axioscope,
Zeiss)上数字照相机(Axiocam,Zeiss)进行拍照。使用Photoshop软件加工图像。

[0652] 组织学

[0653] 对于苏木精染色和曙红染色，将石蜡切片的小鼠脑简单地在二甲苯中脱石蜡并且在乙醇梯度直到水中水合，并且使用迈耶苏木精(Meyer’s hematoxylin)(细胞质)和曙红(用于核)染色，然后在乙醇梯度中脱水并且在二甲苯中清洗。Permount被用于安装，如在别处描述的(Fischer等人(2008)CSH Protoc,4986)。加工斑马鱼JB4塑料切片并且使用先前描述的方案(Kitambi和Malicki(2008)Dev Dyn,237,3870-3881)进行染色。用显微镜安装的数字照相机(Axioscope,Zeiss)对染色的切片拍照。使用Photoshop(Adobe)软件加工图像。

[0654] 免疫染色

[0655] 将具有冷切片的小鼠或斑马鱼脑的预涂覆的玻璃载片解冻至室温并且用PBS简单地洗涤以除去低温冷冻的培养基。然后，小鼠脑切片被加工用于二氨基联苯胺(DAB)免疫组织化学染色或免疫荧光染色并且斑马鱼切片进行免疫荧光染色。DAB免疫染色程序如先前描述的(Toledo和Inestrosa(2010)Mol Psychiatry,15,272-285)进行。整个试验，免疫试剂的洗涤和稀释使用具有0.2％曲通X-100(Triton X-100)的0.01M PBS(PBS-T)进行。内源性过氧化酶活性的猝灭用0.5％H2O2处理持续30分钟，随后是用10％的在PBS-T中的正常的驴血清在室温下温育持续1小时以避免非特异性结合来实现。将一级抗体人类GFAP(1:500稀释，Millipore)或人类神经上皮干细胞蛋白(1:1000稀释，Millipore)在4℃下温育过夜。
使用生物素化的二级抗体(Vector Labs)进行检测，并且使用ABC扩增(ABC试剂盒Vector Labs)用0.6％二氨基联苯胺和0.01％H2O2开发。在免疫染色之后，所有的切片被安装在
superfrost玻璃载片上、空气干燥、脱水并且用安装的培养基D.P.X.(Sigma)覆盖。对于免疫荧光染色，在盖玻片上生长的切片或GSC用PBS-T简单地洗涤并且在10％正常的驴血清中封闭持续30分钟(封闭溶液)。封闭之后，如先前描述的(Marmigere等人，2006)，一级抗体溶液由在封闭溶液中的抗LC-3抗体(1:500稀释，Nanotools)或抗LAMP1抗体(1:500稀释，
abcam)或抗磷酸化(S257/Thr261)-SEK1/MKK4(R&D Systems)或人类神经上皮干细胞蛋白
(1:1000稀释，Millipore)或抗人类核抗原抗体(1:500稀释，Chemicon)或抗激活的裂解的胱天蛋白酶3抗体(Asp175)(1:100稀释，Cell Signaling Technology(细胞信号转导技
术))组成，这之后，样品用荧光团缀合的二级抗体(Alexa,Molecular Probes)温育并且用免疫荧光安装的培养基(Dako)安装。

[0656] 细胞提取物和免疫印迹

[0657] 在SDS缓冲剂(25mM三(羟甲基)氨基甲烷-HCl、pH 7.5、1mM EDTA、蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、和磷酸酶抑制剂[2mM原矾酸钠、20mMβ-甘油酸磷酸盐]、和1％SDS)中制备全细胞提取物。如先前描述的(Aranda等人(2008)Mol Cell Biol,28,5899-5911)通过蛋白印迹用以下抗体：抗组蛋白H3(Abcam)、抗三甲基(antitrimethyl)(Lys27)-组蛋白H3(Millipore)和抗磷酸化(S257/Thr261)-SEK1/MKK4(R&D Systems)来分析样品。

[0658] 于电脑中进行的ADME预测

[0659] 在瑞典乌普拉萨大学药学系(Department of Pharmacy,Uppsala University,Sweden)使用由UDOPP开发的计算机模型进行类药性、固有的水溶性、和被动的Caco2膜渗透性和口服吸收的预测。模型基于药物和类药分子的小心地维护的数据集。用于训练模型的溶解度和渗透性数据使用已经在过去二十年期间在UDOPP被开发、优化和验证的高度受控制的测定来测量。

[0660] 活体成像

[0661] 细胞的活体成像使用Operetta高含量成像系统(PerkinElmer)以指示的放大率使用被保持在5％CO2和37℃下的活细胞室在黑色的、透明底部的384孔TC CellCarrier板
(PerkinElmer)中进行。使用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院
(U.S.National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA)的Rasband,W.S.,
ImageJ,http://imagej.nih.gov/ij/,1997-2012)加工图像和影像。

