技术领域
[0001] 本
发明涉及
家畜胚胎工程技术领域，更具体的说是涉及一种牛体外受精的受精液及其使用方法。
背景技术
[0002] 家畜胚
胎体外培养是一项具有潜在研究价值和商用价值的技术，可广泛应用于胚胎体外移植、动物基因编辑育种及优良家畜品种扩增等方面。但至今体外培养获得的胚胎在
质量及数量上往往不及在体内正常发育的胚胎，在牛体外受精中，往往使用的是冷冻保存的精液，这导致了体外受精时精子的质量不稳定，浓度低，导致胚胎受精率不稳定，形成原核的受精卵少，进而影响原核融合和卵裂，影响早期胚胎体外发育，显著制约着此技术的广泛应用。
[0003] 因此，如何改善牛体外受精的受精液并建立一套稳定的使用方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明提供了一种牛体外受精的受精液及其使用方法，促进早期胚胎体外发育。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种牛体外受精的受精液，包括不含肌醇的SOF
基础培养基，还包括以下添加剂：L-精
氨酸、L-天冬氨酸、L-肉
碱、肾上腺素、青霉胺、亚牛磺酸、肝素。
[0007] 肝素是精子细胞化学活能物质，L-精氨酸、L-天冬氨酸、肾上腺素、亚牛磺酸和L-肉碱够较好的刺激精子细胞的体外活
力；青霉胺可促精子入卵，亚牛磺酸和L-肉碱能减缓细胞毒素乙
醛-过
氧化级联反应的最终物质，从而限制ROS的有害作用；L-精氨酸还有提高细胞活力，改善细胞形态的保护作用。
[0008] 七种添加剂添加到受精液中，可有效提高牛精子活力，提高牛体外受精时受精胚原核形成率和受精胚的发育质量。
[0009] 进一步，所述L-精氨酸的浓度为10-100mg/L，L-天冬氨酸的浓度为1-10mg/L，L-肉碱浓度为10-100μM，肾上腺素浓度为0.2-20μM，青霉胺浓度为2-200μM，亚牛磺酸浓度为1-100μM，肝素浓度为5-20mg/L。
[0010] 进一步，所述受精液还包括必需氨基酸、非必需氨基酸和无
脂肪酸牛血清
白蛋白。
[0011] 进一步，所述必需氨基酸体积分数为0.1-2％，非必需氨基酸体积分数为0.1-2％，无脂肪酸牛血清白蛋白浓度为1-100mg/mL。
[0012] 通过控制必需氨基酸、非必需氨基酸及无脂肪酸牛血清白蛋白可进一步提高牛胚胎体外发育质量。
[0013] 进一步，每100mL所述SOF基础培养基包括26.168mg CaCl2·2H2O、9.999mg C6H5Na3O7·2H2O、2.923mg谷氨酰胺、37.218mg MgSO4·7H2O、1.000mg酚红、53.378mg KCl、16.195mg KH2PO4、4.402mg丙
酮酸钠、210.025mgNaHCO3、629.399mgNaCl和0.0757mg乳酸钠。
[0014] 进一步，所述受精液还包括12μg/mL庆大霉素和12μg/mL头孢霉素。
[0015] 进一步，一种牛体外受精的受精液的使用方法，将成熟后牛卵母细胞置于
权利要求1-6中任一项所述的受精液中与精子进行共培养。
[0016] 进一步，一种牛体外受精的受精液的使用方法，将受精液预热至少2h，然后将牛精子与牛卵子放在受精液中，在CO2
培养箱中结合8-10h；然后再将牛受精卵加入胚胎培养液中，CO2N2培养箱中培养，于胚胎培养液培养后的第3天挑选出卵裂的胚胎，继续培养至第7-8天，未卵裂的丢弃。
[0017] 进一步，所述L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-肉碱、肾上腺素、青霉胺和亚牛磺酸，在预热前添加于不含肌醇的SOF基础培养基中，受精液上不
覆盖石
蜡油。
[0018] L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-肉碱、肾上腺素、青霉胺、亚牛磺酸、肝素加入受精液中，能够充分发挥其作为精子活力及环境培养作用因子的积极作用，高效率地获得牛体外受精卵，显著提高牛体外受精胚胎发育率、囊胚数及囊胚细胞数，大幅降低制备胚胎的生产成本。
[0019] 进一步，牛体外受精胚在38.5℃、5％CO2饱和湿度下培养。
[0020] 经由上述的技术方案可知，与
现有技术相比，本发明公开提供了一种牛体外受精的受精液及其使用方法，本发明受精液中添加有L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-肉碱、肾上腺素、青霉胺、亚牛磺酸、肝素，可有效保证牛胚胎体外受精率和受精胚胎的发育质量。
具体实施方式
[0021] 下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 实施例1
[0024] 庆大霉素、头孢霉素、无机盐、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-肉碱、肾上腺素、青霉胺、亚牛磺酸、肝素、
石蜡油(M8410)为sigma公司产品；
[0025] 无Hepes的M199基础培养液为Thermo公司产品；
[0026] 特级胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品；
[0027] 必需氨基酸为Thermo Fisher公司产品(货号1831512)；
[0028] 非必需氨基酸为Thermo Fisher公司产品(货号1958909)；
[0029] 无脂肪酸牛血清白蛋白EFAF-BSA为sigma公司产品(货号A6003-5G)；
[0030] 胰岛素-转
铁蛋白-硒添加剂ITS-G为Thermo Fisher公司产品(货号1865342，胰岛素1g/L，转铁蛋白0.55g/L，硒0.00067g/L)；
[0031] β-巯基
乙醇为Thermo Fisher公司产品(货号1922445)；
[0032] 亚牛磺酸为sigma公司产品(货号H1384)；
[0033] 1-油酰基-sn-甘油-3-
磷酸钠为Enzo Life Science公司产品(货号LP100-0025)；
