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可溶性糖胺聚糖酶及制备和应用可溶性糖胺聚糖酶的方法

阅读：914发布：2021-02-14

专利汇可以提供可溶性糖胺聚糖酶及制备和应用可溶性糖胺聚糖酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及发现新的可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGPs)、制备方法，和它们帮助其他分子的 给药 或者缓解糖胺聚糖相关的病理的用途。描述了可溶性中性活性sHASEGP结构域的最小化的活性多肽结构域，其包括对于功能性的中性活性透明质酸酶结构域而言所必需的天冬酰胺－连接的糖部分。包括了经修饰的可增强sHASEGP的分泌的 氨 基末端前导肽。本发明进一步包括重组sHASEGP的唾液 酸化 和 聚乙二醇化 形式，以增强其 稳定性 和血清药物动 力 学，使其优于天然发生的来自屠宰场的酶。进一步描述了基本上纯的重组sHASEGP糖蛋白的合适制剂，所述的重组sHASEGP糖蛋白来自于可产生适当的糖基化作用的真核细胞，所述糖基化对于所述蛋白的最佳活性是必需的。，下面是可溶性糖胺聚糖酶及制备和应用可溶性糖胺聚糖酶的方法专利的具体信息内容。

1.基本上纯化的糖蛋白，其包含具有中性活性的可溶性透明质酸酶多肽和至少一 个N-连接糖部分，其中所述N-连接糖部分共价连接于所述多肽的天冬酰胺残基上。
2.权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽选自：
(a)包含由如此序列编码的氨基酸序列的多肽，所述序列具有与SEQ ID NO.1 中所示的氨基酸序列至少约74％氨基酸序列同一性；
(b)包含由SEQ ID NO.6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽；
(c)包含由如此核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽，所述核苷酸序列在高严 格性条件下沿着它全长的至少85％，与SEQ ID NO.6中所示的核苷酸序列杂交； 或
(d)由如此核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列是包含SEQ ID NO.50中 所示的序列的核苷酸序列剪接变体。
3.权利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分被共价连接到天冬酰胺残基上，所 述天冬酰胺残基选自SEQ ID NO.1中所列的氨基酸82、166、235、254、368、393 或490。
4.权利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分是通过PNGase敏感性键被共价连 接到所述的多肽上。
5.权利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分是高甘露糖型。
6.权利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分是复合型。
7.权利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分是杂合型。
8.权利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分进一步包括至少一个以唾液酸为末 端的糖部分。
9.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽基本上由人透明质酸酶糖蛋白 (sHASEGP)的透明质酸酶结构域或其催化活性部分组成。
10.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的透明质酸酶部分包括sHASEGP的透 明质酸酶结构域或其催化活性部分。
11.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽被聚合物修饰。
12.权利要求11所述的多肽，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。
13.多肽，其基本上由人透明质酸酶蛋白的透明质酸酶结构域或其催化活性部分组 成。
14.权利要求13所述的多肽，其中所述透明质酸酶是超唾液酸化的。
15.权利要求13所述的多肽，其中所述透明质酸酶结构域包括SEQ ID NO.3的氨 基酸1-450所示的氨基酸序列。
16.权利要求13所述的多肽，其中所述透明质酸酶结构域包括SEQ ID NO.3的氨 基酸1-438所示的氨基酸序列。
17.权利要求13所述的多肽，其中所述透明质酸酶结构域包括SEQ ID NO.3的氨 基酸1-459所示的氨基酸序列。
18.权利要求13所述的多肽，其中所述多肽被聚合物修饰。
19.权利要求18所述的多肽，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。
20.权利要求1所述的多肽，其中所述sHASEGP是人多肽。
21.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.4所示的可溶性多肽。
22.权利要求1所述的多肽，其中能够将所述多肽引导出所述细胞的信号序列被可 操作地连接到所述sHASEGP多肽。
23.分离的可溶性人透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，其中所述sHASEGP的效价大 于40,000 USP单位/mg蛋白。
24.权利要求23所述的sHASEGP，其中所述透明质酸酶是唾液酸化的。
25.权利要求23所述的sHASEGP，其中所述蛋白被聚合物修饰。
26.权利要求25所述的sHASEGP，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。
27.核酸分子，其编码权利要求1所述的多肽。
28.核酸分子，其包括选自下列的序列：
(a)SEQ ID NO.6中所述的序列；
(b)在高严格性条件下，沿全长的至少约70％，与SEQ ID NO.6中所述的核苷 酸序列杂交的序列；
(c)编码SEQ ID No.1、3、4、5和50中所述的多肽的核苷酸序列；
(d)为(a)、(b)或(c)的剪接变体的序列；
(e)编码透明质酸酶结构域或其催化活性部分的序列，其包括与SEQ ID No.6 或50中所述的序列具有至少约60％序列同一性的核苷酸序列；和
(f)包括(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的简并密码子的序列。
29.载体，其具有SEQ ID NO：51所述的序列。
30.载体，其包含权利要求27所述的核酸分子。
31.分离的细胞，其包含权利要求30所述的载体。
32.权利要求31所述的细胞，其为哺乳动物细胞。
33.抗体，其结合于权利要求1所述的sHASEGP，其中所述的抗体对牛、羊或细 菌透明质酸酶无反应活性。
34.转基因非人动物，其中编码权利要求1的多肽的内源性基因已通过该动物或其 祖先的同源重组或者插入诱变而被破坏。
35.用于产生含有sHASEGP的可溶性多肽的方法，包括：
将被可操作地连接于启动子的、SEQ ID NO.6中所述的核酸导入细胞中，所述 细胞可将N-连接的糖部分整合到sHASEGP中；
在被编码的多肽被所述细胞表达的条件下培养所述细胞；和
回收所述被表达的多肽。
36.用于产生含有sHASEGP的可溶性多肽的方法，其包括：
将被可操作地连接于合适启动子的、编码权利要求1所述多肽的核酸导入细胞 中，所述细胞能够将N-连接的糖部分整合到sHASEGP中；在所述被编码的多肽 被所述细胞表达的条件下培养所述细胞；和回收所述表达的多肽。
37.用于产生含有sHASEGP的可溶性多肽的方法，其包括：
在被编码的多肽被细胞表达的条件下，培养权利要求31所述的细胞；和
回收所述表达的多肽。
38.离体基因治疗的方法，包括：
在体外，将可操作地连接于合适启动子的、编码权利要求1所述多肽的核酸导 入细胞中，所述细胞能够将N-连接糖部分整合到sHASEGP中；从而产生含有所 述核酸的遗传修饰的细胞；和将含有所述核酸的细胞施用到所述对象，从而编码 所述sHASEGP的所述核酸被转移到所述对象。
39.制备用于体外受精的哺乳动物卵母细胞的方法，所述的方法包括：
将卵母细胞与一定数量的权利要求1的sHASEGP接触，所述数量足以去除卵 丘基质。
40.权利要求39所述的方法，其中所述卵丘被有效地去除，而不需使用窄孔移液 管对所述卵母细胞进行操作。
41.用于产生sHASEGP多肽的方法，包括：
将权利要求1所述多肽与糖基转移酶接触，所述糖基转移酶能够将所述N-连 接糖部分引入多肽，从而产生sHASEGP。
42.组合物，包含基本上纯的sHASEGP糖蛋白多肽和合适的药物载体。
43.组合物，包含权利要求1所述多肽和合适的药物载体。
44.用于治疗具有过量的sHASEGP底物的对象的方法，包括：
施用一定数量的权利要求1的sHASEGP多肽，所述数量足以去除所述的 sHASEGP底物。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的过量的底物由瘢痕组织产生。
46.权利要求45所述的方法，其中所述的瘢痕组织是由脊髓损伤引起的神经胶质 瘢痕。
47.权利要求45所述的方法，其中所述的瘢痕组织是瘢痕瘤瘢痕。
48.用于增加直径小于约0.5微米的治疗物质或其它分子或大分子复合物(每一种 都为药剂)在对象中的扩散的方法，包括：
施用给对象sHASEGP多肽和药剂，所述sHASEGP多肽的量足以打开或形成 直径小于约0.5微米的通道，从而增加所述药剂的扩散。
49.权利要求48所述的方法，其中所述的sHASEGP多肽以0.1至1500单位之间 的剂量被注射。
50.权利要求48所述的方法，其中所述的sHASEGP多肽在注射之前与所述治疗 物质或其它药剂混合。
51.试剂盒，包含：
(a)在可接受的载体中的、剂量在0.1至1500单位/ml之间的sHASEGP多肽；
(b)在可接受的载体中的至少一种治疗物质或其它分子或大分子复合物(每一 种都为药剂)；和
(c)任选地，递送治疗物质和其它药剂的说明书。
52.权利要求51所述的试剂盒，其中所述sHASEGP多肽和所述治疗物质或其它 药剂以混合物的形式提供。
53.治疗心血管紊乱的方法，包括：
以足以去除过量糖胺聚糖的量，施用给对象权利要求1的sHASEGP多肽。
54.权利要求53所述的方法，其中所述的心血管紊乱选自心肌梗塞、充血性心力 衰竭或动脉硬化。
55.治疗肿瘤的方法，包括：
以足以去除过量糖胺聚糖的用量，施用给对象权利要求1的sHASEGP多肽。
56.将分子输送到含有过量糖胺聚糖的组织的方法，包括：将权利要求1的 sHASEGP多肽施用给组织，所施用的量足以充分降解糖胺聚糖，以打开直径小于 约500nm的通道；和将分子施用给包含所述降解的糖胺聚糖的组织。
57.权利要求56所述的方法，其中所述多肽用聚合物修饰。
58.权利要求57所述的方法，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。
59.权利要求56所述的方法，其中所述sHASEGP多肽在施用所述分子之前、同 时或之后被施用。
60.药物组合物，包含权利要求1的基本上纯化的可溶性透明质酸酶糖蛋白 (sHASEGP)多肽和药物载体。
61.药物组合物，包含权利要求1所述的基本上纯化的sHASEGP多肽。
62.权利要求60所述的药物组合物，进一步包含药物活性剂或药理剂。
63.权利要求62所述的药物组合物，其中所述药物活性剂或药理剂选自：化疗剂、 止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟 疾剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄 生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀 生物剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避 孕药剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激 素、高血糖药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋 剂、镇定剂、促睡眠剂、拟交感神经药、安定剂、泌尿剂、阴道用药剂、杀病毒 剂、维生素药剂、非类固醇抗炎药剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白质、 核酸、药物或有机分子。
64.组合物，包括，
无菌小瓶和权利要求60所述的药物组合物，其中所述组合物被包含于所述小 瓶中。
65.试剂盒，包括权利要求64所述的组合物和下列中的至少一种：
(a)包装材料；或
(b)使用所述试剂盒来应用所述药物组合物的说明书。
66.组合物，包括，
含有权利要求60所述的药物组合物的无菌注射器。
67.组合物，包括，
含有权利要求62所述的药物组合物的无菌注射器。
68.权利要求67所述的组合物，进一步包括含有药物学上有效的试剂的第二注射 器。
69.权利要求67所述的组合物，其中所述药物学上有效的试剂或药理剂选自：化 疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、 抗疟疾剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、 抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、 杀生物剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、 避孕药剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、 激素、高血糖药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴 奋剂、镇定剂、促睡眠剂、拟交感神经药、安定剂、泌尿剂、阴道用药剂、杀病 毒剂、维生素药剂、非类固醇抗炎药剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白 质、核酸、药物或有机分子。
70.权利要求68所述的组合物，其中所述第二注射器包括粘弹剂。
71.试剂盒，包括权利要求67所述的组合物和下列中的一种或多种：
(a)包装材料；和
(b)使用所述试剂盒来应用所述药物组合物的说明书。
72.用于治疗糖胺聚糖的病理性积聚的方法，包括
以足以改善或降低积聚的糖胺聚糖的量，施用重组sHASEGP，其中所述的 sHASEGP无牛、羊或细菌酶。
73.权利要求72所述的方法，其中所述积聚选自心血管积聚、脑积聚、箝顿包茎、 粘液性水肿、苔藓性粘液水肿和淋巴水肿。
74.促进坏死组织的血管再生的方法，包括以足以在所述的坏死组织中诱导新血管 生长的量，施用重组sHASEGP。
75.从玻璃体液中去除糖胺聚糖的方法，包括；
施用sHASEGP。
76.用于产生基本上纯化的中性活性的可溶性透明质酸酶多肽和至少一个N-连接 糖部分的方法，其中所述N-连接糖部分被共价连接到所述多肽的天冬酰胺残基上， 包括：在适合于产生所述多肽的条件下，在存在0.1-1mM丁酸钠的条件下，在合 适的生长培养基中培养中国仓鼠卵巢细胞。
77.用于纯化sHASEGP的方法，所述的方法包括：在低离子强度下将含有 sHASEGP的培养基与阴离子交换树脂在中性pH下接触，用约400mM的盐洗脱 所述的sHASEGP；将所述的sHASEGP在约0.5M硫酸铵存在的条件下与疏水相 互作用层析树脂接触；将硫酸铵中的所述sHASEGP与苯基硼酸树脂接触；在低盐、 中性pH下洗脱所述的sHASEGP；将所述的sHASEGP与羟磷灰石树脂接触，用 约100mM磷酸钠洗脱所述的sHASEGP，从而产生sHASEGP，其中所述的 sHASEGP基本上被纯化。
78.诱导玻璃体液液化以治疗哺乳动物眼障碍的方法，包括将所述玻璃体液与一定 量的权利要求1的蛋白接触，所述蛋白的量足以有效液化所述的玻璃体液，从而 治疗所述障碍。
79.降低在对象的眼内的眼内压的方法，包括将人sHASEGP施用给需要其的对象， 所述人sHASEGP的特征为：
基本上无牛、羊或细菌酶；
大于约40,000 USP单位/mg蛋白；和
由此降低所述对象的眼内压。
80.促进将sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)输送到哺乳动物的第一组织 的方法，包括将一定体积的包含所述GAG酶的液体引入所述第一组织，并且使所 述体积的液体和所述GAG酶的催化活性去促进所述GAG酶进入所述组织。
81.权利要求80所述的方法，其中所述体积的液体在引入所述体积的液体的位置 或靠近引入所述体积的液体的位置足以引起所述第一组织的局部膨胀。
82.权利要求80所述的方法，进一步包括将一种或多种另外的药理剂或其它药剂 (A-X)导入所述第一组织。
83.权利要求82所述的方法，其中A-X选自可检测到的分子或其它诊断试剂、麻 醉剂或其它组织改性剂、药理剂或制药学上有效的试剂，以及整形试剂或其它美 容化妆试剂。
84.权利要求82所述的方法，其中A-X是药理剂或制药学上有效的试剂。
85.权利要求82所述的方法，其中A-X选自化疗剂或抗癌剂、止痛剂、抗炎剂、 抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗痉挛剂、 抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、 α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀菌剂、抑 菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕药剂、整形或美容 化妆剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激 素、高血糖药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋 剂、镇定剂、促睡眠剂、拟交感神经药、安定剂、泌尿剂、阴道用药剂、杀病毒 剂、维生素药剂、非类固醇抗炎药剂或血管紧张素转化酶抑制剂。
86.权利要求82所述的方法，其中A-X选自阿达木单抗(例如HUMIRATM)、β-半 乳糖苷酶(例如FABRAZYMETM)、阿地白介素(例如PROLEUKINTM IL-2)、阿法赛 特(例如AMEVIVETM)、氨苄青霉素(例如UNASYNTM注射剂)、阿那白滞素(例如 KINERETTM)、抗脊髓灰质炎疫苗(例如PEDIARIXTM)、抗胸腺细胞(例如 THYMOGLOBULINTM)、阿奇霉素(例如ZITHROMAXTM IV)、贝卡普勒明(例如 REGRANEXTM)、卡泊芬净(例如CANCIDASTM)、头孢唑啉(例如ANCEFTM和 CEFAZOLINTM)、头孢吡肟(例如MAXIPIMETM)、头孢替坦(例如CEFOTANTM)、 头孢他啶(例如FORTAZTM)、头孢曲松(例如ROCEFINTM)、西妥昔单抗(例如 ERBITUXTM)、西司他丁(例如PRIMAXINTM IV)、克拉维酸(例如，与阿莫西林联 合，诸如AUGMENTINTM)、克林霉素(例如CLEOCINTM)、α-达贝泊汀(例如 ARANESpTM)、Deaclizumabs(例如ZENAPAXTM)、白喉类毒素(一般为药物联合， 例如DAPTACELTM、INFANRIXTM和PEDIARIXTM)、依法利珠单抗(例如 RAPTIVATM)、肾上腺素(例如EPIPENTM)、α-促红细胞生成素(例如EPOGENTM和 PROCRITTM)、依那西普(例如ENBRELTM)、非格司亭(例如NEUPOGENTM)、氟康 唑(例如DIFLUCANTM注射剂)、促滤泡素例如α-促滤泡素(例如GONAL-FTM)和β- 促滤泡素(例如FOLLISTIMTM)、磷苯妥英(例如CEREBYXTM)、氟康唑(例如 DIFLUCANTM)、钆双胺(例如OMNISCANTM)、钆喷酸(例如MAGNEVISTTM)、加 替沙星(例如TEQUINTM)、格拉默(例如COPAXONETM)、GM-CSF’s(例如 LEUKINETM)、戈舍瑞林(例如ZOLADEXTM)、格拉司琼(例如KYTRILTM)、流感 嗜血杆菌B’s(例如COMVAXTM和HibTITERTM)、氟哌啶醇(例如HALDOLTM)、甲 型肝炎疫苗(例如HAVRIXTM、TWINRIXTM和VAQTATM)、乙型肝炎疫苗(例如重组 体COMVAXTM、ENGERIXTM-B、RECOMBIVAXTM-HB、TWINRIXTM，和非重组 体BAYHEPTM-B和NABIM-HB)、替伊莫单抗(例如ZEVALINTM)、免疫球蛋白(包 括免疫球蛋白的混合物，如GAMMAGARDTM和类似物，以及各种纯化的免疫球 蛋白中的任意种)、流感病毒疫苗(例如FLUMISTTM)、英利昔单抗(例如 REMICADETM)、胰岛素(例如HUMALOGTM、HUMALOGTM MIX 75/25TM、 HUMULINTM产品(包括50/50、70/30、Regular、NPH、Ultra和Ultralente)，和 NOVOLINTM)、甘精胰岛素(例如LANTUSTM)、干扰素α-2a(ROFERANTM-A)、干 扰素α-2b(例如INTRON-ATM)、复合α干扰素(例如INFERGENTM)、干扰素α-n3 (例 如ALFERON NTM)、干扰素β(例如BETASERONTM和BETAFERONTM)、干扰素β-1a (例如AVONEXTM和REBIFTM)、干扰素γ(例如ACTIMMUNETM)、碘克沙醇(例如 VISIPAQUETM)、碘海醇(OMNIPAQUETM)、碘帕醇、碘佛醇(例如OPTIRAYTM)、 酮咯酸(例如TORADOLTM)、艾杜糖醛酸水解酶(例如ALDURAZYMETM)、左氧氟 沙星(例如LEVAQUINTM)、利多卡因、利奈唑酮(例如ZYVOXTM)、劳拉西泮(例如 ATIVANTM)、麻疹疫苗(例如ATTENUVAXTM)、麻疹-腮腺炎-风疹病毒疫苗(例如 M-M-RTM II)、甲羟孕酮(例如DEPO-PROVERATM)、美洛培南(例如MERREMTM IV)、甲基强的松龙(例如SOLU-MEDROLTM)、咪达唑仑(例如VERSEDTM)、吗啡(例 如ASTRAMORPH/PFTM)、奥曲肽(例如SANDOSTATINTM)、奥马佐单抗(例如 XOLAIRTM)、昂丹司琼(例如ZOFRANTM)、帕利珠单抗(例如SYNAGISTM)、泮托 拉唑(例如PROTONIXTM)、培门冬酶(例如ONCASPARTM)、聚乙二醇化非格司亭(例 如NEULASTATM)、聚乙二醇化干扰素α-2a(例如PEGASYSTM)、聚乙二醇化干扰 素α-2b(例如PEG-INTRONTM)、培维索孟(例如SOMAVERTTM)、百日咳疫苗、哌 拉西林(例如ZOSYNTM)、肺炎球菌疫苗(例如PNEUMOVAXTM 23)和肺炎球菌组合 疫苗(例如PREVNARTM)、异丙嗪(例如PHENERGANTM)、瑞替普酶(例如 RETAVASETM)、生长激素(例如GENOTROPINTM、HUMATROPETM、 NORDITROPINTM、NUTROPINTM、SAIZENTM、SEROSTIMTM、ZORBTIVETM)、 舒巴坦、舒马曲坦(例如IMITREXTM)、他左巴坦、替奈普酶(例如TNKASETM)、精 制破伤风类毒素、替卡西林(例如TIMENTINTM)、托西莫单抗(例如BEXXARTM)、 曲安奈德、万古霉素(例如VANCOCINTM)、水痘疫苗(例如VARIVAXTM)和其它疫 苗。
87.权利要求82所述的方法，其中A-X是选自下列的抗生素药剂或药剂的组合： 氨基苷类抗生素；酰胺醇；袢霉素；碳头孢烯；碳青霉烯；头孢菌素或头孢烯； 头霉素；克拉维烷；环式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮内酯类；林可胺类药物；大环 内酯类；单环内酰胺；硝基呋喃；氧头孢烯；唑烷酮；青霉烯、硫霉素和β-内 酰胺类；青霉素；多肽抗生素；喹诺酮；氨磺酰；砜；四环素；和其它抗生素(例 如氯福克酚、梭链孢酸、海克西定、六胺、呋喃妥因、硝羟喹啉、利替培南、牛 磺罗定、Xibomols)。
88.权利要求80所述的方法，其中所述GAG酶是sHASEGP。
89.权利要求88所述的方法，其中所述sHASEGP是人sHASEGP。
90.权利要求89所述的方法，其中所述人sHASEGP是PH20 sHASEGP。
91.权利要求90所述的方法，其中所述sHASEGP是SEQ ID NO.4所示的可溶性 多肽。
92.权利要求88所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的或超唾液酸化 的sHASEGP。
93.权利要求91所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的人PH20 sHASEGP。
94.增加哺乳动物的靶组织的渗透性的方法，包括将sHASEGP引入所述组织。
95.权利要求94所述的方法，其中通过将所述sHASEGP注射入所述组织或附近 组织，将所述sHASEGP引入所述组织。
96.权利要求94所述的方法，其中通过预先将所述sHASEGP引入供应所述组织 的血流，将所述sHASEGP引入所述组织。
97.权利要求96所述的方法，其中所述的预先引入血流是通过静脉内注射或输注 所述sHASEGP来介导。
98.权利要求96所述的方法，其中所述的预先引入血流是通过将所述sHASEGP 非静脉内肠胃外给药来介导。
99.权利要求94所述的方法，进一步包括将A-X引入所述组织。
100.权利要求99所述的方法，其中A-X通过注射入所述组织或附近组织被引入 所述组织。
101.权利要求99所述的方法，其中通过预先将PH20引入供应所述组织的血流， 将A-X引入所述组织。
102.权利要求101所述的方法，其中所述的预先引入血流是通过静脉内注射或输 注所述分子或大分子复合物来介导。
103.权利要求101所述的方法，其中所述的预先引入血流是通过将所述分子或大 分子复合物非静脉内肠胃外给药来介导。
104.权利要求99所述的方法，其中所述将A-X引入所述组织的步骤在所述将所 述sHASEGP引入所述组织的步骤之后的3小时内开始。
105.权利要求99所述的方法，其中所述将A-X引入所述组织的步骤在所述将所 述sHASEGP引入所述第一组织的步骤之后的12小时内开始。
106.权利要求99所述的方法，其中A-X是选自小分子、蛋白质和核酸的分子。
107.权利要求99所述的方法，其中A-X是大分子复合物，其包含选自小分子、 蛋白质、核酸、脂类和两亲性分子的分子的组合。
108.权利要求99所述的方法，其中A-X选自可检测到的分子或其它诊断试剂、 麻醉剂或其它组织改性剂、药理剂或制药学上有效的试剂，以及整形试剂或其它 美容化妆试剂。
109.权利要求99所述的方法，其中A-X是药理剂或制药学上有效的试剂。
110.权利要求99所述的方法，其中A-X选自化疗剂或抗癌剂、止痛剂、抗炎剂、 抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗痉挛剂、 抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、 α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀菌剂、抑 菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕药剂、整形或美容 化妆剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激 素、高血糖药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋 剂、镇定剂、促睡眠剂、拟交感神经药、安定剂、泌尿剂、阴道用药剂、杀病毒 剂、维生素药剂、非类固醇抗炎药剂或血管紧张素转化酶抑制剂。
111.权利要求99所述的方法，其中A-X是选自下列的抗癌剂或抗癌剂的组合： 阿克拉霉素、放线菌素、阿霉素、安西他滨、氨曲霉素、阿扎胞苷、氮丝氨酸、 6-氮尿苷、双蒽生、博来霉素、放线菌素C、卡莫氟、卡莫司汀、卡柔比星、嗜癌 素、色霉素、顺铂、克拉立滨、阿糖胞苷、放线菌素D、柔红霉素、二甲叶酸、 6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、去氧氟尿苷、多柔比星、依达曲沙、乙嘧替氟、依诺 他滨、Fepirubicins、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊达比星、Loxuridines、美 诺立尔、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄 霉素、培洛霉素、吡柔比星、吡曲克辛、普卡霉素、泊非霉素、蝶罗呤、嘌罗霉 素、维生素A酸、链黑霉素、链脲菌素、呋喃脲嘧啶、他莫昔芬、硫唑嘌呤胺、 硫鸟嘌呤、曲安西龙、三甲曲沙、杀结核菌素、长春碱、长春新碱、净司他丁和 佐柔比星。
112.权利要求99所述的方法，其中A-X是具有抗癌活性或化学治疗活性的抗体 或其它蛋白质。
113.权利要求99所述的方法，其中A-X是选自下列的抗生素药剂或药剂的组合： 氨基苷类抗生素；酰胺醇；袢霉素；碳头孢烯；碳青霉烯；头孢菌素或头孢烯； 头霉素；克拉维烷；环式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮内酯类；林可胺类药物；大环 内酯类；单环内酰胺；硝基呋喃；氧头孢烯；唑烷酮；青霉烯、硫霉素和β-内 酰胺类；青霉素；多肽抗生素：喹诺酮；氨磺酰；砜；四环素；和其它抗生素(例 如氯福克酚、梭链孢酸、海克西定、六胺、呋喃妥因、硝羟喹啉、利替培南、牛 磺罗定、Xibomols)。
114.权利要求94所述的方法，其中所述sHASEGP是人sHASEGP。
115.权利要求114所述的方法，其中所述人sHASEGP是PH20 sHASEGP。
116.权利要求115所述的方法，其中所述sHASEGP是SEQ ID NO.4所示的可溶 性多肽。
117.权利要求94所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的或超唾液酸化 的sHASEGP。
118.权利要求116所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的人PH20 sHASEGP。
119.缓解哺乳动物中风或其它CNS损伤的后果的方法，包括将sHASEGP引入所 述中风或CNS损伤之后的哺乳动物。
120.权利要求12或19的任何一项所述的多肽，其中所述聚合物是PEG。
121.权利要求120所述的多肽，其中所述多肽每一个多肽包含至少约3个PEG部 分。
122.权利要求120所述的多肽，其中所述的PEG部分是分支的。
123.权利要求120所述的多肽，其中所述的PEG部分选自mPEG-SBA(5kDa)、 mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB (30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、 mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa 分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、 PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。
124.制备聚乙二醇化的多肽的方法，包括使权利要求12或19中的任一项的多肽 与摩尔过量的选自下列的PEG试剂反应：PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯、PEG-琥珀酰亚 胺甲基丁酸酯、PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯、PEG-N-羟基琥珀酰亚胺、PEG-醛、PEG- 碳酸酯、PEG-丙醛和PEG-马来酰亚胺。
125.权利要求124所述的方法，其中所述PEG试剂选自：mPEG-SBA(5kDa)、 mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB (30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、 mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa 分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、 PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。
126.聚乙二醇化的多肽，其根据权利要求124所述方法生产。
127.聚乙二醇化的多肽，其根据权利要求125所述方法生产。
128.聚乙二醇化的透明质酸酶，其中所述透明质酸酶每个多肽包括至少约3个PEG 部分。
129.权利要求128所述的透明质酸酶，其中所述的PEG部分是分支的。
130.权利要求128所述的透明质酸酶，其中所述的PEG部分选自mPEG-SBA (5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、 mPEG-SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA (30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS (40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰 化的)、PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。
131.权利要求128所述的透明质酸酶，其中所述透明质酸酶是聚乙二醇化的 sHASEGP。
132.权利要求128所述的透明质酸酶，其中所述透明质酸酶是聚乙二醇化的 rHuPH20。
133.权利要求128所述的透明质酸酶，其中所述透明质酸酶是聚乙二醇化的动物 来源或细菌来源的透明质酸酶。
134.制备聚乙二醇化的透明质酸酶的方法，包括使透明质酸酶与摩尔过量的选自 下列的PEG试剂反应：PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯、PEG-琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、PEG- 琥珀酰亚胺丙酸酯、PEG-N-羟基琥珀酰亚胺、PEG-醛、PEG-碳酸酯、PEG-丙醛 和PEG-马来酰亚胺。
135.权利要求134所述的方法，其中所述PEG试剂选自mPEG-SBA(5kDa)、 mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB (30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA (30kDa)、 mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa 分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、 PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。
136.聚乙二醇化的透明质酸酶，其根据权利要求134所述方法生产。
137.聚乙二醇化的透明质酸酶，其根据权利要求135所述方法生产。
138.将分子输送到含过量糖胺聚糖的组织的方法，包括：将权利要求128的聚乙 二醇化的透明质酸酶以如此量施用到组织，所述量足以充分降解糖胺聚糖，以打 开直径在大约500nm以下的通道；和将分子施用到包含所述降解的糖胺聚糖的组 织。
139.药物组合物，包括权利要求128的聚乙二醇化的透明质酸酶和药物学载体。
140.用于增加直径小于约0.5微米的治疗物质或其它分子或大分子复合物(各种 药剂)在对象中的扩散的方法，包括：
施用给对象权利要求128的聚乙二醇化的透明质酸酶和药剂，所述聚乙二醇化 的透明质酸酶的量足以打开或形成直径小于约0.5微米的通道，从而增加所述药剂 的扩散。
141.权利要求140所述的方法，其中所述药剂选自化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗 微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗痉挛剂、抗 抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α- 肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀菌剂、抑菌 剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕药剂、解充血药剂、 利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激素、高血糖药剂、肌松 弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋剂、镇定剂、促睡眠剂、 拟交感神经药、安定剂、泌尿剂、阴道用药剂、杀病毒剂、维生素药剂、非类固 醇抗炎药剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白质、核酸、药物或有机分子。
142.试剂盒，包括：
(a)在可接受的载体中的、剂量在0.1至1500单位/ml之间的权利要求128的 聚乙二醇化的透明质酸酶；
(b)在可接受的载体中的至少一种治疗物质或其它分子或大分子复合物(每一 种都为药剂)：和
(c)可选地，输送治疗物质或其它药剂的说明书。
143.从玻璃体液去除糖胺聚糖的方法，包括：
施用权利要求128的聚乙二醇化的透明质酸酶。
144.诱导玻璃体液液化以治疗哺乳动物眼障碍的方法，包括将所述玻璃体液与一 定量的权利要求128的聚乙二醇化的透明质酸酶接触，所述聚乙二醇化的透明质 酸酶的量足以有效液化所述的玻璃体液，从而治疗所述障碍。
145.缓解哺乳动物中风或其它CNS损伤的后果的方法，包括将权利要求128的 聚乙二醇化的透明质酸酶引入所述中风或CNS损伤之后的哺乳动物。
146.将一种或多种药理剂或其它药剂(A-X)引入机体的组织的方法，包括在施 用所述的药剂之前或同时，将权利要求128的聚乙二醇化的透明质酸酶施用到所 述的组织。
147.权利要求146所述的方法，其中A-X选自可检测到的分子或其它诊断试剂、 麻醉剂或其它组织修饰剂、药理剂或药物学上有效的试剂、和整型或其它美容化 妆试剂。
148.权利要求146所述的方法，其中A-X是抗癌药或抗感染药。
149.权利要求146所述的方法，其中A-X是修饰血液的药理剂。
150.权利要求146所述的方法，其中A-X是直径约20nm到200nm之间的分子或 大分子复合物。
151.权利要求146所述的方法，其中A-X选自阿达木单抗(例如HUMIRATM)、β- 半乳糖苷酶(例如FABRAZYMETM)、阿地白介素(PROLEUKINTM IL-2)、阿法赛特 (例如AMEVIVETM)、氨苄青霉素(例如UNASYNTM注射剂)、阿那白滞素(例如 KINERETTM)、抗脊髓灰质炎疫苗(例如PEDIARIXTM)、抗胸腺细胞(例如 THYMOGLOBULINTM)、阿奇霉素(例如ZITHROMAXTM IV)、贝卡普勒明(例如 REGRANEXTM)、卡泊芬净(例如CANCIDASTM)、头孢唑啉(例如ANCEFTM和 CEFAZOLINTM)、头孢吡肟(例如MAXIPIMETM)、头孢替坦(例如CEFOTANTM)、 头孢他啶(例如FORTAZTM)、头孢曲松(例如ROCEFINTM)、西妥昔单抗(例如 ERBITUXTM)、西司他丁(例如PRIMAXINTM IV)、克拉维酸(例如，与阿莫西林联 合，诸如AUGMENTINTM)、克林霉素(例如CLEOCINTM)、α-达贝泊汀(例如 ARANESPTM)、Deaclizumabs(例如ZENAPAXTM)、白喉类毒素(一般为药物联合， 例如DAPTACELTM、INFANRIXTM和PEDIARIXTM)、依法利珠单抗(例如 RAPTIVATM)、肾上腺素(例如EPIPENTM)、α-促红细胞生成素(例如EPOGENTM和 PROCRITTM)、依那西普(例如ENBRELTM)、非格司亭(例如NEUPOGENTM)、氟康 唑(例如DIFLUCANTM注射剂)、促滤泡素例如α-促滤泡素(例如GONAL-FTM)和β- 促滤泡素(例如FOLLISTIMTM)、磷苯妥英(例如CEREBYXTM)、氟康唑(例如 DIFLUCANTM)、钆双胺(例如OMNISCANTM)、钆喷酸(例如MAGNEVISTTM)、加 替沙星(例如TEQUINTM)、格拉默(例如COPAXONETM)、GM-CSF’s(例如 LEUKINETM)、戈舍瑞林(例如ZOLADEXTM)、格拉司琼(例如KYTRILTM)、流感 嗜血杆菌B’s(例如COMVAXTM和HibTITERTM)、氟哌啶醇(例如HALDOLTM)、甲 型肝炎疫苗(例如HAVRIXTM、TWINRIXTM和VAQTATM)、乙型肝炎疫苗(例如重组 体COMVAXTM、ENGERIXTM-B、RECOMBIVAXTM-HB、TWINRIXTM，和非重组 体BAYHEpTM-B和NABIM-HB)、替伊莫单抗(例如ZEVALINTM)、免疫球蛋白(包 括免疫球蛋白的混合物，如GAMMAGARDTM和类似物，以及各种纯化的免疫球 蛋白中的任意种)、流感病毒疫苗(例如FLUMISTTM)、英利昔单抗(例如 REMICADETM)、胰岛素(例如HUMALOGTM、HUMALOGTM MIX 75/25TM、 HUMULINTM产品(包括50/50、70/30、Regular、NPH、Ultra和Ultralente)，和 NOVOLINTM)、甘精胰岛素(例如LANTUSTM)、干扰素α-2a(ROFERANTM-A)、干 扰素α-2b(例如INTRON-ATM)、复合α干扰素(例如INFERGENTM)、干扰素α-n3(例 如ALFERON NTM)、干扰素β(例如BETASERONTM和BETAFERONTM)、干扰素β-1a (例如AVONEXTM和REBIFTM)、干扰素γ(例如ACTIMMUNETM)、碘克沙醇(例如 VISIPAQUETM)、碘海醇(OMNIPAQUETM)、碘帕醇、碘佛醇(例如OPTIRAYTM)、 酮咯酸(例如TORADOLTM)、艾杜糖醛酸水解酶(例如ALDURAZYMETM)、左氧氟 沙星(例如LEVAQUINTM)、利多卡因、利奈唑酮(例如ZYVOXTM)、劳拉西泮(例如 ATIVANTM)、麻疹疫苗(例如ATTENUVAXTM)、麻疹-腮腺炎-风疹病毒疫苗(例如 M-M-RTM II)、甲羟孕酮(例如DEPO-PROVERATM)、美洛培南(例如MERREMTM IV)、甲基强的松龙(例如SOLU-MEDROLTM)、咪达唑仑(例如VERSEDTM)、吗啡(例 如ASTRAMORPH/PFTM)、奥曲肽(例如SANDOSTATINTM)、奥马佐单抗(例如 XOLAIRTM)、昂丹司琼(例如ZOFRANTM)、帕利珠单抗(例如SYNAGISTM)、泮托 拉唑(例如PROTONIXTM)、培门冬酶(例如ONCASPARTM)、聚乙二醇化非格司亭(例 如NEULASTATM)、聚乙二醇化干扰素α-2a(例如PEGASYSTM)、聚乙二醇化干扰 素α-2b(例如PEG-INTRONTM)、培维索孟(例如SOMAVERTTM)、百日咳疫苗、哌 拉西林(例如ZOSYNTM)、肺炎球菌疫苗(例如PNEUMOVAXTM 23)和肺炎球菌组合 疫苗(例如PREVNARTM)、异丙嗪(例如PHENERGANTM)、瑞替普酶(例如 RETAVASETM)、生长激素(例如GENOTROPINTM、HUMATROPETM、 NORDITROPINTM、NUTROPINTM、SAIZENTM、SEROSTIMTM、ZORBTIVETM)、 舒巴坦、舒马曲坦(例如IMITREXTM)、他左巴坦、替奈普酶(例如TNKASETM)、精 制破伤风类毒素、替卡西林(例如TIMENTINTM)、托西莫单抗(例如BEXXARTM)、 曲安奈德、万古霉素(例如VANCOCINTM)、水痘疫苗(例如VARIVAXTM)和其它疫 苗。
152.权利要求146所述的方法，其中A-X是选自下列的抗生素药剂或药剂的组合： 氨基苷类抗生素；酰胺醇；袢霉素；碳头孢烯；碳青霉烯；头孢菌素或头孢烯； 头霉素；克拉维烷；环式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮内酯类；林可胺类药物；大环 内酯类；单环内酰胺；硝基呋喃；氧头孢烯；唑烷酮；青霉烯、硫霉素和β-内 酰胺类；青霉素；多肽抗生素；喹诺酮；氨磺酰；砜；四环素；和其它抗生素(例 如氯福克酚、梭链孢酸、海克西定、六胺、呋喃妥因、硝羟喹啉、利替培南、牛 磺罗定、Xibomols)。
153.权利要求146所述的方法，其中A-X选自下列的抗癌剂或抗癌剂的组合：阿 克拉霉素、放线菌素、阿霉素、安西他滨、氨曲霉素、阿扎胞苷、氮丝氨酸、6- 氮尿苷、双蒽生、博来霉素、放线菌素C、卡莫氟、卡莫司汀、卡柔比星、嗜癌素、 色霉素、顺铂、克拉立滨、阿糖胞苷、放线菌素D、柔红霉素、二甲叶酸、6-重氮 基-5-氧-L-正亮氨酸、去氧氟尿苷、多柔比星、依达曲沙、乙嘧替氟、依诺他滨、 Fepirubicins、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊达比星、Loxuridines、美诺立尔、 6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培 洛霉素、吡柔比星、吡曲克辛、普卡霉素、泊非霉素、蝶罗呤、嘌罗霉素、维生 素A酸、链黑霉素、链脲菌素、呋喃脲嘧啶、他莫昔芬、硫唑嘌呤胺、硫鸟嘌呤、 曲安西龙、三甲曲沙、杀结核菌素、长春碱、长春新碱、净司他丁和佐柔比星。

说明书全文

发明领域

[0002]总的来说，本发明涉及糖胺聚糖酶(Glycosaminoglycanase enzymes)，包括 在中性条件下具有活性(Neutral-Active)的可溶性的透明质酸酶糖蛋白 (Hyaluronidase Glycoproteins)(sHASEGPs)，以及它们的一部分，尤其是透明质 酸酶结构域。更具体地，本发明涉及化学修饰、药物组合物、表达质粒、制造方 法和应用糖胺聚糖酶(及其结构域和编码核酸分子)在疾病的治疗中对糖胺聚糖 进行治疗修饰的治疗方法，以及应用糖胺聚糖酶来增加其它分子如注射分子在动 物体内的扩散的方法。背景信息
[0003]糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)是细胞外基质(ECM)的复杂线 性多糖。GAGs的特征在于N-取代己糖胺和糖醛酸构成的重复二糖结构(在透明 质素(hyaluronan，HA)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)、软骨素(C)、硫 酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)和肝素(H) 的情况下)或者N-取代己糖胺和半乳糖构成的重复二糖结构(在硫酸角质素 (keratan sulfate，KS)的情况下)。除了HA，所有都以与核心蛋白质共价连接的 方式存在。GAGs及其核心蛋白质在结构上被称为蛋白聚糖(PGs)。
[0004]透明质素(Hyaluronan，HA)在哺乳动物中主要被发现于结缔组织、皮肤、 软骨和滑液。透明质素也是眼睛玻璃体的主要成分。在结缔组织中，与透明质素 结合的水合水在组织间形成水合基质。透明质素在与细胞运动相关的生物现象中 起到重要作用，所述生物现象包括快速发育、再生、修复、胚胎发生、胚胎发育、 伤口复原、血管生成和肿瘤发生(Toole 1991 Cell Biol.Extracell.Matrix，Hay(ed)， Plenum Press，New York，1384-1386；Bertrand et al.1992 Int.J.Cancer 52：1-6； Knudson et al，1993 FASEB J.7：1233-1241)。另外，透明质素水平与肿瘤侵袭性有 关(Ozello et al.1960 Cancer Res.20：600-604；Takeuchi et al.1976，Cancer Res. 36：2133-2139；Kimata et al.1983 Cancer Res.43：1347-1354)。
[0005]HA在许多细胞的细胞外基质中被发现，尤其是在软结缔组织中。HA被赋 予了多种生理功能，诸如在水和血浆蛋白的体内稳态中(Laurent TC et al(1992) FASEB J 6：2397-2404)。在增生的细胞中HA的产量增加，其在有丝分裂中可能起 到作用。它还涉及到移动(locomotion)和细胞迁移。HA在细胞调控、发育和分 化中似乎起着重要作用(Laurent et al，supra)。
[0006]HA已被用于临床医学。它的组织保护特性和流变学性能已证实在眼外科 (例如，在白内障手术中保护眼角膜内皮)中是有用的。血清HA是肝病和多种 发炎状态例如风湿性关节炎的征候。HA堆积引起的间质水肿可能引起多种器官的 功能紊乱(Laurent et al，supra)。
[0007]透明质素蛋白相互作用还与细胞外基质(“matrix”或“ground substance”) 的结构有关。
[0008]透明质酸酶是一类通常在中性或酸性条件下具有活性的酶，在动物界中随 处可见。透明质酸酶的底物特异性和作用机理有所不同。
[0009]主要有三类透明质酸酶：
[0010]1.哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)是内切-β-N-乙酰己糖胺酶 (endo-beta-N-acetylhexosaminidases)，以四糖和六糖作为主要终产物。它们具有 水解活性和转糖苷酶活性，并可降解透明质素和硫酸软骨素(CS)，一般是C4-S 和C6-S。
[0011]2.细菌透明质酸酶(EC 4.2.99.1)，降解透明质素，以及不同程度地降解CS 和DS。它们是内切-β-N-乙酰己糖胺酶(endo-beta-N-acetylhexosaminidases)，通 过β消除反应来起作用，主要产生二糖终产物。
[0012]3.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，是内切- β-葡糖苷酸酶(endo-beta-glucuronidases)，通过β1-3键的水解产生四糖和六糖终 产物。
[0013]哺乳动物透明质酸酶可进一步分为两类：中性活性酶和酸性活性酶。在人 类基因组中有六种透明质酸酶样基因(hyaluronidase-like genes)：HYAL1、HYAL2、 HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，HYAL3尚未显 示出对任何已知的底物具有酶促活性。HYAL4是软骨素酶，对透明质素几乎没有 活性。HYAL1是原型酸性活性酶(prototypical acid-active enzyme)，PH20是原型 中性活性酶。酸性活性的透明质酸酶，例如HYAL1和HYAL2，一般在中性pH(即， pH 7)缺乏催化活性。例如，HYAL1在高于pH 4.5的体外环境中几乎没有催化活 性(Frost et al Anal Biochemistry，1997)。HYAL2是酸性活性酶，其在体外具有非 常低的比活性。
[0014]透明质酸酶样酶还可被表征为，通常通过糖基磷酯酰肌醇锚被固定在质膜 上的酶，例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova，et al.Proc Natl Acad Sci USA.2003 Apr 15；100(8)：4580-5，Phelps et al.，Science 1988)，和通常为可溶性的酶， 例如人HYAL1(Frost et al，Biochem Biophys Res Commun.1997 JuI 9；236(1)：10-5)。 但是，物种与物种之间存在着差异：例如，牛PH20，非常松散地附于质膜上，并 没有通过磷脂酶敏感性锚被锚定(Lalancette et al，Biol Reprod.2001 Aug；65(2)：628-36.)。牛透明质酸酶的这个独特性质，使得可溶性牛睾丸透明质酸 酶可以作为提取物用于临床应用(WydaseTM，HyalaseTM)。其它PH20种类为脂质 锚定酶，在不使用去污剂或脂酶的情况下，通常是不可溶的。例如，人PH20通过 GPI锚锚定在质膜上。尝试制备不会在多肽中引入脂质锚的人PH20 DNA构建物， 但这导致产生了无催化活性的酶或不可溶的酶(Arming et al Eur J Biochem.1997 Aug 1；247(3)：810-4)。自然发生的猕猴精子透明质酸酶被发现有可溶性和膜结合两 种形式。64kDa膜结合形式在pH 7.0具有酶活性，但54kDa形式只在pH 4.0有 活性(Cherr et al，Dev Biol.1996 Apr 10；175(1)：142-53)。因此，PH20的可溶形式 在中性条件下通常缺乏酶活性。
[0015]软骨素酶(Chondroitinases)被发现是遍布动物界的酶。这些酶通过内切糖 苷酶反应降解糖胺聚糖(glycosaminoglycans)。软骨素酶的具体例子包括：软骨素 酶ABC(源于普通变形菌(Proteus vulgaris)；日本专利申请公开第6-153947号，T. Yamagata，H.Saito，O.Habuchi，and S.Suzuki，J.Biol.Chem.，243，1523(1968)，S. Suzuki，H.Saito，T.Yamagata，K.Anno，N.Seno，Y.Kawai，and T.Furuhashi，J.Biol. Chem.，243，1543(1968))；软骨素酶AC(源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)；T.Yamagata，H.Saito，O.Habuchi，and S.Suzuki，J.Biol.Chem.，243， 1523(1968))；软骨素酶AC II(源于Arthrobacter aurescens；K.Hiyama，and S.Okada， J.Biol.Chem.，250，1824(1975)，K.Hiyama and S.Okada，J.Biochem.(Tokyo)，80， 1201(1976))；透明质酸酶ACIII(源于黄杆菌某种Hp102；Hirofumi Miyazono， Hiroshi Kikuchi，Keiichi Yoshida，Kiyoshi Morikawa，and Kiyochika Tokuyasu， Seikagaku，61，1023(1989))；软骨素酶B(源于肝素黄杆菌；Y.M.Michelacci and C. P.Dietrich，Biochem.Biophys.Res.Commun.，56，973(1974)，Y.M.Michelacci and C. P.Dietrich，Biochem.J.，151，121(1975)，Kenichi Maeyama，Akira Tawada，Akiko Ueno，and Keiichi Yoshida，Seikagaku，57，1189(1985))；软骨素酶C(源于黄杆菌某 种Hp102；Hirofumi Miyazono，Hiroshi Kikuchi，Keiichi Yoshida，Kiyoshi Morikawa， and Kiyochika Tokuyasu，Seikagaku，61，1023(1989))；等等。
[0016]糖蛋白是由共价结合有一个或多个碳水化合物部分的多肽链组成的。有两 大类糖蛋白，其具有通过N-糖苷键或O-糖苷键连接到其组成蛋白的碳水化合物。 N-连接和O-连接的聚糖分别通过天冬酰胺-N-乙酰基-D-葡糖胺和丝氨酸(苏氨 酸)-N-乙酰基-D-半乳糖胺键接附着于多肽上。复杂N-连接寡糖不含末端甘露糖残 基。它们只含有末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸残基。杂合寡糖包含末端 甘露糖残基，以及末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸残基。
[0017]对于N-连接的糖蛋白，当肽在内质网中合成时，寡糖前体附着到天冬酰胺 的氨基基团上。寡糖部分随后通过删除和添加糖组分的一系列特定的酶来进行有 序地加工。此加工发生在内质网中，并在通过高尔基器的顺面、中间区室和反面 时继续。发明概述
[0018]本文提供的是可溶性糖胺聚糖酶，尤其是可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋 白家族的成员(本文也称之为sHASEGPs)，优选的成员是人类可溶性中性-活性透 明质酶糖蛋白，尤其是人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(本文也称之为 rHuPH20s)。本文提供的可溶性中性-活性透明质酸酶每个都是sHASEGP家族成 员，它们在本文被表示为sHASEGP。可溶性透明质酸酶结构域及其应用也被提供。 尽管大量的可溶性糖胺聚糖酶(在本文中有时被称为GAG酶)应用和用途通过使 用rHuPH20作为示例性糖胺聚糖酶(例如，用于促进药理学试剂和其它试剂在哺 乳动物体内组织中的传递)而在本文中阐述，本领域技术人员应该理解，其它糖 胺聚糖酶例如文中描述的那些或本领域已知的其它糖胺聚糖酶，可被运用于许多 此类应用中。目前优选的可溶性糖胺聚糖酶，例如sHASEGPs，表现出一些透明质 酸酶活性，并且还可表现出其它的糖胺聚糖酶活性。人类可溶性糖胺聚糖酶目前 优选应用于在人体中使用该酶的应用，包括本文中描述并阐释的许多医学应用。
[0019]本发明的一个方面是基于这样的发现，即，可溶的、中性-活性的透明质酸 酶活性可通过引入在人PH20 cDNA的羧基末端缺少编码氨基酸的狭窄区域的核 酸，在哺乳动物表达系统中以高产量产生。sHASEGP的额外修饰也被提供，以通 过应用非天然前导肽(non-native leader peptides)促进分泌。进一步提供的是修饰 sHASEGP的方法，以通过用聚乙二醇(PEG)遮蔽蛋白质来延长它的半衰期，和/ 或对天然糖基化进行翻译后修饰。以前对于产生可溶性中性-活性人类透明质酸酶 糖蛋白的尝试没有成功。结论是，人类透明质酸酶多肽的截短，导致中性酶活性 的丧失，并使细胞无法在哺乳动物表达系统中分泌重组蛋白(Arming，et al Eur J Biochem 1997 Aug 1；247(3)：810-4)。产生中性起效的分泌型sHASEGP，对于商业 生产和作为透明质酸酶的治疗效用是极其主要的。这里公开的本发明解决了这些 以及其它挑战。
[0020]本发明还包括具有催化活性的人类sHASEGP糖蛋白，其中sHASEGP具有 至少一个N-连接的糖部分。这里显示的研究证明，人类PH20的催化活性需要N- 连接的聚糖，而牛和蜂毒透明质酸酶在缺少这样的N-连接聚糖的情况下仍保留活 性。缺乏N-连接部分的人类透明质酸酶HP20结构域是无催化活性的。因此，经 典的重组DNA技术不能生产有催化活性的人类sHASEGP，这与能够在大肠杆菌 中制造的蜂毒透明质酸酶不同。
[0021]本发明包括用于产生N-连接的sHASEGP糖蛋白多肽的方法和细胞，其通 过使用能够引入所述N-连接的糖部分的细胞或通过将所述N-连接部分引入到 sHASEGP多肽上。鉴别恰当地糖基化的sHASEGPs的方法被进一步公开。
[0022]具有催化活性的聚乙二醇化(PEGylated)和/或超唾液酸化(super-sialated) sHASEGP糖蛋白也被提供。聚乙二醇化和/或超唾液酸化sHASEGPs与天然产生 的非唾液酸化牛和绵羊睾丸sHASEGPs相比，具有更长的血清半衰期，并因此在 需要延长的半衰期的情况下(例如，普遍地在静脉内传递的情形中)对于酶稳定 性和用作药物或佐剂都是优选的。本发明提供制备聚乙二醇化和/或超唾液酸化 sHASEGPs的方法，及其组合物和应用。并不被限于特定的应用或作用机理，通常 认为，PEG部分与sHASEGPs及其它糖胺聚糖酶的连接，可用于有效地保护分子， 降低其对蛋白酶的相对敏感性，还可潜在地降低其从身体中清除和除去的程度和 速度。将这些理论和技术应用于其它糖胺聚糖酶，聚乙二醇化、超唾液酸化和/或 其它修饰形式的此类其它糖胺聚糖酶，可同样被产生并应用于本文描述和阐明的 方法和技术中(例如，用于促进药剂和其它试剂在身体组织中的分散的技术)。
[0023]由天然的GPI锚缺陷型sHASEGP拼接变体编码的蛋白质也被提供。
[0024]进一步提供的是sHASEGP的组合物，包括含有金属离子的可溶性 sHASEGP糖蛋白，其中金属离子为钙、镁或钠。sHASEGPs通常在上述金属存在 下具有最佳活性。由sHASEGP组成的有所述金属离子存在的配方也被提供。
[0025]为了进一步延长半衰期而对sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶所作的修饰被提 供。用聚合物如聚乙二醇和葡聚糖对sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶进行的化学修 饰被提供。这种修饰保护了sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶，使其不会被循环和免 疫系统以及甘露糖和脱唾液酸糖蛋白的糖基化受体所除去。进一步提供的是连接 到特定官能团的方法，所述特定官能团例如糖基化位点、带正电荷的氨基酸和半 胱氨酸。
[0026]调节sHASEGPs的活化、表达或活性的效应物和条件的鉴定分析方法也在 这里被提供，所述效应物例如化合物，包括小分子，所述条件例如pH、温度和离 子强度。在示例性的分析中，受测化合物对sHASEGP的透明质酸酶结构域切割已 知底物的能力的影响被评定，所述底物通常为糖胺聚糖或蛋白聚糖。调节透明质 酸酶结构域的活性的试剂，通常为化合物，尤其是小分子，是调节sHASEGP活性 的候选化合物。透明质酸酶结构域还可被用于生产具有功能干扰活性 (function-perturbing activity)的透明质酸酶特异性抗体。这里提供的透明质酸酶 结构域包括，但不限于，N-末端glycsoyl-水解酶结构域及其C-末端截短部分，其 在体外显示出催化活性。
[0027]编码蛋白质和透明质酸酶结构域的核酸分子被提供。编码可溶性透明质酸 酶结构域或其催化活性部分的核酸分子以及编码全长sHASEGP的核酸分子被提 供。编码示例性透明质酸酶结构域的核酸及下游核酸被列于SEQ ID No.6中；示 例性sHASEGP的透明质酸酶结构域被列于SEQ ID No.1中(氨基酸35-464)。示 例性全长sHASEGP的蛋白质序列和编码核酸序列被列于SEQ ID Nos.1和6中。
[0028]沿着编码sHASEGP的核酸的全长或沿着全长的至少大约70％、80％或90％ 与该编码sHASEGP的核酸杂交并编码透明质酸酶结构域或其部分的核酸分子也 被提供。杂交通常在至少低严格性(stringency)条件下发生，一般在至少中等严 格性，经常在高严格性条件下发生。
[0029]分离的核酸片段是DNA，包括基因组DNA或cDNA，或是RNA，或者可 以包括其它成分，例如蛋白核酸或其它核苷酸类似物。分离的核酸可包括额外的 成分，例如异源的或天然的启动子、增强子和其它转录和翻译调控序列，这些基 因可与其它基因例如报告基因或其它指示基因或编码指示蛋白的基因连接。
[0030]还提供了分离的核酸分子，其包括与编码sHASEGP的核苷酸序列或其中 一部分互补的分子序列。
[0031]还提供了它们的可用作探针或引物的片段或寡核苷酸，所述片段或寡核苷 酸包含至少约10到16个核苷酸，通常至少约20个核苷酸，一般1000个核苷酸 以下，通常约100个核苷酸以下，其列于SEQ ID NO.6(或其互补物)；或包含至 少约30个核苷酸(或其互补物)或包含沿其全长(或其至少约70％、80％或90％) 与任何此类片段或寡核苷酸杂交的寡核苷酸。片段的长度取决于它们的使用目的 和/或感兴趣的基因组的复杂性。通常探针和引物含有大约50、150或500以下的 核苷酸。
[0032]还提供了含有这里提供的任何核酸分子的质粒。含有质粒的细胞也被提供。 这些细胞包括，但不限于，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细 胞和动物细胞。
[0033]还提供了增强的哺乳动物表达系统，其使用了能够有效分泌sHASEGPs的 信号前导肽。这种有效促分泌的前导肽氨基酸序列以及与sHASEGP的融合蛋白列 在SEQ ID Nos.43和46中。
[0034]还提供了生产sHASEGPs的方法，其通过在sHASEGP被细胞表达的条件 下培养上述细胞，并回收所表达的sHASEGP多肽或糖蛋白。编码其它sHASEGPs 的核酸的分离方法也被提供。
[0035]还提供了细胞，通常是真核细胞，如哺乳动物细胞和酵母细胞，其中 sHASEGP多肽在细胞表面被表达。这些细胞可用于药物筛选分析以鉴别调节 sHASEGP多肽活性的化合物。这些分析，包括体外结合分析，和基于转录的分析， 其中由sHASEGP直接介导或间接介导——例如通过原生长因子(pro-growth factor)的激活来介导——的信号转导被评价。
[0036]还提供了由此类核酸分子编码的肽。sHASEGP透明质酸酶结构域或具有氨 基酸改变但特异性和/或透明质酸酶活性保持基本不变的多肽被包括在那些多肽之 中。特别地，基本上纯化的哺乳动物sHASEGP糖蛋白被提供，其包括分泌的中性 -活性酶。
[0037]本发明还包括透明质酸酶催化结构域，并且可额外地包括其它结构域。 sHASEGP可形成同型二聚体，还可与一些其它蛋白质形成异源二聚体，所述其它 蛋白例如膜结合蛋白。还提供了基本上纯化的糖蛋白，包括与示例性的sHASEGP 具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨 基酸序列，其中同一性百分比使用将同一性百分比最大化的标准算法和空位罚分 来确定。
[0038]sHASEGPs的拼接变体被考虑，尤其是含有具有催化活性的透明质酸酶结构 域的拼接变体。
[0039]在其它实施方式中，基本上纯化的多肽被提供，所述多肽包括sHASEGP 多肽的透明质酸酶结构域或其催化活性部分，但不包括SEQ ID No.1中示出的整 个氨基酸序列。包括与SEQ ID No.1或3具有至少70％、80％、85％、90％、95 ％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽也在其中。
[0040]在特定的实施方式中，编码真核生物透明质酸酶糖蛋白——其表示为真核 生物sHASEGP——的核酸被提供。特别地，核酸包括SEQ ID No.6中列出的核苷 酸序列，尤其是SEQ ID No.6的核苷酸106-1446所示的序列，或包括编码具有催 化活性的多肽的一部分核苷酸序列。
[0041]还提供了与SEQ ID NO.6或其简并序列杂交的核酸分子，杂交在至少低严 格性条件下进行，一般为至少中等严格性，更经常在高严格性条件下进行。
[0042]在一种实施方式中，分离的核酸片段与含SEQ ID No.6(或其简并物)所 示的核苷酸序列的核酸分子在高严格性条件下杂交。全长sHASEGP被列在SEQ ID No.1中，由SEQ ID NO.6或其简并物编码。
[0043]还提供了sHASEGPs的透明质酸酶结构域的突变蛋白，尤其是透明质酸酶 结构域中一个或多个自由Cys残基(即，不与透明质酸酶结构域中的任何其它Cys 残基形成二硫键)被其它氨基酸取代的突变蛋白，尽管不是必须的，但通常为保 守氨基酸替换或不削弱活性的替换，所述突变蛋白还可以是一个或多个特定糖基 化位点被消除的突变蛋白。
[0044]在此提供了sHASEGP多肽，包括但不限于其拼接变体(splice variant)，和 编码sHASEGPs的核酸，以及其结构域、衍生物和类似物。还提供了单链分泌型 透明质酸酶糖蛋白，其具有这样的N-末端，该N-末端在功能上等价于通过信号肽 酶的活化以形成sHASEGP而产生的N-末端。有七个潜在的N-连接糖基化位点， 在SEQ ID NO：1中示例的人PH20 sHASEGP的N82、N166、N235、N254、N368、 N393、N490。在Cys残基C60-C351之间和Cys残基C224-C238之间形成二硫键， 以形成核心透明质酸酶结构域。但是，对于中性酶催化活性，在羧基末端需要额 外的半光氨酸，这样，在SEQ ID No.1中从氨基酸36到Cys 464的sHASEGP结 构域包含了最小范围的活性人PH20 sHASEGP透明质酸酶结构域。因此，N-连接 糖基化位点N-490对于合适的sHASEGP活性来说不是必需的。正如将被本领域技 术人员所理解的，可对本文描述并阐明的这些组成作出次要的变化，这并不实质 地消除它们的有用活性，或在一些情况下，这并不实质地降低(或可能甚至提高) 它们的有用活性，因此，这些变化可在文中描述的各种用途中类似地加以使用。
[0045]一些sHASEGPs(例如，包括SEQ ID No.1的氨基酸序列的sHASEGP)的 N-连接糖基化作用对其催化活性和稳定性是非常重要的。尽管改变用于修饰糖蛋 白的聚糖的类型可对蛋白质的抗原性、结构折叠、可溶性和稳定性产生重大影响， 但大多数酶被认为不需要为了最佳酶活性而进行糖基化作用。因此，就此方面而 言，此类sHASEGPs是独特的，原因是N-连接糖基化的去除可导致透明质酸酶活 性几乎完全失活。对于这种sHASEGPs，N-连接聚糖的存在对于产生活性酶是非 常重要的。适于在sHASEGPs上引入关键的N-连接糖基化残基的蛋白表达系统被 包括。另外，在存在能够引入N-连接聚糖的提取物的情况下去糖基化的sHASEGP 多肽的引入被包括。在本发明的一个方面中，通过唾液酸化作用封端的复合糖基 化(complex glycosylation)被描述，而用自由甘露糖残基封端的其它糖基化也被 考虑。优选地，唾液酸残基在sHASEGPs上的N-连接糖基化作用的末端残基中被 发现。
[0046]N-连接寡糖归为几种主要类型(寡甘露糖型(oligomannose)、复合型 (complex)、杂合型(hybrid)、硫酸化型(sulfated))，它们都具有通过在 -Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)中的Asn残基的酰胺氮连接的(Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-核。在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化作用已在凝结蛋白C (coagulation protein C)中被报道。N-连接位点通常是通过在测序过程中“空白” 循环的出现而被间接认定的。正面的鉴定可在用PHGase F将寡糖释放后进行， PHGase F将糖基化的Asn转化为Asp。PNGase F释放后，N-连接寡糖可被纯化， 例如，通过使用Bio-Gel P-6层析，其中对一群寡糖进行制备型高pH阴离子交换 色谱(HPAEC)(Townsend et al.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体 可以使用HPAEC拆分。海藻糖残基在HPAEC色谱图中的洗脱位置将迁移到更早 的位置，而额外的唾液酸残基将增加保留时间。寡糖结构已知的糖蛋白(例如， 牛胎球蛋白、a-1酸性糖蛋白、卵清蛋白、RNA酶B、转铁蛋白)的同时处理(cocurrent treatment)，可促进寡糖峰的指认。收集的寡糖可通过成分分析和甲基化键接分析 (methylation linkage analyses)的联合来表征(Waegheet al.，(1983)Carbohydr Res. 123，281-304.)，端基异构构型通过NMR光谱术来指认(Van Halbeek(1993)in Methods Enzymol 230)。
[0047]在一些sHASEGPs的情况中，以这里描述的人类sHASEGP rHuPH20为例， sHASEGP可包括N-糖苷连接和O-糖苷连接。例如，rHuPH20(如在DG44 CHO 系3D3中产生的，如下面实施例中描述的)被发现具有O-连接寡糖和N-连接寡糖。 此类sHASEGPs的糖苷修饰(例如，包括此类N-连接和/或O-连接寡糖的一个或 多个添加、去除或改变的修饰)可用于产生糖苷变异性sHASEGPs，其表现出改变 的药动学和/或药效学曲线，这使得它们能满足特定的应用。作为例证性说明，但 不限于特定的作用机理，在与细胞受体或其它受体结合时所涉及的一个或多个N- 连接和/或O-连接寡糖的去除或改变(例如，通过封端(capping)或以其它方式进 行的掩盖(de-exposing))，可以被用于改变sHASEGP与特定组织结合或被特定组 织吸收的程度和/或速度，这继而又可用来改变例如其药动学曲线(例如，通过增 加其血清半衰期或以其它方式改变其生物吸收)。
[0048]sHASEGPs的制剂也被提供。sHASEGPs可配制成例如冻干形式和稳定溶 液。含特定金属离子的制剂对于中性pH时的最佳活性是有益的，所述金属离子例 如钙、镁或钠。除了稳定的溶液制剂，缓释制剂在此也被考虑，用于糖胺聚糖的 延时去除，或试剂(如药理学试剂)的散布或分散的延时促进。在此还提供了试 剂盒，所述试剂盒提供了sHASEGPs的预包装注射器，用于在眼内外科手术中和 其它小体积操作中小量sHASEGP的给药。用于在人造再生技术程序中离体应用的 平衡盐制剂也被提供。
[0049]应用包括sHASEGPs在内的糖胺聚糖酶来移除糖胺聚糖的方法也被提供。 包括sHASEGPs在内的糖胺聚糖酶通过糖胺聚糖的降解在间质空间中打开通道， 其通常允许大小在约500nm以下的分子扩散。这些通道可保持相对开放24-48小 时的时间，其取决于剂量和制剂。这种通道可用于协助外源添加的分子的扩散， 所述外源添加的分子例如流体、小分子、蛋白质、核酸和基因疗法载体以及小于 大约500nm的其它分子。另外，不限于特定理论或作用机理，相信，这种通道的 形成可促进大体积流体在间质空间中的流动，其又可促进溶质(例如可检测到的 分子或其它诊断试剂、麻醉剂或其它组织改性剂(tissue-modifying agent)、药理学 试剂或制药学上有效的试剂、或整形试剂或其它美容化妆试剂(esthetic agent)) 的分散或运动，所述溶质在本文有时被称为“对流转运(convective transport)”或 简称为对流的过程中由流体有效地被载运。这种对流转运可实质性地超过分子扩 散的速度和累积作用，并可因此导致治疗分子或其它被给予的分子更迅速和有效 地布满组织。此外，当分子例如治疗试剂或其它试剂(例如小分子药物或较大分 子或复合物)与sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)共同配制或共同给药且都注射到 相对狭小的局部位置时，例如非静脉内的肠胃外给药(例如，皮内、皮下、肌肉 内，或施于其它内部组织内或周围、器官或体内其它相对狭小的空间)，伴随被给 予的药剂的流体可提供局部驱动力(即，静水压力)和较低的流动阻力(通过打 开间质基质中的通道)——它们都趋于增加流体流动，以及随之的在流体中包含 的治疗试剂或其它分子的对流转运。正如本文更详细讨论和阐明的，且正如本领 域技术人员所了解的，关于sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶的应用的这些方面可具 有实质的效用，用于改善生物利用度，并操纵共同配制或共同给予的试剂的其它 药动学和/或药效学特性。
[0050]sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶还可用于去除过量的糖胺聚糖，例如在缺血再 灌注、发炎、动脉硬化、浮肿、癌症、脊髓损伤和其它形式的创伤之后出现的那 些。在一些情形中，sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶可通过静脉内输注被全身性输送。 当局部的接触不易获得时，例如心脏或脑中，或者在疾病遍及全身的播散性瘤的 情况下，这可以是有帮助的。对于这样的静脉内的应用或其他血管内应用，相对 于缺少末端唾液酸的天然透明质酸酶，超唾液酸化sHASEGPs通常是优选的，以 增加血清半衰期和分布，。
[0051]在一些情况下，例如脊髓损伤和其它神经系统紊乱、青光眼和某些其它眼 部病症、以及各种自体免疫、发炎状况、癌症和其它慢性进行性疾病和状况、和 美容治疗，持续递送是优选的。正如本领域技术人员所了解的，许多不同的组合 物和技术已被开发，以提供缓释或持续释放制剂或感兴趣分子的储库(depots)。
[0052]在其它适应征中，单次的短时生效剂量是优选的。糖胺聚糖的暂时去除可 用于促进溶液和药物传递进入和/或通过间质空间。这对于麻醉剂的扩散和对于治 疗流体、分子和蛋白质的给药是有用的。在sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖酶) 存在下，分子的皮下、皮内和肌肉内给药，也促使它们的全身性分布更加迅速。 当静脉内路径不可利用时或当需要更迅速的全身性分子递送时，这种方法是非常 有用的。例证性地，通过皮下给药生物利用度很低的其它大分子例如因子III(Factor III)的递送，可与sHASEGPs一起注射，以增加它们的利用度。
[0053]sHASEGPs对卵母细胞周围的卵丘基质(cumulus matrix)的酶促去除的应 用也被提供。卵丘基质的去除使用纯化的sHASEGP，其不含提取物来源的透明质 酸酶的毒性污染物，允许具有更强生存能力的卵母细胞的更温和的回收。另外， sHASEGPs可以不使用牛提取物或携带病毒或其它病原体如传染性海绵状脑病的 其它生物体来制造。
[0054]用于眼内应用的小量sHASEGP的注射也可用于小空间。例如，sHASEGP 和/或其它糖胺聚糖酶可被注射到眼的前房，以去除手术中施用的过量粘弹性基质。 sHASEGPs的眼内注射还可用于降低青光眼的眼内压，用于溶解玻璃体聚集物或 “漂物”，用于清除玻璃体出血，用于治疗黄斑变性，用于促进在糖尿病性视网膜 病变中的玻璃体视网膜脱离，以及与其它酶混合以促进角膜沿矫正晶体的重新塑 形。如这里描述的，sHASEGPs和/或其它糖胺聚糖酶也可被注射到眼中或以“散 布剂”的形式注射到周围的眼眶间隙，即，以便将诊断剂、麻醉剂或药理学试剂 递送到目标组织中的位点和/或周围的位点。例如，在注射诊断剂、麻醉剂或药理 学试剂到特农下隙(sub-Tenon’s)或巩膜上隙的同时或者在时间上紧接着注射 sHASEGP，可用于促进药物向眼的内部(例如脉络膜、视网膜和玻璃体)的巩膜 (transcleral)递送。巩膜上隙是眼球筋膜(特农囊)和巩膜之间的含淋巴的间隙， 它是脉络膜、视网膜和眼内部周围相对坚韧的保护组织。特农下隙或巩膜上隙， 有时被称为巩膜周边(periscleral)淋巴间隙，通常也是与硬膜下腔和蛛网膜下腔 相连，且被由筋膜(fascia)到巩膜延伸的结缔组织带贯穿。如被本领域技术人员 所理解的，促进组合物穿过覆盖眼的保护性巩膜层递送的能力，允许多种药理学 试剂和其它试剂被方便地和有效地递送到眼中的底层组织，如脉络膜、视网膜或 玻璃状液。通过将本发明组合物应用于这样的体内递送路径，甚至相对难以达到 的组织，例如眼睛后部的那些，可通过最低限度侵入性的方法来治疗。将认识到， 在一些情况中，使用更持久的sHASEGP例如聚乙二醇化的sHASEGP将是令人满 意的。
[0055]重要的是，注意到，尽管动物来源的透明质酸酶可以并已被用于治疗眼的 某些征状，并作为散布因子来促进麻醉剂和其它治疗剂或药理学试剂的递送，但 当它们被用于治疗人类时，几个重要的考虑因素牵涉到动物来源的酶的使用，并 潜在地限制了它们的应用或产生了安全问题或额外的风险。在这些考虑之中的是 这样的问题，当应用于体内人类组织时，蛋白质和存在于制剂中的其它杂质，可 导致免疫原性问题和/或其它问题。另外，就采用非人类动物酶而言，甚至纯化的 酶本身也可进一步导致免疫原性，因为它们并非来源于人类。进一步，在此方面， 降解性酶例如透明质酸酶可有效促进其自身分散(如在文中所述)的潜力，可增 加此类动物来源的产品的免疫原性形式或制剂被免疫系统接触的可能性。
[0056]对于动物来源和/或杂质因素的顾虑还在许多情形中变得愈发明显；例如， 目标组织已经接受外科手术或其它处理的情形，试剂被引入相对的免疫禁区 (immune-privileged space)(如，眼睛部分、心脏、神经系统和许多其它通常不暴 露于外部环境的组织和器官)的情形，和/或病人免疫受损或处于感染所带来的高 风险的情形。此类动物来源制剂的使用可能因此在许多应用中被避免，在所述应 用中，感染或其它并发症的风险消除了它们的潜在效用。在那些情形及其它情形 中，本发明的重组制备的sHASEGPs的使用可以提供高效且具有良好安全性的应 用，并因此改善和扩展能够有益地使用这些酶的条件和情形。
[0057]在非静脉肠胃外注射(例如皮内、皮下、肌肉内和向非脉管空间的其它注 射)的情况下，在一定体积的液体(例如，药物学赋形剂或其它溶液)中的sHASEGP (和/或另外的糖胺聚糖酶)和另一种试剂(例如，共同制剂或混合物，其包含 sHASEGP和另一种试剂例如诊断试剂、麻醉剂、药理学试剂、美容剂(esthetic agent) 或其联合)，可通过注射或灌输被引入身体中的一个或多个位点。不希望受理论约 束，相信，几种驱动力可用于促进药理学试剂或其它试剂的递送(其程度部分取 决于例如具体的组合物、体积和给药位置)。这些驱动力可包括由于一定体积的流 体被有效地强迫进入一个受限空间(例如，上述的特农下隙，或皮内、皮下、肌 肉内位点，或其它非-IV肠胃外注射位点)时所产生的液体静压力的增加、接着由 于流体流动随其压力梯度增加(并且溶解的分子或大分子复合物也随其被运载) 而导致的溶质对流输送(或对流)的增加，以及由糖胺聚糖的降解和在下游细胞 间基质或间质空间内伴随的通道形成介导的扩散和/或渗透的增加。
[0058]在sHASEGPs被注射到眼前房以去除过量粘弹性基质例如含糖胺聚糖的制 剂(其通常在各种前段操作(anterior segment procedures)中被用作眼外科佐剂 (opthalmosurgical aids))的情况下，将被技术人员理解的是，考虑到本申请的教 导，sHASEGP可被用于补充或消除对术后程序例如冲洗(irrigation)和吸出 (aspiration)的需求，冲洗和吸出通常被用来减少在手术完成后留在眼内的被应 用的粘弹性物质的量。粘弹性物质在前段手术中被普遍使用，以保持深度前房， 这允许进行更有效的处理并在手术过程中潜在地保护角膜内皮和其它组织。含有 透明质酸盐和/或硫酸软骨素的各种粘弹性物质被应用于外科手术中，例如眼前段 操作(anterior eye segment procedures)(参见，例如ProvisoTM，ViscoatTM和 DuoviscTM(可从Alcon Laboratories，Inc.获得，www.alconlabs.com)；HealonTM， Healon 5TM和Healon GVTM(可从Advanced Medical Optics获得，www.healon.com)； AmviscTM和AmviscTM Plus(可从Bausch&Lomb获得，www.bausch.com)；I-ViseTM， I-ViseTM Plus，I-ViscTM 18和I-ViseTM Phaco(可从I-MED Pharma获得， www.imedpharma.com)；LA LONTM(可从General Innovations获得， www.generaltrade.net))。但是，如本领域中已知的，外科手术处理例如白内障手术 后在前房残留的粘弹性物质，可导致从前房的外流受到不利影响(可能通过减少 经过小梁网的外流)，这可引起眼内压升高(IOP spikes)，其可导致青光眼。
[0059]因此，本发明的sHASEGPs可被引入，例如，通过作为先前应用的含糖胺 聚糖例如透明质素的粘弹性制剂的“粘弹性物质解毒剂(viscoelastic antidote)”注 射到眼前房。为了用作这种粘弹性物质解毒剂，sHASEGP通常将通过手术后注射 到前房(进行或不进行前期的冲洗或吸出以去除一部分先前使用的粘弹性物质) 来引入，这在前段手术例如青光眼手术和眼内晶状体移植(例如，通过晶状体乳 化法或囊外手术)、青光眼滤过手术(滤帘切除术)、角膜移植手术(例如，穿透 性角膜成型术)、外伤后眼手术等等之后进行。正如本领域技术人员将会理解的， 在这种情况中sHASEGP的使用量将取决于其比活性和所使用的粘弹性物质的量， 以及一些粘弹性物质是否已先被物理性去除(例如，通过冲洗和吸出)。因此，每 种应用通常将根据具体情况被优化，本领域技术人员考虑到本文提供的描述和例 证性说明将理解这些。
[0060]一些粘弹性物质，如ViscoatTM和DuoviscTM(可从Alcon Labs获得)包括 透明质酸盐和硫酸软骨素。有利地，本发明的许多sHASEGPs具有透明质酸酶和 软骨素酶的酶活性，这使它们尤其适合这种双配方的粘弹性物质。
[0061]包括sHASEGPs的透明质酸酶还可与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(例如 软骨素酶)联合，用于例如前述的应用或在间质间隙中进一步打开通道，以用于 其它应用，如文中描述和阐明的那些。
[0062]就粘弹性物质也被用于其它程序而言，本发明的sHASEGPs可同样与用于 减少或去除所用的粘弹性物质的量的技术一起使用，或者作为上述技术的替代来 使用，即，作为粘弹性物质解毒剂。