[0662] 扫描电子显微镜学

[0663] 使生长至75％汇合率的GSC胰蛋白酶化并且重悬在1ml的包含DMSO或7.5μM S10的生长培养基中。将细胞暴露至DMSO或7.5μM S10持续6小时。允许重悬的细胞直接滴在聚碳酸酯过滤器(Nuclepore,Inc.,Pleasanton,CA,USA)的表面上。聚碳酸酯过滤器专门地由GP Plastic AB(Gislaved,Sweden)制备并且由Sempore AB(Stockholm,Sweden)供应。过滤器适于设计有流道的密闭装置，当从下面应用真空吸力时所述流道允许细胞流至过滤器的中心。当在约两分钟的真空吸力之后，细胞培养基被完全除去时，其随后用离子化的金在JEOL JFC-1200精细涂覆机(JEOL Tokyo,Japan)中被涂覆持续两分钟至的厚度。使用SEM显微镜(荷兰埃因霍温Philips Electronic Instruments的Philips高分辨率SEM 515)检查
具有1cm直径的每个过滤器的总面积。在该研究中使用的SEM法早期已经检测到CSF中的人类免疫缺陷病毒(Sonnerborg等人(1989)J Infect Dis,159,1037-1041)。

[0664] 透射电镜

[0665] GSC生长至70％汇合率并且暴露至DMSO或7.5μM S10持续6小时。然后，使用在pH 7.4、0.1M磷酸盐缓冲剂中的2.5％(wt/vol)戊二醛在室温下简单地固定细胞持续30分钟，之后从陪替氏培养皿刮下来并且转移到Eppendorf管，用于进一步固定和在4℃下储存。接着，细胞在0.1M磷酸盐缓冲剂中冲洗并且离心。小球在4℃下在0.1M磷酸盐缓冲剂(pH7.4)中的2％(wt/vol)四氧化锇中被后固定处理持续2小时，在乙醇随后是丙酮中脱水，并且嵌入LX-112(Ladd)中。使用Leica EM UC 6超薄切片机(Leica)切割超薄切片(～40–50nm)。切片与乙酸双氧铀，随后是柠檬酸铅对比并且在Tecnai 12Spirit Bio TWIN透射电子显微镜(FEI)中在100kV下检查。使用Veleta照相机(OlympusSoft Imaging Solutions))拍摄数字图像。如先前描述的(Ruzzenente等人(2012)EMBO J,31,443-456)获得电子显微照相的照片。

[0666] shRNA筛选

[0667] 使用早期描述的方案(Pasini等人，2008)，将生长至70％汇合率的GSC通过由人类模块1、2和3组成的DECIPHER混合的慢病毒shRNA库转导。然后，使用嘌呤霉素选择成功地转导的细胞并且用包含作为对照的DMSO或不同浓度的S10的生长培养基替代(replated)。在24小时的暴露之后，包含DMSO或S10的生长培养基用正常的生长培养基替代并且允许细胞生长直到板是汇合的。细胞被洗涤并且收获并且被制备用于基因组DNA提取和条形码扩增(barcode amplification)，如较早描述的(Pasini等人(2008)Gen Dev,22,1345-1355)。然后，在Illumina Hiseq 2000测序器上对扩增的条形码进行测序，这之后进行在此筛选中富集的shRNA命中的统计分析。

[0668] 病毒产生、转导、和药物治疗

[0669] 用于MAP2K4(CLL-H-016251)的shRNA构造从Cellecta获得。将10μg的每个构造与8μg的pCMV-dR8.74psPAX2 包装质粒、4μg的VSV-G信封质粒(envelope plasmid)混合在一起并且使用磷酸钙法(Graham和van der Eb(1973)Virology,52,456-467)将介体(vector)转染到293FT细胞中。转染后24小时和48小时收集慢病毒上清液并且过滤通过0.45μM低蛋白结合过滤器(TPP，目录号99745)以除去碎片和293FT细胞。通过在4000g下在4℃下离心过夜，将病毒上清液浓缩。然后，用包含4μg/mL聚凝胺的培养基(Sigma,目录号H9268)用浓缩的病毒将GSC转导持续48小时，产生约80％转导效率。接着，病毒上清液用新鲜的培养基替换并且保持转导的细胞持续48小时，允许选择的标志物的表达。其后，通过胰蛋白酶化将细胞分离并且使用嘌呤霉素(1.5μg/mL；Life Technologies，目录号A11138-03)选择。在选择之后，收集细胞的一小部分用于qPCR分析以测试敲除效率。将剩余的细胞保持在10cm组织培养板中。将幸免于药物治疗的转导的细胞分到384孔板中，用于液泡形成和ATP合成的分析。

