促卵泡素(卵泡刺激素，FSH)和促性腺激素绒毛膜促性腺激素 (CG)、促黄体激素(黄体化激素，LH)以及促甲状腺激素(甲状腺激素 刺激激素，TSH)构成了糖蛋白激素家族。每种激素都是两种共价连接的 亚基(α和β)的异二聚体。在同一物种内，所有激素的α亚基的氨基酸序 列都是相同的，而β亚基的序列是激素特异的(Pierce，J.G.and Parsons，T. F.″Glycoprotein hormones：structure and function.″Ann.Rev.Biochem.50： 465-495(1981))。从鱼到哺乳动物的这些亚基序列都是高度保守的事实说 明这些激素都是由共同的祖先蛋白进化而来的(Fontaine Y-A.and Burzawa-Gerard，E.″Esquisse de l′evolution des hormones gonadotopes et thyreotropes desvertebres.″Gen.Comp.Endocrinol.32：341-347(1977))。
重组促卵泡素已经被用于某些治疗，例如治疗患有不育症的患者 (Lathi and Milki，″Recombinant gonadotropins，″Curr Womens Health Rep. 1(2)：157-63(2001))。激素已经被用于诱导女性排卵，和诱导男性的精子 生成(Bouloux et al.，″Induction of spermatogenesis by recombinant follicle-stimulating hormone(puregon)in hypogonadotropic azoospermic men who failed to respond to human chorionic gonadotropinalone，″J Androl. 24(4)：604-11(2003))，改善被破坏的精子结构(Haidl et al.，″Drug treatment of male fertility disorders，″Asian J Androl.2(2)：81-5(2000))，以及治疗与睾 酮水平降低相关的病变(见美国专利No.5,574,011和6,562,790，在此 通过引用并入本申请)。女性对外源性FSH治疗的应答已经显示出有所不 同，一些女性对标准治疗方案的应答比较差(需要调整FSH剂量)，而其 它女性表现出卵巢过度刺激综合征(Perez et al.，″Ovarian response to follicle-stimulating hormone(FSH)stimulation depends on the FSH receptor genotype，″J Clin Endocrinol Metab.85(9)：3365-9(2000))。需要的是具有增 加活性的FSH的修饰的衍生物，以便有助于治疗应答差者，同时容许用 更低剂量的治疗方案治疗有卵巢过度刺激倾向的患者。

本发明包括修饰的FSH蛋白和编码相同蛋白的核酸，其中与野生型 FSH相比较，显著地提高了修饰的蛋白的体内和体外的生物学活性。具 体地，与野生型FSH相比较，本发明的修饰的类似物令人惊讶地表现出 更强的药物学性能，包括效力(potency)和Vmax(功效(efficacy))。此外， 本发明的修饰的类似物增加了所治疗的动物体内的卵母细胞、胚泡和胚 胎的数量和质量。本发明的类似物因此为大量患有不育症的患者提供了 期待已久的解决方案，所述患者包括在体外受精(IVF)后应答差的女性、 已经不能进行IVF的女性、具有低数目的FSH受体的女性以及FSH突变 导致不育症的女性。
本发明的修饰的FSH分子含有至少一个修饰α亚基，所述亚基含有 至少两种FSH周围环中的突变的组合，这就形成了具有比野生型FSH更 强效力的修饰的FSH或单独包括所指出的突变的修饰蛋白。本发明的修 饰的FSH蛋白通常具有比野生型FSH高约10倍的效力，以及优选的α 亚基突在对应于SEQ ID No.1中的位点13、14、16、17、20、21、22、 66、68、73、74和81的位点上变包括至少两个碱性氨基酸。
本发明的修饰的FSH蛋白还可以包括修饰β亚基，具体地，修饰β亚 基在对应于SEQ ID No.2的位点2、4、14、63、64、67和69中的任一 位点上包括至少一个碱性氨基酸。本发明的修饰的FSH蛋白也可以具有 比野生型FSH更长的血浆半衰期或者比野生型FSH更短的血浆半衰期。 通过聚乙二醇化、通过包含潜在的糖基化位点或通过其它方式都可以促 进血浆半衰期的延长。
本发明也包括辅助对象生殖的方法，包括使用辅助量的本发明的修 饰的FSH，例如在体外受精方案或人工受精方案或其它需要诱导排卵或 精子生成的方案。也包括诊断和治疗女性体内与糖蛋白激素活性相关的 病变的方法，包括但不限于排卵异常、黄体期缺陷、限时怀孕、生长卵 泡中的FSH受体表达低下、FSH受体敏感性低下、FSH受体结合和/或偶 合不足、垂体衰竭或损伤、原因不明的不育症和卵巢癌。本发明的修饰 的FSH蛋白特别适用于治疗有卵巢过度刺激倾向的女性，其中可以在周 期的早期应用具有最长半衰期的类似物，而具有更短半衰期的那些类似 物可以应用于周期的晚期，以便预防或减少卵巢过度刺激综合征(OHHS) 的可能性。也包括诊断和治疗男性体内的与糖蛋白激素活性相关的病变 的方法，这包括但不限于男性因素的不育症、垂体衰竭或损伤、男性型 脱发症、睾丸癌以及任何与睾酮生成水平缺陷相关的病变。
附图说明
图1A-E是显示比较如用瞬时转染的CHO-FSHR细胞所测定到的各 种单一突变在体外对FSH生物学活性的影响(与野生型(WT)相比较) 的图。
图2是显示βE4R突变对转染CHO-FSHR细胞的hFSH生成的影响的 图。
图3A和3B是显示了比较如用瞬时转染的CHO-FSHR细胞所测定到 的各种组合突变在体外对FSH生物学活性的影响的图。
图4A和4B是显示比较大鼠和人LHR对FSH类似物和野生型FSH 的交叉反应性的图。图4A显示了FSH TR-4402和大鼠黄体化激素受体 之间的交叉反应性。图4B显示了FSH TR-4402和人黄体化激素之间没有 交叉反应性。
图5是FSH结构的示意图，显示了α和β亚基中的环。
图6A和6B是显示CHO细胞分别应答于纯化类似物TR-4402对野 生型FSH、纯化的类似物TR4401对野生型FSH的cAMP生成的图。
图7是显示KGN细胞应答于纯化类似物TR-4402对野生型FSH的 cAMP生成的图。
图8是显示GLHR-15细胞应答于纯化类似物TR-4402对野生型FSH 的cAMP生成的图。
图9是显示在体外卵泡生物检测过程中所观察到的在具有野生型 hFSH(化合物#3)和类似物TR-4402(化合物#4)时的卵泡生存时间的 图。
图10是显示在体外卵泡生物检测过程中所观察到的在具有野生型 hFSH(化合物#3)和类似物TR-4402(化合物#4)时的卵泡窦(antrum) 形成的图。
图11A是显示在体外卵泡生物检测过程中所观察到的在具有野生型 hFSH(化合物#3)和类似物TR-4402(化合物#4)时的COC粘液化的图。 图11B是显示在体外卵泡生物检测过程中所观察到的在具有野生型hFSH (化合物#3)和类似物TR-4402(化合物#4)时的hCG刺激后的％卵母细胞 释放的图。
图12是显示在体外卵泡生物检测过程中所观察到的在具有野生型 hFSH(化合物#3)和类似物TR-4402(化合物#4)时的用PB挤压所测定到 的卵母细胞核成熟的图。
图13A和B是显示在体外卵泡生物检测过程中所观察到的在具有野 生型hFSH(化合物#3)(13A)和类似物TR-4402(化合物#4)(13B)时的黄 体酮生成的图。
图14A-D显示了利用不成熟的Sprague-Dawley雌鼠所进行的 Steelman-Pohley生物检测的结果(Steelman and Pohley，1953)。图14A、C 和D中的图显示了与野生型(Follistim)相比较，应答于TR-4402所测定 到的卵巢重量的差异。图14B中的图比较了在生物检测过程中的血清的 TR-4402和野生型FSH水平。
图15是显示了与经类似物TR-4402处理过的鼠相比较，经野生型 FSH (Follistim)处理过的鼠的卵巢内的雌二醇含量的图。
图16是显示用相应剂量的野生型FSH(Follistim)和类似物TR-4402 刺激之后的血清抑制素B水平的图。
图17A和B是显示与野生型FSH相比较的FSH类似物TR-4901、 TR-4401和TR-4402的排出和吸收。
图18显示了用于延长FSH类似物的半衰期的N末端延伸(SEQ ID No.3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12)。
图19是显示与LA1FSH(FSH被修饰以增加FSH的血清半衰期)、 TR-4402和野生型FSH相比较，CHO细胞应答于LA1-4402(TR-4402被 进一步修饰以增加FSH的血清半衰期)的cAMP产生的图。
图20是显示与单独的野生型FSH(Follistim)和hCG相比较，在体 内应答于LA1-4402(TR-4402被进一步修饰以增加FSH的血清半衰期) 增加了所生成的被排卵的卵母细胞数目的图。
图21是显示与野生型FSH(Gonal F)相比较，在体内施用TR 4401 之后增加了所生成的卵母细胞总数的图。
图22是显示与野生型FSH(Gonal F)相比较，在体内施用TR 4401 之后增加了卵母细胞受精率的图。
图23是显示与野生型FSH(Gonal F)相比较，在体内施用TR 4401 之后增加了胚泡形成的图。
图24是显示与野生型FSH(Gonal F)相比较，在体内施用TR 4401 之后增加了胚胎总数的图。

本发明提供了修饰的“超活性的”FSH分子，与野生型FSH相比较， 其显示出令人惊讶的增强的效力。被“修饰的”意思是，虽然所述蛋白 含有不同于野生型FSH的氨基酸序列，但是其序列并没有被改变得以至 于它与另一物种的已知FSH序列相同。用各种参数可以评价“超活性”， 包括效力和功效。“效力(potency)”是用测定半最大应答所确定出的生物 学活性的参数。通过将FSH类似物在基线和最大值(EC50)之间的中间 值的FSH应答值与野生型FSH的FSH应答值进行比较，可以确定出“效 力”的差异。可以用纯化蛋白在体外测定出FSH应答，或者可以在瞬时 转染编码修饰蛋白的核酸之后评估出FSH应答。也可以在体内(即在对 所述FSH类似物有应答的动物体内)测定出FSH应答。这些应答包括任 何FSH与其受体结合后的细胞的或生物学的以及定量的或定性的应答， 即cAMP生成、蛋白质例如孕酮合成、受精率、胚泡形成率、每个受精 卵母细胞的胚胎发育率等。
“功效(efficacy)”(Vmax)或最大应答是另一种生物学活性的参数。 如在此所讨论的，根据所检测细胞株中的受体数目和受体结合力，生物 学活性的参数可以有所不同。在具有低受体数目或结合较差的系统中， Vmax(功效)上的差异更为明显。在受体过度表达的系统中，效力上的差 异更为显著。
可以用对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量在体内测定出定量和 定性的参数例如卵母细胞的数量、受精率和胚泡及胚胎形成率。对于卵 母细胞数目而言的最大有效剂量是对卵母细胞的质量和数量而言为最佳 量的超活性FSH。对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量是依赖于动物 的体重和代谢率。例如，具有较慢代谢率的较大动物的最大有效剂量要 比具有较快代谢率的较小动物的最大有效剂量更大。能经验性地确定出 每只动物的最大有效剂量。
但是，无论所用的系统如何，与野生型FSH比较，本发明的修饰超 活性FSH蛋白的效力至少增加约10倍、更优选地至少约20倍、30倍、 40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或甚至增加约100倍，或者其 最大功效比野生型FSH增加了约10％、更优选地至少20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％、或甚至100％。本发明的超活性类似物也 提供了比野生型FSH高出约5到10倍的效力或增加5％到10％的最大功 效。本发明的一些修饰蛋白证实比野生型具有高出至少约30到50倍的 效力或者高出30％到50％的最大功效。因此，本发明的修饰的FSH蛋白 特别适用于治疗具有低受体数目或受体应答缺陷的患者，因为本发明的 修饰蛋白甚至在低受体数目或弱应答的系统中都保留了至少增加了10倍 的效力或增加了10％的最大功效。
修饰超活性FSH的吸收率可以造成作用持续时间的增加或缩短。具 有吸收率增加以及作用持续时间缩短的修饰的FSH类似物都可以有利于 治疗高刺激综合征高危的超敏患者。用Ka测定吸收率。用Ke测定排出率。
本发明的修饰的FSH分子包括选自人、牛、马、猪、养、小鼠、大 鼠、兔、灵长类动物、鱼等物种的修饰蛋白。在水产养殖中可以使用鱼 FSH(也称作GTH-1)，也就是为了圈养培育濒临灭绝的或其它的鱼类。 其它物种的修饰的FSH可以被用于农业育种，或用于实验室以便测试不 同的组合突变对各种雄性及雌性糖蛋白激素相关性病变的作用。其它物 种的修饰的FSH分子在对应于在此所述的修饰人FSH分子的那些位点的 位点上具有取代，利用任一排列程序可以鉴定出这一点，所述排列程序 包括但不限于DNASIS、ALIONment、SIM和GCG程序例如Gap、BestFit、 FrameAlign和Compare。
本发明的修饰的人FSH分子至少包括一个修饰的α亚基，其中α亚基 至少包括两个碱性氨基酸，例如在对应于野生型人FSHα(SEQ ID No.1) 的位点13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位点上 的碱性氨基酸。修饰的蛋白也可以含有修饰的β亚基，其中β亚基至少包 括一个碱性氨基酸，例如在对应于野生型人FSHβ(SEQ ID No.2)的位点 2、4、14、63、64、67和69的位点上的碱性氨基酸。本发明的修饰蛋白 也可以含有更多的取代，特别是不会改变蛋白的增强了的性能的保守取 代。但是，这些修饰蛋白在除上面所列的那些位点以外的其它位点上所 含有的取代通常不会超过5个，且可以在除上面所列的位点以外的其它 位点上具有与相应的野生型FSHα和β亚基完全相同的氨基酸序列。
碱性氨基酸包括氨基酸赖氨酸、精氨酸、和组氨酸、以及任一作为 这三种氨基酸的修饰物的其它碱性氨基酸、正常在自然界中不能发现的 合成的碱性氨基酸、任一在中性pH值条件下带正电荷的其它氨基酸。其 中，优选的碱性氨基酸选自赖氨酸和精氨酸。
示例的具有两个碱性氨基酸取代的修饰的FSH类似物包括，但不限 于在α亚基的14和66位点上具有取代的蛋白(具体地是E14R和N66R)、 在α亚基的14和73位点上具有取代的蛋白(具体地是E14R和G73R)、 在α亚基的16和20位点上具有取代的蛋白(具体地是P16R和Q20R)、 在α亚基的20和21位点上具有取代的蛋白(具体地是Q20R和P21R)。
本发明的修饰的FSH蛋白也可以具有包括三个碱性氨基酸取代的α 亚基，所述取代位于选自位点13、14、16、17、20、21、22、66、68、 73、74和81中的位点。这些修饰蛋白包括但不限于具有位点16、20和 21(具体地是P16R、Q20R和P21R)、位点14、20和73(具体地是E14R、 Q20R和G73R)、位点66、73和81(具体地是N66K、G73K和A81K)、 位点14、66和73(具体地是E14R、N66R和G73R)、以及位点14、21 和73(具体地是E14R、P21R和G73R)上的组合取代的蛋白。
本发明的修饰的FSH蛋白也可以具有包括四个碱性氨基酸取代的α 亚基，所述取代位于选自位点13、14、16、17、20、21、22、66、68、 73、74和81中的位点。这些修饰蛋白包括但不限于具有位点13、14、 16和20上的组合取代的蛋白，具体地是Q13R、E14R、P16R和Q20R 的组合、以及Q13K、E14K、P16K和Q20K的组合。
本发明的修饰的FSH蛋白也可以具有包括五个碱性氨基酸取代的α 亚基，所述取代位于选自位点13、14、16、17、20、21、22、66、68、 73、74和81中的位点。这些修饰蛋白包括但不限于具有位点14、20、 21、66和73上的组合取代(具体地是E14R、Q20R、P21R、N66R和G73R)、 以及位点14、16、20、66和73上的组合取代(具体地是E14R、P16R、 Q20R、N66R和G73R)的蛋白。
本发明的修饰的FSH蛋白也可以具有包括六个碱性氨基酸取代的α 亚基，所述取代位于选自位点13、14、16、17、20、21、22、66、68、 73、74和81中的位点。这些修饰蛋白包括但不限于具有位点13、14、 16、20、66和73上的组合取代(具体地是Q13K、E14K、P16K、Q20K、 N66K和G73K)、以及位点14、16、20、21、66和73上的组合取代(具 体地是E14R、P16R、Q20R、P21R、N66R和G73R)的蛋白。
本发明的特别有效的修饰β亚基在对应于SEQ ID No.2的位点4的位 点上包括一个碱性氨基酸(更具体地是E4R)。该突变造成了FSH效力和 表达水平的显著增加。本发明者已经发现当与其它在此所述的取代组合 使用时，该突变造成了重组FSH的产生增加了2到3倍。
FSH超激动剂的设计
通过与其它物种比较相关FSH的α和β的氨基酸序列鉴定出其它物种 的FSH蛋白中的基础残基可以设计出本发明所包括的超激动剂。在美国 专利.6,361,992中阐述了这些方法，在此通过引用其全部内容将其并入本 申请。对于所选定的用于比较和取代的物种，要结合考虑不同物种的相 对的FSH的生物学活性。此外，可以用基于相关糖蛋白激素的结构同源 性模型鉴定出表面暴露出的氨基酸残基。
因此，本发明也提供了比同一物种的野生型FSH具有更高效力的修 饰的FSH蛋白，其中修饰的FSH包括碱性氨基酸取代，所述氨基酸取代 位于对应于其它物种的比野生型FSH蛋白具有更高效力的FSH蛋白中的 相同氨基酸位点的位点。被修饰增加其效力的糖蛋白可以来自非人的物 种。例如，可以比较猪FSH和牛FSH，设计出在猪和牛序列有所不同的 位点上具有氨基酸取代的猪FSH蛋白，构建出具有所选变化的猪FSH蛋 白，并给猪动物施用所修饰的猪FSH。同样的，被修饰的FSH可以是牛 FSH。
本发明也提供了具有比同一物种的野生型FSH更高效力的修饰的 FSH，其中修饰的FSH包括碱性氨基酸取代，所述取代位于对应于来自 同一物种的具有比野生型糖蛋白激素更高效力的不同的糖蛋白激素中的 相同氨基酸位点的位点。例如，可以比较人FSH和人绒毛膜促性腺激素 的β亚基，并且可以根据任一序列兼并性对FSHβ亚基进行氨基酸取代。 天然地，仅仅预期了那些普遍增加了修饰的FSH的效力的变化，因为仍 需要保持激素的受体特异性。
为了修饰附加的氨基酸位点，利用标准的计算机软件程序例如 DNASIS(Hitachi Software Engineering Co.Ltd.)或任一上面所列的其它 排列程序(包括但不限于LIONment、SIM和GCG程序例如Gap、BestFit、 FrameAlign和Compare)都可以排列来自人和非人的糖蛋白激素序列。然 后利用上面所提及的技术可以取代在人和非人的糖蛋白激素之间的有所 不同的氨基酸残基，并用其中一种在此所提及的检测法检测所形成的糖 蛋白激素的效力。
本发明也包括具有超激动剂或拮抗剂活性的在此所述的类似物的片 段。例如，可以单独地或联合β链的片段或全长β链使用本发明的修饰α 链的片段生成超激动剂化合物。同样，可以单独地或联合α链的片段或全 长α链使用本发明的修饰β链的片段生成超激动剂化合物。在一些情况中， 本发明的修饰的FSH分子的片段可以被用作拮抗剂，例如在施用治疗性 FSH之后限制其活性的持续时间的拮抗剂。