[0063]在sHASEGPs在组织例如眼中作为散布剂的应用中，本文描述的包括一种 或多种sHASEGPs的制剂通常在施用需要被递送到目标组织或其附近的麻醉剂、 诊断试剂、药理学试剂或其它试剂之前或同时被应用于目标组织。在一些情况下， sHASEGPs可被用于促进药理学试剂或其它试剂的递送，其穿过第一组织到达远离 第一组织的一个或多个组织。例证性地，sHASEGPs向眼周巩膜上隙的引入，可用 于促进试剂递送，使其穿过保护性巩膜组织并进入脉络膜、视网膜和玻璃体，所 述sHASEGPs的引入先于或伴随着药理学试剂或其它试剂向巩膜上隙的引入。以 这种方式，可用于治疗脉络膜、视网膜和/或玻璃体病症的许多药理学试剂和/或其 它试剂，可被相对局部地递送到目标组织，但同时使用的是相对非入侵性的方法， 例如特农下注射。相似的情形存在于其它情形中，其中sHASEGPs可用于身体中 的一个组织或位置，以促进药理学试剂或其它试剂在那种组织或位置和/或向远端 位点(distal sites)的递送，如文中所描述和说明的。
[0064]尽管共同配制或共同施用的试剂的分散程度和速度部分取决于所涉及的组 织和试剂，但这种分散通常可通过下列途径被增加：例如，增加所使用的sHASEGP 的量、采用具有更高比活性的sHASEGP、采用更能抵抗降解或其它失活作用的 sHASEGP(例如聚乙二醇化的、超唾液酸化的或其它此类修饰的sHASEGP)、提 供sHASEGP的持续释放制剂或储库式制剂，以及可增加所使用的sHASEGP的有 效活性和/或持续时间的其它此类方法。另外，在希望sHASEGP促进试剂向远离 例如注射位点的组织或位置扩散的情形中，则以大体积液体(例如将部分充满甚 至稍稍超溢注射位点)的形式提供sHASEGP和/或试剂，可用于通过对流输送的 过程进一步促进分散，如本文所描述和阐明的。
[0065]如本领域技术人员所理解的，sHASEGPs可因此被用于有效地促进多种麻 醉剂、诊断剂、药理学试剂和/或其它试剂递送到眼的后段(posterior segments)， 用以治疗一些征状，如视网膜脱离、视网膜静脉闭塞、增殖性视网膜病、糖尿病 性视网膜病变、发炎状况(例如葡萄膜炎、脉络膜炎、视网膜炎等等)，以及变性 疾病、血管病和各种肿瘤。再次如本领域技术人员所理解的，多种药理学或制药 学上有效的试剂可被有效地用以治疗此类后段病症(posterior segment condition) 和疾病，包括，示例性的麻醉剂和药理学试剂，如下面描述和阐明的那些。
[0066]sHASEGP与其它物质的共制剂或共给药也可被考虑用于小体积或快速皮下 给药的注射笔(injectable pens)。例如，EpipenTM、胰岛素和其它流体可被配制。 本发明的方法包括，在施用其它治疗分子之前、同时或之后，进行sHASEGP多肽 或含sHASEGP的药物组合物的给予。sHASEGP可在不同于治疗分子给药位置的 位置给药，或sHASEGP可在与治疗分子给药位置相同的位置给药。
[0067]不希望被理论约束，相信，sHASEGP和其它糖胺聚糖酶引起细胞间的间质 空间(interstitial spaces)中一部分糖胺聚糖降解的能力，导致间质中通道的暂时开 启，这又往往增加间质流体流动并同时促进间质流体中溶解成份(例如，麻醉剂、 药物和其它药理学试剂、标记试剂和诊断试剂等等)的扩散和/或对流溶质输送(对 流(convection))。如本领域技术人员所理解的，本发明的sHASEGPs可被用于提 高多种药理学试剂和其它试剂的生物利用度(并有可能改善其他药动学和/或药效 学性质)，这些试剂有用于治疗或诊断各种疾病状况或在体内以其它方式修饰一种 或多种组织。这些试剂的示例性种类包括：抗癌剂、抗感染药、麻醉剂、抗炎剂、 细胞因子、抗体和其它蛋白质、核酸、大分子复合物，和修饰细胞活性或其它生 理活性的各种其它分子和药理学试剂，包括本文描述的和本领域中的各种试剂(及 其典型成员)。
[0068]尽管甚至小分子的扩散和对流输送可通过开启间质通道和增加流体流动来 提高，但在更大药理学试剂或其它试剂的情况下，例如在许多生物治疗剂(包括 抗体和其它蛋白质、大核酸、大分子复合物(例如脂质体和其它大分子载体)、以 及基因治疗载体等等)的情况下，分子大小和间质成分例如糖胺聚糖的存在，实 质性地削弱了试剂的扩散和/或对流。潜在地限制试剂的有效性的几种后果被导致。 例如，试剂的药动学可通过减缓吸收和由此引发的试剂分布而被削弱。另外，在 给药位点处或附近一部分试剂的陷埋，限制了它的生物利用度，并且还可因潜在 持续的和高的局部剂量而引发毒性。关于后者，可能伴随有疼痛或其它副作用的 局部毒性，是通过非静脉注射给药的许多大生物分子的一个问题，所述非静脉注 射例如通过皮下、皮内或肌肉内注射。结果，许多药理学试剂具有能够通过将该 试剂与sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)共同配制或共同给药而被提高的药动学 (PK)和/或药效学(PD)曲线，sHASEGP可在所述试剂之前、同时或之后提供， 并可以在相同或不同的位置给药，其参数将是在标准模型(例如通常用于评价试 剂的药动学和药效学的动物模型)中进行优化的对象。因此，通常通过肠胃外给 药的各种治疗剂和药理学试剂及其它试剂(例如整形或美容制剂(esthetic formulation))中的任何一种，都可以通过使用sHASEGPs而被增加。
[0069]尽管血管内给药，尤其是通过静脉(IV)注射，通常可以提供快速的生物 利用度，但IV注射经常是不方便的，并伴随风险或不适用(甚至在可行的情况下 也可能出现达不到最佳总体PK/PD曲线)。由于sHASEGPs可被用于提高通过非 IV肠胃外途径(例如皮下、皮内、肌肉内和将试剂递送到间质的其它途径)给药 的试剂的生物利用度，通过IV注射递送的试剂可重新配制，用以通过非IV肠胃 外途径递送。这种重新配制可提供明显的优势，例如允许IV给药不方便、不适用、 不安全、太昂贵或有其它限制的试剂被使用。将IV试剂以非IV肠胃外形式重新 配制，还可允许患者自己施用试剂，并可通过避免对静脉注射给药的需求，允许 定量给药(dosing)被优化(例如，依据试剂的PK/PD参数进行更好的改变)。
[0070]如本领域技术人员将理解的，可通过使用sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖 酶)来改善的PK/PD参数包括如下测量，Cmax(吸收后在例如血流中达到的试剂 最大浓度)、Tmax(达到最大浓度所需时间)、T1/2(浓度降至一半所需时间)、Cmin (在代谢和排泄后，试剂的最小浓度)、AUC(浓度对时间的曲线下面积，生物利 用度总量的量度)、在感兴趣的各种组织中的浓度(包括，例如，达到所需浓度的 速度、总体水平、保持所需水平的持续时间)和Emax(达到的最大效果)。例证 性地，将药物或其它药理学试剂与sHASEGP一起重新配制，或将试剂与sHASEGP (其可被局部地或全身性地引入，可在试剂给药之前、一起或之后)共同给药， 可被用于例如增加试剂的Cmax、降低其Tmax、降低其T1/2、增加其AUC和/或增 加其Emax。如本领域技术人员将理解的，容易地并相称地操控这些关键PK和PD 参数的能力(例如，通过使用更多或更少的sHASEGP单位并改变给药时间和/或 位置)，使许多药理学试剂或其他试剂的改进可以实现。对这些参数水平的测评可 在模型中进行，例如用于试剂的PK/PD测量的动物模型，并且促进相对功效-安全 特征的共制剂和/或共给药因而可被选择用于特定应用。
[0071]在非IV肠胃外给药中，sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖酶)也可被使用， 以使试剂能够通过更方便的途径给药，和/或具有更高效率。例证性地(但不限于 此)，通过将试剂与sHASEGP(或局部或全身，在试剂给药之前、同时或之后) 重新配制和/或共给药，那些通常通过皮下注射给药的试剂可改为通过皮内注射给 药，通常通过肌肉内注射给药的试剂可改为通过皮下或皮内注射给药。或者，试 剂可通过相同途径给药，但通过使用sHASEGPs，其将具有改进的药动学和/或药 效学性质。
[0072]使用sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖酶)将IV药物和其它试剂重新配制成 非IV肠胃外给药的形式，也使试剂能够通过各种设计用于简化和/或加速递送以及 帮助自给药的新注射器件中的任何一种进行递送。这样的器件包括，例如，超锐 微针器件(ultra-sharp and microneedle devices)(例如由Becton Dickinson等开发的 那些)，以及无针注射器材(needle-free injection devices)(例如BiojectorTM和Bioject 的其它器材；IntraJectTM和可获自Aradigm的其它器材；MedijectorTM器材等)。许 多器件(例如Biojector)对于帮助皮内注射尤为有用，皮内注射在使用标准针时 往往需要更多的经验(由于在针头定位过程中刺透真皮并将试剂递送到组织下层 位置例如皮下层的可能)。对于一些药理学试剂，例如疫苗(例如，基于DNA的 疫苗或其它疫苗)，将试剂递送到皮层而非皮下层是尤其有益的，因为往往具有相 对高浓度的抗原呈递细胞(APCs)存在于皮肤内。
[0073]对于那些通常通过皮内注射(无论是通过标准针或其它更新的器材)递送 的试剂，或许多其它可以但目前没有通过皮内注射递送的试剂，sHASEGP(和/或 其它糖胺聚糖酶)的局部共引入(co-introduction)可用于促进药理学试剂或其它 试剂的递送，并促进其在皮肤中的分散或散布。对于疫苗，在皮肤可能是主要目 标组织——其具有局部充足的APCs——的情况下，sHASEGP(和/或其它糖胺聚 糖酶)可因而促进疫苗在目标组织中的分散，因此增加疫苗和APCs间相互作用的 可能性和程度(其可显著加强免疫调节应答的产生)。对于其它试剂，皮肤可能不 是主要目标组织，而是一定剂量的试剂被引入的组织，由此期望试剂被吸收到另 一组织中，通常到血流中。在后者的情形中，血流本身可以是感兴趣的目标组织 (例如，对于本文描述的和本领域中的血液调节因子)，或血流本身可以是递送组 织，通过它试剂被输送到远端目标组织(例如，身体中由血液供给的组织)。在这 些后者情形中的任何一种中(其中，递送是皮内的，但需要试剂被递送到血流中)， sHASEGP(以及，有可能地，一定体积的液体，它通过该液体被注射)可促进试 剂首先在皮肤中的分散，以及随后进出皮肤的脉管系统，并最后进入到更大的血 液供给中，如本文描述并举例说明的。
[0074]用sHASEGPs促进其它治疗剂或药理学试剂的药动学和/或药效学的应用， 还可被应用于通过不是非IV肠道外给药途径递送的试剂。例如，不希望被理论所 限制，相信，sHASEGPs在身体中间质空间里的存在(其可通过局部和/或全身的 sHASEGPs给药来实现)趋向于促进间质通道和增加间质空间中的流体流动，进而 促进溶解于间质流体中的试剂(如药理学试剂和其它试剂)的扩散和对流输送。 例证性地，直接向血流中给药的试剂(例如，通过静脉注射)，或口服(例如，并 因此在胃肠道吸收后进入血流)的试剂，仍可能受限于吸收后(post-absorption)， 即，它们的药动学的分布相(distrubution phase)。不希望被理论限制，相信， sHASEGPs可通过增加间质渗透性和流体流动并因此增加试剂在间质间隙中的扩 散和/或对流(其有效地在几乎所有药理学递送途径与目标细胞之间形成媒介)来 促进其向目标细胞的递送。
[0075]另外，由sHASEGPs的使用导致的膨胀压(oncotic pressure)改变，被认为 可有助于促进药理学试剂的递送。再次，不希望被理论所限制，sHASEGP的存在 和伴随的沿脉管组织间质侧的降解，将趋于降低间质间隙中的膨胀压，这继而将 促进流体从脉管到间质间隙的滤过。
[0076]降低间质压力的潜力，在肿瘤内间质压力(TIF的肿瘤间质压力)被升高的 许多癌症情形中，被认为是尤其重要的。高TIF可对从脉管向肿瘤中心的流体流 动产生相对阻挠，从而限制有效到达肿瘤的抗癌剂的量，尤其是瘤体中较深的位 置。sHASEGPs向肿瘤间质的引入将因此趋向于促进局部递送和全身可利用的抗癌 试剂的递送，当间质膨胀压被降低且扩散和/或对流输送被增加时，抗癌试剂能更 容易地渗透进肿瘤。肿瘤中TIF和水力传导度(K)的测量(例如，使用标记的分 子，如伊文思蓝染料(Evan′s Blue dye)标记的白蛋白)可用于定量地评价各种浓 度的sHASEGPs在体内对肿瘤的流体力学的影响，如本文举例说明的和/或本领域 中已知的。
[0077]下面的事实进一步加剧了许多肿瘤中降低的流体动力，并且突出了对肿瘤 使用sHASEGPs的额外的可能好处：许多肿瘤表现出糖胺聚糖的积累，尤其是透 明质素(其可能是由于作为透明质素分解代谢主要途径的淋巴系统在许多肿瘤中 被削弱或缺乏)。这种过量的透明质素可妨碍水力传导度。因而，sHASEGPs的引 入可用于抵消许多肿瘤中糖胺聚糖的积聚，改善肿瘤中的水力传导度，并有效地 使它们表现得更易受抗癌剂(无论是局部的或是全身递送的)的影响。
[0078]如本领域技术人员将理解的，这里描述的原理还可被应用于许多其它需要 被递送到身体中各位点的药理学试剂和其它试剂，例如，用于疾病的预防、诊断 和/或治疗或以其它方式调节生理功能。这些试剂的示例性种类(及其典型成员) 在本文被提供，还有许多是本领域已知的或正在开发的。
[0079]除了它们在对各种肠胃外给药的药理剂和/或试剂的潜在的改进和/或重新 配制方面的应用，sHASEGPs还可与非肠胃外试剂(例如制成片剂、液体或用于通 过胃肠道摄取和典型吸收的其它形式的试剂)一起使用。例如，由于大多数非肠 胃外药物最终必须到达间质中的细胞，以发挥它们期望的作用，sHASEGPs促进间 质中的扩散和/或对流输送的应用(全身地或局部地(例如，通过sHASEGP的局 部或靶向给药))可被用于改进非肠胃外药物(及肠胃外药物)到达期望目标细胞 的范围和/或速度。
[0080]另外，许多通常是非肠胃外给药(例如，口服)的试剂可被重新配制，或 它们的活性成分被重新配制，以用于肠胃外给药，其与sHASEGPs联合后表现得 更有效和/或安全。为了阐明这种可广泛应用的方法，sHASEGPs促进向特定组织 靶向给药的能力(例如，sHASEGPs提供向眼后部中的组织进行巩膜(transcleral) 递送的能力)，可被用于直接地且优先地递送各种试剂中的任何一种(包括以前全 身性给药的试剂)到身体中感兴趣的局部位点。这不仅能够在感兴趣的位点提供 更期望的和/或更快速达到的浓度，还能充分减少伴随全身给药可能出现的问题和 限制，在全身给药中，在非期望位点(undesired sites)的浓度可能与期望目标位点 (desired target site)的浓度相同甚至超过它(这潜在地引发不希望的副作用和试 剂浪费)。在一些情况下，并非广泛使用的试剂或并非用于某些适应症或某些病人 的试剂，例如，可以通过与sHASEGPs共同配制或共同给药，有效地被应用以使 另外的患者受益，如本文描述和阐明的。
[0081]如本领域技术人员将理解的，采用sHASEGPs来促进、加速和/或靶向共同 配制和/或共同给药的试剂的生物分布，以及操纵它们的药动学或药效学的其它方 面(例如，为了改进它们的风险：益处情况或协助患者、家庭或健康护理专业人员 的使用)的能力，提供了改进用于治疗、诊断或预防疾病的药物和其它试剂的主 要机会。
[0082]不被一系列具体应用所限制，糖胺聚糖酶，包括本文描述的sHASEGPs(以 及其它透明质酸酶和其它糖胺聚糖酶)，可被用于有效地实现许多药理学试剂和其 它试剂的大丸或大丸样递送，其通过非静脉肠胃外途径，以及通过其它给药途径 (例如，在其离开血流后(无论它们被直接引入血流(例如通过IV给药)或间接 引入血流(例如通过口服或非IV肠胃外给药))，通过促进试剂向目标组织和/或通 过目标组织的递送)。
[0083]不限于特定的作用机理或它的某个方面，相信，这些酶暂时地降解细胞之 间间质基质成分(其构成了身体中流体空间(fluid space)的实质部分，以及为了 使药理学试剂和其它试剂到达大多数目标细胞所必须穿过的相应大空间)的能力， 能显著促进试剂通过几种潜在协同的方法中的一种或多种向目标细胞的递送。首 先，尽管大量的间质流体表现出一定程度的流动性，但这种流动性经常被糖胺聚 糖例如透明质素和其它间质成分限制或阻碍。如本文描述和阐明的，糖胺聚糖酶 包括sHASEGPs(及其它透明质酸酶和其它糖胺聚糖酶)在这种间质间隙中开启通 道的能力，能用于减小阻碍并增加由任何特定“上游”压力导致的“下游”流动 的程度和速度。第二，在非IV肠胃外注注射sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)和 另外的药理学试剂或其它试剂的情况下，非IV肠胃外注射的体积可用于增加上游 驱动压或压位差(例如，通过增加限定空间内的液体静压力)，其可进一步促进流 动。第三，由于包括所引入的sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)和其它试剂的流体 的体积有效地压低(drive down)了升高的压力梯度(即，由伴随注射“大丸”的 液体静压力的升高和周围组织中间质压力的同时降低所导致的升高的梯度)，大丸 (bolus)中的溶质可被有效地运载(例如，通过对流输送)到相邻的组织中。因 此，这种注射流体或大丸能被有效地和相对快速地移动到相邻的组织中，并递送 任何在相同或临近引入位点引入的药理学试剂或其它试剂(例如，通过将试剂与 sHASEGP或其它糖胺聚糖酶联合共同配制或共同给药)。
[0084]例证性地，使用糖胺聚糖酶例如sHASEGPs在间质间隙中打开通道，如本 文描述和阐明的，可被用于增加间质流动流入和经过组织例如肿瘤和其它组织， 其中流动通常被阻碍且间质压力被升高。如本文所描述的这些理论的说明举例包 括使用sHASEGPs在体内降低肿瘤中的间隙压力。
[0085]增加的流动同样能被应用于正常组织中，例如，以便允许将麻醉剂、诊断 剂、整型试剂或其它美容试剂(esthetic)，或药理学试剂或其它试剂递送到组织中 (例如，为了修饰组织或将长效(depot)制剂引入组织中)。增加的流动同样能被 应用于第一组织或近端组织，以促进试剂穿过该引入组织向远端组织递送，其中 远端组织本身可以是期望的目标组织或是到达期望的目标组织的路径。本文所描 述的这些理论的说明性举例包括，例如，：(i)应用被引入到眼周围的巩膜上隙中 的sHASEGPs，促进试剂穿过巩膜的递送，以便靶向于眼内部的远端目标组织，例 如视网膜和脉络膜；和(ii)应用被皮内引入的sHASEGPs，以促进试剂穿过真皮 下层(subdermal layers)并进入血流的递送，血流本身可以是目标组织(例如，对 于血液修饰剂(blood-modifying agent))或可以是通过它试剂能被递送到身体中其 它目标组织的途径。
[0086]作为对用于促进药理学试剂和其它试剂向身体中期望组织的递送的这些技 术和组合物的进一步说明，下面的额外例子被提供。通过本文描述和阐明的手段， 药理学试剂的药动学和/或药效学曲线，以及其它试剂的吸收、分布和/或效力曲线， 可被增强或以其它形式改变。另外，那些基本上或实际上被限于通过一种途径(如， 通过IV注射)递送的试剂，可以通过其它更安全、更低侵入性、更低价和/或更方 便的途径来递送。
[0087]为了进一步举例说明且不限于具体的应用类型，一定体积(V)的含 sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)的液体(L)可被引入身体中的组织位点 (给药组织(dosing tissue))。通过本文描述和阐明的手段，GAG酶可被递送进给 药组织并且在一定程度上穿过给药组织。不限于具体的作用机理，GAG酶可通过 液体(L)体积的对流输送被有效地运载进入给药组织。对流输送又可被加速，这 部分地通过伴随L(其可提供驱动压)的液体静压力，部分地通过GAG酶在给药 组织的间质空间中打开通道的能力(其可降低对流动的下游阻碍并因而降低抵抗 压力(resisting pressure))。因此，流体驱动压力差异可产生，且在预期程度上讲， 其可被增加，例如，通过下述之一或两者：(i)引入并且在需要的情况下增加驱动 液体静压力(例如，通过将L引入限定空间并在需要的情况下增加V)；和(ii) 降低下游对流动的阻碍(例如，通过引入GAG酶，并在需要的情况下增加其效力， 例如可通过增加其浓度、增加其对降解的抵抗(例如，通过聚乙二醇化作用、超 唾液酸化作用或其它修饰)，和/或通过对流输送来增加它的递送(例如，通过增加 V)来实现))。
[0088]在某些实施方式中(例如，其中需要增加的递送范围或速度)，V是足以临 时扩大给药组织中GAG酶引入位点的体积。如将被本领域技术人员所理解的，可 适应的体积(V)和所产生的扩大(distension)(D)程度取决于具体组织。为了 说明的目的且非限制，扩大发生的程度依不同的情况有所不同，例如，情况(i) 给药组织是相对大的和/或快速移动流体填充的空间(例如，与静脉和动脉递送有 关的血流)，在这种情况中，L可以是大的(例如，如果需要的话可以是很多毫升)， 但D往往是相对最小的；(ii)给药组织是相对较小的和/或较低速流体填充的空间 (如，与鞘内递送有关的脑脊液)，这种情况中，L仍可以相对较大，但D可能高 于最小，取决于注射的准确位置和体积；(iii)给药组织是相对较小但可略微扩大 的空间(例如，眼周围的巩膜上隙)；或(iv)给药组织是相对更致密的和/或具有 更高抵抗压力(resisting pressure)的更局限的空间(例如，示例性地，与皮内递 送相关的皮肤)。
[0089]如将被本领域技术人员所理解的，V可在0.1ml以下的体积到大于100ml 的体积范围内变化，在许多应用中是在约0.5ml到20ml的范围，许多是在1ml到 10ml的范围，常常是在2到5ml；但对于具体情况可以有所变化，如本文所阐明 的。V还可以针对所需具体应用在这样的范围内被具体优化；例如，就一定范围 的测试体积，比较标准的药动学和/或药效学曲线。
[0090]如考虑到这些教导的本领域技术人员将理解的，通过将GAG酶的快速起效 和重新启动(reinitiating)通道开启活性(其既可促进递送也被它自己的递送所促 进)，与既能促进该催化活性又能被该催化活性促进的递送系统结合，多方协同药 物递送系统因而可以被产生；如本文进一步描述和阐明的。
[0091]在第一个例证性的方面，含sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)和一 种或多种药理学试剂或其它试剂(一种或多种试剂(例如可检测的分子或其它诊 断试剂、麻醉剂或其它组织修饰剂、药理学试剂或制药上的有效试剂、整形试剂 或其它美容试剂，和需要被引入到体内的一个或多个组织的试剂))的一定体积(V) 的液体，被引入体内的第一组织位点(first tissue site)(给药组织)，其本身是试剂 的期望目标组织(Target Tissue)。通过这里描述和阐明的方法，试剂被递送进目标 组织并遍及目标组织，其相比没有GAG酶的情况具有更大的范围(extent)和/或 速度(rate)。
[0092]关于此方面和本文的其它例证性方面，本领域技术人员将理解的是，给药 组织可以是从身体外部(例如，使用本文描述和阐明的和/或本领域已知的各种给 药途径)或从身体内部(例如，与外科手术有关，或使用各种非外科或最小侵入 性的方法和器件中的任意种类来到达身体中的组织)易于到达的各种组织中的任 意组织。这样的给药组织包括本文描述和阐明的那些以及本领域中已知的其它组 织。
[0093]关于此方面和本文的其它例证性方面，本领域技术人员还将理解的是，目 标组织可以是GAG酶和可能其它试剂被期望递送到的各种组织中的任意组织(例 如，(i)作为诊断、预防或治疗疾病症状(无论是内在因素导致的，例如遗传的或 后天的疾病症状，或外在因素导致的，例如感染)的努力的对象的组织；(ii)需 要被麻醉或以其它方式调节的组织(例如，在外科手术和/或其它处理的情况下)； (iii)期望在其中引发免疫应答的组织(例如，与疫苗接种相关)；(iv)作为将试 剂释放到其它组织的储库位点的组织；(v)为美容或整形目的而被修饰的组织； 和(vi)为了其它目的而被修饰的体内组织或位点)。这样的目标组织包括本文描 述和阐明的那些，以及本领域中已知的其它组织。
[0094]关于前述方面和本文的其它例证性方面，本领域技术人员还将理解的是， 试剂可以是各种分子、大分子和大分子复合物中的任意种类，其被用于或可以被 用于改变或调节身体中的状况(例如，(i)为了诊断、预防或治疗影响目标组织和 /或临近组织的疾病症状(无论是内在因素导致的，例如遗传的或后天的疾病症状， 或外在因素导致的，例如感染)的目的；(ii)为了麻醉或以其它方式调节目标组 织的生理机能的目的；(iii)为了引发疫苗接种所伴随的免疫应答的目的；(iv)为 了将目标组织用作释放试剂到其它组织的储库位点的目的；(v)为了美容或整形 目的；和/或(vi)为了通过将GAG酶和可能其它试剂递送到体内组织或其它位点 所能达到的目的)。这样的试剂包括本文描述和阐明的各个种类的试剂及其成员， 以及这些种类的试剂的其它成员，以及本领域已知的其它种类试剂(及其成员)。
[0095]在第二个例证性的方面，含sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)和一 种或多种药理学试剂或其它试剂(Agent(s))的一定体积(V)的液体，被引入身 体中的组织位点(给药组织)，其与本身是期望的目标组织(Target Tissues)的组 织(组织B)临近或最接近。通过本文描述和阐明的手段，试剂从组织A被递送 到组织B，其相比没有GAG酶的情况具有更大的范围和/或速度。
[0096]在第三个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和 一种或多种药理学试剂或其它试剂的一定体积(V)的液体，被引入身体中的组织 位点(给药组织)，其最接近位于组织A和本身作为期望的目标组织或包含期望的 目标组织(目标组织)的另外一个或多个组织(远端组织)之间的一个或多个组 织(中间组织)。通过本文描述和阐明的手段，试剂经由一个或多个中间组织，从 组织A被递送到一个或多个目标组织，其相比没有GAG酶的情况具有更大的范围 和/或速度。
[0097]在第四个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和 一种或多种药理学试剂或其它试剂的一定体积(V)的液体，被引入身体中的组织 位点(给药组织)，其最接近一个或多个递送组织，例如血流、淋巴或脑脊液(递 送组织)，它们是期望的目标组织或包括期望的目标组织。通过本文描述和阐明的 手段，试剂从组织A被递送到一个或多个递送组织，其相比没有GAG酶的情况具 有更大的范围和/或速度。
[0098]在第五个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和 一种或多种药理学试剂或其它试剂的一定体积(V)的液体，被引入身体中的组织 位点(给药组织)，其最接近一个或多个递送组织，例如血流、淋巴或脑脊液(递 送组织)，递送组织将流体递送到身体中的一个或多个所需目标组织(目标组织)。 通过本文描述和阐明的手段，试剂从组织A被递送到一个或多个递送组织，然后 从那里被递送到一个或多个下游目标组织，其相比没有GAG酶的情况具有更大的 范围和/或速度。
[0099]在第六个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和 一种或多种药理学试剂或其它试剂的一定体积(V)的液体，被引入一个或多个递 送组织，例如血流、淋巴或脑脊液(递送组织)，递送组织将液体提供给一个或多 个所需目标组织(例如，通过供给目标组织的血流)。通过本文描述和阐明的方法， 试剂渗入目标组织，其相比没有GAG酶的情况具有更大的范围和/或速度。
[0100]在第七个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的 一定体积(V)的液体，被引入身体中的组织位点(组织A)，其即是所需目标组 织或临近所需目标组织(目标组织)，并且一种或多种药理学试剂或其它试剂通过 另一给药途径(例如，通过口服递送或静脉注射)被引入体内，这使得试剂能够 到达目标组织(例如，在吸收或注射入血液后，通过供给目标组织的血流)。通过 本文描述和阐明的方法，试剂渗入目标组织，其相比没有GAG酶的情况具有更大 的范围和/或速度。
[0101]在第八个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的 一定体积(V)的液体，被引入身体中的一个或多个组织位点(Tissue Sites)，所 述位点具有升高的间质压力。通过本文描述和阐明的方法，组织位点中的间质压 力通过GAG酶的降解活性被降低。
[0102]在第九个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的 一定体积(V)的液体，被引入身体中的一个或多个组织位点，所述位点具有过量 的透明质素或其它糖胺聚糖。通过本文描述和阐明的方法，组织位点中过量的透 明质素或其它糖胺聚糖通过GAG酶的降解活性被减少。
[0103]在第十个例证性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的 一定体积(V)的液体，被引入身体中的一个或多个组织位点，其位于或接近于皮 下输液的期望接入点(access point)(点滴位点(Clysis Site))。通过本文描述和阐 明的方法，流体然后可以被递送进并经过点滴位点，其相比没有GAG酶的情况具 有更大的范围和/或速度。
[0104]考虑到文中提供的详细描述和例证性实施方式，本领域技术人员将理解， 许多种类的试剂中的任意试剂都可被共同引入(例如，通过与GAG酶共同配制和 共同给药)，各种GAG酶中的任何酶都可以被使用，其使用浓度可以是本文提供 的那些范围，但通常针对所涉及的特定组织和对象进行优化。在上述例证性方面 中使用的液体体积(V)通常将取决于引入位点的性质，并且同样地，通常将针对 所涉及的特定组织和对象进行优化。如本文描述和阐明的，在非IV肠胃外给药的 情况下，V可被增加(在组织位点的具体限制内)，以便提供增强的静液驱动压力， 其与伴随透明质素或其它糖胺聚糖的降解而出现的降低的阻碍相结合，可以有效 地导致该体积的液体能够作为大丸剂而发挥作用——将其所含有的任何溶质运载 到下游间质空间和潜在地更远的位置。
[0105]因此，本文提供的是应用透明质酸酶(和/或其它糖胺聚糖酶)来促进药理 学试剂和其它试剂向体内位点递送的各种技术，以及被称为sHASEGPs的一组真 核细胞分泌的中性活性透明质酸酶糖蛋白，以及其功能结构域，尤其其透明质酸 酶(或催化)结构域，突变蛋白和其它衍生物以及其类似物。本文还提供了编码 sHASEGPs的核酸。另外，提供了所述sHASEGPs(包括通过与其它试剂共同给药) 的制剂、联合制剂和治疗用途，用于治疗、预防或诊断疾病，以及用作组织修饰 酶。附图说明
[0106]图1为sHASEGP载体HZ24的载体图。发明详述
[0107]A.定义：除非另外指出，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属技术 领域技术人员的常规理解具有相同的含义。除非另外指出，在本文的全部公开内 容中所引用的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、网址和 其他公开材料通过引用方式将其整体并入本文。如果对于本文中的术语有许多定 义，以这部分中的定义为主。
[0108]当引用URL或其他此种标识或地址时，应该理解的是，此种标识可能变化， 因特网上的特定信息可以来来往往，但是通过搜索因特网可以找到等同的信息。 因此，引用是证明了这样的信息是可获得的且是公开传播的。
[0109]如本文中所使用的，除非另外指出，任何保护基团、氨基酸和其他化合物 的缩写是依据它们的常规用法、公认缩写或IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(参见(1972)Biochem.11：942-944)。
[0110]如本文中所使用的，真核透明质酸酶是指各种不同家族的糖胺聚糖内切氨 基葡萄糖苷酶，其中，透明质酸酶中的谷氨酸残基通过酸-碱催化机制水解透明质 素和硫酸软骨素的β-1，4键。
[0111]尤其感兴趣的是哺乳动物包括人来源的可溶性中性-活性透明质酸酶或 sHASEGPs。本领域技术人员将认识到，一般来说，在多肽的非实质性区域的单个 氨基酸替代基本上不改变生物学活性(参见如Watson et al.，(1987)Molecular Biology of the Gene，4th Edition，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
[0112]如本文中所使用的，膜锚定sHASEGP(membrane anchored sHASEGP)是 指膜锚定的透明质酸酶家族，其具有本文中描述的共同结构特征。如本文所描述 和阐明的，通常被膜锚定的透明质酸酶(例如，能够分解透明质素的糖胺聚糖酶， 优选在中性pH范围内表现出至少一些活性的那些酶)可通过移除或以其它方式修 饰一个或多个参与将透明质酸酶锚定在膜中的区域，而被转化为可溶性HASEGPs 或sHASEGPs。
[0113]如本文中所使用的，可溶性透明质酸酶是指在生理条件下具有溶解性的多 肽。可溶性HASEGP例如可以通过它分配进入加温到37℃的Triton X-114溶液的 水相而被辨别(Bordier et al J Biol Chem.1981 Feb 25；256(4)：1604-7)。另一方面， 脂锚定HASEGP(Lipid anchored HASEGP)将分配进入富含去污剂的相，但在用 磷脂酶C处理后，将分配进入缺乏去污剂的相或水相中。
[0114]因此，在提及例如“sHASEGP”时，包括了由sHASEGP基因家族编码的 所有糖蛋白，包括但不限于：人sHASEGP、小鼠sHASEGP，或从任何其他来源 获得的等同分子，或者合成制备而得的等同分子，或者显示出同样活性的等同分 子。示范性的sHASEGPs和/或其结构域的编码核酸分子序列和编码的氨基酸序列 描述于例如SEQ ID NO：4中。该术语也包括具有氨基酸替代的sHASEGP，所述 替代基本上不改变每一成员的活性，该术语也包含其拼接变体(splice variants)。 合适的替代，包括——尽管不必须是——氨基酸的保守替代，是本领域技术人员 已知的，并且这样的替代可以在不消除所得分子的生物活性诸如催化活性的情况 下进行。
[0115]如本文中所使用的，sHASEGP，在本文中无论什么时候被提及时，都包括 下述物质中的至少一个或所有或任何组合：由SEQ ID NO.6中阐述的核苷酸序列 编码的多肽，或由包括编码SEQ ID No.1的氨基酸1-509的核苷酸的核苷酸序列编 码的多肽；由在低、中等或高严格条件下与SEQ ID NO.6中所述的核苷酸序列杂 交的核苷酸序列编码的多肽；包括SEQ ID No.1的氨基酸1-509所述的氨基酸序列 的多肽；包括与SEQ ID No.1中所述的氨基酸序列或SEQ ID No.4中的氨基酸1-448 的序列具有至少约60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％ 序列同一性的氨基酸序列的多肽。
[0116]特别地，提供了sHASEGP多肽，其具有SEQ ID No.4所示的透明质酸酶结 构域。该多肽是单链多肽或双链多肽。也提供了保留有透明质酸酶活性的其更小 部分。sHASEGPs的透明质酸酶结构域在尺寸上和构成上有所变化，可以包括在表 面环(surface loops)中的插入和删除。因此，对于本文的目的，催化结构域是 sHASEGP的一部分，如本文中所定义，并且与以前已被鉴定的其他透明质酸酶样 序列(hyaluronidase like sequences)诸如HYAL1、HYAL2、HYAL3的结构域同源； 然而，过去还未发现，分离的单链形式的人透明质酸酶结构域能在体外测定中发 挥功能。对活性而言所必需的天冬氨酸和谷氨酸残基存在于保守的基序(motifs) 中。
[0117]如本文中所使用的，“可溶性sHASEGP的中性透明质酸酶结构域(neutral hyaluronidase domain of a soluble sHASEGP)”是指sHASEGP的β-1，4内切氨基葡 萄糖苷酶结构域，其在中性pH中显示出透明质酸酶活性，在所述的条件下是可溶 性的，并且与透明质酸酶糖基-水解酶家族结构域具有同源性和共同的结构特征， 但在羧基末端含有额外的序列，这对于中性条件下的活性是必需的。因此，它至 少是在标准的体外分析评价中显示出透明质酸酶活性并保留可溶性的结构域的最 小部分。本文中所考虑的是这样的透明质酸酶结构域和其催化活性部分。也提供 了截短形式的透明质酸酶结构域，包括其最小的片段，它以单链形式发挥催化作 用。如本文和本领域所使用的，中性或中性-活性是指，蛋白质在中性pH表现出 活性(例如，在约pH 7表现出活性)并因此在许多生理组织的特征pH范围内是 有活性的。还被本领域技术人员所理解的是，蛋白质通常在其最适pH附近表现出 一定范围的活性。中性活性蛋白的最适pH通常在pH 7上下一到几个pH单位内， 但其活性范围可延伸到许多个pH单位之外。
[0118]sHASEGP的透明质酸酶结构域，在本文中无论什么时候被提及，都包括下 述多肽中的至少一个或所有或任何组合或催化活性部分：包括SEQ ID No.1所述的 氨基酸序列的N-连接糖蛋白多肽；由在低、中等或高严格条件下与SEQ ID NO.6 中所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的多肽；包括SEQ ID No.1中所述的氨 基酸序列的多肽；包括与SEQ ID No.1中所述的氨基酸序列具有至少约70％、75％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，和/ 或由sHASEGP的拼接变体编码的多肽的透明质酸酶结构域。
[0119]因此，对于本文的目的，透明质酸酶结构域是sHASEGP的一部分，如本文 中所定义，并且与其他sHASEGP的结构域同源。对于透明质酸酶家族的更大类别 的酶，sHASEGP催化结构域享有高度的氨基酸序列同一性。对于活性所必需的 Asp和Glu残基存在于保守基序中。
[0120]至于活性形式，是指在体内和/或体外具有活性的形式。如本文中所描述的， 透明质酸酶结构域也能以可溶的分泌的糖蛋白的形式存在。本文已经显示，至少 在体外，单链形式的sHASEGPs和其催化结构域或酶活性部分(通常C-末端截短) 显示出透明质酸酶活性。因此，本文中提供的是分离形式的sHASEGPs透明质酸 酶结构域，以及它们在体外药物筛选分析中的应用，所述体外药物筛选分析用于 鉴定调节其活性的试剂。
[0121]如本文中所使用的，sHASEGP的催化活性结构域是指中性活性的内切氨基 葡萄糖苷酶结构域，如通过针对糖胺聚糖底物的体外活性所定义的。
[0122]感兴趣的sHASEGPs包括那些在体内和体外对硫酸软骨素和硫酸软骨素 蛋白聚糖(CSPG′s)具有活性的sHASEGPs；和那些对透明质素具有活性的 sHASEGPs。如本文中所使用的，人sHASEGP是由存在于人类基因组中的核酸诸 如DNA编码的sHASEGP，包括所有的等位基因变体和保守变异，只要它们不是 在其他哺乳动物中发现的变体就可以。
[0123]如本文中所使用的，编码sHASEGP的透明质酸酶结构域或其催化活性部 分的核酸可解释为只编码所述的单链透明质酸酶结构域或其活性部分的核酸，该 核酸不编码作为连续序列的sHASEGP其他相邻部分。
[0124]如本文中所使用的，“疾病(disease)”或“紊乱(disorder)”指由例如感染 或遗传缺陷引起的生物体中的病理状态，并表征为可检测的症状。
[0125]如本文中所使用的，拼接变体(splice variant)是指对基因组核酸诸如DNA 的初级转录物进行不同的加工而产生的变体，通过所述的不同的加工可以产生一 种以上类型的mRNA。本文中提供了sHASEGPs的拼接变体。
[0126]如本文中所使用的，sHASEGP蛋白的透明质酸酶结构域是指显示出中性内 切氨基葡萄糖苷酶活性的sHASEGP透明质酸酶结构域。因此，它至少是蛋白质的 最小部分，其显示出内切氨基葡萄糖苷酶活性，如用标准的体外分析所评价的。 示范性的人透明质酸酶结构域包括SEQ ID No.4所述的氨基酸序列的至少一个足 以显示出内切氨基葡萄糖苷酶活性的部分。
[0127]也考虑了这样的核酸分子，其编码在体外透明质酸酶分析中具有内切氨基 葡萄糖苷酶活性的多肽，与sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域的全长具有至少 70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或沿着它 们的全长或沿着全长的至少约70％、80％或90％与编码透明质酸酶结构域的核酸 杂交，尤其是在中等严格条件下，通常在高严格条件下杂交。
[0128]对于例如PH20的透明质酸酶结构域，N-末端区域的残基对活性可能是关 键的，但不是充分的。通过应用例如本文所示的技术，可以产生具有催化活性的 sHASEGP透明质酸酶结构域。作为举例说明，尽管人PH20的透明质酸酶结构域 通常需要其N-末端氨基酸以获得活性；C-末端部分可被截短直至最后的半胱氨酸 残基，但为了获得最佳活性，仍需要额外的氨基酸。通过用评价催化切割的体外 分析来测试多肽的透明质酸酶活性，可以被截去的数量可以经验性地被确定。
[0129]因此，本发明考虑了透明质酸酶结构域特别是单链结构域的较小部分，其 保留透明质酸酶活性。这样的较小的形式一般是透明质酸酶结构域的C-端截短形 式。透明质酸酶结构域在尺寸和构成上有所变化，包括在表面环中的插入和删除。 这样的结构域显示出保守的结构，包括至少一个结构特征，诸如质子供体，和/或 内切氨基葡萄糖苷酶的透明质酸酶结构域的其他特征。因此，对于本文目的，透 明质酸酶结构域是sHASEGP的一个单链部分，如本文中所定义，但在它的结构特 征和序列类似性或同源性的保留方面与其他透明质酸酶样序列的透明质酸酶结构 域具有同源性。作为单链，该糖蛋白显示出透明质酸酶活性。
[0130]如本文中所使用的，同源性是指约大于25％的核酸序列同一性，诸如25％、 40％、60％、70％、80％、90％或95％。如果有必要的话，同源性百分比将被明确 说明。术语“同源性(homology)”和“同一性(identity)”常常交换使用。一般 地，将序列进行联配，以便获得最高级别的匹配(参见如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing： Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993； Computer Analysis of Sequence Data，Part/，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.， Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje， G.Academic Press，1987和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.， eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et A1.(1988)et al.(1988)Slam J Applied Math 48)：1073)。
[0131]根据序列身份，保守氨基酸的数目通过标准的联配算法程序而被确定，其 中使用由各供应商设立的默认空位罚值。基本上同源的核酸分子将通常沿着感兴 趣的核酸分子的全长或沿着全长的至少约70％、80％或90％，在中等严格性或高 严格性条件下发生杂交。也考虑了这样的核酸分子，其包含了简并密码子来替代 杂交核酸分子中的密码子。
[0132]任意两种核酸分子是否具有至少例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％“同一性”的核苷酸序列，可以使用已知的计算机算法诸如“FASTA” 程序来确定，使用例如Pearson et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中的 默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al，Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.，et al，J MOLEC BIOL 215： 403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，[ED.，]Academic Press，San Diego，1994，和[CARILLO et al.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，美国 国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库的 BLAST功能可以被用于确定同一性。其他商业的或公用的程序包括DNASTAR ″MEGALIGN″PROGRAM(Madison，WI)和威斯康星大学Genetics Computer Group (UWG)″Gap″程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或同一性百分比 可以例如通过使用GAP计算机程序来比较序列信息而得以测定，GAP计算机程序 例如Needleman et al.(1970)，J Mol Biol.48：443，按照Smith and Waterman Adv.Appl. Math(1981)2：482的修改。简言之，GAP程序将相似性定义为，相似的联配符号 (即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两条序列中较短的一条中的符号总数。GAP 程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(unary comparison matrix)(对于相 同的情况，所包含的值为1，对于不相同的情况，值为0)和Gribskov et al(1986)Nucl. Acids Res.14：6745的加权比较矩阵(weighted comparison matrix)，如Schwartz and Dayhoff，eds.，Atlas Of Protein Sequence And Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)描述；(2)每一空位的罚值为3.0，每一空位中的每一 符号的附加罚值为0.10；和(3)末端空位无罚值。因此，如本文中所使用的，术语 “同一性”代表了受测和参考多肽或多核苷酸之间的比较。
[0133]如本文中所使用的，术语“至少90％同一性”是指相对于参考多肽的90至 99.99的同一性百分比。90％或更高水平的同一性表明这样一个事实，示例性地假 设100个氨基酸长的受测和参考多肽被比较的话，在受测多肽中不超过10％(即 100个中的10个)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。在受测和参考多核苷酸之 间，可以进行类似的比较。这样的差异可以体现为在全长的氨基酸序列中随机分 布的点突变，或可以它们可以聚集在变化长度的一个或多个位置，最高可至所允 许的最大值，例如10/100的氨基酸差异(约90％同源性)。差异可以限定为核酸或 氨基酸的替代或缺失。在同源性或同一性的水平超过约85-90％时，结果应该不依 赖于程序和空位参数设置；这样的高水平的同一性可以很容易进行评估，通常不 需要依靠软件。
[0134]如本文中所使用的，引物是指包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核 苷酸的寡核苷酸，通常大于3个，由所述引物可以启动引物延伸产物的合成。有 助于合成的实验条件包括存在核苷三磷酸和用于聚合反应和延伸的试剂，诸如 DNA聚合酶，以及合适的缓冲液、温度和pH。
[0135]如本文中所使用的，动物包括任何动物，诸如但不限于山羊、牛、鹿、绵 羊、啮齿类动物、猪和人。非人动物是指除了人之外的被考虑到的动物。所提供 的sHASEGPs来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。优选的sHASEGPs 是动物来源，包括哺乳动物来源，更优选地，在它们用于人类的情况下，是人类 来源。
[0136]如本文中所使用的，遗传疗法涉及将异源核酸例如DNA转移到哺乳动物特 别是人的某些细胞，即靶细胞，所述动物具有此疗法所要解决的紊乱或症状。核 酸例如DNA以这样的方式导入所选择的靶细胞，即，使得该异源核酸例如DNA 被表达并且所编码的治疗性产物由此产生。
[0137]可选择地，异源核酸，例如DNA，可以以某方式介导编码治疗性产物的 DNA的表达，或它可以编码某产物，例如肽或RNA，其以某方式直接或间接地介 导治疗性产物的表达。遗传疗法也可以被用来递送编码某基因产物的核酸，其替 代缺陷基因，或补充由导入有所述核酸的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入 的核酸可以编码治疗化合物，诸如其生长因子抑制剂，或肿瘤坏死因子或其抑制 剂，诸如受体，这些治疗化合物一般情况下不产生于哺乳动物宿主中，或不以治 疗上有效的量或不在治疗上有用的时间产生。在导入到病痛的宿主的细胞中之前， 编码治疗性产物的异源核酸例如DNA可以被修饰，以增强或以其它方式改变该产 物或其表达。遗传疗法也可以涉及递送基因表达的抑制剂或阻遏物或其他调节物。
[0138]如本文中所使用的，异源核酸是这样的核酸，该核酸编码的蛋白质(或者， 如果是DNA，则编码编码蛋白质的RNA)在正常情况下不由表达所述异源核酸的 细胞在体内产生，或者异源核酸介导内源性核酸例如DNA的表达或编码改变内源 性核酸例如DNA的表达的调节物，所述介导或改变是通过影响转录、翻译或其他 可调节的生物化学过程来实现的。异源核酸，例如DNA，也可以称为外来核酸， 例如DNA。本领域技术人员将其识别为或考虑为对于表达它的细胞来说是异源的 或外来的任何核酸例如DNA，均包括在本文的异源核酸之内；异源核酸包括外源 性加入的核酸，其也被内源性表达。异源核酸的例子包括，但不限于：编码可追 踪的标记蛋白的核酸，所述的可追踪的标记蛋白例如赋予药物抗性的蛋白；编码 治疗上有效的物质的核酸，所述的治疗上有效的物质例如抗癌剂、酶和激素；和 间接或直接编码其他类型的蛋白例如抗体的核酸(例如DNA和RNA)。由异源核 酸编码的抗体可以被分泌或表达在已经导入有该异源核酸的细胞的表面。
[0139]通常，异源核酸对于导入它的细胞来说不是内源性的，但是已经从别的细 胞获得或通过合成制备得到。
[0140]一般地，尽管不是必须的，这样的核酸编码的RNA和蛋白质在正常情况下 不由表达它的细胞产生。
[0141]如本文中所使用的，治疗上有效的产物是由异源核酸——通常是DNA—— 编码的产物，一旦将该核酸导入到宿主中后，产物被表达，可缓解或消除作为遗 传疾病或获得性疾病的表现的症状，或者该产物治愈该疾病。
[0142]如本文中所使用的，糖蛋白基本上由透明质酸酶结构域组成的这一叙述是 指，多肽的唯一sHASEGP部分是透明质酸酶结构域或其催化活性部分。该多肽可 以任选地——并且一般地——将包括额外的非sHASEGP来源的氨基酸序列。
[0143]如本文中所使用的，结构域(domain)是指分子例如糖蛋白或编码核酸的 某部分，其在结构上和/或功能上不同于该分子的其他部分。
[0144]如本文中所使用的，透明质酸酶(hyaluronidase)是指催化糖胺聚糖——包 括透明质素——的水解的酶。
[0145]为了清楚起见，提及透明质酸酶时，是表示所有的形式，并且特定的形式 将被特别地指出。对于本文的目的，透明质酸酶结构域包括膜结合形式和可溶形 式的sHASEGP蛋白。
[0146]如本文中所使用的，核酸包括DNA、RNA和其类似物，包括蛋白核酸 (protein nucleic acids，PNA)和其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及探 针或引物时——其用可检测的标记诸如荧光染料或放射性标记任选地标记，通常 考虑单链分子。这样的分子通常是这样的长度，即，其使得在探查或起动(priming) 一个文库时它们的靶标是统计上独特的或低拷贝数的(通常小于5，一般小于3)。 如本领域所知的，一般地，探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的相邻序 列或几乎相邻序列的至少14、16、20或30个残基。探针和引物的长度可以是10、 20、30、50、100或更多的核苷酸。
[0147]如本文中所使用的，编码sHASEGP片段或部分的核酸是指编码仅仅所述 的sHASEGP片段或部分，而不编码sHASEGP的其他相邻部分的核酸。
[0148]如本文中所使用的，异源核酸与调控核苷酸序列或效应子(effector)核苷 酸序列，例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其他信号序列的操作性连 接(operative linkage)是指此种核酸例如DNA和此种核苷酸序列之间的关系。例 如，异源DNA与启动子的操作性连接是指DNA和启动子之间的功能(以及通常 物理上的)关系，依据这样的关系，此种DNA的转录由RNA聚合酶从启动子处 启动，所述RNA聚合酶特异性地识别、结合并转录阅读框中的DNA。因此，操 作性连接或操作性地关联是指，核酸例如DNA与调控核苷酸序列和效应核苷酸序 列例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点或其他信号序列之间的功能关系。 为了优化表达和/或体外转录，可能有必要去除、添加或改变克隆的5’非翻译部分， 以消除多余的、潜在不合适的选择性翻译起始(即，起始)密码子或其他序列， 这样密码子或其他序列或在转录水平或在翻译水平干扰或减少表达。可选择地， 共有的核糖体结合位点(参见如Kozak J.Biol.Chem.266：19867-19870(1991))可以 紧挨着起始密码子的5′端插入，从而可以增强表达。对此种修饰的愿望(或需求) 可以经验性地被确定。
[0149]如本文中所使用的，与RNA的至少一部分相互补的序列，也称为反义寡核 苷酸，是指这样的序列，其与RNA充分互补，能与RNA杂交，一般是在中等或 高严格条件下杂交，形成稳定的双螺旋；在双链sHASEGP反义核酸的情况下，可 以测试双螺旋DNA(或dsRNA)的单链，或可以分析三股螺旋的形成。杂交的能力 取决于互补的程度和反义核酸的长度。一般地，杂交核酸越长，它能够容许的与 sHASEGP的编码RNA的碱基错配越多，并且依然能形成稳定的双螺旋(或三股 螺旋，如果情况合适的话)。通过使用标准的程序去测定杂交复合体的熔点，本领 域技术人员可以确定错配的可容忍程度。
[0150]对于本文的目的，只要所得到的蛋白质显示有透明质酸酶活性，氨基酸替 代可以在任何的sHASEGPs和其透明质酸酶结构域进行。所考虑的氨基酸替代包 括保守性替代，例如表1中所述的那些，以及不会消除蛋白水解活性的其它修饰。 如本文中所描述的，也考虑了改变蛋白质的特性的替代，例如去除切割位点和其 他此类位点；此类替代一般是非保守的，但会容易地被本领域技术人员完成。
[0151]合适的氨基酸保守性替代是本领域技术人员已知的，一般可以在不消除(并 且优选地不实质性地改变)所得分子的生物活性如酶活性的情况下进行。本领域 技术人员将认识到，一般来说，在多肽的非必需区域进行的单个氨基酸的替代基 本上不会改变生物学活性(参见如Watson et al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。同样包括在此定义中的是， sHASEGP的催化活性片段，特别是单链透明质酸酶部分。例如，根据下面表1所 述的那些来进行的保守的氨基酸替代：
[0152]表1原始残基保守性替代Ala(A)Gly；Ser，Abu Arg(R)Lys，Orn Asn(N) Gln；His Cys(C)Ser Gln(Q)Asn Glu(E)ASP Gly(G)Ala；Pro His(H)Asn；Gln Ile (I)Leu；Val；Met；Nle；Nva Leu(L)；Val；Met；Nle；Nva Lys(K)Arg；Gln； Glu Met(M)Leu；Tyr；Ile；NLe Val Orn Lys；Arg Phe(F)Met；Leu；Tyr Ser(S)Thr Thr(T)Ser Trp(W)Tyr Tyr(Y)Trp；Phe Val(V)ILE；Leu；Met；Nle；Nva。其他 的替代也是允许的，并可以经验性地确定，或根据已知的保守替代来确定。
[0153]如本文中所使用的，Abu是2-氨基丁酸；Nle是正亮氨酸；Nva是正缬氨酸； Orn是鸟氨酸。如本文中所使用的，本文中出现的各种氨基酸序列中的氨基酸是根 据它们公知的三字母或单字母缩写来表示的。出现在各种DNA片段中的核苷酸， 是用本领域常规使用的标准的单字母标识来表示的。
[0154]如本文中所使用的，基于公开于本文中的核苷酸序列的探针或引物，包括 SEQ ID NO.6的至少10、14，通常至少16个连续核苷酸序列，以及甚至更优选地， SEQ ID NO.6的至少20、30、50或100个连续核苷酸序列。用于特定杂交的探针 或引物的长度是感兴趣的基因组的复杂度的函数。
[0155]如本文中所使用的，通过给予特定的药物组合物而导致的特定紊乱的症状 的缓解是指，可归因为组合物的给予或与组合物的给予相关的任何的减轻，无论 是永久的还是暂时的，持续的还是瞬时的。
[0156]如本文中所使用的，反义多核苷酸是指合成的核苷酸碱基序列，其与mRNA 或双链DNA的有义链相互补。有义和反义多核苷酸的混合物在合适的条件下导致 两分子的结合或杂交。当这些多核苷酸与mRNA结合(杂交)时，蛋白质合成(翻 译)的抑制发生。当这些多核苷酸结合到双链DNA时，RNA合成(转录)的抑 制发生。
[0157]所产生的翻译和/或转录抑制作用抑制了有义链编码的蛋白质的合成。反义 核酸分子通常含有足够数目的核苷酸来特异性地结合目标核酸，通常至少5个连 续的核苷酸，常常至少14或16或30个连续的核苷酸或修饰的核苷酸，其与编码 感兴趣的基因的核酸分子的编码部分相互补，例如与编码sHASEGP的单链透明质 酸酶结构域的核酸互补。
[0158]如本文中所使用的，阵列是指元素例如抗体的集合，其含有3个或更多成 员。可寻址阵列(addressable array)是这样的阵列，在其中，阵列的成员一般可 以通过在固相支持物上的位置而被鉴定。因此，一般而言，阵列的成员被固定在 固相表面的离散的可鉴定的位点上。
[0159]如本文所使用的，抗体是指免疫球蛋白，无论是天然的或者部分或全部合 成产生的，包括保留抗体特异性结合能力的任何衍生物。因此，抗体包括具有结 合结构域的任何蛋白质，所述结合结构域与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上 同源。抗体包括任何免疫球蛋白主张中的成员，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0160]如本文所使用的，抗体片段是指抗体的任何衍生物，它的长度小于全长， 保留了全长抗体的特异性结合能力的至少一部分。抗体片段的例子包括，但不限 于，Fab、Fab’、F(AB)2、单链Fvs(scFV)、FV、dsFV双抗体和Fd片段。片段可 以包括例如通过二硫桥连接在一起的多条链。一般地，抗体片段包括至少约50个 氨基酸，典型地含有至少200个氨基酸。
[0161]如本文所使用的，Fv抗体片段是由一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻 链结构域通过非共价相互作用联系在一起而组成。
[0162]如本文所使用的，dsFV是指具有工程制造的分子间二硫键的Fv。
[0163]如本文所使用的，F(AB)2片段是用胃蛋白酶在pH 4.0-4.5消化免疫球蛋白 而得到的抗体片段；它可以通过重组方法来表达，从而产生等同的片段。
[0164]如本文所使用的，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而产生的抗体片 段；它们可通过重组的方法表达，以产生等同的片段。
[0165]如本文所使用的，scFVs是指含有可变轻链V和通过多肽连接子以任何顺 序共价连接的可变重链(VH)的抗体片段。该连接子的长度可以使两个可变结构 域在基本上无相互干扰的情况下连接起来。所述的连接子包括(Gly-Ser)n残基，其 中遍布着一些Glu或Lys残基，以增加溶解性。
[0166]如本文所使用的，人源化抗体是指被修饰成包含人类氨基酸序列的抗体， 这样对人体给药时不会引起免疫反应。这种抗体的制备方法是已知的。例如，为 了产生这种抗体，表达单克隆抗体的杂交瘤或其它原核或真核细胞如大肠杆菌或 CHO细胞，可通过重组DNA技术来改变以表达此抗体，其中非可变区域的氨基 酸组成是基于人抗体的。计算机程序已被设计用于识别这样的区域。
[0167]如本文所使用的，双抗体(diabodies)是二聚的scFV；双抗体一般具有比 ScFVs短的肽连接子，且它们一般形成二聚体。
[0168]如本文所使用的，通过使用重组DNA方法的重组手段的生产，是指使用已 知的分子生物学方法来表达由克隆DNA编码的蛋白质。
[0169]如本文所使用的，术语评估(assessing)，旨在包括定量地和定性地获得存 在于样品中的sHASEGP或其结构域的活性的绝对值测定，还包括获得表征活性水 平的指数(index)、比率、百分比、视觉的或其它的数值。评估可以是直接或间接 的，实际检测的化学品种类不必必须是蛋白质水解产物本身，也可以是，例如， 其衍生物或一些更进一步的物质。
[0170]如本文所使用的，生物活性是指化合物的体内活性，或由化合物、组合物 或其它混合物的体内给药所引起的生理应答。因此，生物活性包括此类化合物、 组合物和混合物的治疗效果和药物活性。生物活性可以采用被设计用来测试或应 用此类活性的体外系统来观察。因此，对于本文的目的，荧光素酶的生物活性是 其加氧酶活性，由此，当底物发生氧化时，产生光。
[0171]如本文所使用的，功能活性(functional activity)是指显示出与全长蛋白质 相关的一种或多种活性的多肽或其一部分。
[0172]功能活性包括，但不限于，生物学活性、催化或酶活性、抗原性(结合多 肽或与多肽竞争来结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、与受 体或多肽配体特异结合的能力。
[0173]如本文所使用的，缀合物(conjugate)是指本文提供的化合物，其包括一 种或多种sHASEGPs和一种或多种寻靶试剂，其中所述一种或多种sHASEGPs包 括sHASEGP，尤其是其单链透明质酸酶结构域。这些缀合物包括通过重组方法生 产为融合蛋白的那些，通过化学方法生产的那些，例如通过化学偶联，例如，通 过偶联到巯基，以及由其它任何方法产生的那些，其中至少一个sHASEGP或其结 构域通过连接子直接或间接地连接到寻靶试剂上。
[0174]如本文所使用的，寻靶试剂(targeting agent)是提供缀合物与细胞表面受 体的特异性结合的任何部分，例如，蛋白质或其有效部分，其可内化缀合物或其 sHASEGP部分。寻靶试剂还可以是促进或推动例如亲和分离或缀合物纯化、将缀 合物附着到表面或检测缀合物或含缀合物的复合物的物质。
[0175]如本文所使用的，抗体缀合物是指其中的寻靶试剂是抗体的缀合物。
[0176]如本文所使用的，分子的衍生物或类似物是指由分子衍生的一部分或分子 经修饰的形式。
[0177]如本文所使用的，用于治疗特定疾病的化合物的有效量，是指足以改善或 以某种方式减少疾病所伴随的症状的量。这个量可以作为单一剂量或根据用药方 案给药，并因此产生效果。所述的量可治疗疾病，但通常为了改善疾病的症状而 给药。反复的给药可能是获得理想的症状改善效果所必需的。
[0178]如本文使用的，“等同的(equivalent)”，当用于两个核酸序列时，是指被研 究的两个序列编码同样的氨基酸序列或等同的蛋白质。当“等同的”在用于两个 蛋白质或肽时，它是指两个蛋白质或肽具有基本相同的氨基酸序列，其中只含有 基本上不改变蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸替代(例如，但不限于，保守变 化，如上面表1中所述的那些)。当“等同的”用于性质时，该性质不必以同样的 程度存在(例如，两个肽可表现出不同速度的同种酶活性)，但活性通常是基本相 同的。“互补的(complementary)”，当涉及两个核苷酸序列时，是指两个核苷酸序 列能够杂交，一般在相对的核苷酸之间具有25％、15％、5％或0％以下的错配。 如果需要，互补百分比将被指明。一般地，这两个分子被选择，以至于它们可以 在高严格条件下杂交。
[0179]如本文所使用的，调节蛋白质活性或基因或核酸的表达的试剂，降低或增 加或以其它方式改变蛋白质的活性，或以某些方式上调或下调或以其它方式改变 核酸在细胞中的表达。
[0180]如本文所使用的，sHASEGP活性抑制剂包括：抑制或减少sHASEGP的生 产、翻译后修饰、成熟或膜定位(membrane localization)的任何物质，或干扰或 降低其蛋白水解功效的任何物质，所述功效尤其是在体外筛选分析中的单链形式 的蛋白水解功效。
[0181]如本文中所使用的，用于治疗或预防肿瘤性疾病的方法是指，任何的症状 例如肿瘤、其转移、肿瘤的血管化作用或表征该疾病的其他参数被降低、改善、 预防、置于缓解的状态或维持在缓解的状态。它也指肿瘤性疾病和转移的特征 (hallmarks)可以通过该治疗而被消除、减少或预防。所述特征的非限制性的例 子包括基底膜(basement membrane)和附近胞外基质不受控制的降解，内皮细胞 迁移、分裂和组织成新的功能化毛细管，以及这样的功能化毛细管的维持。
[0182]如本文所使用的，缀合物的制药上可接受的盐、酯或其它衍生物，包括可 通过本领域技术人员利用已知的衍生方法容易地制备的任何盐、酯或衍生物，这 样所产生的化合物能够施用于动物或人而基本上没有毒性效应，并且它们或者具 有药物学活性或者是药物前体。
[0183]如本文所使用的，药物前体是指这样的化合物，其通过体内给药后，被代 谢或以其它方式转化成化合物的生物活性形式、药物活性形式或治疗活性形式。 为了生产药物前体，药物活性化合物被修饰，这样，活性化合物通过代谢过程重 新产生。药物前体可被设计以改变药物的代谢稳定性或转运特性，防止副作用或 毒性，改善药物的味道或改变药物的其它特征或性质。根据药效过程和体内药物 代谢的知识，一旦知道药物活性化合物，本领域技术人员可设计该化合物的药物 前体(见，例如，Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，388-392页)。
[0184]如本文所使用的，通过本文提供的筛选方法鉴定的药物，是指用作治疗剂 或用作用于设计治疗剂的前导化合物的任何候选化合物。此类化合物可以是小分 子，包括小的有机分子、肽、肽模拟物、反义分子或dsRNA，例如，RNAi、抗体、 抗体片段、重组抗体和其它可作为药物候选者或前导化合物的此类化合物。
[0185]如本文所使用的，肽模拟物(peptidomimetic)是模拟生物活性形式的特定 肽的构型及其某些立体化学特征的化合物。一般，肽模拟物被设计用于模拟化合 物的某些所需性质，而不是导致生物活性构型丧失和键断裂的不期望的性质，例 如柔性(flexibility)。肽模拟物可从生物活性化合物中制备，通过用生物电子等排 体(bioisosteres)替换某些导致不期望性质的基团或键来进行。生物电子等排体对 于本领域技术人员是已知的。例如，亚甲基生物电子等排体CH2S已在脑啡呔类 似物中被用作酰胺替代物(见，例如，Spatola(1983)pp.267-357 in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，Weistein，Ed.volume 7，Marcel Dekker，New York)。吗啡，其可通过口服给药，是内啡肽的肽模拟物化合物。对 于本文的目的，环化的肽被包括在肽模拟物中。
[0186]如本文所使用的，启动子区域或启动子元件，是指控制与其可操作性连接 的DNA或RNA转录的DNA或RNA片段。启动子区域包括足以被RNA聚合酶 识别、结合并使转录启动的特定序列。
[0187]启动子区域的这一部分被称为启动子。另外，启动子区域包括调节RNA聚 合酶的此识别、结合和转录启动活性的序列。这些序列可以是顺式作用的或是对 反式作用因子(trans acting factor)有响应的。启动子，根据调控的性质，可以是 组成型或可调型(regulated)。考虑用于原核生物的示例性启动子，包括噬菌体T7 和T3启动子。
[0188]如本文中所使用的，受体是指对于给定的配体具有亲和力的分子。受体可 以是天然发生的或合成的分子。受体在本领域也可以指抗-配体(anti-ligands)。如 本文中所使用的，受体和抗-配体是可互换的。受体可以在它们的未加以改变的状 态下使用，或作为与其他物质的聚集体使用。受体可以直接地或通过特定的结合 物质或连接物而间接地，共价地或非共价地或以物理接触的方式附着到结合组分 上。受体的例子包括但不限于：抗体、细胞膜受体表面受体和内化受体(internalizing receptors)、单克隆抗体和对诸如病毒、细胞或其他物质上的特异性抗原决定簇具 有反应活性的抗血清、药物、多核苷酸、核酸、肽、因子、凝集素、糖、多糖、 细胞、细胞膜和细胞器。
[0189]受体的例子和使用此类受体的应用的例子，包括但不限于：a)酶：对微生 物的存活至关重要的特定转运蛋白或酶，其可以充当抗生素[配体]选择的靶标；b) 抗体：抗体分子上的与感兴趣的抗原的表位相结合的配体结合位点的鉴定可以被 研究；通过模拟抗原表位的序列的测定可以开发出疫苗，其免疫原是基于一种或 多种这样的序列，或可以开发出相关的诊断试剂或化合物，它们可以用于治疗例 如自体免疫疾病；c)核酸：配体的鉴定，诸如蛋白质或RNA，结合位点；d)催 化多肽：聚合物，包括能够促进涉及将一种或多种反应物转化为一种或多种产物 的化学反应的多肽；这样的多肽一般包括对至少一种反应物或反应中间产物具有 特异性的结合位点，以及靠近该结合位点的活性官能毒，其中，该官能度能够通 过化学的方法修饰被结合的反应物(参见例如美国专利5,215,899)；e)激素受体： 以高亲和力与受体相结合的配体的确定，可以用于开发激素替代疗法；例如，通 过对结合此类受体的配体的鉴定可以开发出控制血压的药物；和f)鸦片受体：在 脑中结合鸦片受体的配体的确定，可以用于开发出吗啡和相关毒品的上瘾性较弱 的替代品。
[0190]如本文中所使用的，样品是指可能含有分析物分析所期望的分析物的任何 物质。样品可以是生物学样品，例如生物流体或生物组织。生物流体的例子包括 尿、血、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液、精液、 羊水或类似物。生物组织是细胞的聚集体，通常是与它们的胞间物质一起形成的 特定类型，其构成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构性材料之一， 包括结缔组织、上皮组织、肌肉和神经组织。生物组织的例子也包括器官、肿瘤、 淋巴结、动脉和各细胞。
[0191]如本文中所使用的：在测定错配百分比时的杂交严格性描述如下：1)高严 格性：0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃；2)中等严格性：0.2×SspE，0.1％SDS，50℃； 3)低严格性：1.0×SspE，0.1％SDS，50℃。本领域技术人员知道洗涤步骤对稳定 的杂交的选择作用，也知道SspE的成分(参见如Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis， in：Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol 3，p.B.13，也参见描述常用实验室溶液的大量目录)。SspE是pH 7.4的磷 酸盐缓冲的0.18 NaCl。进一步地，本领域技术人员知道杂合子的稳定性取决于 TmT，它是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6+0.41(％G+C)-600/L))，这样， 在洗涤条件中仅有的对杂交稳定性至关重要的参数是SspE(或SSC)中的钠离子 浓度和温度。
[0192]应该理解的是，使用其它的缓冲液、盐和温度，可以获得等同的严格性。 作为例子而不是为了限制，使用低严格性条件的程序如下(也参见Shilo and Weinberg，Proc.Natl.Acad Sci USA 78：6789-6792(1981))：含有DNA的滤膜在40℃ 预处理6小时，预处理在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500ug/ml变性鲑鱼精DNA(10×)的溶 液中进行，SSC是1.5M氯化钠和0.15M柠檬酸钠，调节到pH 7。
[0193]杂交在同样的溶液中进行，作下述修改：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％ BSA、100VG/M精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖和使用5-20×106cpm 32P-标 记的探针。滤膜在杂交混合物中40℃温育18-20小时，然后在55℃洗涤1.5小时， 洗涤在含有2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中 进行。洗涤溶液用新鲜溶液更换，在60℃再温育1.5小时。将滤膜进行斑点干燥 (blotted dry)并暴露以进行放射自显影。如果必要，滤膜可以在65-68℃进行第 三次洗涤，并再暴光于胶片。可以使用的低严格性的其他条件是本领域已知的， 例如在种间交叉杂交(cross-species hybridizations)中所使用的。
[0194]作为例子而不是为了限制，使用中等严格性条件的程序包括但不限于，使 用此类中等严格性条件的程序如下：含有DNA的滤膜在55℃预处理6小时，预处 理在含有6×SSC、5×Denhart′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶 液中进行。杂交在同样的溶液中进行，并使用5-20×106 32P标记的探针。滤膜在 55℃在杂交混合物中温育18-20小时，然后在60℃洗涤30分钟，洗涤2次，洗涤 在含有1×SSC和0.1％SDS的溶液中进行。将滤膜进行斑点干燥并暴露以便放射 自显影。可以使用的中等严格性的其他条件是本领域已知的。对滤膜的洗涤在37℃ 进行1小时，洗涤在含有2×SSC、0.1％SDS的溶液中进行。
[0195]作为例子而不是为了限制，使用高严格性条件的程序描述如下：含有DNA 的滤膜的预杂交在65℃进行8小时至过夜，预杂交在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500ug/ml变性鲑鱼 精DNA组成的缓冲液中进行。滤膜在65℃杂交48小时，杂交在含有100ug/ml 变性鲑鱼精DNA和5-20×106 CPM 32P标记探针的预杂交混合物中进行。滤膜的 洗涤在37℃进行1小时，洗涤在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA的溶液中进行。然后，在放射自显影之前，在50℃在0.1×SSC中洗涤45分 钟。可以使用的高严格性的其他条件是本领域熟知的。
[0196]术语“基本上相同的”或“基本上同源的”或“类似的”随上下文而有所 变化，这是相关技术领域的技术人员所能理解的，一般是指至少60％或70％，优 选至少80％、85％，或更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
[0197]如本文中所使用的，与产物基本上相同，是指足够地相似，以至于感兴趣 的特性实质上未被改变，这样，该基本上相同的产物可以用于替代所述产物。
[0198]如本文中所使用的，基本上纯化的是指具有足够地匀质的，用标准的分析 方法进行测定时似乎没有易被检测到的杂质，标准的分析方法诸如薄层层析 (TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)，它们被本领域技术人员用来评估此类纯 度，或指具有足够的纯度，以至于经过进一步的纯化作用，无法检测到物理和化 学特性的改变，诸如物质的酶活性或生物活性的改变。对化合物进行纯化以产生 化学上基本上纯的化合物的方法是本领域技术人员知道的。化学上基本上纯的化 合物然而可以是立体异构体或异构体的混合物。在这样的情况下，进一步的纯化 可能增加混合物的比活性。
[0199]如本文中所使用的，目标细胞(靶细胞)是指表达sHASEGP的细胞(在 如本文所描述的生产sHASEGP的情况下)，或指在体内被sHASEGP或共同配制 或共同给药的试剂作为目标的细胞(在如本文所描述的使用sHASEGPs来促进药 理学试剂和其它试剂向靶细胞的递送的情况下)。
[0200]如本文中所使用的，受测物质(或受测化合物)是指化学上定义的化合物(例 如有机分子、无机分子、有机/无机分子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、脂、多 糖、糖类，或这些分子的杂合物诸如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如受测化合 物文库、天然提取物或培养上清液等)，本文中提供了它们对sHASEGP，特别是包 括了透明质酸酶结构域或其足以具有活性的部分的单链形式的效应，这可以通过 体外方法例如本文所提供的分析方法进行测定。
[0201]如本文中所使用的，术语治疗剂、治疗方案、辐射防护剂或化学治疗剂是 指常规的药物和药物治疗，包括疫苗，其是本领域技术人员知道的。放射治疗剂 是本领域众所周知的。
[0202]如本文中所使用的，治疗是指涉及状况、紊乱或疾病的症状得以改善或发 生其他有利改变的任何方式。
[0203]治疗也包括本文的组合物的任何药物学应用。
[0204]如本文中所使用的，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入到细胞中以 进行其表达或复制的独立元件。载体通常保持为附加体(episomal)，但也可以被 设计成可以使得基因或其部分被整合入基因组染色体中。也考虑人工染色体载体， 诸如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。此类载体的选择和使用对本领域技 术人员来说是熟知的。表达载体包括能够表达DNA的载体，该DNA与调控序列 可操作连接，所述调控序列诸如启动子区域，其能够影响此类DNA片段的表达。 因此，表达载体是指重组的DNA或RNA构建物，诸如质粒、噬菌体、重组病毒 或其他载体，其一旦被导入合适的宿主细胞后，可以使克隆的DNA被表达。合适 的表达载体对本领域技术人员来说是公知的，包括那些在原核细胞和/或真核细胞 中可复制的载体，和那些保持为附加体的载体或那些整合入宿主细胞基因组的载 体。
[0205]如本文中所使用的，蛋白质结合序列是指这样的蛋白质或肽序列，其能够 特异性结合到其他蛋白质或肽序列，一般地，是结合到一组蛋白质或肽序列，或 结合到特定的蛋白质或肽序列。
[0206]如本文中所使用的，表位标记(epitope tag)是指对应于表位的短的氨基酸 残基链，它们有利于随后对具有该表位标记的蛋白质或肽进行生化和免疫学分析。 通过将表位标记序列包括入合适表达载体中的蛋白质编码序列，可以完成对表位 的标记。表位标记的蛋白质可以用高特异性的抗体进行亲合纯化，所述抗体是用 利用标记获得。
[0207]如本文中所使用的，金属结合序列是指这样的蛋白质或肽序列，其能够特 异性结合到金属离子，通常是结合到一组金属离子，或结合到特定的金属离子。
[0208]如本文中所使用的，组合或联合(combination)指两个或更多个元素之间 的任何结合。
[0209]如本文中所使用的，组合物指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、 粉、糊，含水的、不含水的或其任何组合。
[0210]如本文中所使用的，流体指可以流动的任何组合物。因此流体包括半固体、 膏、溶液、水混合物、胶、洗液、乳液形式的组合物，和任何其他这样的组合物。
[0211]如本文中所使用的，细胞的提取物指由裂解的或破裂的细胞制得的制备物 或组分。
[0212]如本文中所使用的，当试剂是被随意选择而未考虑在单独的蛋白质或蛋白 质同与之联系的底物、结合伴侣(binding partners)等的结合中所涉及的特异性序 列时，该试剂被认为是随意选择的。随意选择的试剂的例子是使用化学文库或肽 组合文库(peptide combinatorial library)，或生物体的生长肉汤或条件培养基。
[0213]如本文中所使用的，当试剂是在非随机的基础上被选择，考虑到了目标位 点的序列和/或它的与试剂的作用相关的构象时，该试剂被认为是理性选择的或设 计的。如描述于实施例中的，在具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的糖蛋白中， 提出了透明质酸酶结合位点和(催化)位点。通过利用构成这些位点的肽序列， 可以被理性地选择或理性地设计出试剂。例如，理性选择的肽试剂可以是其氨基 酸序列与ATP或钙调蛋白结合位点或结构域相同的肽。
[0214]寡糖被认为具有还原端和非还原端，无论在还原端的糖是否实际上是还原 糖。根据公认的命名法，本文在描述寡糖时将非还原端置于左边，将还原端置于 右边。本文在描述所有的寡糖时，使用了非还原糖的名字或缩写(例如Gal)，然后 是糖苷键的构型(α或β)、环键(ring bond)、在该键中涉及的还原糖的环位置，然后 是还原糖的名字或缩写(例如GlcNAc)。两个糖之间的连接可以表示为，例如2，3、 2.fw darw.3或(2，3)。每个糖均为吡喃糖。
[0215]如本文中所使用的，N-连接糖部分(N-linked sugar moiety)是指通过Asn 残基的酰胺氮附着到sHASEGP的寡糖。N-连接寡糖分为几个主要的类型(甘露寡 糖型、复合型、杂合型、硫酸化型)，它们全都通过Asn残基的酰胺氮附着有(Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-核，所述Asn残基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa不 是Pro)。在测序期间，N-连接位点常常可由“空白(blank)”循环的出现而间接指 示出来。可以在由PNGase F释放寡糖之后，进行阳性鉴定，PNGase F将糖基化 Asn转变为Asp。PNGase F进行释放之后，N-连接的寡糖可以用Bio-Gel P-6层析 进行纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析(HPAEC)(Townsend et al.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体可以用HPAEC拆分。在HPAEC 层析谱中海藻糖残基将较早地出现在洗脱位置，而其他唾液酸残基将会增加保留 时间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-1酸性糖蛋白、卵白蛋白、 RNAse B、转铁蛋白)被同时进行处理，这将方便寡糖峰的指认。收集到的寡糖可 以用成分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征(Waegheet al.，(1983) Carbohydr Res.123，281-304.)，利用NMR光谱术来测定端基异构构型(anomeric configurations)(Van Halbeek(1993)in Methods Enzymol 230)。
[0216]可选择地，寡糖可以用荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)进行鉴定。 Callewaert et al.(2001)Glycobiology 11，275-281。
[0217]如本文中所使用的，术语“唾液酸”指九碳羧基化糖(carboxylated sugars) 家族的任何成员。唾液酸家族最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3，5- 二脱氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-l-onic acid(常常缩写为Neu5Ac、NeuAc 或NANA)。该家族的另一个成员是N-羟乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其 中，NeuAc的N-乙酰基团被羟基化。唾液酸家族的第三个成员是2-酮-3-脱氧 -nonulosonic acid(KDN)(Nadano et al.(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557； Kanamori et al.(1990)J.Biol.Chem.265：21811-21819。该家族也包括9-取代的唾液 酸，诸如9-O-C.sub.1-C.sub.6酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰-Neu5Ac或9-O-乙酰 -Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。对于唾液酸家族的综 述，参见Varki(1992)Glycobiology 2：25-40；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，N.Y.(1992))。唾液酸化合物的合成和在 唾液酸化程序中的应用公开于1992年10月1日公开的国际申请WO 92/16640中。