[0670] 斑马鱼异种移植试验

[0671] 采用在斑马鱼书籍(Westerfield(2000)The zebrafish book,第4版,Eugene,University of Oregon Press)中描述的方案，使用三卡因将在2dpf(受精后天数)的斑马鱼幼体麻醉。将麻醉的幼体嵌入在使用幼虫霉菌(KLS)制备的琼脂糖平台上并且填充在卵水中的三卡因以保持胚胎在麻醉下。如上文描述的，用细胞示踪剂红色标记胶质瘤(成胶质细胞瘤)细胞并且每个胚胎注射～3000个细胞。在注射之后，监测胚胎并且将未注射的和部分注射的胚胎除去。允许注射的胚胎在没有亚甲蓝的卵水中恢复持续30分钟并且然后转移到96孔板中。将三个胚胎转移到每个有或没有化合物的、包含200μl的卵水的孔中。将新鲜的卵水(有或没有化合物)每6小时装满持续10天，这之后，如上文描述的，胚胎被麻醉并且固定在4％PFA中。

[0672] S10的体内药代动力学研究

[0673] 在印度海得拉巴的SAI Life Sciences Ltd.进行S10的体内药代动力学研究以确定在雄性BALB/c小鼠中单次静脉内施用、腹膜内施用和口服施用之后，S10的血浆药代动力学和脑分布。从每个小鼠的眼眶后丛(retro-orbital plexus)收集血液样品(约60μL)。在给药后0.08小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时和144小时(静脉内地)；0.08小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时(腹膜内地)以及0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、72小时和144小时(经口)获得血浆和脑样品。血浆通过血液的离心收获并且储存在-70℃下直到分析。在血液收集之后立即从每个小鼠中收集脑样品。使用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pH
7.4)将组织样品(脑)匀浆并且将匀浆物在低于-70℃下储存直到分析。总匀浆物体积是组织重量的三倍！采用LC-MS/MS法将血浆样品和脑样品定量，对于血浆LLOQ＝1.03ng/mL并且对于脑LLOQ＝10.25ng/mL。S10的血浆浓度-时间数据和脑浓度-时间数据被用于药代动力学分析。考虑到总匀浆物体积和脑重量，将脑浓度从ng/mL转化成ng/g(即，稀释因数是3)。
使用Phoenix WinNonlin Enterprise(版本6.3)的NCA模块进行药代动力学分析。

[0674] 小鼠异种移植试验

[0675] GSC用胰蛋白酶被分离，重悬在PBS中并且保持在冰上并且在试验之前和之后，使用台盼蓝检查细胞的活力。小鼠中的手术使用无菌技术进行，使用异氟烷和氧气的混合物将6周龄至8周龄的NOD-SCID小鼠麻醉。如别处描述的(Cetin等人(2006)Nature Prot,1,3166-3173)将小鼠放置在立体定位设备上并且使用微电机无绳手钻(Angthos)，在小鼠额叶之上的颅骨中制成小的钻孔(坐标是嘴至前卤1mm，横向至中间2mm并且2.5mm深)。用在5μl PBS中的100,000个细胞填充的Hamilton微注射器(10μl)被用于在5分钟的时间段内缓慢地将细胞递送到纹状体中。在注射程序之后，将针保持在原位持续5分钟以最小化材料的回流并且然后在5分钟的时间段内被缓慢地移出。然后，在操作之后，用骨蜡填充钻孔。对于大脑内的给药，包含在PBS工作溶液中的15μM S10的Alzet微渗透泵(ALZET M1007D)根据制造商方案被制备。在细胞注射后6周，将渗透泵植入以允许将S10连续递送至肿瘤部位持续多达7天(0.5μL/小时；100μL总体积)。在将小鼠麻醉之后，制作切口以暴露先前被制作用于细胞注射的钻孔，该钻孔被清洁以除去所有骨蜡。将泵插入并且将插管头放置到钻孔中并且用胶粘至合适位置中。对于S10的耐受性和标准化的口服剂量，采用标准的口服灌胃技术用不同剂量的S10(50mg/kg/天、40mg/kg/天、20mg/kg/两次每天、20mg/kg/天)施用于野生型C57雄性小鼠。小鼠被监测重量损失和悲痛的病征。给药方案指示20mg/kg/天被很好地耐受。GSC注射后6周的NODSCID小鼠因此用S10口服给药持续5天。

[0676] 小鼠Kaplan-Meier试验

[0677] 对于Kaplan-Meier试验，如上文描述的，将来自U3013MG的100,000个GSC注射到NOD-SCID小鼠中。然后监测小鼠持续6周，并且然后开始口服施用方案。小鼠通过口服灌胃被给予200μl的水或对应于20mg/kg在水中的S10。总计九个动物被进行每种治疗(对照，S10)。口服施用按照一天一次持续5天，之后施用被停止并且监测动物直到其达到无痛的终点，之后其被处死。

[0678] 等效物

[0679] 本发明可以以其他特定的形式被具体体现，而不背离其精神或本质特性。因此，前述实施方案应被认为在所有方面对本文描述的本发明是说明性的而不是限制性的。本发明的范围因此通过所附的权利要求而不是通过前述描述被指示，并且在权利要求的等效的含义和范围内的所有变化意图被包含在其中。

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