本发明也包括单链类似物和整合由在此所述的类似物的突变区的嵌 合蛋白。例如，本发明者已经发现在双活性促性腺激素的α亚基内整合超 强的取代可以使得促黄体生成素和促卵泡生成素的活性都增加了3到5 倍，这说明通过组合本发明的取代可以进一步地强化双活性促性腺激素 的内在活性。在美国专利4,237,224中描述了双活性促性腺激素的构建， 在此通过引用其全部内容将其并入本申请。
FSH超激动剂的表征
用多种方法可以确认在此所述的对野生型FSH的修饰作用。例如， 可以测定促经编码修饰的糖蛋白的核酸所转染的细胞中的环AMP (cAMP)的产生，并将其与经编码野生型糖蛋白激素的核酸所转染的相似 细胞中的cAMP的产生进行比较。同样，可以测定出经修饰的糖蛋白所 转染的细胞中的孕酮的产生，并将其与经野生型糖蛋白激素所转染的相 似细胞中的孕酮的产生进行比较。同样的，可以从受体结合检测、胸腺 嘧啶摄取检测或T4分泌检测中确定出修饰的糖蛋白激素的活性。在此所 含的实施例部分中列出了用于确定修饰的糖蛋白激素的活性的这些检测 法的特殊实例。本领域的技术人员可以容易地确定出任一合适的用于确 定野生型或修饰的糖蛋白激素的活性的检测法。
在本发明的一个实施方式中，修饰的糖蛋白激素具有比野生型糖蛋 白激素的效力增加至少约10倍的效力。用上面所提及的以及在此所含的 实施例中所述的任一技术、或者用本领域人员所能容易确定出的任何其 它合适的检测法都可以检测出所增加的效力。所增加的效力在不同检测 法之间或不同细胞株之间并不一定都保持一致，显而易见将会有所不同。 利用表达不同水平的应答性FSH受体的细胞株，本发明的修饰的FSH分 子将具有比野生型高至少约20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、 80倍、90倍或甚至100倍的效力。
在本发明的另一个实施方式中，修饰的糖蛋白激素具有比野生型糖 蛋白计算的最大功效高至少约10％的最大功效。用上面所提及的以及在 此所含的实施例中所述的任一技术、或者用本领域人员所能容易确定出 的任何其它合适的检测法都可以检测出所增加的最大功效。所增加的功 效在不同检测法之间或不同细胞株之间并不一定都保持一致，显而易见 将有所不同。利用表达不同水平的应答性FSH受体的细胞株，本发明的 修饰的FSH分子将具有比野生型高至少约10％、至少20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或100％的最大功效。
在PCT/US99/05908中描述了适用于表征在此所述的类似物的其它 检测法，在此通过引用将其全部内容并入本申请。例如，可以施用各种 免疫检测法，其包括但不限于利用技术例如放射免疫检测法、ELISA、三 明治免疫检测法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检测 法、原位免疫检测法、Western印迹法、沉淀反应法、凝集检测法、补体 固定检测法、免疫荧光检测法、蛋白A检测法和免疫电泳检测法等竞争 性和非竞争性检测系统。
用体外和体内检测法都可以检测出卵母细胞的质量和数量上的提 高。常见的是，利用体外受精过程中的不同终点例如卵母细胞形成、卵 母细胞受精、和胚泡形成确定出卵母细胞的数量和质量上的提高。体外 受精试验可以按照“超排卵方案”，其中用本发明的超活性FSH类似物处 理对象，造成多个卵母细胞的释放和成熟。在体外受精试验中，可以与 hCG一起施用FSH(超活性FSH和重组野生型FSH)以便引发排卵。可 以使用对照动物，其仅仅接受hCG或孕马血清促性腺激素(PMSG)。
通过增加动物体内的受精率可以提高卵母细胞的质量。通过比较用 超活性FSH所获得的受精率和用相同数量的重组野生型FSH所获得的受 精率可以在体内或体外确定出超活性卵泡刺激素的受精率。也可以使用 接受hCG的对照动物。
通过每一卵母细胞总数所发育出的双细胞胚胎可以测定出受精率。 如果受精发生在体外，可以在受精皿中计数双细胞胚胎。在小鼠中，在 受精后近24个小时后发育出双细胞胚胎。
根据所施用的超活性FSH的量，受精率可以有所不同。动物可以接 受多剂量的超活性FSH。以对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量施用 超活性FSH造成了受精率增加了至少约10％。以对于卵母细胞数目而言 的最大有效剂量施用超活性FSH造成了受精率增加至少约20％、优选地 至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
超活性卵泡刺激素通过提高每个受精卵母细胞的胚泡形成率可以提 高卵母细胞的质量。通过确定出形成胚泡的双细胞胚胎的百分比可以测 定出胚泡形成率。无论在体内或体外形成胚泡，都增加了胚泡形成率。 胚泡形成率依赖于所施用的超活性卵泡刺激素的量。以对于卵母细胞数 目而言的最大有效剂量施用超活性卵泡刺激素造成了胚泡形成率增加了 至少约10％。以对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量施用超活性FSH 造成了胚泡形成率增加至少约20％、优选地至少30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％或100％。
超活性卵泡刺激素通过提高每个受精卵母细胞的胚胎总数可以提高 卵母细胞的质量。无论体内或体外发生受精，都增加了每个受精卵母细 胞的胚胎总数。每个受精卵母细胞的胚胎总数的增加依赖于所施用的超 活性卵泡刺激素的量。以对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量施用超 活性卵泡刺激素造成了每个受精卵母细胞的胚胎总数增加了至少约 10％。以对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量施用超活性FSH造成了 每个受精卵母细胞的胚胎总数增加至少约20％、优选地至少30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或100％。
可以用超活性FSH提高动物的卵母细胞的质量和数量，所述动物包 括但不限于人、小鼠、大鼠、灵长类动物、兔、猪、马、羊、和狗。优 选地，所施用的超活性FSH是人FSH。
具有增加半衰期的FSH类似物
本发明的修饰的FSH蛋白还可以被进一步地修饰，使得半衰期比野 生型FSH的半衰期更长。例如，本发明的修饰的FSH蛋白还可以包括至 少一个具有潜在的糖基化位点的序列，所述序列包括在α或β链上包括N- 糖基化和/或O-糖基化位点的序列。提供潜在的糖基化识别位点的序列可 以是α或β链的N末端或C末端延伸。示例的修饰蛋白在其α链上含有N 末端延伸，所述延伸选自ANITV(SEQ ID No.3)和ANITVNITV(SEQ ID No.4)。其它示例的修饰蛋白在所述的β链上含有一个其它的修饰，所述 修饰选自Y58N和V78N。
通过聚乙二醇化或缀合其它合适的化学基团或通过构建具有增加半 衰期的融合蛋白或任一其它的方法也可以提供半衰期的增加。这些方法 在本领域是已知的，例如在美国专利5,612,034、美国专利6,225,449、和 美国专利6,555,660中所述的方法，在此通过引用将其全部内容并入本申 请。通过增加分子内的带负电荷残基的数目(例如谷氨酸和/或天冬氨酸) 的数目也可以增加半衰期。通过定点诱变方法可以实现这些改变，优选 的改变选自α亚基取代A85E和A85D等。通过往所述修饰的FSH中插入 含有一个或多个带负电荷残基的氨基酸序列也可以实现这些改变，所述 插入物包括选自GEFT(SEQ ID No.5)和GEFTT(SEQ ID No.6)等中的 插入物。在一个实施方式中，插入位于α亚基内，以及它选自 APD-GEFT-VQDC(SEQ ID No.7)和APD-GEFTT-QDC(SEQ ID No.8) 等。
蛋白的半衰期是蛋白稳定性的测定值，它说明了蛋白浓度降低一半 所需的时间。通过任一适用于测定一段时间内的对象样品中的FSH水平 可以确定出在此所述的修饰的FSH分子的血清半衰期，所述方法例如， 但不限于，是利用抗FSH抗体的免疫检测法测定在施用修饰的FSH一段 时间后所取得的血清样品中的FSH水平，或者通过检测在施用标记FSH 后所取得的对象血清样品中的标记FSH分子即放射性标记的分子。
FSH超激动剂的表达和/或合成
本发明也包括编码本发明的修饰的FSH的α和β亚基的核酸，以及用 于表达核酸的载体和宿主细胞。用于在不同宿主细胞内表达核酸的合适 的启动子在本领域是公知的，根据用于表达的载体-宿主系统容易将其互 换。在美国专利6,361,992中描述了示例的载体和宿主细胞，在此通过引 用将其全部内容并入本申请。
例如，一旦构建、修饰、或分离出编码相关的特殊糖蛋白激素的核 酸、或核酸的一个区域时，核酸可以被克隆到合适的载体内，所述载体 可以指导野生型和/或修饰的糖蛋白激素的体内或体外合成。预期载体具 有指导和调节所插入基因或杂交基因的转录所必需的功能元件。这些功 能元件包括，但不限于启动子、启动子的上游或下游区域、复制起点、 有助于克隆邻近启动子的插入物的合适的限制性位点、用于选择含有载 体的细胞或含有插入物的载体的抗生素耐药基因或其它标记物、RNA剪 切连接物、转录终止区、或任何有助于表达插入基因或杂交基因的其它 区域。(一般见于，Sambrook等，分子克隆：实验手册，第2版(1989))。
本领域技术人员已知多种能用于表达所插入的核酸的大肠杆菌表达 载体。其它适用的微生物宿主包括杆菌例如枯草杆菌、和其它肠道细菌 例如沙门氏菌、灵杆菌、和各种假单胞菌属。在这些原核宿主中，也可 以制备表达载体，它通常含有与宿主细胞相兼容的表达控制序列(例如复 制起点)。此外，还可以存在任何数目的各种公知的启动子，例如乳酸启 动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或噬菌 体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选地具有操纵子序列，并且 具有例如启动和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列。如果需要，通 过插入5’的Met密码子以及骨架内插入下游核酸都可以提供氨基末端的 甲硫氨酸。利用标准的寡核苷酸诱变方法可以去除核酸插入物中的羧基 末端延伸。
另外，可以使用酵母表达。使用酵母表达系统具有一些优点。首先， 事实表明酵母分泌系统中所产生的蛋白具有正确的二硫键配对。其次， 用酵母分泌系统可以有效地实施翻译后的糖基化。常规用酿酒酵母前α因 子原前导区(MF”-1基因编码)指导酵母分泌蛋白。(Brake，et al.， ″varies.-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae.″Proc.Nat.Acad.Sci.，81：4642-4646(1984))。前 α因子原的前导区含有一个信号肽和一个包括KEX2基因所编码的酵母 蛋白酶的识别序列的前片段：该酶在Lys-Arg二肽裂解信号序列的羧基侧 裂解前体蛋白。可以将FSH编码序列与前α因子原的前导区骨架融合。 然后将该构建体放置在强转录启动子例如乙醇脱氢酶I启动子或糖酵解 启动子的控制之下。核酸编码序列之后的是转录终止密码子，其之后是 转录终止信号。同样，核酸编码序列可以与第二种蛋白编码序列例如Sj26 或β半乳糖苷酶融合，所述第二种蛋白可以有助于亲和色谱法纯化融合蛋 白。用于分离融合蛋白组分的蛋白酶裂解位点的插入可以应用于在酵母 中表达的构建体。用杆状病毒系统也可以实现重组蛋白的有效的翻译后 糖基化和表达。
哺乳动物细胞容许在有利于重要的翻译后修饰环境中表达蛋白，所 述修饰包括折叠和半胱氨酸配对、添加复杂的糖水化合物结构、以及分 泌活性蛋白。用于在哺乳动物细胞内表达活性蛋白的载体的特征是在强 病毒启动子和多腺苷酸化信号之间插入蛋白编码序列。载体可以含有赋 予潮霉素耐药性、庆大霉素耐药性的基因、或其它适用为选择性标记物 的基因或表型、或甲氨蝶呤耐药性基因扩增的基因或表型。利用编码甲 氨蝶呤耐药性的载体可以将嵌合蛋白编码序列引入到中国仓鼠(CHO) 细胞株内，或者利用合适的选择标记物将嵌合蛋白编码序列引入到其它 细胞株内。用Southern印迹分析可以确定出载体DNA在转化细胞中的存 在。用Northern印迹分析可以确定出对应于插入编码序列的RNA的产生。 在本领域已经开发出了大量的其它适合的能分泌完整的人类蛋白的宿主 细胞株，其包括CHO细胞株、HeLa细胞、骨髓瘤细胞株、Jurkat细胞等。 这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列例如复制起点、启动子、增 强子以及必需的信息加工处理位点，例如核糖体结合位点、RNA剪切位 点、多腺苷酸化位点、和转录终止序列。示例的表达控制序列是源自免 疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。用公知的 方法可以将含有相关核酸片段的载体转移到宿主细胞内，所用的方法根 据细胞宿主的类型而有所不同。例如，氯化钙转化常常被用于原核细胞， 而磷酸钙、DEAE葡聚糖、或脂染介导的转染或电穿孔可以用于其它的 细胞宿主。
可以采用用于在哺乳动物细胞内表达基因的其它载体，那些与被开 发用于表达人γ干扰素、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子VIII、乙型肝炎 病毒表面抗原、蛋白酶Nexinl、和嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白的载体 相似的载体。此外，载体可以包括CMV启动子序列和适用于在哺乳动物 细胞(例如COS-7)内表达所插入的核酸的多腺苷酸化信号。
可以在体内或体外表达基因或杂交基因。体外合成包括转化作为载 体的宿主细胞的原核或真核细胞。同样，可以在体外表达系统中进行基 因表达。例如，可以商业化获得体外转录系统，其可被常规地用于合成 相当大量的mRNA。在这些体外转录系统中，将编码糖蛋白激素的核酸 克隆到邻近于转录启动子的表达载体内。例如，Bluescript II克隆和表达 载体含有多个克隆位点，其侧面是强的原核细胞的转录启动子。 (Stratagene Cloning Systems，La Jolla，Calf.)可以获得含有所有从DNA模 板例如Bluescript载体体外合成RNA所必需的试剂的试剂盒(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，Calf.)。然后可以在体外翻译系统在体外所生成 的RNA，以生成所需的糖蛋白激素(Stratagene Cloning Systems，La Jolla， Calf.)。
生成糖蛋白激素的另一种方法是用蛋白化学技术将两种肽或多肽连 接在一起。例如，利用目前可获得实验室设备，利用Fmoc(芴甲氧羰基) 或Boc(叔丁氧羟基)化学可以化学地合成肽或多肽。本领域技术人员可 以容易地知道用标准的化学反应可以合成对应于杂交糖蛋白激素的肽或 多肽。例如，肽或多肽可以被合成并且不将其从合成树脂中裂解下来， 而杂交肽的其它片段可以被合成并随后从树脂中解离下来，据此暴露出 在其它片段中被功能封闭的末端基团。通过肽缩合反应，这两种片段可 以分别经其羧基和氨基末端的肽键共价地连接在一起，以便形成杂交肽。 (Grant，G.A.，″Synthetic Peptides：A UserGuide，″W.H.Freeman and Co.，N. Y.(1992)and Bodansky，M and Trost，B.，Ed.，″Principles of PeptideSynthesis，″Springer-Verlag Inc.，N.Y.(1993))。同样，如上所述可以 体内独立地合成肽或多肽。一旦分离出肽或多肽，经相似的肽缩合反应 可以将这些独立的肽或多肽连接在一起形成糖蛋白激素。例如，所克隆 的或合成的肽片段的酶的或化学的连接可以容许相对短的肽片段连接在 一起，生成更大的肽片段、多肽或整个蛋白结构域。(Abrahmsen，L.，et al.， Biochemistry，30：4151(1991)；Dawson，et al.，″Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation，″Science，266：776-779(1994))。
本发明也提供了具有超激动剂或拮抗剂活性的修饰的糖蛋白激素的 片段。本发明的多肽片段可以是通过将编码多肽的核酸克隆到能生成多 肽片段的表达系统内所获得的重组蛋白。例如，可以确定出修饰的FSH 蛋白的活性结构域，其与β亚基一起可以与糖蛋白激素受体相互作用，并 引起与糖蛋白激素相关的生物效应。在一个实例中，可以删除所发现的 不会影响糖蛋白激素的活性或结合特异性或亲和力的氨基酸，且不会丢 失相应的活性。
例如，可以依次去除天然或修饰的糖蛋白激素中的氨基或羧基末端 的氨基酸，并用如上所述的其中一种可获得的检测法测试相应的活性。 在另一个实例中，可以用多肽片段或其它基序(例如生物素)取代本发明 的修饰蛋白中的氨基末端或羧基末端或者甚至激素的内在区域的一部 分，所述多肽片段或其它基序可以有助于修饰的糖蛋白激素的纯化。例 如，通过将编码两种多肽片段的相应的核酸克隆到表达载体内使得编码 区的表达生成杂交多肽的肽化学可以将修饰的糖蛋白与麦芽糖结合蛋白 融合。通过将杂交多肽流经过亲和柱可以亲和纯化杂交多肽，然后通过 用特异的蛋白酶因子Xa裂解杂交多肽可以将修饰的糖蛋白与麦芽糖结 合区分离开来。(见例如，New England Biolabs Product Catalog，1996，164 页)。
也可以直接地合成或者可以通过化学地或机械地分裂更大的糖蛋白 激素获得本发明的FSH分子的活性片段。活性片段被定义为源自天然存 在的氨基酸序列的至少约5个连续氨基酸的氨基酸序列，其具有相关的 活性例如结合或调节活性。无论是否与其它的序列相连接，片段也可以 包括插入、缺失、取代、或其它所选的对特殊区域或特异氨基酸残基的 修饰，只要肽的活性与修饰的糖蛋白的活性相比较没有被显著地改变或 削弱。这些修饰可以提供一些附加的性能，例如去除能形成二硫键的氨 基酸以便增加其生物寿命等。在任何情况中，肽必须具备生物学活性的 性能，例如结合活性、调节结合区域的结合的活性等。通过对激素的特 异区域的诱变作用，以及随后的对所表达多肽的表达及测试可以鉴定出 糖蛋白激素的功能的或活性的区域。这些方法对于本领域人员是显而易 见的，并且包括对编码受体的核酸的位点特异性的诱变作用(Zoller，M.J. et al.)。
本发明也包括包括在此所述的突变的融合蛋白和嵌合蛋白，例如包 括与LH或CG蛋白的CTEP区的融合。通过用本领域已知的方法彼此连 接编码所需氨基酸序列的合适的核酸序列的合适的编码框，并用上面所 述的任一方法表达融合蛋白，可以生成这样一种融合蛋白。同样，用蛋 白合成激素例如用肽合成仪可以生成这样一种融合蛋白。本发明的单链 类似物和嵌合蛋白可以在其α和β亚基之间或在嵌合蛋白的不同部分之间 整合有肽连接物。
治疗方法
本发明的修饰的FSH超激动剂可以用于治疗任一与糖蛋白激素活性 相关的病变。“与糖蛋白激素活性相关的”病变是完全或部分由改变了的 糖蛋白激素应答性所引起的病变，或者能从施用糖蛋白激素中获益的病 变。例如，这些病变包括，但不限于排卵功能障碍、黄体期缺陷、原因 不明的不育症、雄性因素的不育症、限时怀孕、FSH受体低表达、FSH 受体低敏感性、FSH受体结合缺陷、FSH受体偶合缺陷、低睾酮生成、 男性型脱发症、和垂体衰竭或损伤。
具体地，通过给动物施用在此所述的超活性FSH类似物可以提高卵 母细胞的数量和质量。例如，如在此所报道的那样，申请人惊奇地发现 通过施用含有位点13、14、16和20上具有碱性氨基酸的取代的α亚基的 超活性FSH获得了卵母细胞的数量和质量的显著增加。通过增加超活性 FSH的FSH血清半衰期可以进一步增强超活性FSH对卵母细胞的数量和 质量的作用。通过进一步地修饰超活性FSH可以增加FSH血清半衰期。 可以用更多的修饰(包括但不限于前面所述的那些修饰)增加FSH血清 半衰期。例如，可以用ANITV(SEQ ID No.3)延伸来延长FSH血清半衰 期。