[0218]如本文中所使用的，PNGase是指天冬酰氨肽特异性N-糖苷酶F，诸如黄杆 菌maningoseptum肽-N-糖苷酶F。PNGASE酶的特征为对N-连接寡糖而不对O- 连接寡糖具有特异性。PNGASE效用的表征可以用SDS PAGE电泳或荧光辅助碳 水化合物电泳来定义。
[0219]如本文中所使用的，末端基本上唾液酸化(substantially terminated sialation) 是指用唾液酸残基作为末端糖进行末端化处理的N-连接寡糖。末端唾液酸可以通 过用神经氨酸酶处理之后对释放的碳水化合物进行FACE分析来鉴定。
[0220]糖蛋白在血液中的循环寿命(circulatory lifetime)很大程度取决于它的N- 连接碳水化合物基团的组成和结构。该事实与打算经肠胃外给药的治疗性糖蛋白 直接相关。一般来说，糖蛋白的最大循环半衰期要求它的N-连接碳水化合物基团 以序列NeuAc-Gal-GlcNAc终止。如果没有末端唾液酸(NeuAc)，糖蛋白通过涉及 基础的N-乙酰半乳糖胺(GaINAc)或半乳糖(Gal)残基的识别的机制，迅速从血液中 清除掉(Goochee et al.(1991)Biol/Technology 9：1347-1355)。由于该原因，确保在 治疗性糖蛋白的N-连接碳水化合物基团上存在末端唾液酸，对于它们的商业开发 是重要的考虑因素。
[0221]循环中的糖蛋白被暴露于能去除末端唾液酸残基的唾液酸酶(或神经氨酸 酶)。通常，唾液酸的去除暴露半乳糖残基，这些残基被肝细胞中的半乳糖特异性 受体识别并结合(综述于Ashwell and Harford(1982)Ann.Rev.Biochem.51：531)。 肝脏也含有其他的糖特异性受体，其介导糖蛋白从循环中的清除。此类受体的特 异性也包括N-乙酰葡糖胺、甘露糖、海藻糖和磷酸甘露糖。通过肝细胞的半乳糖 受体而被清除的糖蛋白经历实质性的降解作用，然后进入胆汁；通过Kupffer细胞 的甘露糖受体而被清除的糖蛋白进入网状内皮系统(综述于Ashwell and Harford (1982)Ann.Rev.Biochem.51：53)。
[0222]如本文中所使用的，中性活性是指在pH 5和8之间，在盐小于150mM和 缓冲强度小于50mM的条件下，sHASEGP糖蛋白在体外对糖胺聚糖底物具有催化 活性。
[0223]如本文中所使用的，稳定的溶液是指在室温保存30天之后，保留大于60％ 的最初活性的sHASEGP。
[0224]如本文中所使用的，除非另外特别指出，单位用浊度降低单位(turbidity reducing units，TRU)来表示。一个TRU被定义为降低透明质酸的酸化溶液的浊 度所需要的透明质酸酶活性的量，并等同于U.S.P./National Formulary(NF XIII)单 位(NFU)。本文中描述的ELISA样酶分析可以通过经U.S.P.标准化的透明质酸酶样 品(例如USP或WHO标准)标准曲线而与TRU、NFU和U.S.P.单位相关联。因 此，用ELISA样酶分析测定的酶活性实际上是相对TRU，因为酶活性不是用浊度 计分析实际测量得到的(Dorfman et al.，1948，J.Biol.Chem.172：367)。
[0225]如本文中所使用的，效价(potency)是用在体外降解底物所需要的sHASEGP 蛋白的量来定义的，其基于浊度降低单位或相对浊度降低单位(Relative Turbidity Reducing Unit)。
[0226]如本文中所使用的，比活性是指每毫克蛋白质的活性的单位数。sHASEGP 蛋白的量定义为在280nm处sHASEGP溶液的吸光度，假定摩尔消光系数为近似 1.7，单位为M-1cm-1。
[0227]聚乙二醇(PEG)已经被广泛用于生物材料、生物技术和医学中，主要是因为 PEG是生物可相容的、无毒的、无免疫原性的和水溶性的聚合物(Zhao and Harris， ACS Symposium Series 680：458-72，1997)。在药物传送领域，PEG衍生物已经被广 泛用于共价附着到蛋白质(即″聚乙二醇化″)，以减少免疫原性、蛋白水解和肾清除， 并增强溶解性(Zalipsky，Adv.Drug Del.Rev.16：157-82，1995)。类似地，PEG已经 被附着到低分子量、相对疏水的药物上，以增加溶解性、减少毒性和改变生物分 布(biodistribution)。通常，PEG化的药物作为溶液被注射。
[0228]紧密相关的应用是合成交联的可降解的PEG网络或制剂以用于药物传送， 因为在可降解的可溶性药物载体的设计中所使用的相同化学术的许多方面也可以 用于设计可降解的凝胶(Sawhney et al.，Macromolecules 26：581-87，1993)。还知道， 大分子间的复合体可以通过混合两种互补的聚合物的溶液而形成。此类复合体一 般通过所涉及的聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(聚酸- 聚碱)，和/或通过在水环境中聚合物之间的疏水相互作用而被稳定化(Krupers et al.， Eur.Polym J.32：785-790，1996)。例如，聚丙烯酸(PAAc)和聚氧乙烯(PEO)的混合溶 液在合适的条件下，主要基于氢键而形成复合体。这些复合体在生理条件下的解 离作用已经被用于传送游离的(即，非PEG化的)药物。此外，互补聚合物的复合 体已经由均聚物和共聚物形成。
[0229]在一个方面，聚乙二醇的分子量在约3kD至约50kD范围内，优选约5kD 至约30kD范围内。通过已知的化学合成技术可将PEG共价附着到药物(称为“PEG 化”或“聚乙二醇化”)。例如，在本发明的一个方面，蛋白质的PEG化可以通过 在合适的反应条件下，通过将NHS活化的PEG与蛋白质反应而实现。
[0230]尽管已经描述了关于PEG化作用的大量反应，最普遍适用的那些反应赋予 了方向性、使用温和的反应条件，并且不需要大量的下游处理来去除毒性催化剂 或副产物。例如，单甲氧基PEG(mPEG)只有一个活性末端羟基，因此它的使用一 定程度地限制了所得到的PEG-蛋白产物混合物的异质性。与末端甲氧基基团相反 的聚合物末端的羟基的激活通常是获得有效的蛋白质PEG化作用所必需的，目的 是使得衍生的PEG更容易遭受亲核攻击。攻击性的亲核试剂通常是赖氨酰残基的 ε-氨基基团，但是其他的胺也可以反应(例如组氨酸的N-末端α-胺或环胺)，如果局 部条件是有利的话。在含有单个赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中可能发生更为定向 的附着。后一残基可以被PEG-马来酰亚胺作为目标，用于硫醇特异性的修饰。可 选择地，PEG酰肼可以与高碘酸盐氧化的sHASEGP反应，并在NaCNBH3存在的 条件下被还原。更特别地，PEG化的CMP糖可以与sHASEGP在合适的糖基转移 酶存在的条件下发生反应。一种技术是“聚乙二醇化作用”技术，其中，许多聚 合物分子被偶联到被研究的多肽上。当使用该技术时，免疫系统难以识别形成抗 体所需的多肽表面上的表位，从而减少免疫应答。对直接引入人体循环系统以给 予特定的生理效应的多肽(即药品)，典型的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答， 而通过呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)潜在地可以引起IgE应答(即过敏应 答)。解释减少的免疫应答的理论之一是聚合物分子掩蔽了多肽表面上的表位，而 正是这些表位对导致抗体形成的免疫应答负有责任。另一理论或至少部分因素是 缀合物越重，所能获得的免疫应答的减少程度越大。
[0231]在人sHASEGPs应用于人体的情况，如本文所述的优选的组合，sHASEGP 引起免疫应答的倾向可以显著的降低，与例如非人类动物来源的酶如牛或绵羊的 透明质酸酶相比(例如，即便那些源于动物的酶可以从其它源于动物的蛋白质中 完全地被纯化出来，但其在实践中是非常困难以致于不能实现的)。尽管人 sHASEGPs表现出优于动物源产品的实质的且非常重要的改进，但对于许多应用， 其还可通过翻译后修饰(PTMs)如PEG化而被进一步改进，从而增强其对降解或 消除的抵抗能力，和/或改善其它性质，使其对于具体应用更加有益。
[0232]例如，尽管对于人类的优选组合物(例如，人sHASEGPs)，与动物来源的 透明质酸酶或非人类sHASEGPs相比，显示出降低的免疫原性，此类人sHASEGPs 的PEG化可用于例如延长它们在血流和/或身体其它组织中的半衰期。不限制于具 体作用机理，通常认为，PEG部分在sHASEGPs上的连接可用于有效地遮蔽分子， 降低它对蛋白酶的相对敏感度，也可潜在地降低其从身体中清除和排出的程度和 速度。
[0233]偶联到多肽的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，具有依据本发明 所限定的分子量，包括天然的和合成的均聚物，诸如多元醇(即，聚-OH)、聚胺(即， 聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)，以及进一步地，杂聚物，即包括一个或多个不 同的偶联基团例如羟基基团和胺基团的聚合物。
[0234]合适的聚合物分子的例子包括选自下列的聚合物分子：聚环氧烷烃(PAO)， 诸如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二 醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支链聚乙二醇 (PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯顺 丁烯二酸酸酐共聚物、聚苯乙烯苹果酸酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖、 肝素、同源白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟 乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，壳聚糖的水解物，淀粉诸如羟乙基- 淀粉和羟丙基-淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物，瓜尔胶、普鲁兰多糖、菊糖、黄 原胶、卡拉胶、果胶、海藻酸水解产物和生物多聚物。
[0235]优选的聚合物分子是无毒性的聚合物分子，诸如(m)聚乙二醇(mPEG)，进 一步地，它们需要相对简单的化学过程便能够共价偶联到酶表面上的附着基团。
[0236]常见的聚环氧烷烃(PAO)，诸如聚环氧乙烷，例如PEG，特别是mPEG，是 优选的聚合物分子，这是因为这些聚合物分子相比多糖例如葡聚糖、普鲁兰多糖 和类似物，具有更少的能够发生交联的活性基团，而交联是不利的。
[0237]对PEG化和其它类型的翻译后修饰(PTMs)的改进已经非常广泛，且现 有大量PTM技术和试剂是本领域已知的，新的技术被定期开发。PEG化的技术和 试剂包括，例如：(i)专门化的连接子和偶联化学(见，例如，Harris，J.M.，Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476(2002)以及其主要参考文献所综述的试剂和技术)；(ii)支 链的PEGs，其有效地使另外的PEG基团可以连接到单独的结合位点上(见，例如， Veronese，F.M.et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180(2002))；(iii)位点特异性 (site-specific)PEG化，包括位点特异性单PEG化(见，例如，Chapman，A.P.et al.， Nature Biotech.17：780-783(1999))；和(iv)定点酶促PEG化(site-directed enzymatic PEGylation)(例如，应用如Sato，H.，Adv.Drug Deliv.Rev.54：487-504(2002)所描 述的转谷氨酰胺酶反应)。从数量日益增加的供应商那里还可获得其它技术和试剂 (见，例如，Nektar/Shearwater(www.nektar.com)，Sunbio(www.sunbio.com和 www.sunbio.com/peg-shop)，Celares GmbH(www.celares.com)，及其它)。
[0238]B.sHASEGP的组织表达情况
[0239]尽管先前认为sHASEGP是睾丸特异性的，但当使用更灵敏的技术如 RT-PCR时，发现人sHASEGP表达于人的多种组织中。sHASEGP转录物被发现于 髓质(脑)、微血管内皮、前列腺、乳房、视网膜、收集的人黑素细胞、胎儿心脏和 怀孕子宫中。sHASEGP也表达在生殖细胞肿瘤中。sHASEGP转录物的RT-PCR 检测通常是检测在除睾丸之外的组织中的水平所必需的。
[0240]C.sHASEGP酶活性的分析
[0241]透明质酸酶活性的比浊微量滴定测定
[0242]透明质酸酶活性可以通过修改的比浊分析在酸化的血清溶液中进行检测。 所需要的试剂如下：用于灌洗的UV灭菌的2×去离子水或无菌水 Braun  R5000-01 Hylumed Medical-透明质酸钠，高分子量HA Genzyme Advanced Biomaterials  4876 透明质酸酶参照标准品 USP  31200 乙酸钾，粒状，USP，ACS JTBaker  2914-01 冰醋酸，99+％ Sigma  A-6283 一水合磷酸二氢钠，USP，粒状 Mallinkrodt  7774 无水磷酸氢钠，USP Mallinkrodt  7771 氯化钠，晶体，GR，ACS EMScience  SX0420-5 明胶水解产物，酶促形成 Sigma  G-0262 马血清，供体群，受测的细胞培养物，受测的杂交 瘤培养物，美国来源 Sigma  H-1270 人血清白蛋白20％ Griffols 盐酸，ACS试剂 Sigma  H-7020 氯化钙，二水合物，粒状，USP，-FCC JTBaker  1336-01
[0243]制备下述试剂：醋酸盐缓冲溶液-将14.0g的乙酸钾和25.0mL的冰乙酸 加入水中制得1000mL溶液。磷酸盐缓冲溶液-将2.5g的磷酸二氢钠、1.0g的无 水磷酸氢钠和8.2g的氯化钠加入水中制得1000mL溶液。酶稀释贮液-500mL 的磷酸盐缓冲溶液加500mL的水。酶稀释工作液-将33mg的水解明胶加入到50 mL的酶稀释贮液中——制备后2小时内使用。样品稳定缓冲溶液(″SSB″Soln.) -将125μL的20％人血清白蛋白溶液和50μL的1M氯化钙溶液加入到50mL的 酶稀释工作液中，充分混合。血清贮存液-用9体积的醋酸盐缓冲溶液稀释1体 积的马血清。用4N盐酸将pH值调到3.1，并使溶液在室温保持18至24小时。 将溶液保存在4℃，并在30天内使用。血清工作液-将10mL的血清贮液加入到 30mL的醋酸盐缓冲溶液中，调节到室温。透明质酸贮液-将透明质酸钠配制为浓 度为5.0mg/mL的水溶液。透明质酸工作液-将0.75mL的透明质酸贮液加入到 4.25mL的磷酸盐缓冲溶液。标准品贮液-在一个容器中制备浓度为1000单位/mL 的USP参照标准透明质酸酶的水溶液，分为50μL的小份，保存在-20℃。标准品 工作液-将40μL的标准品贮液加入到960μL的冷酶稀释工作液，获得已知浓度 为40单位/mL的溶液，制备后立即用于测定中。
[0244]依据下述指导，将所有的酶样品稀释于“低蛋白结合(Low Protein Binding)” 96-孔板中。
[0245]a)该测定的最大灵敏度的范围在10-30单位/mL之间。为了获得在该范围 内的结果，测定需要反复进行，为了使次数最小化，首先确定样品的总单位数/mL 的近似值，然后选择稀释倍数(整数)，以便最终浓度为大约20单位/ml。
[0246]b)为了实施测定所需要的最小样品体积描述如下：FPLC级分＝50μL，组织 培养物上清液＝1mL，纯化的/浓缩的/最终步骤的材料＝10μL。
[0247]c)对于连续稀释的样品，通过将360μL的“SSB”溶液和40μL的样品吸到 各个孔中，在“低蛋白结合”96-孔板上进行1∶10的稀释，一式三份。
[0248]为了制备USP标准，按如下所述利用“低蛋白结合”96-孔板制备USP标 准曲线：                              USP标准曲线：
                 酶           标准           最终
                 稀释         工作           浓度
孔       标准
                 溶液(μL)：  溶液(μL)：    (单位/mL)：
A1-A3    St01    0            100            40
B1-B3    St02    20           80             32
C1-C3    St03    40           60             24
D1-D3    St04    60           40             16
E1-E3    St05    80           20             8
F1-F3    St06    90           10             4
G1-G3    St07    100          0              0
[0249]为了制备1-3栏的透明质酸对照，按如下所述在“平底”96-孔板中制备H.A. 对照：                   H.A.对照：
                   透明质酸           酶稀释
孔：     对照：    工作溶液(μL)：    工作溶液(μL)：
H1-H3    Co01      0                  60
[0250]反应板(Reaction Plate)：以每孔30μL的量，使用50μL8-通道转移移液管， 将透明质酸工作液吸放到“平底”96-孔微量滴定板，让孔H1-H3空着。以60μL/ 孔的量，将酶稀释工作液吸放到同样的板的孔H1-H3中，作为HA对照。
[0251]血清工作液：将40mL的血清工作液分配入转移盘(transfer basin)，并靠 近热块(Heat Block)。
[0252]预热阶段：一旦两种板制备完成，将含有稀释样品、标准品、对照的低蛋 白结合96-孔板，和含有透明质酸工作液的平底96-孔板置于热块上，将它们在37 ℃温热5分钟。
[0253]通过将酶加入到底物来起始反应：使用5-50μL 8-通道移液管将来自酶板的 30μL加入到96-孔平底板(含底物)的#1栏中的所有孔中。在第一个15秒中，将 酶/底物反应混合物吹吸5次(用移液器上下吹吸溶液)，以确保样品完全混合。将 酶和底物混合之后，去除掉吸头，将一组新的吸头装载于转移移液管上以用于下 一栏的操作。重新启动计时器，在时间(t)＝0:30时，对栏2重复该过程。在下一 30秒间隔(t)＝1:00时，对栏3重复该过程。该过程从左到右横跨整个板重复进行， 每30秒进行一次，直到所有的孔含有酶和底物。
[0254]终止反应：当时间达到6分钟(t)＝6:00时，使用50-300μL 8-通道转移移液 管，将240μL的血清工作液吸放到每一个孔，由临近的50mL试剂容器吸放到96- 孔平底板的栏1中。在第一个10秒中，混合物被吹吸3次(用移液器上下吹吸溶 液)，以确保完全混合。该过程每30秒重复一次，从栏1进行到栏12。一旦完成 最后一栏(栏12)，将反应板从热块上移去，并将板置于平板读数器的读数盘上， 640nM。由标准曲线产生线性曲线拟合，由此可以对受测样品进行推导。
[0255]透明质酸酶的其它可供选择的分析方法
[0256]生物素化透明质素微量滴定分析
[0257]使用生物素-酰肼(Pierce)、硫代NHS(Pierce)和1-乙基二甲氨基丙基-碳二亚 胺(Sigma)，使透明质素的葡糖醛酸残基上的自由羧基在一步反应中被生物素化。 该生物素化的HA底物在第二个反应中，被共价偶联到96孔微滴定板上。酶反应 完成时，残留的底物用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应进行检测，其可以用标准的 ELISA平板读数器读出。因为底物是被共价结合于微滴定板，所以矫作结果 (artifact)例如生物素化底物的pH依赖性置换没有发生。灵敏度使得能够对来自 培养细胞和生物样品的透明质酸酶活性进行快速测定，分析之间的偏差小于10％。
[0258]透明质酸酶的比活性用浊度降低单位(turbidity reducing units，TRU)来表 示。一个TRU被定义为降低透明质酸的酸化溶液的浊度所需要的透明质酸酶活性 的量，并等同于U.S.P./National Formulary(NF XIII)单位(NFU)。用于纯化的ELISA 样酶分析可以通过经U.S.P.标准化的透明质酸酶样品(例如USP)的标准曲线而与 TRU、NFU和U.S.P.单位相关联。因此，用ELISA样酶分析测定的酶活性实际上 是相对TRU，因为酶活性不是用浊度计分析实际测量得到的(Dorfman et al.，1948，J. Biol.Chem.172：367)。
[0259]许多透明质酸酶分析是基于测量新的还原性N-乙酰氨基基团的产生 (Bonner and Cantey，Clin.Chim.Acta 13：746-752，1966)，或粘性的损失(De Salegui et al.，Arch.Biochem.Biophys 121：548-554，1967)或浊度的损失(Dorfman and Ott，J. Biol.Chem.172：367，1948)。采用纯化的底物，所有这些方法足以测定内切葡萄糖 胺活性(endoglucosamidic activity)的存在或不存在。
[0260]基本上纯化的糖胺聚糖底物也可以被用于凝胶迁移分析(Gel Shift Assay)。 将糖胺聚糖与重组sHASEGP混合，以测试内切葡糖苷酶活性，所述的内切葡糖苷 酶活性导致底物在凝胶中的迁移率发生变化。硫酸软骨素-4和硫酸软骨素-6、硫酸 皮肤素、硫酸乙酰肝素可以从Sigma Chemical获得。人脐带透明质素可以从ICN 获得。将每一受测底物用pH 3.5-7.5范围内的缓冲液稀释到0.1mg/ml。10μL纯化 的sHASEGP样品或来自表达sHASEGP的细胞的条件培养基与90μl的受测底物在 期望的缓冲液中混合，并在37℃温育3小时。温育之后，样品用样品缓冲液(Tris EDTA pH 8.0、溴酚蓝和甘油)中和，然后进行电泳。通过在含有0.5％阿尔新蓝的 3％冰乙酸中将凝胶染色过夜，然后在7％冰乙酸中脱色，来检测糖胺聚糖。通过比 较存在和不存在酶的情况下的底物迁移率，对降解结果进行测定。
[0261]透明质酸酶活性也可以用底物凝胶酶谱法(substrate gel zymography)进行 检测(Guentenhoner et al.，1992，Matrix 388-396)。在这种测定中，将样品应用于含有 透明质酸的SDS-PAGE凝胶，然后通过电泳分离样品中的蛋白。然后将该凝胶在 酶分析缓冲液中温育，随后进行染色，以检测凝胶中的透明质酸。通过底物凝胶 中的透明带(cleared zone)，可以看出透明质酸酶活性。
[0262]D.sHASEGP多肽基因的鉴定和分离
[0263]sHASEGP多肽基因和/或其结构域可以通过利用本领域已知的DNA分离方 法获得。本领域技术人员所知道的用于鉴定编码期望基因的核酸的任何方法都可 以被使用。本领域可以利用的任何方法都可以用来获得编码sHASEGP多肽的全长 (即包括整个编码区)cDNA或基因组DNA克隆。例如，聚合酶链反应(PCR)可 以用来从基因组或cDNA文库中扩增在正常组织中表达的序列，例如编码 sHASEGP多肽的核酸(SEQ.No：1和2)。与在鉴定的序列的3′和5′末端的序列杂 交的寡核苷酸引物可以被用作引物，以便通过PCR扩增来自合适的来源(例如睾 丸、前列腺、乳腺)的核酸样品(RNA或DNA，一般是cDNA文库)的序列。
[0264]PCR可以例如通过使用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(Gene Amp)来进行。被扩增的核酸可以包括来自真核物种的mRNA或cDNA或基因组 DNA。可以选择合成若干不同的简并引物，以用于PCR反应。
[0265]也可以改变用于引发PCR反应的杂交条件的严格性，以便扩增核酸同源物 (例如，为了从除人之外的物种获得sHASEGP多肽序列，或为了获得与sHASEGP 多肽同源的人序列)，这通过允许在已知的核苷酸序列和正在被分离的核酸同源物 之间存在更大或更小的核苷酸序列相似性来进行。对于种间交叉杂交(cross-species hybridization)，可以使用低至中等严格性的条件。对相同物种的杂交，可以使用中 等严格至高度严格的条件。这些条件可以经验性确定。
[0266]在含有整个的或部分的被鉴定的sHASEGP多肽序列的核酸，或编码整个 的或部分的sHASEGP多肽同源物的核酸，被成功扩增之后，该片段可以进行分子 克隆和测序，并可用作探针来分离全cDNA或基因组克隆。这又使得能够测定该 基因的全部核苷酸序列、分析它的表达，和生产它的蛋白质产物以用于功能分析。 一旦核苷酸序列被确定，编码sHASEGP多肽基因蛋白质产物的开放阅读框，可以 用本领域已知的用于确定开放阅读框的任何方法来确定，例如，使用用于核苷酸 序列分析的公众可得的计算机程序来确定开放阅读框。一旦开放阅读框被限定之 后，确定由该开放阅读框编码的蛋白质的氨基酸序列便是常规的了。这样，整个 sHASEGP多肽基因的核苷酸序列以及sHASEGP多肽蛋白质和类似物的氨基酸序 列得以确定。
[0267]任何真核细胞都可能作为用于sHASEGP多肽基因的分子克隆的核酸来源。 核酸可以从脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬以及其他灵长类 来源、昆虫、植物和其他生物体分离得到。DNA可以通过本领域已知的标准程序 从克隆的DNA(例如DNA“文库”)获得、由化学合成获得、由cDNA克隆获得，或 通过对从期望的细胞纯化获得的基因组DNA或其片段进行克隆而获得(参见如 Sambrook et al.1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.Ed.，1985， DNA Cloning：A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.1，11)。从基因 组DNA获得的克隆除了编码区域之外，可以含有调控DNA区域和内含子DNA 区域；从cDNA获得的克隆将只含有外显子序列。对于任何来源，将该基因克隆 入合适的载体，以对其进行增殖。
[0268]对来自基因组DNA的基因进行分子克隆，产生DNA片段，其中的一些将 编码想要的基因。
[0269]使用各种限制性酶，可以将DNA在特定位点切割。
[0270]可选择地，可以使用DNAse在锰存在的条件下切碎DNA，或者可以用物 理的方法剪切DNA，例如利用超声波法。线性DNA片段然后可以依据大小用标 准的技术进行分离，包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析。
[0271]一旦DNA片段被产生，对含有想要的基因的特定DNA片段的鉴定可以用 许多方法来完成。
[0272]例如，(任何物种的)sHASEGP多肽基因的一部分(例如按上面描述的方法获 得的PCR扩增产物，或具有已知的核苷酸序列的一部分序列的寡核苷酸)或它的特 定RNA，或其片段可以被纯化和标记，所产生的DNA片段可以通过将核酸与标 记的探针杂交而进行筛选(Benton and Davis，Science 196：180(1977)；Grunstein and Hogness，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961(1975))。与该探针基本上同源的那 些DNA片段将发生杂交。也能够通过下述方法鉴定正确的片段：进行限制性酶消 化，并将依据已知的限制性图谱——如果可获得的话——所期望的那些片段大小 与消化片段大小相比较来鉴定正确的片段；或进行DNA序列分析，并与sHASEGP 多肽的已知核苷酸序列进行比较来鉴定正确的片段。依据该基因的特性还可以作 进一步的筛选。可选择地，可以通过基于它的表达产物的物理、化学或免疫学特 性的分析，来检测该基因的存在与否。例如，杂交-选择正确的mRNA的cDNA克 隆或DNA克隆可以被选择，其产生具有类似或相同的电泳迁移行为、等电聚焦行 为、蛋白水解消化图谱、抗原特性、透明质酸酶活性的蛋白质。如果抗sHASEGP 多肽的抗体是可以利用的，可以在ELISA(酶联免疫吸附测定)类型的程序中，通过 标记的抗体与推断的合成sHASEGP多肽的克隆的结合来鉴定蛋白质。
[0273]分离sHASEGP多肽基因组DNA的可供选择的方法包括，但不限于：利用 已知的序列通过化学的方法合成基因序列，或由cDNA制备编码sHASEGP多肽的 mRNA。
[0274]例如，用于sHASEGP多肽基因的cDNA克隆的RNA可以从表达该蛋白的 细胞中分离得到。然后可以将被鉴定和分离出的核酸插入到合适的克隆载体中。 可以使用许多本领域已知的载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰 的病毒，但是载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。此类载体包括但不限于细 菌噬菌体，诸如λ衍生物，或质粒，诸如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript 载体(Stratagene，La Jolla，CA)。例如，通过将DNA片段连接入携带有互补粘性末 端的克隆载体中，可以将DNA片段插入到克隆载体中。
[0275]如果克隆载体中不存在用于切割该DNA的互补限制性位点，DNA分子的 末端可以进行酶法修饰。可选择地，通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端， 可以产生任何想要的位点，这些被连接的接头可以包括特定的化学合成的寡核苷 酸，其编码限制性核酸内切核酸酶识别序列。在另一方法中，切割的载体和 sHASEGP多肽基因可以用均聚物加尾(homopolymeric tailing)的方式进行修饰。
[0276]重组分子可以通过转化、转染、感染、电穿孔、钙沉淀和其他方法被导入 宿主细胞中，这样，产生许多拷贝的基因序列。
[0277]在具体的实施方案中，用整合有分离的sHASEGP多肽基因、cDNA或合成 的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞，能产生多拷贝的基因。
[0278]因此，基因可以通过下述方法大量获得：培养转化子，从转化子中分离重 组DNA分子，并且必要时，从分离的重组DNA中回收感兴趣的基因。
[0279]E.含有编码sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域的核酸的载体、质粒和 细胞，以及sHASEGP多肽载体和细胞的表达
[0280]为了重组表达一种或多种sHASEGP多肽，含有编码sHASEGP多肽的核苷 酸序列的所有序列或部分序列的核酸可以被插入到合适的表达载体中，所述的表 达载体含有用于转录或翻译插入的蛋白质编码序列的必要元件。必要的转录和翻 译信号也可以由sHASEGP基因的天然启动子和/或它们的侧翼区域提供。
[0281]也提供了这样的载体，其含有编码sHASEGPs的核酸，该核酸可以被导入 到能够产生可溶性中性活性sHASEGP的表达系统中。
[0282]也提供了含有载体的细胞。所述细胞包括真核和原核细胞，所述载体适合 用于那些细胞中。
[0283]提供了含有载体的真核细胞，包括二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细 胞(DG44)。合适的细胞包括酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细 胞。细胞可以被用来生产sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域，通过下述方法： (a)将上述细胞在编码的sHASEGP多肽或sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域被细 胞表达的条件下培养，然后(b)回收表达的透明质酸酶结构域蛋白。在示范性的实 施方案中，透明质酸酶结构域被分泌入培养基中。
[0284]在一种实施方案中，提供的载体包括编码多肽的核苷酸序列，其中，该多 肽具有透明质酸酶活性并且含有sHASEGP蛋白的仅仅透明质酸酶结构域的整个 部分或一部分或其多份拷贝。也提供了这样的载体，其包括编码透明质酸酶结构 域和sHASEGP蛋白的额外部分——可长达全长sHASEGP蛋白和包括全长 sHASEGP蛋白质——的核苷酸序列，也提供其多个拷贝。载体可以被选择以便在 细胞中表达sHASEGP蛋白质或其透明质酸酶结构域，或，sHASEGP蛋白可以作 为分泌蛋白而被表达。可选择地，载体可以包括对于编码蛋白的分泌所必需的信 号。当透明质酸酶结构域被表达时，核酸被连接到编码分泌信号的核酸上，所述 信号序列诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的交配因子(mating factor)信 号序列或其部分，或天然的信号序列。
[0285]为了产生可溶性的中性活性的sHASEGP，能够引入N-连接糖基化作用的 细胞是被要求的。在优选的实施方案中，二氢叶酸还原酶缺陷型哺乳动物中国仓 鼠卵巢细胞诸如DG44，用质粒进行电转，所述质粒编码强哺乳动物启动子诸如 CMV、sHASEGP编码核酸以及跟随着的内部核糖体进入位点、小鼠二氢叶酸还原 酶基因和SV40多聚腺苷酸化序列，如SEQ ID NO.51所显示。然后将此类细胞在 缺少次黄嘌呤和胸苷的化学成份确知的培养基中培养，然后再用增加浓度的甲氨 蝶呤进行基因扩增。
[0286]各种宿主-载体系统可以被用来表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于： 用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆 状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物诸如含有酵母载体的酵母；或用噬菌体、 DNA、质粒DNA或黏粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在它们强度和特异性 方面有所变化。取决于所使用的宿主-载体系统，大量合适的转录和翻译元件中的 任何一种可以被使用。注意，sHASEGP DNA在细菌中的表达本身不会产生具有催 化活性的sHASEGP，但是当与合适的糖基化作用联合时——可以通过人工的方法 进行这样的糖基化作用，便能产生具有催化活性的sHASEGP。
[0287]本领域技术人员所知道的用于将核酸片段插入载体的任何方法都可以被用 于构建含有嵌合基因的表达载体，其含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码 序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。 编码sHASEGP多肽或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列的表达可以受 到另一核酸序列的调控，以便基因或其片段表达于用重组DNA分子转化的宿主中。 例如，蛋白质的表达可以受到本领域已知的启动子/增强子的控制。在特定的实施 方案中，启动子对于sHASEGP多肽的基因来说不是天然的。可以被使用的启动子 包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981)、 包含在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto et al.，Ce//22： 787-797(1980)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42 (1982))；原核表达载体诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 75：3727-3731 1978))或TAC启动子(Deboer et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80：21-25(1983))；也参见″Useful Proteins from Recombinant Bacteria″：in Scientific American 242：79-94(1980))；包含opaline合成酶启动子的植物表达载体 (Herrar-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35S RNA启动 子(Garder et al.，Nucleic Acids RES.9：2871(1981))，和光合成酶核酮糖二磷酸羧化 酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))；来自酵母和其他真 菌的启动子元件诸如Gal4启动子、乙醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱 性磷酸酶启动子，和下述的显示出组织特异性并已被应用于转基因动物的动物转 录控制区域：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift Et Al.， Cell 38：639-646(1984)；Ornitz Et Al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50： 399-409(1986)；Macdonald，Hepatology 7：425-515(1987))；在胰腺β细胞中具有活 性的胰岛素基因控制区域(Hanahan et AL.，Nature 315：115-122(1985))，在淋巴细胞 中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et AL.，Cell 38：647-658(1984)； Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et AL.，Mol.Cell Biol. 7：1436-1444(1987))，在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤 病毒控制区(Leder etAL.，CELL 45：485-495(1986))，在肝脏中具有活性的白蛋白基 因控制区(PINCKERT et AL.，Genes and Devel.1：268-276(1987))，在肝脏中具有活 性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf et AL.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)； Hammer et AL.，Science 235：53-58 1987))，在肝脏中具有活性的α-l抗胰蛋白酶基 因控制区(Kelsey et al.，Genes And Devel.1：161-171(1987))，在髓细胞中具有活性的 β球蛋白基因控制区(Mogram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et AL.， CE//46：89-94(1986))，在脑的少突细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区 (Readhead et al.，Cell 48：703-712(1987))，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2 基因控制区(Sani，Nature 314：283-286(1985))，和在下丘脑的促性腺激素细胞中具 有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason et al.，Science 234：1372-1378 (1986))。
[0288]在特定的实施方案中，使用这样的载体，其含有启动子，其可操作地连接 到编码sHASEGP多肽或其结构域、片段、衍生物或同源物的核酸，还含有一个或 多个复制起点，以及任选地，一个或多个选择性标记(例如抗生素抗性基因)。
[0289]特定的起始信号是有效地翻译sHASEGP序列所需要的。这些信号包括ATG 起始密码子和临近的序列。对于sHASEGP，在它的起始密码子和上游序列被插入 到合适的表达载体中的情况下，可以不需要额外的翻译控制信号。然而，在仅仅 编码序列或其一部分被插入的情况下，需要提供外源的转录调控信号，包括ATG 起始密码子。而且，起始密码子必须在正确的阅读框中，以确保整个插入物能够 转录。外源的转录元件和起始密码子可以是各种来源的，可以天然的或合成的。 通过包含适合于所使用的细胞系统的增强子，表达的效率可以得到增强(Schaff D et al(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Bittner et al(1987)Methods in Enzymol 153：516-544)。
[0290]此外，可以选择能够调节插入的序列的表达或能以期望的方式对表达的蛋 白质进行加工的宿主细胞菌株。对多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化作用、羧 化作用、糖基化作用、磷酸化作用、脂化作用和酰化作用。对“前原(prepro)” 形式的蛋白质进行切割的翻译后加工，对于正确的插入、折叠和/或功能也是重要 的。不同的宿主细胞诸如CHO(DG44、DXB11 CHO-Kl)、HeLa、MDCK、293、 WI38等都具有实现这样的翻译后活性的特定细胞器(cellular machinery)和特征 机制(characteristic mechanisms)，可以对它们加以选择以确保对引入的外来蛋白 质进行正确的修饰和加工。
[0291]为了长期地高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，稳定 表达sHASEGP的细胞系可以用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择性标 记基因的表达载体进行转化。引入载体后，细胞可以在加富培养基中培养1-2天， 再转移到选择性培养基。选择性标记的目的是赋予抗性以便进行选择，它的存在 使得成功地表达被引入的序列的细胞能够生长和被回收。稳定转化的细胞的抗性 群落(resistant clumps)可以用适合于该细胞类型的组织培养技术进行增殖。
[0292]大量的选择系统可以被用于回收转化的细胞系。这些包括但不限于单纯疱 疹病毒胸苷激酶(Wigler M et al(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶 (Lowy I et al(1980)Cell 22：817-23)基因，它们分别可以被用于TK-或APRT-细胞。 另外，抗代谢药、抗生素或除草剂抗性可以被用作选择的基础；例如DHFR，其赋 予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M et al(1980)Proc Natl Acad Sci 77：3567-70)；npt，其 赋予对氨基糖苷新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin F et al(1981)J Mol Biol 150：1-14)，和als或pat，其分别赋予对氯磺隆和草铵膦乙酰转移酶的抗性(Murry， supra)。其他的选择基因已经被描述，例如，trpB，其使得细胞可以利用吲哚来替 代色氨酸，或hisD，其使得细胞可以利用组氨醇来替代组氨酸(Hartman S C and R C Mulligan(1988)Proc Natl Acad Sci 85：8047-51)。最近，使用可视化的标记已成为流 行，这样的标记如花青素、β葡糖醛酸酶和它的底物GUS以及荧光素酶和它的底 物虫荧光素，这不但已经被广泛用于鉴定转化子，也被用于对通过特定的载体系 统来实现的瞬时或稳定的蛋白表达进行量化(Rhodes C A et al(1995)Methods Mol Biol 55：121-131)。
[0293]对含多核苷酸序列的转化体的鉴定
[0294]尽管标记基因表达的存在/不存在表明了感兴趣的基因的存在与否，但是活 性sHASEGP的存在和表达应该被确证。例如，如果sHASEGP被插入到标记基因 序列中，含有sHASEGP的重组细胞可以通过标记基因功能的缺乏而得以鉴定。可 选择地，标记基因可以与sHASEGP序列一前一后地置于单个启动子的控制之下。 标记基因因诱导或选择而发生的表达通常表示与之串连的sHASEGP也被表达。通 过在合适的条件下测试条件培养基的sHASEGP酶活性，可以检测被适当糖基化的 具有中性活性的sHASEGP。
[0295]sHASEGP的纯化
[0296]用sHASEGP核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于表达被编码的蛋白 质和从细胞培养物中对其进行回收的条件下进行培养。由重组细胞产生的蛋白质 优选是可分泌的，但可以被包含于细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。如 本领域技术人员所知道的，包含sHASEGP的表达载体，可以设计为具有信号序列， 这有利于sHASEGP通过原核或真核细胞膜直接分泌出来。其他重组构建可以将 sHASEGP与编码有助于可溶性蛋白的纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接起来 (Kroll D J et al(1993)DNA Cell Biol 12：441-53；cf discussion of vectors infra containing fusion proteins)。
[0297]sHASEGP也可以与一个或多个额外的多肽结构域一起作为重组蛋白表达， 添加这些额外的多肽结构域是为了方便蛋白纯化。这样的有助于纯化的结构域包 括但不限于金属螯合肽，诸如组氨酸-色氨酸模块，其允许在固定化的金属上进行 纯化，蛋白A结构域，其允许在固定化的免疫球蛋白上进行纯化，以及用于FLAGS 延伸/亲合纯化系统的结构域(Immunex Corp，Seattle Wash.)。在所述纯化结构域和 sHASEGP之间包含入可切割的连接子序列诸如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，San Diego Calif.)，可用于帮助纯化。一种这样的表达载体提供了包含sHASEGP的融 合蛋白的表达，并含有编码6-组氨酸残基的核酸，并接有硫氧还蛋白和肠激酶切 割位点。所述组氨酸残基有助于在IMIAC(固定化金属离子亲合层析)上进行纯 化，如Porath et al(1992)Protein Expression and Purification 3：263-281中所述，而 肠激酶切割位点为由融合蛋白纯化出趋化因子提供了手段。
[0298]除了重组生产之外，sHASEGP的片段也可以使用固相技术通过直接的肽合 成产生(cf Stewart et al(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，W H Freeman Co，San Francisco；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc 85：2149-2154)。使用手工技术或自动 化技术，可以进行蛋白质的体外合成。自动化合成例如可以通过使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer，Foster City Calif.)，依据制造商提供的说 明书来完成。sHASEGP的不同片段可以分别进行化学合成，然后使用化学的方法 组合起来，产生全长的分子。
[0299]含有sHASEGP多肽的编码序列或其部分的表达载体，例如可以通过将所 述编码部分亚克隆入3个PGEX载体中的每一个的EcoRI限制性位点而制备得到 (谷胱甘肽S-转移酶表达载体(Smith and Johnson，Gene 7：31-40(1988))。这使得产物 可以以正确的阅读框被表达。用于表达sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域的示范 性载体和系统包括公知的毕赤酵母(Pichia)载体(例如可从Invitrogen，San Diego， CA获得)，特别是那些设计用于分泌被编码的蛋白质的载体和系统。蛋白质也可 以在细胞质内被表达，诸如以包涵体的形式。一种示范性的载体描述于实施例中。
[0300]用于转化大肠杆菌细胞的质粒包括例如pET表达载体(参见美国专利 4,952,496；可从Novagen，Madison，WI获得；也参见Novagen出版的文献，其描 述了该系统)。
[0301]这样的质粒包括pET 11a，其包含T7 lac启动子、T7终止子、诱导型大肠 杆菌lac操纵子和lac阻遏物基因；pET 12A-C，其含有T7启动子、T7终止子和 大肠杆菌OMPT分泌信号；和pET 15B和pET19B(Novagen，Madison，Wi)，其含 有便于用His柱纯化的His-Tag前导序列和便于在柱纯化之后进行切割的凝血酶切 割位点；T7-lac启动子区域和T7终止子。
[0302]载体被导入宿主细胞，诸如毕赤酵母细胞和细菌细胞诸如大肠杆菌中，蛋 白质表达于其中。示范性的毕赤酵母菌株例如包括GS115。示范性的细菌宿主含 有编码T7 RNA聚合酶的DNA的染色体拷贝，其可操作地连接到诱导型启动子诸 如LACUV启动子(参见美国专利4,952,496)。这样的宿主包括但不限于溶原性大 肠杆菌菌株BL21(DE3)。
[0303]sHASEGP结构域、衍生物和类似物可以通过各种本领域已知的方法产生。 例如，一旦表达HASEGP多肽或其结构域、片段或衍生物的重组细胞被鉴定出之 后，单独的基因产物可以被分离和分析。这可以通过基于该蛋白的物理/或功能特 性的分析来实现，所述分析包括但不限于：对产物进行放射性标记，然后通过凝 胶电泳、免疫测定、与标记物标记的产物进行交联和测定蛋白水解活性来进行分 析。
[0304]sHASEGP多肽可通过本领域已知的标准方法(或从天然来源或从表达复合 物或蛋白质的重组宿主细胞)分离和纯化，包括但不限于柱层析(例如，离子交 换、亲和、凝胶排阻、反相高压和快速蛋白质液相)、差速离心、差异溶解度或用 于蛋白质纯化的其它任何标准技术。
[0305]在一种实施方案中，sHASEGP可以由HZ24转染和甲氨蝶呤扩增的DG44 细胞的化学成分确定的条件培养基中纯化至同质，这通过下述方法进行：1)切向 流渗滤，2)利用阴离子交换层析进行结合并洗脱，3)流经苯基琼脂糖层析，4)利 用苯基硼酸盐层析进行结合并洗脱，和4)利用羟磷灰石层析进行结合并洗脱。
[0306]可以使用本领域已知的任何合适的分析方法来评价功能特性。
[0307]可选择地，一旦鉴定出sHASEGP多肽或它的结构域或衍生物，该蛋白的 氨基酸序列可以从编码它的基因的核苷酸序列推断出来。结果，蛋白或它的结构 域或衍生物可以用本领域已知的标准化学方法合成得到(例如参见Hunkapiller et al， Nature 310：105-111(1984))，再进行体外的糖基化作用。
[0308]可以在蛋白质水平对sHASEGP多肽序列进行操作。本文也考虑这样的 sHASEGP多肽蛋白、其结构域、其衍生物或类似物或片段，其在翻译期间或翻译 后进行不同的修饰，例如通过糖基化作用、乙酰基化作用、磷酸化作用、氨基化 作用、聚乙二醇化作用、通过已知的保护/封阻基团进行的衍生化作用、蛋白质水 解切割、连接到抗体分子或其他细胞配体。
[0309]许多化学修饰中的任何一种都可以用已知技术来实施，包括但不限于用溴 化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8、NABH4进行特异性的化学切割， 乙酰基化作用、甲酰基化作用、氧化作用、还原作用、新陈代谢合成，这是在衣 霉素和其他这样的试剂存在的情况下进行的。
[0310]此外，sHASEGP多肽的结构域、类似物和衍生物可以化学合成。例如，对 应于sHASEGP多肽的某部分的肽——其包括想要的结构域或者其在体外介导想 要的活性——可以使用肽合成仪来合成。
[0311]而且，如果有必要的话，非典型的氨基酸或化学氨基酸类似物可以被引入， 以替代或加入到sHASEGP多肽序列。总体上说，非典型的氨基酸包括但不限于常 见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、E-ABU、 e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬 氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯 基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、特别设计的氨基酸诸如β- 甲基氨基酸、ca-甲基氨基酸、na-甲基氨基酸和氨基酸类似物。此外，氨基酸可以 是d(右旋)或1(左旋)的。
[0312]当天然产物被怀疑是突变体或者是分离自新种时，分离自该天然来源的 sHASEGP多肽的氨基酸序列，以及那些在体外表达的或者在体内或体外由合成的 表达载体表达的多肽的氨基酸序列，可以通过对DNA序列的分析来确定，或者可 选择地，可以通过对分离的蛋白质进行直接测序来确定。这样的分析可以通过人 工测序或通过使用自动氨基酸测序仪来实施。
[0313]修饰一本文考虑了sHASEGP多肽和结构域的许多的修饰。编码sHASEGP 的核酸分子可以利用本领域已知的许多策略的任何策略来进行修饰(Sambrook ET A/.(1990)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。这些序列可以用限制性内切核酸酶在合 适的位点进行切割，然后进行进一步的酶促修饰，如果有必要的话，再分离并进 行体外连接。在编码sHASEGP的结构域、衍生物或类似物的基因的生产中，应该 小心以确保在编码期望活性的基因区域，该被修饰的基因保留原始的翻译阅读框， 而不被翻译终止信号阻断。
[0314]此外，编码sHASEGP的核酸分子可以在体外或体内进行突变，以产生和/ 或破坏翻译、起始和/或终止序列，或者产生编码区域中的变异，和/或形成新的限 制性内切核酸酶位点或破坏先前存在的位点，从而方便进一步的体外修饰。而且， 如本文中所描述地，考虑了具体一级序列变化的突变蛋白，例如Cys残基的替代 和糖基化位点的消除或添加；SEQ ID No.1的sHASEGP具有7个潜在的糖基化位 点。这样的修饰可以由本领域已知的用于突变发生的任何技术来完成，这些技术 包括但不限于化学诱变和体外定点诱变(Hutchinson et al.，j.Biol.Chem.253： 6551-6558(1978))，使用TABE Linkers(Pharmacia)。在一种实施方案中，例如， sHASEGP多肽或其结构域被修饰以包括进荧光标记。在其它特定的实施方案中， sHASEGP多肽被修饰以具有异质双功能试剂，这样的异质双功能试剂可以被用于 交联复合体中的成员。
[0315]此外，sHASEGP的结构域、类似物和衍生物可以用化学的方法合成。例如， 对应于sHASEGP多肽的某部分的肽——其包括想要的结构域或者其在体外介导 想要的活性——可以使用肽合成仪来合成。而且，如果有必要的话，非典型的氨 基酸或化学氨基酸类似物可以被引入，以替代或加入到sHASEGP序列。总体上说， 非典型的氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁 酸、Abu、2-氨基丁酸、E-ABU、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨 基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、 t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基 酸、特别设计的氨基酸诸如ti-甲基氨基酸、ca-甲基氨基酸、na-甲基氨基酸和氨基 酸类似物。此外，氨基酸可以是d(右旋)或1(左旋)的。
[0316]F.具有N-连接糖部分的功能活性糖基化SHASEGP的产生
[0317]适当地N-糖基化的人sHASEGP是产生催化性能稳定的蛋白质所必需的。 sHASEGP的N-连接糖基化可以通过各种技术来实现。sHASEGP的糖基化作用可 以通过下述方法实现：将编码sHASEGP的核酸引入能够进行适当的N-连接糖基 化的真核细胞，或者，将sHASEGP多肽与能够引入期望的N-连接糖部分的无细 胞提取物或纯化的酶相接触。
[0318]表达系统的选择
[0319]由真核细胞表达系统引入到异位表达的多肽中的糖基化作用的程度和类型 会有所变化。例如，CHO细胞可高效率地将N-连接糖基化作用引入到活性 sHASEGP多肽中。
[0320]引入N-连接的糖基化作用以产生功能性sHASEGP产物的其他真核表达系 统可以通过将人sHASEGP表达质粒引入所述细胞中并测试中性活性而得以测试。 合适的N-连接糖基化作用可以利用PNGASE释放的寡糖的FACE分析来确定。本 文中进一步提供了具有催化活性的sHASEGP的糖基化情况。糖基化的确认也可以 通过用PNGASE-F处理来自所述细胞的sHASEGP来进行，或通过在导入编码 sHASEGP的核酸之后将此细胞培养在衣霉素中来进行。
[0321]sHASEGP多肽在体外的N-糖基化作用。sHASEGP多肽可以通过下述方法 进行N-糖基化：将sHASEGP多肽与无细胞提取物接触，该无细胞提取物含有将 N-连接的糖转移到sHASEGP多肽的活性，无细胞提取物诸如犬微粒体膜，或者通 过偶联的转录和翻译进行N-糖基化，如通过商业渠道可获得的(Promega Madison WI)。
[0322]寡糖被认为具有还原端和非还原端，无论在还原端的糖是否实际上是还原 糖。根据公认的命名法，本文在描述寡糖时将非还原端置于左边，将还原端置于 右边。本文在描述所有的寡糖时，使用了非还原糖的名字或缩写(例如Gal)，然后 是糖苷键的构型(α或β)、环键(ring bond)、在该键中涉及的还原糖的环位置，然 后是还原糖的名字或缩写(例如GlcNAc)。两个糖之间的连接可以表示为例如2，3、 2.fw darw.3或(2，3)。每个糖均为吡喃糖。
[0323]如本文中所使用的，N-连接糖部分(N-linked sugar moiety)是指通过Asn 残基的酰胺氮附着到sHASEGP的寡糖。N-连接寡糖分为几个主要的类型(甘露寡 糖型、复合型、杂合型、硫酸化型)，它们都具有通过Asn残基的酰胺氮连接的 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核，所述Asn残基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa 不是Pro)。N-连接位点常常可由在测序期间“空白(blank)”循环的出现而间接指 示出来。可以在由PNGase F释放寡糖之后，进行阳性鉴定，PNGase F将糖基化 Asn转变为Asp。PNGase F释放之后，N-连接的寡糖可以用Bio-Gel P-6层析进行 纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析(HPAEC)(Townsend et al.， (1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体可以用HPAEC拆分。在HPAEC 层析谱中海藻糖残基将较早地移至洗脱位置，而其他唾液酸残基将会增加保留时 间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-1酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAse B、转铁蛋白)被同时进行处理，这可方便寡糖峰的指认。收集到的寡糖可以用成 分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征(Waegheet al.，(1983)Carbohydr Res.123，281-304.)，利用NMR光谱术来测定端基异构构型(Van Halbeek(1993)in Methods Enzymol 230)。
[0324]可选择地，寡糖可以用荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)进行鉴定。 Callewaert et al.(2001)Glycobiology 11，275-281。
[0325]G.sHASEGP上的N-连接糖部分的检测和表征
[0326]确定蛋白是否事实上被糖基化是糖蛋白聚糖分析中的起始步骤。在十二烷 基硫酸钠存在的条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)这一方法已经作为在 蛋白质测序之前的最终步骤被选择。糖基化的蛋白质在SDS-PAGE中常常以弥散 的条带进行迁移。用肽-N4-(N-乙酰-D-氨基葡萄糖基)天冬酰胺酰胺酶(PNGase F) 处理之后带宽的显著减小和迁移位置的变化被认为表明发生了N-糖基化作用。如 果其他类型的糖基化作用是主要的，其他方法必须被使用。凝集素印迹法提供了 一种独立于糖基化类型(N和O)的方法。凝集素，从各种植物组织得到的碳水化合 物结合蛋白，对于在糖蛋白聚糖上发现的广泛的确定的糖表位不但具有高的亲和 力而且具有窄的特异性(Cummings，R.D.(1994)Methods in Enzymol.230，66-86.)。当 与生物素或地高辛结合时，利用与碱性磷酸酶连接的抗生物素蛋白或抗-地高辛抗 体，可以容易地通过比色反应在膜印迹上将它们鉴定出来(Haselbeck，et al.(1993) Methods in Mol.Biol.14，161-173.)，这类似于蛋白质印迹中使用的二抗-碱性磷酸酶 反应。用一组具有明确限定的特异性的凝集素所进行的筛选可以提供关于糖蛋白 的碳水化合物补充物的大量信息。重要的是，颜色显影放大(color development amplification)是足够高的，以致10-50ng的糖蛋白能容易地在SDS-PAGE的膜印 迹上看见。尽管凝集素对它们的同系配体显示出很高的亲和力，但一些的确对结 构相关的表位表现出显著的亲和力。因此，重要的是，当选择一组凝集素时，应 该注意交叉反应性的可能性，并使用最有可能将复合型、杂合型和高甘露糖型N- 连接聚糖与O-连接结构分别地区分开来的那些凝集素。
[0327]单糖分析也可以被用来确定sHASEGP是否被糖基化，并且如同凝集素分 析的情况，这提供了关于结构特征的额外信息。定量单糖成分分析i)鉴定糖基化 蛋白，ii)给出各种糖与蛋白质的摩尔比，iii)在某些情况下提示寡糖类型的存在， iv)是设计结构阐明策略(structural elucidation strategy)的第一步，和v)为用于 重组糖蛋白疗法的产品一致性提供了测量手段。近年来，带有脉冲电流检测(pulsed amperometric detection)的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)已被广泛用于测 定单糖成分(Townsend，et al.(1995)in Carbohydrate Analysis：High-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis(Z.El Rassi ed.).pp.181-209.)。更 最近地，基于荧光团的标记方法已被引入，并且许多可以以试剂盒的形式获得。 荧光方法的明显优点是灵敏性增加(50倍)。一个潜在的不利之处是，在水解产物中 或者在外部标准混合物(external standard mixture)中，在偶联反应期间，不同的 单糖对荧光团可能显示出不同的选择性。然而，灵敏性的增加和由可利用的糖蛋 白的总量中的一小部分便能鉴定出存在哪些单糖的能力，以及应用激光诱发荧光 所带来的潜在的更大的灵敏性使得该方法具有吸引力。
[0328]小量的sHASEGP的单糖成分分析最好在电印迹——如果待分析的是更少 量的样品等份的话，最好是被点印迹——之后，再在PVDF(PSQ)膜上进行 (Weitzhandleret al，(1993)J.Biol.Chem.268，5121-5130.)。PVDF是碳水化合物分析 的理想基质，这是因为一旦通过酸或酶促水解被释放之后，单糖或寡糖都不再结 合于膜。
[0329]FACE分析是检测sHASEGP的糖基化情况的有效手段。应用了30％寡糖凝 胶的FACETM N-连接寡糖作图(Prozyme)便是一种这样的机制。通过用N-聚糖酶 (a.k.a PNGase)进行酶促消化而从100μg的糖蛋白上切下的、经荧光团ANTS标记 并通过电泳分离而得到的寡糖可以用于检测sHASEGP的糖基化情况。通过将样品 和该样品的稀释物以及寡糖标准梯度标记物一同跑胶，可以确定寡糖条带的相对 位置，其中，以聚合度(DP)单位来表示迁移距离。
[0330]H.用于鉴定调节sHASEGP活性的化合物的筛选方法
[0331]本文中例举并描述了若干类分析方法。应该理解的是，透明质酸酶结构域 可以用于其他分析方法。然而，这里要说明的是，透明质酸酶结构域显示出催化 活性。
[0332]同样地，它们对于体外的筛选分析也是理想的。
[0333]它们也可以用于结合分析。
[0334]sHASEGP全长酶原、活性酶和透明质酸酶结构域都被考虑应用于本领域技 术人员已知的任何筛选分析中，包括本文中提供的那些分析方法。因此，下面的 描述，如果是涉及透明质酸酶分析，则旨在适用于包括sHASEGP在内的任何透明 质酸酶的单链透明质酸酶结构域或其催化活性部分的应用。其他分析例如结合分 析也在本文中提供，特别是对于应用sHASEGP，包括其任何变体例如其拼接变体。
[0335]1.用于鉴定调节sHASEGP蛋白的透明质酸酶活性的试剂的催化分析方法。 本文提供了用于鉴定sHASEGP——特别是其单链透明质酸酶结构域或催化活性部 分——的催化活性的调节物的方法。该描述通过下述步骤实施：将全长酶原或活 化形式的sHASEGP，特别是其单链结构域在受测物质存在的情况下与sHASEGP 的底物相接触，检测底物的蛋白水解，由此评估该sHASEGP的活性，并将该活性 与对照相比较。例如，对照可以是通过下述步骤评价出的sHASEGP活性：将包括 全长酶原或活化形式在内的sHASEGP，特别是其单链结构域与该sHASEGP的底 物相接触，检测底物的蛋白质水解，由此评估出sHASEGP的活性。在存在和不存 在所述的受测化合物时的结果被比较。活性的差异指示了受测物质调节sHASEGP 的活性。sHASEGP活化切割的激活剂也被考虑到；这样的分析在后面被讨论到。
[0336]在一种实施方案中，多种受测物质在上述的筛选方法中同时被筛选。在另 一实施方案中，sHASEGP从靶细胞中分离出，然后作为工具用于鉴定对所述靶细 胞具有潜在的特异性的试剂。
[0337]在另一种实施方案中，受测物质是治疗性化合物，因此，在受测物质存在 和受测物质不存在的情况下所测得的sHASEGP活性的差异表明靶细胞对治疗性 化合物有应答。
[0338]一种方法包括下述步骤：(a)将sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域与一 种或多种受测化合物在有助于配体和化合物相互作用的条件下相互接触；和(b)在 所述的一系列化合物中鉴定出特异性地结合于所述配体的一种或多种化合物。
[0339]本文中提供的另一方法包括下述步骤：a)将sHASEGP多肽或其透明质酸 酶结构域与sHASEGP多肽的底物接触，检测底物的降解，由此评估该sHASEGP 多肽的活性；b)在受测物质存在的情况下，将该sHASEGP多肽与sHASEGP多肽 的底物接触，检测底物的降解，由此评估sHASEGP多肽的活性；和c)比较在步 骤a)和b)中所评估的sHASEGP多肽的活性，从而，由步骤a)中测得的活性与由 步骤b)中测得的活性的差异表明该受测物质调节该sHASEGP多肽的活性。
[0340]在另一种实施方案中，多种受测物质同时被筛选。在比较存在或不存在受 测物质时的sHASEGP多肽活性以评估该受测物质是否是该sHASEGP多肽的调节 物时，不一定必须平行地测定活性，尽管这样的平行测量是常用的。在一个时间 点测量sHASEGP多肽的活性，并将所测得的活性与该sHASEGP多肽的活性历史 值相比较是可行的。
[0341]例如，可以在受测物质存在的情况下测量该sHASEGP多肽的活性，并与 先前在没有该受测物质的情况下所测得的sHASEGP多肽的活性历史值相比较，反 之亦然。例如，这可以通过在与用于执行分析的试剂盒一同提供的插页或者小册 子上提供该sHASEGP多肽的活性值来实现。
[0342]用于选择特定sHASEGP的底物的方法在实施例中被描述，并例举了特定 的透明质酸酶分析方法。
[0343]提供了联合物以及含有所述联合物并任选地包括实施分析的说明书的试剂 盒。所述联合物包括sHASEGP多肽和待分析的sHASEGP多肽的底物，以及可任 选的用于检测所述底物的蛋白水解的试剂。所述底物，可以是生色或荧光分子， 包括糖胺聚糖，可被特定的sHASEGP多肽水解，它可以通过测试该sHASEGP多 肽切割该受测底物的能力而被经验性地鉴定。鉴定出可被最有效地被切割的底物， 即，以最低的蛋白浓度和/或最快的速度或在理想的条件下被切割的底物。
[0344]本文还提供了含有上述联合物的试剂盒。该试剂盒可任选地包括鉴定 sHASEGP多肽活性的调节物的说明书。任何sHASEGP多肽都被考虑作为鉴定其 活性的调节物的靶。
[0345]2.结合分析。本文也提供了用于鉴定和分离试剂特别是结合sHASEGPs的 化合物的方法。这些分析是被设计用来鉴定结合分离的透明质酸酶结构域(或含有 sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域的非sHASEGP多肽的其它蛋白质)的试剂，或 结合包括衍生自全长酶原或衍生自延伸的透明质酸酶结构域的活化形式在内的活 化形式的试剂。这样被鉴定得到的化合物是用于鉴定用来治疗涉及异常透明质酸 酶活性的紊乱和疾病的化合物的候选化合物或先导化合物。用于所述方法中的 sHASEGP多肽包括本文中定义的任何sHASEGP多肽，包括sHASEGP单链透明 质酸酶结构域或其蛋白水解活性部分。
[0346]多种方法在本文中被提供。这些方法可以在溶液中或在固相反应中实施， 其中，在固相反应中，sHASEGP多肽或其透明质酸酶结构域通过连接子直接或间 接地连接到固体支持物上。筛选分析被描述于实施例中，并且这些分析方法已经 被用来鉴定候选化合物。
[0347]对于本文的目的，所有上述结合分析都是被提供用于sHASEGP。
[0348]本文提供了鉴定试剂例如化合物的方法，所述试剂特异性地结合于 sHASEGP单链透明质酸酶结构域、全长活化的sHASEGP或其双链透明质酸酶结 构域。该方法可以通过下述步骤来实施：(a)在可使得sHASEGP和试剂之间发生 结合的条件下，将sHASEGP与一种或多种受测试剂接触；和(b)在所述的一系列 试剂中鉴定出特异性地结合sHASEGP的一种或多种试剂。
[0349]例如，在实施这样的方法时，将sHASEGP多肽与可能的结合伴侣或细胞 提取物或细胞组分在允许潜在的结合伴侣与多肽相结合的条件下混合。在混合之 后，将已与sHASEGP结合的肽、多肽、蛋白或其他分子从混合物中分离出来。结 合到sHASEGP上的结合伴侣然后可以被移走并作进一步的分析。为了鉴定和分离 结合伴侣，整个蛋白质例如SEQ ID No.1的整个公开的蛋白质可以被使用。可选 择地，可以使用该蛋白质的片段。
[0350]许多方法都可以被用来获得细胞提取物或体液，诸如血液、血清、尿、汗 液、滑液、CSF和其他此类液体。
[0351]例如，可以使用物理或化学破碎方法将细胞破碎。物理破碎方法的例子包 括但不限于超声波和机械剪切。化学裂解方法的例子包括但不限于去污剂裂解和 酶裂解。为了获得用于本方法的提取物，技术人员可以方便地采用制备细胞提取 物的方法。
[0352]一旦细胞的提取物被制备，在蛋白质和结合伴侣能够结合的条件下，将提 取物与sHASEGP混合。可以使用各种条件，包括类似于人细胞的细胞质中的条件 或体液中的条件的条件，所述体液例如血液。特性，例如所使用的细胞提取物的 同渗浓度pH、温度和浓度可以被改变，以优化蛋白质与结合伴侣的结合。类似地， 用于从体液中分离出感兴趣的分子的方法是已知的。
[0353]在合适的条件下混合之后，将结合的复合体从混合物中分离出来。可以使 用各种技术来分离混合物。例如，对sHASEGP具有特异性的抗体可以被用来免疫 沉淀结合伴侣复合体。可选择地，可以使用标准的化学分离技术诸如层析和密度/ 沉淀离心。
[0354]将提取物中的非结合的细胞组分除去之后，可以使用常规方法，将结合的 伴侣从复合体上解离下来。例如，可以通过改变混合物的盐浓度或pH来完成解离。
[0355]为了帮助将结合在一起的结合伴侣对从混合提取物中分离出来，可以将 sHASEGP固定到固体支持物上。例如，该蛋白质可以附着到硝化纤维基质或丙烯 酸珠子上。该蛋白质或其片段与固体支持物的粘附有助于将肽/结合伴侣对与提取 物中的其他组分分离开来。被鉴定出的结合伴侣可以是单个蛋白质或由两个或更 多个蛋白质构成的复合物。
[0356]可选择地，编码单链透明质酸酶的核酸分子可以被用于酵母双杂交系统。 酵母双杂交系统已被用于鉴定其他的蛋白伴侣对，并且可以容易地加以应用，以 利用本文中描述的核酸分子。
[0357]其他的体外结合分析，特别是sHASEGP的体外结合测定，使用的是多肽 的混合物，其至少包括这些蛋白质中的一个的催化结构域和一个或多个候选结合 目标或底物。在合适的条件下温育混合物之后，sHASEGP或其含有催化结构域的 多肽片段结合候选底物或与候选底物相互反应的能力被评估。对于无细胞的结合 分析，这些成分中的一种成分包括可检测的标记或与可检测的标记偶联。所述标 记可以提供直接的检测，诸如放射性、发光性、光密度或电子密度等，或间接的 检测，诸如表位标签、酶等。许多方法都可以被用来检测标记，取决于标记的性 质以及其它的分析成分。例如，结合于固体基质的标记物可被检测，或含有该标 记物的结合复合体的一部分，可以从该固体基质上分离出来，然后所述标记可以 被检测。
[0358]3.信号转导的检测。作为膜锚定蛋白的sHASEGP，可以直接或间接地参与 信号转导，即，可以直接作为细胞表面受体参与信号转导，或间接地通过激活蛋 白质例如能够引发信号转导的促生长因子来参与信号转导。
[0359]此外，分泌的sHASEGP，诸如SEQ ID NO.4中描述的sHASEGP的可溶性 结构域可以参与信号转导，或者直接地通过结合到细胞表面受体或与细胞表面受 体相互作用而进行，或间接地通过激活蛋白质例如可以引发信号转导的促生长因 子而进行。用于评价信号转导的分析方法是本领域技术人员已知的，它们可以适 用于sHASEGP多肽。
[0360]提供了用于鉴定可影响或改变信号转导的试剂的分析方法，所述信号转导 由sHASEGP——尤其是全长的sHASEGP或sHASEGP的足以将胞外结构域或其 功能部分锚定在细胞表面的部分——直接或间接地——例如通过来激活促生长因 子——介导。这样的分析例如包括基于转录的分析，其中，转导信号的调节是通 过检测对报告基因表达的影响而被评估的(参见美国专利5,436,128)。
[0361]4.用于鉴定调节编码sHASEGP的核酸的表达的试剂的方法。另一实施方 案提供了用于鉴定调节sHASEGP编码核酸的表达的试剂的方法。这样的分析方法 可以使用任何可利用的用于监控编码sHASEGP的核酸的表达水平的变化的手段。
[0362]可以使用任何分析方法来监测试剂调节编码sHASEGP的核酸的表达的能 力。例如，mRNA表达可以通过与核酸的杂交而被直接监测。而且，所描述的酶 分析方法可以被用来检测可调节sHASEGP的表达的试剂。
[0363]在合适的条件下和在合适的时间，将细胞系暴露于待被测试的试剂，并通 过标准的程序分离总RNA或mRNA(参见，例如Sambrook et al(1989) MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press)。用于检测暴露于试剂的细胞和对照细胞之间在RNA表达水平上 的差异的探针可以由核酸制备得到。通常地，但不是必需的，所设计的探针在高 严格性的条件下只与目标核酸杂交。在高严格性的条件下，只有高度互补的核酸 杂交体形成。因此，分析条件的严格性决定了为了能够形成杂交体而在两核酸链 之间应该存在的互补的数量。应该选择可以将探针：靶标杂交体和可能的探针：非靶 标杂交体之间的稳定性的差异最大化的严格性。
[0364]例如，sHASEGP的N末端和C末端片段可以表达在细菌中，并用来搜索 与这些片段相结合的蛋白质。融合蛋白，例如在sHASEGP的N或C末端区域融 合有His标记或GST的蛋白可以被制备，以用作底物。这些融合蛋白可以偶联到 例如谷胱甘肽-琼脂糖珠子上，然后探查细胞裂解物或体液。在裂解之前，细胞或 体液可以用候选试剂处理，所述候选试剂能够调节sHASEGP或与其上的结构域相 互作用的蛋白。结合于所述融合蛋白的裂解物蛋白可以用SDS-PAGE来分辨、通 过蛋白质测序或质谱术进行分离和鉴定，如本领域所知的。
[0365]抗体探针可以通过使用肽、多肽或蛋白质，采用合适的免疫方案，对合适 的哺乳动物宿主进行免疫而制备得到，如果所述的肽、多肽或蛋白质足够长(例如 sHASEGP多肽的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、 40或更多的连续氨基酸)，或者如果需要增强免疫原性的话，可以将它们偶联到合 适的载体上。用于制备携有载体——例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH) 或其他载剂蛋白质——的免疫原性偶联物的方法是本领域已知的。在某些情况下， 使用例如碳二亚胺试剂所进行的直接偶联是有效的；在其他例子中，连接试剂诸 如那些由Pierce Chemical Co.，Rockford，IL提供的试剂是被期望的，以提供对半抗 原的可及性。半抗原肽可以用Cys残基在氨基或羧基端处延伸，或者有半胱氨酸 残基散布其中，例如，这可以方便与载剂的连接。
[0366]免疫原的施用通常可以通过在一段合适的时间内进行注射来完成，可以与 合适的佐剂一同使用，如本领域常规理解的。在实施免疫方案期间，对抗体进行 滴定，以确定形成了足够的抗体。
[0367]抗肽抗体(anti-peptide antibodies)可以应用合成的肽来产生，所述的合成 的肽例如对应于sHASEGP的羧基末端氨基酸。
[0368]合成肽的长度可以小至1-3个氨基酸，通常至少4个氨基酸残基或更长。 可以使用标准方法将肽偶联到KLH，并将其免疫到动物诸如兔或有蹄类动物中。 然后可以纯化出多克隆抗体，例如使用含有共价结合的肽的Actigel珠子进行纯化。
[0369]尽管使用这种方法产生的多克隆抗血清可以满足某些应用，例如药物组合 物，但通常是使用单克隆制剂。如通常所知道的，通过使用Kohler等人的标准方 法(Nature 256：495-7(1975)或进行修改——所述修改可以实现淋巴细胞或脾细胞的 无限增殖，可以制备出分泌期望的抗体的永久化细胞系。通过免疫测定，筛选出 分泌期望的抗体的永久化细胞系，其中，抗原是肽半抗原、多肽或蛋白质。
[0370]当分泌期望抗体的合适的永久化细胞系被鉴定出之后，该细胞可以借助于 腹水在体外培养或在体内产生。特别感兴趣的是识别sHASEGP的催化结构域或活 化切割位点(区域)的单克隆抗体。
[0371]也可以产生抗体或片段。特异性地结合受体的期望区域的区域，也可以利 用多个物种来源以嵌合体的形式产生。
[0372]在上述方法中被分析的试剂可以是被随机选择的或者被理性选择或设计 的。
[0373]试剂可以是例如肽、小分子和碳水化合物。本领域技术人员可以容易理解， 对试剂的结构性质是没有限制的。
[0374]如本领域所知道的，肽试剂可以使用标准的固相(或液相)肽合成方法来 制备。此外，编码这些肽的DNA可以使用商业上可获得的寡核苷酸合成仪器合成， 并使用标准的重组生产系统重组产生。如果欲包含非基因编码的氨基酸，则使用 固相肽合成的生产方法是必需的。
[0375]I.治疗方法
[0376]由本文中的方法鉴定出的sHASEGPs被用于治疗或预防sHASEGP底物在 动物特别是哺乳动物包括人中的异常积聚。在一种实施方案中，该方法包括给予 哺乳动物有效量的sHASEGP糖蛋白，从而使疾病或紊乱得以治疗或预防。
[0377]在另一实施方案中，sHASEGP抑制剂可以被用于处理过量的中性透明质酸 酶活性。被处理的哺乳动物可以是人。本文中所提供的抑制剂是通过筛选分析鉴 定出来的那些抑制剂。此外，考虑了抗体和反义核酸或双链RNA(dsRNA)，诸如 RNAi。
[0378]1.反义治疗(antisense treatment)：在特定的实施方案中，如上文所描述的， sHASEGP多肽功能可以被sHASEGP多肽反义核酸降低或抑制，从而治疗或预防 过度的软骨素酶活性。提供了至少6个核苷酸，一般可多达大约150个核苷酸的 核酸的治疗或预防用途，这些核酸对于编码sHASEGP多肽或其部分的基因或 cDNA是反义的。本文中所使用的sHASEGP多肽“反义”核酸指这样的核酸，其 借助于一定程度的序列互补性，并且通常在高严格性的条件下，能够与sHASEGP 多肽RNA(一般是mRNA)的一部分序列相杂交的核酸。反义核酸可以与sHASEGP 多肽mRNA的编码和/或非编码区域相互补。这样的反义核酸具有治疗剂的用途， 其可以减弱或抑制sHASEGP多肽功能，可以用于治疗或预防上述的紊乱。
[0379]sHASEGP多肽反义核酸至少6个核苷酸，通常是寡核苷酸(范围在6至约 150个核苷酸内，包括6至50个核苷酸)。反义分子可以与透明质酸酶结构域的所 有或部分序列互补。例如，寡核苷酸至少10个核苷酸、至少15个核苷酸，优选 至少20、40、80到至少100个核苷酸、或至少125个核苷酸。寡核苷酸可以是 DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修饰形式，可以单链的或双链的。寡核 苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上有修饰。寡核苷酸可以包括其他附加 的基团，诸如肽或有助于转运通过细胞膜的试剂(参见，例如Letsinger et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556(1989)；Lemaitre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652(1987)；PCT出版物WO 88/09810，公开于1988年12月15日)或有助 于转运通过血脑屏障的试剂(参见例如PCT出版物WO 89/10134，公开于1988年4 月25日)、杂交引发切割试剂(hybridization-triggered cleavage agents)(参见例如 Krol et al.，BioTechniques 6：958-976(1988))或嵌入剂(参见例如Zon.Pharm.Res.5： 539-549(1988))。
[0380]sHASEGP多肽反义核酸通常是寡核苷酸，典型地是单链DNA或RNA或其 类似物或其混合物。例如，该寡核苷酸包括与编码人sHASEGP多肽的核酸的一部 分序列反义的序列。寡核苷酸可以用本领域已知的取代物在它的结构的任何位置 进行修饰。
[0381]sHASEGP多肽反义寡核苷酸可以包括至少一个经修饰的碱基部分，其可以 选自下列但不限于下列：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次 黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫 尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、 N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌 呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5- 甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-apos- 甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲巯-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5- 羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿 嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、 尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶、 (ACP3)w和2，6-二氨基嘌呤。
[0382]在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个修饰的糖部分，其可以选自下 述但不限于下列：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和已糖。寡核苷酸可以包括至 少一个修饰的磷酸骨架，其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯 (phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三 酯和甲乙缩醛(formacetal)或其类似物。