[0034] 红景天苷为sigma公司产品(货号SMB00072-1MG)；
[0035] SOF基础培养基为自行配置；
[0036] 其他未标明的均为sigma公司产品。
[0037] a.卵母细胞体外成熟培养液
[0038] 无Hepes的M199基础培养液中添加10％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)ITS-G、0.075IU/mL HMG、1μg/mL 17β-雌二醇、10ng/mL EGF、12ng/mL bFGF和50ng/mL CXCL12。
[0039] b.SOF溶液、SOFaa溶液、mSOFaa溶液
[0040] SOF溶液：26.168mg CaCl2·2H2O、9.999mg C6H5Na3O7·2H2O、2.923mg谷氨酰胺、37.218mg MgSO4·7H2O、49.904mg肌醇、1.000mg酚红、53.378mg KCl、16.195mg KH2PO4、
4.402mg
丙酮酸钠、210.025mgNaHCO3、629.399mg NaCl、0.0757mg乳酸钠，去离子
水定容到
100mL，1mMNaOH调pH到7.2-7.4。
[0041] SOFaa溶液：以SOF溶液作为基础培养液，添加体积分数1％的必需氨基酸、体积分数1％的非必需氨基酸、6mg/mL无脂肪酸牛血清白蛋白、12g/mL庆大霉素和12μg/mL头孢霉素。
[0042] mSOFaa溶液(胚胎培养液)：以SOFaa溶液作为基础培养液，预热时添加体积分数为1％的ITS-G、55μMβ-巯基乙醇、2.5mM亚牛磺酸、0.4μg/mL1-油酰基-SN-甘油-3-磷酸钠盐和
0.1mM红景天苷，0.5mg/100mL的透明质酸，0.02mg/mL的L-瓜氨酸。
[0043] c.受精液(BO液)
[0044] BO液是以不含肌醇的SOFaa溶液作为基础培养液，还包含有63μg/mL L-精氨酸、6μg/mL L-天冬氨酸、50μM L-肉碱、2mM肾上腺素、20mM青霉胺、10mM亚牛磺酸、10μg/mL肝素。
[0045] (二)牛体外受精胚胎的制备方法
[0046] a.卵母细胞的成熟培养
[0047] 牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场(采集时间2015年1月至2017年12月)，将卵巢置于保温瓶内含200U/ml青霉素、0.2mg/ml
链霉素的20-25℃的生理盐水中，5h以内运回实验室。卵巢运回后，用灭菌
剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL
注射器抽取卵巢表面2-8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中，在实体
显微镜下收集卵丘-卵母细胞
复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)；收集后在含10％胎牛血清的PBS中清洗三遍。选择卵母细胞形态正常的COCs用于体外成熟培养(记为总卵母细胞数)。
[0048] 将选择的COCs在卵母细胞体外成熟培养液中洗两遍，然后移入装有3mL卵母细胞体外成熟培养液(提前在38.5℃培养箱平衡一小时)的3cm平皿中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养20-22h。将培养成熟的COCs用1000mL移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打至COCs周围只剩下紧密包裹的四到五层卵丘细胞时，在受精液(BO液)中洗2次，洗干净吹下的游离卵丘细胞，然后将紧密包裹四到五层卵丘细胞的卵母细胞移至受精液滴(提前放置到38.5℃培养箱中平衡2h以上)中。
[0049] b.精子的解冻、纯化、受精
[0050] 将冻精(西安市
奶牛中心，2015年9月采集)从液氮罐取出后，放置于37℃水浴解冻，离心管中做Percoll分层液。将2mL 90％Percoll液置于离心管底部，把2mL 45％Percoll液小心加到90％Percoll液面上，再将解冻后的精子置于45％Percoll液面上，1500rpm离心20min，小心吸取底部约100μL精液加入至含有卵母细胞的受精液中，放回培养箱内使精卵结合10h。
[0051] c.受精胚胎的培养
[0052] 处理组：于四孔板中添加mSOFaa溶液，每孔500μL，液面上覆盖500μL石蜡油，预先在38.5℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中平衡至少2h。
[0053] 受精完毕后用口吸管或者枪头吹去卵子周围的残存卵丘细胞和精子，获得假定受精的牛体外受精胚，置于四孔板的mSOFaa溶液中，每孔40枚左右，38.5℃、5％CO2、7％N2饱和湿度培养箱中培养72h，挑出未卵裂的受精胚，放回培养箱继续培养至第八天(192h)。
[0054] 对照组1用含10ug/ml的肝素的SOF溶液培养受精。
[0055] 观察并记录各组极体排出和原核形成情况，试验结果如表1所示。
[0056] 表1
[0057]
[0058] 表1结果表明，使用本发明的受精液进行牛体外受精，得到的正常原核状态的胚胎数目显著多于通用BO受精液。
[0059] 观察并记录各组发育情况，试验结果如表2所示。
[0060] 表2
[0061]
[0062] a、b上标不同表示显著，显著性使用卡方检验来检测；AB级囊胚为可移植囊胚，C级为不推荐移植囊胚，囊胚ABC分级是根据国际胚胎移植协会的囊胚质量评分标准来评定。
[0063] 表2结果表明，使用本发明的受精液进行牛体外受精，得到的可移植胚胎数目显著多于通用BO受精液。
[0064] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种
修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