根据美国专利5,574,011，在此通过引用将其全部内容并入本申请， FSH刺激性腺生成类固醇例如睾酮。因此，可以用本发明的FSH类似物 治疗任一与低类固醇生成相关的病变，特别是与低睾酮生成相关的病变。 根据美国专利6,562,790，在此通过引用将其并入本申请，可用睾酮治疗 冠状动脉堵塞。因此，可以用本发明的类似物提高患有冠状动脉疾病的 患者体内的睾酮水平。
也可以在男性或女性对象的辅助生殖的治疗方案中施用本发明的类 似物，包括给对象施用辅助量的修饰的FSH。在这些方法中，可以单独 地施用或联合其它的治疗药物施用类似物，其它的治疗药物例如包括但 不限于枸橼酸氯米芬、GnRH(促性腺释放激素)和LH(黄体化激素)。例 如，在患有单一性促性腺激素缺陷症(IGD)的患者中，可以给对象施用 修饰的FSH和LH，以便恢复正常的性腺功能。本领域所广泛认同的是， 糖蛋白激素(例如FSH和LH)在雌性生殖生理中是一个整体，可以给对 象施用糖蛋白激素以便克服大量的生殖疾病并据此辅助生殖。
本发明的类似物特别适合于治疗有卵巢过度刺激症倾向的女性，例 如通过在联合方案中施用具有不同血清半衰期的类似物。这些方法包括 (a)施用辅助量的第一种本发明的修饰的FSH，其中所述的第一种修饰的 FSH的血浆半衰期要比野生型FSH长，和(b)随后施用辅助量的本发明 的第二种修饰的FSH，其中所述的第二种修饰的FSH的血浆半衰期要比 所述的第一种修饰的FSH的半衰期短。例如，比野生型FSH具有更短半 衰期的类似物(TR-4401)可以用于治疗有过度卵巢刺激症倾向的女性。
本领域的技术人员可以容易地确定出所施用的有效量的糖蛋白激 素，这将依据于因素例如体重、大小、特殊病变的严重度、和对象本身 的类型。通过常规的优化方法可以容易地确定出治疗有效量。本发明提 供了具有比野生型糖蛋白激素更强效力的糖蛋白激素。这些修饰的糖蛋 白激素将容许本领域人员施用比野生型糖蛋白激素更小剂量的修饰的糖 蛋白激素，以获得相似的治疗效果，或者施用与野生型糖蛋白激素相似 剂量的修饰的糖蛋白激素可以获得更高的治疗疗效。
根据是否口服、肠外或其它方式施用糖蛋白激素，所施用的前列腺 素可以是固体、半固体形式或液体剂量形式，例如片剂、丸剂、胶囊、 粉末、液体、乳膏和悬浮液等，优选地是适用于给予精确剂量的单位剂 量形式。糖蛋白激素可以包括与药用可接受的载体组合的有效量的所选 的糖蛋白激素，另外还可以包括其它的药剂、药物、载体、佐剂、稀释 剂等。“药用可接受的”意思是非生物的或非必需的物质，即可以与所选 的糖蛋白激素一起给个体施用且不引起不可接受的生物效应或以不可接 受的方式与糖蛋白激素相互作用的物质。制备这些剂量形式的实际方法 对于本领域人员是已知的或者是显而易见的，例如见最新版的 Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。
基因治疗是用本发明的修饰的糖蛋白激素治疗激素疾病的另一种方 法。在这种方法中，可以将编码修饰的糖蛋白激素的基因引入到细胞内， 例如生殖系细胞或体细胞，使得在细胞内表达所述基因，以及这些细胞 的后面的子代都能表达所引入的基因。例如，编码本发明的修饰的FSH 蛋白的核酸可以被插入到卵巢细胞、或其前体细胞内，以增强排卵。转 运编码序列的合适载体在本领域是公知的。例如，载体可以是病毒载体 例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或非病毒的载体例如阳离子脂质 体。
本发明的类似物具有比野生型蛋白更高的活性，因此特别适用于将 作用物(agent)转运到表达糖蛋白激素受体的细胞内。因此，本发明还提 供了一种利用本发明的修饰的糖蛋白激素将作用物转运到所需治疗的对 象体内的表达糖蛋白受体的细胞内。将作用物转运到细胞内的方法(即靶 向转运)可以采用任何合适的试剂，依赖于对象的疾病或可疑疾病的性 能。作用物可以是细胞保护性化合物、抗体、药物、增敏剂、生物应答 修饰剂、放射性核素、毒素或其组合物。
在某些实施方式中，靶向转运的方法被用于治疗患有与异常糖蛋白 受体表达相关的疾病或可疑疾病的对象。在某些实施方式中，靶向转运 的方法被用于诊断或检测与异常糖蛋白受体表达相关的疾病。在某些实 施方式中，可以与其它治疗性方法、诊断性方法或临床方式(包括放疗和 /或手术)一起使用靶向转运方法。
在一个实施方式中，提供了靶向转运作用物的方法，其中作用物是 细胞保护性化合物。细胞保护性化合物是那些作用为保护或减少细胞损 伤的发生率或严重性的化合物。商品化可获得的细胞保护性化合物包括 美司钠(MESNEX，Bristol-Myers Squib)、阿米福汀(ETHYOL，Alza)、 右丙亚胺(ZINECARD，Phaimacia&UJpjohn)和四氢叶酸钙(多个产 家)。
在一个实施方式中，作用物可以是任何用于治疗各种形式癌症的药 物，例如天然的或合成的雌激素、雌激素受体调节剂、黄体酮、雄激素、 促性腺激素释放激素、雄激素抑制剂、二磷酸盐、糖皮质激素、甲状腺 素、抗甲状腺药物、碘药物、溴隐停、烷化剂、抗代谢药、抗有丝分裂 剂、鬼臼乙叉甙、抗肿瘤性抗生素、抗肿瘤性激素、铂配位络合物、 anthracenediones、取代尿素、丙卡巴肼衍生物、DNA拓扑异构酶抑制剂、 类视黄醛、porfimer、米托坦或其组合。
在一个实施方式中，作用物可以是任一用于治疗男性或女性生殖系 统癌症(例如，子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、睾丸癌)的药物。 在一个优选的实施方式中，作用物可以是氯米芬、非那司提、丙基硫氧 嘧啶、甲硫咪唑、博莱霉素、长春新碱、长春碱、顺铂、丝裂霉素、异 环磷酰胺、环磷酰胺、阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、卡铂、表柔比星、 六甲密胺、长春瑞滨、米托蒽醌、强的松或其组合。
也可以使用已知能增强某些抗癌药物以及放射性药物的细胞毒作用 的药物。这些药物一般被称作增敏剂。增强各种治疗性药物(例如抗癌药 物)的增敏剂的示例是丁硫氨酸亚矾胺和钙离子通道拮抗剂例如维拉帕 米、和地尔硫卓。(见，美国专利No.4,628,047和Important Advances in Oncology 1986，De Vita，ét al.，Eds.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，pages 146-157(1986)，在此通过引用将其全部内容并入本申请)。本领域已知的 其它增敏剂是甲硝唑、迷索硝唑、某些2-氨磺酰-6-硝基苯甲酸衍生物、 3-硝基吡唑的2.6-双取代衍生物、和某些isoindoledione化合物(见，美 国专利No.4,647,588、4,654,369、4,609,659和4,494,547，在此通过引用 将其全部内容并入本申请)。
在某些实施方式中，作用物可以是生物应答修饰剂。可以使用在本 领域范围内的任一生物应答修饰物。本发明的方法中所用的生物应答修 饰物的实例包括，但不限于α干扰素、β干扰素、γ干扰素、肿瘤坏死因子、 淋巴细胞毒素、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、 白介素-6或其组合。
在某些实施方式中，作用物可以是抗体。抗体可以是单克隆或多克 隆抗体。在某些实施方式中，抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体、或功 能性抗体片段包括例如Fab1、Fab2等。
可以应用于本发明的方法中的毒素的实例是蓖麻毒素、相思豆毒素、 白喉毒素、假单胞菌外毒素A、核糖体灭活蛋白、和真菌毒素例如单端 孢霉烯族毒素。单端孢霉烯族毒素是一种不完全真菌型的土壤真菌所生 成的或从Baccharus megapotamica中所分离到的真菌毒素(Bamburg，Proc. Molec.Subcell Bio.1983，8：41-110，Jarvis and Mazzola，Acc.Chem.Res. 1982，15：338-395，在此通过引用将其全部内容并入本申请)。可以施用治 疗有效的修饰毒素或其片段，例如通过遗传工程或蛋白工程所生成的毒 素。
可以采用任何将作用物与修饰的糖蛋白激素相结合或连接的方法。 例如，先前已经描述了大量的不同的可裂解的连接物。见，美国专利 No.4,618,492、4,542,225、和4,625,014，在此通过引用将其全部内容并入 本申请。从这些连接物基团中释放出作用物的机制包括照射不耐光键、 以及酸催化水解。美国专利No.5,563,250(在此通过引用将其全部内容并 入本申请)阐述了包括特异化学结构的连接物的免疫缀合物，其中体外裂 解连接物，释放出天然形式的化合物(放射性药物、药物、毒素等)。连 接物对轻微酸性pH下的裂解敏感，相信它在被转运到靶细胞的细胞浆内 的过程中可以被降解，据此在靶细胞内释放出生物学活性的化合物。美 国专利No.4,671,958(在此通过引用将其全部内容并入本申请)包括对免 疫缀合物的描述，所述免疫缀合物包括在靶细胞内被患者补体系统的蛋 白裂解酶体内裂解的连接物。
已经描述了其它方式的结合或连接。例如，连接物分子是商品化获 得的，例如从Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois中获得的那些连 接物分子(见Pierce 1986-87General Catalog，pages 313-354，在此通过引 用将其全部内容并入本申请)。与抗体结合的方法(见，例如美国专利 4,671,958和4,659,839，在此通过引用将其全部内容并入本申请)和连接 或结合放射性核素金属螯合剂、毒素及药物和蛋白的方法是已知的。见， 例如欧洲专利申请文献No.188,256、美国专利No.4,671,958、4,659,839、 4,414,148、4,699,784、4,680,338、4,569,789、和4,590,071；Borlinghaus et al.Canc.Res.47：4071-4075，Aug.1，1987；Foran，Best Pract.Res.Clin. Haematol.2002，15(3)：449-65和Fotiou，et al.，Eur.J.Gynaecol.Oncol.1988， 9(4)：304-7，在此通过引用将其全部内容并入本申请。对于更多的所报道 的能将各种放射诊断性化合物、放射性药物、药物、毒素、及其它作用 物与蛋白结合的方法，本领域人员能确定出用于连接给定的作用物和修 饰的糖蛋白的合适方法。
显像方法
本发明的类似物具有比野生型蛋白更强的活性，因此特别适合于用 于显像表达糖蛋白激素受体的细胞。因此，在一个实施方式中，本发明 还提供了利用本发明的修饰的糖蛋白激素显像包括糖蛋白激素受体的细 胞的方法。显像及检测激素的方法可以是本领域人员已知的任一方法。 商品化所用的显像方法包括例如磁共振显像(MRI)、X光片、计算机断 层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、乳腺成像和超声波。
已经描述了利用基本的放射学技术显像对象的方法，例如“Textbook of Radiology andImaging”，Sutton and Livingstone，7th Edition，(2Volume set)，Churchill Livingstone(Elsevier Sciences)，London，2002；“A Concise Textbook ofRadiology”，Armstrong and Wastie(eds.)Arnold Publishing(The Thomson Corporation)，Scarborough，Ontario，Canada，2001；“Walter& Miller′s Textbook of Radiotherapy”，Bomford and Knuckler，6th Edition， Churchill Livingstone (Elsevier Sciences)，London，2001，在此通过引用将其 全部内容并入本申请。也见于，Bottomley，Comput.Radiol.1984，8(2)： 57-77；Dixon，Radiology 1984，153(1)：189-94；Daley and Cohen，Cancer Res. 1989，49(4)：770-9；Ellis，et al.，Clin.Radiol.2001，56(9)：691-9；Paushter，et al.，Med.Clin.North Am.1984，68(6)：1393-421；Blecher，Aust.Fam. Physician 1983，12(6)：449-50，452；Bragg，Cancer 1977，40(1Suppl)：500-8； Moseley，Br.Med.J.(Clin.Res.Ed.)1982，284(6323)：1141-4；Lentle and Aldrich，Lancet 1997，350(9073)：280-5；Weber，et al.，Strahlenther Onkol. 1999，75(8)：356-73；Hanbidge，Can.J.Gastroenterol.2002，16(2)：101-5； Miles，Bur.Radiol.2003，Suppl S：M134-8；Prigent-Le Jeune，et al.，Eur.J. Nucl.Med.Mol.Imaging 2004，Feb19[Epub ahead of print]；DeSimone，et al.，Gynecol.Oncol.2003，89(3)：543-8和Goldenberg，et al.，J.Clin.Oncol. 1987，5(11)：1827-35；在此通过引用将其全部内容并入本申请。
主要根据于对象的疾病或可疑疾病的性质、所显像的组织以及是否 需要功能性(生理性)或结构性(解剖性)图像，可以采用任一合适的显 像或检测方法。在一些实施方式中，显像方法提供了通过检测对象体内 的所标记的修饰的糖蛋白激素的量或检测对象体内的修饰的糖蛋白激素 所增加的水平，可以说明自身免疫性疾病或癌症性疾病的存在，所述癌 症选自卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、睾丸癌或垂体 肿瘤。
显像方法通常可以被分类成那些提供对象的结构或解剖方面的信息 的方法或者那些提供对象的功能或生理学方面的信息的方法。结构显像 提供了骨骼或组织成分的形状，以便确定出是否存在异常信息或者某些 元件的破坏。肿瘤或癌细胞的存在可以表现为结构变化。更新类型的结 构显像提供了组织内的不同部分的化学组成，以便确定出是否存在正在 进行的损害或异常的生物化学过程(例如癌细胞的存在或生长)。见，例 如Bonilha，et al.，Med.Sci.Monit.2004，10(3)：RA40-6，epub 2004 Mar 01； Ballmaier，et al.，Psychiatry Res.2004，15；130(1)：43-55；Ballmaier，et al.， Biol.Psychiatry，2004，55(4)：382-9；Cha，Magn.Reson.Imaging Clin.N.Am. 2003，11(3)：403-13和Kopelman，et al.，Hippocampus，2003；13(8)：879-91， 在此通过引用将其全部内容并入本申请。
功能显像是一种相当新的技术，它能查明特殊的组织或器官是否正 在进行特殊的功能任务。该技术能计算出多种生理过程，包括例如血流 以及活性相关的血流变化(例如肿瘤的存在或生长)，以及监视对化疗的 应答。见，例如Takeuchi，et al.，J.Med.Invest.2004，51(1-2)：59-62；Otsuka， et al.，J.Med.Invest.2004，51(1-2)：14-9；Martincich，et al.，Breast CancerRes.Treat.2004，83(1)：67-76；Cohen and Goadsby，Curr.Neurol. Neurosci.Rep.2004，4(2)：105-10和Lewis，et al.，Eur.J.Neurosci.2004， 19(3)：755-60，在此通过引用将其全部内容并入本申请。
一般而言，放射学方法例如磁共振显像(MRI)、X光片、计算机断 层扫描(CT)、乳腺成像和超声波提供了对象的结构或解剖的信息。放射 学方法例如核医学、放射性核素显像以及正电子放射断层扫描(PET)提 供了对象的功能或生理学的信息。两种结构的和功能的显像都在本发明 的范围之内。
在本发明的一个实施方式中，显像方法提供了修饰的糖蛋白激素是 被标记的(即使用了造影剂)。可以施用任一标记或造影剂。见，例如 Minato，et al.J.Comput.Assist.Tomogr.2004，28(1)：46-51；Antoch，et al.， JAMA 2003，290(24)：3199-206；Brinker，Rev.Caxdiovasc.Med.2003；4 Suppl 5：S19-27；el-Diasty，et al.，J.Urol.2004，171(1)：31-4；Williams，et al.， Int.J.Oral Maxillofac.Surg.2003，32(6)：651-2；Follen，et al.，Cancer 2003， 98(9Suppl)：2028-38；Behrenbruch，et al.，Med.Image Anal.2003，7(3)： 311-40；Knopp，et al.，Mol.Cancer Ther.2003，2(4)：419-26，在此通过引用 将其全部内容并入本申请。标记可以是本领域人员已知的任一标记。在 一个实施方式中，标记可以是放射线所不能穿透的标记、放射性标记、 荧光标记或顺磁标记。
放射性核素一般发射贝塔(β)或伽马(γ)射线。I131发射约90％的 β射线以及约10％的γ粒子，其物理学半衰期约为8天。Tc99m发射γ射线， 其半衰期约为6小时。在施用例如Tc99m标记的蛋白之后，利用已知的 方法通过用伽马照相机扫描患者可以检测出放射性核酸的生物分布。因 此，容易显像出Tc99m在靶向位点上的蓄积。见，Toohey，Radiographics. 2000；20：533-546；Kostakoglu，et al.，RadioGraphics 2003，23：315-340； Saremi，et al.，RadioGraphics 2002，22：477-490；Intenzo，et al.， RadioGraphics 2001，21：957-964；Ranger，RadioGraphics 1999，19： 481-502；Simpkin，RadioGraphics 1999，19：155-167；Janoki and Kerekes， Acta Physio.Hung.1992，79(2)：183-96；Hoefnagel，Anticancer Drugs 1991， 2(2)：107-32；Hoefnagel，Eur.J.Nucl.Med.1991，18(6)：408-31；Gatley，et al.， Acta Radiol.Suppl.1990，374：7-11；Ott，Br.J.Radiol.1989，62(737)：421- 32；Andersen，Cerebrovasc.Brain Metab.Rev.1989，1(4)：288-318和Miraldi， Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.1986，12(7)：1033-9，在此通过引用将其全 部内容并入本申请。
除了I131或Tc99m之外，在本发明的方法中可以采用任一本领域技 术人员已知的放射性同位素。其他的放射性核素和螯合剂可以包括例如 Co57、Co58、Cr51、F18FDG、Ga67、氯化In111、三胺五乙酸(DTPA) In111、In111oxyquinoline(oxine)、In111卡罗单抗喷地肽、In111Imciroma pentetate、I123、I125碘肽酸盐、I125人血白蛋白(RISA)、I131碘马尿 酸盐、I131odomethylnorcholesterol(NP-59)、I131间碘苄胍(MIBG)、 Kr81m气体、P32磷酸铬、P32磷酸钠、Ru82、Sm153lexidronam(Sm-153 EDTMP)、Sr89、T1201和Xe133。