[0383]寡核苷酸可以是a-异头(anomeric)寡核苷酸。a-异头寡核苷酸与互补RNA 形成特异性的双链杂交体，其中，双链相互平行(Gautier et al.，Nucl.Acids Res. 15：6625-6641(1987))。
[0384]寡核苷酸可以联接到另一分子，例如但不限于肽；杂交引发交联试剂 (hybridization triggered cross-linking agent)、转运试剂或杂交引发切割试剂 (hybridization-triggered cleavage agent)。寡核苷酸可以使用本领域已知的标准方 法合成，例如使用自动DNA合成仪(例如可以商购自Biosearch，Applied Biosystems 等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可以使用Stein et al.，Nucl.Acids Res.16：3209(1988) 的方法合成；甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用可控有孔玻璃聚合物支持物 (controlled pore glass polymer supports)来制备(Sarin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85：7448-7451(1988))等。在特定的实施方案中，sHASEGP多肽反义寡核苷 酸包括具有催化活性的RNA或核酶(参见如PCT国际公布WO 90/11364，公开于 1990年10月4日；Sarver et al.，Science 247：1222-1225(1990))。在另一实施方案 中，寡核苷酸是2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，Nucl.Acids Res. 15：6131-6148(1987))，或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue et al.，FEBS Lett. 215：327-330(1987))。
[0385]可选择地，寡核苷酸可以是双链RNA(dsRNA)，诸如RNAi。
[0386]在可选择的实施方案中，sHASEGP多肽反义核酸通过外源序列的转录而在 细胞内产生。
[0387]例如，载体可以被导入体内，这样它被细胞吸收，在该细胞中，载体或其 一部分被转录，产生反义核酸(RNA)。这样的载体将含有编码sHASEGP多肽反义 核酸的序列。这样的载体可以保持为附加体的形式或整合入染色体，只要它能被 转录以产生期望的反义RNA。这样的载体可以用本领域标准的重组DNA技术方 法构建得到。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其他载体，它们可以用于在 哺乳动物细胞内的复制和表达。编码sHASEGP多肽反义RNA的序列的表达可以 借助于本领域已知的在包括人在内的哺乳动物的细胞中起作用的任何启动子。这 样的启动子可以是诱导型的或组成型的。这样的启动子包括但不限于：SV40早期 启动子区域(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981))；包含在劳斯肉瘤病 毒的3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto et al.，Ce//22：787-797(1980))；疱疹 胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))；金 属硫蛋白基因的调控序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))等。
[0388]反义核酸包括这样的序列，即，该序列与HASEGP多肽基因——包括人 sHASEGP多肽基因——的RNA转录物的至少一部分互补。绝对的互补是不被要 求的。可有效地治疗或预防赘生性疾病的sHASEGP多肽反义核酸的量取决于疾病 的性质，并且可以通过标准的临床技术经验性地确定。
[0389]如果可能，在用人进行测试和进行应用之前，在体外测定在细胞中的反义 细胞毒性(antisense cytotoxicity)然后再在有用的动物模型系统中进行测定是有利 的。
[0390]2.RNA干扰。RNA干扰(RNAi)(参见例如Chuang et al.(2000)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 97：4985)可以被用来抑制编码sHASEGP的基因的表达。干扰RNA(RNAi) 片段，特别是双链(ds)RNAi可以被用来产生sHASEGP功能的丧失。在生物体中， 包括哺乳动物、线虫(C.elegans)、果蝇和植物以及人中，使用RNAi来使得基因 沉默的方法是已知的(参见例如Fire et al.(1998)Nature 391：806-811；Fire(1999) Trends Genet.15：358-363；Sharp(2001)Genes Dev.15：485-490；Hammond et al. (2001)Nature Rev，Genet.2：110-119；Tuschl(2001)Chem.Biochem.2：239-245； Hamilton et al.(1999)Science 286：950-952；Hammond et al.(2000)Nature 404： 293-296；Zamore et al.(2000)Cell 101：25-33；Bernstein et al.(2001)Nature 409： 363-366；Elbashir et al.(2001)Genes Dev.15：188-200；Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-498；国际PCT申请WO 01/29058；国际PCT申请WO 99/32619)。
[0391]表达双链RNA(dsRNA)的构建物被导入宿主，诸如动物和植物，其中使用 可保持为附加体或者可整合入基因组的可复制载体。通过选择合适的序列，dsRNA 的表达可以干扰编码sHASEGP的内源mRNA的积聚。RNAi也可以在体外被用来 抑制表达。
[0392]包括对sHASEGP具有选择性的(即，对sHASEGP是独特的)至少约21(或 21)个核苷酸的区域，被用来制备RNAi。约21个核苷酸的较小片段可以直接(即， 在体内或在体外)转化入细胞中；更大的RNAi dsRNA分子通常通过使用编码它们 的载体而被导入。dsRNA分子至少约21bp长或更长，例如50、100、150、200 和更长。在体外和体内，将核酸分子导入细胞的方法、试剂和实验方案是本领域 技术人员知道的。
[0393]3.基因疗法。在示范性的实施方案中，借助于基因疗法，施用包括编码 sHASEGP多肽或其功能结构域或其衍生物的核苷酸序列的核酸，以促进sHASEGP 多肽功能。基因疗法是指通过将核酸给予患者而进行的治疗。在该实施方案中， 由核酸产生它的编码蛋白，而该蛋白通过促进sHASEGP多肽功能来实现治疗效 果。可以使用任何本领域可利用的用于基因治疗的任何方法(参见Goldspiel et al.， Clinical Pharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)； Tolstoshev，An.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260： 926-932(1993)和Morgan and Anderson，An.Rev.Biochem.62：191-217(1993)； TIBTECH 115：155-215(1993))。例如，用于基因治疗的一种治疗组合物包括编码 sHASEGP多肽的序列，其是表达载体的一部分，所述表达载体可以在合适的宿主 中表达sHASEGP多肽或其结构域、片段或嵌合蛋白。特别地，这样的核酸具有与 sHASEGP多肽编码区域可操作地连接的启动子，该启动子是诱导型的或组成型的， 并且，可任选地，可以是组织特异性的。在另一特定的实施方案中，使用这样的 核酸分子，在该核酸分子中，有助于在基因组的期望位点发生同源重组的区域位 于sHASEGP多肽编码序列和任何其他期望的序列的两侧，从而使得sHASEGP蛋 白质核酸可以染色体内表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86： 8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。
[0394]将核酸传送到患者，可以是直接的，在这种情况下，病人被直接暴露于核 酸或携带核酸的载体，或可以是间接的，在这种情况下，细胞首先用核酸进行体 外转化，然后移植到患者中。这两种途径都是已知的，分别称为体内或离体(先 体外后体内)基因疗法。
[0395]在特定的实施方案中，核酸被直接体内给药，在体内，它被表达从而产生 被编码的产物。这可以通过利用本领域已知的许多方法中的任何方法来实现，诸 如通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并将它给予患者，由此，它变为 细胞内的物质，这可以例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体 来实现(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击 法(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或包覆以脂质或细胞表面受体或转染试剂，封 装在脂质体、微颗粒或微胶囊中，或通过将其连接到已知能进入核内的肽上并将 它给予患者，或通过将其连接到将遭受受体介导的胞吞作用的配体并将它给予患 者(参见如Wu and Wu，J.Biol.Chem，262：4429-4432(1987))其可以被用来靶向特异 性表达受体的细胞类型)，等等。在另一实施方案中，可以形成核酸-配体复合物， 在该复合物中，配体是破坏核内体的促融合病毒肽，这使得核酸可以免遭溶酶体 降解。在另一个实施方案中，通过靶向特异性的受体，核酸可以在体内被作为靶 标，被细胞特异性地吸收和表达(参见例如PCT公布号WO 92/06180，日期为1992 年4月16日(Wu et al.)；WO 92/22635，日期为1992年12月23日(Wilson et al.)； WO 92/20316，日期为1992年11月26日(Findeis et al.)；WO 93/14188，日期为1993 年7月22日(Clarke et al.)，WO 93/20221，日期为1993年10月14日(Young))。可 选择地，核酸可以被导入细胞内，并整合入宿主细胞DNA中以便于表达，这通过 同源重组进行(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)； Zijistra et al.，Nature 342：435-438(1989))。
[0396]在特定的实施方案中，可以使用含有sHASEGP多肽核酸的病毒载体。例 如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller et al.，Meth.Enzymol.217：581-599 (1993))。这些逆转录病毒载体已被修饰以剔除对于病毒基因组的包装和整合入宿 主细胞DNA是非必要的逆转录病毒序列。用于基因疗法的sHASEGP多肽核酸被 克隆入载体，其帮助基因传送到患者中。关于逆转录病毒载体的更为详细的描述 可以参见Boesen et al.，Biotherapy 6：291-302(1994)，其描述了使用逆转录病毒载体 将mdr1基因传送给造血干细胞，以便使干细胞对化学疗法更具抗性。
[0397]阐述逆转录病毒载体在基因治疗中的应用的其他参考文献是：Clowes et al.， J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；和Grossman and Wilson，Curr. Opin.In Genetics And Devel.3：110-114(1993)。
[0398]腺病毒是可以用于基因治疗的另一种病毒载体。腺病毒是可以用来将基因 传送给呼吸上皮细胞的特别具有吸引力的载体。腺病毒天然地感染呼吸上皮细胞， 在那里它们引起轻微的疾病。基于腺病毒的传送系统的其他靶标是肝、中枢神经 系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染未分裂细胞的优点。Kozarsky and Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)综述了基于腺 病毒的基团治疗。Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)证明了使用腺病毒 载体将基因转移到猕猴的呼吸上皮细胞。腺病毒在基因治疗中的应用的其他例子 可以参见Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68： 143-155(1992)；和Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)。
[0399]腺相关病毒(AAV)也已被提议用于基因疗法(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp. Biol.Med.204：289-300(1993))。
[0400]基因治疗的其他途径涉及，通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导转染或 病毒感染的方法，将基因转移到组织培养物的细胞中。通常，转移的方法包括将 选择性标记转移到细胞中。然后对细胞进行选择，以分离出已经吸收并正在表达 被转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞传送给患者。
[0401]在这种实施方案中，将核酸导入细胞，然后再在体内给予所得到的重组细 胞。这种导入可以用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、 微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体进行感染、细胞融合、染色体介导 的基因转移、微细胞(microcell)介导的基因转移、原生质球融合等。用于将外源 基因导入细胞的许多技术是本领域已知的(参见如Loeffler and Behr，Meth.Enzymol. 217：599-618(1993)；Cohen et al.，Meth.Enzymol.217：618-644(1993)；Cline， Pharmac.Ther.29：69-92(1985))，并且它们都可以被使用，只要作为接受者的细胞 的必要的发育和生理功能不被破坏。该技术应该能够稳定地将核酸转移入细胞中， 这样，核酸被细胞表达并且通常能遗传给子代细胞并被子代细胞表达。
[0402]所获得的重组细胞可以通过本领域已知的各种方法被传送给患者。在一种 实施方案中，上皮细胞被注射，例如进行皮下注射。在另一实施方案中，重组皮 肤细胞可以用作皮移植片，移植到患者上。重组血细胞(例如造血干细胞或祖先细 胞)可以通过静脉给予。欲使用的细胞的数量取决于所想要的效果、患者的状态等， 并可以由本领域技术人员确定。
[0403]可以导入核酸以便实施基因治疗的细胞包括任何期望的可以利用的细胞类 型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质化细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、 肝细胞；血细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒 细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干 细胞或祖细胞，例如诸如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏和其他来源获得的 干细胞。
[0404]例如，用于基因治疗的细胞对于患者是自体的。在重组细胞被用于基因治 疗的实施方案中，sHASEGP多肽核酸被导入细胞中，这样，它被细胞或它们的子 代表达，然后重组细胞被体内施用以获得治疗效果。在特定的实施方案中，使用 干细胞或祖细胞。依据该实施方案，可以体外分离和培养的任何干细胞和/或祖细 胞都具有潜在应用价值。
[0405]这样的干细胞包括但不限于造血干细胞(HSC)、上皮组织诸如皮和肠内膜 (lining)的干细胞、胚胎心肌细胞、肝脏干细胞(PCT公开号WO 94/08598，日期 为1994年4月28日)和神经干细胞(Stemple andAnderson，Cell 71：973-985(1992))。
[0406]上皮干细胞(ESC)或角质化细胞可以通过已知的程序从组织诸如皮肤和肠 内膜获得(Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229(1980))。在成层上皮组织诸如皮肤 中，通过胚层——最靠近基膜的层——内的干细胞的有丝分裂，发生更新作用 (renewal)。肠内膜内的干细胞使得该组织可以快速的更新。从患者或供体的皮肤 或肠内膜获得的ESC或角质化细胞可以培养在组织培养基中(Rheinwald，Meth. Cell Bio.21A：229(1980)；Pittelkow and Scott，Cano.Clinic Proc.61：771(1986))。如 果ESC由供体提供，也可以使用抑制宿主对移植物的反应活性的方法(例如放射、 给予药物或抗体，以促进温和的免疫抑制)。
[0407]至于造血干细胞(HSC)，能分离、增殖和体外培养HSC的任何技术都可以 用于本实施方案中。可以被用来实现这些实施方案的技术包括(a)从骨髓细胞分离 并建立HSC培养物，所述骨髓细胞分离自未来的宿主或者供体；或(b)应用先前建 立的长期HSC培养物，其可以是过敏原性的或异种的。
[0408]在使用非自体的HSC时，通常也使用抑制未来宿主/患者的移植免疫反应的 方法。在特定的实施方案中，人骨髓细胞可以通过针吸法(needle aspiration)从后 髂嵴获得(参见例如Kodo et al.，J.Clin.Invest.73：1377-1384(1984))。例如，HSC可 以制备成高度富集或基本上纯的形式。所述的富集可以在长期培养之前、期间或 之后完成，并且可以使用本领域已知的任何技术来进行。骨髓细胞的长期培养物 可以通过使用例如改良的Dexter细胞培养技术(Dexter et al.，J.Cell Physiol.91：335 (1977))或Witlock-Witte培养技术(Witlock and Witte，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79： 3608-3612(1982))来建立和维持。
[0409]在特定的实施方案中，待被导入以进行基因治疗的核酸包括可操作地连接 于编码区域的诱导型启动子，这样，该核酸的表达通过控制合适的转录诱导物的 存在或不存在而得以控制。
[0410]3.药物前体(prodrugs)-提供了治疗肿瘤的方法。该方法通过给予药物前 体而得以实施，该药物前体被HASEGP在特定的位点切割从而释放出活性药物或 能够在体内被转化为活性药物的前体(precursor)。一旦与表达sHASEGP活性的 细胞接触，所述药物前体被转化为活性药物。药物前体可以是缀合物(或称为偶 联物)，其含有连接到目标sHASEGP的底物上的活性试剂，诸如抗肿瘤药物，例 如细胞毒性试剂或其他治疗试剂(TA)，这样，该缀合物中的药物或试剂是无活性的 或者不能进入细胞，但是在切割之后便被激活。例如，药物前体可以含有硫酸软 骨素分子，通常相对短、小于约20个双糖单位，其被目标sHASEGP催化切割。 细胞毒性试剂包括但不限于烷化剂、抗增殖剂和微管蛋白结合试剂。其他的试剂 包括长春花类药物(vinca drugs)、丝裂霉素、争光霉素和紫杉醇。
[0411]J.药物组合物和给药方式
[0412]1.组合物的成分。本文提供了含有活性sHASEGP的药物组合物。本文也 提供了调节sHASEGP多肽活性的化合物与其它的用于治疗透明质酸酶紊乱的疗 法或化合物诸如抗体化合物的联合。
[0413]sHASEGP多肽和另外的试剂可以作为分离开的组合物进行包装，以便可以 一起给药或连续给药或间断给药。可选择地，它们可以提供为单一的组合物来施 用，或提供为两种组合物但给药时作为单一的组合物。所述的这些联合可以包装 为试剂盒。
[0414]2.制剂和给药途径
[0415]本文中提供的sHASEGP多肽和其可溶性人透明质酸酶结构域可以配制成 药物组合物，通常用于单剂量给药。所述制剂中的多肽的浓度可以有效地传送在 给药之后对于目的治疗为有效的量。通常，组合物被配制成便于单次剂量给药的 形式。为了配制组合物，一定重量分数的sHASEGP多肽、其可溶性人透明质酸酶 结构域或其混合物以有效的浓度溶解、悬浮、分散或者以其它方式混合于所选择 的媒介物(载体)中，这样，被治疗的症状可以被缓解或改善。
[0416]适用于本文提供的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的给药的药 物载体或媒介物包括本领域技术人员所知道的适用于特定的给药模式的任何载 体。
[0417]此外，多肽可以作为组合物中唯一的药物活性组分而配制于组合物中，或 者，可以与其他活性组分组合。脂质体悬浮液，包括以组织为靶的脂质体，也可 以用作药物学上可接受的载体。这些都可以依据本领域技术人员已知的方法来制 备。例如，脂质体制剂可以按美国专利4,522,811中所述的制备。
[0418]活性sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域被包含在药物学上可接受 的载体中，其数量足以在不对被治疗的患者产生不利副作用的情况下产生治疗上 有用的效果。治疗上有效的浓度可以通过在已知的体外和体内系统中测试多肽而 经验性地确定，例如通过可以使用本文中提供的分析方法，或参见Taliani et al. (1996)Anal.Biochem.240：60-67，Filocamo et al.(1997)J Virology 71：1417-1427， Sudo et al.(1996)Antiviral Res.32：9-18；Buffard et al.(1995)Virology 209：52-59； Bianchi et al.(1996)Anal.Biochem.237：239-244；Hamatake et al.(1996) Intervirology 39：249-258；Steinkühler et al.(1998)Biochem.37：8899-8905；D′Souza et al.(1995)J.Gen.Virol.76：1729-1736；Takeshita et al.(1997)Anal.Biochem.247： 242-246；也参见例如Shimizu et al.(1994)J Yirol.68：8406-8408；Mizutani et al. (1996)J.Virol.70：7219-7223；Mizutani et al.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun. 227：822-826；Lu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93：1412-1417；Hahm et al. (1996)Virology 226：318-326；Ito et al.(1996)J.Gen.Virol.77：1043-1054；Mizutani et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.212：906-911；Cho et al.(1997)J.Virol. Meth.65：201-207，然后由此推断出用于人的剂量。
[0419]通常，考虑治疗上有效的剂量。被给予的量可以在每毫升血液体积0.001 至1mg的级别，包括约0.005-0.05mg/ml血液体积和约0.01mg/ml血液体积。制 备药物的单位剂量形式(Pharmaceutical dosage unit forms)，其在每单位剂量形式 中可提供约1mg至约1000mg的必需活性组分或必需组分的组合，包括约10至约 500mg，包括约25-75mg的必需活性组分或必需组分的组合。精确的剂量可以经验 性地确定。
[0420]在一些例子中，优选高单位剂量的人sHASEGP。例如，对于sHASEGP的 静脉内给药，优选的sHASEGP浓度为每毫升500-100,000单位。冻干的sHASEGP 制剂对于保存大的单位剂量的sHASEGP也是理想的。考虑将200,000单位的 sHASEGP冻干小瓶装制剂用于静脉内传送。
[0421]高浓度的剂量也被考虑用于传送小体积的sHASEGP。考虑将10-100μl的 5000单位/ml的sHASEGP注射入眼睛前房，以溶解之前在白内障和有晶体眼人工 晶体植入手术期间施用的粘弹性物质。50-200U/ml剂量的小体积注射也被考虑用 于玻璃体内操作，例如治疗糖尿病视网膜病的玻璃体出血或玻璃体视网膜脱落。
[0422]稍大体积的注射(例如，在约1到几ml，或者更多)被考虑用于稍大的和 /或更容易引流(drained)的体内空间。例如，如本文所述，1到几ml或更多的眶 周注射可注射到一个或多个眼周间隙，例如，通过向特农下隙或巩膜上隙注射， 以促进药理学试剂向眼后部组织例如脉络丛(choroid plexus)和/或视网膜的巩膜 递送。如本领域技术人员所理解的，一些体内间隙能够易于容纳较大体积。例证 性地，眼周的巩膜上隙和特农下隙能够易于容纳1到几ml或甚至更大的体积(例 如，高达或高于5到10ml，取决于例如具体组织的特性和递送体积的速度)。
[0423]另外，如本文所描述和例证的，可以看出较大体积sHASEGP(可与一种或 多种其它药理学试剂或其它试剂联合)的引入可用于进一步驱动试剂向体内期望 的目标位置的递送。不限制于特定作用机理，相信此类较大体积注射可通过由增 加的压差所促进的对流输送过程，进一步驱动sHASEGP和存在于被治疗组织中的 其它试剂的渗透或散布。此外，不希望限制于特定作用机理，相信这种增加的压 差可在本发明中发生，其通过下列所述中的一种或多种作用而发生：(i)升高的驱 动压或升高的“压位差(pressure head)”(例如，由伴随大量填充或略微溢出或超 过间隙或注射位点产生的增加的液体静压力所引起)；和(ii)降低的下游压力或 降低的“阻力(impedance)”(例如，由间质基质中通路的打开所引起，其是伴随 局部的透明质酸酶活性和随之发生的相对水合的透明质素的降解而发生的)。用于 本发明的这种应用和其它应用(如，促进药理学试剂及其它试剂的递送)的优选 透明质酸酶是sHASEGPs，特别是人sHASEGPs，在将试剂递送到人体内的一个或 多个组织的情况下。但是，在透明质酸酶应用和用途中涉及的这些以及其它方法， 也可应用于使用非人sHASEGPs的情况，诸如哺乳动物sHASEGPs，以及其它人 类或哺乳动物透明质酸酶，优选此类透明质酸酶的可溶形式。
[0424]活性成分可以一次给予，或者可以分为多次较小的剂量，间隔一段时间给 药。可以理解的是，精确的剂量和治疗的持续时间取决于正在被治疗的疾病，并 且可以使用已知的测试方案经验性地确定，或由体内或体外的测试数据推出。应 该注意的是，浓度和剂量值也可以随待减轻的症状的严重程度而有所变化。进一 步应该理解的是，对于任何特定的对象，具体的剂量方案应该随着时间的推移， 根据个体的需要以及实施和监控该组合物的给药的人员的专业判断作出调整，应 该理解本文中所阐述的浓度范围仅仅是示范性的，不是为了限制所要求保护的组 合物和含有它们的联合物的范围或应用。
[0425]药学上可接受的衍生物包括酸、盐、酯、水合物、溶剂化形式和药物前体 形式。通常所选择的衍生物的药物动力学特性优于对应的中性sHASEGP或其可溶 性人透明质酸酶结构域。
[0426]因此，为了形成药物组合物，将有效浓度或数量的一种或多种在本文中提 供的多肽或其药学上可接受的衍生物与用于全身性给药、外部给药或局部给药的 合适的药物载体或媒介物混合。sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域以 可有效地改善或治疗正被考虑治疗的紊乱的量被包括在其中。组合物中活性多肽 的浓度取决于活性多肽的吸收、失活、排泄率、给药方案、给药量、具体剂型以 及本领域技术人员已知的其他因素。
[0427]用于所述方法的治疗剂可以通过本领域技术人员已知的任何途径来施用， 例如但不限于局部给药、关节内给药、脑池内给药、眼内给药、眶周给药、心室 内给药、鞘内给药、静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、腹腔内给药、皮内给 药、皮下给药、气管内给药以及其中的任何两种或更多种给药途径的组合。也可 尝试干粉状肺制剂(dry powder pulmonary formulations)。
[0428]最合适的给药途径将依据所打算的用途而变化，所述的用途例如用作传送 试剂(delivery agent)以促进流体的皮下传送、用来降低接受粘弹性物质的青光眼 患者的眼内压力，或用作“扩散剂”以增强化学治疗剂的活性，还将依据感兴趣 的位置而变化，所述的位置例如具体的内脏、肿瘤生长物、眼内腔和表皮。给药 的方式包括但不限于外部给药、局部给药、关节内给药、脑池内给药、眼内给药、 眶周给药、心室内给药、鞘内给药、静脉内给药、肌肉内给药、气管内给药、腹 腔内给药、皮内给药、皮下给药以及其中的任何两种或更多种给药方式的组合。 例如，对于各种癌症的治疗，例如鳞状细胞癌、乳腺癌、膀胱癌和肠胃癌的治疗， 局部给药，包括给药于肿瘤生长的位点(例如，鞘内给药、心室内给药或脑池内给 药)，是有益的，其优点在于，治疗剂可以高的浓度被施用，而无并发症的危险， 而这些并发症会伴随着治疗剂的全身性给药而发生。
[0429]作为示范性的一类能与sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)联合的药理学试 剂(例如通过与一种或多种sHASEGP共同配制或与一种或多种sHASEGPs共同 施用(其可在施用所述试剂之前、同时或之后施用)来联合)，对于治疗各种癌症 有效的或可能有效的许多试剂已在本领域中被描述，且新抗癌试剂定期被开发， 其同样可以与一种或多种sHASEGPs联合(例如，通过共同配制，或在试剂给药 之前、同时和/或之后共同给药)，以改进试剂的药动学、药效学或其它有益的性能。
[0430]例证性地(不限于此)，许多抗癌或化疗试剂现已被批准可以与sHASEGPs (或其它糖胺聚糖酶)联合用于治疗各种癌症，此联合可通过共同配制或共同给 药(在抗癌剂给药之前、同时或之后)。此类试剂包括，例如，阿地白介素 (Aldesleukins)(例如，PROLEUKINTM)、阿仑单抗(Alemtuzumabs)(例如， CAMPATHTM)、Alitretinoins(例如，ANRETINTM)、别嘌呤醇(Allopurinols)(例如， ZYLOPRIMTM)、六甲蜜胺(Altretamines)(例如，HEXALENTM)、氨磷汀 (Amifostines)(例如，ETHYOLTM)、阿那曲唑(Anastrozoles)(例如，ARIMIDEXTM)、 三氧化二砷(Arsenic Trioxides)(例如，TRISENOXTM)、天冬酰胺酶(Asparaginases)(例 如，ELSPARTM)、BCG Live(例如，TICETM BCG)、贝沙罗汀(Bexarotenes)(例如， TARGRETINTM)、博来霉素(Bleomycins)(例如，BLENOXANETM)、静脉注射白消 安(Busulfan intravenous)(例如，BUSULFEXTM)、口服白消安(Busulfan orals)(例如， MYLERANTM)、卡普睾酮(Calusterones)(例如，METHOSARBTM)、卡培他滨 (Capecitabines)(例如，XELODATM)、卡铂(Carboplatins)(例如，PARAPLATINTM)、 卡莫司汀(Carmustines)(例如，BCNUTM，BiCNUTM)、聚苯丙生为载体的卡莫司 (Carmustines with Polifeprosans)(例如，GLIADELTM Wafer)、塞来昔(Celecoxibs)(例 如，CELEBREXTM)、苯丁酸氮芥(Chlorambucils)(例如，LEUKERANTM)、顺铂 (Cisplatins)(例如，PLATINOLTM)、克拉屈滨(Cladribines)(例如，LEUSTATINTM， 2-CdATM)、环磷酰胺(Cyclophosphamides)(例如，CYTOXANTM，NEOSARTM)、阿糖 胞苷(Cytarabines)(例如，CYTOSAR-UTM)、阿糖胞苷脂质体(Cytarabine liposomals) (例如，DepoCytTM)、达卡巴嗪(Dacarbazines)(例如，DTIC-DomeTM)、放线菌素 D(Dactinomycins)(例如，COSMEGENTM)、达依泊汀α(Darbepoetin Alfas)(例如， ARANESPTM)、道诺红菌素脂质体(Daunorubicin liposomals)(例如， DANUOXOMETM)、道诺红菌素/道诺霉素(Daunorubicins/Daunomycins)(例如， CERUBIDINETM)、地尼白介素-毒素连接物(Denileukin Diftitoxes)(例如， ONTAKTM)、右雷佐生(Dexrazoxanes)(例如，ZINECARDTM)、多烯紫杉醇 (Docetaxels)(例如，TAXOTERETM)、亚德里亚霉素(Doxorubicins)(例如， ADRLAMYCINTM，RUBEXTM)、亚德里亚霉素脂质体(Doxorubicin liposomals)(例 如，DOXILTM)、屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone propionates)(例如， DROMOSTANOLONETM和MASTERONETM注射剂)、Elliott′s B Solutions(例如， Elliott′s B SolutionTM)、表柔比星(Epirubicins)(例如，ELLENCETM)、阿法依伯汀 (Epoetin alfas)(例如，EPOGENTM)、雌莫司汀(Estramustines)(例如，EMCYTTM)、磷 酸依托泊甙(Etoposide phosphates)(例如ETOPOPHOSTM)、依托泊甙VP-16s (Etoposide VP-16s)(例如VEPESIDTM)、依西美坦(Exemestanes)(例如 AROMASINTM)、非格司亭(Filgrastims)(例如NEUPOGENTM)、5氟脱氧尿苷 (Floxuridines)(例如FUDRTM)、氟达拉宾(Fludarabines)(例如FLUDARATM)、含 5-FUs的氟尿嘧啶(Fluorouracils incl.5-FUs)(例如ADRUCILTM)、氟维司群 (Fulvestrants)(例如FASLODEXTM)、吉西他滨(Gemcitabines)(例如GEMZARTM)、 吉妥单抗/奥唑米星(Gemtuzumabs/Ozogamicins)(例如MYLOTARGTM)、醋酸戈舍 瑞林(Goserelin acetates)(例如ZOLADEXTM)、羟基脲(Hydroxyureas)(例如 HYDREATM)、替伊莫单抗(Ibritumomabs/Tiuxetans)(例如ZEVALINTM)、去甲氧正 定霉素(Idarubicins)(例如IDAMYCINTM)、异磷酰胺(Ifosfamides)(例如IFEXTM)、甲 磺酸伊马替尼(Imatinib mesylates)(例如GLEEVECTM)、干扰素α-2as(Interferon alfa-2as)(例如ROFERON-ATM)、干扰素α-2bs(Interferon alfa-2bs)(例如INTRON ATM)、伊立替康(Irinotecans)(例如CAMPTOSARTM)、来曲唑(Letrozoles)(例如 FEMARATM)、甲酰四氢叶酸(Leucovorins)(例如WELLCOVORINTM， LEUCOVORINTM)、左旋咪唑(Levamisoles)(例如ERGAMISOLTM)、环己亚硝脲 (Lomustines/CCNUs)(例如CeeBUTM)、Meclorethamines/氮芥 (Meclorethamines/Nitrogen mustards)(例如MUSTARGENTM)、醋酸甲地孕酮 (Megestrol acetates)(例如MEGACETM)、美法仑/L-PAM(Melphalans/L-PAMs)(例如 ALKERANTM)、含6-MPs的巯基嘌呤(Mercaptopurine incl.6-MPs)(例如 PURINETHOLTM)、美司那(Mesnas)(例如MESNEXTM)、甲氨蝶呤(Methotrexates)、 甲氧沙林(Methoxsalens)(例如UVADEXTM)、丝裂霉素Cs(Mitomycin Cs)(例如 MUTAMYCINTM，MITOZYTREXTM)、米托坦(Mitotanes)(例如LYSODRENTM)、米 托蒽醌(Mitoxantrones)(例如NOVANTRONETM)、苯丙酸南诺龙(Nandrolone Phenpropionates)(例如DURABOLIN-50TM)、Nofetumomabs(例如VERLUMATM)、 白细胞介素-11(Oprelvekins)(例如NEUMEGATM)、奥沙利铂(Oxaliplatins)(例如 ELOXATINTM)、紫杉醇(Paclitaxels)(例如PAXENETM，TAXOLTM)、氨羟二磷酸二 钠(Pamidronates)(例如AREDIATM)、培加酶(Pegademases)(例如ADAGENTM)、培 门冬酶(Pegaspargases)(例如ONCASPARTM)、培非格司亭(Pegfilgrastims)(例如 NEULASTATM)、喷司他丁(Pentostatins)(例如NIPENTTM)、哌泊溴烷 (Pipobromans)(例如VERCYTETM)、普卡霉素/光辉霉素 (Plicamycin/Mithramycins)(例如MITHRACINTM)、卟吩姆钠(sodiums)(例如 PHOTOFRINTM)、甲基苄肼(Procarbazines)(例如MATULANETM)、奎纳克林 (Quinacrines)(例如ATABRINETM)、拉布立酶(Rasburicases)(例如ELITEKTM)、美罗 华(Rituximabs)(例如RITUXANTM)、沙格司亭(Sargramostims)(例如PROKINETM)、 链脲霉素(Streptozocins)(例如ZANOSARTM)、滑石(Talcs)(例如SCLEROSOLTM)、 它莫西芬(Tamoxifens)(例如NOLVADEXTM)、替莫唑胺(Temozolomides)(例如 TEMODARTM)、替尼泊甙/VM-26s(Teniposides/VM-26s)(例如VUMONTM)、睾内酯 (Testolactones)(例如TESLACTM)、含6-TG的硫代鸟苷(Thioguanines incl.6-TG)、 三胺硫磷(Thiotepas)(例如THIOPLEXTM)、托泊替康(Topotecans)(例如 HYCAMTINTM)、托瑞米芬(Toremifenes)(例如FARESTONTM)、托西莫单抗 (Tositumomabs)(例如BEXXARTM)、曲妥珠单抗(Trastuzumabs)(例如 HERCEPTINTM)、维生素A酸/ATRA(Tretinoins/ATRA)(例如VESANOIDTM)、尿 嘧啶氮芥(Uracil Mustards)、戊柔比星(Valrubicins)(例如VALSTARTM)、长春花碱 (Vinblastines)(例如VELBANTM)、长春新碱(Vincristines)(例如ONCOVINTM)、长春 瑞宾(Vinorelbines)(例如NAVELBINETM)、唑来磷酸(Zoledronates)(例如ZOMETATM) 以及本文所描述的和本领域中的其它试剂。
[0431]如同本文描述的其它种类的药理学试剂一样，sHASEGP(或其它糖胺聚糖 酶)可与各种药理学试剂(例如，抗肿瘤药，或者本文描述的和/或本领域已知的 另一类试剂中的成员)的施用联合使用(或共同配制)。可选择地，sHASEGP(或 其它糖胺聚糖酶)可与指定种类的多于一种药理学试剂(例如，若干抗肿瘤试剂， 或本文所述的和/或本领域已知的其它种类试剂中的若干成员)联合施用(或共同 配制)。在与指定种类的两种或更多种试剂联合的情况下，通常优选这两种或多种 试剂通过两种或更多种不同的作用机理来起效。sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶) 也可与下述试剂联合施用(或共同配制)，即，第一指定类型的一种药理学试剂(例 如，抗肿瘤药，或本文所述的和/或本领域已知的其它类型试剂中的一种的一个成 员)，以及用于治疗多种症状中的任何症状的一种或多种不同类型的药理学试剂中 的一种或多种额外的药剂。尽管某些原理在这里以抗癌试剂为例被提出，但这些 原理也可适用于，例如，抗感染药和本文描述和列举的其它类型试剂中的众多成 员，以及本领域已知的或新开发的其它试剂。
[0432]在本文描述的任何联合物和/或联合制剂的情况下(包括至少一种sHASEGP (或其它糖胺聚糖酶)和至少一种其它试剂(例如药理学试剂，例如，本文列举 的一类试剂中的成员))，也考虑这种联合物和/或联合制剂可进一步包括一种或多 种试剂(如，各种稳定剂、赋形剂及其类似物)，其本身不发挥实质上的药效作用， 但其促进联合物和/或联合制剂的有效性(例如，通过稳定一种或多种成分或整个 制剂，通过帮助促进或靶向一种或多种试剂的活性或者sHASEGP的活性，和/或 通过降低毒性或者以其它方式改进联合物或联合制剂的安全性能)。
[0433]如本领域技术人员所理解的，这些试剂和其它抗癌试剂(以及本文描述的 其它类型试剂的成员)的新形式和配方被定期开发，其可同样与sHASEGPs(或其 它糖胺聚糖酶)联合。另外，由于此类酶可用于改进多种试剂的药动学和/或药效 学特性，并使试剂能够通过不同的(和可能更有目标的)途径被递送，例如， sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)可用于增强先前认为具有不理想特性的多种试剂 的PK和/或PD特性。在合适的动物模型中在同时存在和不存在sHASEGP的情况 下，对试剂进行测试，可以用来评估具体试剂的相对有效性和毒性。
[0434]如本文所阐释和例举的，多种大分子试剂(如，抗体和其它蛋白质，尤其 是通过非IV肠胃外注射给药的那些)显示出相对差的药动学性质，并可通过与 sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共同配制或共同给药而被显著地增强。不限制于 特定作用机理，一般地认为显示出相对低的疏水性的小分子试剂能更有效地散布， 例如通过间质流体中的对流输送，这可以通过sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)被 促进。预测这种属性的常用方法是，评估计算的和/或估计的辛醇：水分配系数 (Kow)，多种化合物的这种分配系数已被报道。在那一方面，试剂显示出＜3的log Kow，更优选＜2或＜1，更加优选＜0，还优选＜(-1)。如本领域技术人员所理解的， 许多试剂也可被共价地和/或非共价地修饰，以增加它们的亲水性，和/或将此类试 剂包裹于小泡或大分子复合物中以促进它们的渗透和/或递送。
[0435]为了进一步阐明的目的(但不限制于此)，示例性的可与sHASEGPs(或其 它糖胺聚糖酶)联合的抗癌药剂或化疗药剂被包括在下列列表中(其它是本领域 已知的)：阿西维辛(Acivicins)；阿柔比星(Aclarubicins)；阿考达唑(Acodazoles)； 阿克罗宁(Acronines)；阿多来新(Adozelesins)；阿地白介素(Aldesleukins)； Alitreninoins(9-顺式维甲酸)；六甲蜜胺(Altretamines)；Alvocidibs；安巴腙 (Ambazones)；二霉素(Ambomycins)；阿美蒽醌(Ametantrones)；氨鲁米特 (Aminoglutethimides)；氨吖啶(Amsacrines)；阿那曲唑(Anastrozoles)；阿那昔酮 (Anaxirones)；安西他滨(Ancitabines)；安曲霉素(Anthramycins)；Apaziquones；精 美司那(Argimesnas)；天冬酰胺酶(Asparaginases)；曲林菌素(Asperlins)；阿曲氮芥 (Atrimustines)；阿扎胞苷(Azacitidines)；阿扎替派(Azetepas)；固氮酶素 (Azotomycins)；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他(Batimastats)；贝那昔滨 (Benaxibines)；苯达莫司汀(Bendamustines)；苄替哌(Benzodepas)；贝沙罗汀 (Bexarotenes)；比卡鲁胺(Bicalutamides)；比他舍平(Bietaserpines)；Biricodars；双 蒽生(Bisantrenes)；双蒽生(Bisantrenes)；二甲磺酸双奈法德(Bisnafide Dimesylates)； 比折来新(Bizelesins)；博来霉素(Bleomycins)；硼替佐米(Bortezomibs)；布喹那 (Brequinars)；溴匹立明(Bropirimines)；布度钛(Budotitanes)；白消安(Busulfans)； 放线菌素C(Cactinomycins)；卡鲁睾酮(Calusterones)；卡纽替尼(Canertinibs)；卡 培他滨(Capecitabines)；卡醋胺(Caracemides)；卡贝替姆(Carbetimers)；卡铂 (Carboplatins)；卡波醌(Carboquones)；卡莫氟(Carmofurs)；卡莫司汀(Carmustines)； 卡瑞斯汀(Carubicins)；卡折来新(Carzelesins)；西地霉素(Cedefingols)；西地霉素 (Cemadotins)；苯丁酸氮芥(Chlorambucils)；塞奥罗奈(Cioteronels)；西罗霉素 (Cirolemycins)；顺铂(Cisplatins)；克拉屈宾(Cladribines)；克兰氟脲(Clanfenurs)； 克罗拉滨(Clofarabines)；Crisnatols；环磷酰胺(Cyclophosphamides)；阿糖胞苷 (Cytarabines)；达卡巴嗪(Dacarbazines)；放线菌素D(Dactinomycins)；柔红霉素 (Daunorubicins)；地西他滨(Decitabines)；右尼古地平(Dexniguldipines)；右奥马铂 (Dexormaplatins)；地扎胍宁(Dezaguanines)；地吖醌(Diaziquones)；Dibrospidiums； 地诺孕素(Dienogests)；Dinalins；Disermolides；多烯紫杉醇(Docetaxels)；Dofequidars； 氟铁龙(Doxifluridines)；阿霉素(Doxorubicins)；屈洛昔芬(Droloxifenes)；丙酸甲雄 烷酮(Dromostanolone Propionates)；偶氮霉素(Duazomycins)；依考莫司汀 (Ecomustines)；依达曲沙(Edatrexates)；Edotecarins；依氟鸟氨酸(Eflornithines)；依 克立达(Elacridars)；依利奈法德(Elinafides)；依沙芦星(Elsamitrucins)；乙嘧替氟 (Emitefurs)；恩洛铂(Enloplatins)；恩普氨酯(Enpromates)；Enzastaurins；依匹哌啶 (Epipropidines)；表阿霉素(Epirubicins)；依他前列素(Eptaloprosts)；厄布洛唑 (Erbulozoles)；依索比星(Esorubicins)；雌莫司汀(Estramustines)；依他硝唑 (Etanidazoles)；依托格鲁(Etoglucids)；依托泊甙(Etoposides)；氯苯乙嘧胺(Etoprines)； Exisulinds；法倔唑(Fadrozoles)；法扎拉滨(Fazarabines)；芬维A胺(Fenretinides)； 氟脲苷(Floxuridines)；氟达拉滨(Fludarabines)；氟尿嘧啶(Fluorouracils)；氟甲睾酮 (Fluoxymesterones)；氟西他滨(Flurocitabines)；磷喹酮(Fosquidones)；福司曲星 (Fostriecins)；福司曲星(Fostriecins)；福曲他明(Fotretamines)；加柔比星 (Galarubicins)；加洛他滨(Galocitabines)；吉西他滨(Gemcitabines)；吉罗酚 (Geroquinols)；吉马替康(Gimatecans)；吉莫斯特(Gimeracils)；格洛沙腙 (Gloxazones)；葡膦酰胺(Glufosfamides)；羟基脲(Hydroxyureas)；去甲氧基柔红霉 素(Idarubicins)；异磷酰胺(Ifosfamides)；伊莫福新(Ilmofosines)；伊洛马司他 (Ilomastats)；依美克(Imexons)；英丙舒凡(Improsulfans)；Indisulams；Inproquones； 干扰素(Interferons)；干扰素α(Interferon Alfas)；干扰素β(Interferon Betas)；干扰 素γ(Interferon Gammas)；白细胞介素-2s(Interleukin-2s)及其它白细胞介素(包括 重组的白介素)；茚托利辛(Intoplicines)；碘苄胍[131-I](Iobenguanes[131-I])；异丙 铂(Iproplatins)；依立替康(Irinotecans)；伊索拉定(Irsogladines)；伊沙匹隆 (Ixabepilones)；酮曲沙(Ketotrexates)；L-阿拉诺新(L-Alanosines)；兰瑞肽 (Lanreotides)；拉帕替尼(Lapatinibs)；Ledoxantrones；来曲唑(Letrozoles)；Leuprolides； 亮丙瑞林(Leuprorelins)(Leuprorelides)；来沙骨化醇(Lexacalcitols)；利奥吡咯 (Liarozoles)；洛铂(Lobaplatins)；洛美曲索(Lometrexols)；洛莫司汀(Lomustines)； 洛那法尼(Lonafarnibs)；洛索蒽醌(Losoxantrones)；勒托替康(Lurtotecans)；马磷酰 胺(Mafosfamides)；甘露舒凡(Mannosulfans)；马立马司他(Marimastats)；马索罗酚 (Masoprocols)；美登素(Maytansines)；氮芥(Mechlorethamines)；甲地孕酮 (Megestrols)；美仑孕酮(Melengestrols)；美法仑(Melphalans)；美诺立尔(Menogarils)； 美雄烷(Mepitiostanes)；巯嘌呤(Mercaptopurines)；美替辛德(Metesinds)；甲氨蝶呤 (Methotrexates)；美托咪酯(Metomidates)；氯苯氨啶(Metoprines)；美妥替哌 (Meturedepas)；米帕(Miboplatins)；米泼昔芬(Miproxifenes)；米索硝唑 (Misonidazoles)；米丁度胺(Mitindomides)；米托克星(Mitocarcins)；Mitocromins； 米托拉酮(Mitoflaxones)；米托洁林(Mitogillins)；米托胍腙(Mitoguazones)；米托马 星(Mitomalcins)；丝裂霉素(Mitomycins)；米托萘胺(Mitonafides)；米托喹酮 (Mitoquidones)；米托司培(Mitospers)；米托坦(Mitotanes)；米托蒽醌(Mitoxantrones)； 米托唑胺(Mitozolomides)；Mivobulins；咪唑立宾(Mizoribines)；莫法罗汀 (Mofarotenes)；莫哌达醇(Mopidamols)；Mubritinibs；霉酚酸(Mycophenolic Acids)； 奈达铂(Nedaplatins)；Nelzarabines；奈莫柔比星(Nemorubicins)；二胺硝吖啶 (Nitracrines)；诺考达唑(Nocodazoles)；诺拉霉素(Nogalamycins)；诺拉曲特 (Nolatrexeds)；Nortopixantrones；奥曲肽(Octreotides)；奥马铂(Ormaplatins)； Ortataxels；奥替拉西(Oteracils)；奥昔舒仑(Oxisurans)；氧苯砷(Oxophenarsines)； 紫杉醇(Paclitaxels)；氨羟二磷酸二钠(Pamidronates)；Patubilones；培门冬酶 (Pegaspargases)；Peldesines；培利霉素(Peliomycins)；Pelitrexols；培美曲塞 (Pemetrexeds)；奈莫司汀(Pentamustines)；培洛霉素(Peplomycins)；培磷酰胺 (Perfosfamides)；哌立福新(Perifosines)；吡铂(Picoplatins)；吡萘非特(Pinafides)； 哌泊溴烷(Pipobromans)；哌泊舒凡(Piposulfans)；吡非尼酮(Pirfenidones)；吡罗蒽 醌(Piroxantrones)；Pixantrones；Plevitrexeds；普卡霉素(Plicamycins)；普洛美坦 (Plomestanes)；普洛美坦(Plomestanes)；Porfimers；泊非霉素；泼尼 莫司汀(Prednimustines)；丙卡巴肼(Procarbazines)；普罗帕脒(Propamidines)； Prospidiums；嘌嘧替派(Pumitepas)；嘌罗霉素(Puromycins)；吡唑呋喃菌素 (Pyrazofurins)；雷莫司汀(Ranimustines)；利波腺苷(Riboprines)；利曲舒凡 (Ritrosulfans)；罗谷亚胺(Rogletimides)；罗喹美克(Roquinimexs)；链黑霉素 (Rufocromomycins)；沙柔比星(Sabarubicins)；沙芬戈(Safingols)；沙铂(Satraplatins)； 司铂(Sebriplatins)；司莫司汀(Semustines)；辛曲秦(Simtrazenes)；西佐喃(Sizofirans)； 索布佐生(Sobuzoxanes)；索拉芬尼(Sorafenibs)；Sparfosates；膦门冬酸(Sparfosic Acids)；司帕霉素(Sparsomycins)；螺锗(Spirogermaniums)；螺莫司汀(Spiromustines)； 螺铂(Spiroplatins)；螺铂(Spiroplatins)；鲨胺(Squalamines)；链黑霉素(Streptonigrins)； 链伐立星(Streptovarycins)；链脲菌素(Streptozocins)；磺磷酰胺(Sufosfamides)；磺 氯苯脲(Sulofenurs)；Tacedinalines；他利霉素(Talisomycins)；Tallimustines(他莫司 汀)；Tariquidars；牛磺莫司汀(Tauromustines)；Tecogalans；替加氟(Tegafurs)；替 洛蒽醌(Teloxantrones)；替莫泊芬(Temoporfins)；替尼泊甙(Teniposides)；替罗昔隆 (Teroxirones)；睾内酪(Testolactones)；Thiamiprines；硫代鸟嘌呤(Thioguanines)； 噻替派(Thiotepas)；硫米嘌呤(Tiamiprines)；噻唑呋啉(Tiazofurins)；噻氯咪索 (Tilomisoles)；替洛龙(Tilorones)；Timcodars；噻莫西酸(Timonacics)；替拉扎明 (Tirapazamines)；Topixantrones；托瑞米芬(Toremifenes)；Trabectedins(海鞘素743 (Ecteinascidin 743))；曲妥珠单抗(Trastuzumabs)；曲托龙(Trestolones)；曲西立滨 (Triciribines)；曲西立滨(Triciribines)；曲洛司坦(Trilostanes)；三甲曲沙 (Trimetrexates)；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林(Triptorelins)；曲磷胺 (Trofosfamides)；妥布氯唑(Tubulozoles)；乌苯美司(Ubenimexs)；乌拉莫司汀(Uracil Mustards)；乌瑞替派(Uredepas)；伐司扑达(Valspodars)；伐普肽(Vapreotides)；维 替泊芬(Verteporfins)；长春碱(Vinblastines)；长春新碱(Vincristines)；长春碱酰胺 (Vindesines)；长春匹定(Vinepidines)；长春氟宁(Vinflunines)；长春米特 (Vinformides)；长春甘酯(Vinglycinates)；长春西醇(Vinleucinols)；长春罗新 (Vinleurosines)；长春瑞宾(Vinorelbines)；长春罗定(Vinrosidines)；长春曲醇 (Vintriptols)；长春利定(Vinzolidines)；伏氯唑(Vorozoles)；黄链霉素A(胍甲四环 素)(Xanthomycin A′s(Guamecyclines))；折尼铂(Zeniplatins)；亚苄维[2-H](Zilascorbs [2-H])；净司他汀(Zinostatins)；佐柔比星(Zorubicins)；Zosuquidars；及其类似物。
[0436]适合于本文提供的sHASEGP多肽或可其溶性人类透明质酸酶结构域的施 用的制药上的和整型美容用的载体或媒介物，包括本领域技术人员已知的适合于 特定给药模式的任何此类载体。另外，多肽可以作为组合物中唯一的药物活性成 分被配制，或者可与不削弱所需作用的其它活性成分联合，或者与本领域技术人 员已知的能够补充所需作用的材料联合。例如，本文提供的sHASEGP多肽可用作 递送剂或“散布”剂，与另一种活性化合物联合，所述另一种活性化合物如治疗 上有效的试剂，包括但不限于药物或前药，以促进所述另一种活性成分的递送或 增强其活性。在具体实施方案中，sHASEGP多肽或其可溶性人类透明质酸酶结构 域，可与麻醉剂如利多卡因(Lignocaine)、丁哌卡因(Bupivicaine)或两者的混合 物共同配制或共同给药，可选择地，还和激素试剂如肾上腺素共同配制或共同给 药，以减少或终止眼科手术过程中的血液摄取。在另一个具体实施方案中， sHASEGP多肽或其可溶性人类透明质酸酶结构域，可与药理学试剂如抗炎剂共同 配制或共同给药，以增强药理学试剂在体内向哺乳动物组织的递送(例如，到眼 的一部分)，其中，此试剂被期望用于治疗特定症状。共同给药被考虑为，将 sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)与药理学试剂一起给药或在接近的时间内给药。 通常优选sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)在药理学试剂前不久(例如，之前5到 60分钟)给予，或者，最方便地，与药理学试剂一起给予。如本领域技术人员理 解的，所需的共同给药的接近程度主要取决于试剂在具体组织环境中的有效半衰 期，和所治疗的具体疾病，并可通过测定在适当模型例如适当的动物模型中以不 同的时间施用药剂的作用来优化。在一些情况下，给予sHASEGP(或其它糖胺聚 糖酶)的最佳计时将超过60分钟。例证性地，且不希望被理论束缚，在一些肿瘤 的情形中，例如，在化疗剂可以最大程度地进入肿瘤之前，在肿瘤中的透明质素 的降解充分地完成，从而减小肿瘤的间质体积，接着是透明质素再生阶段，在此 阶段中，流体被汲回肿瘤中，导致浆体对化疗剂的吸收增加。在后者情况下， sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)的最佳给药可能在药理学试剂给药前约1到20小 时获得。为了优化与用于疾病情况和药理学试剂的具体组合的药理学试剂相关的 提前给药的时间，本领域技术人员可采用常规时间进程的提前给药，通常用一个 小时或更短时间中的一个或几个时间点与大于一小时(但通常不超过一天)中的 一个或几个时间点相比较，以优化给药时间。sHASEGP多肽或其可溶性人类透明 质酸酶结构域，也可与多种化疗剂如毒素或肿瘤坏死因子共同配制或共同给予， 以增强化疗剂的活性和/或化疗剂对靶肿瘤的可达性。活性化合物被包括在载体中， 其量足以在被治疗的个体中发挥治疗有益作用且没有严重毒性作用。有效浓度可 通过使用体外和体内系统——包括本文描述的动物模型——测试化合物而被经验 性地确定。
[0437]在通过肠胃外给药(例如，通过消化道以外的其它途径，例如，通过皮下 的、皮内的、肌肉内的或静脉内的途径)递送的药理学试剂的情况下，sHASEGPs (或者其它糖胺聚糖酶)可容易地与多种此类药理学试剂中的任何共同配制或共 同给药，以增强它们向体内所需位点的递送。例如，取决于药理学试剂和给药途 径的具体结合，可通过增加试剂扩散通过递送位点处的组织或邻近组织(例如， 在其注射后)的程度(和/或速度)来增强递送，和/或通过增加试剂扩散和/或通过 经过目标组织的对流转运(例如，在其从血流、淋巴、脑脊液或其它流动体系释 放以后)被运载的程度(和/或速度)来增强递送。递送被增强的程度可被容易地 评估，例如，在动物模型系统中评价，在其中，sHASEGP的添加导致在体内的感 兴趣的组织中试剂的生物利用度有可测量到的增加。
[0438]不希望被理论束缚，相信在非静脉肠胃外(如，皮下的、皮内的和肌肉注 射剂)的情况下，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)在注射位点附近和在“下游” 位点处例如在注射位点与远端脉管床之间的位置的存在，可增强试剂向递送系统 如脉管的扩散和/或对流转运。在这种情况下的增强的递送，可伴随有效穿过并脱 离初始递送位点的试剂的量增加(可能通过增加流体总体流量的体积和速度来完 成)。
[0439]在许多药理学试剂——其在组织中会被降解、移除或以其它形式失活—— 的情况下，增加其通过组织的速度可实质地增加通过组织的有效试剂的量，进一 步增加其生物利用度。对于随后进入血流或其它管道(conduit)的非静脉给药的 肠胃外给药试剂，以及直接递送到脉管(conduit vessels)中的试剂(如，通过静 脉内给药，IV)，试剂扩散穿过由管道供给的组织的能力也可通过组织中sHASEGP 的存在而被增强。无论sHASEGP是存在于“递送组织”，正如前者的情况，和/或 存在于“靶标组织”，正如后者的情况，sHASEGP的存在都可因而增强药理学试 剂向体内靶标组织的递送的有效程度和/或速度。在任一情况中，sHASEGP都可用 于增加已与之共同配制或共同给药的药理学试剂的有效生物利用度。结果， sHASEGP可用于获得升高的和/或更快速达到的试剂浓度，以提供例如更有效的和 /或更快速的对给定剂量的反应。可选择地，例如，sHASEGP可用于在更低给药试 剂剂量下获得特定的反应。sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)在注射点处或其邻近 处增强总体流体流动的能力，也可改进伴随的药理学试剂递送的其它方面。例如， 总体流体流动的增加可帮助使注射的流体体积更容易地从注射点出散开(降低可 能出现的疼痛或注射的其它不良结果)。确实，很久前就已经认识到，非IV肠胃 外注射所伴随的这种不良感觉，是患者可能抵抗或回避非IV肠胃外给药的主要原 因(其强烈要求产品采用静脉给药，而它原本通过非IV途径给药可能更方便和/ 或更安全)。
[0440]当使用本发明的sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)来增强一种或多种药理学 试剂或其它试剂在体内的递送时(有时该应用被称为“散布”)，sHASEGP(或其 它糖胺聚糖酶)本身可通过与药理学试剂相同的途径给药(在这种情况下，它可 与药理学试剂共同配制或以其它方式一起共同给药，或者可分别给药，优选如上 文讨论的在药理学试剂之前给药)。可选择地，或额外地，sHASEGP(或其它糖胺 聚糖酶)可通过不同的给药途径来给药。例如，药理学试剂可通过非IV肠胃外注 射被局部地引入，sHASEGP可被静脉内引入。作为另一个示范性的且非限制性的 例子，sHASEGP可通过非IV肠胃外注射(在期望被药理学试剂靶向的组织中) 被局部地引入，药理学试剂本身可通过另一种途径被引入，例如静脉内、非肠胃 外(例如，口服)或其它途径。因此，如本领域技术人员理解的，本发明的sHASEGPs 可被用于增强多种药理学试剂和其它试剂的递送和生物利用度，包括通常通过肠 胃外和非肠胃外途径递送的试剂。
[0441]例如，sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)可与一般通过肠胃外递送给予的各 种药理学试剂共同配制或共同给药，例如，以增强它们的效力和/或改进它们在治 疗疾病中的风险/益处特性。
[0442]作为可通过肠胃外施用并可通过与本发明的sHASEGPs(或其它糖胺聚糖 酶)共同配制和/或共同施用而增强其递送和/或生物利用度的多种药理学试剂的示 例，下面的列表并非详尽地(因而并非限制性地)而仅仅是提供了示范性的试剂： 阿达木单抗(Adalimumabs)(例如HUMIRATM)、β-半乳糖苷酶(例如 FABRAZYMETM)、阿地白介素(例如PROLEUKINTM IL-2)、阿法赛特(Alefacepts)(例 如AMEVIVETM)、氨苄青霉素(例如UNASYNTM注射剂)、阿那白滞素(Anakinras)(例 如KINERETTM)、抗脊髓灰质炎疫苗(Antipoliomyelitic Vaccines)(例如 PEDIARIXTM)、抗胸腺细胞(Anti-Thymocytes)(例如THYMOGLOBULINTM)、阿奇 霉素(Azithromycins)(例如ZITHROMAXTM IV)、贝卡普勒明(Becaplermins)(例如 REGRANEXTM)、卡泊芬净(Caspofungins)(例如CANCIDASTM)、头孢唑啉 (Cefazolins)(例如ANCEFTM和CEFAZOLINTM)、头孢吡肟(Cefepimes)(例如 MAXIPIMETM)、头孢替坦(Cefotetans)(例如CEFOTANTM)、头孢他啶 (Ceftazidimes)(例如FORTAZTM)、头孢曲松(Ceftriaxones)(例如ROCEFINTM)、西妥 昔单抗(Cetuximabs)(例如ERBITUXTM)、西司他汀(Cilastatins)(例如PRIMAXINTM IV)、克拉维酸(Clavulanic Acids)(例如与阿莫西林联合，如AUGMENTINTM)、克林 霉素(Clindamycins)(例如CLEOCINTM)、α-达贝泊汀(Darbepoetin Alfas)(例如 ARANESPTM)、Deaclizumabs(例如ZENAPAXTM)、白喉类毒素(Diphtheria Toxoids)(一般联合例如DAPTACELTM、INFANRIXTM和PEDIARIXTM)、依法利珠 单抗(Efalizumabs)(例如RAPTIVATM)、肾上腺素(Epinephrines)(例如EPIPENTM)、 α-促红细胞生成素(Erythropoietin Alphas)(例如EPOGENTM和PROCRITTM)、依那 西普(Etanercepts)(例如ENBRELTM)、非格司亭(Filgrastims)(例如NEUPOGENTM)、 氟康唑(Fluconazoles)(例如DIFLUCANTM注射剂)、促滤泡素(Follicle-Stimulating Hormones)例如α-促滤泡素(Follitropin Alphas)(例如GONAL-FTM)和β-促滤泡素 (Follitropin Betas)(例如FOLLISTIMTM)、磷苯妥英(Fosphenytoins)(例如 CEREBYXTM)、氟康唑(Fluconazoles)(例如DIFLUCANTM)、钆双胺(Gadodiamides) (例如OMNISCANTM)、钆喷酸(Gadopentetates)(例如MAGNEVISTTM)、加替沙星 (Gatifloxacins)(例如TEQUINTM)、格拉默(Glatiramers)(例如COPAXONETM)、 GM-CSF′s(例如LEUKINETM)、戈舍瑞林(Goserelins)(例如ZOLADEXTM)、格拉司 琼(Granisetrons)(例如KYTRILTM)、流感嗜血杆菌B(Haemophilus Influenza B′s)(例 如COMVAXTM和HibTITERTM)、氟哌啶醇(Haloperidols)(例如HALDOLTM)、甲型 肝炎疫苗(Hepatitis A Vaccines)(例如HAVRIXTM、TWINRIXTM和VAQTATM)、乙型 肝炎疫苗(Hepatitis B Vaccines)(例如重组COMVAXTM、ENGERIXTM-B、 RECOMBIVAXTM-HB、TWINRIXTM，和非重组BAYHEPTM-B和NABFM-HB)、替 伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetans)(例如ZEVALINTM)、免疫球蛋白(Immunoglobulins) (包括免疫球蛋白的混合物，如GAMMAGARDTM和类似物，以及多种纯化的免疫 球蛋白中的任意一种)、流感病毒疫苗(Influenza Virus Vaccines)(例如FLUMISTTM)、 英利昔单抗(Infliximabs)(例如REMICADETM)、胰岛素(Insulins)(例如 HUMALOGTM、HUMALOGTM MIX 75/25TM、HUMULINTM产品(包括50/50、70/30、 Regular、NPH、Ultra和Ultralente)和NOVOLINTM)、甘精胰岛素(Insulin Glargines)(例 如LANTUSTM)、α-2a干扰素(Interferon Alfa-2a′s)(ROFERANTM-A)、α-2b干扰素 (Interferon Alfa-2b′s)(例如INTRON-ATM)、复合α干扰素(Interferon Alfacon-1′s)(例 如INFERGENTM)、α-n3干扰素(Interferon Alfa-n3s)(例如ALFERON NTM)、β-干扰 素(Interferon Betas)(例如BETASERONTM和BETAFERONTM)、β-1a干扰素(Interferon Beta-1a′s)(例如AVONEXTM和REBIFTM)、γ-干扰素(Interferon Gammas)(例如 ACTIMMUNETM)、碘克沙醇(Iodixanols)(例如VISIPAQUETM)、碘海醇(lohexols) (OMNIPAQUETM)、碘帕醇(Iopamidols)、碘佛醇(Ioversols)(例如OPTIRAYTM)、酮 咯酸(Ketorolacs)(例如TORADOYTM)、艾杜糖醛酸水解酶(Laronidases)(例如 ALDURAZYMETM)、左氧氟沙星(Levofloxacins)(例如LEVAQUINTM)、利多卡因 (Lidocaines)、利奈唑酮(Linezolids)(例如ZYVOXTM)、劳拉西泮(Lorazepams)(例如 ATIVANTM)、麻疹疫苗(Measles Vaccines)(例如ATTENUVAXTM)、麻疹-腮腺炎-风 疹病毒疫苗(Measles-Mumps-Rubella Virus Vaccines)(例如M-M-RTM II)、甲羟孕酮 (Medroxyprogesterones)(例如DEPO-PROVERATM)、美洛培南(Meropenems)(例如 MERREMTM IV)、甲基强的松龙(Methylprednisolones)(例如SOLU-MEDROLTM)、 咪达唑仑(Midazolams)(例如VERSEDTM)、吗啡(Morphines)(例如 ASTRAMORPH/PFTM)、奥曲肽(Octreotides)(例如SANDOSTATINTM)、奥马佐单抗 (Omalizumabs)(例如XOLAIRTM)、昂丹司琼(Ondansetrons)(例如ZOFRANTM)、帕 利珠单抗(Palivizumabs)(例如SYNAGISTM)、泮托拉唑(Pantoprazoles)(例如 PROTONIXTM)、培门冬酶(Pegaspargases)(例如ONCASPARTM)、聚乙二醇化非格司 亭(Pegfilgrastims)(例如NEULASTATM)、聚乙二醇化α-2a干扰素(Peg-Interferon Alfa-2a′s)(例如PEGASYSTM)、聚乙二醇化α-2b干扰素(Peg-Interferon Alfa-2b′s)(例 如PEG-INTRONTM)、培维索孟(Pegvisomants)(例如SOMAVERTTM)、百日咳疫苗 (Pertussis vaccines)、哌拉西林(Piperacillins)(例如ZOSYNTM)、肺炎球菌疫苗 (Pneumococcal Vaccines)(例如PNEUMOVAXTM 23)和肺炎球菌组合疫苗 (Pneumococcal Conjugate Vaccines)(例如PREVNARTM)、异丙嗪(Promethazines)(例 如PHENERGANTM)、瑞替普酶(Reteplases)(例如RETAVASETM)、生长激素 (Somatropins)(例如GENOTROPINTM、HUMATROPETM、NORDITROPINTM、 NUTROPINTM、SAIZENTM、SEROSTIMTM、ZORBTIVETM)、舒巴坦(Sulbactams)、 舒马曲坦(Sumatriptans)(例如IMITREXTM)、他左巴坦(Tazobactams)、替奈普酶 (Tenecteplases)(例如TNKASETM)、精制破伤风类毒素(Tetanus Purified Toxoids)、替 卡西林(Ticarcillins)(例如TIMENTINTM)、托西莫单抗(Tositumomabs)(例如 BEXXARTM)、曲安奈德(Triamcinolone Acetonides)、万古霉素(Vancomycins)(例如 VANCOCINTM)、水痘疫苗(Varicella vaccines)(例如VARIVAXTM)和其它疫苗；及类 似物。
[0443]如本文所描述和列举的，许多不同种类和给药途径的药理学试剂，可通过 与sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)共同施用或共同配制而受益，以改进它们应用 中的一个或多个方面。此类改进可包括，例如，下列中的一个或任意组合：(i)改 进吸收的程度和/或速度，从而改进试剂的生物利用度(例如，通过在非IV肠胃外 给药后使其更多地到达血流，和/或通过更快速的渗透，使其在这种局部给药后更 少地被降解)，其可通过例如加速非IV肠胃外给药后的间质流动和潜在的对流转 运来实现(例如，通过应用伴随注射体积的流体静力，联合透明质素降解所导致 的阻力降低)；(ii)提供更安全或更便捷的给药途径(例如，使非IV肠胃外给药 能够代替IV，或使改进的或更便捷的非IV肠胃外给药例如皮内或皮下给药能够代 替肌肉给药)；(iii)更好的给药方案(例如，更低频率的给药，或更高频率但更低 剂量的非IV途径，与更低频率但更高剂量的IV相反)；(iv)减少副作用或者以其 它方式降低毒性(例如，IV定量给药产生的初始高浓度(高Cmax)所伴随的效 应，或由非IV肠胃外给药后的缓慢和/或不完全吸收所产生的高局部剂量导致的效 应)；(v)另外地改进药动学和/或药效学(例如通过使试剂更多地到达靶位(例如， 通过递送位点如注射位点处或附近存在的sHASEGP增加间质流体流动和对流转 运)，和/或通过增强靶位内的渗透(例如，通过靶位内存在的sHASEGP增加间质 流体流动和对流转运)，或者通过将试剂优先递送到靶位(例如，通过向靶位局部 给药，并联合sHASEGP的局部或全身给药，以促进靶的透过，或者通过使用载体 或大分子复合物将试剂优先靶向到特定位点，并联合sHASEGP的局部或全身给 药，以促进靶位的透过)；原来通过口服递送的试剂也可通过重新配制成肠胃外递 送而受益，例如，从而避免试剂在肠道内的流失或随后的降解或毒性，使得可以 更有效地靶向于期望起效的位点，并因而可能具有更高效力和/或更低毒性，或者 以其它方式提供更好的药动学和/或药效学性质。另外，sHASEGPs可用于改进口 服给药的试剂的药效学(例如，通过增强口服给药试剂在其期望靶位中的透过(例 如，通过增加间质流体流动和对流转运，其由sHASEGP全身给药后和/或sHASEGP 向靶位局部给药后存在于靶位中的sHASEGP导致))。
[0444]甚至在试剂如药理学试剂的期望靶位是血流本身的情况下，此类试剂可通 过与sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共同施用和/或共同配制而被增强。例如， 存在用作血液修饰剂(blood modifier)的许多试剂，它们可通过包括口服给药和 肠胃外给药(如IV注射)的多种途径中的一种途径来给药。通过或能够通过口服 给药的许多试剂仍然显示出相对有限的或缓慢的吸收和/或受不期望的降解作用的 影响(且有些其它试剂一旦引入血流便是基本上安全和有效的，但由于那个原因 而不被口服给药)。此类试剂的肠胃外给药(例如，通过肌肉内、皮下、皮内或经 皮的途径，并联合sHASEGP的施用，施用位置优选位于或邻近肠胃外给药位点) 因而可被采用，以将其引入血流中。另外，有许多紧急的医学情况，其中将试剂 快速的递送到血流是很重要的，但口服给药太慢，静脉注射又不方便、不安全或 不可用。这些紧急情况包括血液是靶的那些情况，以及血流仅仅是向另一靶组织 递送的途径的那些情况。在这些情况下，与sHASEGP联合给药的能力(或应用已 制成的与sHASEGP的共同制剂)可允许试剂通过非IV肠胃外给药快速递送。如 本领域技术人员理解的，有许多为非IV肠胃外给药设计的配方和器材，其可以提 供，例如，时控的或其它触发释放的试剂，以及可变受控的定量给药等。大量此 类药理学试剂(其可与sHASEGP共同制出制剂或联合使用)被有规律地应用于医 学实践，并且它们的应用的各个方面被详细描述(见，例如，Physicians′Desk Reference，Thomson 2003，2004，2005)，许多其它此类试剂是本领域中已知的。在 后一方面，如本领域技术人员理解的，sHASEGPs可以与目前使用的试剂联合使用 (例如，如本文所述的，以改进它们的适用性)，与目前并未使用的试剂联合使用 (例如，以改进它们的药动学和/或药效学，并因而使其变得有用)，或与新开发的 试剂联合使用。
[0445]因此，对于一般通过肠道外引入(例如，通过IV注射)的药理学试剂(如， 本文描述的抗癌试剂、血液修饰剂或其它种类试剂中的成员)，sHASEGP(或其它 糖胺聚糖酶)可用于，例如，使此类试剂能够通过其它可能更便捷和/或更安全的 途径如非IV肠胃外给药的方式被施用(例如，通过肌肉内、皮下、皮内或经皮的 途径)。对于已经可以通过非IV肠胃外途径递送的试剂，sHASEGPs可用于增强 其吸收和递送的程度和/或速度(例如，通过促进它的散布及随后进入血流，其可 能受到本文描述的对流输运的帮助)。此类效应的优点包括：更大部分的试剂到达 血流中，对试剂的局部暴露降低(在浓度和/或时间方面)(例如，在注射点处或附 近，其经常限制定量给药或导致局部毒性问题)，增加试剂能够被递送到血流中的 速度，其它改进的药动学和/或药效学性质，以及便利的给药。最后一方面，非IV 肠胃外给药可以使许多试剂在医院外施用，否则将需要静脉给药通常所需的住院 护理或其它医学关照。
[0446]血液修饰剂的示范性例子包括如下试剂，如抗血友病试剂和血液因子缺乏 试剂(blood factor deficiency agents)(包括，例如，抗血友病因子(例如，ADVATETM、 HEMOFILTM、KOATETM-DVI、KOGENATETM-FS、RECOMBINATETM和 REFACTOTM)、抗抑制剂促凝复合物(anti-inhibitor coagulent complexes)(例如， FEIBATM VH)、抗凝血酶III(antithrombin IIIs)(例如，THROMBATETM III)、凝集因 子VII(coagulations Factor VIIs)(例如NOVOSEVENTM)、凝集因子VIII(coagulation Factor VIIIs)(例如，ADVATETM、KOGENATETM-FS和RECOMBINATETM)、凝集 因子IX(coagulation Factor IXs)(例如，BEBULINTM、BENEFIXTM和PROPLEXTM T)、 血浆蛋白部分(plasma protein fractions)(例如PLASMANATETM)、von Willebrand因 子))；抗血小板试剂(antiplatelet agents)(包括，例如，阿昔单抗(abciximabs)(例如， REOPROTM)、阿那格雷(anagrelides)(例如AGRYLINTM)、西洛他唑(cilostazols)(例 如PLETALTM)、氯吡格雷二硫酸盐(clopidogrel bisulfates)(例如PLAVIXTM)、双嘧 达莫(dipyridamoles)(例如AGGRENOXTM和PERSANTINETM)、依前列醇 (epoprostenols)(例如FLOLANTM)、埃替非巴肽(eptifibatides)(例如INTEGRILINTM)、 替罗非班(tirofibans)(例如AGGRASTATTM))；集落刺激因子(colony stimulating factors，CSFs)(包括，例如，粒细胞CSFs(Granulocyte CSFs)(例如NEULASTATM 和NEUPOGENTM)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage CSFs) (例如LEUKINETM))；红细胞生成刺激物(erythropoiesis stimulators)(包括，例如， 红细胞生成素，如达依泊汀α(darbepoetin alfas)(例如ARANESPTM)和红细胞生成 素α(epoetin alfas)(例如EPOGENTM和PROCRITTM))、止血剂和白蛋白(包括，例 如，抑蛋白酶肽(aprotinins)(例如TRASYLOLTM)、抗血友病因子和血浆的联合(例 如ADVATETM)、醋酸去氨加压素(Desmopressin Acetates)(例如DDAVPTM)和白蛋白 (例如BUMINATETM和PLASBUMINTM))；免疫球蛋白(例如BAYGAMTM、 CARIMUNETMNF IV、FLEBOGAMMATM、GAMIMUNETM、GAMMAGARD S/DTM、 GAMUNEXTM、IVEEGAMTM、IVEEGAMTM EN IGIV、MICRHOGAMTM、 RHOGAMTM、PANGLOBULINTM和THYMOGLOBULINTM，以及乙型肝炎免疫球 蛋白(hepatitis B immune globulins)(例如BAYHEPTM B、NABI-HBTM和 NOVAPLUSTM NABI-HB)；凝血酶抑制剂(thrombin inhibitors)(包括，例如，直接 凝血酶抑制剂(例如ARGATROBANTM)和来匹卢定(lepirudin)(例如REFLUD ANTM)，和drotecogin alfas(例如XIGRISTM)；抗凝血剂(包括，例如，达肝素 (dalteparins)、低分子肝素(enoxaperins)和其它肝素(例如FRAGMINTM和 LOVENOXTM)、华法令(warfarins)(例如COUMADINTM和JANTOVENTM))，及类似 物。
