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牛混合羊精液 体外受精新方法

阅读：599发布：2020-05-17

专利汇可以提供牛混合羊精液体外受精新方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种牛混合羊精液体外受精新方法，属于动物繁殖技术领域，将COCs分别用牛卵母细胞捡卵液、牛卵母细胞成熟液洗后，放入牛卵母细胞成熟液中成熟培养，在BO-AB液中洗后，放入牛羊原精混合的精子滴中培养；再用SOF液脱掉颗粒细胞，把脱掉颗粒细胞的卵子放入SOF液中培养。本发明的优点是利用异种动物不交叉受精的生殖隔离的受精生物学原理，牛羊原精混合，进行牛卵子体外受精处理；通过羊精子推流作用，促进低于正常受精所需的牛精子和卵子受精，达到制作牛胚胎的目的。，下面是牛混合羊精液体外受精新方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种牛混合羊精液体外受精的新方法，其特征在于：按如下的步骤进行：
（一）、配制试剂：
（1)配制牛卵母细胞捡卵液：
H-M199+10%胎牛血清
4℃保存，使用期限为一个月;
（2）配置牛卵母细胞成熟液:
M199+1μg/ml雌二醇+0.1IU/ml垂体分泌卵泡刺激素+1IU/ml黄体化激素+10%胎牛血清
4℃保存，使用期限为一个月;
（3）配制牛体外受精液BO液：
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（4）配制BO-A受精液：
使用BO液进行溶解，现配现用;
（5）配制BO-B受精液：
使用BO液进行溶解，现配现用;
（6）配制BO-AB受精液：
等量BO-A与BO-B混合,现配现用;
（7）配制牛体外受精培养液Stock A液：
名称浓度
Nacl 997.6mM
Kcl 71.63mM
KH2PO4 11.90mM
Mgcl2·6H20 4.919mM
乳酸钠 0.616(V/V)%
葡萄糖 14.99mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（8）配制牛体外受精培养液Stock B液：
名称浓度
NaHCO3 250.0mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（9）配制牛体外受精培养液Stock C液：
名称浓度
丙酮酸钠 32.72mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（10）配制牛体外受精培养液Stock D液：
名称浓度
Cacl2·2H2O 171.4mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（11）配制牛体外受精培养液Stock X液：
名称浓度
L-谷氨酰胺 99.90mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（12）配制牛体外受精培养液Stock Y液：
名称浓度
柠檬酸钠 34.00mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（13）配制牛体外受精培养液Stock Z液：
名称浓度
肌醇 277.0mM
使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;
（14）配制牛体外受精培养液IVC SOF液：
SOF液体总体积 10ml
stockA 1ml
stockB 1ml
stockC 100μl
stockD 100μl
stockX 100μl
stockY 100μl
stockZ 100μl
非必需氨基酸 100μl
必需氨基酸 200μl
牛血清白蛋白 0.08g
青霉素/链霉素 10μl
酚红 10μl
超纯水 7.18ml
4℃保存，使用期限为一个月;
（二）、体外受精：
（1）牛卵细胞的成熟培养：
①屠宰3h之内的新鲜牛卵巢用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净的生理盐水中,用20ml注射器17#针头抽取直径在2-8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘-卵母细胞复合体COCs；
②把牛卵母细胞捡卵液与牛卵母细胞成熟液放在38.5℃，5%的二氧化碳培养箱中平衡1h以上，然后将拣出的卵丘-卵母细胞复合体COCs用平衡好的牛卵母细胞捡卵液洗一遍，再用牛卵母细胞成熟液洗两遍后，取一四孔板，每孔先加入500μl牛卵母细胞成熟液，再加入500μl石蜡油，按照每孔50-120枚的数目放入牛卵母细胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；
（2）体外受精：
①取50ml烧杯两个，分别标记为A和B：A配制牛体外受精液BO-A液，B配制牛体外受精液BO-B液；配置好的牛体外受精液BO-A液和BO-B液分别用0.2μm滤器过滤到新的
50ml烧杯中，均放入37.5℃恒温水浴锅中预热；
②取牛、羊原精按1：1或1：9比例混合，加入5ml预热的牛体外受精液BO-A液，轻轻将混合精液混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml预热的牛体外受精液BO-A液，轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，用预热的牛体外受精液BO-AB液将牛羊混合精子浓度稀释为1000万/ml；
③用②处理好的精液在35mm皿中做100μl的精子滴，做好后加入石蜡油放入38.5℃，
5%二氧化碳培养箱中；
④打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出成熟22h的牛卵细胞，在预热的牛体外受精液BO-AB液中洗3次，将③中做好的精子滴从培养箱中拿出，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%二氧化碳培养箱中培养6h；
（3）受精卵的体外发育培养：
受精6h后，用培养箱中预热的牛体外受精培养液IVC SOF液脱掉颗粒细胞，然后，把脱掉颗粒细胞的卵子放入预热的每孔含500μl牛体外受精培养液IVCSOF液，上盖500μl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养。