诊断性检测法
本发明还提供了对干扰本发明的修饰的糖蛋白激素与糖蛋白激素受 体结合的分析物的检测。在一个实施方式中，提供了用于检测生物样品 中的干扰修饰的糖蛋白激素受体的结合的分析物的方法，所述方法包括 (i)将样品与本发明的修饰的糖蛋白激素接触；和(ii)检测信号，其中所 检测到的信号的存在或量说明了是否存在干扰修饰的糖蛋白激素与糖蛋 白受体结合的分析物。
在一个实施方式中，用于检测分析物的方法是竞争性结合检测法。 竞争性结合检测法是基于反应物中的标记的和未标记的配体与受体结合 物(例如抗体、受体、转运蛋白)之间的竞争性结合的检测法。IUPAC Compendium of Chemical Terminology，1997，2nd edition，″Competitive Protein Binding Assays″Odell and Daughaday，W.H.Lippincott，1972和 ″Principles of Competitive Protein-binding Assays″Odell and Franchimont，P. John Wiley&Sons Inc.，1983，在此通过引用将其全部内容并入本申请。 也见于美国专利No.6,537,1760，在此通过引用将其全部内容并入本申请。
在某些实施方式中，信号是表示与样品中的糖蛋白受体结合的修饰 的糖蛋白激素的存在或量的信号。在某些实施方式中，方法采用了检测 第二信号，例如检测cAMP或类固醇(例如孕酮)的存在或量。在某些实 施方式中，方法采用了生物样品中的整个细胞。在某些实施方式中，方 法仅仅采用部分细胞，例如细胞膜。
在某些实施方式中，可以在溶液中进行检测。在某些实施方式中， 可以将一种或多种检测中的组分固定于固相上。可以将塑料表面、微粒、 磁性颗粒、滤膜、多聚体凝胶材料以及其他的固相底物用作固相。见， 例如6,664,114、6,589,798、6,479,296和6,294,342，在此通过引用将其全 部内容并入本申请。使得本发明所提供的检测方法自动化是有可能的。
利用FSH超激动剂设计糖蛋白受体激动剂和拮抗剂的方法
本发明也提供了依据本发明的FSH蛋白和同种受体之间的相互作用 设计新的受体激动剂和拮抗剂的方法。这些方法包括预测本发明的FSH 蛋白中的带电基序与同种受体中的互补氨基酸残基之间的相互作用。例 如，这种方法可以包括比较FSH与来自进化远源物种的受体(例如人LH 和鼠LH受体)的结合和生物学活性方面的相互作用的差异；定位出仅仅 存在于两个受体序列其中之一中的细胞内结构域和/或细胞外环中的带电 氨基酸；进行丙氨酸扫描以及电荷逆转诱变，以便进一步地验证给定的 预测；建立整合了所验证的相互作用的激素-受体复合物的模型；以及利 用模型设计出新的激素类似物和受体拮抗剂。新的激素类似物包括那些 利用本模型预测将与受体结合的类似物。新的拮抗剂包括那些利用本模 型预测将与FSH类似物结合的从受体蛋白的结构域或环中设计出来的拮 抗剂。
例如，已经发现本发明的其中一种类似物(TR-4402，包括α取代 (E14R+Q20R+G73R)+βE4R)与高浓度的鼠LH受体(SEQ ID No.23， NCBI Accession No.NP_037110)相互作用，但不与人LH受体(SEQID No.24，NCBI Accession No.NP_000224，数据没有显示)相互作用。根据 TR-4402与这些受体的特异性上的差异，Arg14、Arg20和Arg73应当与 鼠LH受体中的带负电荷残基Asp和Glu相互作用。在鼠受体中存在的 但人受体所不具有的带负电荷残基是Asp312和Glu314(根据具有信号肽 的人LH受体氨基酸序列)(在人LH受体中分别是Ser和Lys)。人FSH受 体(SEQ ID No.22，NCBI Accession No.AAA52477)中的相应残基是 Glu316、Asp317和Glu319。因此，预测该酸性氨基酸簇与TR-4402的α 亚基中的Arg14、Arg20和Arg73相互作用。该信息容许为糖蛋白激素的 相关作用更好地建模，并且将有助于设计新的糖蛋白激素，包括含有对 应于人FSH受体的298-338的序列以及包括Glu300及Asp302的肽/蛋白 拮抗剂。
提供了描述和举例说明本发明的下面的实施例。这些实施例不应当 被认为是限制了本发明的范围。本领域人员将认识到许多其他的实施方 式也可以在如上面所描述过的以及权利要求书中所定义的本发明的范围 之内。
实施例
实施例1：FSH超激动剂的产生和表征
定点诱变：利用Stratagene的QuickChange诱变试剂盒对人α亚基 (SEQ ID No.1)和FSHβ亚基(SEQ ID No.2)cDNA进行定点诱变。根据 美国专利No.6,361,992所述的方法设计出类似物，在此通过引用将其全 部内容并入本申请。
在被亚克隆到表达载体内之后，测序所有构建体的整个PCR产物， 以便验证突变以及排除任何非所需的聚合酶错误。
瞬时表达：在中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞中瞬时表达类似物。利 用基于脂质体剂型(LipofectAMINE试剂，GibcoBRL)的瞬时转染方案， 在60或100mm培养皿中，用野生型和突变体亚基cDNA(α和FSHβ亚 基)瞬时共转染细胞。在常规培养基中复原12个小时之后，将所转染的 细胞在CHO-无血清培养基中培养72个小时。随后，收集条件培养基， 其包括来自用无基因插入物的表达载体的模拟转染的对照培养基，用 Centriprep 10浓缩器(Amicon，Beverly，MA)浓缩，并储存在-70℃。用一 组不同的识别不同FSH表位的单克隆和多克隆抗体定性类似物。
FSH生物学活性检测法：通过类似物诱导表达hFSH受体的CHO细 胞生成cAMP的能力评价出类似物的促卵泡活性。将稳定表达hFSH受 体的CHO细胞在96孔组织培养板中生长到融合。随后，在37℃、5％CO2 下，将细胞孵育在无盐条件培养基(2h)或具有系列稀释的野生型及突变 体FSH的生理培养基(1h)以及来自模拟转染的对照培养基中。用放射 免疫检测法测定出所生成的cAMP的量。
选择在体外具有最高生物学活性以及对FSH生成没有副作用的FSH 突变用于组合菌株。图1包括了显示出比较如瞬时转染CHO-FSHR细胞 所测定到的各种单个突变在体外对FSH生物学活性的作用的图。显示出 最高效力的单个突变包括α位点Q13、E14、V68、P21和G73以及β位点 E4上的碱性取代。F18上的精氨酸取代造成了生物学活性的减低。βE4R 特别地造成了FSH生成的增加(见图2)。在图3中显示出了一些组合取 代对生物学活性的协同作用。
总共测试了α亚基中的26个单一突变以及β亚基上的23个单一突变， 选择每个亚基中的头几个突变，以便构建出具有组合取代的领先类似物。 下面的表1显示了在体外证实具有增强的生物学活性的组合突变。
表1造成效力增强的组合取代。
  类似物  取代   4201  αE14R+βE4R   4202  α(E14R+N66R)+WTβ   4203  α(E14R+G73R)+WTβ   4204  α(P16R+Q20R)+WTβ   4205  α(Q20R+P21R)+WTβ   4301  α(E14R+Q20R+G73R)+WTβ   4302  α(E14R+P21R+G73R)+WTβ   4303  α(E14R+N66R+G73R)+WTβ   4304  α(E14R+N66R)+βE4R   4305  α(E14R+G73R)+βE4R   4306  α(P16R+Q20D+P21R)+WTβ   4307  α(P16R+Q20R+P21R)+WTβ   4308  α(N66K+G73K+A81K)+WTβ   4401  α(Q13R+E14R+P16R+Q20R)+WTβ   4402  α(E14R+Q20R+G73R)+βE4R   4403  α(E14R+P21R+G73R)+βE4R   4404  α(E14R+N66R+G73R)+βE4R   4405  α(Q13K+E14K+P16K+Q20K)+WTβ   4501  α(E14R+Q20R+P21R+N66R+G73R)+WTβ   4601  α(Q13K+E14K+P16K+Q20K+N66K+G73K)+WTβ   4602  α(E14R+P16R+Q20R+P21R+N66R+G73R)+WTβ   4603  α(E14R+Q20R+P21R+N6R+G73R)+βE4R   4701  α(E14R+P16+Q20R+P21R+N66R+G73R)+βE4R   4901  α(Q13R+E14R+P16R+Q20R)以及α亚基中的N末端的ANITV(SEQ ID No.3)延伸   4910  α(Q13R+E14R+P16R+Q20R)+WTβ以及α亚基中的N末端的ANITV(SEQ ID No.3)延伸
如本领域已知的那样，根据所用的系统，具体的药物可以表现出不 同的效能。见，Kenakin，″Predicting Therapeutic Value in the Lead Optimization Phase of Drug Disclovery，″Nature Rev.2：429-38(2003)。因 此，也用表达少量FSH受体的鼠颗粒细胞(GLHR-15细胞)测试了本发 明的类似物的生物学活性。如图4所示，与野生型FSH和游离α链(没有 显示出显著的剂量依赖性应答)相比较，本发明的类似物仍造成了显著的 cAMP应答。
实施例2：类似物TR-4402的纯化和表征
选择TR-4402进行纯化和进一步的表征。TR-4402是FSH类似物， 其含有两个αL1环中的突变(αE14R和αQ20R)、一个αL3环中的突变 (αG73R)、以及一个βL1环中的突变(E4R)。见图5。通过脂染胺方法将 含有人α亚基cDNA以及二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的修饰pED载 体、以及含有经IRES序列以及扩增基因标记物腺苷酸脱氨酶(ADA)所 分开的FSH β亚基cDNA的修饰pIRES载体共转染到CHO-DHRF(-)细 胞内，建立了产TR-4402的细胞株。将所转染的细胞培养在选择培养基 (缺乏核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的含10％透析过的FBS的aMEM) 中。为了在CHO双缺失突变体(dhEr-/dhEr-)中稳定地生成hFSH类似 物，CHO-DG44细胞株由L.Chasin博士(Columbia University，New York， N.Y.)惠赠。
将分泌FSH#4402的克隆细胞株培养在递增浓度的甲氨蝶呤(MTX) (最大浓度为2μM)中。DHFR扩增依据于没有添加核苷酸的培养基中的 MTX的系统的增加。在恢复了细胞的多边形形态之后(2到3周)，筛选 出用于下面的扩增步骤的细胞。因为MTX浓度增加约800倍(从 0.005μM到约4.0μM)，扩增过程花费了约4个月。具有最大分泌水平的 克隆也被用于进行第二次处理，包括用脱氧柯福霉素定向扩增ADA标记 物基因。
利用所建立的用于检测FSH#4402的FSH免疫检测法测试单个克隆 的表达。选择出经pED-analoga+pIRES-ADA-analogb(a∶b的摩尔比＝1∶5， 5mg总DNA)所转染的稳定细胞株(克隆编码为H-2-3)，并将其在加有 10％透析过的牛血清(Gibco，Cat No：26400-044)和2mM甲氨蝶呤 (MTX；ICN，Cat.No：102299，Aurora，Ohio)的α最小必需培养基(a-MEM： Cat#：12561-056，Lot#1141509，具有L-谷氨酰胺，不含核糖核苷酸和脱 氧核糖核苷酸)；GIBCO，Grand Island，N.Y.)中进行繁殖。
生物反应器接种物的制备：当500cm2的T瓶中的＞90％CHO-DG44 细胞都融合时，用胰蛋白酶处理细胞，在4℃、400g离心5分钟。通过 将细胞悬浮液加液到2L塑料瓶内，将所有细胞(1.6′109/500ml a-MEM培 养基)都接种到Celligen plus Bioreacto内。
在扩增之后，将产生最大量FSH#4402的细胞株生长在多个瓶内。然 后利用灌注模式在具有内在的停留设备(篮)和垂直混和系统的3.5L生 物反应器Packed-Bed Bioreactor(Celligen Plus，NewBrunswick Scientific， Edison，NJ)内进一步繁殖细胞。细胞被捕捉到位于停留设备内的Fibracel 盘上。所溶解的氧气被保持在50％饱和度。温度为37℃。搅拌速度为 100rpm。用四气混和系统以及自动注射碳酸氢钠可以保持pH值为7.2。 调整灌注，以保持葡萄糖水平高于1.5g/L以及乳酸低于1.5g/L。
Celligen plus bioreactor中的FBS断离方法以及FSH-TR4402类似物 的产生。用加有次黄嘌呤-胸腺嘧啶补充物(Gibco，100′)、青霉素-链霉素 (Gibco，100′；Cat#：15140-122，Lot No.：1161387)、谷氨酰胺-1(Gibco，100′； Cat#：35050-61，Lot No.：1163550)、10％pluronic F-68(Gibco，100′；Cat#： 24040-032，Lot No.：1153058)和1％透析过的胎牛血清(Gibco)的CHO IIIA(Gibco，Formula No.：97-0147DK，Lot No.：1147268)进行生物反应器 中的血清断离。在生物反应器处理的第17天，我们将CHO-IIIA培养基 更换成无CHO蛋白、无动物成分的培养基(Sigma，Cat#：C-8730；Lot No.： 122K8401)，直到第23天(见概述生物反应器运行的SLIDE)。收集生物 反应器中的培养基，离心，过滤(0.45μM膜)并用Millipore浓缩器进行 浓缩。
纯化：用免疫亲和(Maine Biotechnology Services，Inc.的单克隆抗体 ME.112)及疏水作用色谱法纯化TR-4402。用SDS-PAGE(-85％)评价纯 度。
利用采用表达人FSH受体的CHO、人颗粒细胞样肿瘤(KGN)和鼠 颗粒(GLHR-15)细胞株以及以总cAMP产生为终点的体外检测法表征 修饰的类似物TR-4402(见图6-8)。利用CHO-FSHR细胞，TR-4402表现 出比Follistim (野生型FSH)的效力高30倍以及Vmax增加17％。利用 KGN-FSHR，TR-4402的效力也比野生型FSH高30倍。
也测试了TR-4402与LH和TSH受体的结合，以确认FSH类似物的 特异性，采用等电聚焦确认碳水化合物链的异质性，即存在着α和β亚基 (数据没有显示)。
利用EggCentris的体外卵泡生物检测法也测试了TR-4402在体外对 小鼠卵泡的作用(与野生型FSH相比较)。该检测法研究了早期窦前期卵 泡的生长和发育，直到排卵期。整个过程在体外接近模拟了体内卵泡形 成的生理过程。培养系统开始于分离出直径在100和130μM之间的同源 类型的小鼠的窦前期卵泡。将卵泡单个铺板，并将其与1、3和9mIU/mL 野生型(“化合物3”)和TR-4402(“化合物4”)一起培养12天。
卵泡生物检测说明与Follistim(野生型)相比较，暴露于TR-4402之 后能提高卵母细胞的质量，如增强卵泡生存(图9)、增强卵泡窦形成(图 10)、增强COC的粘液化(图11)、增强核成熟(图12)和增强孕酮生成 (图13)所显示的那样。。这些不同与卵母细胞膜上的FSH受体的存在及 抗凋亡作用相关(例如，见Meduri et al.，J.Clin.Endocrinol..Metab.87(5)： 2266-76)，并说明本发明的修饰超激动剂可以被用于提高寻求辅助生殖治 疗的患者体内的卵母细胞的性能。
实施例3：利用TR-4402的体内研究
利用不成熟的21天大的Sprague-Dawley雌鼠进行TR-4402的体内研 究。每日一次皮下注射FSH共3天(第0、24和48小时)。收集第72h 时的血液样品并进行尸解。测定两个卵巢的重量。用ICN-IRMA FSH免 疫检测法确定出血清中的FSH和抑制素B的水平。在对卵巢进行匀浆化 之后，用CT 17β雌二醇试剂盒(ICN Pharmaceuticals，Inc.)确定出卵巢内 的雌二醇含量。
先前已经显示卵巢重量的增加与所注射的FSH剂量有关(Steelman and Pohley，1953)。FSH刺激卵泡生长(颗粒细胞增殖、充血、雌二醇和 抑制素B生成)。观察到了在用相应剂量的TR-4402和Follistim刺激之后 的卵巢重量(图14A、C和D)、卵巢内雌二醇含量(图15)和血清抑制 素B水平(图16)的统计学显著性差异。观察到了TR-4402在卵巢肿瘤、 抑制素和雌二醇产量方面优于野生型FSH的优点，尽管在每个试验结束 时，仍保留在血清中的TR-4402水平比Follistim低40-50％。
因为啮齿动物的研究常常被认为是FSH制剂在人体中的临床疗效的 好的指示物，因此预计TR-4402在治疗人类患者方面应当能显示出相当 多的优于Follistim的优点。此外，具有更快清除率的超活性FSH(例如 TR-4402)在IVF方案的第二阶段应当会有直接的应用，并造成卵巢过度 刺激综合征(OHSS)发生率的降低。
实施例4：比较FSH类似物与野生型FSH的体外受精、胚胎发育、 和活产的研究。
在试验的第1天，23天大的B6D2F1雌鼠(5组)接受皮下注射10IU TR-4402、10IU TR-4901、10IU野生型FSH(Follistim)、或20IU野生型 FSH(Follistim)。作为对照，给至少一只动物腹腔内注射施用排卵剂量的 hCG。
在FSH注射后72个小时之后，收集精子和卵母细胞，并发生受精。 从年龄大于2个月的雄性B6D2和CB6F1鼠中收集到精子。通过颈脱位 法处死雄鼠。在下腹部位置打开一个切口，切下附睾和输精管，并将其 放置于精子盘内。切割附睾和输精管3到5次，将精子从器官内轻轻地 挤压到精子盘内。将含有精子的精子盘放置在37℃和5％CO2的孵育箱内， 并容许催熟30到90分钟。
通过处死雌鼠并切割下输卵管，从接受TR-4401、TR-4901或野生型 FSH(Follistim)的超排卵的雌鼠中收集到卵母细胞。将输卵管放置在一滴 HTF培养基内，并撕裂ampulae以便释放出egg clutches。将完整的egg clutches转移到受精盘内并计数。表2提供了每组5只动物的卵母细胞的 数目：10IU剂量的FSH类似物TR-4401和TR-4901比10IU和20IU剂 量的重组野生型FSH (Follistem)生成了更多的卵母细胞。
在将卵母细胞放置到受精盘内之后，往每个受精盘内加入一部分精 子(1×106到2×106个精子/ml)。将受精盘放置在37℃和5％CO2的孵育箱 内最少4个小时，以便容许发生受精。在孵育4个小时之后，将受精过 的卵从受精盘中转移到洗涤盘内，其中它们在250μL HTF培养基滴中洗 涤至少2次，以去除碎片。将盘中HTF滴中的卵母细胞在37℃和5％CO2 的孵育箱内储存过夜。
受精后24个小时，从孵育箱中取出细胞。计数双细胞胚胎(表2， 题为“双细胞胚胎的数目”的列)，并用发育成双细胞胚胎的卵母细胞的 百分比计算出受精率(表2，题为“％双细胞胚胎”的列)。在经FSH类 似物TR-4401和TR-4901所处理过的小鼠组中所生成的双细胞胚胎的数 目更多。所有组(FSH类似物和重组野生型FSH)中的受精率都是高的。
随后将双细胞胚胎转移到培养皿内进行进一步的发育(表2，题为 “培养中剩余的双细胞胚胎的数目”的列)或将其植入到假孕的雌鼠内 (表2，题为“所转移的双细胞胚胎的数目”的列)。