[0447]进一步举例，通过肠胃外给药并可与sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共 同施用和/或共同配制的各种类型的试剂的例子，包括在下面的列举中：乙酰唑胺 (Acetazolamides)、阿昔洛韦(Acyclovirs)、胆影酸(Adipiodones)、Alatrofioxacins、 阿地白介素(Aldesleukins)、阿仑单抗(Alemtuzumabs)、阿芬他尼(Alfentanils)、变态 反应原性提取物(Allergenic extracts)、别嘌醇(Allopurinols)、α1-蛋白酶抑制剂 (Alpha 1-proteinase inhibitors)、前列地尔(Alprostadils)、阿米福汀(Amifostines)、阿 米卡星(Amikacins)、氨基酸、氨基已酸(Aminocaproic acids)、氨茶碱 (Aminophyllines)、阿密替林(Amitriptylines)、异戊巴比妥(Amobarbitals)、氨力农 (Amrinones)、阿那白滞素(Anakinras)、止痛剂(Analgesics)、抗脊髓灰质炎疫苗(Anti- poliomyelitic vaccines)、抗狂犬病血清(Anti-rabic serums)、抗破伤风免疫球蛋白 (Anti-tetanus immunoglobulins)、抗凝血酶III(Antithrombin Ills)、抗蛇毒血清 (Antivenom serums)、阿加曲班(Argatrobans)、精氨酸(Arginines)、砷、抗坏血酸、 天冬酰胺酶(Asparaginases)、阿替洛尔(Atenolols)、阿曲库铵(Atracuriums)、阿托品 (Atropines)、金硫葡糖(Aurothioglucoses)、巯唑嘌呤(Azathioprines)、阿奇霉素 (Azithromycins)、氨曲南(Aztreonams)、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin(BCG) vaccines)、杆菌肽(Bacitracins)、巴氯酚(Baclofens)、巴利西单抗(Basiliximabs)、苯 甲酸(Benzoic acids)、苯托品(Benztropines)、倍他米松(Betamethasones)、生物素 (Biotins)、比伐卢定(Bivalirudins)、博来霉素(Bleomycins)、肉毒抗毒素(Botulism antitoxins)、溴苄胺(Bretyliums)、丁苯氧酸(Bumetanides)、布比卡因(Bupivacaines)、 丁丙诺啡(Buprenorphines)、白消安(Busulfans)、布托啡诺(Butorphanols)、降钙素 (Calcitonins)、骨化三醇(Calcitriols)、钙(Calciums)、卷曲霉素(Capreomycins)、卡 前列素(Carboprosts)、卡莫司汀(Carmustines)、肉毒碱(Carnitines)、卡泊芬净 (Caspofungins)、头孢孟多(Cefamandoles)、头孢唑林(Cefazolins)、头孢哌酮 (Cefoperazones)、头孢噻肟(Cefotaximes)、头孢替坦(Cefotetans)、头孢西丁 (Cefoxitins)、头孢他啶(Ceftazidimes)、头孢唑肟(Ceftizoximes)、头孢呋辛 (Cefuroximes)、氯霉素(Chloramphenicols)、氯普鲁卡因(Chloroprocaines)、氯喹 (Chloroquines)、氯噻嗪(Chlorothiazides)、氯丙嗪(Chlorpromazines)、 Chondroitinsulfuric acids、绒促性素α(Choriogonadotropin alfas)、铬(Chromiums)、 西多福韦(Cidofovirs)、西咪替丁(Cimetidines)、环丙沙星(Ciprofloxacins)、顺阿曲 库胺(Cisatracuriums)、顺铂(Cisplatins)、克拉立滨(Cladribines)、克拉维酸(Clavulanic acids)、克林霉素(Clindamycins)、可乐定(Clonidines)、可待因(Codeines)、秋水仙 碱(Colchicines)、粘菌素(Colistins)、胶原(Collagens)、Corticorelin ovine triflutates、 促皮质素(Corticotrophins)、替可克肽(Cosyntropins)、氰钴胺(Cyanocobalamins)、环 磷酰胺(Cyclophosphamides)、环孢菌素(Cyclosporines)、半胱氨酸(Cysteines)、阿糖 胞苷(Cytarabines)、达卡巴嗪(Dacarbazines)、达克珠单抗(Dacliximabs)、放线菌素 D(Dactinomycins)、达福普汀(Dalfopristins)、达肝素(Dalteparins)、达那肝素 (Danaparoids)、丹曲林(Dantrolenes)、柔红霉素(Daunorubicins)、去铁胺 (Deferoxamines)、地尼白介素2(Denileukin diftitoxs)、去氨加压素(Desmopressins)、 地塞米松(Dexamethasones)、右美托咪啶(Dexmedetomidines)、右泛醇 (Dexpanthenols)、右雷佐生(Dexrazoxanes)、右旋糖苷(Dextrans)、泛影酸(Diatrizoic acids)、地西泮(Diazepams)、二氮嗪(Diazoxides)、双环胺(Dicyclomines)、Digibinds、 地高辛(Digoxins)、双氢麦角胺(Dihydroergotamines)、地尔硫(Diltiazems)、苯海拉 明(Diphenhydramines)、白喉，百日咳及破伤风混合疫苗(Diphteria，tetanus and pertussis vaccines)、白喉抗毒素(Diptheria antitoxins)、双嘧达莫(Dipyridamoles)、多 巴酚丁胺(Dobutamines)、多巴胺(Dopamines)、杜什氯铵(Doxacuriums)、多沙普仑 (Doxaprams)、度骨化醇(Doxercalciferols)、多西环素(Doxycyclines)、氟哌利多 (Droperidols)、Drotrecogin alfas、二羟丙茶碱(Dyphyllines)、依地酸(Edetic acids)、 Edrophoniums、依那普利拉(Enalaprilats)、麻黄碱(Ephedrines)、依前列醇 (Epoprostenols)、麦角钙化甾醇(Ergocalciferols)、麦角新碱(Ergonovines)、厄他培南 (Ertapenems)、红霉素(Erythromycins)、艾司洛尔(Esmolols)、雌二醇(Estradiols)、 雌激素(Estrogenics)、依他尼酸(Ethacrynic acids)、乙醇胺(Ethanolamines)、乙醇 (Ethanols)、乙碘油(Ethiodized oils)、依替膦酸(Etidronic acids)、依托咪酯 (Etomidates)、依托泊甙(Etoposides)、因子8(Factor VIIIs)、法莫替丁(Famotidines)、 非诺多泮(Fenoldopams)、芬太尼(Fentanyls)、氟尿苷(Floxuridines)、氟达拉滨 (Fludarabines)、氟马西尼(Flumazenils)、荧光素(Fluoresceins)、氟尿嘧啶 (Fluorouracils)、氟奋乃静(Fluphenazines)、叶酸(Folic acids)、促卵泡成熟激素 (Follicle-stimulating hormones)、甲吡唑(Fomepizoles)、福米韦生(Fomivirsens)、磺 达肝素(Fondaparinuxs)、膦甲酸(Foscarnets)、磷苯妥英(Fosphenytoins)、氟维司群 (Fulvestrants)、呋塞米(Furosemides)、钆特醇(Gadoteridols)、钆弗塞胺 (Gadoversetamides)、更昔洛韦(Ganciclovirs)、加替沙星(Gatifloxacins)、吉妥单抗 (Gemtuzumab ozogamicins)、庆大霉素(Gentamicins)、胰高血糖素(Glucagons)、葡 萄糖(Glucoses)、甘氨酸(Glycines)、格隆溴胺(Glycopyrrolates)、戈那瑞林 (Gonadorelins)、绒毛膜促性腺激素(Gonadotropin chorionics)、B型嗜血杆菌多糖 (Haemophilus B polysaccarides)、氟哌啶醇(Haloperidols)、氯化血红素(Hemins)、流 感嗜血杆菌疫苗(Hemophilus influenza vaccines)、肝炎疫苗(Hepatitis vaccines)、草 药(Herbals)、组胺(Histamines)、肼苯达嗪(Hydralazines)、氢化可的松 (Hydrocortisones)、氢吗啡酮(Hydromorphones)、羟钴胺(Hydroxocobalamins)、羟嗪 (Hydroxyzines)、莨菪碱(Hyoscyamines)、伊布利特(Ibutilides)、去甲氧基柔红霉素 (Idarubicins)、异环磷酰胺(Ifosfamides)、伊米苷酶(Imiglucerases)、免疫球蛋白 (Immunoglobulins)、靛兰胭脂红(Indigo carmines)、吲哚美辛(Indomethacins)、干扰 素α-conl(Interferon alfa-conls)、干扰素α-2A(Interferon alfa-2As)、干扰素α-N3 (Interferon alfa-N3s)、干扰素β-1A(Interferon beta-1As)、碘化物(Iodides)、碘普罗 胺(Iopromides)、碘替酸(Iothalamic acids)、碘格利酸(Ioxaglic acids)、碘昔兰 (Ioxilans)、右糖肝铁注射剂(Iron dextran injections)、异烟肼(Isoniazids)、异丙肾上 腺素(Isoproterenols)、日本脑炎疫苗(Japanese encephalitis vaccines)、卡那霉素 (Kanamycins)、氯胺酮(Ketamines)、酮咯酸(Ketorolacs)、拉贝洛尔(Labetalols)、来 匹卢定(Lepirudins)、亚叶酸(Leucovorins)、亮丙瑞林(Leuprolides)、左布比卡因 (Levobupivacaines)、左旋甲状腺素(Levothyroxines)、利多卡因(Lidocaines)、林可 霉素(Lincomycins)、Linezolids、碘塞罗宁(Liothyronines)、劳拉西泮(Lorazepams)、 促黄体激素(Luteinising hormones)、莱姆病疫苗(Lyme disease vaccines)、锰福地吡 (Mangafodipirs)、甘露醇(Mannitols)、麻疹病毒(Measles virus)、氮芥 (Mechlorethamines)、美法仑(Melphalans)、脑膜炎球菌多糖菌苗(Meningococcal polysaccharide vaccines)、哌替啶(Meperidines)、甲哌卡因(Mepivacaines)、美罗培南 (Meropenems)、美司钠(Mesnas)、美索哒嗪(Mesoridazines)、间羟胺(Metaraminols)、 美沙酮(Methadones)、美索巴莫(Methocarbamols)、美索比妥(Methohexitals)、甲氨 蝶呤(Methotrexates)、甲基多巴乙酯(Methyldopates)、甲基麦角新碱 (Methylergonovines)、甲氧氯普胺(Metoclopramides)、美托洛尔(Metoprolols)、甲硝 唑(Metronidazoles)、咪达唑仑(Midazolams)、二甲胺四环素(Minocyclines)、光神霉 素(Mithramycins)、丝裂霉素(Mitomycins)、米托蒽醌(Mitoxantrones)、美维松 (Mivacuriums)、鱼脂酸(Morrhuic acids)、莫西沙星(Moxifloxacins)、腮腺炎病毒 (Mumps viruses)、莫罗莫那-CD3(Muromonab-CD3s)、霉酚酸酯(Mycophenolate mofetils)、萘夫西林(Nafcillins)、纳布啡(Nalbuphines)、纳美芬(Nalmefenes)、纳洛 酮(Naloxones)、南诺龙(Nandrolones)、新斯的明(Neostigmines)、烟酰胺 (Niacinamides)、尼卡地平(Nicardipines)、硝酸甘油(Nitroglycerins)、硝普盐 (Nitroprussides)、去甲肾上腺素(Norepinephrines)、奥普瑞白介素(Oprelvekins)、奥 芬那君(Orphenadrines)、苯唑西林(Oxacillins)、奥沙利铂(Oxaliplatins)、 Oxyniorphones、土霉素(Oxytetracyclines)、缩宫素(Oxytocins)、本可松 (Pancuroniums)、泛醇(Panthenols)、泛酸(Pantothenic acids)、Papaverines、 Pegaspargases、聚乙二醇干扰素α-2α(Peginterferon alfa 2As)、青霉素G(Penicillin Gs)、喷他眯(Pentamidines)、喷他佐辛(Pentazocines)、戊巴比妥(Pentobarbitals)、喷 司他丁(Pentostatins)、全氟丙烷(Perflutrens)、羟哌氯丙嗪(Perphenazines)、百日咳 疫苗(Pertussis vaccines)、苯巴比妥(Phenobarbitals)、酚妥拉明(Phentolamines)、苯 福林(Phenylephrines)、苯妥英(Phenytoins)、毒扁豆碱(Physostigmines)、维生素K1 (Phytonadiones)、肺炎球菌疫苗(Pneumococcal vaccines)、多粘菌素B(Polymyxin bs)、Porfimers、Pralidoximes、丙胺卡因(Prilocaines)、普鲁卡因胺(Procainamides)、 普鲁卡因(Procaines)、丙氯拉嗪(Prochlorperazines)、黄体酮(Progesterones)、异丙嗪 (Promethazines)、普萘洛尔(Propranolols)、吡斯的明羟化物(Pyridostigmine hydroxides)、维生素B6(Pyridoxines)、奎尼丁(Quinidines)、奎奴普丁(Quinupristins)、 狂犬病免疫球蛋白(Rabies immunoglobulins)、狂犬病疫苗(Rabies vaccines)、雷尼替 丁(Ranitidines)、拉布立酶(Rasburicases)、瑞芬太尼(Remifentanils)、核黄素 (Riboflavins)、利福平(Rifampins)、罗哌卡因(Ropivacaines)、风疹疫苗(Rubella vaccines)、钐(Samariums)、莨菪碱(Scopolamines)、硒(Seleniums)、舍莫瑞林 (Sermorelins)、辛卡利特(Sincalides)、人蛋氨生长素(Somatrems)、大观霉素 (Spectinomycins)、链激酶(Streptokinases)、链霉素(Streptomycins)、链脲霉素 (Streptozocins)、琥珀酰胆碱(Succinylcholines)、舒芬太尼(Sufentanils)、舒巴坦 (Sulbactams)、磺胺异唑(Sulfamethoxazoles)、舒马普坦(Sumatriptans)、他克莫司 (Tacrolimuss)、替尼泊苷(Teniposides)、特布他林(Terbutalines)、特立帕肽 (Teriparatides)、睾酮(Testosterones)、破伤风抗毒素(Tetanus antitoxins)、丁卡因 (Tetracaines)、十四烷硫酸盐(Tetradecyl sulfates)、茶碱(Theophyllines)、硫胺素 (Thiamines)、硫乙拉嗪(Thiethylperazines)、硫喷妥(Thiopentals)、促甲状腺激素 (Thyroid stimulating hormones)、替卡西林(Ticarcillins)、亭扎肝素(Tinzaparins)、替 罗非班(Tirofibans)、妥布霉素(Tobramycins)、妥拉唑林(Tolazolines)、甲苯磺丁脲 (Tolbutamides)、托泊替康(Topotecans)、托拉塞米(Torsemides)、氨甲环酸(Tranexamic acids)、曲前列尼尔(Treprostinils)、曲安奈德(Triamcinolone acetonides)、己曲安奈 德(Triamcinolone hexacetonides)、曲安西龙(Triamcinolones)、三亚乙基硫代磷酸胺 (噻替派)(Triethylenethiophosphoramides(Thiotepa))、三氟拉嗪(Trifluoperazines)、 曲美苄胺(Trimethobenzamides)、甲氧苄啶(Trimethoprims)、三甲曲沙(Trimetrexates)、 曲普瑞林(Triptorelins)、氨基丁三醇(Tromethamines)、结核菌素(Tuberculins)、伤寒 菌苗(Typhoid vaccines)、尿促卵泡素(Urofollitropins)、尿激酶(Urokinases)、丙戊酸 (Valproic acids)、戊柔比星(Valrubicins)、水痘-带状疱疹免疫球蛋白(Varicella Zoster immunoglobulins)、加压素(Vasopressins)、Vecuroniums、维拉帕米(Verapamils)、长 春碱(Vinblastines)、长春新碱(Vincristines)、伏立康唑(Voriconazoles)、华法林 (Warfarins)、黄热病疫苗(Yellow fever vaccines)、齐多夫定(Zidovudines)、锌(Zincs)、 盐酸齐拉西酮(Ziprasidone hydrochlorides)，以及与上述相关的试剂或者与上述试剂 同类的或相似种类的试剂。
[0448]用于肠胃外给药(包括通过肌肉内、皮内、皮下、局部应用和其它非口服 途径)的溶液或悬浮液，可以包括下述的任何成分：无菌稀释剂例如注射用水、 盐水溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂，例 如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；掩蔽剂 (cheating agents)，例如乙二铵四乙酸(EDTA)；缓冲液，例如醋酸缓冲液、柠檬 酸缓冲液和磷酸缓冲液；以及用于调整渗透压的试剂，包括但不限于氯化钠、氯 化钙、氯化镁、右旋糖、丙三醇或硼酸。肠胃外给药的制剂可以装入由玻璃、塑 料或其它合适材料制成的安瓿、一次性注射器或者单剂量或多次剂量的小瓶中。
[0449]sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域可以以微粉化的形式或其他 合适的形式被悬浮，或可以被衍生化以产生更加可溶性的活性产物或产生药物前 体。所得到的混合物的形式取决于许多因素，包括预期的给药方式和多肽在所选 择的载体或媒介物中的溶解性。有效的浓度是足以改善目标症状的浓度，并可以 使用本领域技术人员已知的方法经验性地确定。为了配制组合物，一定重量分数 的多肽以可有效缓解或改善的所要治疗的症状的浓度被溶解、悬浮、分散或者以 其它方式混合于所选择的媒介物中。
[0450]在sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域显示出不足的溶解性的 情形下，可以使用溶解多肽的方法。此类方法是本领域技术人员知道的，包括但 不限于使用辅助溶剂诸如二甲亚砜(DMSO)、使用表面活性剂诸如TWEENTM和 PluronicTM F68；或者溶解在含水碳酸氢钠中。多肽的衍生物，诸如多肽的药物前 体，也可以用于配制有效的药物组合物。对于眼科适应症，将组合物配制在眼科 可接受的载体中。对于本文中的眼科用途，考虑局部给药，这可以通过外部给药 或通过注射来进行。缓释制剂也是理想的。通常，组合物配制成用于单剂量给药 的形式，这样，单次剂量可以提供有效的数量。
[0451]在将多肽与媒介物混合或将多肽加入媒介物后，所得到的混合物可以是溶 液、悬浮液、乳液或其他组合物，并可以配制成含水混合物、乳液、胶状物、药 膏、乳剂、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、糊状、泡沫、气溶胶、灌洗剂、 喷雾剂、栓剂、绷带形式或任何其他的适于全身性给药、外部给药或局部给药的 制剂形式。
[0452]所得的混合物的形式取决于许多因素，包括预期的给药方式和化合物在所 选择的载体或媒介物中的溶解性。如果必要的话，制备成化合物的药学上可接受 的盐或其他衍生物。对于局部的内部给药，诸如肌肉内给药、肠胃外给药或关节 内给药，化合物优选用含水介质例如等渗缓冲盐水配制成悬浮溶液，或者与适用 于内部给药的生物相容性支持物或生物粘结剂组合起来。
[0453]sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域被包括于药学上可接受的载 体中，其数量足以在不对接受治疗的患者产生不利副作用的情况下产生治疗上有 用的效果。应该理解的是，副作用的数量和程度取决于化合物被给药时的情况。 例如，某些毒性的和不利的副作用在治疗威胁生命的疾病时是可以接受的，而在 治疗具有较轻后果的紊乱时则是无法接受的。对治疗用途而言有效的量当然将取 决于疾病的严重性和患者的体重和总体状态以及给药途径。尽管在局部给药之后 治疗剂的局部浓度在某些情况下可能高于全身性给药后安全获得的浓度，但治疗 剂的局部给药通常需要比任何方式的全身性给药的剂量都要小的剂量。
[0454]因为各个患者的症状的严重程度各有不同，而且每种治疗剂都具有其独特 的治疗特性，所以实施人员应该确定患者对治疗的反应，并相应地改变剂量。在 体外使用的剂量可以为药学组合物的原位施用数量提供有用的指导，并且动物模 型在某些情况下可以被用来确定治疗具体的紊乱时的有效剂量。然而，总的来说， 对于局部给药，可以考虑，治疗剂的有效量为每kg体重约0.1皮克(pg)至约1ng 的范围内。获得有效剂量时的各种考虑因素对本领域技术人员来说是已知的，并 已被描述(参见如Goodman And Gilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics， 8th ed.，Pergamon Press，1990；Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990；和Mantyh et al.，Science，278：275-79，1997，其涉 及鞘内注射神经元特异性配体-毒素，其中的每一篇文献都通过引用方式整体并入 本文)。
[0455]本文中应用的sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域的制剂包括 那些适用于口服给药、直肠给药、外部给药、吸入给药、口腔含化给药、舌下含 化给药、其它肠胃外给药(例如皮下、肌肉内、皮内、静脉内、透皮给药或静脉给 药)或任何给药途径的制剂。在任何给定情况下的最合适的途径取决于正在治疗的 症状的性质和严重性，以及正在使用的特定活性化合物的性质。制剂可以以单元 剂量形式给予人和动物，诸如片剂、胶囊、药丸、粉剂、颗粒、无菌肠胃外给药 溶液或悬浮液、口服给药溶液或悬浮液和油-水乳剂，它们都含有合适数量的多肽 和/或其他试剂或其药学上可接受的衍生物。药学上具有治疗活性的多肽和/或其他 试剂和其衍生物通常以单元剂量形式或多剂量形式配制并给药。本文中所使用的 单元剂量形式是指适用于人和动物个体的物理上独立的单元，它们被独立包装， 如本领域已知的。
[0456]药物组合物可以以单元剂量形式给予人和动物，诸如片剂、胶囊、药丸、 粉末、颗粒、无菌肠胃外给药溶液或悬浮液、口服给药溶液或悬浮液和油-水乳剂， 它们都含有合适数量的sHASEGP多肽和/或其可溶性人透明质酸酶结构域和可任 选的另一试剂或其药学上可接受的衍生物。药学上具有治疗活性的化合物和/或其 衍生物通常以单元剂量形式或多剂量形式配制并给药。本文中所使用的单元剂量 形式是指适用于人和动物个体的物理上独立的单位，并独立地包装，如本领域已 知的。每一单元剂量含有足以产生期望的治疗效果的预先确定数量的治疗上有活 性的化合物，所述化合物与必需的药物载体、媒介物或稀释剂结合。单元剂量的 形式的例子包括但不限于安瓿、注射器和各自包装的片剂或胶囊。例如，含有稳 定溶液和1至5000单位的sHASEGP的小体积诸如5至50μl的制剂可以预先包装 于注射器中，例如可以在粘弹性试剂注射之后使用。单元剂量形式可以以其小部 分给药或多倍地给药。多剂量形式是一系列完全相同的单元剂量形式，其包装于 单个容器中，可以以分离的单元剂量形式被施用。多剂量的形式的例子包括小药 瓶、片剂瓶或胶囊瓶或品脱瓶或加仑瓶。因此，多剂量形式是在包装中不隔离开 来的单元剂量形式的倍数。
[0457]除了活性组分例如sHASEGP多肽之外，组合物还可以含有：稀释剂，诸 如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和 滑石；和粘结剂，诸如淀粉、天然胶，例如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚 乙烯吡咯烷、纤维素和其衍生物，聚维酮、交聚维酮和其他这样的粘合剂，如本 领域技术人员所知道的。液体的药学上可施用的组合物可以通过例如将上面定义 的活性化合物和可任选的药物佐剂溶解、分散或以其它方式混合在载体中，从而 形成溶液或悬浮液来制备，所述的载体例如水、盐水、含水右旋糖、丙三醇、乙 二醇、乙醇和类似物。如果需要的话，待施用的药物组合物也可以含有很小量的 无毒辅助物质诸如润湿剂、乳化剂或增溶剂、pH缓冲剂和类似物，例如醋酸盐、 柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺 油酸盐和其他这样的试剂。制备这样的剂型的方法是已知的，或对于本领域技术 人员是显而易见的(参见如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，15th Edition，1975)。待施用的组合物或制剂含有一定数量的 活性化合物，该数量足以改善接受治疗的对象的症状。例如，本文提供的sHASEGP 或其可溶性人透明质酸酶结构域的标准稳定化制剂包括EDTA、NaCl和CaCl2中 配制的150单位/ml的可溶性糖蛋白。此外，抗细菌或抗真菌试剂——包括但不限 于硫柳汞——可以存在于制剂中。本文中提供的另一制剂是于EDTA、NaCl和 CaCl2中的稳定化溶液或冻干形式的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域， 其中含有有效活性数量的可溶性糖蛋白，例如150单位/ml，并加入了乳糖，例如 13mg/ml。本文也提供了含有处于EDTA、NaCl和CaCl2中的稳定化溶液或冻干形 式的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的制剂，其中含有有效活性数量的 可溶性糖蛋白，例如150单位/ml，并加入了乳糖，例如13mg/ml，和白蛋白、 PluronicTM F68、TWEENTM和/或其他去污剂。本文中提供的另一制剂，或者是冻 干的或者是作为稳定溶液，含有有效数量的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结 构域，例如1至300单位/ml，它们处于EDTA、NaCl和CaCl2中。
[0458]可以制备含有0.005％至100％的活性组分并由非毒性载体来平衡的剂型或 组合物。对于口服给药，药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，其用药学 上可接受的赋形剂，利用常规的方法制备，所述赋形剂例如粘结剂(例如预糊化的 玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素或 磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧甲 淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂可以用本领域已知的方法包被。
[0459]sHASEGPs或其可溶性人透明质酸酶结构域或药学上可接受的衍生物可以 用可保护该可溶性糖蛋白免遭身体的快速清除的载体来制备，例如缓释制剂或包 衣。组合物可以包括其他药学上具有效力的试剂，所述试剂是该常规领域已知在 治疗一种或多种疾病或医学症状中具有价值的试剂，包括但不限于化学治疗剂、 止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、抗毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟 疾剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄 生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生 物剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕 药剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激素、 高血糖药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋剂、 眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋剂(psychic energizer agent)、镇定剂、拟交 感神经药、安定剂、泌尿剂(urinary agent)、阴道用药剂、杀病毒剂、维生素药剂、 非类固醇类抗炎药剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白质、核酸、药物、 药物前体、有机分子和促睡眠剂(sleep inducer)，这样可以获得理想的特性组合。 应该理解的是，这样的联合治疗构成了本文中提供的治疗组合物和方法的又一方 面。
[0460]1.口服组合物
[0461]口服药物剂型是固体、胶状和液体。固体剂型是片剂、胶囊、颗粒和整装 粉剂。口服片剂的类型包括压缩的、可咀嚼的锭剂和片剂，其可以是肠衣包被的、 糖衣包被的或膜包被的。胶囊可以是硬的或软的明胶胶囊，而颗粒和粉末可以与 本领域技术人员已知的其它组分联合起来以非泡腾或泡腾的形式提供。
[0462]含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的药物组合物可以是液体 形式，例如溶液、糖浆或悬浮液，或可以以在使用之前需要与水或其他合适的载 体进行重构的药物产品的方式提供。这样的液体制品可以通过常规的手段用药学 上可接受的添加剂来制备，所述的添加剂例如悬浮剂(诸如山梨醇糖浆、纤维素衍 生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(诸如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水的介质(诸如杏仁油、 油酯或分级分离的植物油)；和防腐剂(诸如p-羟基苯甲酸甲酯或p-羟基苯甲酸丙酯 或山梨酸)。
[0463]在某些实施方案中，制剂是固体剂型形式，优选胶囊或片剂。片剂、药丸、 胶囊、药片和类似物可以含有下述的任何组分或者具有类似性质的化合物：粘结 剂；稀释剂；分解剂；润滑剂；助滑剂；甜味剂；和调味剂。
[0464]粘结剂的例子包括微晶纤维素、黄芪胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶、植物粘 胶、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、 石松和硬脂酸。稀释剂包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸 氢钙。助滑剂包括但不限于胶状二氧化硅。分解剂包括交联羧甲纤维素钠、羧甲 淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基 纤维素。着色剂包括例如任何被批准的合法的可溶于水的FD和C染料、其混合 物；和悬浮在水化氧化铝上的不溶于水的FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、 甘露醇和人工甜味剂例如糖精和任何数量的喷干香料(spray dried flavors)。调味 剂包括从植物例如水果提取得到的天然香料，和可产生愉悦感觉的合成的化合物 混合物例如但不限于薄荷油和水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、脱水 山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylene laural ether)。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫漆、氨化虫漆和醋酸邻苯二甲酸纤维 素。膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素纳、聚乙二醇4000和醋酸邻苯二甲 酸纤维素。
[0465]如果希望口服给药，sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域可以以这样 的组合物形式提供，即，该组合物可以保护它免遭胃的酸性环境的破坏。例如， 该组合物可以配制在肠衣中，该肠衣在胃中维持它的完整性，并在肠中释放出活 性化合物。组合物也可以与抗酸剂或其他这样的组分联合起来进行配制。
[0466]当单元剂型是胶囊时，除了上面类型的物质外，它还可以含有液体载体诸 如脂肪油。此外，单元剂量形式可以含有各种其他的材料，其修饰该剂量单元的 物理形式，例如糖和其他肠内吸收试剂的包衣。化合物也可以作为酏剂、悬浮液、 糖浆、干糊片(wafer)、喷洒剂、口香糖或类似物的组分而被施用。除了活性化合 物外，糖浆还可以含有蔗糖作为甜味剂，还可以含有某些防腐剂、染料和着色料 以及香料。
[0467]sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域也可以与不会削弱期望的作用的 其他活性材料混合，或与可以补充期望的作用的材料例如抗酸剂、H2封阻剂和利 尿剂混合。活性组分是本文中描述的化合物或其药学上可接受的衍生物。可以包 括更高浓度的活性组分，最高可达重量的约98％。
[0468]包括在片剂中的药学上可接受的载体是粘结剂、润滑剂、稀释剂、分解剂、 着色剂、调味剂和润湿剂。肠包衣片剂，由于该肠衣的缘故，可以抵抗胃酸的作 用，并在中性和碱性的肠中溶解或分解。糖包被的片剂是压缩片剂，其包有不同 层的药学上可接受的物质。膜包被的片剂是压缩片剂，其已用聚合物或其他合适 的包衣包被。多重压缩片剂(multiple compressed tablet)是利用先前提及的药学上可 接受的物质通过一个以上的压缩循环制成的压缩片剂。着色剂也可以用于上述剂 型。调味剂和甜味剂被用于压缩片剂、糖包被的、多重压缩的和可咀嚼的片剂。 调味剂和甜味剂在可咀嚼片剂和锭剂的制备中是特别有用的。
[0469]液体口服剂型包括含水溶液、乳剂、悬浮液、溶液和/或由非泡腾颗粒重构 的悬浮液和由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。含水溶液包括例如酏剂和糖浆。乳剂是 水包油的或油包水的。
[0470]酏剂是清透的、增甜的水醇(hydroalcoholic)制剂。用于酏剂的药学上可 接受的载体包括溶剂。糖浆是糖例如蔗糖的浓缩水溶液，并可以含有防腐剂。乳 状液是两相体系，在其中，一种液体以小球体的形式分散于另一种液体中。用于 乳剂的药学上可接受的载体是非水液体、乳化剂和防腐剂。悬浮液使用药学上可 接受的悬浮试剂和防腐剂。用于可以被重新配成液体口服剂型的非泡腾颗粒的药 学上可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。用于可以被重新配成液体口服 剂型的泡腾颗粒的药学上可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。着色剂和增味 剂被用于上述的所有剂型中。
[0471]溶剂包括甘油、山梨醇、乙醇和糖浆。防腐剂的例子包括甘油、对羟基苯 甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和乙醇。用于乳剂的非含水液 体的例子包括矿物油和棉籽油。乳化剂的例子包括明胶、阿拉伯胶、黄芪胶、膨 润土和表面活性剂诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。悬浮剂包括羧甲基纤维 素钠、果胶、黄芪胶、维格姆胶(Veegum)和阿拉伯胶。稀释剂包括乳糖和蔗糖。 甜味剂包括蔗糖、糖浆、甘油和人造甜味剂诸如糖精。润湿剂包括丙二醇单硬脂 酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。有机添加 剂包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括任何批 准合法的可溶于水的FD和C染料以及其混合物。调味剂包括从植物例如水果提 取得到的天然风味剂，以及任何可以产生贻人味觉的合成的化合物混合物。
[0472]对于固体剂型，将处于例如碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液或悬 浮液封装于明胶胶囊中。这样的溶液、制剂和其封装描述于美国专利4,328,245； 4,409,239和4,410,545中。对于液体剂型，处于例如聚乙二醇中的溶液可以用足够 数量的药学上可接受的液体载体例如水稀释，这可以在施用时被容易地测定。
[0473]可选择地，液体或半固体制剂可以通过将sHASEGP或其可溶性人透明质 酸酶结构域溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(例如碳酸丙烯酯) 和其他此类载体中，并将这些溶液或悬浮液封装于硬的或软的明胶胶囊壳中而制 备得到。其他有用的制剂包括在美国专利Re 28,819和4,358,603中描述的制剂。
[0474]适用于口腔含化给药(舌下含化给药)的制剂包括例如锭剂，其含有处于有风 味的基质(flavored base)中的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，所述 的风味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；还例如喉片，其含有处于惰性基质 (inert base)中的化合物，所述的惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶。
[0475]在所有的实施方案中，片剂和胶囊制剂可以按本领域技术人员所知道的那 样进行包被，以便改变或维持活性组分的溶解过程。因此，例如，它们可以用常 规的肠道可消化包衣——例如水杨酸苯酯、蜡和醋酸邻苯二甲酸纤维素来包被。
[0476]2.注射剂、溶液和乳剂
[0477]本文也考虑了sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的肠胃外给药， 通常以注射为特征，皮下、肌肉内或静脉内给药。注射剂可以以常规的形式制备， 或者作为液体溶液或者作为悬浮液；也可以以适于在注射之前用液体溶解或悬浮 的固体形式制备；或作为乳状液。合适的赋形剂例如水、盐水、右旋糖、丙三醇 或乙醇。此外，如果需要的话，待施用的药物组合物也可以含有很小数量的非毒 性辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其他此类试剂 诸如例如醋酸钠、失水山梨醇单月桂酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。本文也考虑 应用缓慢释放或持续释放的体系，以便维持恒定水平的剂量(参见例如美国专利 3,710,795)。sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域在此类肠胃外组合物中的百 分比取决于其特定性质以及化合物的活性和患者的需要。
[0478]组合物的肠胃外给药包括静脉、皮下和肌肉内给药。用于肠胃外给药的制 剂包括用于注射的无菌溶液、无菌干状可溶性产品，诸如冻干的粉末，其仅在使 用之前才与溶剂或无菌溶液混合，包括用于皮下注射的片剂、用于注射的无菌悬 浮液、仅在使用之前才与媒介物混合的无菌干状不可溶性产品，和无菌乳剂。溶 液可以是含水的或者不含水的。
[0479]如果是静脉内给药，合适的载体包括生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS)，以及 含有增稠剂和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
[0480]用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载体包括含水媒介、无水媒介、抗微 生物剂、等渗试剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、 螯合剂或掩蔽剂和其他药学上可接受的物质。
[0481]含水媒介的例子包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无 菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。无水肠胃外媒介包括植物来源的固定油、 棉籽油、玉米油、香油和花生油。其浓度可以达到抑制细菌或抑制真菌效果的抗 微生物剂必须加入到包装于多剂量容器中的肠胃外制剂中，其中包括苯酚或甲酚、 水银剂、苯甲醇、三氯丁醇、p-羟基苯甲酸甲酯和p-羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯 扎氯铵和苄索氯铵。等渗试剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸 盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮和分散剂包括 羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇 酯80(TWEENTM 80)。金属离子的螯合剂或掩蔽剂包括EDTA。药物载体也包括用 作可与水混溶的媒介的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于调节pH的氢氧化钠、盐 酸、柠檬酸或乳酸。
[0482]药物活性化合物的浓度被调节，以便注射液提供可以产生理想药理效果的 有效用量。准确的剂量取决于患者或动物的年龄、体重和状态，如本领域所知道 的。
[0483]单元剂量肠胃外制剂被包装于安瓿、小瓶或携带针的注射器中。所有用于 肠胃外给药的制剂必须是无菌的，如本领域所已知并实践的。
[0484]示范性地，含有活性化合物的无菌水溶液的动脉内或静脉内灌输是一种有 效的给药方式。另一实施方案是含有为了产生理想的药理效果所必需的活性材料 的无菌含水或油质溶液或悬浮液。
[0485]可设计注射剂以用于局部给药和全身性给药。通常，治疗上有效的剂量被 配制，对于接受治疗的组织，其含有浓度至少约0.1％w/w至高达约90％w/w，或 更多的活性化合物，优选浓度大于1％w/w的活性化合物。活性组分，诸如 sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域可以一次给药，或分为许多较小的剂量 在间隔的时间里给药。应该理解的是，精确的剂量和治疗的持续时间与正在被治 疗的组织有关，并且可以利用已知的测试方案经验性地确定，或由体内或体外测 试数据推断得到。应该注意，浓度和剂量值也可以随着接受治疗的个体的年龄而 变化。应该进一步理解的是，对于任何特定的对象，具体的给药方案应该依据个 体的需要和正在执行或监督制剂给药的人员的专业判断而随着时间的推移进行调 整，还应该理解的是，本文中阐述的浓度范围只是示范性的，并不是为了限制要 求保护的制剂的范围或实施。
[0486]本文中提供的化合物可以被配制用来通过注射——例如通过弹丸注射或持 续灌输——进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以以单元剂量形式存在于例如安 瓿中或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。组合物可以是处于油或含水载体中的 悬浮液、溶液或乳状液，可以含有配方试剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可 选择地，活性组分可以是粉末形式，其在使用之前与合适的介质，例如无菌无热 原的水或其他溶剂重新配制。例如，本文所提供的是稳定化溶液或冻干形式的肠 胃外制剂，其中含有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域，例如为 500至500,000单位。
[0487]化合物可以以微粉化或其他合适的形式悬浮，或可以被衍生化以产生更可 溶的活性产物或产生药物前体。所得到的混合物的形式取决于许多因素，包括所 打算的给药方式以及化合物在所选择的载体或媒介物中的溶解性。有效的浓度足 以改善状况的症状并可以经验性地确定。
[0488]3.冻干粉末
[0489]本文也提供了含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的冻干粉末， 其可以被再配制为溶液、乳状液和其他混合物而给药。这些制剂也可以被重构和 配制为固体或胶。
[0490]无菌的冻干粉末可以通过将含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构 域的固体部分溶解在合适的溶剂中或者将含有sHASEGP或其可溶性人透明质酸 酶结构域的溶液的小等份与合适的溶剂相混合而得以制备。所述溶剂可以含有改 善该粉末或由该粉末所制备得到的重构溶液的稳定性的赋形剂或其他药理学组 分。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、 甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂。所述溶剂也可以含有缓冲液，诸 如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其他这样的缓冲液，这是本领域技术人员所知道 的，通常为约中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，再在本领域技术人员已知的标 准条件下进行冻干，从而得到冻干的制剂。通常，将由无菌过滤获得的溶液分配 入小瓶中进行冻干。每个小瓶可以含有单剂量的化合物，诸如10-1000mg或 100-500mg，或者含有多倍剂量的化合物。
[0491]简言之，冻干粉末可以这样来制备，将右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、 木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂以约1-20％的量溶解于合适 的缓冲液例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它的本领域技术人员所知道的这样 的缓冲液中并使pH约为中性。然后将所选择的盐例如sHASEGP的钠盐(每 10-100gm的缓冲溶液约1gm，通常约1gm/30gms)在室温之上的温度例如约30-35 ℃加入到所得到的混合物中，并进行搅拌直到它溶解。所获得的混合物通过加入 更多的缓冲液进行稀释，以将所获得的盐浓度降低约10-50％，通常约15-25％。所 获得的混合物进行无菌过滤或处理，以去除微粒并确保其无菌，并分配入小瓶中 用于冻干。冻干的粉末可以在合适的条件下例如在约4℃至室温进行保存。
[0492]用注射用水重构该冻干粉末，从而提供了用于肠胃外给药的制剂。为了重 构，在每毫升的无菌水或其它适当的载体中，加入治疗上有效量的含有sHASEGP 或其可溶性人透明质酸酶结构域的冻干粉末。精确的数量依赖于所选择的化合物， 并可以通过本领域技术人员已知的方法经验性地确定。
[0493]4.外部给药
[0494]外部混合物按照所描述的进行制备以用于局部和全身性给药。外部给药， 其有时在本领域被称为经皮给药，典型地包括设计用来跨皮肤、粘膜或机体其它 表面吸收的应用(例如直接运用到皮肤上的应用；舌下的(舌下的(sublingual)) 应用；对面颊(面颊(buccal))应用；对眼、鼻或耳的应用；或对肺的应用(吸 入))。所得到的混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂或类似物，可以配制成乳液、 凝胶、药膏、乳胶体、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、膏、泡沫、气溶胶、 灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮贴或适合于外部给药的任何其它制剂。
[0495]sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域或其药学上可接受衍生物的组合 物可以被配制成气溶胶以用于外部应用，例如通过吸入方法(参见例如美国专利 4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用来输送用于治疗炎性疾病特别是哮 喘的类固醇的气溶胶)。这些用于呼吸道给药的制剂可以是用于喷雾器的气溶胶或 溶液形式，或是作为用于吹入法的超细粉末，其单独使用或与惰性载体诸如乳糖 联合使用。在这样的情况下，典型地，制剂的颗粒具有小于50微米的直径，例如 小于10微米。
[0496]对于吸入给药，本文使用的组合物可以以气溶胶喷雾给药的形式从加压的 包装或喷雾器中输送出来，其中使用合适的推进剂，这些推进剂包括但不限于二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和其它合适的气体。在加压 气溶胶的情况中，通过提供阀可以确定剂量单位，以输送定量数量。用于吸气器 或吹药器的例如明胶的胶囊和药筒(cartridge)可以被配制成含有所述化合物和合 适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0497]组合物可以被配制用于局部或外部应用，例如以凝胶、乳液和洗液的形式 外用于皮肤和粘膜诸如眼里，以及应用于眼或用于脑池内应用或脊柱内应用。外 部给药也被考虑用于经皮传送，以及用于眼给药或粘膜给药，或用于吸入治疗。 也可以将活性化合物的鼻溶液单独或与其它药学上可接受的赋形剂一起施用。
[0498]例如，适合于外部应用于皮肤或眼的制剂通常配制为药膏、乳液、洗液、 膏、凝胶、喷雾剂、气溶胶和油。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二 醇、醇和其两种或更多种物质的组合。外用制剂可进一步有利地含有重量比例为 0.05％至15％的增稠剂，包括但不限于：羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯 基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚亚烷基乙二醇、聚羟烷基、(甲基)丙烯酸酯或聚(甲基) 丙烯酰胺。外用制剂常常通过滴注或作为药膏应用到结膜囊。也可以将其用于眼、 面窦(facial sinuses)和外耳道的灌洗或润滑。液体状的外用制剂也可以存在于条 带(strip)、隐形眼镜和类似物的形式的亲水性的三维聚合物基质中，从中可以释 放出活性组分。也可以将其注入眼前房、巩膜上隙和其它地方。例如，本文提供 了在粘弹性物质注射之后于眼内使用的制剂，其含有有效量的sHASEGP或其可溶 性人透明质酸酶结构域的稳定化溶液，例如含有1至5000单位的具有30至150,000 单位/mg的比活性的可溶性糖蛋白，所述溶液的体积是小量的，例如5至50μl。 作为另一个实例，本文也提供了用于眼内使用的制剂，以在通过诸如特农下注射 的给药途径注射入包围巩膜的巩膜上隙后，增强一种或多种药理剂到眼内组织的 输送，该制剂包括有效量的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域的稳定化溶 液，例如在诸如0.5到10ml体积里含有50至5,000单位的具有30至150,000单位 /mg的比活性的可溶性糖蛋白。
[0499]这些溶液，特别是那些打算眼用的溶液，可以用合适的盐配制成0.01％-10％ 等渗溶液，其pH约5-7。
[0500]离子渗入疗法的联合应用
[0501]在外部给药到易于被离子渗入疗法所影响的组织和向易于被离子渗入疗法 所影响的组织的其它应用情况中，可将一种或多种sHASEGPs的使用(可能地， 与另外的药理剂或其它药剂联合配制或联合施用)与离子渗入疗法技术相结合， 以进一步驱动组织的通透。考虑到这些，离子渗入疗法和sHASEGPs可以协同行 使功能，因为离子渗入疗法可促进将sHASEGPs输送到组织或身体内的其它位置， 而且这样输送的sHASEGPs可以进一步促进酶的通透，以及联合配制的或联合施 用的或存在于组织中的其它分子，即，通过酶促打开通道，其帮助扩散，并且帮 助促进大量流体的流动，并且因而帮助溶质如药剂(pharmacologics)的对流输送。
[0502]用于其它给药途径的组合物
[0503]其他的给药途径，例如外部应用、经皮膏贴以及直肠给药也在本文考虑之 中。
[0504]例如，用于直肠给药的药物剂型是产生全身性效果的直肠栓剂、胶囊和片 剂。本文中使用的直肠栓剂指用于插入到直肠中的固体，其在体温下融解或软化， 释放出一种或多种药理学上或治疗上的活性成分。在直肠栓剂中使用的药学上可 接受的物质是基质(bases)或载体(vehicle)和试剂，以提高熔点。基质的例子 包括可可油(可可油(theobroma oil))、甘油-明胶、碳蜡(聚氧化亚乙基二醇)和 脂肪酸的甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯的恰当混合物。可以使用各种基质的组 合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过铸型 来制备。直肠栓剂的典型重量为约2至3gm。
[0505]用于直肠给药的片剂和胶囊可以使用同样的药学上可接受的物质并且采用 与制备口服给药制剂相同的方法进行制造。
[0506]适用于经皮给药的制剂可以作为独立的贴剂存在，其适于在延长的时间段 内与接受者的表皮保持紧密接触。此种贴剂适当地含有活性化合物，对于该活性 化合物，可相当于例如浓度为0.1至0.2M的可选缓冲的水溶液。适合于经皮给药 的制剂也可以通过离子渗入疗法输送(参见例如Pharmaceutical Research 3(6)：318 (1986))，并且典型地采用活性化合物的可任选缓冲的水溶液的形式。
[0507]药物组合物也可以通过受控释放方法和/或输送装置来施用(参见例如美国 专利3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719； 4,687,610；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,566；5,591,767； 5,639,476；5,674,533和5,733,566)。活性化合物或药学上可接受的衍生物可以用可 保护化合物免于从身体迅速清除的载体来制备，例如定时释放的制剂或包衣。
[0508]在本文提供的组合物和方法的一个实施方式中，治疗剂通过缓慢释放输送 载体被局部施用，例如，将治疗剂封装于胶体分散系统中或聚合物稳定化晶体中。 可用的胶体分散系统包括纳米胶囊、微球体、珠子和脂基系统，包括水包油乳剂、 微囊、混合微囊和脂质体。例如，胶体分散系统可以是脂质体或微球体。脂质体 是人造膜小泡，当被注射或植入时可用作缓慢释放输送载体。脂类-聚合物偶联物 和脂质体的一些实例公开于美国专利5,631,018中，在此引入其全部作为参考。缓 慢释放输送载体的其它实例是生物可降解的水凝胶基质(美国专利5,041,292)、树枝 状聚合物偶联物(美国专利5,714,166)和多小泡脂质体(DepofoamTM Depotech，San Diego，CA)(美国专利5,723,147和5,766,627)。适用于封装治疗剂以用于局部注射 (例如注射入皮下组织)的一类微球体是聚(D，L)丙交酯微球体，其描述于D.Fletcher， Anesth.Analg.84：90-94，(1997)中。例如，含有有效量的sHASEGP或其可溶性人 透明质酸酶结构域——例如1至5000单位/ml——的缓慢释放制剂可以用于各种用 途或用于治疗各种病症，包括但不限于化妆制剂(cosmetic formulation)、整形制 剂、治疗脊髓损伤和其它神经系统紊乱、某些眼病、炎性或自身免疫病症、癌症 和其它慢性疾病病症，其中sHASEGP的延时输送是有益的。
[0509]期望的血液水平可以通过持续输入活性试剂来维持，这通过血浆水平进行 确证。应该注意的是，由于毒性或者骨髓、肝脏或肾功能紊乱的原因，主治医生 将知道如何以及何时停止、中断或调整治疗，以降低剂量。相反地，如果临床反 应不足(排除毒性副作用)，主治医生也知道如何以及何时将治疗调到更高的水平。
[0510]sHASEGP多肽和/或其抑制剂——单独或与其它试剂例如治疗有效剂的组 合——的效用和/或毒性也可以通过本领域已知的方法进行评价(参见例如O& Apos；Reilly，Investigational New Drugs 15：5-13(1997))。
[0511]6.制品
[0512]sHASEGP多肽或其可溶性人透明质酸酶结构域或含有任何前述试剂的组合 物可以被包装为制品，其包含包装材料、包装材料内本文中提供的化合物或其适 当的衍生物——它们可以有效地治疗本文所考虑的疾病或紊乱，以及标明所述化 合物或其适当的衍生物是用于治疗本文所考虑的疾病或紊乱的标签。该标签可以 任选地包括被证明可以治疗的紊乱。
[0513]本文提供的制品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料是本领域技 术人员众所周知的(参见例如美国专利5,323,907、5,052,558和5,033,352)。药物包 装材料的实例包括但不限于硬质泡沫塑料包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、 容器、注射器、瓶和适用于所选择的制剂和拟给药和治疗方式的任何包装材料。 本文所提供的化合物和组合物的各种制剂被考虑，同样被考虑的是针对任意的紊 乱的各种治疗，在所述的紊乱中，HCV感染涉及作为症状或病因的介导者或原因。
[0514]本文也提供了含有组合物和/或其与给药说明书的组合的试剂盒。试剂盒可 以进一步包括通常以无菌形式包装的用于注射复合物的注射针头或注射器，和/或 包装的酒精垫。说明书也可以任选地包含在其中，以指导临床医生或患者施用活 性药剂。例如，本文提供了如此试剂盒，其包含带有有效量的sHASEGP或其可溶 性人透明质酸酶结构域的小体积注射器，例如包含在5至50μl体积中的1至5000 单位的可溶性糖蛋白，可选地包含含有粘弹性物质的第二注射器。本文也提供了 这样的试剂盒，其包含小体积注射器，其中含有有效量的sHASEGP或其可溶性人 透明质酸酶结构域，例如1至500单位的可溶性糖蛋白，以及治疗量的第二活性 组分，例如药物、小分子、蛋白或核酸。
[0515]K.动物模型
[0516]本文提供了转基因动物模型和动物，例如包括小鼠和大鼠的啮齿类动物、 牛、鸡、猪、山羊、绵羊、包括大猩猩和其它灵长类的猴类。特别地，提供了含 有编码sHASEGP多肽的异源核酸的转基因非人动物，或者在其中该多肽的表达已 被改变的转基因动物，这种改变例如通过置换或修饰内源基因的启动子区域或其 它调控区域。此类动物可以通过促进内源性核酸和外源性sHASEGP基因之间通过 同源重组事件或其它重组事件而发生的重组来产生，其中，所述外源性sHASEGP 基因可以被过量表达或不当表达，例如通过在强启动子下进行表达。
[0517]转基因动物可以通过使用任何已知的输送方法将核酸引入生殖系细胞或体 细胞例如胚胎干细胞而产生，所述的输送方法包括但不限于微注射、脂转染和其 它基因输送方式。典型地，将核酸引入细胞例如胚胎干细胞(ES)中，然后将该ES 细胞注射入胚泡，并将胚泡植入代孕母亲，再生出转基因动物。一般地，通过异 源的sHASEGP编码核酸和内源性核酸之间的重组将异源核酸分子引入动物染色 体。异源核酸可以靶向特定的染色体。在一些实例中，可以产生基因敲除动物。 此类动物可以首先通过促进其染色体中的sHASEGP多肽基因和生物学上已失活 (典型地，通过插入异源序列例如抗生素抗性基因来实现)的外源性sHASEGP多肽 基因之间的同源重组而产生。在一个实施方式中，这种同源重组通过用包含插入 失活的sHASEGP多肽基因的载体转化胚胎来源的干细胞(ES)来实施，这样， 发生同源重组，然后将ES细胞注射入胚泡，并将胚泡植入代孕母体，由此生出 sHASEGP多肽基因已失活的嵌合动物(“基因敲除动物”)(参见Capecchi，Science 244：1288-1292(1989))。可以培育该嵌合动物，以产生纯合的基因敲除动物，然后 可以使用所述基因敲除动物来产生另外的基因敲除动物。基因敲除动物包括但不 限于小鼠、仓鼠、绵羊、猪、牛和其它非人哺乳动物。例如，产生基因敲除小鼠。 所得到的动物可以充当特定疾病例如癌症的模型，其显示出sHASEGP多肽的不足 表达。这样的基因敲除动物可以用作此类疾病的动物模型，例如用来筛选或测试 能够治疗或预防此类疾病或紊乱的分子。
[0518]也可以产生其它类型的转基因动物，包括过量表达sHASEGP多肽的那些 转基因动物。这样的动物包括“基因敲入”动物，它们是其中正常基因被变体例 如突变体、过量表达形式或其它形式所替代的动物。例如，一个物种例如啮齿类 动物的内源性基因可被其它物种例如人的基因所替代。动物也可以通过非同源重 组进入染色体中的其它位点而产生；包括发生过多种整合事件的动物。
[0519]在产生第一代转基因动物之后，可以对嵌合动物进行培育，以产生具有过 量表达的或不当表达的sHASEGP多肽的另外的动物。这样的动物包括但不限于小 鼠、仓鼠、绵羊、猪、牛和其它非人哺乳动物。所得到的动物可以充当特定疾病 例如癌症的模型，其显示出sHASEGP多肽的过量表达或不当表达。这样的动物可 以用作此类疾病的动物模型，例如用来筛选或测试能够治疗或预防此类疾病或紊 乱的分子。在具体的实施方式中，产生具有过量表达的或不当表达的sHASEGP多 肽的小鼠。
[0520]下面包括的实施例仅是用于说明目的，而不是打算限制本发明的范围。
[0521]L.sHASEGP的治疗用途
[0522]在过去的40年里，来自屠宰场的天然发生的透明质酸酶已经成为临床酶制 剂的主要来源。牛和羊睾丸是这种材料的主要来源。然而，这种临床酶制剂是非 常粗糙的，基于已知的比活性为30-100,000单位/mg之间，可知被售的制剂的纯度 在0.5-5％范围内。因此，它们纯度的缺乏以及它们的屠宰场来源，使得它们不但 成为人的免疫源而且成为克-雅二氏症(Jacob Creutzfeld)和其它牛和羊病原体的 潜在来源。已经知道发生过对牛和羊透明质酸酶制剂的过敏反应。
[0523]牛或细菌源的透明质酸酶已经被用于治疗与过量透明质酸相关的疾病，并 且被用来增强生理液和/或治疗剂的循环。例如，牛透明质酸酶可以与用于眼科手 术程序的球周、球后和特农囊下(sub-Tenon′s block)阻断中的麻醉剂一起注入。 而且，在缺乏透明质酸酶时手术并发症出现增加(Brown SM et al.J Cataract Refract Surg.1999 Sep；25(9)：1245-9.)。牛透明质酸酶也可以用作局部坏死的解毒剂，该 局部坏死来自于致坏死物质例如长春花植物碱的静脉旁注射(Few，B.J.(1987)Amer. J.Matern.Child Nurs.12，23-26)。牛睾丸透明质酸酶也可用于治疗神经节囊肿(Paul et al.J Hand Surg 1997 Apr；22(2)：219-21)。透明质酸酶也可以用来帮助流体在皮下 灌注术中的皮下输送(Berger EY，Am Geriatr Soc 1984 Mar；32(3)：199-203)。透明质 酸酶也已被用于降低接受粘弹性物质的青光眼患者和白内障患者眼睛内的眼内压 (美国专利4,820,516，1989年4月11日出版)。
[0524]牛或细菌源的透明质酸酶已被用作“分散剂(spreading agent)”，来增强化 学治疗剂的活性和/或使得肿瘤能更容易接近化学治疗剂(Schuller et al.，1991，Proc. Amer.Assoc.Cancer Res.32：173，abstract no.1034；Czejka et al.，1990，Pharmazie 45： H.9)。化学治疗和透明质酸酶的组合在各种癌症的治疗中是有效的，所述癌症包括 膀胱癌(Horn et al.，1985，J.Surg.Oncol.28：304-307)、鳞状细胞癌(Kohno et al.，94，J. Cancer Res.Oncol.120：293-297)、乳腺癌(Beckenlehner et al.，1992，J.Cancer Res. Oncol.118：591-596)和胃肠癌(Scheithauer et al.，1988，Anticancer Res.8：391-396)。透 明质酸酶作为治疗脑癌(神经胶质瘤)的唯一治疗剂是有效的(PCT公开申请号WO 88/02261，1988年4月7日公布)。透明质酸酶的给药也诱导胰腺、胃、结肠、卵 巢和乳房的以前抗化学治疗的肿瘤发生应答(Baumgartner et al.，1988，Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker et al.，1986，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27：390)。不幸的 是，污染物和此类透明质酸酶的非人性质会导致过敏反应。
[0525]除了其间接的抗肿瘤效应外，牛来源的透明质酸酶具有直接的抗癌发生的 效应。透明质酸酶阻止移植入小鼠的肿瘤的生长(De Maeyer et al.，1992，Int.J. Cancer 51：657-660)，并且抑制在暴露于致癌物质时的肿瘤形成(Pawlowski et al.， 1979，Int.J.Cancer 23：105-109；Haberman et al.，1981，Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology，Washington，D.C.，22：105， abstract no.415)。
[0526]考虑到牛来源的透明质酸酶作为治疗剂的价值，特别是在其与传统的化疗 剂一起用于化学治疗时，或者其本身作为化学治疗的治疗剂时，在本领域就存在 着对基本上纯的人源透明质酸酶制剂的需求。也需要有效的、具成本效益的制备 透明质酸酶的方法，以提供商业上相当数量的酶。本发明致力于这些问题。
[0527]透明质酸是胞外基质的基本成分。透明质酸发现于哺乳动物的结缔组织中， 并且是眼玻璃体的主要成分。在结缔组织中，与透明质酸缔合的水合水在组织之 间创造出空间，从而产生有利于细胞运动和增殖的环境。透明质酸在与细胞运动 相关的生物学现象中起到关键作用，所述生物学现象包括快速发育、再生、修复、 胚胎发生、胚胎发育、伤口愈合、血管生成和肿瘤发生(Toole，1991，Cell Biol. Extracell.Matrix，Hay(ed)，Plenum Press，New York，1384-1386；Bertrand et al.，1992， Int.J.Cancer 52：1-6；Knudson et al.，1993，FASEB J.7：1233-1241)。另外，透明质 酸水平与肿瘤侵入性相关(Ozello et al.，1960，Cancer Res.20：600-604；Takeuchi et al.，1976，Cancer Res.36：2133-2139；Kimata et al.，1983，Cancer Res.43：1347-1354)。
[0528]脊髓损伤之后，神经胶质瘢痕由星形细胞产生，并且神经胶质瘢痕含有硫 酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)。CSPGs在抑制轴突生长中发挥关键作用(Levine，1994； Powell et al.，1997)。例如，在胚胎发育期间，CSPGs压迫轴突并抑制神经细胞粘 着。CSPGs也在边界形成中发挥重要作用(Snow et al.，1990，1992；Powell and Geller， 1999)。另外，在CNS损伤之后CSPG的表达增加(Mckeon et al.，1991；Davies et al.， 1997)。
[0529]研究表明，CSPGs的抑制效应主要是由硫酸软骨素(CS)糖胺聚糖(GAG)糖 链引起的(Snow et al.，1990；Cole and McCable，1991；Geisert and Bidanset，1993)。 发现细菌软骨素酶的鞘内给药事实上促进了轴突再生，这支持了这点。而且，电 生理学实验确定，再生的CST轴突建立了功能联系(Bradbury，et al 2002)。除了 CSPGs的直接抑制效应之外，CSPGs也可以与细胞粘附分子或神经营养因子相互 作用，以影响神经突的生长(Roberts et al.，1988；Ruoslahti and Yamaguchi，1991； Milev et al.，1994)。重组的哺乳动物透明质酸酶因此可以用于逆转CSPG在神经胶 质瘢痕中的抑制作用并且促进损伤之后的轴突再生。
[0530]充分降解神经胶质瘢痕中的CSPG所需的sHASEGP的数量将会变化。在 一些情况下，需要通过鞘内输送反复地给予10-5000单位的sHASEGP以去除瘢痕 内的CSPG。在其它情况下，通过使用缓释制剂持续释放sHASEGP可能是优选的。 可选地，施用编码sHASEGP的基因治疗载体可以有效地增强CSPG的清除。
[0531]sHASEGPs也可以在称为化学髓核溶解术的方法中被用来治疗椎间盘脱出。 软骨素酶ABC和切割sHASEG相似底物的酶可诱导降低腰椎中的椎间盘内压力 (Sasaki et al.，2001，Ishikawa et al.，1999)。有三类椎间盘损伤。椎间盘膨出(protruded disk)是完整但是凸出(intact but bulging)的一种类型。在椎间盘突出(extruded disk) 中，纤维质包裹物已经撕裂，并且NP泄出，但其依然与椎间盘相联。在椎间盘脱 出(sequestered disk)中，NP的片段从椎间盘脱落，并游离于脊椎管。化学髓核溶 解术对于椎间盘膨出和椎间盘突出是有效的，但对于椎间盘脱出损伤没有效果。 在美国，化学髓核溶解术仅被批准用于腰部(更低的)脊椎。在其它国家，它已经被 成功地用于治疗颈(上部脊椎)突出。因此，当优选要降低椎间盘压力时，化学髓核 溶解术是椎间盘手术的保守性替代方案。
[0532]糖蛋白上的碳水化合物链的精确组成和结构可直接影响其血清寿命，这是 因为肝脏和网状内皮系统中的细胞可与携带特定碳水化合物的循环糖蛋白相结合 并使之内在化。肝细胞在它们的表面上具有受体，这些受体识别末端(即，聚糖相 对于多肽的最远端)具有Gal残基的寡糖链，巨噬细胞包含识别末端Man或GlcNAc 残基的受体，肝细胞和淋巴细胞具有识别暴露的岩藻糖残基的受体。然而，还没 有发现唾液酸特异性受体。尽管有些依赖于寡糖的空间排布，但按照一般规则来 说，被肝脏和网状内皮系统中的细胞表面受体识别的暴露糖残基的数量越多，糖 蛋白被清除出血清越快。然而，因为不存在唾液酸特异性受体，所有具有用唾液 酸末端化或“封端(capped)”的分支的寡糖不会加快与之连接的蛋白质的清除。
[0533]除了影响其被肝脏和网状内皮细胞中的糖特异性受体识别之外，糖蛋白上 寡糖链的存在和性质也能影响重要的生物化学特性。从糖蛋白上除去碳水化合物 通常将降低其溶解性，并且其也可能通过将正确的多肽折叠形式去稳定化和/或暴 露蛋白酶敏感位点，而使得它更易遭受蛋白水解降解。由于相似的原因，蛋白质 中的糖基化状况可影响免疫系统对其的识别。
[0534]在深低温保藏和其它体外受精技术例如细胞质内精子注射(ICSI)之前， sHASEGPs可以被用来除去包围卵的卵丘细胞。可以将在缓冲盐溶液中的 10-200U/ml之间的透明质酸酶加入到收集的卵母细胞中。通过吸取和用缺少透明 质酸酶的介质进行数次洗涤，将卵母细胞与释放的卵丘细胞分离开来。然后可以 对卵进行处理，以用于深低温保臧或IVF技术。
[0535]sHASEGPs也可以用于更有效地将化学治疗剂渗入实体肿瘤中。sHASEGPs 可以与抗癌剂一起进行肿瘤内注射，或者对于弥散性癌症或难以到达的肿瘤进行 静脉内注射。抗癌剂可以是化学治疗剂、抗体、肽或基因治疗载体、病毒或DNA。 此外，sHASEGPs可以被用来将肿瘤细胞募集至循环库(cycling pool)，以对具有 获得多元药物抗性的先前耐药性(chemorefractory)肿瘤进行增敏作用(St Croix et al Cancer Lett 1998 Sep 11；131(1)：5-44)。sHASEGPs也可以用于增强将生物制剂例如 单克隆抗体、细胞因子和其它药物输送到积聚糖胺聚糖的肿瘤。许多肿瘤缺失了 参与糖胺聚糖的分解代谢的基因，这样局部积聚可阻止抗肿瘤试剂和免疫系统到 达肿瘤块。
[0536]sHASEGP也可以用于增加对常规的化学治疗有抗性的肿瘤的敏感性。在一 个实施方式中，将sHASEGP施用给具有与LuCa-1缺陷相关的肿瘤的患者，施用 量足以增加在肿瘤位点周围的扩散(例如，增加化学治疗因子的循环；例如，促进 化学治疗剂在肿瘤位点和肿瘤位点周围的循环和/或聚集)、抑制肿瘤细胞运动性 (例如，通过HA降解)和/或降低肿瘤细胞凋亡阈值(即，将肿瘤细胞带入失巢凋亡 状态)，该状态使得肿瘤细胞更易遭受化学治疗剂或可促进细胞死亡的其它试剂的 作用，优选地，所述试剂优先地促进失巢凋亡中的细胞程序性细胞死亡。本文中 使用的化学治疗剂旨在包括所有分子，合成的(例如，顺铂)以及天然发生的(例如， 肿瘤坏死因子IF))，它们帮助抑制肿瘤细胞生长，优选地促进肿瘤细胞死亡，更优 选地优先促进肿瘤细胞死亡。
[0537]特别感兴趣的是，使用sHASEGP来治疗转移癌和非转移癌，特别是转移 癌，其相对于非癌症(正常)细胞，具有降至不能被检测的透明质酸酶活性。 sHASEGP可以用作化学治疗剂(单独或与其它化学治疗剂联合)，用于治疗多种癌 症的任意一种，特别是侵入性肿瘤。例如，sHASEGP可以被用来治疗肺小细胞癌、 肺鳞状细胞癌以及胸癌、卵巢癌、头和颈癌，或与降低的透明质酸酶水平相关的 任何其它癌症，或与缺陷LuCa-1(hpHAse)基因(例如，不能表达足够水平的hpHAse 的LuCa-1基因，或编码不能提供足够水平的透明质酸酶活性的缺陷hpHAse的 LuCa-1基因)相关的任何其它癌症，或与降低的透明质素分解代谢相关的其它缺 陷。sHASEGP优选用于治疗与缺陷HA分解代谢相关的恶性细胞增生性疾病，它 不需要细胞参与来进行降解。
[0538]适于给药的具体剂量可以由本领域普通技术人员根据上面讨论的因素容易 地确定(参见例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，1 1th Ed.，1987)。另外， 适用于人的剂量的估计可以从sHASEGP在体外确定的酶活性水平和/或在动物研 究中的有效剂量进行外推。例如，70-300TRU的透明质酸酶能有效地减少重症联 合免疫缺陷鼠(scid mouse)中的肿瘤负荷。考虑到该信息，在平均70kg的人中 相应的剂量范围为约250,000-1,200,000TRU透明质酸酶。将sHASEGP施用给人 类患者的数量通常在1TRU至5,000,000TRU的酶活性范围内，优选在约1,000 TRU至2,500,000TRU的范围内，更优选在约100,000TRU至1,500,000TRU的范 围内，正常情况下在约250,000TRU和1,200,000TRU之间，约725,000TRU的剂 量代表了平均处方剂量。
[0539]在一个实施方式中，将sHASEGP配制在包含浓度约150,000TRU/cc的 sHASEGP的0.15M盐溶液中。然后将制剂以15,000TRU/kg患者体重的量静脉内 注射。可选地，该酶制剂也可以皮下注射，以使得透明质酸酶可以灌注至肿瘤位 点的周围。在优选的实施方式中，将sHASEGP注射在肿瘤周围，或者注射入肿瘤 块。在另一个优选的实施方式中，sHASEGP被配制成脂质体，通过静脉内注射进 行输送，或者通过在与LuCa-1(hpHAse)基因的缺陷相关的癌细胞的位点或位点附 近注射而进行输送。sHASEGP的静脉内注射导致在肿瘤位点中具有sHASEGP。 而且，因为sHASEGP上的末端唾液酸防止该酶被网状内皮系统从循环中清除掉， 所以超唾液酸化的sHASEGP对于肠胃外给药是优选的。超唾液酸化的sHASEGP 与非唾液酸化的牛和羊透明质酸酶的比较显示，超唾液酸化的sHASEGP获得基本 上更加有利的药物动力学。
[0540]基因治疗的易化
[0541]大部分基因输送载体的体内效力并不与在体外所观察到的效力相对应。糖 胺聚糖能阻碍DNA和病毒载体转移和扩散入许多细胞类型。这样的胞外基质材料 的水平能大大地阻碍该过程。Dubensky et al.，(Proc Natl Acad Sci USA 1984 Dec； 81(23)：7529-33)证明，当透明质酸酶与胶原酶联合时，透明质酸酶可有助于DNA 的体内转导。已经证明，腺相关病毒也能胜任透明质酸酶介导的基因治疗(Favre et al，Gene Ther 2000 Aug；7(16)：1417-20)。
[0542]我们在本文中已经确定，用sHASEGP在胞外基质中打开确定尺寸的通道。 这些孔通常没有增加直径大于约200-500nm的物质的扩散。然而，更小的分子例 如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和DNA复合体可胜任sHASEGP介导的扩散。 sHASEGPs一般打开基本上足够大以允许大多数治疗剂和其它感兴趣的药理剂(包 括大分子例如蛋白质和核酸以及大分子复合体例如基因治疗载体)进入的通道， 而且该通道一般没有大至促进细胞的易位和运动，该事实保证了sHASEGPs在例 如治疗、预防和/或诊断各种疾病方面具有特别有利的用处。
[0543]可选地，病毒也可以装配有sHASEGP基因，以有助于例如它们在靶组织 中复制和传播。靶组织可以是癌症组织，由此，病毒能够在肿瘤内选择性复制。 病毒也可以是非裂解病毒，其中，病毒在组织特异性启动子下选择性复制。随着 病毒的复制，sHASEGP与病毒基因的共表达将促进病毒在体内的传播。
[0544]可选地，感兴趣的核酸和sHASEGP可以同时使用，或连续使用或错开时 间使用。“同时”是指联合给药。在这种情况下，这两种基本成分可以在给药之前 混合成组合物，或者可以同时施用给细胞或宿主生物。也可以对其连续给药，也 就是说一种接一种，不论本发明的联合产品中的哪种成分先被施用。最后，可以 使用这样的给药方式，即，错开时间施用，或者间断施用，其停止又再重新开始， 并且其间的间隔可以是规律的也可以是不规律的。被指出的是，两种成分的给药 途径和位点可以是不同的。根据一个特别优选的实施方式，sHASEGP在核酸之前 被施用，而且这两种成分的给药途径优选是相似的。注射之间的时间间隔不是关 键的，可以由技术人员来规定。可推荐10min至72h的时间间隔，有利地为30min 至48h的时间间隔，优选1至24h的时间间隔，非常优选地，为1至6h的时间 间隔。
[0545]另外，本发明的联合产品也可以与一种或多种拟改善核酸给药的分子相联 合。所述分子可以是这样的分子，其对核酸具有保护作用(防止其在细胞内降解)， 其提高了它在宿主细胞的渗透或表达(促融合肽、核定位信号等)，其能够靶向特 定的细胞类型(识别细胞表面蛋白质的配体或抗体，等)，或其延长治疗效应(免 疫抑制试剂，等)。所述的联合产品也可以与促进转染的试剂(蛋白质等)联合。
[0546]本发明的联合产品可以以局部或肠胃外给药为目的或以消化途径给药为目 的进行制备。特别提到的途径是胃内、皮下、心脏内、静脉内、腹腔内、滑膜内、 肿瘤内、肺内、鼻内和气管内途径，并且更特别地，是肌肉内途径。给药可以通 过本领域的任何技术(注射、口服途径、气溶胶、滴注等)实现，可以作为单一剂量 或作为在特定的时间间隔之后重复一次或若干次的剂量。可以调整给药途径以适 应将被转染的感兴趣基因和将被治疗的疾病。制剂可以包括药学上可接受的载体 (赋形剂、辅助剂等)。导致胞外基质解体的物质和感兴趣的核酸优选溶解于缓冲液 中，该缓冲液适合用于药物用途且可以是高渗性的、低渗性的或等渗性的。可以 考虑各种缓冲液。可以提出的示例性缓冲液有生理盐溶液(0.9％NaCl)、非生理盐 溶液(1.8％NaCl)、Hepes-Ringer溶液、乳酸盐-Ringer溶液，基于Tris-HCl的缓冲 液(10mM Tris-HCl，pH 7.5至8、1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH 7.5至8、1mM MgCl2)、磷酸缓冲液(Krebs磷酸盐H2O缓冲液)、糖(葡萄糖、蔗糖、海藻糖等)溶 液或仅仅是水。
[0547]皮下灌注术
[0548]皮下灌注术，流体的皮下灌输，是有用和易行的水合技术，其适合于轻微 至中等程度失水的成年患者，尤其是老年患者。该方法被认为是安全的，且不会 造成任何严重的并发症。最常见的副作用是可以通过局部按摩和全身性利尿剂而 得以处理的轻微的皮下浮肿。可以在24小时内在两个不同的位置给药大约3L。常 见的灌输位置是胸腔、腹、股和上肢。优选的溶液是生理盐水，但可以使用其它 溶液，例如半生理盐水，盐水葡萄糖或5％葡萄糖。如果需要的话，可以将氯化钾 加入到溶液袋中。此外，其它药物可以通过类似的途径输送。可以加入人sHASEGP， 以增强流体吸收和增加给药的总速度。因为人sHASEGP不可能具有如同牛的酶所 知道的那样的免疫原性，所以人sHASEGP比屠宰场来源的酶更优选用于反复的皮 下灌注术。人sHASEGP可以在家里由家庭成员或护士施用；该技术应该是每一个 家庭医生熟悉的。
[0549]在能走动的患者中，皮下灌注术的位点包括腹、上胸腔、乳房以上、肋间 隙上和肩胛区。在卧床患者中，优选的位点是股、腹部和上肢外侧。1至4天后， 应该更换注射针头和输液管，尽管灌输装置曾经被使用更长的时间而无并发症出 现。可以1天3次，一次1或2小时，给药500mL，在第一次的早上输注之前于 皮下位点施用150U的sHASEGP。
[0550]治疗性注射的易化
[0551]许多经皮注射(例如通过使用注射针头或其它穿透皮肤并被用来将分子置 于皮下层的器械)的分子缓慢地或以非常缓慢的效率进入循环。几个因素调控皮 下注射(SC)或肌内注射(IM)的分子的药物动力学和药效动力学。通常，更大的分子 以更缓慢的速度和更低的效率进入循环，它们不是通过主动运输进入循环的。通 过计算SC与静脉内给药时的曲线下面积的比率(AUCsc/AUC静脉内)确定皮下生物利 用度。第二因素是基质分子的电荷和亲合性，它们在分子在皮下的螯合 (sequestration)过程中可能发挥作用。如果这些材料在局部被降解，它们可能永 远不能到达它们的期望靶标，并因而对靶器官表现出降低的总的全身性生物利用 度。
[0552]大的蛋白通常是静脉内给药，因此药剂在血流中直接可被利用。然而，如 果药剂可以皮下给药、肌内给药或皮内(ID)给药的话，将是有利的，因为这些给药 形式对于患者而言更容易操作。特别是，如果药剂必需在一生中有规律地服用， 以及治疗开始的很早，当患者是儿童时已经开始治疗的情况下。然而，具有非常 大的和不稳定的分子例如170至300kDa的凝结因子VIII的药剂，如果被皮下给药、 肌内给药或皮内给药，通常具有非常低的生物利用度，这是因为吸收不足而且降 解严重。
[0553]除了需要增加许多皮下给药的生物制剂的生物利用度之外，更快速的药物 动力学在急诊的情况下也是至关重要的。对于许多患者，实现静脉内接通(reach intravenous access)所需要的时间阻止了当原本被全身性地给药时可快速起作用的 药物被利用。在一些情况下，在不能接通静脉内通路之后，再进行皮下注射，这 进一步担搁了到达靶器官的时间。因此，皮下给药的药物的更迅速的可利用性将 是有利的，因为这样是第一时间的治疗而不会由于接通静脉所需要的时间而冒险。 可以皮下以及静脉内输送的分子的实例包括肾上腺素、阿托品、纳洛酮(narcan)、 利多卡因和右旋糖。
[0554]本发明的另一优点在于，能够以ID、SC或IM的方式输送相等体积或更大 体积的溶液，而不存在与注射位点处溶液的压力和体积相关的疼痛和发病。