说明书全文

牛混合羊精液 体外受精新方法

技术领域

[0001] 本发明属于动物繁殖技术领域，具体地说属于一种牛混合羊精液体外受精新方法。

背景技术

[0002] 哺乳动物受精是精子和卵子在雌性生殖道内融合为一个合子的过程，目前常规的体外受精是指把同种动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。哺乳动物的受精具有种间特异性，也就是说绝大部分哺乳动物不能进行异种间受精。 [0003] 为了寻找一种减少牛精子使用量，但能确保受精质量，在生产牛冷冻精液时可以用同样的牛精子数量，但能生产出更多的产品的方法，进行了牛混合羊精液体外受精的方法的研究。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供了一种牛混合羊精液体外受精新方法，该方法利用异种动物不交叉受精的生殖隔离的受精生物学原理，把羊精混合到牛精中，进行牛卵子体外受精处理；通过羊精子推流作用，促进低于正常受精所需的牛精子和卵子受精，达到制作牛胚胎的目的，实现了减少牛精子使用量、但能确保受精质量，在制作牛胚胎时可以通过添加羊精子同时减少牛精子数量，生产出更多的产品的目的。

[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种牛混合羊精液体外受精新方法，其特征在于：它包括下述步骤：

[0006] （一）、配制试剂：

[0007] （1)配制牛卵母细胞捡卵液：

[0008] H-M199+10%FBS

[0009] 4℃保存，使用期限为一个月;

[0010] （2）配置牛卵母细胞成熟液:

[0011] M199+1µg/mlE2+0.1IU/mlFSH+1IU/mlLH+10%FBS

[0012] 4℃保存，使用期限为一个月;

[0013] （3）配制牛体外受精液BO液：

[0014]

[0015] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0016] （4）配制BO-A受精液：

[0017]

[0018] 使用BO液进行溶解，现配现用;

[0019] （5）配制BO-B受精液：

[0020]

[0021] 使用BO液进行溶解，现配现用;

[0022] （6）配制BO-AB受精液：

[0023] 等量BO-A与BO-B混合,现配现用;

[0024] （7）配制牛体外受精培养液Stock A液：

[0025]名称浓度
Nacl 997.6mM
Kcl 71.63mM
KH2PO4 11.90mM
Mgcl2·6H20 4.919mM
Na-lactate 0.616 (V/V)%
Glucose 14.99mM

[0026] [0026] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0027] （8）配制牛体外受精培养液Stock B液：

[0028]名称浓度
NaHCO3 250.0mM

[0029] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0030] （9）配制牛体外受精培养液Stock C液：

[0031]名称浓度
Na Pyrucate 32.72mM

[0032] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0033] （10）配制牛体外受精培养液Stock D液：

[0034]名称浓度
Cacl2·2H2O 171.4mM

[0035] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0036] （11）配制牛体外受精培养液Stock X液：

[0037]名称浓度
L-Glutamine 99.90mM

[0038] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0039] （12）配制牛体外受精培养液Stock Y液：

[0040]名称浓度
Sodium citrate 34.00mM

[0041] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0042] （13）配制牛体外受精培养液Stock Z液：

[0043]名称浓度
myo-Inositol 277.0mM

[0044] 使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;

[0045] （14）配制牛体外受精培养液IVC SOF液：

[0046]SOF液体总体积 10ml
stockA 1ml
stockB 1ml
stockC 100µl
stockD 100µl
stockX 100µl
stockY 100µl
stockZ 100µl
NEAA 100µl
EAA 200µl
BSA 0.08g
P/S 10µl
酚红 10µl
超纯水 7.18ml

[0047] 4℃保存，使用期限为一个月;

[0048] （二）、体外受精：

[0049] （1）牛卵细胞的成熟培养：

[0050] ①屠宰3h之内的新鲜牛卵巢用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净的生理盐水#中,用20ml注射器17 针头抽取直径在2-8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘-卵母细胞复合体COCs；

[0051] ②把牛卵母细胞捡卵液与牛卵母细胞成熟液放在38.5℃，5%的二氧化碳培养箱中平衡1h以上，然后将拣出的卵丘-卵母细胞复合体COCs用平衡好的牛卵母细胞捡卵液洗一遍，再用牛卵母细胞成熟液洗两遍后，取一四孔板，每孔先加入500µl牛卵母细胞成熟液，再加入500µl石蜡油，按照每孔50-120枚的数目放入牛卵母细胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；