在受精后的第4天，观察到了仍剩余在培养皿中的胚胎出现了胚泡 形成。在表2的题为“发育胚泡的数目”的列中提供了发育胚泡的数目。
表2提供了胚泡的总数和孵化胚泡的数目。
被植入用于受精的双细胞胚胎被植入到6和8周大之间的CD1雌鼠 内。每个测试组的3只小鼠内都被植入了60个双细胞胚胎，除了在 TR-4401组中被植入到40个双细胞胚胎。通过腹腔内注射氯胺酮/zylazine 溶液麻醉小鼠。一旦被麻醉后，给每只小鼠备皮，并在肋架尾部以及在 腹部到背部的侧面的头1/3处打开小的切口(0.5cm)。在体壁上打开另一 个切口，以便提供到达腹腔的通路。用镊子夹住卵巢脂肪垫并轻轻地将 卵巢、输卵管、和子宫的近端经体壁拉到体外。将卵巢和输卵管放置到 棉花拭子上，使得卵巢-输卵管连接处产生一个角度。在立体显微镜下鉴 定出漏斗，并用超细镊子在粘液囊上打开一个洞。通过往漏斗内滴入最 小体积的含有胚胎的M2培养基，以转移胚胎。然后将器官复位到体壁 内，并用一针或两针缝线缝合。用一个或两个闭合夹关闭皮肤切口。每 日观察小鼠。在10天之后，检测受体鼠的妊娠情况。表2中的题为“双 细胞胚胎转移的妊娠”的列提供了每个测试组的所形成的妊娠的数目。 FSH类似物TR-4901生成了最多的妊娠。
利用分娩作为终点，进行了比较TR-4401与重组野生型FSH的相似 试验。给雌鼠(3只小鼠/组)注射1IU hCG以及3IU妊娠母马血清促性 腺激素(PMSG)(作为对照)、1IU野生型FSH(Gonal F)、3IU野生型FSH (Gonal F)、1IU TR-4401、或3IU TR-4401。在48个小时之后，给小鼠注 射排卵剂量的5IU hCG。在注射排卵剂量24个小时之后，计数卵母细胞 并如前所述的容许发生体外受精。随后，将20个双细胞胚胎植入到假孕 母体内。表3提供了该试验的结果。接受1IU或3IU TR-4401的测试组 比对照组以及经重组野生型FSH治疗的测试组获得了更高的卵母细胞计 数，更高的胚泡发育率、以及更高的分娩率。
表2：比较TR-4401和TR-4901与重组野生型FSH(Follistim)的体外受 精及胚胎转移的试验。
  测作用物量水   平   卯母细   胞计数   (每组)   双细胞   胚胎数   目   ％双   细胞   胚胎  所转移的  双细胞胚  胎的数目   仍保留在培   养基中的双   细胞胚胎的   数目   发育胚泡   的数目   双细胞胚   胎转移的   妊娠   10IU Follistim   77   77   100％  60(3雌鼠)   12   总共6(孵化3)   0   20IU Follistim   165   161   98％  60(3雌鼠)   101   52(孵化37)   2   10IU TR-4401   207   204   99％  40(2雌鼠)   164   75(孵化38)   1   10IU TR-4901   376   369   98％  60(3雌鼠)   171   197(孵化126)   3
表3：比较TR-4401与重组野生型FSH(Gonal-F)和PMSG(对照)的体 外受精、胚胎发育以及活产的试验。
  测作用物量   水平   卵母细   胞计数   (每组)   双细胞胚   胎数目   ％双细胞   胚胎   仍保留在培养   基中的双细胞   胚胎的数目   发育胚泡   的数目   ％发育   胚泡   分娩率   3IUPMSG   58   51   88％   31   18   58％   0/20   1IU Gonal F   26   26   100％   6   4   67％   0/20   3IU Gonal F   21   21   100％   1   0   0％   0/20   1IU TR-4401   78   59   76％   19   12   63％   5/40   3IU TR-4401   116   113   97％   53   38   72％   11/60
实施例5：来自经TR-4401FSH类似物和重组野生型FSH(Gonal F) 治疗的小鼠的卵母细胞的数量和质量的比较
如表4所示的，在用对照或不同剂量的野生型FSH或FSH类似物 TR-4401体内治疗治疗之后，定量和定性地评价来自B6CBAF1小鼠的卵 母细胞。根据先前所述的方案，体外受精发生在第1天(处理后72个小 时)。
表4：治疗组(3只小鼠/组)
  治疗(第-2天)   hCG(第0天)   对照：2.5IU PMSG(Folligon)   5IU hCG(Chorulon)   对照：仅用hCG   5IU hCG   0.5IU重组FSH(Gonal F)+1IU hCG(Ovritrelle)   5IU hCG(Ovitrelle)   0.5IUTR-4401+1IU hCG(Ovritrelle)   5IU hCG(Ovitrelle)   1IU重组FSH(Gonal F)+1IU Hcg(Ovritrelle)   5IU hCG(Ovitrelle)   1IUTR-4401+l IU hCG(Ovritrelle)   5IU hCG(Ovitrelle)   3IU重组FSH(Gonal F)+1IU hCG(Ovritrelle)   5IU hCG(Ovitrelle)   3IUTR-4401+1IU hCG(Ovritrelle)   5IU hCG(Ovitrelle)
发现TR-4401的处理显著地增加了所产的卵母细胞的数目。图21提 供了在精子洗涤时的每组中的卵母细胞的总数(在体外受精前即刻)。图 显示了所有剂量的TR-4401(0.5IU、1IU和3IU)都比经重组野生型卵泡 刺激素处理过的测试组生成了更多的卵母细胞。
TR-4401的处理增加了体外受精所生成的胚胎的总数。图24提供了 每组中的双细胞胚胎的总数。图显示了所有剂量的TR-4401(0.5IU、1IU 和3IU)都比经重组野生型FSH处理过的测试组生成了更多的双细胞胚 胎。
在相似的试验中，测试组接受了联合1IU hCG的3个剂量的0.5IU、 1IU或3IU TR-4401或重组野生型FSH(Gonal F)。对照组接受了3个剂 量的1IU hCG。在第3天，所有组都接受了一个排卵剂量的15IU hCG。 如前所述的，在小鼠中进行体外受精。图22显示经所有剂量(3x(0.5、1、 3IU)+1IU hCG)的TR-4401FSH类似物处理过的小鼠比经重组野生型 FSH(Gonal F)或对照处理过的小鼠表现出了更高的受精率。此外，来自 经最小剂量TR-4401(3x 0.5TR-4401+1IU hCG)处理过的小鼠的卵母细 胞比来自更高剂量TR-4401处理过的小鼠的那些卵母细胞表现出了更高 的受精率。图23显示来自经TR-4401FSH类似物(所有剂量)处理过的 小鼠的胚胎比来自经重组野生型FSH处理过的测试组的胚胎表现出更高 的胚泡形成率。来自经最小剂量TR-4401(3×0.5TR-4401+1IU hCG)处理 过的小鼠的胚胎比来自更高剂量TR-4401处理过的小鼠的胚胎表现出了 更高的胚泡形成率。
实施例6：FSH类似物的药物动力学比较
进行药物动力学试验确定出与野生型FSH相比较的FSH类似物 TR-4401、TR-4402和TR-401的吸收率和排出率。进行FSH清除检测法 确定出与重组野生型FSH相比较的在一定时间内的TR-4401、TR-4402 和TR-4901的血清FSH的量(IU/ml)。图17A提供了检测的结果。图显 示了FSH类似物TR-4401的清除比TR-4402和TR-4901有所延迟。FSH 类似物TR-4402比其他的类似物表现出更短的作用持续时间。相似地， 图17B显示了与重组野生型FSH相比较的FSH类似物TR-4401、TR-4402 和TR-4901的排出率(一定时间内的血清FSH mIU/ml)。TR-4402比其他 类似物和重组野生型FSH(Follistim)被排出的更快。表5提供了药物动 力学试验的数据。数据确认了FSH类似物TR-4402的排出率(Ke)和吸 收率(Ka)是最高的。和预期的一样，与其他的类似物和重组野生型FSH 相比较，TR-4402的血清半衰期(T1/2)是最低的。
表5：FSH类似物TR-4901、TR-4401、和TR-4402和重组野生型FSH (Follistem)的药物动力学数据。
  TR-4901   TR-4401   TR-4402  野生型FSH   Ke   0.09   0.076   0.124  0.099   Ka   0.5794   0.5654   1.55  0.3503   V   17.47   31.55   20.46  12.51   AUC(0-t)(mIU/ml)   9328   6328   6868  8768   Tmax(小时)   3.8   4.1   1.8  5.0   Cmax(mIU/ml)   609.6   348.1   588.6  728.8   T1/2(小时)   7.7   9.1   5.6  7.0   AUC(mIU*小时/ml)   9508.8   6570.9   6897.1  8804.5
药物动力学对于患者对FSH类似物的应答有着显著的影响。对过度 刺激综合征高危的高敏患者可能从FSH类似物例如TR-4402中获益，因 为它比其他的类似物作用得更快以及更短的持续时间。其他患者将可能 从FSH类似物例如TR-4401中获益，因为它证实具有延长的药物动力学 作用。
进行了其他的药物动力学试验比较TR-4401和重组野生型FSH (Gonal F)。在一个实施方式中，给小鼠注射单一剂量的重组野生型FSH 或TR-4401。在注射后68个小时(尸解时)确定出末梢血水平。TR4401 的末梢血FSH值比重组野生型FSH高出5到6倍。表6提供了剂量和末 梢血FSH数据。
表6：FSH的末梢血FSH数据。
  FSH  剂量(μg)   末梢血FSH值(mIU/ml)   重组野生型FSH(Gonal F)  2.22μg   所有动物都小于2.5mIU/ml   TR-4401  0.22μg   所有动物都小于2.5mIU/ml   TR-4401  2.2μg   所有动物在12-15mIU/ml之间
实施例7：增加FSH类似物的血清半衰期的修饰
如前所述的用N末端延伸进一步地修饰的FSH类似物TR-4402，以 增强血清半衰期。图18提供了可以增强FSH类似物的血清半衰期的进一 步修饰实例。实施利用CHO细胞的体外cAMP刺激研究，以比较N末 端修饰TR-4402(LA1-4402)、“野生型”N末端修饰的FSH(LA1-Wt)、 TR-4402和重组野生型FSH(Follistem)。图19显示修饰延长了FSH类似 物TR-4402和重组野生型FSH的FSH血清半衰期。
在杂交B6D2F1小鼠中进行体内排卵检测，以标记N末端修饰 TR-4402和重组野生型FSH。经0.5IU、1.0IU、2.5IU、5.0IU、和10IU 剂量的N末端修饰TR-4402处理过的小鼠比经重组野生型FSH或hCG (对照)处理过的那些小鼠生成了更多的卵母细胞。图20显示了试验的结 果。
通过引用将在本申请中所讨论过的所有文献、专利和专利申请一同 并入本申请。虽然在前面的说明书中，已经根据某些优选的实施方式描 述了本发明，并且为了举例说明的目的已经设定了许多细节，但是显而 易见的是，本领域人员明白本发明还将包括其他的实施方式，以及与在 此所述的某些细节可以有着相当的不同，只要它们不脱离本发明的基本 原则。
序列表
<110>TROPHOGEN，INC.
<120>卵泡刺激素超激动剂
<130>056815-5001-WO
<150>US 60/554,419
<151>2004-03-19
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>92
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1               5                   10                  15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
            20                  25                  30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
        35                  40                  45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
    50                  55                  60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65                  70                  75                  80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
                85                  90
<210>2
<211>111
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
            85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
        100                 105                 110
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino terminal extension；potential glycosylation recognition
site
<400>3
Ala Asn Ile Thr Val
1               5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino terminal extension；potential glycosylation recognition
site
<400>4
Ala Asn Ile Thr Val Asn Ile Thr Val
1               5
<210>5
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Negatively charged amino acid insert to modify protein half-life
<400>5
Gly Glu Phe Thr
1
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Negatively charged amino acid insert to modify protein half-life
<400>6
Gly Glu Phe Thr Thr
1               5
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial  Sequence
<220>
<223>FSH segment with negatively charged amino acid insert to modify
protein half-life
<400>7
Ala Asp Pro Gly Glu Phe Thr Val Gln Asp Cys
1               5                   10
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial  Sequence
<220>
<223>FSH segment with negatively charged amino acid insert to modify
protein half-life
<400>8
Ala Asp Pro Gly Glu Phe Thr Thr Gln Asp Cys
1               5                   10
<210>9
<211>97
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH alpha mature peptide sequence with N-terminal
extension
<400>9
Ala Asn Ile Thr Val Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr
1               5                   10                  15
Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln
            20                  25                  30
Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser
        35                  40                  45
Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys
    50                  55                  60
Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys
65                  70                  75                  80
Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys
                85                  90                  95
Ser
<210>10
<211>97
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH alpha mature peptide sequence with N-terminal
extension
<400>10
Ala Asn Ile Thr Val Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr
1               5                   10                  15
Leu Gln Arg Asn Pro Phe Phe Ser Arg Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln
            20                  25                  30
Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser
        35                  40                  45
Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys
    50                  55                  60
Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Arg Phe Lys
65                  70                  75                  80
Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys
                85                  90                  95
Ser
<210>11
<211>101
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH alpha mature peptide sequence with N-terminal
extension
<400>11
Ala Asn Ile Thr Val Asn Ile Thr Val Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys
1               5                   10                  15
Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala
            20                  25                  30
Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr
        35                  40                  45
Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser
    50                  55                  60
Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met
65                  70                  75                  80
Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys
                85                  90                  95
Tyr Tyr His Lys Ser
            100
<210>12
<211>101
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH alpha mature peptide sequence with N-terminal
extension
<400>12
Ala Asn Ile Thr Val Asn Ile Thr Val Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys
1               5                  10                  15
Pro Glu Cys Thr Leu Gln Arg Asn Pro Phe Phe Ser Arg Pro Gly Ala
            20                  25                  30
Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr
        35                  40                  45
Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser
    50                  55                  60
Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met
65                  70                  75                  80
Gly Arg Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys
                85                  90                  95
Tyr Tyr His Lys  Ser
            100
<210>13
<211>111
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH beta mature peptide sequence
<400>13
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Asn Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110
<210>14
<211>111
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH beta mature peptide sequence
<400>14
Asn Ser Cys Arg Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Asn Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110
<210>15
<211>111
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH beta mature peptide sequence
<400>15
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Asn Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110
<210>16
<211>111
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Mutated FSH beta mature peptide sequence
<400>16
Asn Ser Cys Arg Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Asn Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110
<210>17
<211>121
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
Ser Arg Glu Pro Leu Arg Pro Trp Cys His Pro Ile Asn Ala Ile Leu
1               5                   10                  15
Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr
            20                  25                  30
Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Met Arg Val Leu Gln Ala Val
        35                  40                  45
Leu Pro Pro Leu Pro Gln Val Val Cys Thr Tyr Arg Asp Val Arg Phe
     50                  55                  60
Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asp Pro Val Val
65                  70                  75                  80
Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Arg Cys Gly Pro Cys Arg Arg Ser
                85                  90                  95
Thr Ser Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp His
            100                 105                 110
Pro Gln Leu Ser Gly Leu Leu Phe Leu
        115                 120
<210>18
<211>24
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Val Phe Leu His Val Leu His Ser
            20
<210>19
<211>18
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile
1               5                   10                  15
Cys Cys
<210>20
<211>20
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Met Glu Met Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly
1               5                   10                  15
Gly Ala Trp Ala
            20
<210>21
<211>692
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<400>21
Met Ala Leu Leu Leu Val Ser Leu Leu Ala Phe Leu Gly Tnr Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Cys His His Trp Leu Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys
            20                  25                  30
Gln Asp Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Thr Asp Leu Pro Arg Asn Ala
        35                  40                  45
Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Pro Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Phe Ala Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn
65                  70                  75                  80
Asp Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asp Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys
                85                  90                  95
Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asn
            100                 105                 110
Pro Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Ser Leu Arg Tyr Leu Leu Ile Ser
        115                 120                 125
Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Ala Val His Lys Ile Gln Ser Leu
    130                 135                 140
Gln Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Ile Val
145                 150                 155                 160
Ala Arg Asn Ser Phe Met Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Leu Ser Lys Asn Gly Ile Glu Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly
            180                 185                 190
Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu
        195                 200                 205
Leu Pro Asn Asp Val Phe Gln Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp
    210                 215                 220
Ile Ser Arg Thr Lys Val His Ser Leu Pro Asn His Gly Leu Glu Asn
225                 230                 235                 240
Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Arg Leu Lys Lys Leu Pro
                245                 250                 255
Asn Leu Asp Lys Phe Val Thr Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro
            260                 265                 270
Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Leu Lys Arg Gln Ile Ser Glu Leu
        275                 280                 285
His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Asp Ile Asp Asp Met
    290                 295                 300
Thr Gln Ile Gly Asp Gln Arg Val Ser Leu Ile Asp Asp Glu Pro Ser
305                 310                 315                 320
Tyr Gly Lys Gly Ser Asp Met Met Tyr Asn Glu Phe Asp Tyr Asp Leu
                325                 330                 335
Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala Phe
            340                 345                 350
Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val Leu Ile
        355                 360                 365
Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Thr Thr Val Leu Val
    370                 375                 380
Val Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met
385                 390                 395                 400
Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu Leu
                405                 410                 415
Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr Ala
            420                 425                 430
Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe Thr
        435                 440                 445
Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr Leu
    450                 455                 460
Glu Arg Trp His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Glu Cys Lys Val
465                 470                 475                 480
Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Val Met Val Leu Gly Trp Thr Phe Ala
                485                 490                 495
Phe Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met Lys
            500                 505                 510
Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln Leu
        515                 520                 525
Tyr Val Met Ala Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val Ile
    530                 535                 540
Cys Gly Cys Tyr Thr His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Thr Ile