[0555]例证性地(而非限制)，大量的生物制剂以可通过与一种或多种sHASEGPs 联合(例如通过共同配制，或在所述生物制剂给药之前、同时或之后的sHASEGP 联合给药)而得到增强，其包括例如：阿昔单抗(例如REOPROTM)、Adalimumabs(例 如HUMIRATM)、β-半乳糖苷酶(Agalsidase betas)(例如FABRAZYMETM)、 Aldesleukins(例如PROLEUKINTM)、阿法赛特(Alefacepts)(例如AMEVIVETM)、阿 仑单抗(Alemtuzumabs)修如CAMPATHTM)、Alteplases(例如ACTIVASETM)、 Alteplases(例如CATHFLO ACTIVASETM)、阿那白滞素(Anakinras)(例如 KINERETTM)、阿西莫单抗(Arcitumomabs)(例如CEA-ScanTM)、天冬酰胺酶(例如 ELSPARTM)、巴利昔单抗(Basiliximabs)(例如SIMULECTTM)、贝卡普勒明 (Becaplermins)(例如REGRANEXTM)、贝伐单抗(bevacizumabs)(例如AVASTINTM)、 A型肉毒毒素(例如BOTOXTM)、B型肉毒毒素(例如MYOBLOCTM)、Capromab Pendetides(例如PROSTASCINTTM)、西妥昔单抗(Cetuximabs)(例如ERBITUXTM)、 达利珠单抗(Daclizumabs)(例如ZENAPAXTM)、α-达比波廷(Darbepoetin alfas)(例如 ARANESPTM)、白喉毒素-IL-2融合蛋白(Denileukin diftitoxs)(例如ONTAKTM)、 Dornase alfas(例如PULMOZYMETM)、Drotrecogin alfas(例如XIGRISTM)、依法利珠 (Efalizumabs)(例如RAPTIVATM)、α-依伯汀(Epoetin alfas)(例如EPOGENTM)、依那 西普(Etanercepts)(例如ENBRELTM)、非格司亭(Filgrastims)(例如NEUPOGENTM)、 替依莫单抗(Ibritumomabs/Tiuxetans)(例如ZEVALINTM)、Imciromab Pentetates(例如 MYOSCINTTM)、因福利美(Infliximabs)(例如REMICADETM)、α-2a干扰素(例如 ROFERON-ATM)、复合干扰素(Interferon alfacon-ls)(例如INFERGENTM)、α-n3干扰 素(Interferon alfa-n3s)(例如ALFERON NTM)、β-1a干扰素(Interferon beta-las)(例如 AVONEXTM，BETASERONTM)、β-1a干扰素(Interferon beta-las)(例如REBIFTM)、γ-1b 干扰素(Interferon gamma-lbs)(例如ACTIMMUNETM)、拉罗尼酶(Laronidases)(例如 ALDURAZYMETM)、99-锝标记抗癌单抗(Nofetumomabs)(例如VERLUMATM)、奥 马珠单抗(Omalizumabs)(例如XOLAIRTM)、Oprelvekins(例如NEUMEGATM)、帕利 珠单抗(Palivizumabs)(例如SYNAGISTM)、聚乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastims)(例 如NEULASTATM)、聚乙二醇化α-2a干扰素(Peg-interferon alfa-2as)(例如 PEGASYSTM)、聚乙二醇化α-2b干扰素(Peginterferon alfa-2bs)(例如 PEG-INTRONTM)、拉布立酶(Rasburicases)(例如ELITEKTM)、瑞替普酶 (Reteplases)(例如RETAVASETM)、利妥昔单抗(Rituximabs)(例如RITUXANTM)、替 奈普酶(Tenecteplases)(例如TNKaseTM)、托西莫单抗和碘I-131(Tositumomab and Iodine I-131s)(例如BEXXARTM)、曲妥珠单抗(Trastuzumabs)(例如HERCEPTINTM)、 尿激酶(Urokinases)(例如ABBOKINASETM)。
[0556]玻璃体出血
[0557]为了将在施行玻璃体切开术期间造成视网膜的进一步脱离或撕裂的可能性 最小化，在美国专利5,292,509(Hageman)中已经提出，在除去玻璃体之前，将某些 无蛋白酶的糖胺聚糖酶注射入玻璃体，从而造成玻璃体与视网膜的解离或“剥离 (disinserted)”。玻璃体的这种剥离或解离的目的是使当玻璃体被除去时视网膜被 进一步撕裂或脱离的可能性最小化。可以用来实现这种玻璃体剥离的特定的无蛋 白酶的糖胺聚糖酶的实例据称包括：软骨素酶ABC、软骨素酶AC、软骨素酶B、 4-硫酸软骨素酶、6-硫酸软骨素酶、透明质酸酶和β-葡糖醛酸酶。
[0558]尽管已经知道透明质酸酶可以用于各种眼科应用，其包括在美国专利 5,292,509(Hageman)中描述的玻璃体切除辅助应用，但已公开的研究表明透明质酸 酶本身对于视网膜和/或眼的其它解剖学结构是有毒性的。参见The Safety of Intravitreal Hyaluronidase；Gottleib，J.L.；Antoszyk，A.N.，Hatchell，D.L.and Soloupis，P.，Invest Ophthalmol Vis Sci 31：11，2345-52(1990)。而且，使用不纯的屠 宰场来源的透明质酸酶制剂可能引起眼色素层炎或眼部炎症。因此，由于其增加 的效价、纯度和非动物的来源，人sHASEGP是优选被使用的，而对于动物来源来 说，在反复的给药之后，它会引起免疫原性反应和抗体介导的中和作用。在另一 个实施方式中，可以将聚乙二醇化形式的sHASEGP注射入眼睛。此类聚乙二醇化 的sHASEGP不会以非常快速的方式从玻璃体清除，而在玻璃体中更长的时间维持 其活性。
[0559]一些透明质酸酶制剂的眼科毒性(ophthalmic toxicity)已经被其他研究者 所证实，这些研究者已经提出此类透明质酸酶制剂被用作毒性刺激物，在动物毒 性模型中在眼中造成实验诱导的新血管形成(参见An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit；Antoszyk，A.N.，Gottleib，J.L.，Casey，R. C.，Hatchell，D.L.and Machemer，R.，Invest Ophthalmol Vis Sci 32：1，46-51(1991))。 使用没有水银基污染物和牛源或细菌源污染物的高度纯化的sHASEGP对于眼内 方法是优选的。而且，考虑到其无牛病原体的纯度和降低的免疫原性风险，重组 的人sHASEGP相比屠宰场源制剂是优选的。最优选地，考虑聚乙二醇化的 sHASEGP。
[0560]因此，提供使用人sHASEGP的酶学方法来治疗哺乳动物眼的眼疾病。在 本发明的一个实施方式中，所述的sHASEGP被聚乙二醇化，以延长其在玻璃体内 的居留时间，并防止在局部被吸收。预防新血管形成和增加对视网膜具有毒性的 材料从玻璃体清除的速度，通过施用一定量的透明质酸酶来实现，所述量的透明 质酸酶有效地液化接受治疗的眼睛的玻璃体液，而不对眼睛产生毒性损害。玻璃 状液的液化增加了玻璃体腔的液体交换的速度。该交换的增加去除了造成眼科损 害和视网膜损害的那些物质和条件。
[0561]sHASEGP的整容美容用途
[0562]已经知道，透明质酸酶具有将基础物质的粘多糖长链解聚化的作用，所述 粘多糖长链可以保留住结合水，并且减慢——通过毛细压缩——有机液体的扩散， 该扩散消除代谢废物。与脂细胞的脂肪超载相关的水和废物的这种保留，构成了 典型的“猪皮(pigskin)”水肿或“桔皮(orange peel)”水肿。因此，该解聚作用 将粘多糖的长链切割成较短的链，由此消除了结合水，消除了废物，恢复了静脉 和淋巴循环，局部水肿也从而消失。
[0563]因此，经由皮下给药的sHASEGP的应用，优选用于除去所谓的脂肪团 (cellulite)的积聚过程中所涉及的糖胺聚糖，和促进淋巴流动。人sHASEGP优选用 于处理脂肪团，这是因为其能够去除所述的糖胺聚糖，而没有屠宰场源的蛋白的 促炎成分，而且它是高纯度的并且不太可能是免疫原性的。sHASEGP可以通过反 复的皮下注射进行给药、以药膏或乳液的形式透皮输送给药，或通过使用可注射 的缓释制剂进行给药，这样可以促进糖胺聚糖的持续降解，并防止它们的重新形 成。
[0564]器官移植
[0565]透明质素具有若干生物学效应，它们部分地涉及其分子尺寸(West，D.C.， Kumar，S.Exp.Cell.Res.183，179-196，1989)。器官中的透明质素的含量在该器官出 现炎症的不同症状下会有所增加。因此，在表征为炎症性免疫损伤例如牙槽炎 (Nettelbladt 0 et al，Am Rev Resp Dis 1989；139：759-762)和心急梗塞(Waldenstrom et al，J Clin Invest 1991；88(5)：1622-1628)的不同器官的组织中，已经表明透明质素 的浓度是增加的。其它的实例是在肾(Ha′llgren et al，J Exp Med 1990a；171： 2063-2076；Wells et al，Transplantation 1990；50：240-243)、小肠(Wallander et al， Transplant Int 1993；6：133-137)或心脏(Hallgren et al，J Clin Invest 1990b；85： 668-673)移植之后的同种异体移植排斥；或者病毒引起的心肌炎症(Waldenstrdm et al，Eur J Clin Invest 1993；23：277-282)。
[0566]发生与器官移植相关的间质水肿是移植手术领域中严重的问题。多达25％ 的移植会肿胀到导致功能暂时失去的程度。而且，在2-3％的情形中，肿胀导致了 肾的破裂，因此导致大出血。
[0567]sHASEGP可被用来降解器官移植中积聚的糖胺聚糖。这些糖胺聚糖的去除 促进了水从移植物中去除，并因此促进器官行使功能。这样，500-10,000单位/kg 范围内的剂量可被施用，以减少组织间隙压。
[0568]糖胺聚糖在脑中的病理性积聚
[0569]在大量脑脊髓病理状态下，透明质素水平被提高。在成年人中，脑脊髓透 明质素的水平在正常情况下小于200μg/L(Laurent et al，Acta Neurol Scand 1996 Sep； 94(3)：194-206)。在疾病例如脑膜炎、椎管狭窄、头部损伤和脑梗塞中，这些水平 可以提高到8,000μg/L以上。因此，sHASEGP的给药(例如通过将sHASEGP、聚 乙二醇化的sHASEGP或超唾液酸化的sHASEGP鞘内输送或全身性注射)可以被 用来降解其水平危险地提高的底物。
[0570]头部创伤之后，脑中缺乏有效的淋巴也可导致危及生命的水肿。透明质素 积聚是HA合成酶介导的合成增加和降解减少的结果。尽管透明质素的积聚最初 可以提供有益的效果——增加受伤组织中的水含量，以帮助白细胞外渗，但是持 续的积聚可能是致命的。因此，将人sHASEGP施用给遭受头部创伤的患者，可以 去除组织透明质素积聚和与它相结合的水。人sHASEGP可以通过分流管(shunt) 进行鞘内给药，或者可选地，sHASEGP、聚乙二醇化的sHASEGP或超唾液酸化 的sHASEGP(优选其人类形式)可以被静脉内给药，以到达脑组织。
[0571]在中风中发生脑缺血和脑再灌注后，透明质素含量通常增加，这很大程度 上是由于HA合成酶的表达增加和分解代谢减少。离子泵失效并且血浆泄漏入间 隙中，导致流体滞留，如果滞留的流体不能被淋巴系统恰当地清除掉，将导致组 织坏死。一些团体企图通过阻断血管渗透，来防止缺血再灌注之后的间隙流体积 聚。然而，一旦流体已经外渗，阻止血管渗透性则可能阻止了水肿的消解，并使 病症恶化。如上面提到的，人sHASEGP可鞘内给药(例如通过分流管)，或者 sHASEGP、聚乙二醇化的sHASEGP或超唾液酸化的sHASEGP(优选人sHASEGP) 可以被静脉内给药，以到达脑组织。
[0572]人sHASEGP也可以用于治疗与脑瘤相关的水肿，特别是与多形成胶质细 胞瘤相关的水肿。与脑瘤相关的水肿由透明质素在肿瘤附近的非癌症部分的脑中 积聚所产生。将透明质酸酶投药于透明质素积聚的位置(例如通过静脉注射或通过 分流管)，通过降解这些位置过量的透明质素可以缓解与此种恶性相关的水肿。因 此，透明质酸酶能成功地治疗脑瘤，不但减少了肿瘤块，抑制肿瘤生长和/或转移， 而且也可用于缓解与该恶性相关的水肿。可以用与施用牛睾丸透明质酸酶治疗水 肿相类似的方式(参见例如Sa Earp Arq.Braz.Med.44：217-20)，将人sHASEGP给 药以治疗水肿。
[0573]不被限于具体的应用或作用机制，sHASEGP可通过下述的一项或多项潜在 地缓解缺血或出血中风和/或其它的CNS损伤病症：(i)通过减少颅内压而增加受 损组织的氧合作用；(ii)促进凝块溶解和毒性代谢重吸收；(iii)抑制白血球外渗 入梗塞或出血区域(例如通过除去为CD44受体的透明质素)；(iv)促进受损组织 的神经再生；或(v)提高脑血管发生。
[0574]心血管疾病中的糖胺聚糖积聚的处理
[0575]已经显示，在动物模型中，在实验性心肌梗塞之后施用透明质酸酶可以减 少梗塞大小(Maclean，et.al Science 1976 Oct 8；194(4261)：199-200)。被提出的牛透 明质酸酶减少动物的梗塞大小的机制是通过缺血再灌注之后发生的透明质酸积聚 的减少。梗塞大小的减小被认为是由淋巴排泄(lymph drainage)增加和组织氧合 作用增加和心肌水含量减少引起的。尽管可以在动物模型中梗塞大小的减小可以 获得，但是该好处并没有在更大的针对人的临床研究中得以实现。牛睾丸透明质 酸酶在动物和人中具有非常短的血清半衰期，大约3分钟(Wolf，et.al.，J Pharmacol Exp Ther 1982 Aug；222(2)：331-7)。该短暂的半衰期是由于末端甘露糖残基容易被 网状内皮系统的清道夫受体识别的缘故。尽管小的动物由于其较小的血管床的原 因可能从透明质酸酶受益，但也需要具有更长的半衰期的酶。由于不存在识别唾 液酸化作用的清道夫受体，所以超唾液酸化的sHASEGP具有更好的药物动力学特 性。在100-200,000单位/kg范围内的剂量的超唾液酸化sHASEGP可以被用于帮助 分解缺血再灌注后过量的透明质素，并减少梗塞大小。
[0576]超唾液酸化sHASEGP也可以被用来限制动脉硬化的冠脉斑块(coronary plaques)。此种斑块积聚糖胺聚糖并介导巨噬细胞和泡沫细胞粘附。Kolodgie et al， Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002 Oct 1；22(10)：1642-8。超唾液酸化sHASEGP 的给药可以被用来少斑块形成。考虑以100-100,000U/kg的剂量反复地将透明质 酸酶投药，利用具有低免疫原性风险和增加的半衰期的人重组蛋白的需求将导致 斑块明显减少。
[0577]外周组织坏死的治疗
[0578]组织坏死发生在因静脉机能不全而引起的许多疾病中。缺少足够的氧合是 组织再生的主要障碍之一。已经证明，动脉内透明质酸酶治疗显著地改善患有外 周动脉阻塞性疾病的患者的临床现象(Elder et.al，Lancet(1980)648-649)。 sHASEGP可以以10-200,000单位的剂量动脉内注射，一周3-5次。
[0579]麻醉剂和其它药理剂向哺乳动物组织的输送的增强
[0580]屠宰场来源的透明质酸酶通常在眼手术之前的局部麻醉中被用来进行球周 阻断(peribulbar block)。该酶的存在避免了对其它阻断的需求并加速了运动不能(眼 睛运动的丧失)的发作。球周和特农下阻断是透明质酸酶在眼科手术中最常见的应 用。自从WydaseTM停产以来，复视和下垂增加的报告就已经被报导与球周阻断有 关(Brown et al J Cataract Refract Surg 1999；25：1245-9)。
[0581]由于惠氏公司(Wyeth’s)停产WydaseTM，牛睾丸来源的透明质酸酶材料现 在由复合药剂供应。然而，对于使用临时的复合无菌产品，存在着若干顾虑。 http://www.ashp.org/shortage/hyaluronidase.cfm？cfid＝11944667&CFToken＝9426953-r ef#ref。复合制剂并不是FDA批准的产品。同样地，FDA也没有对该制造方法的 质量和一致性进行控制。
[0582]10-500单位的sHASEGP可以直接与5ml的2％利多卡因(Xylocaine)、5ml 的0.5％布比卡因(Marcaine)以及可任选的1∶200,000的肾上腺素相混合。sHASEGP 可被用来增加运动不能的发作并除去对其它的阻断的需要。sHASEGP对于眼睑整 容和脸部提整(face lift)中的整容手术时的运动不能也是理想的。sHASEGP也可 以在此种手术程序之后被使用，以扩散抗炎症剂和减少组织肿胀。
[0583]sHASEGP也可以与缓冲溶液例如碳酸氢盐相混合，以预防在注射程序中的 不适。sHASEGP也可以与用于裂伤的麻醉剂相混合，以减少注射所需要的材料的 总体积并减少因组织肿胀引起的疼痛。
[0584]使用sHASEGP促进药理剂和其它药剂的分散
[0585]如本文所述，本发明的组合物和方法可被用来促进或加强将麻醉剂和其它 药理剂(例如，本文涉及的多种类别的药学上有效的药剂的成员)输送到任何种 类的哺乳动物的活体中。就此方面而言，sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构 域可被用来帮助扩散，并且因此促进小分子药理剂以及较大分子药理剂的输送， 所述小分子药理剂例如示例的麻醉剂、抗感染剂和消炎药，所述较大分子药理剂 例如蛋白质(包括例如酶、单克隆抗体和类似物)、核酸(包括脱氧核糖核酸(例 如基因和反义分子)和核糖核酸(包括RNA干扰分子(RNAi)和类似物))和可 包括这些成分的组合的大分子组合物(包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类和 脂基分子及类似物的组合)。作为举例说明而不是作为限制，当间隙区在之前或同 时暴露于本文描述和说明的sHASEGP，直径范围在从小于大约10nm到大约 500nm，特别是从大约20到200nm的分子和大分子复合体，很可能在通过间隙区 的输送中表现出显著的提高。
[0586]不被限定于作用机制的特定理论，相信本发明的sHASEGP主要通过水解 包围哺乳动物细胞的胞外基质内的糖胺聚糖以生成孔型通路或通道来行使其功 能，所述通路或通道有助于暴露的胞外基质内的分子的扩散或其它运动；并且进 一步，这样部分的胞外基质的渗透化作用对那些没有大到被胞外基质内其它大分 子成分——例如胶原蛋白的拱形网络——阻碍的分子的扩散或“散布”具有最大 的效果。在特定组织环境中给定的sHASEGP或其可溶性人透明质酸酶结构域可得 到的散布效果(spreading effect)的程度，可通过评估测试sHASEGP或其结构域 对测试组织中不同大小的可检测测试分子(例如荧光标记或其它标记的珠子)的 扩散的影响容易地进行确定，如本文阐述，该评估是在使用sHASEGP或其结构域 在一定的时间和浓度下进行或不进行预处理或同时处理的情况下进行的。作为举 例说明，在将重组rHuPH20皮下注射入鼠的侧部皮肤的情况下，荧光标记珠子的 扩散测试(如本文示例的)表明，对于直径小于大约500nm的珠子，对扩散的影 响是最大的。
[0587]进一步相信更大的大分子(以500nm或更大的珠子为例)在扩散中不但被 它们较大的尺寸所阻碍，而且被与胞外基质中相对更加开放的其它网络的潜在相 互作用所阻碍，所述网络例如由间质胶原蛋白条带形成的网络。另外，与所述的 动物源透明质酸酶不同，本发明当前优选的sHASEGP不包含促进外渗的试剂或污 染剂——例如胶原蛋白酶(其可开放更大的通道)——或者可激发免疫反应的其 它污染物。在需要更大的孔或通道的具体的应用中，sHASEGP或其可溶性人透明 质酸酶结构域可以优选地与其它基质降解酶——例如有助于更大尺寸的大分子复 合体或细胞的进一步散布的胶原蛋白酶——的相对纯的形式联合。对于大多数应 用，使用可促进小于约500nm大小的大分子，更优选的小于约200nm大小的大分 子的通透性的试剂是非常有利的，理由是所述试剂基本上不促进经过处理的组织 内的细胞的运动，但是其可以促进较小的复合物和试剂通过。
[0588]如本文描述和说明的，sHASEGP可被用来增强将多种其它药理剂和/或其 它药剂输送到人体内的组织(包括例如眼后部的典型的很难触及的组织)。不希望 被理论束缚，相信sHASEGP可通过潜在增强药剂在组织内的扩散或渗透，和/或 通过增加组织间隙的总体流体流动进而增强的对流运输，增强许多此类药剂的药 物动力学和/或药效动力学特性。以举例说明为目的(而不是限制)，可以与本发明 的sHASEGP相联合(例如通过与一种或多种sHASEGP共同配制而联合，或者通 过与一种或多种sHASEGP共同给药(其可在施用药剂之前、同时或之后给药)而 联合)的用于治疗影响眼睛的各种疾病的药理剂的实例包括，例如血管发生抑制 剂(例如制管张素、乙酸阿奈可他(anecortave acetate)(例如RETAANETM)、内 皮抑制素、血小板反应蛋白(例如血小板反应蛋白-1和血小板反应蛋白-2)、抗血 管生成抗体和其它抗血管生成剂或血管靶向剂(VTA)(例如抗VEGF抗体例如贝 伐单抗(bevacizumab)(AVASTINTM)、羧基酰胺三唑(CAI)、白细胞介素-12 (IL-12)、OLTIPRAZTM(5-[2-吡嗪基]-4-甲基-1，2-3-硫酮)、SU-5416、TNP-470、 沙利度胺(thalidomide))和类似物)；抗白内障和抗糖尿病视网膜病物质(例如醛 糖还原酶抑制剂(ARI)诸如托瑞司他(tolrestat)(例如ALREDASETM)和唑泊司 他(zopolrestat)(例如ALONDTM)、赖诺普利(lisinopril)、依拉普利(enalapril)、 statil和硫醇交联物质以及类似物)；抗炎剂(包括如本文描述的和本领域的甾体抗 炎剂和非甾体抗炎剂)；抗感染剂(包括下面描述的化合物，以及许多其眼科制品 (opthalmic preparation)，例如BLEPHAMIDETM、CILOXANTM、POLYTRIMTM、 QUIXINTM、TOBRADEXTM、VIGAMOXTM、ZYMARTM)；β-肾上腺素能阻断剂(例 如倍他洛尔(betaxolol)(BETOPTICSTM)、噻吗洛尔(timolol)(例如BETIMOLTM 和TIMOPTICTM)和其组合(例如噻吗洛尔和碳酸酐酶抑制剂诸如杜塞酰胺 (dorzolamide)(例如COSOPTTM)；碳酸酐酶抑制剂(例如乙酰唑胺、布林佐胺 (brinzolamide)(例如AZOPTTM)、双氯酚酰胺、杜塞酰胺(dorzolamide)(例如 TRUSOPTM和与其它药剂的组合，例如COSOPTTM)、醋甲唑胺和类似物)；扩瞳 药(例如硫酸阿托品、环喷托酯、后马托品、东莨菪碱、托吡卡胺、尤卡托品和 羟基安菲他命以及类似物)；光动力学疗法药剂(例如维替泊芬(verteporfin)(例 如VISUDYNETM)；前列腺素类似物(例如比马前列素(bimatoprost)(例如 LUMIGANTM)、拉坦前列素(Latanoprost)(例如XALATANTM)和曲伏前列腺素 (travoprost)(例如TRAVATANTM)；拟交感神经剂(例如溴莫尼定(bimatoprost) (例如ALPHAGANTMP)；以及其组合(例如β-肾上腺素能阻断剂和碳酸酐酶抑 制剂的组合，如在COSOPTTM中)；和大量其它类的药剂，例如如下面或本文其它 地方描述的和/或本领域已知的或新开发的抗感染剂和各种其它生理调节剂。
[0589]可与本发明sHASEGP联合的大量其它药理剂(例如通过与一种或多种 sHASEGP联合配制而联合，或者通过与一种或多种sHASEGP联合给药(其可在 施用药剂之前、同时或之后给药)而联合)，可被用来治疗影响眼或影响机体的其 它多种组织的各种疾病。以举例说明为目的(而不是限制)，这类药剂包括，例如： 麻醉剂；抗代谢药、抗瘤剂和其它抗癌药；抗病毒药；抗感染剂，其包括抗菌药 和其它抗生素、抗真菌剂和其它抗感染剂；免疫调节剂；甾体抗炎剂和非甾体抗 炎剂；β-阻断剂；拟交感神经剂；Ducosanoid、前列腺素和前列腺素类似物；缩瞳 药、类乙酰胆碱功能药和抗胆碱酯酶；抗过敏剂和解充血药；激素剂；生长因子； 其它合成和生物学来源药剂(biologically derived agent)；及它们的组合。具有这 类特性的药剂——其可在新型药理学制剂的配方中和/或现有药理学试剂的重新配 方中与sHASEGP相结合——的一些说明性实例，包括上面和下面描述的多类药剂 (以及被常规用作诊断、预防或治疗各种疾病的其它已知的和新颖的药剂)：
[0590]麻醉剂，特别是非吸入局部麻醉剂(例如氨布卡因(ambucaines)；阿莫卡因 (amoxecaines)；阿米洛卡因(amylocaines)；阿托卡因(aptocaines)；阿替卡因 (articaines)；奥布卡因(benoxinates)；苯甲醇；苯佐卡因(benzocaines)；贝托卡因 (betoxycaines)；珍尼柳酯(biphenamines)；丁吖卡因(bucricaines)；布美卡因 (bumecaines)；布比卡因(bupivacaines)；布他卡因(butacaines)；氨苯丁酯(butambens)； 布坦卡因(butanilicaines)；卡比唑卡因(carbizocaines)；氯普鲁卡因(chloroprocaine)； 氯丁卡因(clibucaines)；氯达卡因(clodacaines)；可卡因(cocaines)；地昔卡因 (dexivacaines)；二胺卡因(diamocaines)；地布卡因(dibucaines)；达克罗宁 (dyclonines)；依鲁卡因(elucaines)；依替卡因(etidocaines)；尤普罗辛(euprocins)； 苯氧卡因(fexicaines)；福莫卡因(fomocaines)；heptacaines；海克卡因(hexylcaines)； 羟普鲁卡因(hydroxyprocaines)；羟丁卡因(hydroxytetracaines)；氨苯异丁酯 (isobutambens)；凯托卡因(ketocaines)；亮氨卡因(leucinocaines)；利多卡因 (lidocaines)；甲哌卡因(mepivacaines)；美普卡因(meprylcaines)；octocaines(奥他卡 因)；奥索卡因(orthocaines)；奥昔卡因(oxethacaines)；奥布卡因(oxybuprocaines)； 非那卡因(phenacaines)；哌诺卡因(pinolcaines)；哌罗卡因(piperocaines)；匹多卡因 (piridocaines)；聚多卡醇(polidocanols)；普莫卡因(pramocaines)；丙胺卡因 (prilocaines)；普鲁卡因(procaines)；丙泮卡因(propanocaines)；丙哌卡因 (propipocaines)；丙氧卡因(propoxycaines)；丙美卡因(proxymetacaines)；吡咯卡因 (pyrrocaines)；夸他卡因(quatacaines)；奎尼卡因(quinisocaines)；利索卡因 (risocaines)；罗多卡因(rodocaines)；罗哌卡因(ropivacaines)；水杨醇；suicaines； 丁卡因(tetracaines)；曲喷卡因(trapencaines)；三甲卡因(trimecaines))和类似物；以 及各种其它非吸入麻醉剂(例如阿法沙龙(alfaxalones)；阿莫拉酮(amolanones)；乙 苯啶(etoxadrols)；芬太尼(fentanyls)；氯胺酮(ketamines)；左屈尔(levoxadrols)； 美西妥拉(methiturals)；美索比妥(methohexitals)；咪达唑仑(midazolams)；米那索 龙(minaxolones)；丙泮尼地(propanidids)；丙泊酯(propoxates)；丙吗卡因 (pramoxines)；丙泊酚(propofols)；瑞芬太尼(remifentanyls)；舒芬太尼(sufentanyls)； 替来他明(tiletamines)；佐拉敏(zolamine)和类似物)；
[0591]抗代谢药(例如叶酸类似物(诸如二甲叶酸(denopterins)、乙基去氮氨蝶呤 (依达曲沙，edatrexates)、甲氨蝶呤(methotrexates)、吡曲克辛(piritrexims)、蝶酰三 谷氨酸(蝶罗呤，pteropterins)、雷替曲塞(Tomudex)、三甲氧蝶呤(三甲曲沙， trimetrexates))、嘌呤类似物(诸如克拉立滨(cladribines)、氟达拉滨(fludarabines)、 6-巯基嘌呤(6-mercaptopurines)、硫唑嘌呤胺(thiamiprines)、thiaguanines)和嘧啶类 似物(诸如环胞啶(安西他滨，ancitabines)、阿扎胞苷(azacitidines)、6-氮尿苷 (6-azauridines)、卡莫氟(carmofurs)、阿糖胞苷(cytarabines)、去氧氟尿苷 (doxifluridines)、乙嘧替氟(emitefurs)、山嵛酰阿糖胞苷(依诺他滨，enocitabines)、 氟尿苷(floxuridines)、氟尿嘧啶(fluorouracils)、双氟脱氧胞苷(吉西他滨， gemcitabines)、替加氟(tegafurs))和类似物；
[0592]抗瘤剂(例如阿克拉霉素(aclacinomycins)、放线菌素(actinomycins)、阿霉 素(adriamycins)、安西他滨(ancitabines)、氨曲霉素(anthramycins)、阿扎胞苷 (azacitidines)、氮丝氨酸(azaserines)、6-氮尿苷(6-azauridines)、比生群(双蒽生， bisantrenes)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycins)、卡莫氟(carmofurs)、 卡莫司汀(carmustines)、卡柔比星(carubicins)、嗜癌素(carzinophilins)、色霉素 (chromomycins)、顺铂(cisplatins)、克拉立滨(cladribines)、阿糖胞苷(cytarabines)、 放线菌素D(dactinomycins)、柔红霉素(daunorubicins)、二甲叶酸(denopterins)、6- 重氮基-5-氧-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucines)、去氧氟尿苷(doxifluridines)、 多柔比星(doxorubicins)、依达曲沙(edatrexates)、乙嘧替氟(emitefurs)、依诺他滨 (enocitabines)、fepirubicins、氟达拉滨(fludarabines)、氟尿嘧啶(fluorouracils)、吉西 他滨(gemcitabines)、伊达比星(idarubicins)、loxuridines、美诺立尔(menogarils)、6- 巯基嘌呤(6-mercaptopurines)、甲氨蝶呤(methotrexates)、光辉霉素(mithramycins)、 丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acids)、诺拉霉素(nogalamycins)、橄 榄霉素(olivomycines)、培洛霉素(peplomycins)、吡柔比星(pirarubicins)、吡曲克辛 (piritrexims)、普卡霉素(plicamycins)、泊非霉素(porfiromycins)、蝶罗呤(pteropterins)、 嘌罗霉素(puromycins)、维生素A酸(retinoic acids)、链黑霉素(streptonigrins)、链脲 菌素(streptozocins)、呋喃脲嘧啶(tagafurs)、他莫昔芬(tamoxifens)、硫唑嘌呤胺 (thiamiprines)、硫鸟嘌呤(thioguanines)、曲安西龙(triamcinolones)、三甲曲沙 (trimetrexates)、杀结核菌素(tubercidins)、长春碱(vinblastines)、长春新碱 (vincristines)、净司他丁(zinostatins)、佐柔比星(zorubicin)和类似物)(也参见本文 描述的其它示例性抗癌药)；
[0593]抗病毒药(例如阿巴卡韦(abacavirs)(例如ZIAGENTM)、阿昔洛韦(acyclovirs) (例如ZOVIRAXTM)、金刚烷胺和金刚乙胺(amantadines和rimantadines)(例如 SYMMETRELTM)、氨普那韦(amprenavirs)(例如AGENERASETM)、西多福韦 (cidofovirs)(例如VISTIDETM)、地拉韦啶(delavirdines)(例如RESCRIPTORTM)、双 脱氧胞甙(didanosines)(例如VIDEXTM)、依法韦仑(efavirenz)(例如SUSTIVATM)、泛 昔洛韦(famciclovirs)(例如FAMVIRTM)、福米韦生(fomivirsens)(例如 VITRAVENETM)、膦甲酸(foscamets)(例如FOSCAVIRTM)、更昔洛韦(ganciclovirs)(例 如CYTOVENETM)和缬更昔洛韦(valganciclovirs)(例如VALCYTETM)、碘苷 (idoxuridines)(例如HERPLEXTM)、茚地那韦(indinavirs)(例如CRIXIVANTM)、干扰 素(interferons)(例如ALFERONNTM、INTRONTM A、PEGASYSTM、PEG-INTRONTM、 ROFERON-ATM以及干扰素和其它抗病毒药例如ROBETRONTM和 PEGASYS/COPEGUSTM)、拉米夫定(lamivudines)(例如3TCTM和EPIVIRTM)以及拉 米夫定和齐多夫定(zidovudines)的组合(例如COMBIVIRTM)、单克隆抗体例如帕利 珠单抗(Palivizumabs)(诸如SYNAGISTM)、奈非那韦(nelfmavirs)(例如 VIRACEPTTM)、奈韦拉平(nevirapines)(例如VIRAMUNETM)、奥塞米韦 (oseltamivirs)(TAMIFLUTM)、喷昔洛韦(penciclovirs)(例如DENAVIRTM)、普来可那 利(pleconarils)、利巴伟林(ribavirins)(例如COPEGUSTM和REBETOLTM)、金刚乙胺 (rimantadines)(例如FLUMADINETM)、利托那韦(ritonavirs)(NORVIRTM)、沙奎那韦 (saquinavirs)(例如INVERSETM)、司他夫定(stavudines)(d4T，例如ZERITTM)、伐 昔洛韦(valacyclovirs)(例如VALTREXTM)、阿糖腺苷(vidarabines)(例如VIRA-ATM)、 扎西他滨(zalcitabines)(例如HWIDTM)、扎那米韦(zanamivirs)(RELENZATM)、齐多 夫定(zidovudines)(例如AZT，RETROVIRTM)以及类似物)；
[0594]抗菌药和其它抗生素包括，例如氨基苷类抗生素(Aminoglycosides)；酰胺醇 (Amphenicols)；袢霉素(Ansamycins)；碳头孢烯(Carbacephems)；碳青霉烯 (Carbapenems)；头孢菌素或头孢烯(Cephalosporins或Cephems)；头霉素 (Cephamycins)；棒烷(克拉维烷，Clavams)；环式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮内酯类 (Ketolides)；林可胺类药物(Lincosamides)；大环内酯类(Macrolides)；单环内酰胺 (Monobactams)；硝基呋喃(Nitrofurans)；氧头孢烯(Oxacephems)；唑烷酮 (Oxazolidinones)；青霉烯(Penems)、硫霉素(thienamycins)和混杂的β-内酰胺；青 霉素(Penicillins)；多肽抗生素；喹诺酮；氨磺酰；砜；四环素(Tetracyclines)；以及 下面提供了其示例性成员的其它抗生素(和在本领域已知或新开发的其它抗生 素)：
[0595]氨基苷类抗生素(Aminoglycosides)(例如阿米卡星(amikacins)、阿拉伯霉素 (apramycins)、阿贝卡星(arbekacins)、班贝霉素(bambermycins)、丁胺菌素(butirosins)、 地贝卡星(dibekacins)、双氢链霉素(dihydrostreptomycins)、福提霉素(fortimicins)、 庆大霉素(gentamicins)、异帕米星(isepamicins)、卡那霉素(kanamycins)、小诺米星 (micronomicins)、新霉素(neomycins)、十一烯酸新霉素(neomycin undecylenates)、 奈替米星(netilmicins)、巴龙霉素(paromomycins)、核糖霉素(ribostamycins)、西索 米星(sisomicins)、大观霉素(spectinomycins)、链霉素(streptomycins)、妥布霉素 (tobramycins)、丙大观霉素(trospectomycins)以及类似抗生素)；
[0596]酰胺醇(amphenicol)(例如叠氮氯霉素(azidamfenicols)、氯霉素 (chloramphenicols)、氟苯尼考(florfenicols)、甲砜霉素(thiamphenicols)和类似物)；
[0597]安沙霉素类(ansamycins)(例如利福米特(rifamides)、利福平(rifampins)或利福 平(rifampicins)(诸如RIFADINTM、RIFADIN IVTM以及包括利福平的组合，例如利 福平/异烟肼(例如RIFAMATETM)和利福平/异烟肼/吡嗪酰胺(例如RIFATERTM)、利 福霉素(rifamycins)、利福喷汀(rifapentines)、利福昔明(rifaximins)(例如XIFAXAMTM) 以及类似物)；
[0598]碳头孢烯类(carbacephems)(例如氯碳头孢(loracarbefs)、3-氯-1-碳头孢烯、3- 硫代碳头孢烯、美国公开的专利申请第20050004095号描述的碳头孢烯以及类似 物)；
[0599]碳青霉烯类(carbapenems)(例如比阿培南(biapenems)、亚胺培南(imipenems)、 美罗培南(meropenems)、帕尼培南(panipenems)以及类似物)；
[0600]头孢菌素(Cephalosporins)或头孢烷(cephams)(例如头孢克洛(cefaclors)(例如 CECLORTM)、头孢羟氨苄(cefadroxils)、头孢孟多(cefamandoles)、头孢曲秦 (cefatrizines)、头孢西酮(cefazedones)、头孢唑林(cefazolins)(例如ANCEFTM)、头孢 卡平酯(cefeapene pivoxils)、头孢利定(cefelidins)、头孢地尼(cefdinirs)、头孢托仑 (cefditorens)、头孢吡肟(cefepimes)(例如MAXIPIMETM)、头孢他美(cefetamets)、头 孢克肟(cefiximes)、头孢甲肟(cefmenoximes)、头孢美唑(cefmetazoles)、头孢地秦 (cefodizimes)、头孢尼西(cefonicids)、头孢哌酮(cefoperazones)、头孢雷特 (ceforanides)、头孢噻肟(cefotaximes)、头孢替安(cefotiams)、头孢替坦(cefotetans)、 头孢西丁(cefoxitins)、头孢唑兰(cefozoprans)、头孢咪唑(cefpimizoles)、头孢匹胺 (cefpiramides)、头孢匹罗(cefpiromes)、头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetils)、头孢丙 烯(cefprozils)、头孢沙定(cefroxadines)、头孢磺啶(cefsulodins)、头孢他啶 (ceftazidimes)(例如FORTAZTM)、头孢特仑(cefterams)、头孢替唑(ceftezoles)、头孢 布烯(ceftibutens)、头孢唑肟(ceftizoximes)、头孢曲松(ceftriaxones)(例如 ROCEPHINTM)、头孢呋辛(cefuroximes)(例如ZINACEFTM)、头孢唑南(cefuzonams)、 头孢赛曲(cephacetriles)、头孢氨苄(cephalexins)、头孢来星(cephaloglycins)、头孢 噻啶(cephaloridines)、头孢菌素、头孢噻酚(cephalothins)、头孢匹林(cephapirins)、 头孢拉定(cephradines)、pivcefalexins以及类似物)；
[0601]头霉素(Cephamycins)(例如头孢拉宗(cefbuperazones)、头孢美唑 (cefinetazoles)、头孢米诺(cefininoxes)、头孢替坦(cefotetans)、头孢西丁 (cefoxitins)(例如MEFOXINTM)以及类似物)；
[0602]棒烷(克拉维烷，Clavams)(例如棒酸(克拉维酸，clavulinic acid)或棒酸酯(克 拉维酸酯，clavulanates)、2-和3-苯基棒烷以及包括这些药剂的组合，例如阿莫西 林/棒酸酯(amoxicillin/clavulanates)(例如AUGMENTINTM)和替卡西林/棒酸酯 (ticarcillin/clavulanates)(例如TIMENTINTM)以及类似物)；
[0603]环式脂酰肽(cyclic lipopeptides)(例如达托霉(daptomycins)(例如 CUBICINTM)；
[0604]二氨基嘧啶，例如2，4-二氨基嘧啶(诸如溴莫普林(brodimoprims)、四氧普林 (tetroxoprims)、甲氧苄啶(trimethoprims)以及类似物)；
[0605]酮内酯类(Ketolides)(例如替利霉素(telithromycins)(诸如KETEKTM)和桥式 二环酮内酯类(例如Enanta EP-013420和6-11副环(bycyclic)酮内酯类，如在美国公 开专利申请20040157787中所述)以及类似物)；
[0606]林可胺类药物(Lincosamides)(例如克林霉素(clindamycins)、林可霉素 (lincomycins)以及类似物)；
[0607]大环内酯类(Macrolides)(例如阿奇霉素(azithromycins)(诸如 ZITHROMAXTM)、卡波霉素(carbomycins)、克拉霉素(clarithromycins)、地红霉素 (dirithromycins)、红霉素(erythromycins)、醋硬脂红霉素(erythromycin acistrates)、 依托红霉素(erythromycin estolates)、葡庚糖酸红霉素(erythromycin glucoheptonates)、乳糖酸红霉素(erythromycin lactobionates)、司丙红霉素 (erythromycin propionates)、硬脂酸红霉素(erythromycin stearates)、交沙霉素 (josamycins)、柱晶白霉素(leucomycins)、麦迪霉素(midecamycins)、美欧卡霉素 (miokamycins)、竹桃霉素(oleandomycins)、普利霉素(primycins)、罗他霉素 (rokitamycins)、罗沙米星(玫瑰霉素，rosaramicins)、罗红霉素(roxithromycins)、螺 旋霉素(spiramycins)、醋竹桃霉素(troleandomycins)和类似物)；
[0608]单环内酰胺(Monobactams)(例如氨曲南(aztreonams)(诸如AZACTAMTM)、卡 芦莫南(carumonams)、替吉莫南(tigemonams)和类似物)；
[0609]硝基呋喃(例如呋喃他酮(furaltadones)、呋唑氯铵(furazolium chlorides)、硝 呋拉定(nifuradenes)、硝呋太尔(nifuratels)、硝呋复林(nifurfolines)、硝呋吡醇 (nifurpirinols)、硝呋拉嗪(nifurprazines)、硝呋妥因醇(nifurtoinols)、呋喃妥因 (nitrofurantoins)和类似物)；
[0610]氧头孢烯类(Oxacephems)(例如氟氧头孢(flomoxefs)、拉氧头孢(latamoxefs) 或者拉氧头孢(moxalactams)(诸如MOXAMTM)和类似物)；
[0611]唑烷酮(Oxazolidinones)(例如利奈唑胺(linezolids)(诸如ZYVOXTM)、羟哌 酮(eperezolids)和类似物)；
[0612]青霉烯(Penems)、硫霉素(thienamycins)和混杂的β-内酰胺(miscellaneous beta-lactams)(例如厄他培南(ertapenems)(诸如INVANZTM)、亚胺培南(imipenems)(诸 如具有西司他丁(Cilastatin)，如在PRIMAXINTM中)、美罗培南(meropenems)(诸如 MERREMTM)和类似物)；
[0613]青霉素(例如甲亚胺青霉素(amdinocillins)、氮苄脒青霉素双酯(amdinocillin pivoxils)、阿莫西林(amoxicillins)、氨苄西林(ampicillins)(包括它们的组合(诸如含 有sublactams，如在UNASYNTM中))、阿帕西林(apalcillins)、阿扑西林(aspoxicillins)、 阿度西林(azidocillins)、阿洛西林(azlocillins)、巴氨西林(bacampicillins)、苄基青霉 素酸(benzylpenicillinic acids)、苄基青霉素钠(benzylpenicillin sodiums)、羧苄西林 (carbenicillins)、卡茚西林(carindacillins)、氯甲西林(clometocillins)、氯唑西林 (cloxacillins)、coamoxiclavs、环己西林(cyclacillins)、双氯西林(dicloxacillins)、依 匹西林(epicillins)、芬贝西林(fenbenicillins)、氟氯西林(floxacillins)、海他西林 (hetacillins)、仑氨西林(lenampicillins)、美坦西林(metampicillins)、甲氧西林钠 (methicillin sodiums)、美洛西林(mezlocillins)、萘夫西林(nafcillins)、苯唑西林 (oxacillins)、培那西林(penamecillins)、氢碘酸喷沙西林(penethamate hydriodides)、 苯明青霉素G(penicillin G benethamines)、苄星青霉素G(penicillin G benzathines)(诸如BICILLINTM L-A)、青霉素G二苯甲胺盐(penicillin G benzhydrylamines)、青霉素G钙(penicillin G calciums)、哈胺青霉素G(penicillin G hydrabamines)、青霉素G钾(penicillin G potassiums)、普鲁卡因青霉素G(penicillin G procaines)、青霉素N(penicillin N)、青霉素O(penicillin O)、青霉素V(penicillin V)、苄星青霉素V(penicillin V benzathines)、哈胺青霉素V(penicillin V hydrabamines)、青哌环素(penimepicyclines)、非奈西林钾(phenethicillin potassiums)、 哌拉西林(piperacillins)(包括它们的组合(例如含有β-内酰胺酶抑制剂例如 tazobactam，如在ZOSYNTM中))、匹氨西林(pivampicillins)、丙匹西林(propicillins)、 喹那西林(quinacillins)、磺苄西林(sulbenicillins)、舒他西林(sultamicillins)、酞氨西 林(talampicillins)、他唑西林(tazocillins)、替莫西林(temocillins)、替卡西林 (ticarcillins)(诸如含有克拉维酸酯(clavulanates)，如在TIMENTINTM中)和类似物)；
[0614]多肽抗生素(例如安福霉素(amphomycins)、杆菌肽(bacitracins)、卷曲霉素 (capreomycins)、粘菌素(colistimethates)(诸如COLI-MYCINTM M)、粘杆菌素 (colistins)、持久杀菌素(enduracidins)、恩维霉素(enviomycins)、夫沙芬净 (fusafungines)、短杆菌肽(gramicidins)、米卡霉素(mikamycins)、多粘菌素 (polymyxins)、普那霉素(pristinamycins)(以及普那霉素衍生物例如奎奴普丁 (quinupristins)和达福普汀(dalfopristins)(诸如SYNERCIDTM))、利托菌素 (ristocetins)、替考拉宁(teicoplanins)、硫链丝菌肽(thiostreptons)、结核放线菌素 (tuberactinomycins)、短杆菌酪肽(tyrocidines)、短杆菌素(tyrothricins)、万古霉素 (vancomycins)、紫霉素(viomycins)、维吉霉素(virginiamycins)、杆菌肽锌(zinc bacitracins)和类似物)；
[0615]喹诺酮(包括氟喹诺酮(fluoroquinolones)和类似物)(例如甲磺酸阿拉曲伐沙 星(alatrofloxacin mesylates)、西诺沙星(cinoxacins)、环丙沙星(ciprofloxacins)(诸如 CIPROTM)、克林沙星(clinafloxacins)、二氟沙星(difloxacins)、依诺沙星(enoxacins)、 氟罗沙星(fleroxacins)、氟甲喹(flumequines)、加替沙星(gatifloxacins)(例如 TEQUINTM)、格帕沙星(grepafloxacins)、左氧氟沙星(levofloxacins)(诸如 LEVAQUINTM)、洛美沙星(lomefloxacins)、米洛沙星(miloxacins)、马波沙星 (moxyfloxacins)(诸如AVELOXTM)、那氟沙星(nadifloxacins)、萘啶酸(nalidixic acids)、 诺氟沙星(norfloxacins)、氧氟沙星(ofloxacins)、喹酸(oxolinic acids)、帕珠沙星 (pazufloxacins)、培氟沙星(pefloxacins)、吡哌酸(pipemidic acids)、吡咯酸(piromidic acids)、罗索沙星(rosoxacins)、芦氟沙星(rufloxacins)、司帕沙星(sparfloxacins)、替 马沙星(temafloxacins)、托氟沙星(tosufloxacins)、甲磺酸曲伐沙星(trovafloxacin mesylates)和类似物)；
[0616]氨磺酰(Sulfonamides)(例如磺胺乙酰甲氧吡嗪(acetyl sulfamethoxypyrazines)、苄磺胺(benzylsulfamides)、氯胺B(chloramine-B)、氯胺T (chloramine-T)、二氯胺T(dichloramine T)、甲酰磺胺异二甲嘧啶 (formylsulfisomidines)、β-葡糖基磺胺(beta-glucosylsulfanilamides)、磺胺米隆 (mafenides)、4′-甲基胺磺酰基-磺苯胺(4′-(methylsulfamoyl)sulfanilanilides)、诺丙磺 胺(noprylsulfamides)、酞磺醋胺(phthalylsulfacetamides)、酞磺胺噻唑 (phthalylsulfathiazoles)、柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidines)、琥珀磺胺噻唑 (succinylsulfathiazoles)、苯甲酰磺胺(sulfabenzamides)、磺胺醋酰(sulfacetamides)、 磺胺氯哒嗪(sulfachlorpyridazines)、磺胺柯定(sulfachrysoidines)、磺胺西汀 (sulfacytines)、磺胺嘧啶(sulfadiazines)、磺胺戊烯(sulfadicramides)、磺胺二甲氧嘧 啶(sulfadimethoxines)、磺胺多辛(sulfadoxines)、磺胺乙二唑(sulfaethidoles)、磺胺 胍(sulfaguanidines)、磺胺胍诺(sulfaguanols)、磺胺林(sulfalenes)、磺胺洛西酸 (sulfaloxic acids)、磺胺甲嘧啶(sulfamerazines)、甲氧嘧啶(sulfameters)、磺胺甲嘧啶 (sulfamethazines)、磺胺甲二唑(sulfamethizoles)、磺胺托嘧啶(sulfamethomidines)、 磺胺异唑(sulfamethoxazoles)、磺胺甲氧嗪(sulfamethoxypyridazines)、磺胺美曲 (sulfametroles)、磺胺米柯定(sulfamidoclirysoidines)、磺胺唑(sulfamoxoles)、磺 胺(sulfanilamides)、4-磺胺水杨酸(4-sulfanilamidosalicylic acids)、磺胺酰磺胺 (sulfanilylsulfanilamides)、磺胺脲(sulfanilylureas)、n-磺胺酰-3，4-二甲苯甲酰胺 (n-sulfanilyl-3，4-xylamides)、磺胺硝苯(sulfanitrans)、磺胺培林(sulfaperines)、磺胺 苯吡唑(sulfaphenazoles)、磺胺普罗林(sulfaproxylines)、磺胺吡唑(sulfapyrazines)、 磺胺吡啶(sulfapyridines)、磺胺异噻唑(sulfasomizoles)、磺胺均三嗪(sulfasymazines)、 磺胺噻唑(sulfathiazoles)、磺胺硫脲(sulfathioureas)、磺胺托拉米(sulfatolamides)、 磺胺二甲异嘧啶(sulfisomidines)、磺胺曲沙唑(sulfisoxazoles)和类似物)；
[0617]砜(例如醋氨苯砜(acedapsones)、醋地砜(acediasulfones)、磺胺苯砜钠 (acetosulfone sodiums)、氨苯砜(dapsones)、地百里砜(diathymosulfones)、葡胺苯砜 钠(glucosulfone sodiums)、苯丙砜(solasulfones)、舒巴坦(sublactams)、琥珀氨苯砜 (succisulfones)、对氨基苯磺酸(sulfanilic acids)、对磺胺酰基苄胺 (p-sulfanilylbenzylamines)、阿地砜钠(sulfoxone sodiums)、噻唑砜(thiazolsulfones) 和类似物)；
[0618]四环素(例如阿哌环素(apicyclines)、氯四环素、氯莫环素(clomocyclines)、 地美环素(demeclocyclines)、多西环素(doxycyclines)、胍甲环素(guamecyclines)、赖 甲环素(lymecyclines)、甲氯环素(meclocyclines)、美他环素(methacyclines)、米诺环 素(minocyclines)、氧四环素、青哌环素(penimepicyclines)、匹哌环素(pipacyclines)、 罗利环素(rolitetracyclines)、山环素(sancyclines)、四环素(tetracycline))，和其它(例 如环丝氨酸(cycloserines)、莫匹罗星(mupirocins)、薯球蛋白(tuberins)和类似物)；
[0619]以及其它抗生素(例如氯福克酚(clofoctols)、梭链孢酸(fusidic acids)、海克西 定(hexedines)、六胺(methenamines)(包括例如乌洛托品(methenamine)、脱水亚甲基 柠檬酸六胺(methenamine anhydromethylene-citrates)、马尿酸乌洛托品(methenamine hippurates)、杏仁酸乌洛托品(methenamine mandelates)、磺基水杨酸环六亚甲基四 胺(methenamine subsalicylates)、呋喃妥因(nitrofurantoins)(例如FURAD ANTINTM)、 硝羟喹啉(nitroxolines)、利替培南(ritipenems)、牛磺罗定(taurolidines)、xibomols和 类似物)；
[0620]抗真菌剂，包括多烯例如两性霉属B(amphotericin Bs)(如ABELCETTM和 AMBISOMETM)、克念菌素(candicidins)、制皮菌素(dermostatins)、菲律宾菌素 (filipins)、抗真菌色素(fungichromins)、抗滴虫霉素(hachimycins)、哈霉素(hamycins)、 鲁斯霉素(lucensomycins)、甲三菌素(mepartricins)、游霉素(natamycins)(如纳他霉素 (Natacyn))、制霉菌素(nystatins)、变曲霉素(pecilocins)、标霉素(perimycins)和其它(如 重氮丝氨酸(azaserines)、灰黄霉素(griseofulvins)、寡霉素(oligomycins)、十一烯酸 新霉素、吡咯菌素(pyrrolnitrins)、千蠕孢菌素(siccanins)、杀结核菌素(tubercidins)、 绿毛绿素(viridins))；以及合成的抗真菌剂例如烯丙胺(allylamines)(如布替萘芬 (butenafines)、萘替芬(naftifines)、特比萘芬(terbinafines))；咪唑(如联苯苄唑 (bifonazoles)、布康唑(butoconazoles)、氯登妥因(chlordantoins)、氯米达唑 (chlormidazoles)、氯康唑(cloconazoles)、克霉唑(clotrimazoles)、益康唑(econazoles)、 恩康唑(enilconazoles)、芬替康唑(fenticonazoles)、氟曲马唑(flutrimazoles)、异康唑 (isoconazoles)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazoles)、拉诺康唑 (lanoconazoles)、咪康唑(miconazoles)、奥莫康唑(omoconazoles)、硝酸奥昔康唑 (oxiconazole nitrates)、舍他康唑(sertaconazoles)、硫康唑(sulconazoles)、噻康唑 (tioconazoles)、伏立康唑(voriconazoles)(如VFENDTM))；硫代氨基甲酸酯(如托西拉 酯(tolciclates)、托林达酯(tolindates)、托萘酯(tolnaftates))；三唑(诸如氟康唑 (luconazoles)(如DIFLUCANTM)、伊曲康唑(traconazoles)(如SPORANOXTM)、沙康 唑(saperconazoles)、特康唑(terconazoles))；和其它合成物(如吖啶琐辛(acrisorcins)、 阿莫罗芬(amorolfines)、珍尼柳酯(biphenamines)、溴柳氯苯胺 (bromosalicylchloranilides)、丁氯柳胺(buclosamides)、丙酸钙、氯苯甘醚 (chlorphenesins)、ciclopiroxes、cloxyquins、艾索帕尔(coparaffinates)、二盐酸地马 唑(diamthazole dihydrochlorides)、依沙酰胺(exalamides)、氟胞嘧啶(flucytosines)、 哈利他唑(halethazoles)、海克替啶(hexetidines)、脂酰肽例如棘白菌素 (echinocandin)(如在卡泊芬净(caspofungin)CANCIDASTM中)、氯氟卡班 (loflucarbans)、硝呋太尔(nifuratels)、碘化钾、丙酸、2-巯基吡啶氧化物(pyrithiones)、 水杨苯胺(salicylanilides)、丙酸钠、舒苯汀(sulbentines)、替诺尼唑(tenonitrozoles)、 三醋精、苄硫噻二嗪乙酸(ujothions)、十一碳烯酸(undecylenic acids)、丙酸锌)和类 似物；
[0621]杀阿米巴药(Amebicides)和抗原生动物药(anti-protozoals)(包括例如阿托伐 醌(atovaquone)、盐酸氯喹(chloroquine hydrochloride)、磷酸氯喹(chloroquine phosphate)、甲硝唑(metronidazole)、盐酸甲硝唑(metronidazole hydrochloride)、依 西酸喷他脒(pentamidine isethionate)和类似物)；驱虫药(Anti-helmenthics)和抗寄生 虫药(anti-parasitics)(包括例如甲苯达唑(mebendazole)、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)、噻苯哒唑(thiabendazole)和类似物)；抗疟药(Anti-malarials)(包括例如盐 酸氯喹(chloroquine hydrochloride)、磷酸氯喹(chloroquine phosphate)、多西环素 (doxycycline)、硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、盐酸甲氟喹(mefloquine hydrochloride)、磷酸伯氨喹(primaquine phosphate)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、含 有磺胺多辛的乙胺嘧啶(pyrimethamine with sulfadoxines)；抗肺结核药 (Anti-tuberculotics)和抗麻风药(anti-leprotics)(包括例如氨苯吩嗪(clofazimine)、环丝 氨酸、氨苯砜(dapsone)、盐酸乙胺丁醇(ethambutol hydrochloride)、异烟肼(isoniazid)、 吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福布汀(rifabutin)、利福平(rifampin)、利福喷汀 (rifapentine)、硫酸链霉素(streptomycin sulfate)和类似物，以及它们的组合例如利福 平/异烟肼(如RIFAMATETM)和利福平/异烟肼/吡嗪酰胺(如RIFATERTM)。
[0622]以进一步举例说明为目的(而非限制)，可与本发明的sHASEGP相联合(如 通过与一种或多种sHASEGP共同配制或通过与一种或多种sHASEGP共同给药 (可以将sHASEGP在所述药剂给药以前、同时或之后施用))的免疫调节剂的实 例包括，例如下列类型药剂中的成员：
[0623]免疫抑制剂(包括例如咪唑硫嘌呤(azathioprine)、巴利昔单抗(basiliximab)、 环孢菌素(cyclosporine)、达利珠单抗(daclizumab)、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单 抗-CD3(muromonab-CD3)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、盐酸霉酚酸酯 (mycophenolate mofetil hydrochloride)、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus) 和类似物)；
[0624]疫苗和类毒素(包括例如BCG疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附 的(absorbed))、吸附的白喉和破伤风类毒素和无细胞的百日咳疫苗、白喉和破伤风 类毒素和全细胞的百日咳疫苗、乙型流感嗜血杆菌联合疫苗(Haemophilius b conjugate vaccines)、甲肝疫苗(失活的)、乙肝疫苗(重组的)、流行性感冒病毒疫苗(基 于纯化的表面抗原)、流行性感冒病毒疫苗(基于亚病毒或纯化的亚病毒)、流行性 感冒病毒疫苗(基于全病毒)、日本脑炎病毒疫苗(失活的)、莱姆病(Lyme disease)疫 苗(重组OspA)、麻疹、腮腺炎和风疹病毒疫苗(活体的)、麻疹、腮腺炎和风疹病毒 疫苗(活体减活的)、麻疹病毒疫苗(活体减活的)、脑膜炎球菌多糖(meningococcal polysaccharide)疫苗、腮腺炎病毒疫苗(活体的)、瘟疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多价的)、 脊髓灰质炎病毒疫苗(失活的)、脊髓灰质炎病毒疫苗(活体的、口服的、三价的)、 狂犬病疫苗(吸附的)、狂犬病疫苗(人二倍体细胞)、风疹和腮腺炎病毒疫苗(活体 的)、风疹病毒疫苗(活体的、减活的)、破伤风类毒素(吸附的)、破伤风类毒素(流 体)、伤寒疫苗(口服的)、伤寒疫苗(不经肠的)、VI型伤寒多糖疫苗、水痘病毒疫 苗、黄热病疫苗和类似疫苗和类似物)；
[0625]抗毒素和抗蛇毒血清(antivenins)(包括例如黑寡妇和其它蜘蛛的抗蛇毒血 清、响尾蛇抗蛇毒血清(多价的)、白喉抗毒素(马的)、黄金珊瑚蛇抗蛇毒血清 (Micrurus fulvius antivenin)和类似物)；
[0626]免疫血清(包括例如细胞巨病毒免疫球蛋白(静脉内的)、乙型肝炎免疫球蛋 白(人的)、肌肉内的免疫球蛋白、静脉内的免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白(人的)、 静脉内的呼吸道合胞病毒免疫球蛋白(respiratory syncytial virus immune globulin intravenous)(人的)、免疫球蛋白(人的)、破伤风免疫球蛋白(人的)、水痘-疹子免疫 球蛋白和类似物)；
[0627]其它的免疫调节剂(包括例如阿地白介素(aldesleukin)、依泊汀α(epoetin alfa)、非格司亭(Filgrastims)、用于注射的乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)、复合干 扰素(Interferon alfacon-1)、α-2a干扰素(interferon alfa-2a)(重组的)、α-2b干扰素 (interferon alfa-2b)(重组的)、α-n3干扰素(interferon alfa-n3)、β-1a干扰素(interferon beta-1a)、β-1b干扰素(interferon beta-1b)(重组的)、γ-1b干扰素(interferon gamma-1b)、 盐酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、沙格司亭 (sargramostim)和类似物)。
[0628]可与本发明的sHASEGP联合的其它药剂(如通过与一种或多种sHASEGP 共同配制或通过与一种或多种sHASEGP共同给药(可以将sHASEGP在所述药剂 给药以前、同时或之后施用))包括，例如下面列出的：
[0629]类固醇抗炎剂(例如阿氯米松(alclomethasones)、阿尔孕酮(algestones)、倍氯 米松(beclomethasones)、倍他米松(betamethasones)、布地奈德(budesonides)、氯倍 他索(clobetasols)、氯倍他松(clobetasones)、氯可托龙(clocortolones)、氯泼尼醇 (cloprednols)、皮质酮(corticosterones)、可的松和氢化可的松(cortisones和 hydrocortisones)(如乙酸氢化可的松(hydrocortisone acetate))、可的伐唑(cortivazols)、 地夫可特(deflazacorts)、地奈德(desonides)、去羟米松(desoximetasones)、地塞米松 (dexamethasones)(如磷酸地塞米松21(dexamethasone 21-phosphate))、difluorosones、 二氟可龙(diflucortolones)、二氟泼尼酯(difluprednates)、甘草次酸(enoxolones)、氟 扎可特(fluazacorts)、氟氯奈德(flucloronides)、双氟美松(flumethasones)、氟尼缩松 (flunisolides)、氟轻松(fluocinolones)、醋酸氟轻松(fluocinonides)、氟可丁 (fluocortins)、氟可龙(fluocortolones)、氟米龙(fluorometholones)、氟培龙 (fluperolones)、氟泼尼定(fluprednidenes)、氟泼尼龙(fluprednisolones)、氟氢缩松 (flurandrenolides)、氟替卡松(fluticasones)、福莫可他(formocortals)、哈西奈德 (halcinonides)、卤倍他索(halobetasols)、卤米松(halometasones)、卤泼尼松 (halopredones)、氢可他酯(hydrocortamates)、氢化可的松(hydrocortisones)、氯替泼 诺(loteprednol etabonate)、马泼尼酮(mazipredones)、甲羟松(medrysones)、甲泼尼 松(meprednisones)、甲泼尼龙(methylprednisolones)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、帕拉米松(paramethasones)、泼尼卡酯(prednicarbates)、泼尼松龙 (prednisolones)(如泼尼松龙25-二乙氨基-乙酸酯(prednisolone 25-diethylamino-acetate)、泼尼松龙磷酸钠(prednisolone sodium phosphate))、强的松 (prednisones)、泼尼松龙戊酸酯(prednivals)、泼尼立定(prednylidenes)、利美索龙 (rimexolones)、替可的松(tixocortols)、去炎松(氟羟脱氢皮醇，triamcinolones)(如曲 安奈德(triamcinolone acetonide)、苯曲安奈德(triamcinolone benetonide)和己曲安奈 德(triamcinolone hexacetonide))和类似物)；
[0630]非类固醇抗炎剂(例如色甘酸盐(或酯)(cromoglicates)、双氯芬酸 (diclofenacs)、氟比洛芬(flurbiprofens)、消炎痛(indomethacins)、布洛芬(ibuprofens)、 酮咯酸(ketorolacs)(如酮咯酸氨基丁三醇(ketorolac tromethamine))、洛度沙胺 (lodoxamides)、奈多罗米(nedocromils)、吡罗昔康(piroxicams)、水杨酸盐(salicylates) 和类似物)；
[0631]β阻断剂(例如倍他洛尔(betaxolols)(如盐酸倍他洛尔(betaxolol hydrochloride))、卡替洛尔(carteolols)、艾司洛尔(esmolols)、左布诺洛尔 (levobunolols)、metipranalols、噻吗洛尔(timolol)(如半水合噻吗洛尔(timolol hemihydrate)和各种形式的马来酸噻吗洛尔(timolol maleate))和类似物)；
[0632]拟交感神经剂(例如肾上腺素(adrenaline)、溴莫尼定(brimonidines)、地匹福 林(dipivefrins)、肾上腺素(epinephrines)和类似物)；
[0633]Ducosanoids、前列腺素和前列腺素类似物(例如比马前列素(bimatoprosts)、 拉坦前列素(Latanoprost)、曲伏前列腺素(travoprost)、乌诺前列酮(unoprostones)和 类似物)，以及抗前列腺素(antiprostaglandin)和前列素前体；
[0634]缩瞳药(Miotics)、类乙酰胆碱功能药(cholinergics)和抗胆碱酯酶 (anti-cholinesterases)(例如氯化乙酰胆碱、卡巴可、地美溴铵(demecarium bromides)、 二异丙基氟磷酸盐(或酯)(diisopropyl fluorophosphates)、毒扁豆碱(eserines)、毒扁豆 碱(physostigmines)、毛果云香碱(pilocarpines)、碘化二乙氧磷酸硫胆碱(phospholine iodines)、水杨酸盐和类似物)；
[0635]抗过敏剂(例如安他唑啉钠(sodium antazolines)、西替利嗪(cetirizines)、氯苯 吡胺(chlorpheniramines)、色甘酸盐(或酯)(cromoglycates)、色甘酸钠(cromolyn sodium)(Crolom)、富马酸依美斯汀(emedastine difumarate)、酮替芬(ketotifins)(如富 马酸酮替芬(ketotifen fumarate))、左卡巴斯汀(levocabastines)、噻吡二胺 (methapyrilines)、奈多罗米钠(nedocromil sodium)、奥洛他定(olopatadines)、吡拉明 (pyrilamines)、非尼腊明(prophenpyridamines)和类似物)；
[0636]解充血药(Decongestants)(例如苯肾上腺素(phenylephrines)、萘甲唑啉 (naphazolines)、四氢唑啉(tetrahydrozolines)和类似物)；
[0637]激素剂(例如雌激素、雌二醇、孕激素(progestationals)、孕酮、胰岛素、降 钙素、甲状旁腺素和甲状旁腺肽以及血管生压素下丘脑释放因子(vasopressin hypothalamus releasing factor)和类似物)；
[0638]生长因子(例如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、 转化生长因子β、促生长素和迁连蛋白以及类似物)；
[0639]镇痛药(例如醋氨沙洛(acetaminophen)；阿芬太尼(alfentanil)；氨基苯甲酸酯 (aminobenzoate)；氨基苯甲酸盐(aminobenzoate)；阿尼多昔(anidoxime)；阿尼利定 (anileridine)；氨苄哌替啶(anileridine)；阿尼洛泮(anilopam)；阿尼罗酸(anirolac)； 安替比林(antipyrine)；阿斯匹林(aspirin)；本洛芬(benoxaprofen)；苄达明 (benzydamine)；盐酸比西发定(bicifadine hydrochloride)；布芬太尼(brifentanil)；溴 朵林(bromadoline)；溴芬酸(bromfenac)；丁丙诺啡(buprenorphine)；布他西丁 (butacetn)；布替西雷(butixirate)；布托菲诺(butorphanol)；丁啡喃(butorphanol)；卡 马西平(carbamazepine)；卡巴匹林钙(carbaspirin calcium)；卡必芬(carbiphene)；卡 芬太尼(carfentanil)；琥珀酸环丙法多(ciprefadol succinate)；希拉马多(ciramadol)； 希拉马多(ciramadol)；氯尼塞利(clonixeril)；氯尼辛(clonixin)；可待因(codeine)；磷 酸可待因(codeine phosphate)；硫酸可待因(codeine sulfate)；conorphone；环佐辛 (cyclazocine)；右奥沙屈(dexoxadrol)；右培美酸(dexpemedolac)；地佐辛(dezocine)； 二氟尼柳(diflunisal)；二氢可待因(dihydrocodeine)；二甲法登(dimefadane)；安乃近 (dipyrone)；多匹可明(doxpicomine)；氨甲茚酮(drinidene)；依那朵林(enadoline)； 依匹唑(epirizole)；酒石酸麦角胺(ergo tamine tartrate)；乙托沙素(ethoxazene)；依托 芬那酯(etofenamate)；子香酚(eugenol)；菲诺洛芬(fenoprofen)；苯氧丙酸钙 (fenoprofen calcium)；枸橼酸芬太尼(fentanyl citrate)；夫洛非宁(floctafenine)；氟苯 柳(flufenisal)；氟尼辛(flunixin)；氟尼辛葡胺(flunixin meglumine)；氟吡丁(flupirtine)； 氟丙喹宗(fluproquazone)；氟朵林(fluradoline)；氟比洛芬(flurbiprofen)；氢吗啡酮 (hydromorphone)；异丁芬酸(ibufenac)；吲哚洛芬(indoprofen)；酮佐辛(ketazocine)； 酮啡诺(ketorfanol)；酮咯酸(ketorolac)；来替米特(letimide)；左旋醋美沙朵 (levomethadyl acetate)；盐酸左旋醋美沙朵(levomethadyl acetate hydrochloride)；左 南曲朵(levonantradol)；左啡诺(levorphanol)；洛非咪唑(lofemizole)；草酸洛芬太尼 (lofentanil oxalate)；洛西那多(lorcinadol)；氯诺昔康(lomoxicam)；水杨酸镁 (magnesium salicylate)；甲芬那酸(mefenamic acid)；美大麻坦(menabitan)；麦啶 (meperidine)；美普他酚(meptazinol)；美沙酮(methadone)；醋美沙朵(methadyl acetate)；甲氧夫啉(methopholine)；甲氧异丁嗪(methotrimeprazine)；乙酸美克法胺 (metkephamid acetate)；米姆本(mimbane)；米芬太尼(mirfentanil)；吗林那宗 (molinazone)；硫酸吗啡(morphine sulfate)；莫沙佐辛(moxazocine)；大麻坦(nabitan)； 纳布啡(nalbuphine)；纳美酮(nalmexone)；纳莫雷特(namoxyrate)；南曲多(nantradol)； 萘普生(naproxen)；甲氧萘丙酸(naproxen)；萘普索(naproxol)；奈福泮(nefopam)； 奈西利定(nexeridine)；诺美沙多(noracymethadol)；奥芬太尼(ocfentanil)；奥他酰胺 (octazamide)；奥伐尼(olvanil)；奥昔托隆(oxetorone)；羟考酮(oxycodone)；14-羟基 二氢可待因酮(oxycodone)；对苯二酸氧可酮(oxycodone terephthalate)；羟吗啡酮 (oxymorphone)；培美酸(pemedolac)；戊吗酮(pentamorphone)；喷他佐辛 (pentazocine)；喷他佐辛(pentazocine)；非那吡啶(phenazopyridine)；苯吡氨醇 (phenyramidol)；哌西那多(picenadol)；皮那朵林(pinadoline)；吡非尼酮(pirfenidone)； 吡罗昔康乙醇胺(piroxicams olamine)；普拉朵林(pravadoline)；普地利定 (prodilidine)；普罗法多(profadol)；丙吡胺(propiram)；达而丰(propoxyphene)；萘磺 酸达而丰(propoxyphene napsilate)；普罗沙唑(proxazole)；普罗啡烷(proxorphan)； 吡咯利芬(pyrroliphene)；瑞芬太尼(remifentanil)；柳胆来司(salcolex)；马来酸沙乙 酰胺(salethamide maleate)；水杨酰胺(salicylamide)；水杨酸葡胺(salicylate meglumine)；双水杨酯(salsalate)；水杨酸盐(或酯)(salicylate)；螺朵林(spiradoline)； 舒芬太尼(sufentanil)；舒芬太尼(sufentanil)；sucapsaicin；他美辛(talmetacin)；他尼 氟酯(talniflumate)；他洛柳酯(talosalate)；他扎朵林(tazadolene)；特丁非隆 (tebufelone)；四氢甲吲胺(tetrydamine)；替呋酸(tifurac)；替利定(tilidine)；硫平酸 (tiopinac)；托那佐辛(tonazocine)；曲马多(tramadol)；曲芬太尼(trefentanil)；三乙醇 胺(trolamine)；维拉朵林(veradoline)；维立洛泮(verilopam)；伏拉佐辛(volazocine)； 佐尔啡诺(xorphanol)；甲苯噻嗪(xylazine)；zenazocine mesilate；佐美酸(zomepirac)； 和类似物)；
[0640]其它大分子药理剂例如其它蛋白质、核酸和类似物；以及大分子复合体例 如各种药物输送载体、蛋白输送载体和/或基因输送载体(包括合成制备的载体例如 脂质体和类似物，以及生物学发生的载体例如病毒载体和类似物)；和
[0641]如本领域已知的，用于各种状况的另外的药剂(和各种药剂的关于用法、 剂量、禁忌征候等其它信息，所述多种制剂包括本文确认的那些药剂)，包括如在 下列参考文献中确定的那些另外的药剂，以及在下列专利参考中确定的那些另外 的药剂，所述参考文献例如：Physicians′Desk Reference(PDR)(Thomson 2003，2004， 2005)；the American College of Physicians Complete Home Medical Guide(DK Publishing 2003)；所述专利参考包括如美国公开的申请20040224023、20040224012 和20050002865(该药剂列表在此引入作为参考)。
[0642]药剂的组合(例如选自上述药剂组中的一组或多组和/或选自本文描述的或 本领域已知的其它组或类别的药理剂和其它药剂的两种或更多种药剂)。
[0643]sHASEGPs对于减低眼内压和其它眼科征候的应用
[0644]术后白内障患者中发生的一个普遍副效应是早期的——有时候会延长的— —显著的眼内压增加。此种状况有时候是严重的，特别在具有青光眼视神经盘变 化的患者中。尽管当在手术期间将粘弹性试剂例如透明质酸注射入眼睛中时，压 力增加往往会更加严重，但即使不使用此种试剂，术后眼内压也会升高。而且， 即使在手术过程中不使用其它附加的药物，此种压力增加也会发生。在一些情况 下，让粘弹性试剂留在眼睛里是有益处的，这常常使得有必要给予患者大剂量的 碳酸酐酶抑制剂。这些抑制剂通过减少房水的形成而降低眼内压，房水是正常情 况下在眼睛中由睫状体分泌的流体。目前用于减缓眼睛内术后压力增加的方法包 括各种类型的滴眼液，诸如β-肾上腺能阻断剂、拟交感神经药、缩瞳药、αII选择 性试剂、碳酸酐酶抑制剂和前列腺素试剂。
[0645]去除粘弹性试剂例如透明质酸的优选方法是在前节或后节手术程序的期间 或之后紧接着注射sHASEGP，尽管本领域已知的其它给药方法也是可能的。如果 透明质酸和sHASEGP在前节眼手术程序期间通过注射投药于眼睛前房，以使得透 明质酸在手术程序开始期间能够充当间隔物，则是优选的。在角膜移植的一些情 况中，可以在适当位置缝合角膜移植物之前，将透明质酸和sHASEGP组合置于眼 内结构的表面。该组合也可以用于后节手术中，例如视网膜或玻璃体手术中。
[0646]在一些情况下，在手术结束时，将粘弹性试剂例如HealonTM、ViscoatTM或 其它可占据空间的物质留在眼的前房可能是明智的。对于在眼内内含物趋向于向 前运动并压迫角膜后表面时的正压力升高，这是尤其适用的。如果这发生在在适 当位置具有人工眼内晶体的眼中，则角膜内皮上的压力可能显著伤害细胞并随后 引起角膜肿胀，并且发生浑浊化现象，其与视力减低相关。通常，如果在手术程 序结束时患者的眼内压显著升高，则有必要给予这样的患者大剂量的碳酸酐酶抑 制剂，以及外用滴眼液诸如β-阻断剂和αII促效药，以便减少水形成和/或增加水 外流。这些试剂都具有显著的副作用，并且在一些情况下，对于具有各种医学症 状例如呼吸问题、心脏病或高血压的患者，它们的使用则属于治疗不当。然而， 在这些情况下使用sHASEGP将省去给予这些患者大剂量的此类药物的必要。
[0647]而且，在小梁网中具有相当数量的透明质酸。sHASEGP将分解这些透明质 酸，并因此促进水通过小梁网流出。患者的眼内压将因此减小。sHASEGP与其他 前房试剂例如甲基纤维素(OcucoatTM，例如商购自Storz Instrument Co.)——在白内 障手术中用作间隔剂和/或保护试剂——的组合也将有效地防止压力的显著升高， 这是因为它将有效地打开小梁网，通过降解小梁网中存在的大量的透明质酸来排 除更多的房水。
[0648]从小梁网去除糖胺聚糖，对于患有隅角开放性青光眼的个体的眼内压的降 低也是有用的。人sHASEGP可以通过结膜下注射或直接注射在眼前房中而被给 药。因为sHASEGP起酶作用，所以甚至相对有限量的sHASEGP可有效地行使粘 弹剂解毒剂的功能或者对通过应用糖胺聚糖酶而得到帮助或改善的情形起作用。 如用于其它用途时，对于最佳应用的sHASEGP提供的透明质酸酶活性单位部分取 决于治疗的具体情形——特别是需要的糖胺聚糖降解的量，但是其可以使用适当 的模型被容易评估，然后根据具体的用途对其适当的优化。作为举例说明，被用 作解毒剂的sHASEGP单位将受到例如下列因素的影响：具体使用的步骤和粘弹剂 使用量，以及是否使用其它的步骤例如冲洗和吸出将任何使用的粘弹剂去除。当 在冲洗和吸出之后使用sHASEGP时，通常可使用的数量提供的范围是10到12,000 单位，典型地100到5,000单位，更典型地500到2,000单位，尽管这将再一次取 决于具体的应用。当sHASEGP被用于避免对冲洗和吸出的需要时，将使用更大的 数量，以便有效消化更大量的使用的粘弹剂，通常可使用的数量提供的范围是50 到20,000单位，典型地400到10,000单位，更典型地1,500到5,000单位，尽管 这将再一次取决于具体的应用。