[0052] （２）体外受精：

[0053] ①取50ml烧杯两个，分别标记为A和B：A配制牛体外受精液BO-A液，B配制牛体外受精液BO-B液；配置好的牛体外受精液BO-A液和BO-B液分别用0.2μm滤器过滤到新的50ml烧杯中，均放入37.5℃恒温水浴锅中预热；

[0054] ②取牛、羊原精混合，加入5ml预热的牛体外受精液BO-A液，轻轻将混合精液混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml预热的牛体外受精液 BO-A液，轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，用预热的牛体外受精液BO-AB液将牛羊混合精子浓度稀释为1000万/ml；

[0055] ③用②处理好的精液在35mm皿中做100µl的精子滴，做好后加入石蜡油放入38.5℃，5%二氧化碳培养箱中；

[0056] ④打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出成熟22h的牛卵细胞，在预热的牛体外受精液BO-AB液中洗3次，将③中做好的精子滴从培养箱中拿出，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%二氧化碳培养箱中培养6h；

[0057] （３）受精卵的体外发育培养：

[0058] 受精6h后，用培养箱中预热的牛体外受精培养液IVC SOF液脱掉颗粒细胞，然后，把脱掉颗粒细胞的卵子放入预热的每孔含500µl牛体外受精培养液IVC SOF液，上盖500µl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养

[0059] 本发明的优点和有益效果是：它是利用异种动物不交叉受精的生殖隔离的受精生物学原理，把羊精混合到牛精中，进行牛卵子体外受精处理；通过羊精子推流作用促进低于正常受精所需的牛精子和卵子受精，达到制作牛胚胎的目的，实现了减少牛精子使用量，但能确保受精质量，在生产牛胚胎时可以通过添加羊精子同时减少牛精子数，但能保证牛卵子受精生产出更多的产品的目的。

具体实施方式

[0060] 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的保护范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。实施例中M-199购买于美国GIBICO公司,货号为11150；H-M199购买于美国GIBICO公司,货号为12340，其它没有特别指出的试剂均为市售产品。

[0061] 本发明中出现的英文缩写字母的解释如下：

[0062] FBS－胎牛血清；　　FSH－垂体分泌卵泡刺激素；　LH―黄体化激素； [0063] Glucose－葡萄糖；　Na Pyrucate－丙酮酸钠； SA-牛血清蛋白； [0064] stock－贮存液；　　NEAA－非必需氨基酸；　　　　EAA－必需氨基酸； [0065] P/S－青霉素/链霉素；Na-lactate-乳酸钠；　L-Glutamine-L-谷氨酰胺；　Sodium citrate-柠檬酸钠；　myo-Inositol-　肌醇；SOF－合成输卵管液； [0066] 实施例1：

[0067] 1、把屠宰场收集的3h之内的新鲜牛卵巢，用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净#的生理盐水中；用20ml注射器17 针头抽取直径在2-8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在
10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘-卵母细胞复合体COCs；将拣出的COCs放入在38.5℃的二氧化碳培养箱中平衡1h的洗卵液中洗一遍，成熟液中洗两遍，按照每孔50枚的数目放入每孔有含500µl成熟培养液上盖500µl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；

[0068] 2、取50ml烧杯2个，分别标记为A、B：A配制BO-A液40ml，B配制BO-B液6ml，配置好的BO-A液、BO-B液过滤到新的烧杯中，并放入37.5℃恒温水浴锅中预热； [0069] 3、取牛原精1000万放入15ml离心管中，加入预热的BO-A液5ml，将精子轻轻混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml BO-A液轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，加入1ml BO-AB液，将牛精子浓度稀释为1000万/ml,为纯牛组； [0070] 4、取牛、羊原精各500万放入15ml离心管中混合，加入预热的BO-A液5ml，轻轻将混合精液混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml BO-A液，轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min；弃掉上清后，加入1ml BO-AB液，将牛羊混合精子浓度稀释为1000万/ml，为牛：羊1:1混精组；

[0071] 5、取牛原精100万，羊原精900万一起放入15ml离心管中，加入预热的BO-A液6ml，轻轻将混合精液混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入6ml BO-A液，轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min；弃掉上清后，加入1ml BO-AB液，将牛羊混合精子浓度稀释为1000万/ml，为牛：羊1:9 混精组；

[0072] 6、用步骤3-5处理好的精液在35mm皿中做100µl的精子滴，做好后加入石蜡油，放入38.5℃，5%二氧化碳培养箱内；

[0073] 7、打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出成熟22h后的牛卵细胞，在预热的BO-AB混合液中洗3次，拿出步骤6做好的精子滴，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%CO2培养箱中培养6h；

[0074] 8、受精处理6h后，将受精卵从培养箱中拿出，用培养箱中预热的 IVC SOF液脱掉

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牛混合羊精液体外受精新方法

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