545                 550                 555                 560
Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met Ala Thr Leu
                565                 570                 575
Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile
            580                 585                 590
Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ala Lys Ile
        595                 600                 605
Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu
    610                 615                 620
Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile Leu Leu
625                 630                 635                 640
Ser Lys Phe Gly Cys Tyr Glu Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg Thr Glu
                645                 650                 655
Thr Ser Ser Ala Thr His Asn Phe His Ala Arg Lys Ser His Cys Ser
            660                 665                 670
Ser Ala Pro Arg Val Thr Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Leu Asn His
        675                 680                 685
Ser Ser Gln Asn
    690
<210>22
<211>695
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
Met Ala Leu Leu Leu Val Ser Leu Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys
            20                  25                  30
Gln Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala
        35                  40                  45
Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Gln Lys Gly
    50                  55                  60
Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn
65                  70                  75                  80
Asp Val Leu Glu Val Ile Glu Ala Asp Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys
                85                  90                  95
Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Thr
            100                 105                 110
Pro Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Gln Tyr Leu Leu Ile Ser
        115                 120                 125
Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Asp Val His Lys Ile His Ser Leu
    130                 135                 140
Gln Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr Ile
145                 150                 155                 160
Glu Arg Asn Ser Phe Val Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly
            180                 185                 190
Thr Gln Leu Asp Ala Val Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu
        195                 200                 205
Leu Pro Asn Asp Val Phe His Gly Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp
    210                 215                 220
Ile Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn
225                 230                 235                 240
Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro
                245                 250                 255
Thr Leu Glu Lys Leu Val Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro
            260                 265                 270
Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu Leu
        275                 280                 285
His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Val Asp Tyr Met
    290                 295                 300
Thr Gln Ala Arg Gly Gln Arg Ser Ser Leu Ala Glu Asp Asn Glu Ser
305                 310                 315                 320
Ser Tyr Ser Arg Gly Phe Asp Met Thr Tyr Thr Glu Phe Asp Tyr Asp
                325                 330                 335
Leu Cys Asn Glu Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala
            340                 345                 350
Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val Leu
        355                 360                 365
Ile Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Ile Ile Val Leu
    370                 375                 380
Val Ile Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu
385                 390                 395                 400
Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu
                405                 410                 415
Leu Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr
            420                 425                 430
Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe
        435                 440                 445
Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr
    450                 455                 460
Leu Glu Arg Trp His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Asp Cys Lys
465                 470                 475                 480
Val Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Val Met Val Met Gly Trp Ile Phe
                485                 490                 495
Ala Phe Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met
            500                 505                 510
Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln
        515                 520                 525
Leu Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val
    530                 535                 540
Ile Cys Gly Cys Tyr Ile His Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Asn
545                 550                 555                 560
Ile Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Arg Ile Ala Lys Arg Met Ala Met
                565                 570                 575
Leu Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala
            580                 585                 590
Ile Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ala Lys
        595                 600                 605
Ile Leu Leu Val Leu Phe His Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe
    610                 615                 620
Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asp Phe Phe Ile Leu
625                 630                 635                 640
Leu Ser Lys Cys Gly Cys Tyr Glu Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg Thr
                645                 650                 655
Glu Thr Ser Ser Thr Val His Asn Thr His Pro Arg Asn Gly His Cys
            660                 665                 670
Ser Ser Ala Pro Arg Val Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Ile Leu Val Pro
        675                 680                 685
Leu Ser His Leu Ala Gln Asn
    690                 695
<210>23
<211>700
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>23
Met Gly Arg Arg Val Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu Val Leu Ala Val
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Lys Pro Ser Gln Leu Gln Ser Arg Glu Leu Ser Gly Ser
            20                  25                  30
Arg Cys Pro Glu Pro Cys Asp Cys Ala Pro Asp Gly Ala Leu Arg Cys
        35                  40                  45
Pro Gly Pro Arg Ala Gly Leu Ala Arg Leu Ser Leu Thr Tyr Leu Pro
    50                  55                  60
Val Lys Val Ile Pro Ser Gln Ala Phe Arg Gly Leu Asn Glu Val Val
65                  70                  75                  80
Lys Ile Glu Ile Ser Gln Ser Asp Ser Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn
                85                  90                  95
Ala Phe Asp Asn Leu Leu Asn Leu Ser Glu Leu Leu Ile Gln Asn Thr
            100                 105                 110
Lys Asn Leu Leu Tyr Ile Glu Pro Gly Ala Phe Thr Asn Leu Pro Arg
        115                 120                 125
Leu Lys Tyr Leu Ser Ile Cys Asn Thr Gly Ile Arg Thr Leu Pro Asp
    130                 135                 140
Val Thr Lys Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asn Phe Ile Leu Glu Ile Cys
145                 150                 155                 160
Asp Asn Leu His Ile Thr Thr Ile Pro Gly Asn Ala Phe Gln Gly Met
                165                 170                 175
Asn Asn Glu Ser Val Thr Leu Lys Leu Tyr Gly Asn Gly Phe Glu Glu
            180                 185                 190
Val Gln Ser His Ala Phe Asn Gly Thr Thr Leu Ile Ser Leu Glu Leu
        195                 200                 205
Lys Glu Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Met His Ser Gly Ala Phe Gln Gly
    210                 215                 220
Ala Thr Gly Pro Ser Ile Leu Asp Ile Ser Ser Thr Lys Leu Gln Ala
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ser His Gly Leu Glu Ser Ile Gln Thr Leu Ile Ala Leu Ser
                245                 250                 255
Ser Tyr Ser Leu Lys Thr Leu Pro Ser Lys Glu Lys Phe Thr Ser Leu
            260                 265                 270
Leu Val Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Arg Asn
        275                 280                 285