[0649]在sHASEGP被用来降低青光眼相关联的眼内压的情况中，sHASEGP的应 用也可被用作主要治疗以降低青光眼相关联的IOP，并且因而潜在地避免对于某些 手术过程的需要，所述手术过程例如青光眼滤过、青光眼引流植入物(植入管分 流(tube shunt))、激光小梁成形术、睫状体光凝固或虹膜切开术。因此本发明的 sHASEGP可被引入，例如通过注射入眼前房，以提供最小侵入性的手段，以便降 低青光眼相关联的眼内压。不希望被理论限制，相信在此类情形中施用sHASEGP， 可增强经过小梁网的流体外流，并因此通过降低眼前房内的流体静压和/或血压渗 透压以降低IOP。
[0650]在sHASEGP被用于溶解玻璃体聚集物或“漂物(floater)”——其通常是 肉眼可见的不透明的玻璃体纤维聚集物——的情况中，将sHASEGP施用到玻璃体 可被用来促进分解。
[0651]类似的，如本文描述的sHASEGP可被应用于玻璃体以促进玻璃体出血(即， 血溢出进入玻璃体)的消退，玻璃体出血可连同下述病症一起发生，例如糖尿病 性视网膜病变、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion)、后玻璃体脱落、视网膜 撕裂、眼外伤和类似病症。玻璃体出血——其典型地缓慢消退——的存在，可推 延、复杂化或阻碍要求视网膜通过玻璃体可视化的某些程序，这些程序对于诊断 和/或治疗手术是需要的，例如激光光凝固和通常对于例如增殖性糖尿病性视网膜 病变的病症为主要治疗的类似治疗手术。促进这类玻璃体出血消退的sHASEGP的 使用因此能被用来帮助视网膜病症的诊断和/或避免对更极端的手术例如玻璃体切 割术的需要。
[0652]在sHASEGP被用来在治疗病症例如糖尿病性视网膜病变中促进玻璃体-视 网膜分离的情况中，将sHASEGP施用入玻璃体可用来促进玻璃体与视网膜分离或 分开。在本文中，sHASEGP不但可以促进所述分离，还可以使这种分离以降低视 网膜变形(retinal distortion)或视网膜撕裂的方式进行。
[0653]本发明的sHASEGP也可以用来治疗角膜混浊。就该方面而言，许多扭曲 或变形可能影响角膜的正常组织的结构，并导致在通过角膜的光通路中的中断并 且伴随着视力的损伤。因此，大量的状况和原因导致角膜扭曲，其可以表现为伤 疤、混浊或浊影。在施用sHASEGP以改善或者治疗这些角膜病症时，sHASEGP (在药理学可接受的溶剂中，其包含一种或多种另外的药理剂)可通过数种给药 途径中的任意一种被引入角膜，这部分取决于角膜损伤的程度和位置。作为举例 说明，sHASEGP可被引入到眼的外表面上(使用例如滴液或其它外用途径)， sHASEGP可封装在载体例如脂质体和类似载体中，所述载体可被用来帮助跨角膜 上皮的细胞输送，这通过注射或微注射到角膜上或角膜本身里面，或者通过其它 方法应用到角膜。对于促进输送，除了生物化学或机械学辅助方法，用于促进渗 透的其它方法例如离子电渗疗法，也可被使用。
[0654]本发明的sHASEGP也可被用来例如，增强在光动力学疗法(PDT)中使用 的药剂的渗透性。PDT是针对脉络膜新生血管膜(choroidal neovascular membrane) (CNVM)的治疗，所述脉络膜新生血管膜通常是年龄相关性黄斑变性(AMD)的 “湿(wet)”形式的视网膜下的渗漏性血管结构。在PDT中，光敏染料例如 VISUDYNETM(维替泊芬(verteporfin))典型地被静脉内(IV)给药，并且被允 许灌注CNVM以及机体的剩余部分。然后，眼科医生通常用特定波长(例如689nm) 的红色激光治疗CNVM，激光治疗持续大约90秒。非热激光(non-thermal laser light)活化染料(例如VISUDYNETM)产生氧的活性形式，其凝结和降低了异常 血管的生长，其又抑制了流体从CNVM渗漏。本发明的sHASEGP可被用于，例 如促进染料(例如VISUDYNETM)直接向眼睛的更加局域化的给药；和/或促进通 常与手术例如PDT一起施用到眼的其它药剂的输送。
[0655]神经节囊肿
[0656]神经节囊肿(也称为腕囊肿、Bible囊肿或背腱鞘囊肿)是手的最常见的软组 织块。它是充满流体的囊，其可以在皮肤下被感觉到。它通常附着于手或腕中的 腱鞘(可润滑腱的衬里结构)，或与下面的关节连接；然而，有一些并不会明显地连 接于任何结构。这些神经节囊肿也可以出现在足中。当腱的衬里结构或关节上面 的韧带中出现撕裂和由于韧带缺陷而造成衬里突出并导致在皮肤下形成肿块时， 它常常发生。因为常常伴随有炎症，发炎的组织产生果酱样的流体，充满突出的 囊。它们可以如岩石般坚硬，这是由于在该囊内含有压力高的粘液样流体，它们 常常被误认为是骨突出。
[0657]sHASEGP可以被用于改善神经节囊肿。损伤区内注射入5-1000单位的 sHASEGP，然后进行细针抽吸，可以去除囊肿，而不需要手术。可任选地，皮质 类固醇也可以与sHASEGP一起注射。对于某些患者，则还需要其他注射。
[0658]粘液性水肿
[0659]皮肤的糖胺聚糖(GAG)浸润是甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症、胫 前粘液性水肿、苔藓性粘液水肿和硬化病的一个特征。在所有的病况中和在正常 的皮肤里透明质酸都是主要的GAG。GAG的皮肤分布具有最小的组织多样性。获 得性皮肤粘蛋白症(acquired cutaneous mucinoses)显示出类似的皮肤GAG分布和 生化组成。成纤维细胞活性的形态学差异表明，硬化病和苔藓性粘液水肿的粘蛋 白症代表的是一个局部进程，而甲状腺疾病的GAG浸润则可能具有全身性起源。 这些紊乱可以通过sHASEGP的局部给药和全身性给药而得以改善。对于慢性治 疗，可以考虑使用聚乙二醇化的sHASEGP。
[0660]sHASEGP的肺部应用
[0661]来自正常个体的支气管肺泡灌洗液(BAL)的透明质酸水平通常在15ng/ml以 下。然而，在呼吸窘迫的状况下，BAL水平大大上升(Biermer Br Med J(Clin Res Ed) 1987 Oct 3；295(6602)：803-6)。例如，在ARDS中，透明质酸可以上升到500ng/ml， 然而在农民肺中，BAL水平可以超过1000ng/ml(Hallgren et al Am Rev Respir Dis. 1989 Mar；139(3)：682-7)，(Larrson et al Chest.1992 Jan；101(1)：109-14)。在肺中增 加的透明质酸可以阻止氧扩散和气体交换并且活化嗜中性粒细胞和巨噬细胞应 答。
[0662]牛透明质酸酶制剂并不是治疗此种病况的优选之物，原因有许多。首先， 已经知道屠宰物睾丸来源的透明质酸酶制剂受到丝氨酸蛋白酶例如顶体蛋白酶的 污染。第二，牛的酶的外源性质增加了过敏反应的可能性，其能导致患者死亡。 因此，高纯度的重组人sHASEGP制剂可以通过肺或静脉内传送的方法而被传送。 也可以将人sHASEGP施予患有与升高的糖胺聚糖有关的其他肺部并发症的患者， 或者，给予人sHASEGP以增强其他共同传送的分子至肺部的传送。
[0663]本发明现在将通过参考下面的非限制性实施例来进行更加详细的描述。
[0664]实施例1
[0665]基于微量滴定的透明质酸酶测定
[0666]下面的实施例提供了测量sHASEGP透明质酸酶活性的快速分析方法。该 分析方法可以是关于TRU、IU或NFU，其中使用W.H.O.标准的透明质酸酶制剂。
[0667]生物素化的透明质素微量滴定测定
[0668]使用生物素-酰肼(Pierce)、Sulfo NHS(Pierce)和1-乙基二甲氨基丙基-碳二亚 胺(Sigma)，使透明质素的葡糖醛酸残基上游离的羧基在一步反应中被生物素化。 该生物素化的HA底物在第二个反应中，被共价偶联到96孔微滴定板上。酶反应 完成时，残留的底物用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应进行检测，其可以用标准的 ELISA平板读数器读出。因为底物是被共价结合于微滴定板，所以矫作结果 (artifact)例如生物素化底物的pH依赖性的置换没有发生。灵敏度使得能够对来 自培养细胞和生物样品的透明质酸酶活性进行快速测定，分析之间的偏差小于 10％。
[0669]a.实验方案
[0670]生物素化的HA底物的制备
[0671]在偶联到生物素之前，将100mg的HA(Sigma Chemicals)溶解于0.1M MES， pH 5.0中，至最终浓度为1mg/ml，在4℃溶解至少24小时。将Sulfo-NHS(Pierce； Rockford IL)加入到该CS04 MES溶液中，至最终浓度为0.184mg/ml。将生物素酰 肼(Pierce)溶解于DMSO，作为100mM的贮存液，再加入到CS04溶液，至最终浓 度为1mM。将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)的贮存液制备为溶于 蒸馏水中的100mM贮存液，再加入到HA生物素溶液，至最终浓度为30mM。将 该溶液在4℃搅拌过夜。未连接的生物素和EDAC通过用水透析而去除，其中3 次更换1000×体积的水。将透析过的、生物素化的HA(bHA)进行等分，可在-20℃ 保存达数月。
[0672]用含有浓度为0.2mg/ml的bHA的水将Sulfo-NHS稀释至0.184mg/ml，并 吸放到96孔COVALINK-NH板(NUNC；Placerville NJ)，每孔50μl。将EDAC用 水稀释至0.123mg/ml，并吸放到含有bHA溶液的COVALINK-NH板，结果，bHA 的最终浓度为10μg/孔，EDAC的最终浓度为6.15μg/孔。将板在4℃温育过夜，或 23℃温育2小时，这给出了相当的结果。将bCS04共价固定在微量滴定板上之后， 通过振荡去除偶联溶液(coupling solution)，并将板在含有2M NaCl和50mM MgSO4的PBS(缓冲液A)中洗涤3次。该板可以保存在4℃达1周。
[0673]带有固定化的bHA的COVALINK-NH板可以用100μl/孔的测定缓冲液平 衡，测定缓冲液是0.1M甲酸，pH 3.7、0.1M NaCl、1％TRITON X-100去污剂、 5mM葡糖二酸单内酯，用于溶酶体透明质酸酶；或者是10mM Hepes，PH 7.4，具 有1mM CaCl2和1mg/ml人血清蛋白(ICN)，用于中性活性酶。用于“相对浊度降 低单位”(rTRUs)的酶活性的校准的一组标准通过下述步骤产生：用中性酶缓冲 液将牛睾丸透明质酸酶(Sigma Type VI-S)稀释为1.0至1×10-6rTRU/孔并测定100μl/ 孔，一式三份。用溶酶体测定缓冲液将酸性活性透明质酸酶的样品稀释为1∶10至 1∶130,000，按100μl/孔的量移取，一式三份。对于大部分的组织提取物和人血浆分 析，37℃温育30分钟是足够的。阳性和阴性对照孔(分别没有酶或没有ABC(参 见下面))也被包括，一式三份。
[0674]通过加入200μl/孔的6M盐酸胍来终止反应，然后以300μl/孔的量用PBS、 2M NaCl、50mM MgSO4、0.05％TWEEN 20去污剂(缓冲液B)洗涤3次。抗生物 素蛋白-生物素复合物(ABC)试剂盒(Vector Labs；Burlingame CA)可以在10ml的含 有0.1％TWEEN 20去污剂的PBS中制备，其在温育期间在室温下预先温育30分 钟。加入ABC溶液(100μl/孔)，并在室温温育30分钟。将板用缓冲液B洗涤5次， 然后以100μl/孔的量加入o-苯二胺(OPD)底物，该底物溶液通过将1片10mg的OPD 片剂溶解于10ml的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，pH 5.3，并加入7.5μl的30％H2O2 来制成。将板在黑暗中温育10-15分钟，然后使用492nm滤器，在ELISA平板读 数仪(Titertek Multiskan PLUS；ICN)上读数，通过使用Biometallics(Princeton NJ) 的Delta Soft II平板读数软件的计算机来进行监控。应用了牛睾丸透明质酸酶的标 准曲线可以利用通过商业渠道购得的透明质酸酶制剂的四参量曲线拟合而产生， 未知样品通过它们在492nm的吸收值，借助于内插法而被估算出。
[0675]为了分析透明质酸酶的pH依赖性，纯化的重组sHASEGP和牛睾丸透明质 酸酶被应用。酶活性对pH的依赖性可以通过将纯化的sHASEGP或部分纯化的牛 睾丸透明质酸酶用下述缓冲液稀释至0.1rTRU来进行测量：50mM甲酸盐，pH 3-4.5；50mM醋酸盐，pH 5-6；50mM MES，pH 6-7；或50mM HEPES，pH 7-8。 将样品在37℃测定30分钟，活性用最大活性的百分比来表示。缓冲液中不使用 NaCl，这是因为NaCl能改变睾丸透明质酸酶制剂的pH最适宜值(Gold，Biochem.J. 205：69-74，1982；Gacesa et al.Biochem.Soc.Trans.7：1287-1289，1979)；生理盐浓度 (0.15M)使得表观pH最适宜值降低，这一影响在睾丸酶的纯化制剂中比在原始的 粗样品中更为显著。
[0676]b.结果
[0677]透明质素在使用了生物素-酰肼和EDAC的一步反应中被生物素化。EDAC 是将HA上的游离羧基基团与生物素酰肼进行偶联，将EDAC进行限制，则HA 上只有一小部分的总葡糖醛酸残基被标记。将EDAC(3×10-5M)加入到HA (2.8×10-3M)，按这一数量，则产生最大值：每93个HA二糖单位偶联1分子的生 物素酰肼。
[0678]制备牛睾丸透明质酸酶标准反应的四参量曲线拟合，所述的标准反应在pH 3.7进行测量，并稀释为1.0至1×10-6TRU/孔。四参量曲线拟合由方程来建立：y＝ ((A-D)/(1+(浓度/C)^B))+D)，其中，logit y＝ln(y′/l-y′)，y′＝(y-D)/(A-D)，B＝-b/ln 10， C＝EXP(a/B)。四个参量(A、B、C、D)用软件程序来计算，该软件程序利用了2+2 线性回归运算法则(Rodbard et al.，Clin.Chem.22：350，1976)。该曲线拟合具体表现 为标准曲线的S形特征。样品测定时的最佳准确性通常在0.001至0.01 TRU/孔温 育30分钟时获得。在60分钟的温育期间，可检测到1/1000的TRU。对于更小范 围的值，也可以利用标准对数曲线来建立标准曲线拟合。尽管本发明已经依据特 定的优选实施方案进行了描述，但应该理解的是，要求保护的发明不应该限于这 些特定的实施方案。
[0679]实施例2
[0680]sHASEGP cDNA的克隆
[0681]编码人sHASEGP的核酸可以由本领域技术人员通过许多方法来获得，包 括但不限于人工基因合成、RT-PCR和cDNA文库杂交(例如参见Gmachl et al FEBS 336(3)1993，Kimmel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 1993 10071-10075)。 可选择地，编码人sHASEGP的克隆可以从IMAGE或人基因序列的其他供应商那 里获得(Invitrogen Clone ID IOH10647)。
[0682]全长人PH20 cDNA经计算长为2009个核苷酸，含有1530个核苷酸的开放 阅读框。5′UTR非同寻常的大，其可能代表着滞留的内含子(retained intron)，而 且它可能由于5′UTR中的9个非编码起始密码子的缘故，通过阻止核糖体结合到 正确的起始甲硫氨酸密码子而抑制翻译。该蛋白(Genbank登记号为NP 003108)经 预测包含有509个氨基酸，SEQ ID No.1，计算出的分子量为58kDa。
[0683]为了克隆的测序，PCR扩增条带被切下，并用胶提取回收试剂盒(Qiagen) 洗出，再克隆入合适的经限制性消化而具有粘末端的载体。双链DNA的所有测序 反应依据制造商的说明进行，其中使用Taq染料脱氧终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，在ABI PrismTM自动测序仪(Applied Biosystems)上进行测序。
[0684]使用引物SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 47进行聚合酶链式反应，扩增人睾 丸cDNA文库(Clontech，Palo Alto CA)，获得了人PH-20开放阅读框。PCR产物用 NheI和BamHI消化，并克隆到载体IRESpuro2(Clontech)的NheI和BamHI位点。
[0685]实施例4
[0686]由人PH20 cDNA分离出SHASEGP
[0687]能够在哺乳动物细胞中有效进行糖基化作用的具有催化活性的分泌型重组 人sHASEGP表达载体按照下面描述的方法产生。携带针对不同物种的启动子和选 择基因的其他表达构建物也被考虑，不同的物种诸如酵母和昆虫细胞，其也能产 生sHASEGP。也可以使用阳性选择基因诸如谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶 (DHFR)。下面给出的例子不是为了限制目的，而是提供可以使用的若干质粒表达 系统的例子。
[0688]为了构建分泌形式的sHASEGP，缺少疏水性C末端的截短变体被构建。使 用GPI切割预测程序，GPI锚切割位点被定位于该全长的GPI锚定的蛋白中的氨 基酸位置N483附近。由7个嵌套3′引物组成的引物组被用来构建7个截短的缺失 变体，所述变体从位置Y482处开始缺少预测的GPI锚，并由此逐步剔除一个又一 个的氨基酸。这些引物被设计成具有相容的NheI(5′)和BamH1(3′)位点，以便将所 述的截短变体克隆进载体Irespuro2，其中或者在3′引物中使用终止密码子未标记， 或者其作为C末端用His标记的蛋白质以方便纯化和检测。例如，反向引物SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10被用来产生剔除突变子，以位置Y482、F481 和I480为末端，无6-His标记。其他变体引物用同样的碱基设计产生，其中进行 适当的修饰以包括和排除特定的氨基酸。为了产生His-标记的变体，用于非标记 的变体的同一组引物被类似地使用，不同的是在各自的反向引物中缺少终止密码 子，而正向引物是相同的(对于His标记的构建物，是指具有SEQ ID No 19、20、 21、22、23、24和25的引物，它们是没有终止密码子的反向引物，对应于它们各 自的构建物的非标记的反向引物)。重叠的引物被用来构建6个氨基酸的间隔子， 然后跟着在Irespuro2载体中的BamH1和Not1位点内的六聚组氨酸，这样，His- 标记的突变体通过在含有所述his标记的Irespuro2载体中的Nhe1和BamH1位点 内将PCR扩增并经过限制性消化的产物连接起来而产生。
[0689]为了确认人sHASEGP是否可以在它的羧基末端进行修饰而产生分泌型中 性活性酶，在GPI锚附着位点至预测的“催化结构域”范围进行一系列的截短， 被预测的“催化结构域”是依据与蜂毒酶的同源性获得的。
[0690]在IRESPuro2中的编码人sHASEGP全长GPI锚定克隆的DNA被用作模板 以产生各种截断的缺失变体。软件建模程序给出了全长多肽的若干预测的切割位 点。这样的预测出的位点之一在氨基酸位置N483(SEQ ID No.1)。PCR引物被设 计用来从N483起连续地截短蛋白质，从而产生6个缺失突变体，以Y482(缺少 N)开始，至E477(缺少P)结束。
[0691]a.实验方案
[0692]产生缺少N483的截短变体：
[0693]在pIRESPuro2的Nhe1和BanH1之间的全长GPI锚定sHASEGP克隆被用 作模板。该模板用含有Nhe1位点的5′引物——其从天然信号肽的起始甲硫氨酸 M1开始(SEQ ID No.14)，和含有BamHI位点的3′引物——其在Y482处结束(SEQ ID No.8)进行扩增。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上跑胶，以分离并确认准确大小 的扩增带，将胶纯化，用NheI和BamHI限制性消化，再克隆入载体pIRESPuro2 (Clontech)的NheI和BamHI位点之间，产生用于表达该SHASEGP截短突变体的 表达载体，该截短突变体在氨基酸位置Y482处结束，缺少GPI锚，具有所描述的 氨基酸序列(SEQ ID No.5，对应于所获得的sHASEGP多肽的序列，直至Y482)和 核苷酸序列(SEQ ID No.48：为SEQ ID No.5多肽的编码核苷酸)。
[0694]其它的分别缺少Y482、F481、I480、Q479和P478的截短突变体被产生。
[0695]使用同样的策略，唯一的差异是对于各个突变体使用合适的3′引物。各3′ 引物描述如下：
[0696]用于缺少Y482的sHASEGP突变体的3′引物-SEQ ID No.9
[0697]用于缺少F481的突变体的3′引物-SEQ ID No.10
[0698]用于缺少I480的突变体的3′引物-SEQ ID No.11
[0699]用于缺少Q479的突变体的3′引物-SEQ ID No.12
[0700]用于缺少P478的突变体的3′引物-SEQ ID No.13
[0701]产生进一步的缺失突变体以确定sHASEGP的最小化的活性结构域：
[0702]进一步的剔除作用是从上述的sHASEGP截短至最内部的、序列至E477的 中性pH活性截短突变体的3′末端，以10至20个氨基酸的氨基酸块为单位来进行 的。NheI正向引物SEQ ID No.14与适当定位的3′引物被用来PCR扩增sHASEGP 剔除变体，其中从羧基末端剔除掉了所期望的长度。例如，用描述于SEQ ID No.14 和SEQ ID No.26的引物分别作为5′和3′引物进行PCR，当被IresPuro2载体中的表 达构建物表达时，产生了SEQ ID No.49中的多肽。类似地，用SEQ ID No 27、28、 29、30、31和32中描述的反向3′引物进行PCR，产生分别以成熟sHASEGP的氨 基酸位置A447、S430、G413、S394、A372和S347为末端的剔除突变体。在每一 种情况下，PCR产物用NheI和BamHI消化，消化得到的产物克隆入pIresPuro2 载体的NheI和BamHI位点之间。通过瞬时转染入在CD-CHO无血清培养基 (Invitrogen，CA)中的CHO细胞，每一组的最终表达构建物的一些独立克隆被测试 其分泌型中性活性sHASEGP活性，样品在指定的时间点被取出以用于测定。依照 制造商推荐的实验方案，从过夜培养物制备得到的小量制备DNA用Genejuice (Novagen，CA)转染试剂转染。用上面描述的微量滴定分析方法测量透明质酸酶活 性。
[0703]b.结果
[0704]sHASEGP截短突变体的透明质酸酶活性被测量，从而鉴定出具有分泌型中 性活性透明质酸酶活性的最小化活性结构域。    氨基酸1至     U/ML/24小时PH7.4     347     0.000     372     0.000     394     0.000     413     0.000     430     0.000     447     0.000     467     0.089     477     0.567     478     0.692     479     0.750     480     0.575
    481     0.740     482     0.329     483     0.800     509     0.044
[0705]结果显示，上述的所有6个氨基酸剔除突变体——其以Y482至E477中的 指示出的氨基酸为末端，均比GPI锚定sHASEGP，给出更高的分泌的活性。
[0706]结果还显示，剔除范围超过A467的剔除消除了所有的分泌型活性。A467 克隆的分泌型中性活性降至P478或N483克隆中所发现的活性的大约10％。因此 推断，比起先前由蜂毒酶假定的情况，需要人sHASEGP羧基末端结构域的更多部 分来产生中性活性透明质酸酶结构域。因此，羧基末端结构域中的半胱氨酸是中 性活性所必需的。N483处的GPI切割位点之前的约10个氨基酸的非常窄的范围 界定了最小活性结构域。
[0707]实施例5信号肽的修饰对SHASEGP分泌活性的影响
[0708]人sHASEGP具有异常长的预测出的天然前导肽。此外，在该前导肽中的 两个邻近的半胱氨酸残基的存在可能导致在高水平表达期间多肽多聚体在内质网 中的聚集，并因此阻止了sHASEGP的高水平表达。因此，一系列更具效率的促分 泌前导肽被测试，以检测它们增强sHASEGP靶向分泌的能力。
[0709]a.实验方案
[0710]通过重叠引物退火并用引物进行PCR延伸，构建出Kappa前导肽，所述的 引物对应于SEQ ID No 37、38、39和40中的序列。所获得的PCR扩增的kappa 序列，用侧翼引物进行扩增，所述侧翼引物在5′端含有NheI位点(如SEQ ID No.41 中描述)，在3′端含有EcoRI位点(如在SEQ ID No.42中描述)。这使得能在Litmus 39(NEB)载体的NheI和EcoRI位点之间克隆Kappa前导肽(该多肽序列在SEQ ID No.43中描述)。sHASEGP具有内部EcoRI位点；因此，NheI位点和EcoRI位点 之间的该kappa构建物，进一步用5′SpeI引物(如SEQ ID No.44中描述)和3′MluI 引物(如SEQ ID No.45中描述)扩增。以P478为末端的无GPI锚的sHASEGP用 NheI和BamHI从pIresPuro2中切割出来，并克隆入Litmus 39(NEB)载体的NheI 和BamHI位点内。由此获得的含有sHASEGP的Litmus载体用SpeI和MluI限制 酶消化，用SpeI和MluI引物将扩增的kappa前导肽构建物克隆入该载体中。在该 含有Kappa和sHASEGP序列的Litmus 39载体上进行定点突变，以使sHASEGP 的成熟多肽与Kappa前导序列能够融合在同一阅读框架中。对应于SEQ ID No.34 和35的引物对被用来产生以天然Asp为末端氨基酸的kappa前导序列，该Asp被 融合到sHASEGP的F38(sHASEGP的序列至P478)(如SEQ ID No.46中描述的 融合蛋白质的多肽序列)。其他引物对组合例如SEQ ID No.33和SEQ ID No.35， 被用来产生以Asp(D)为末端的Kappa前导序列，其融合到SHASEGP的L36；SEQ ID No.33和SEQ ID No.36被用来产生以Gly(G)(在所述的末端Asp(D)前面)为末端 的Kappa前导序列，其融合到SHASEGP的L36；SEQ ID No.34和SEQ ID No.36 被用来产生以Gly(G)(在所述的末端Asp(D)的前面)为末端的Kappa，其融合到 SHASEGP的F38。通过定点诱变获得的Kappa-sHASEGP融合蛋白用凝胶纯化， 用酶DpnI消化，以消化任何延续下来的亲代DNA，然后用NheI和Bam HI消化， 并克隆入已用NheI/BamHI消化的HisIresPuro2骨架，该骨架在pIRESPuro2载体 的BamH1和Not1位点之间克隆有his标记(6个氨基酸的间隔子，随后跟着6个组 氨酸)。因此，连接完成之后，我们获得了pIresPuro2中的NheI-kappa-SHASEGP- BamHI-His构建物。获得4组这样的构建物，其对应于在Kappa前导序列的末端 的G或D和在成熟sHASEGP的起始端的L36或F38的组合。来自每一类构建物 的一些独立克隆被转染入CD-CHO培养基(Invitrogen，CA)中的CHO细胞，以测试 与天然的分泌前导序列相比，kappa分泌前导序列的存在是否会促进分泌蛋白质的 水平增加。从过夜培养物制备获得的小量制备DNA用Genejuice(Novagen，CA)转 染试剂，依据制造商推荐的方案进行转染，在指定的时间点收取样品以用于微量 滴定分析测试。透明质酸酶活性按照上面描述的微量滴定分析方法来测量。
[0711]小鼠IgG Kappa链前导肽sHASEGP融合构建物被测试，以测试出更高水平 的分泌型中性活性sHASEGP活性。
[0712]b.结果人sHASEGP基因构建物     U/ML/24小时，PH 7.4 IgG Kappa前导肽sHASEGP氨基酸38-478 HIS6     3.0257 天然前导肽sHASEGP氨基酸1-478 HIS6     0.4857
[0713]酶分析的结果表明，当与缺少IgG Kappa前导序列的克隆P478、Y482或 N483相比时，相对于天然的分泌前导序列，IgG Kappa前导序列能够将sHASEGP 的分泌增强约7至8倍。具有变化的前导序列融合位点的其它kappa前导序列构建 物也产生了增加水平的分泌型中性活性透明质酸酶活性，其中所述的前导序列融 合位点是从该Kappa前导序列的Asp或Gly至sHASEGP的L36或F38。这些实施 例旨在扩展而不是限制本发明的范围，其他有效的促分泌前导序列可以采用同样 的技术而被利用。
[0714]实施例6
[0715]人sHASEGP表达载体的产生
[0716]通过克隆入双顺反子表达序列盒HZ24(SEQ ID NO 47)，产生不带表位标记 的sHASEGP。表达sHASEGP的HZ24质粒载体包括pCI载体骨架(Promega)、编 码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA序列、来自ECMV病毒(Clontech) 的内部核糖体进入位点(IRES)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架也 包括编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒即刻早 期增强子/启动子区(CMV)、嵌合内含子和SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。编 码sHASEGP构建物的DNA在天然信号前导序列的甲硫氨酸处含有Kozak共有序 列，在酪氨酸482处含有终止密码子。得到的构建物pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ-24)导致由CMV启动子驱动的单一mRNA，它编码PH20的氨基酸1-482和二 氢叶酸还原酶的氨基酸1-187，它们由内部核糖体进入位点分隔开。
[0717]利用5′引物和反向引物，将人PH20开放阅读框从Invitrogen ORF克隆 (IOH10647，Invitrogen，Carlsbad CA)中扩增出来，其中所述的5′引物在PH20的甲 硫氨酸之前引入了NheI位点和Kozack共用序列，所述的反向引物在酪氨酸482 之后引入了终止密码子并引入了BamH1限制性位点。用NheI和BamHI消化PH20 PCR片段后，将所得到的PCR产物连接入质粒pIRESpuro2(Clontech，Palo Alto， CA)。
[0718]实施例7
[0719]sHASEGP表达细胞系的产生
[0720]将培养于补充有4mM谷氨酰胺和18ml Plurionic F68/L(Gibco)的用于 DHFR(-)细胞的GIBCO改良型CD-CHO培养基中的未转染DG44 CHO细胞，在 0.5×106细胞/ml时接种到摇瓶中以准备用于转染。细胞于37℃培养在5％CO2的湿 润培养器中，并进行120rpm的振荡。在转染之前，测试指数生长的未转染DG44 CHO细胞的存活率。
[0721]将未转染的DG44 CHO细胞培养物的60,000,000个存活细胞进行沉淀，并 重新悬浮于0.7mL的2×转染缓冲液(2×HeBS＝40mM Hepes，pH 7.0、274mM NaCl、 10mM KCl，1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中，浓度为20,000,000个细胞。向 每一等份的重悬浮细胞，加入0.09mL的线性HZ24质粒(250ug)，在室温下将细胞 /DNA溶液转移入0.4cm间隙BTX(Gentronics)电穿孔小盒。在没有与细胞混合的 质粒DNA的情况下进行阴性对照电穿孔。细胞/质粒混合物被电穿孔时，电容器 的放电条件为330V和960μF或者350V和960μF。
[0722]电穿孔之后，将细胞从小盒中移出，并转移到5mL的改良CD-CHO培养基 中，该培养基是用于DHFR(-)细胞，补充有4mM谷氨酰胺和18ml Plurionic F68/L (Gibco)，让培养物在6孔组织培养板的孔中生长两天而不进行选择，培养板是置 于37℃的5％CO2湿润培养箱中。
[0723]电穿孔2天之后，从各个孔中移出0.5mL的组织培养基，并测试透明质酸 酶活性的存在。
[0724]在转染后的40小时，HZ24转染的DG44 CHO细胞的初始透明质酸酶活性    稀释     活性，单位/ml     转染1  330V     1比10     0.25
    转染2 350V     1比10     0.52     阴性对照     1比10     0.015
[0725]来自转染2(350V)的细胞从组织培养孔中收集，计数，并稀释至每毫升 10,000至20,000个存活细胞。将0.1mL的细胞悬浮液等份试样转移到5个96孔圆 底组织培养板的各个孔中。将0.1mL的CD-CHO培养基(GIBCO)加入到含有细胞 的孔中(最终体积0.2mL)，所述CD-CHO培养基含有4mM Glutamax-1并且没有 次黄嘌呤和胸苷补充物。
[0726]由在无甲氨蝶呤的条件下培养的5个板中鉴定得到的10个克隆    板/孔ID     相对透明质酸酶活性     1C3     261     2C2     261     3D3     261     3E5     243     3C6     174     2G8     103     1B9     304     2D9     273     4D10     302     1E11     242     A1(+)对照     333     H12(-)对照     0
[0727]6个HZ24克隆被培养放大，并作为单细胞悬浮液转移到摇瓶。使用二维无 限稀释策略(two-dimensional infinite dilution strategy)，将克隆3D3、3E5、2G8、 2D9、1E11和4D10接种到96孔圆底组织培养板。将稀释的克隆培养在500个未 转染DG44 CHO细胞/孔的背景中，以便为最初几天的培养提供必要的生长因子。 每一亚克隆制备10个板。
[0728]克隆3D3产生24个可见的亚克隆。这24个亚克隆中8个亚克隆的上清液 中测量到了明显的透明质酸酶活性(＞50单位/mL)，这8个亚克隆在存在50nM甲 氨蝶呤的条件下放大培养于T-25组织培养瓶中。克隆3D3 50nM在存在500nM甲 氨蝶呤的条件下被进一步放大，在摇瓶中获得了活性超过1,000单位/ml的克隆(克 隆3D3 5M)。
[0729]实施例8
[0730]sHASEGP的产生
[0731]将一小管的3D3 5M解冻，并由T型摇瓶通过1L转瓶来进行放大，它们培 养在补充有100nM甲氨蝶呤和Glutamax(Invitrogen)的CHO CDM(Invitrogen， Carslbad CA)中。细胞由转瓶转移到5L生物反应器(Braun)，接种密度为4.0×10E5 个存活细胞/ml。参数为温度设置值37℃、pH 7.2(起始设置值)、溶解氧设置值25％ 和空气覆盖(air overlay)为0-100cc/min。在168小时时，加入250ml的供给#1 培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖)。在216小时时，加入250ml的供给#2培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖+10mM丁酸钠)，在264小时时，加入250ml的供给#2培养 基。该过程产生的最终生产率为1600单位/ml，最大细胞密度为6百万细胞/ml。 发现在生产的最后阶段加入丁酸钠显著地增加了sHASEGP的产量。3D3-5M生长&sHASEGP产量，5L生物反应器
  操作   时间   存活细胞   ×10E5   ％存活   单位/ml   体积(mL)   [葡萄糖]   供给料   0   4.4   100   0   4500   547   24   5.7   100   0   4500   536   48   10.1   100   37   4500   501   72   17.1   99   62   4500   421   96   28.6   99   118   4500   325   120   28.8   99   240   4500   274   144   60.2   100   423   4500   161   168   55   100   478   4500   92   250ml供给#1   192   66.6   98   512   4750   370   216   55.2   92   610   4750   573   250ml供给#2   240   53   88   710   5000   573   264   49.8   84   852   5000   474   250ml供给#2   288   40   70   985   5250   770   312   31   61   1467   5250   773   336   25.4   52   1676   5250   690
[0732]实施例9
[0733]sHASEGP的纯化
[0734]通过深度过滤和切向流透析到10mM Hepes pH 7.0中，将来自3D3克隆的 条件培养基澄清化。然后通过Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换、苯基琼脂糖(Pharmacia) 疏水相互作用层析、苯基硼酸盐(Prometics)和羟磷灰石层析(Biorad，Richmond，CA) 的连续层析，纯化可溶性HASEGP。
[0735]SHASEGP被结合到琼脂糖，用含有400mM NaCl的同样的缓冲液洗脱。将 洗脱物用2M硫酸铵稀释至最终浓度为500mM ASO4，并通过苯基琼脂糖(low sub) 柱，然后在同样的条件下结合到苯基硼酸树脂。用pH 9.0、无AS04的50mM N- 二(羟乙基)甘氨酸(bicine)洗涤之后，sHASEGP用Hepes pH 6.9从该苯基琼脂糖树 脂上洗脱下来。将洗脱物加载到陶瓷羟磷灰石树脂上，pH 6.9，在5mM PO4 1mM CaCl2中，再用含有0.1mM CaCl2的80mM PO4 pH 7.4洗脱。
[0736]借助于使用USP参考标准的微浊度分析(microturbidity assay)，确定所获 得的纯化的sHASEGP具有超过65,000USP单位/mg蛋白的比活性。纯化的 sHASEGP在24至26分钟以单峰的形式，用在0.1％TFA/H2O和0.1％TFA/90％乙 腈/10％H2O之间的梯度从Pharmacia 5RPC苯乙烯二乙烯基苯柱上洗脱出来，经 SDS电泳的辨认，为单一的61kDa的较宽条带，而用PNGASE-F处理之后，其减 为51kDa的较锐利的条带。N-末端氨基酸测序揭示，前导肽已被有效地去除。
[0737]生物化学方法纯化的sHASEGP的N-末端氨基酸序列。  位置  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   理论上  Leu   Asn   Phe   Arg   Ala   Pro   Pro   Val   Ile   Pro   Asn   观察到  -   Asn   Phe   Arg   Ala   Pro   Pro   Val   Ile   Pro   Asn
[0738]实施例10
[0739]DG44CHO来源的sHASEGP糖基化作用的分析
[0740]关于来自不同物种的sHASEGP是否需要糖基化作用以实现它们的催化活 性，存在相互矛盾的数据。例如，据报道，具有酶促催化活性的蜜蜂蜂毒透明质 酸酶可以在缺少糖基化机制的细胞诸如大肠杆菌中合成。而且，用PNGase处理纯 化的牛睾丸透明质酸酶不会使酶活性失活(Yamagata et al 1997)。其他研究报道，去 糖基化作用之后，活性丧失，而且二硫键是额外地需要的。
[0741]所有之前的测试都是使用粗制的或部分纯化的制剂来进行，然而，还没有 弄清楚，活性的丧失是由于去糖基化的酶被暴露于粗制剂中污染的蛋白酶，还是 由于糖基化作用和催化活性之间的直接功能关系。
[0742]a.实验方案
[0743]为了确定在无蛋白质的条件下使用CHO表达系统，功能性的N-连接糖基 化作用是否能被导入人sHASEGP，编码人sHASEGP-HIS6的cDNA被表达于CHO 细胞中，这是通过使用IRESpuro双顺反子表达盒在化学成分确定的培养基中进行 的。将细胞在CHO CDM(Invitrogen/Gibco)中培养72小时，然后浓缩，用30kDa 截留膜(cutoff membranes)在Pellicon TFF单元(Millipore)上进行切向流透析。将 浓缩物与10mM Hepes PH 7.450mM NaCl进行交换。然后将透析后所得物加载在 DEAE流线形琼脂糖树脂上，并在Pharmacia FPLC树脂上，用梯度为0-1M NaCl 的NaCl洗脱。人sHASEGP用10-30％NaCl洗脱下来。柱分离级分中的sHASEGP 的水平证明，大部分的酶在10-30％NaCl的梯度中被回收。来自10-30％NaCl梯 度的酶然后进一步通过亲合层析在带有Ni的IMAC树脂上纯化。用50mM醋酸盐 PH 5.0、10mM Imidizole洗涤之后，人sHASEGP从IMAC树脂上洗脱得到。浓缩 该蛋白，并用10mM Hepes PH 7.4透析。在基于ELISA的生物素化底物的微量滴 定分析中，测得高度纯化的酶在1mM钙和1mg/ml HSA存在的条件下，具有97,000 单位/mg蛋白的比活性。
[0744]为了检测蛋白质相对分子量的变化，纯化的人sHASEGP用PNGASE或神 经氨酸酶处理过夜，然后进行凝胶电泳、电转移，用连接有抗His6单克隆抗体的 HRP(Qiagen)进行蛋白质印迹分析，并进行ECL检测。
[0745]b.结果
[0746]蛋白质印迹分析证明，在CHO细胞中产生的人sHASEGP对PNGASE的 处理敏感。人sHASEGP的相对分子量显示，蛋白质是高度糖基化的。一旦用 PNGASE进行彻底的过夜消化之后，人sHASEGP降为单一物质，这证明未消化的 条带的一些异质性可能是由N-连接糖残基造成的。PNGaseF的部分消化显示出一 系列的中间产物，其从未处理的蛋白发生变化，经过更长时间的处理，则发生进 一步的变化。尽管条带在7％凝胶上稍显弥散，但至少可以看见6个不同的中间同 工异构型。
[0747]用神经氨酸酶对sHASEGP进行的处理揭示，CHO细胞事实上能够合成唾 液酸化的人sHASEGP。用神经氨酸酶进行处理，并在7％凝胶上对sHASEGP进行 蛋白质印迹分析后发现，与未处理的sHASEGP相比，CHO来源的人重组sHASEGP 在迁移中显示出约1-3kDa的变化。因此，这是第一次报道了基本上唾液酸化的人 sHASEGP的产生。这对于人sHASEGP的稳定性和血清半衰期的增加都是非常有 价值的，因为许多物种的天然精液sHASEGP缺少唾液酸化，不能与唾液酸特异性 凝集素进行反应。
[0748]sHASEGP的FACE分析
[0749]利用FACE分析对活性sHASEGP寡糖进行分析，使得能够快速确定具有催 化活性的sHASEGP的特征。
[0750]实验方案
[0751]使用FACETM N-连接寡糖作图方法(N-Linked Oligosaccharide Profiling) (Prozyme)，对来自3D35M克隆的纯化的透明质酸酶进行评价。寡糖用N-聚糖酶 (a.k.a PNGase)通过酶促消化从128.7μg的糖蛋白上切割下来，用荧光团ANTS标 记，并用电泳进行分离。通过将样品以及该样品的稀释物和寡糖标准梯度物一同 跑胶，确定出寡糖条件的相对位置，其中，所述寡糖标准梯度物以聚合度(DP)单 位来表示迁移距离。
[0752]结果
[0753]透明质酸酶样品的N-谱图由10个条带组成，其中的6个(其与寡糖标准 条带G5-G12一同迁移)的强度大于9％。而且，与G9标准物一同迁移的条带的 强度最强，为35％-46％。
[0754]sHASEGP寡糖分析 sHASEGP寡糖   聚合度   占总数的百分比  1   15.64   1.2  2   13.68   3.4
  3   11.6   10.0   4   10.04   10.4   5   8.37   35.4   6   7.32   9.7   7   6.14   9.0   8   5.57   12.4   9   3.84   2.3   10   3.26   0.5
[0755]实施例11
[0756]酶活性对SHASEGP N-连接糖基化作用的依赖性
[0757]a.实验方案
[0758]将纯化的HIS6sHASEGP的样品与缓冲液在37℃混合过夜，该缓冲液含有 神经氨酸酶和PNGASE，并含有或不含有50mM辛基葡糖苷。通过凝胶迁移(gel shift)，由蛋白质印迹分析证明，寡糖被去除。
[0759]b.结果  样品   U/ML   无Rx   22.01   神经氨酸酶O/N 50mM辛基葡糖苷   23.57   PNGaseF w/50mM辛基葡糖苷   0.0   PNGaseF，无50mM辛基葡糖苷o/n   10.74
[0760]实施例12
[0761]SHASEGP对硫酸化的和非硫酸化的糖胺聚糖的活性
[0762]除了使用HA的微量滴定分析之外，sHASEGP对其他糖胺聚糖或蛋白聚糖 的底物特异性，可以用纯化的底物利用凝胶迁移分析来测试，以确定sHASEGP对 其他糖胺聚糖的活性。许多透明质酸酶分析是基于对新的还原性N-乙酰氨基基团 的产生(Bonner and Cantey，Clin.Chim.Acta 13：746-752，1966)或粘性的损失(De Salegui et al.，Arch.Biochem.Bioplays.121：548-554，1967)或浊度(Dorfman and Ott， J.Biol.Chem.172：367，1948)的测定来进行的。采用纯化的底物时，所有这些方法 都足以测定内切葡萄糖胺活性的存在或不存在。
[0763]a.实验方案
[0764]凝胶迁移分析(GEL SHIFT ASSAY)——将纯化的底物与重组sHASEGP 混合，以测试内切葡糖苷酶活性，该活性将使底物在凝胶中的迁移增加。硫酸软 骨素A，Aggrecan和D来自Calbiochem。透明质素(人脐带)、硫酸软骨素C、硫 酸皮肤素和硫酸肝素从Calbiochem获得。人脐带透明质素从ICN获得。将每一受 测底物稀释至0.1mg/ml。将纯化的sHASEGP或来自表达sHASEGP的细胞的条件 培养基的10μl样品与90μl的受测底物在期望的缓冲液中混合，在37℃温育3小时。 温育之后，用样品缓冲液(Tris EDTA PH 8.0、溴酚蓝和甘油)中和样品，然后在15％ 聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将胶在含有0.5％阿尔新蓝的3％冰乙酸中染色过夜，然后 在7％冰乙酸中脱色，检测糖胺聚糖。通过比较在酶存在和不存在的情况下底物的 迁移，来确定降解情况。
[0765]b.结果
[0766]将含有100单位的HASEGPHIS6的10μl溶液与带有50μg/ml人血清白蛋白 的90μl 10mM Hepes缓冲液在37℃温育2小时，其中含有10μg的各种糖胺聚糖和 蛋白聚糖。电泳分析及随后的阿尔新蓝染色显示，硫酸软骨素A、C和D、Aggrecan 和透明质素中的每一种都显示出增加的迁移变化，而硫酸肝素和硫酸软骨素B没 有显示出增加的迁移。未消化的糖胺聚糖的迁移在凝胶的中部表现为成片的模糊 带(smear)，而消化的产物显示出，大部分的阿尔新蓝染色跑在染料的前端，少量 的物质是以递增的梯度在迁移。
[0767]实施例13金属离子对sHASEGP活化的影响
[0768]除了需要糖基化作用以获得最佳酶活性之外，发现人sHASEGP还用阳离 子激活以获得最佳的酶活性。在纯化的过程中，在连续的层析步骤之后，发现 sHASEGP具有低的比活性。当通过DEAE以及随后继续的Ni-IMAC纯化被纯化 至同质时，发现HIS6标记的sHASEGP具有非常低的比活性。因为IMAC树脂能 螯合金属离子，所以将各种金属加回到sHASEGP，以测定相对酶活性。
[0769]a.实验方案
[0770]纯化的sHASEGP在用0.1mM镍(Ni)、钴(Co)、锌(Zn)、钙(Ca)和镁(Mg)在 室温下温育2小时后，用微量滴定分析来测定透明质酸酶活性，从而对纯化的 sHASEGP进行测试。
[0771]b.结果  金属盐添加物   中性活性U/ml   无添加物   11.909   100uM Ni   6.0306   100uM Co   8.972   100uM Zn   3.7476   100uM Ca   101.9892
[0772]用0.1mM钙或0.1mM镁温育sHASEGP之后，发现透明质酸酶活性显著增 加。用其他金属温育之后，未见此种激活作用。基于A280的测量，向sHASEGP 加入钙使酶的比活性增加至约97,000单位/mg蛋白。然后测试钙和镁金属的剂量 响应曲线，以确定酶的最佳金属离子浓度。  mM二价金属   [Ca++]   [Mg++]
  100   1   1.3   10   108   104   1   169   164   0.1   123   78   0.01   59   18   0.001   47   13   0.0001   39   13   0.00001   55   15
[0773]发现sHASEGP的激活作用发生在微摩尔范围内。对钙和镁来说，大于 10mM的浓度都是抑制性的。为了排除针对底物而不是酶的非特异性激活作用，将 含有氯化钙的10mM Hepes缓冲液与固定化的生物素化的底物在微量滴定板上温 育，然后洗涤。当将酶加入到已洗涤过的用钙预温育的板上时，没有发现激活作 用。该激活作用还在用磷脂酶C释放的天然sHASEGP上进行了测试，其结果显 示出类似的钙激活作用，这排除了羧基末端HIS6表位标记可能带来的假结果。
[0774]实施例14
[0775]白蛋白对sHASEGP活性的影响
[0776]发现为了获得最佳活性，除了钙外，对重组rHUPH20和其他屠宰物睾丸来 源的透明质酸酶制剂的稀释还需要白蛋白。
[0777]a.实验方案
[0778]将人血清白蛋白(ICN)稀释入含有钙的10mM Hepes缓冲液中，以测定白蛋 白蛋白对酶活性的影响。使用1mM CaCl2和1mg/ml人血清白蛋白，对sHASEGP 和商业制剂进行酶分析。
[0779]b.结果
[0780]在存在白蛋白的条件下的高度稀释，发现了透明质酸酶活性的激活。至于 该激活作用是否是阻止了变性的结果，或者白蛋白是否影响了底物的可利用性， 尚不清楚。因此，人sHASEGP的优选试剂可以包括白蛋白和由钙或镁组成的金属 盐。
[0781]实施例15纯化的sHASEGP在体内的散布活性(spreading activity)
[0782]a.实验方案
[0783]将在10mM Hepes PH 7.4、150mM NaCl 0.1％Pluronic(普流尼克)中的纯 化的sHASEGP用含0.15M NaCl的无热原的水稀释至浓度为0.5U/ul。用盐水进行 一系列的稀释，最后的体积均为20μL，得到每一次注射量为总共0.01、0.05、0.1 单位的产物。加入20μL的台盼蓝溶液至最终体积为40μL，皮下注射入balb Nu/Nu 小鼠每一侧的侧面皮肤，这些小鼠之前已通过腹膜内注射被麻醉，例如给予氯胺 酮/甲苯噻嗪。用微测径器，从t＝0至t＝45分钟，在2维方向上测量染料面积。面 积用mm2表示。作为对照，缺少中性活性但为分泌型的重组人HYAL1被包括入 该实验。
[0784]b.结果  测试项目  面积@45分钟   A.盐水对照   51.5mm2   B.sHASEGP 0.01U   76.8mm2   C.sHASEGP 0.05U   98.22mm2   D.sHASEGP 0.10U   180.4mm2   E.HYAL1 100U   67.48mm2
[0785]实施例16sHASEGP扩散活性的动力学
[0786]a.实验方案
[0787]将重组纯化的sHASEGPHis6分为2个等份试样。一份等份试样在带有加热 盖的热循环仪中加热至95℃共15分钟，另一等份试样保持在室温中。在微量滴定 酶分析中确认酶活性的热失活。为了进行动力学分析，热失活的和天然的材料被 测试。将4单位纯化的sHASEGP或等量热失活物质与台盼兰染料一同皮下注射。 在长至15分钟之内的各个时间点测量面积。
[0788]b.结果  4个单位   t注射后分钟   4个单位，热失活的   t注射后分钟   t0＝52.38   t0＝50.58   t3＝116.51   t3＝65.48   t6.5＝181.93   t6.5＝63.87   t10＝216.96   t10＝65.80   t16＝279.99   t16＝74.3
[0789]实施例17sHASEGP分解的皮肤屏障的恢复
[0790]a.实验方案
[0791]为了确定在皮下给药后被sHASEGP打开的孔的再建时间，在t＝0时，将2 单位的纯化的sHASEGP或盐水对照经皮下注射入动物的两个相对的侧面位点，然 后在30分钟、60分钟和24小时时，在同样的位点注射台盼蓝。在注射后第15分 钟记录染料扩散的面积，并与对照比较。
[0792]b.结果  2单位   t注射sHASEGP后小时   盐水对照   t注射sHASEGP后小时
  t0.5h＝183   t0.5h＝54   t1hr＝167   t1hr＝50   t22hr＝61   t22hr＝48
[0793]该结果显示，皮肤屏障在给予2单位酶之后的24小时内重新形成。
[0794]实施例18sHASEGP开启的通道大小的测定
[0795]已经显示，人sHASEGP在间质中打开了足以允许小分子例如台盼蓝染料 扩散通过的通道。然而，不知道在sHASEGP存在的情况下可以扩散的颗粒的尺寸 上限是多少。
[0796]a.实验方案
[0797]各种不同大小的荧光分子被用来测定由人sHASEGP打开的通道的大小。 以40μl的体积，在皮下注射入平均分子量为4,400和2,000,000Da的荧光葡聚糖 (Flouresceinated Dextrans，Sigma)以及具有20纳米至500纳米范围内的确定直径 的荧光素标记珠子(Molecular Probes)，然后在同样的位置注射sHASEGP或盐水 对照。在注射后15分钟，在二维方向上测量染料前线包括的面积。
[0798]b.结果  扩散试剂   扩散测试颗粒大小   15分钟时的面积   标准偏差   sHASEGP   4400Da   84.2   25.7   对照   4400Da   38.0   5.8   sHASEGP   2×10E6Da   141.2   4.5   对照   2×10E6Da   51.7   8.1   sHASEGP   20nm直径   92.3   20.6   对照   20nm直径   51.6   3.0   sHASEGP   100nm直径   61.0   5.7   对照   100nm直径   40.0   7.0   sHASEGP   200nm直径   35.5   1.6   对照   200nm直径   27.9   8.2   sHASEGP   500nm直径   44.8   13.6   对照   500nm直径   41.2   9.8
[0799]结果显示，给予sHASEGP之后，从约1kDa(台盼蓝)至直径50nm(乳胶珠) 的分子都显示出扩散增加。牛血清白蛋白(66kDa)显示出与台盼蓝相似的扩散动力 学，而50nm乳胶珠则需要更多的时间来扩散。500nm珠直到480分钟时也没有显 示出扩散。
[0800]实施例19与人SHASEGP皮下共注射之后生物素化抗体的血清药物动力 学特性
[0801]a.实验方案
[0802]雌性Balb/c小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉。然后小鼠用与20μl盐水 或20μL含有4单位活性的sHASEGP相混合的20μL 0.5mg/ml的生物素化小鼠IgG 进行皮下注射。
[0803]b.结果注射后时间 对照     sHASEGP(4U) 血清IgG t＝0小时 0ng/ml     0ng/ml 血清IgG t＝2小时 0ng/ml     360ng/ml 血清IgG t＝51小时 4152ng/ml     4176ng/ml
[0804]结果证明，sHASEGP增加了大分子在循环中的血清分布动力学。在2小时 时，对照组中没有检测到生物素化的IgG，而在sHASEGP组中，在2小时时，明 显地检测到360ng/ml的浓度。
[0805]实施例20在静脉内注射人sHASEGP之后，皮下注射的分子的扩散活性
[0806]a.实验方案
[0807]对于每一剂量的各种受测物质和载剂对照，四个染料注射位点被利用。染 料注射在静脉注射的45分钟后进行。每种剂量的受测物质或对照物质被静脉注射 入2只动物。对于每一剂量或载体对照，在酶给药45分钟之后进行染料注射，在 2.5、5、10和15分钟计算测定染料前沿面积。
[0808]b.结果
[0809]结果显示，在静脉内给药后，高度纯化的sHASEGP是可全身性地获得的， 直至远端组织。全身性地给予的sHASEGP的散布活性是剂量依赖性的，10单位 的注射不能与载剂对照辨别开来。

[0810]实施例21-聚乙二醇化的例证性应用，为了产生显示出改良的药物代谢动 力学的修饰的sHASEGPs
[0811]作为通过聚乙二醇化作用来产生具有改进的药物代谢动力学——例如增加 的血清半衰期——的修饰形式sHASEGPs的例证性的实例，如上所述，我们将直 链或支链的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)部分连接到示例性sHASEGP，重 组人类PH20(rHuPH20)。
[0812]许多不同功能活化基团可被用于将PEG部分连接到sHASEGP，例如， rHuPH20(包括，举例来说，醛、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺及其它)。许多不同聚 乙二醇化试剂可从各种来源，包括Nektar Therapeutics(www.nektar.com)以及许多 其他的供应商(www.pharma.dow.com、www.nof.co.jp、www.sunbio.com、 www.celares.com)商业上得到。为了举例说明，按照本文所述，rHuPH20已经使用 许多例证性的PEG试剂被有效地聚乙二醇化，产生许多不同的聚乙二醇化的 rHuPH20酶。类似的方法也已经被应用于其它透明质酸酶，包括例证性的动物来 源的透明质酸酶(使用羊睾丸透明质酸酶制剂，其从ISTA Pharmaceuticals可得到， 为VitraseTM)、例证性的细菌来源的透明质酸酶(使用细菌透明质酸酶制剂，其从 Sigma可得到，为Hyaluronate Lyase)和例证性的细菌来源的具有透明质酸酶活性 的软骨素酶(使用细菌的软骨素酶ABC制剂，其从Associates of Cape Cod，Inc./ Seikagaku Corporation可得到，为软骨素酶ABC)。
[0813]除了改变功能基团之外，各种不同长度和结构的PEG可得到，其可通过使 用特定的功能基团而被整合。为了举例说明，长度为5至60KDa范围(例如，5、 10、20、30、40和60KDa)的PEG已经被结合到rHuPH20上。另外各种具有不 同长度和结构的不同PEG可以容易地从来源中得到，所述来源包括Nektar、the Dow Chemical Corporation(Dowpharma)、NOF Corporation、Sunbio、Celares和其它来 源。与PEG试剂和将蛋白质聚乙二醇化的方法相关的很多参考文献在本领域是已 知的，包括本文所引用的许多综述和论文(参见，例如Roberts，MJ et al.Advanced Drug Delivery Review 2002，54：459-476；Harris JM and Zalipsky，S(eds)of ″Poly(ethylene glycol)，Chemistry and Biological Applications″ACS Symposium Series 680(1997)；Mehvar，R et al.J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136(2000)； Harris，JM，Nature Reviews 2：215et seq.(2003)；Tsubery，H.，J Biol.Chem 279(37)： 38118-24(2004))；并且在描述聚乙二醇化作用和各种试剂和方法的许多参考文献 中被进一步描述(参见，例如Monfardini，C et al，Bioconjugate Chem.6：62-69(1995)； Veronese FM et al.，J.Bioactive Compatible Polymers 12：197-207(1997))；以及各种 美国和其他出版的专利和申请，包括US 5,672,662；US 5,932,462；US 6,495,659和 US 6,737,505；以及美国专利4,002,531；4,179,337；5,122,614；5,183,550；5,324,844； 5,446,090；5,612,460；5,643,575；5,766,581；5,795,569；5,808,096；5,900,461； 5,919,455；5,985,263；5,990,237；6,113,906；6,214,966；6,258,351；6,340,742； 6,413,507；6,420,339；6,437,025；6,448,369；6,461,802；6,828,401；6,858,736；美国专 利申请公开20010021763；20010044526；20010046481；20020052430；20020072573； 20020156047；20030114647；20030143596；20030158333；20030220447； 20040013637；2005000360；20050114037；20050171328和20050209416；和欧洲公 开EP 01064951和EP0822199；PCT公开WO 00176640；WO 0002017；WO 0249673； WO 9428024和WO 0187925(其中的每一种出版物在此引用以作参考)。
[0814]实施例21-A：例证性的聚乙二醇化形式的人类重组透明质酸酶
[0815]作为例证性sGASEGP的聚乙二醇化的示例性说明，PEG醛、琥珀酰亚胺 和碳酸盐每个都已经被应用于将PEG部分连接到rHuPH20。在这三种化学术中， 琥珀酰亚胺基PEG在rHuPH20这种情况下一般是最方便使用的。例如，rHuPH20 已经被结合到示例性的琥珀酰亚胺基单体PEG(monoPEG，mPEG)试剂，该试 剂包括mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl Propionates，mPEG-SPA)、mPEG- 琥珀酰亚胺丁酸酯(Succinimidyl Butanoates，mPEG-SBA)和(为了连接“支链” PEG)mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺。这些聚乙二醇化的琥珀酰亚胺酯含有位于PEG 基团和活化交联剂之间的不同长度的碳骨架，和单个或带支链的PEG基团。这些 区别可以被使用，例如，以提供不同的反应动力学和在结合过程中潜在地限制PEG 连接到rHuPH20的可利用的位点。
[0816]含有直链或支链PEG的琥珀酰亚胺PEG(如上)已经被结合到rHuPH20。 采用本领域所述的组分和技术，琥珀酰亚胺PEG已经被用于可再生性地产生 rHuPH20，其包括每个sHASEGP含有大约三到六个PEG分子的分子组合。这种 聚乙二醇化的rHuPH20组合物很容易被纯化，从而产生这样的组合物，其具有大 约25000Unit/mg蛋白透明质酸酶活性的比活性，且基本不含非聚乙二醇化的 rHuPH20(少于5％的非聚乙二醇化形式)。正如本领域已知的以及例如在包括上面 引用的那些在内的聚乙二醇化参考文献中描述的，各种试剂和技术也可被利用， 以实现与多分散性PEG产物不同的单分散PEG产物(参见，例如在上面详述的说 明书中引用的与位点特异性单聚乙二醇化和定点聚乙二醇化相关的综述和参考文 献)。
[0817]与未修饰形式的sHASEGP相比，在将聚乙二醇化的sHASEGP给药之后， 在动物模型中已经观察到药动学和药效学方面的改进。举例来说，在给小鼠静脉 注射1000单位的未修饰rHuPH20或1000单位的结合有分子量大约为40kDa的 PEG的rHuPH20(rHuPH20-PEG40)之后，观察到用rHuPH20-PEG40处理的小鼠 的血清内的中性活性透明质酸酶活性(PH20)的血清半衰期比用未修饰的rHuPH20 处理的小鼠中的血清半衰期明显地长(16-20倍)。此外，在大鼠中风模型中 rHuPH20-PEG40的有效性已经与非聚乙二醇化的rHuPH20进行比较。来自这些研 究的最初的结果表明，在诱导中风之后七天的大鼠存活方面，rHuPH20-PEG40(高 于75-85％存活，相对于对照的低于50％)具有更大的有效性。
[0818]利用可从Nektar得到的各种PEG试剂，我们使用mPEG-SBA(30kD)、 mPEG-SMB(30kD)和基于mPEG2-NHS(40kD)、mPEG2-NHS(60kD)的支链形式， 已经制备出示例形式的人类重组透明质酸酶(特别地，基于rHuPH20的优选的酶)。 这些试剂和许多其他试剂可以各种分子量获得(参见，例如2005-06的Nektar产 品目录，其可在线得到：http://www.nektar.com或 http://www.nektar.com/pdf/nektar_catalog.pdf，这些目录和参考文献在此引用以作参 考)。许多其它的PEG试剂和方法可从其他供应商得到和/或在本领域有所描述。 作为举例说明，使用NHS化学术，以及碳酸酯和醛，聚乙二醇化形式的rHuPH20 已经被产生，其中使用可从Nektar得到的以下各种试剂：支链的mPEG2-NHS-40K (Nektar#2z3y0t01)、支链的mPEG-NHS-10K(Nektar#2z3x0Lo1-10)、支链的 mPEG-NHS-20K(Nektar#2z3x0Lo1-20)、支链的mPEG-NHS-40K(Nektar#2z3x0Lo 1-40)、支链的mPEG2-NHS-60K(Nektar#2z3y0v01)、mPEG-SBA-5K(Nektar #2m450h01)、mPEG-SBA-20K(Nektar#2M450p01)、mPEG-SBA-30K(Nektar #2M450r01)、mPEG-SMB-20K(Nektar#2m4k0p01)、mPEG-SMB-30K(Nektar #2m4k0r01)、mPEG-丁醛-30K(Nektar#072M0R01)、mPEG-SPA-20K(Nektar #2m4m0p01)、mPEG-SPA-30K(Nektar#2m4m0r01)，和PEG-NHS-5K-生物素 (Nektar#0H4M0H02)。
[0819]使用来自Dowpharma——陶氏化学集团的一个分公司——的PEG试剂，我 们也制得了聚乙二醇形式的透明质酸酶(例如rHuPH20)；包括用Dowpharma的 对硝基苯基碳酸酯PEG(30kDa)和丙醛PEG(30kDa)聚乙二醇化的透明质酸 酶。基本上按照下述地使用和测试Nektar和Dowpharma试剂及其获得产品，产生 很多种聚乙二醇化透明质酸酶组合物。采用类似技术，其它试剂和其它透明质酸 酶也可以类似地发生反应。
[0820]为了产生聚乙二醇形式的rHuPH20，在针对每种PEG试剂或化学术推荐的 pH和其它条件下(一般地，醛反应是在pH大约4.5下进行，NHS反应是在中性 pH下进行，碳酸盐反应是在pH大约9.5下进行)，将纯化的酶(浓度在大约1 到14mg/ml之间)与摩尔过量的各种PEG试剂(一般大约10∶1的摩尔过量的 PEG∶酶)混合。反应组分在4摄氏度下混和大约16小时而进行反应。
[0821]SDS-PAGE被用于初步检测反应产物。一般地，未修饰的rHuPH20被观察 到作为大约63kDa分子量的单一条带进行迁移。各种聚乙二醇形式的rHuPH20一 般包括在大约150-200kDa范围(典型地大约180kDa)的条带以及大于200kDa的 几个条带。
[0822]然后我们进行了修饰的酶产物的凝胶过滤，接着测试分级分离的蛋白质的 酶活性。简单地说，按照本领域已知的技术，将PEG修饰的透明质酸酶与其各自 的天然未修饰形式分离是通过使用Superose 6柱(GE/Pharmacia)的凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography)进行的。用磷酸盐缓冲盐水作为分离的流动相，流 速为0.2ml/分钟。该柱采用GE/Pharmacia的凝胶过滤标定标准(Gel Filtration Calibration Standards)进行校准。含有分离的透明质素降解酶的级分，通过改进的 美国药典浊度分析实验以微量滴定的形式来测试其相对透明质酸酶活性。通过 Superose 6凝胶过滤柱分级分离的rHuPH20透明质酸酶活性的峰保留体积(时间)， 从未修饰的透明质酸酶的大约16ml(大约60到80KD的表观分子量)移至Peg- 修饰的透明质酸酶的大约10ml(大于100,000KD到大约670,000KD的表观分子 量)。当摩尔过量的聚乙二醇与酶反应时，Peg修饰可明显且完全地将所有可测酶 活性移至更高分子量的修饰形式。
[0823]然后我们采用酶谱法(Zymography)(利用底物凝胶电泳进行的糖胺聚糖降 解活性分析)测定各种天然和修饰的酶的酶活性。简单地说，含有透明质素的 SDS-PAGE酶谱凝胶被铺设，并且基本上按照以前由MiuraRO，et al.Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis(zymography). Anal Biochem.1995 Mar 1；225(2)：333-40描述的方法进行分析。
[0824]根据表观分子量为大约60kDa的单个条带，天然rHuPH20透明质酸酶表明 了在酶谱凝胶中的透明质素降解活性。rHuPH20透明质酸酶的Peg修饰导致了酶 谱凝胶中透明质素降解活性的迁移，其具有在大约180kDa的酶活性信号，并且具 有大于200kDa分子量的酶活性的至少2个额外条带。
[0825]这些结果和本文描述的其它结果表明，使用各种PEG试剂的任何一种，糖 胺聚糖酶可以有效地通过聚乙二醇化作用而被修饰(其可被用于改变它们的药物 代谢动力学特性和/或其它特性)，并且得到的酶可以保留基本的酶活性，使其可以 应用于各种不同应用的任何一种——尤其体内或其它的应用，其中修饰酶以延长 其半衰期可能是有用的。
[0826]实施例21-B：例证性的聚乙二醇形式的非人类透明质酸酶
[0827]尽管人类重组透明质酸酶，在该酶被用于与人类细胞相关的方面是特别优 选的，并且当其应用到人体或人体内时更是特别优选的，但本文所阐明的技术也 可被用于产生药物代谢动力学改进形式的其它透明质酸酶，其可在某些背景或环 境下具有合适的应用。因此，通过将本文所阐明的和本领域所述的方法应用到其 它透明质酸酶，我们已经生产出许多修饰的酶，其被聚乙二醇化(其可以如上所 述地用于改善它们的药物代谢动力学)而且还保留了基本的酶活性。为了举例说 明，本文所述和阐明的方法已经被应用于一系列不同的示范性的“非人类”透明 质酸酶，包括例证性的动物来源的透明质酸酶、例证性的细菌来源的透明质酸酶 和例证性的细菌来源的具有透明质酸酶活性的软骨素酶。如本文所述，聚乙二醇 形式的这些非人类透明质酸酶被用于有效地提供延长的半衰期(例如在静脉给药 或其它体内给药之后)。
[0828]作为非人类动物来源的透明质酸酶的例证性的实例，我们已经产生了聚乙 二醇化形式的羊睾丸透明质酸酶(可从ISTA Pharmaceuticals得到，为VitraseTM)。 购买于ISTA Pharmaceuticals的Vitrase(注射用透明质酸酶，冻干的，Ovine NDC 67425-001-01，6200USP单位/瓶)是来自眼科专家的礼物。Vitrase溶液通过将冻干 的Vitrase用USP 0.9％氯化钠注射液(Baxter)进行重构来制备。
[0829]作为非人类细菌来源的透明质酸酶的例证性的实例，我们已经产生了聚乙 二醇化形式的细菌透明质酸酶，其可作为透明质酸裂解酶(Hyaluronate Lyase)从 Sigma得到。来自Streptomyces hyalurolyticus或其它种类的透明质酸裂解酶(CAS Number 9001-54-1，EC Number 4.2.2.1)(674单位/瓶)购买于Sigma。透明质酸裂 解酶用无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水进行重构。参见，例如Ohya，T.，and Kaneko，Y. Biochim.Biophys.Acta 198，607，(1970)。
[0830]作为非人类的具有透明质酸酶活性的软骨素酶的例证性的实例，我们已经 产生了聚乙二醇化形式的细菌软骨素酶ABC(可为从Associates of Cape Cod，Inc. Seikagaku Corporation得到的软骨素酶ABC)。来自普通变形菌(Proteus vulgaris) 的软骨素酶ABC(软骨素ABC裂解酶，软骨素ABC消除酶，EC Number：4.2.2.4， CAS Number：9024-13-9，cat.#100330或10033)购自Associates of Cape Cod Inc.。 软骨素酶ABC溶液是在0.1％BSA溶液中制备。参考文献包括：(1)Yamagata，T.，et al.，J.Biol.Chem.，243，1523(1968)；(2)Saito，H.，et al.，J.Biol.Chem.，243，1536 (1968)；(3)Suzuki，S.，et al.，J.Biol.Chem.，243，1543(1968)；和(4)Oike，Y.，et al.，J. Biol.Chem.，257，9751(1982)。
[0831]作为例证性的PEG试剂，我们使用了mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(可为从 Nektar得到的mPEG-SBA(30kD))。虽然mPeg-SBA-30K(甲氧基聚(乙二醇)丁酸 的N-羟基琥珀酰亚胺酯，平均分子量30,000，Cat#2M450R01)被用于此实施例， 也可使用其它任何分子量的甲氧基聚(乙二醇)的N-羟基琥珀酰亚胺酯或者任何分 子量的聚(乙二醇)的N-羟基琥珀酰亚胺酯，或任何大小的peg-醛，或任何大小的 peg-碳酸酯，或其它Nektar PEG试剂，或其它聚乙二醇化试剂。参考，例如Zalipsky， S and C Lee，″Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，″J.M.Harris，ed.，Plenum，NY，1992，cf.chapter 21。
[0832]为了生产示例性的聚乙二醇化形式的动物来源的透明质酸酶，一小瓶羊睾 丸透明质酸酶(Vitrase)用0.62ml 0.9％的盐水进行重构(10单位/微升)，并且将 0.3ml重构的酶溶液转移到无菌管中。将示例性的PEG试剂，mPeg-SBA-30K(9.9 mg)加入到含有Vitrase溶液的管中，该管被混合直到看上去所有mPeg进入溶液， 然后该混合物在混合下于4摄氏度反应大约16小时。
[0833]为了生产示例性的聚乙二醇化形式的细菌来源的透明质酸酶，一安瓿的 Sigma透明质酸裂解酶用0.7ml无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水进行重构(～1单位/微 升)，并将0.3ml重构的酶溶液转移到无菌管中。将示例性的PEG试剂， mPeg-SBA-30K(9.8mg)加入到含有透明质酸裂解酶溶液的管中，该管被混合直到 看上去所有mPeg进入溶液，然后该混合物在混合下于4摄氏度反应大约16小时。
[0834]为了生产示例性的聚乙二醇化形式的细菌来源的具有透明质酸酶活性的软 骨素酶，一小瓶软骨素酶ABC(10单位)用0.2ml的0.9％盐水进行重构，并将示 例性的PEG试剂，mPeg-SBA-30K(12.4mg)加入到含有软骨素酶ABC溶液的小瓶 中，混合直到看上去所有mPeg进入溶液，然后该混合物在混合下于4摄氏度反应 大约11小时。
[0835]最初的分析包括应用SDS-PAGE检测修饰的酶，并与未修饰的对照进行比 较。简单地说，在通过3％到8％的NuPage Tris/Acetate凝胶(Invitrogen)分离后，用 考马斯兰(Coomassie Blue)或银染色观察全部的蛋白质。染色的条带的分子量可 通过与在同一凝胶上跑胶的已知分子量的标准蛋白质比较而确定。
[0836]Vitrase的结果如下：(A)Vitrase(未修饰)，为大约如下分子量的5个条带 (kDa)：90、80、63、50和40；(B)PEG-Vitrase，为大约如下分子量的7个条带 (kDa)：150、180和大于200的五个条带。
[0837]软骨素酶ABC的结果如下：(A)软骨素酶ABC(未修饰)，为大约如下分 子量的6个条带(kDa)：100、80、50、38、33和30；(B)PEG-软骨素酶ABC， 为大约如下分子量的8个或更多的条带(kDa)：150-200的一到两个条带和大于 200的六个或更多的条带。
[0838]透明质酸裂解酶的结果如下：(A)透明质酸裂解酶(未修饰)，为大约如下 分子量的一个条带(kDa)：35；(B)PEG-透明质酸裂解酶，为大约如下分子量的 四个或更多的条带(kDa)：大于200。
[0839]正如被证实的，活化的聚乙二醇(例如mPeg-SBA-30K(甲氧基(聚乙二醇) 丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯，平均分子量30,000))，可应用于羊透明质酸酶(例 如Vitrase)、细菌软骨素酶ABC(例如，来自普通线形菌)或细菌透明质酸裂解酶 (例如，来自Streptomyces hyalurolyticus)，以使酶制剂发生化学变化，产生平均 分子量增加的新分子，这将与聚乙二醇形式的这些酶的产生联系起来。对这些产 物的进一步表征提供了额外的证据，这些酶不仅仅能被有效地聚乙二醇化，而且 得到的酶产物能在透明质素降解中显示出基本的酶活性——这证明聚乙二醇化可 应用于这些各种类型的酶(其可被用于改变它们的药物代谢动力学特性而同时保 留了基本的酶活性)。
[0840]然后我们进行了修饰的酶产物的凝胶过滤，接着测试分级分离的蛋白质的 酶活性。简单地说，按照本领域已知的技术，将PEG修饰的透明质酸酶与其各自 的天然未修饰形式分离是通过使用Superose 6柱(GE/Pharmacia)的凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography)进行的。用磷酸盐缓冲盐水作为分离的流动相，流 速为0.2ml/分钟。该柱采用GE/Pharmacia的凝胶过滤标定标准(Gel Filtration Calibration Standards)进行校准。含有分离的透明质素降解酶的级分，通过改进的 美国药典浊度分析实验以微量滴定的形式来测试其相对透明质酸酶活性。对于每 种特定酶，用于分析每种要检测的透明质素降解酶的活性的pH和缓冲液如文献所 述。
[0841]通过Superose 6凝胶过滤柱分级分离的羊透明质酸酶活性(例如，Vitrase) 的峰保留体积(时间)，从天然的羊透明质酸酶的15.5ml(大约60到80KD的 表观分子量)移至Peg-修饰的羊透明质酸酶的9.5ml(大于100,000KD到大约 670,000KD的表观分子量)。当过量摩尔的聚乙二醇与羊酶反应时，Peg修饰可明 显且完全地将所有可测酶活性移至更高分子量的修饰形式。
[0842]注入后天然细菌透明质酸裂解酶活性的峰保留体积(时间)为大约16ml (大约50到70KD的表观分子量)。凝胶过滤分级分离的Peg-修饰的透明质酸裂 解酶在任何级分都没表现出酶活性。没有可测到的酶活性，包括其中天然透明质 酸裂解酶活性在正常情况下可检测到的部分，这表明peg修饰对酶功能产生负作 用。
[0843]Peg-修饰的软骨素酶ABC表明注入后在大约11ml和13ml的酶活性峰(大 约在200和600KD之间的表观分子量)以及注入后还有在大约16ml的峰(大约 50到70KD的表观分子量)。注入后天然软骨素酶ABC具有只在大约16ml的酶 活性。该数据表明该软骨素酶ABC被peg修饰过，保持比天然分子量分子高的酶 活性。
[0844]凝胶过滤法(gel filtration)可用于评价透明质素降解酶的Peg-修饰的程度； 分级分离制剂的酶活性的分析可用于评价Peg修饰对透明质素降解酶的酶活性的 影响，这与总活性和显示酶活性的组分的分子量有关。
[0845]然后我们采用酶谱法(Zymography)(利用底物凝胶电泳进行的糖胺聚糖降 解活性分析)测定各种天然和修饰酶的酶活性。简言之，含有透明质素的SDS-PAGE 酶谱凝胶被铺设，并基本上按照以前在Miura RO，et al.Analvsis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis(zymography). Anal Biochem.1995 Mar 1；225(2)：333-40中描述的方法进行分析。
[0846]天然羊透明质酸酶表明在酶谱凝胶中的透明质素降解活性，鉴定出在大约 60KD和90KD的两个主要活性条带，它们在这些分子量之间具有一些拖尾的酶 活性。没有表现出大于100KD的酶活性。羊透明质酸酶的Peg修饰表现为酶谱凝 胶中的透明质素降解活性的移动，其具有在大约150KD的酶活性信号，和具有大 于200KD分子量的酶活性的至少2个额外条带。
[0847]天然软骨素酶ABC在酶谱凝胶中显示出单个透明质素降解活性条带，表明 分子量大约在80到90KD。软骨素酶ABC的peg修饰表现为酶谱凝胶中的透明 质素降解活性的移动，其具有大约在180KD的酶活性信号，和具有大于200KD 分子量的活性的至少一个额外条带。
[0848]因此，酶谱分析证实，示例性的动物来源的透明质酸酶(Vitrase)和示例 性的具有透明质酸酶活性的细菌来源的软骨素酶(软骨素酶ABC)可以通过聚乙 二醇化(其可用于改变它们的药物代谢动力学特性，正如上面针对重组人类透明 质酸酶的描述)而被修饰，而且得到的修饰酶仍能显示出基本的酶活性。
[0849]考虑到前面的实施例，本领域技术人员将理解的是，其它透明质酸酶(本 文所述的人类和其他重组形式的酶，以及其它非人类动物的或细菌的，原核的或 其它的透明质酸酶，以及软骨素酶)同样可用本领域已知或最新发现的各种PEG 试剂的任何一种来修饰，以产生具有改变了的药物代谢动力学和/或其它特性的修 饰酶，其使得它们能用在特定的应用中。
[0850]实施例22-例证性地使用sHASEGP以促进小分子药理试剂在体内的扩散
[0851]作为使用本发明的sHASEGP组合物来促进药理试剂散布或扩散进入哺乳 动物的器官和组织以及在其内部的散布或扩散的例证性的实施例，我们对使用 rHUPH20促进地塞米松(dexamethasone)(“dex”，用作示例性的药理小分子的抗 炎剂)渗透到哺乳动物眼组织中进行了评价。
[0852]对于像麻醉剂这样的试剂注射到哺乳动物的眼睛，实现麻醉阻断所通常使 用的途径包括眼球周围的、眼球后部的和特农囊下的注射。对于该例证性的实施 例，我们比较了在有或没有sHASEGP伴随给药的情况下的dex特农下注射，然后 检测眼后部组织中dex的浓度，特别是脉络膜和视网膜，其是重要的药物靶但是 有效地接触药理试剂经常是困难的。
[0853]使用新西兰红雄兔(大约2.1到3.2kg)并采用盐酸克他命(21mg/kg)和 盐酸甲苯噻嗪(5.25mg/kg)肌肉注射使其处于基础麻醉状态。表面给药的0.5％ 的丙美卡因(proparacaine)用于麻醉眼睛表面。瞳孔用1％的托吡卡胺(tropicamide) 和2.5％的去氧肾上腺素(phenylephrine)进行扩大。用囊膜剪(Vannas scissor) 将每只兔的右眼结膜剪开之后，将Medez三端口麻醉套管(Eagle Laboratories， Rancho Cucamonga，CA)的一端插入巩膜外隙，1.5ml单独的dex(American Pharmaceutical Partners，n＝18)或含有sHASEGP(3000单位的rHUPH20，n＝18) 的dex被注射到眼的后极附近。棉签(cotton-tipped applicator)放置在结膜入口处 以防流体流出。
[0854]注射后1、2、3或6小时，兔依上述进行麻醉，通过心内注射戊巴比妥(120 mg/kg)将其致死。安乐死之后，取出1ml血样，将两只眼睛从每个动物中剜出。 剜出之后立刻用结核菌素注射器通过前房穿刺术从每个眼睛中收集2ml的房水样 品。从剜出的眼睛中去除前段之后，吸出1ml玻璃质样品并将其放到标记的 Eppendorf管。眼睛的剩余部分被切开，并用6mm环钻(Fine Science Tools，Foster City，CA)将视神经下组织样品打孔，药物在巩膜外侧被注射其中。从打孔的组织 中用钝的刀片将视网膜刮下，并将其放入标记管中，对于脉络膜也是如此。
[0855]用质谱评价组织内的dex水平，其可检测下限在5ng/ml的级别。对于脉络 膜和视网膜样品，含有50mM Tris碱、1mM MgCl2，pH 9.0的缓冲液被加入到该 组织，所以最终浓度为20mg/ml。该组织用超声匀浆器(BioLogics，Inc.，型号150 V/T)碎解5-15秒。组织匀浆、玻璃体液、含水液体和血浆的样品都采用如下方 法分析。含有作为内标(internal standard，I.S.)的地塞米松和强的松龙(prednisolone) 的样品，用甲基叔丁醚通过涡流混合五分钟进行萃取。有机相和水相通过在1,300g 离心5分钟而分离，将水相在-70℃冷冻十五分钟，并将有机相倒入新管，在40℃ 氮气流中进行蒸发。残留物用水∶乙睛(50∶50v/v)重构。处理后的样品采用高效 液相色谱使用保持在45℃的Phenomenex Synery Polar RP柱进行分析。流动相用加 热的氮气在Z-喷雾源/界面处被雾化，离子化的化合物用串联四极质谱仪进行检测。 得到了地塞米松和强的松龙的峰高并用MassLynxTM软件，Micromass，Beverly，MA 进行积分。校准曲线是通过将标准品与内标的峰高比在MassLynxTM中拟合成幂方 程得到的。然后该校准曲线方程通过使用样品的峰高比可用于内插获得样品中地 塞米松的浓度。
[0856]质谱结果表明，单独用dex处理的兔的脉络膜、视网膜和玻璃体的地塞米 松水平在第一时间点达到峰浓度(即注射后1小时)；而接受同时给药的sHASEGP 的兔的脉络膜和视网膜的dex浓度更高而且持续增加直到第二时间点(即注射后2 小时)。在已经用sHASEGP处理的组织中的脉络膜、视网膜和玻璃体峰浓度分别 是大约10倍、5倍和8倍高，而且曲线下的面积(areas under the curve，AUC)也 大了至少50％。
[0857]这些结果表明，sHASEGP的给药可用于实质上提高如dex的药理试剂的递 送，甚至到达体内相对难以到达的组织，例如哺乳动物眼睛的后段。另外，因为 相对厚的巩膜层构成在特农下注射间隙与靶向的脉络膜和视网膜层之间的组织屏 障，递送到后面层的高水平药理试剂表明，sHASEGP可用于有效地促进体内药理 试剂穿过组织层的递送。
[0858]在促进跨巩膜递送方面，sHASEGP因此能应用在最低侵入性的方法中，以 促进用于治疗影响眼睛后部的状况的试剂的传递，这在许多眼疾病的情形中是特 别令人感兴趣的。例如，这对于治疗脉络膜新血管生成(例如通过给予类固醇)、 黄斑变性和影响这些组织的其它疾病——它们典型地是通过玻璃体内注射来治 疗，可以提供更少侵入性的递送途径。目前还有很多种试剂被用于这些状况，例 如但不限于，地塞米松、氟羟强的松龙、MacugenTM和VEGF拮抗剂。
[0859]除了sHASEGP的酶活性有利于递送途径例如通过特农下注射的递送中的 扩散，也认为，导入一定流体容量的sHASEGP，所述流体容量能有效填充或扩张 其所注射的组织间隙，产生了正的液体静压，这有助于进一步驱动流体和其所包 含的试剂传递到周围组织中(例如，通过对流传输)。
[0860]实施例23-例证性地使用sHASEGP降低肿瘤间质流体压力，因此提高肿 瘤对抗肿瘤药理试剂的易感性
[0861]如本文所述和所阐明，sHASEGP可用于产生间质通道，其能增加流体流动 并且促进药理和其它试剂向体内期望的组织位点的递送。对于许多已知的和定期 开发的药理试剂，尤其抗肿瘤剂、抗代谢药、抗血管生成剂和各种细胞毒素剂和 细胞生长抑制剂，肿瘤代表了特别重要的靶标。与将这些药理试剂靶向到体内肿 瘤位点有关的挑战由于如下事实而加剧：许多肿瘤呈现了升高的间质压力，这倾 向于阻止被给药的药理剂的灌注，尤其是向肿瘤物质的深处位点。认为，sHASEGP 能减低这种阻力，因此有利于各种已知和最新开发的药理试剂中的任何一种向肿 瘤的递送，从而通过给定剂量的药剂使得它们更加敏感且更容易治疗。关于这些 方面，本发明的sHASEGP已经显示出能促进间质通道的形成而且加强上述各种大 小的标志物的扩散。此外，我们已经观察到sHASEGP可用于将间质组织的水力传 导性增加10倍以上。
[0862]正如肿瘤细胞情形下这些原理的确认，示例性的sHASEGP(rHuPH20，50单 位)应用于体外的肿瘤细胞，使得基本上除去细胞外周基质，其被认为是升高的 肿瘤间质流体压力的一个主要的贡献因素。
[0863]另外，在异种移植人类肿瘤模型中rHuPH20的体内给药，在给药一小时内 引起了肿瘤间质流体压力的显著降低。
[0864]如上面本发明详述中所描述，本发明的sHASEGP可与许多已知或新开发 的抗癌试剂的任何一种联合使用，用于治疗各种癌症。
[0865]实施例24-例证性地使用sHASEGP以增强通过非静脉内肠胃外注射传送 的大分子的药物动力学
[0866]如上所讨论，sHASEGP可用于调节已知或新开发的药理试剂和其它试剂的 药物动力学，例如通过促进它们的吸收和/或身体的分布。这种改善的药物代谢动 力学参数又可用来改善特定试剂的药效学(例如，通过减少注射部位附近残余试 剂的数量来降低局部毒性，和/或通过增加递送到(和/或穿过)期望靶的试剂的数 量来增加疗效)。另外，因为sHASEGP可用于有效驱动局部给药的药理试剂的扩 散(例如，穿过注射位点和进入血流中)，用sHASEGP本质上改善吸收的药动学 和用降低量的施加药物来获得类似的药效学也是可能的。
[0867]作为使用sHASEGP来增强大分子药物的药动学的一个例证性的实例，所 述药物通常通过非静脉内肠胃外注射给药，我们将重组人类PH20(rHuPH20)与 聚乙二醇化形式的干扰素α-2b(从Schering-Plough可得的PEG-INTRONTM)联合。 PEG-INTRON是大约31KD的大分子，其典型地通过皮下注射给药以治疗丙型肝 炎病毒(HCV)(通常与小分子药物三氮唑核苷(ribavirin)联合)。像许多皮下给 药的大分子一样，PEG-INTRON吸收相对缓慢而且相当一部分试剂从没进入血流， 其生物利用度在50-60％的级别。另外，相当一部分病人(典型地多于一半)表现 出各种注射部位反应，推定是由于滞留的局部浓度的药理试剂引起的或由此而恶 化的。正如本领域技术人员所理解的，这样的药物动力学的后果是翻数倍的；不 但包括注射位点附近所捕获的试剂的“浪费”，而且有局部代谢化合物反应。
[0868]我们通过各种给药途径进行碘-125标记的PEG-INTRON的给药，有或没有 rHuPH20的伴随给药，以检测rHuPH20对PEG-INTRON药物动力学参数的影响。 为了测定rHuPH20的绝对生物利用度，我们也测定了静脉给药的PEG-INTRON的 药物动力学参数。
[0869]简单地说，十八只Sprague-Dawley大鼠(每只重约225-250克)被分成三 组，每组六只。第一组静脉给予(通过尾静脉注射，100微升体积，1.5微克/kg) 测试品(即，I-125标记的PEG-INTRON)。I-125标记的干扰素的比活性为55uCi/ 微克。在给药前和给药后0.5、1、2、4、8、24、48、72、96和120小时收集血样 (100微升)，并将其处理以用于通过γ计数定量标记的药物(表示为每克血浆每 分钟数(CPM))。第二组六只动物通过皮内注射入颈后刮毛备好的地方给予等剂量 和体积的测试品，并且血样如第一组那样进行处理。第三组六只动物如前一组通 过皮内注射给予总体积100微升混合有rHuPH20(100I.U.)的等剂量的测试品， 然后如第一和第二组那样处理血样。该研究结果显示在下面的表24-1中。表24-1sHASEGP对干扰素药物动力学特性的影响
  时间   (小时)   PEG-INTRON   (1.5μg/kg)   皮内   SD   PEG-INTRON   (1.5μg/kg)+   sHASEGP 100U   皮内   SD   PEG-INTRON   (1.5μg/kg)   静脉内   0.5   30,289   9,989   54,808   12,995   281,781   1   43,137   9,343   76,672   17,570   185,630   2   54,655   11,128   102,159   17,626   155,591   3   55,261   11,105   115,329   24,910   128,656
  6   61,214   15,528   118,364   23,817   93,065   8   59,277   14,704   110,443   21,735   79,275   12   46,696   12,752   85,710   28,078   58,457   24   16,233   6,595   26,047   9,006   16,966   36   7,954   1,777   12,498   1,762   9,277   48   3,862   499   5,517   1,130   5,847   AUC   1,222,952   2,212,583   1,910,723   Cmax   61,214   118,364   -   Tmax   6   6   -   绝对生   物利用   度   64％   116％   100％
[0870]如表24-1所示，当PEG-INTRON的皮内给药结合sHASEGP的给药时，示 例性的药理剂PEG-INTRON的生物利用度(用AUC进行估测)得到显著改善。 事实上，联合以sHASEGP的皮内服药所达到的绝对生物利用度与直接的静脉内给 药在统计学上无法区别，对于直接的静脉内给药，所有的材料直接递送到血流里。 因此，与通过非静脉肠胃外给药引入的药理试剂联合使用的sHASEGP，可以提供 与直接向血流的给药相比拟的递送水平。尽管皮内给药后的Tmax必定更长(因为 药剂需要一些时间到达血流)，在ID(皮内)给药sHASEGP之后几个小时内血流 中试剂的浓度基本上达到IV(静脉内)给药所达到的浓度，而且之后显然超过它 们。
[0871]
[0872]实施例25-例证性地使用sHASEGP以促进通常由静脉内注射递送的大分 子的皮内递送
[0873]如上面所讨论，sHASEGP可用于通过不同给药途径促进已知或新开发的药 理试剂和其它试剂的递送，其可以提供更大的便利性、安全性、降低的成本和/或 其它益处。作为这样的再配制(reformulation)的例证性的实例，我们使用sHASEGP 来促进通常由静脉注射给药的大分子药物的皮内递送。对于此特定的实施例，我 们将重组人PH20(rHuPH20)与嵌合的人-鼠抗TNFα-单克隆抗体(Infliximab，可 从Centocor得到的REMICADETM)联合。REMICADE是大约150kD的大分子， 其典型地由静脉内注射给药，用于治疗关节炎或克氏病(Crohn′s disease)。因此， REMICADE的给药一般需要涉及静脉内接入以及伴随的专业护理和风险，而且每 次给药需要约两小时的时间。
[0874]REMICADE(20mg/ml)用125I标记至比活性为10μCi/mg。十八只大鼠被 分成三组，每组六只，(i)通过静脉内给药，(ii)通过皮内给药，或(iii)通过 联合100单位sHASEGP(来自100,000U/ml的储存液)的皮内给药，给予总体积 为100μl的放射性冷REMICADE(总共10mg/kg)混合物；然后在给药后的不同 时间点血液和组织通过γ计数进行处理，基本上遵照前面实施例所述。结果概括 在表中：表25-1sHASEGP对REMICADE的药物动力学参数的影响
  时间   (小时)   CPM   REMICADE   (10mg/kg)   皮内   SD   CPM   REMICADE   (10mg/kg)+   sHASEGP 100U   皮内   SD   CPM   REMICADE   (10mg/kg)   静脉内   0.5   27,451   2,221   94,888   31,318   1,657,849   1   37,213   10,775   146,793   42,014   1,645,571   2   66,001   6,078   412,047   61,240   1,576,145   4   120,704   21,744   691,626   89,002   1,260,646   8   256,987   32,459   833,826   133,887   1,157,268   24   493,004   75,694   853,423   65,777   790,357   48   515,439   53,431   728,302   74,848   684,599   72   454,717   54,388   640,303   81,492   558,307   96   375,993   39,744   598,413   59,533   496,658   120   336,067   66,964   518,861   53,643   434,008   AUC   53,350,555   118,424,609   82,718,550   Cmax   515,439   853,423   1,657,849   Tmax   48   24   0   绝对生物   利用度   62％   121％   100％
[0875]如表25-1所示，当皮内给药联合以一定剂量的sHASEGP时，示例性药理 剂REMICADE的生物利用度(用AUC进行估价)得到显著改善。正如 PEG-INTRON的增强的递送所观察到的，联合以sHASEGP的皮内服药所达到的 REMICADE生物利用度的整体水平在统计学上与静脉内给药的生物利用度相似， 静脉内给药时，所有的材料直接递送到血流里。尽管皮内给药后REMICADE Tmax 相对于静脉给药一定更长，在ID(皮内)给药sHASEGP之后二十四小时内血流 中试剂的浓度超过IV(静脉内)给药所观察到的浓度，而且之后接近或超过IV浓 度。与不含sHASEGP的ID给药相比，使用sHASEGP时所观察到的Tmax的到 达要快两倍(24小时对48小时)；Cmax和生物利用度(AUC)两者都实质上增 加(分别为大约65％和95％)。
[0876]实施例26-例证性使用sHASEGP以促进通常由非静脉肠胃外注射递送的 更大大分子复合物的皮内递送
[0877]作为使用sHASEGP来增强通常由非静脉内肠胃外注射给药的大分子药物 的药物动力学的例证性的实施例，我们将重组人PH20(rHuPH20)与重组人因子 VIII(RECOMBINATETM，可从Baxter得到)联合。因子VIII是包含多个多肽的大 的糖蛋白复合物，具有大约为280kD的结合分子。因子VIII典型地只通过静脉注射 给药以治疗血友病。像皮下给药的许多大分子一样，因子VIII吸收相对缓慢，而且 相当一部分试剂从来没使其进入血流，其生物利用度在0.5-1％的级别。
[0878]十八只大鼠被分成三组，每组六只，(i)通过静脉内给药，(ii)通过皮 内给药，或(iii)通过联合sHASEGP的皮内给药，给予125-I标记的因子VIII；然 后在给药后的不同时间点处理血液和组织，基本上遵照前面实施例所述测量每克 血浆每分钟数(counts per minute，CPM)。表26-1rHuPH20对因子VIII的药物代谢动力学的影响
  时间   (小时)   CPM   因子VIII   (50IU/kg)   皮内   SD   CPM   因子VIII   (50IU/kg)+   sHASEGP 100U   皮内   SD   CPM   因子VIII   (50IU/kg)   静脉内   0.5   29,748   12,002   46,376   5,503   670,743   1   43,767   9,415   70,249   14,614   379,558   2   49,507   14,592   72,736   14,985   247,397   3   56,087   17,621   76,631   14,454   200,602   4   55,494   12,721   84,066   8,646   177,846   5   55,277   14,181   79,735   9,363   165,914   6   50,195   13,970   72,176   6,848   121,198   8   52,290   13,707   66,419   10,495   114,579   12   48,336   10,765   58,817   11,760   75,912   24   23,173   4,700   24,596   4,426   29,610   AUC   1,014,521   1,303,078   2,554,607   Cmax   56,087   84,066   -   Tmax   4   4   -   绝对生物   利用度   39.7％   51％   100％
[0879]如表26-1所示，相对于单独的因子VIII，因子VIII与rHuPH20的共同给药显著 增加了全身性生物利用度(P＜0.01)。利用TCA沉淀对于消除进入血流中完全降 解的I-125标记的因子VIII蛋白质的分布来说是必须的。
[0880]实施例27-例证性地使用sHASEGP来改善中风后的存活和/或行为结果
[0881]在第一组研究中，sHASEGP在中风大鼠模型中进行评估。简单地说，通过 中大脑动脉阻塞手术致使Sprague-Dawley大鼠中风，接着在不同时间进行对照溶 液(盐水)或测试溶液(含sHASEGP的盐水)的静脉给药。让动物康复，并且在 一定时间期间接着评价对照与测试组的存活比。另外，存活者在一系列时间点采 用与中风典型地相关的行为征状的多种分析进行评价。只有在最初的资格预选的 前肢屈伸测试中表现正常的大鼠被包括在该研究中，而且随后随机指定为对照或 测试组的动物。
[0882]无菌外科手术由Zivic Laboratories基本上如下进行。大鼠在提供有2.5％氟 烷(halothane)的室内被麻醉。制造腹部中线切口，并且分离出肌肉组织，暴露出 右外颈动脉，然后将其隔离并两次结扎。然后将未系但束紧的5/0聚酰胺结扎线放 在外颈动脉残余部分(stump)周围。在残余部分的内腔切个小洞，并将18-20mm 长的4/0微丝(microfilament)缝合材料插入内腔而且深入到内部的颈动脉里。当 完全深入时，线栓(monofilament)的内端应当阻止向中大脑动脉的流动。然后束 紧的聚酰胺结扎线被系好以固定住线栓。牵拉被移除，皮肤切口用伤口钳关闭。
[0883]静脉注射程序基本上如下进行。大鼠在提供有2.5％氟烷(halothane)的室 内被麻醉。制造腹部皮肤切口，露出颈静脉。无菌的1ml一次性注射器装上30规 格的针并装上注射材料。用锁骨作支撑，将注射器插入颈静脉(使用注射器上微 小的负压将血液吸进注射器，由此确认静脉注射的合适位置)，然后注射材料缓慢 注射到颈静脉中。注射后，将针慢慢抽出(而且任何出血用无菌棉签进行控制)， 然后皮肤用伤口钳关闭。
[0884]诱发中风后各组(每组大约40只动物)中动物的存活被监控，然后将每天 的存活者数量对中风后的天数进行作图，得到Kaplan-Meier中风曲线。到中风后 第三天时各组间的实质性区别变得明显。致使中风后一周时，超过一半的对照动 物已经死亡，而将近四分之三的sHASEGP治疗的动物仍存活，这是统计学上的显 著差别(p＝0.03)。
[0885]除了测量中风后的存活比率，存活者也采用被设计用来评估中风相关的某 些行为问题的发生率的其它分析进行测试(在中风后第1、2、3和4周)。被评价 的行为状况包括前肢屈曲、躯干扭曲、后肢、步态扰乱和墙走，其被用于生成PNEGS 行为得分(较高的得分反映中风相关的行为问题的增加)。诱发中风后第二周， sHASEGP治疗的动物表现出显著更好的行为得分(p＝0.02)，治疗组与对照之间 的相对差异在随后的几周变得甚至更大(对于第三周和第四周分别为p＝0.007和 p＝0.003)。
[0886]尽管参考上面的实施例本发明已经被描述，要理解的是，修改和变动都包 括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅仅受权利要求限制。相关申请的交叉参考
[0001]本申请是2005年9月27日提交的美国申请系列第11/238,171号的部分继 续申请，上述申请是2005年2月23日提交的美国申请系列第11/065,716的部分 继续申请，它们中的每一个均以其全部并入本文作为参考。

发明背景

序列表
<110>海洋酶医疗公司(HALOZYME THERAPEUTICS，Inc.)
L·H·布宾枫(Bookbinder，Louis H.)
A·昆度(Kundu，Anirban)
G·I·弗罗斯特(Frost，Gregory I.)
M·F·哈勒(HALLER，Michael F.)
G·A·凯勒(KELLER，Gilbert A.)
T·M·迪兰(DYLAN，Tyler M.)
<120>可溶性糖胺聚糖酶及制备和应用可溶性糖胺聚糖酶的方法
<130>HAL01340-3WO
<150>US 11/238,171
<151>2005-09-27
<150>US 11/065,716
<151>2005-02-23
<160>53
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>509
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>82，166，235，254，368，393，490
<400>1
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val
                485                 490                 495
Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
            500                 505
<210>2
<211>35
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr
        35
<210>3
<211>474
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp
 1               5                  10                  15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro
            20                  25                  30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala
        35                  40                  45
Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr
    50                  55                  60
Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp
            100                 105                 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val
        115                 120                 125
Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg
                165                 170                 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His
            180                 185                 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile
        195                 200                 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu
    210                 215                 220
Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile
                245                 250                 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val
            260                 265                 270
Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr
        275                 280                 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp
    290                 295                 300
Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu
                325                 330                 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys
            340                 345                 350
Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp
        355                 360                 365
Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly
    370                 375                 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys
385                 390                 395                 400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp
                405                 410                 415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala
            420                 425                 430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn
        435                 440                 445
Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu
    450                 455                 460
Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
465                 470
<210>4
<211>448
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp
 1               5                  10                  15
Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro
            20                  25                  30
Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala
        35                  40                  45
Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr
    50                  55                  60
Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp
            100                 105                 110
Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val
        115                 120                 125
Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg
                165                 170                 175
Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His
            180                 185                 190
His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile
        195                 200                 205
Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu
    210                 215                 220
Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile
                245                 250                 255
Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val
            260                 265                 270
Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr
        275                 280                 285
Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp
    290                 295                 300
Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu
                325                 330                 335
Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys
            340                 345                 350
Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp
        355                 360                 365
Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly
    370                 375                 380
Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys
385                 390                 395              400
Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp
                405                 410             415
Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala
            420                 425             430
Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn
        435                 440             445
<210>5
<211>482
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
Phe Tyr
<210>6
<211>1530
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1530)
<223>PH-20 GPI锚定透明质酸酶糖蛋白
<400>6
atg gga gtg cta aaa ttc aag cac atc ttt ttc aga agc ttt gtt aaa    48
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                   10                  15
tca agt gga gta tcc cag ata gtt ttc acc ttc ctt ctg att cca tgt    96
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
             20                  25                  30
tgc ttg act ctg aat ttc aga gca cct cct gtt att cca aat gtg cct    144
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
         35                  40                  45
ttc ctc tgg gcc tgg aat gcc cca agt gaa ttt tgt ctt gga aaa ttt    192
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
     50                  55                  60
gat gag cca cta gat atg agc ctc ttc tct ttc ata gga agc ccc cga    240
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
 65                  70                  75                  80
ata aac gcc acc ggg caa ggt gtt aca ata ttt tat gtt gat aga ctt    288
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                 85                  90                  95
ggc tac tat cct tac ata gat tca atc aca gga gta act gtg aat gga    336
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
gga atc ccc cag aag att tcc tta caa gac cat ctg gac aaa gct aag    384
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
aaa gac att aca ttt tat atg cca gta gac aat ttg gga atg gct gtt    432
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
att gac tgg gaa gaa tgg aga ccc act tgg gca aga aac tgg aaa cct    480
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
aaa gat gtt tac aag aat agg tct att gaa ttg gtt cag caa caa aat      528
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
gta caa ctt agt ctc aca gag gcc act gag aaa gca aaa caa gaa ttt      576
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
gaa aag gca ggg aag gat ttc ctg gta gag act ata aaa ttg gga aaa      624
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
tta ctt cgg cca aat cac ttg tgg ggt tat tat ctt ttt ccg gat tgt      672
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
tac aac cat cac tat aag aaa ccc ggt tac aat gga agt tgc ttc aat      720
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
gta gaa ata aaa aga aat gat gat ctc agc tgg ttg tgg aat gaa agc      768
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
act gct ctt tac cca tcc att tat ttg aac act cag cag tct cct gta      816
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
gct gct aca ctc tat gtg cgc aat cga gtt cgg gaa gcc atc aga gtt      864
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
tcc aaa ata cct gat gca aaa agt cca ctt ccg gtt ttt gca tat acc      912
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
cgc ata gtt ttt act gat caa gtt ttg aaa ttc ctt tct caa gat gaa      960
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
ctt gtg tat aca ttt ggc gaa act gtt gct ctg ggt gct tct gga att      1008
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
gta ata tgg gga acc ctc agt ata atg cga agt atg aaa tct tgc ttg      1056
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
ctc cta gac aat tac atg gag act ata ctg aat cct tac ata atc aac      1104
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
gtc aca cta gca gcc aaa atg tgt agc caa gtg ctt tgc cag gag caa      1152
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
gga gtg tgt ata agg aaa aac tgg aat tca agt gac tat ctt cac ctc      1200
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
aac cca gat aat ttt gct att caa ctt gag aaa ggt gga aag ttc aca      1248
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
gta cgt gga aaa ccg aca ctt gaa gac ctg gag caa ttt tct gaa aaa      1296
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
ttt tat tgc agc tgt tat agc acc ttg agt tgt aag gag aaa gct gat      1344
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
gta aaa gac act gat gct gtt gat gtg tgt att gct gat ggt gtc tgt      1392
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
ata gat gct ttt cta aaa cct ccc atg gag aca gaa gaa cct caa att      1440
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
ttc tac aat gct tca ccc tcc aca cta tct gcc aca atg ttc att gtt      1488
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val
                485                 490                 495
agt att ttg ttt ctt atc att tct tct gta gcg agt ttg taa              1530
Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu  *
            500                 505
<210>7
<211>509
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>CARBOHYD
<222>82，166，235，254，368，393，490
<400>7
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465                 470                 475                 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val
                485                 490                 495
Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu
            500                 505
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少N483并以Y482作为结束，5’端有BamHI位点
<400>8
aattggatcc tcagtagaaa atttgaggtt cttc                                34
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少Y482并以F481作为结束，5’端有BamHI位点
<400>9
aattggatcc tcagaaaatt tgaggttctt ctg                                 33
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少F481并以I480作为结束，5’端有BamHI位点
<400>10
aattggatcc tcaaatttga ggttcttctg tctc                                34
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少I480并以Q479作为结束，5’端有BamHI位点
<400>11
aattggatcc tcattgaggt tcttctgtct cc                                  32
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少Q479并以P478作为结束，5’端有BamHI位点
<400>12
aattggatcc tcaaggttct tctgtctcca tg                                  32
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以生成GPI锚，其缺少P478并以E477作为结束，5’端有BamHI位点
<400>13
aattggatcc tcattcttct gtctccatgg g                                   31
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，5’端带有NheI限制性位点
<400>14
aattgctagc atgggagtgc taaaattcaa gc                                  32
<210>15
<211>1473
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1473)
<223>sHASEGP，直至P478，带His标签
<400>15
atg gga gtg cta aaa ttc aag cac atc ttt ttc aga agc ttt gtt aaa      48
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                   10                  15
tca agt gga gta tcc cag ata gtt ttc acc ttc ctt ctg att cca tgt      96
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
             20                  25                  30
tgc ttg act ctg aat ttc aga gca cct cct gtt att cca aat gtg cct      144
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
         35                  40                  45
ttc ctc tgg gcc tgg aat gcc cca agt gaa ttt tgt ctt gga aaa ttt      192
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
     50                  55                  60
gat gag cca cta gat atg agc ctc ttc tct ttc ata gga agc ccc cga      240
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
 65                  70                  75                  80
ata aac gcc acc ggg caa ggt gtt aca ata ttt tat gtt gat aga ctt      288
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                 85                  90                  95
ggc tac tat cct tac ata gat tca atc aca gga gta act gtg aat gga      336
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
gga atc ccc cag aag att tcc tta caa gac cat ctg gac aaa gct aag      384
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
aaa gac att aca ttt tat atg cca gta gac aat ttg gga atg gct gtt      432
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
att gac tgg gaa gaa tgg aga ccc act tgg gca aga aac tgg aaa cct      480
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
aaa gat gtt tac aag aat agg tct att gaa ttg gtt cag caa caa aat      528
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
gta caa ctt agt ctc aca gag gcc act gag aaa gca aaa caa gaa ttt      576
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
gaa aag gca ggg aag gat ttc ctg gta gag act ata aaa ttg gga aaa      624
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
tta ctt cgg cca aat cac ttg tgg ggt tat tat ctt ttt ccg gat tgt      672
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
tac aac cat cac tat aag aaa ccc ggt tac aat gga agt tgc ttc aat      720
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
gta gaa ata aaa aga aat gat gat ctc agc tgg ttg tgg aat gaa agc      768
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
act gct ctt tac cca tcc att tat ttg aac act cag cag tct cct gta      816
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
gct gct aca ctc tat gtg cgc aat cga gtt cgg gaa gcc atc aga gtt      864
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
tcc aaa ata cct gat gca aaa agt cca ctt ccg gtt ttt gca tat acc      912
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
cgc ata gtt ttt act gat caa gtt ttg aaa ttc ctt tct caa gat gaa      960
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
ctt gtg tat aca ttt ggc gaa act gtt gct ctg ggt gct tct gga att      1008
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
gta ata tgg gga acc ctc agt ata atg cga agt atg aaa tct tgc ttg      1056
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
ctc cta gac aat tac atg gag act ata ctg aat cct tac ata atc aac      1104
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
gtc aca cta gca gcc aaa atg tgt agc caa gtg ctt tgc cag gag caa      1152
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
gga gtg tgt ata agg aaa aac tgg aat tca agt gac tat ctt cac ctc      1200
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
aac cca gat aat ttt gct att caa ctt gag aaa ggt gga aag ttc aca      1248
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
gta cgt gga aaa ccg aca ctt gaa gac ctg gag caa ttt tct gaa aaa      1296
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
ttt tat tgc agc tgt tat agc acc ttg agt tgt aag gag aaa gct gat      1344
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
gta aaa gac act gat gct gtt gat gtg tgt att gct gat ggt gtc tgt      1392
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
ata gat gct ttt cta aaa cct ccc atg gag aca gaa gaa cct gga tcc      1440
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gly Ser
465                 470                 475                 480
ggt tct ggt gct cac cat cac cat cac cat taa                          1473
Gly Ser Gly Ala His His His His His His  *
                485                 490
<210>16
<211>490
<212>PRT
<213>人类
<400>16
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 l60
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gly Ser
465                 470                 475                 480
Gly Ser Gly Ala His His His His His His
                485                 490
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>间隔子His，正向引物
<400>17
ataattggat ccggttctgg tgctcaccat caccatcac                           39
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>间隔子His，反向引物
<400>18
tataattgcg gccgcctaat ggtgatggtg atggtgag                            38
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以N483结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>19
aatggatcca ttgtagaaaa tttgaggttc                                     30
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以Y482结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>20
aatggatccg tagaaaattt gaggttcttc                                     30
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以F481结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>21
aattggatcc gaaaatttga ggttcttctg                                     30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以I480结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>22
attggatcca atttgaggtt cttctgtctc                                     30
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以Q479结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>23
aattggatcc ttgaggttct tctgtctcc                                      29
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以P478结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>24
aattggatcc aggttcttct gtctccatg                                      29
<210>25
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>不带终止密码子的3’反向引物，用于生成缺少GPI锚并以E477结束的截短产物HIS-sHASEGP
<400>25
aattggatcc ttcttctgtc tccatggg                                       28
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以A467结束的sHASEGP剔除突变体
<400>26
aattggatcc ctaagcatct atacagacac catcag                              36
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以A447结束的sHASEGP剔除突变体
<400>27
aattggatcc ctaagctttc tccttacaac tcaag                               35
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以S430结束的sHASEGP剔除突变体
<400>28
aattggatcc ctaagaaaat tgctccaggt cttc                                34
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以G413结束的sHASEGP剔除突变体
<400>29
aattggatcc ctatccacct ttctcaagtt gaatag                              36
<210>30
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以S394结束的sHASEGP剔除突变体
<400>30
aattggatcc ctatgaattc cagtttttcc ttatac                              36
<210>31
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以A372结束的sHASEGP剔除突变体
<400>31
aattggatcc ctatgctagt gtgacgttga ttatg                               35
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用以扩增以S347结束的sHASEGP剔除突变体
<400>32
aattggatcc ctaacttcgc attatactga ggg                                 33
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LN正向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，L36作为kappa前导序列之后的 第一个sHASEGP氨基酸
<400>33
ctgaatttca gagcacctcc tgttattcc                                      29
<210>34
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FR正向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，F38作为kappa前导序列之后的 第一个sHASEGP氨基酸
<400>34
ttcagagcac ctcctgttat tccaaatg                                       28
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Asp反向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，Asp作为最后一个Kappa前导序 列氨基酸，其在PH-20的L36或F38之前
<400>35
gtcaccagtg gaacctggaa ccc                                            23
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gly反向引物，用于定点诱变以生成sHASEGP与kappa前导序列的融合，Gly作为最后一个Kappa前导序 列氨基酸，其在PH-20的L36或F38之前
<400>36
accagtggaa cctggaaccc agag                                           24
<210>37
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，其用于kappa前导序列的第一片段
<400>37
gagacagaca cactcctgct atgggtactg                                     30
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，其用于kappa前导序列的第一片段
<400>38
cccagagcag cagtacccat agcaggagtg                                     30
<210>39
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，其用于kappa前导序列的第二片段
<400>39
ggtactgctg ctctgggttc caggtt ccac                                    30
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，其用于kappa前导序列的第二片段
<400>40
gcgtcaccag tggaacctgg aacccag                                        27
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Nhe正向引物，用于kappa前导序列
<400>41
attgctagca tggagacaga cacactcctg                                     30
<210>42
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EcoR1反向引物，用于kappa前导序列
<400>42
aattgaattc gtcaccagtg gaacctgg                                       28
<210>43
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠IgK-链前导序列
<400>43
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp
            20
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>K-前导序列SPE1正向引物
<400>44
actcactagt gctagcatgg agacagacac                                     30
<210>45
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>K-前导序列MLU1反向引物
<400>45
aattacgcgt gaattcgtca ccagtggaac                                     30
<210>46
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Kappa前导序列与sHASEGP的融合蛋白，F38作为推定的成熟分泌sHASEGP的第一个氨基酸(直至P478)
<400>46
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1              5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
            20                  25                  30
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
        35                  40                  45
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
    50                  55                  60
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
                85                  90                  95
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
            100                 105                 110
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
        115                 120                 125
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
    130                 135                 140
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
145                 150                 155                 160
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
                165                 170                 175
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
            180                 185                 190
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
    210                 215                 220
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
225                 230                 235                 240
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
                245                 250                 255
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
            260                 265                 270
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
        275                 280                 285
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
    290                 295                 300
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
305                 310                 315                 320
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
                325                 330                 335
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
            340                 345                 350
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
        355                 360                 365
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
    370                 375                 380
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
385                 390                 395                 400
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
                405                 410                 415
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
            420                 425                 430
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
        435                 440                 445
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro
    450                 455                 460
<210>47
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>3’引物BAM反向sHASEGP带有GPI锚，直至L509，包括终止密码子
<400>47
aattggatcc ctacagaaga aatgataaga aacaaaatac                       40
<210>48
<211>1449
<212>DNA
<213>人类
<400>48
atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60
tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120
cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180
cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240
ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300
tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360
caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420
ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480
aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540
ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600
gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660
tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720
gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780
ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840
cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900
tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960
cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020
accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080
atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140
tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200
aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260
ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320
ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380
gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440
ttctactaa                                                         1449
<210>49
<211>467
<212>PRT
<213>人类
<400>49
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
 1               5                  10                  15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
                85                  90                  95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
    130                 135                 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145                 150                 155                 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
                165                 170                 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
            180                 185                 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
            260                 265                 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
        275                 280                 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
    290                 295                 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
                325                 330                 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
        355                 360                 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
    370                 375                 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
                405                 410                 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
            420                 425                 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
        435                 440                 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
    450                 455                 460
Ile Asp Ala
465
<210>50
<211>1536
<212>DNA
<213>人类
<400>50
atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60
tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120
cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180
cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240
ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300
tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360
caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420
ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480
aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540
ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600
gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660
tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720
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