Leu Pro Lys Lys Glu Gln Asn Phe Ser Phe Ser Ile Phe Glu Asn Phe
    290                 295                 300
Ser Lys Gln Cys Glu Ser Thr Val Arg Lys Ala Asp Asn Glu Thr Leu
305                 310                 315                 320
Tyr Ser Ala Ile Phe Glu Glu Asn Glu Leu Ser Gly Trp Asp Tyr Asp
                325                 330                 335
Tyr Gly Phe Cys Ser Pro Lys Thr Leu Gln Cys Ala Pro Glu Pro Asp
            340                 345                 350
Ala Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Ala Phe Leu Arg Val
        355                 360                 365
Leu Ile Trp Leu Ile Asn Ile Leu Ala Ile Phe Gly Asn Leu Thr Val
    370                 375                 380
Leu Phe Val Leu Leu Thr Ser Arg Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe
385                 390                 395                 400
Leu Met Cys Asn Leu Ser Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly Leu Tyr Leu
                405                 410                 415
Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Ser Gln Thr Lys Gly Gln Tyr Tyr Asn
            420                 425                 430
His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ser Gly Cys Gly Ala Ala Gly Phe
        435                 440                 445
Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Val Ile
    450                 455                 460
Thr Leu Glu Arg Trp His Thr Ile Thr Tyr Ala Val Gln Leu Asp Gln
465                 470                 475                 480
Lys Leu Arg Leu Arg His Ala Ile Pro Ile Met Leu Gly Gly Trp Leu
                485                 490                 495
Phe Ser Thr Leu Ile Ala Thr Met Pro Leu Val Gly Ile Ser Asn Tyr
            500                 505                 510
Met Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Val Glu Ser Thr Leu Ser
        515                 520                 525
Gln Val Tyr Ile Leu Ser Ile Leu Ile Leu Asn Val Val Ala Phe Val
    530                 535                 540
Val Ile Cys Ala Cys Tyr Ile Arg Ile Tyr Phe Ala Val Gln Asn Pro
545                 550                 555                 560
Glu Leu Thr Ala Pro Asn Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Lys Met Ala
                565                 570                 575
Ile Leu Ile Phe Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe
            580                 585                 590
Ala Ile Ser Ala Ala Phe Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Thr Asn Ser
        595                 600                 605
Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Val Asn Ser Cys Ala Asn Pro
    610                 615                 620
Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp Phe Leu Leu
625                 630                 635                 640
Leu Leu Ser Arg Phe Gly Cys Cys Lys Arg Arg Ala Glu Leu Tyr Arg
                645                 650                 655
Arg Lys Glu Phe Ser Ala Tyr Thr Ser Asn Cys Lys Asn Gly Phe Pro
            660                 665                 670
Gly Ala Ser Lys Pro Ser Gln Ala Thr Leu Lys Leu Ser Thr Val His
        675                 680                 685
Cys Gln Gln Pro Ile Pro Pro Arg Ala Leu Thr His
    690                 695                 700
<210>24
<211>699
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Met Lys Gln Arg Phe Ser Ala Leu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Pro Pro Leu Pro Arg Ala Leu Arg Glu Ala Leu Cys Pro Glu
            20                  25                  30
Pro Cys Asn Cys Val Pro Asp Gly Ala Leu Arg Cys Pro Gly Pro Thr
        35                  40                  45
Ala Gly Leu Thr Arg Leu Ser Leu Ala Tyr Leu Pro Val Lys Val Ile
    50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Phe Arg Gly Leu Asn Glu Val Ile Lys Ile Glu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Cln Ile Asp Ser Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn Ala Phe Asp Asn
                85                  90                  95
Leu Leu Asn Leu Ser Glu Ile Leu Ile Gln Asn Thr Lys Asn Leu Arg
            100                 105                 110
Tyr Ile Glu Pro Gly Ala Phe Ile Asn Leu Pro Gly Leu Lys Tyr Leu
        115                 120                 125
Ser Ile Cys Asn Thr Gly Ile Arg Lys Phe Pro Asp Val Thr Lys Val
    130                 135                 140
Phe Ser Ser Glu Ser Asn Phe Ile Leu Glu Ile Cys Asp Asn Leu His
145                 150                 155                 160
Ile Thr Thr Ile Pro Gly Asn Ala Phe Gln Gly Met Asn Asn Glu Ser
                165                 170                 175
Val Thr Leu Lys Leu Tyr Gly Asn Gly Phe Glu Glu Val Gln Ser His
            180                 185                 190
Ala Phe Asn Gly Thr Thr Leu Thr Ser Leu Glu Leu Lys Glu Asn Val
        195                 200                 205
His Leu Glu Lys Met His Asn Gly Ala Phe Arg Gly Ala Thr Gly Pro
    210                 215                 220
Lys Thr Leu Asp Ile Ser Ser Thr Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Leu Glu Ser Ile Gln Arg Leu Ile Ala Thr Ser Ser Tyr Ser Leu
                245                 250                 255
Lys Lys Leu Pro Ser Arg Glu Thr Phe Val Asn Leu Leu Glu Ala Thr
            260                 265                 270
Leu Thr Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Arg Asn Leu Pro Thr Lys
        275                 280                 285
Glu Gln Asn Phe Ser His Ser Ile Ser Glu Asn Phe Ser Lys Gln Cys
    290                 295                 300
Glu Ser Thr Val Arg Lys Val Ser Asn Lys Thr Leu Tyr Ser Ser Met
305                 310                 315                 320
Leu Ala Glu Ser Glu Leu Ser Gly Trp Asp Tyr Glu Tyr Gly Phe Cys
                325                 330                 335
Leu Pro Lys Thr Pro Arg Cys Ala Pro Glu Pro Asp Ala Phe Asn Pro
            340                 345                 350
Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asp Phe Leu Arg Val Leu Ile Trp Leu
        355                 360                 365
Ile Asn Ile Leu Ala Ile Met Gly Asn Met Thr Val Leu Phe Val Leu
    370                 375                 380
Leu Thr Ser Arg Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn
385                 390                 395                 400
Leu Ser Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly Leu Tyr Leu Leu Leu Ile Ala
                405                 410                 415
Ser Val Asp Ser Gln Thr Lys Gly Gln Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp
            420                 425                 430
Trp Gln Thr Gly Ser Gly Cys Ser Thr Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe
        435                 440                 445
Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg
    450                 455                 460
Trp His Thr Ile Thr Tyr Ala Ile His Leu Asp Gln Lys Leu Arg Leu
465                 470                 475                 480
Arg His Ala Ile Leu Ile Met Leu Gly Gly Trp Leu Phe Ser Ser Leu
                485                 490                 495
Ile Ala Met Leu Pro Leu Val Gly Val Ser Asn Tyr Met Lys Val Ser
            500                 505                 510
Ile Cys Phe Pro Met Asp Val Glu Thr Thr Leu Ser Gln Val Tyr Ile
        515                 520                 525
Leu Thr Ile Leu Ile Leu Asn Val Val Ala Phe Phe Ile Ile Cys Ala
    530                 535                 540
Cys Tyr Ile Lys Ile Tyr Phe Ala Val Arg Asn Pro Glu Leu Met Ala
545                 550                 555                 560
Thr Asn Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Lys Met Ala Ile Leu Ile Phe
                565                 570                 575
Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile Ser Ala
            580                 585                 590
Ala Phe Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Thr Asn Ser Lys Val Leu Leu
        595                 600                 605
Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala
    610                 615                 620
Ile Phe Thr Lys Thr Phe Gln Arg Asp Phe Phe Leu Leu Leu Ser Lys
625                 630                 635                 640
Phe Gly Cys Cys Lys Arg Arg Ala Glu Leu Tyr Arg Arg Lys Asp Phe
                645                 650                 655
Ser Ala Tyr Thr Ser Asn Cys Lys Asn Gly Phe Thr Gly Ser Asn Lys
            660                 665                 670
Pro Ser Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ser Thr Leu His Cys Gln Gly Thr
        675                 680                 685
Ala Leu Leu Asp Lys Thr Arg Tyr Thr Glu Cys
    690                 695