细胞增殖因子Fwap10576
阅读：804发布：2020-05-11
专利汇可以提供细胞增殖因子Fwap10576专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 细胞增殖 因子Fwap10576多肽和编码这种多肽的多核苷酸。本发明也公开了用重组技术生产Fwap10576多肽的方法和针对这种多肽的 抗体 和拮抗剂。本发明还公开了含有Fwap10576多肽的药物组合物以及Fwap10576在 治疗 心脑 血管 疾病 等方面的用途。本发明还提供了通过检测样品中Fwap10576核酸序列中的突变，或者Fwap10576多肽含量的改变以及Fwap10576基因产物自身抗体 水 平的改变而进行诊断和测定的方法。本发明的细胞增殖因子是人类来源的。，下面是细胞增殖因子Fwap10576专利的具体信息内容。
1、一种分离的多核苷酸，其与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少90 ％的同源性，并且其编码的多肽与SEQ ID NO：2所示多肽具有相同的功能。
2、权利要求1的多核苷酸，它编码SEQ ID NO：2所示的多肽。
3、权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。
4.权利要求3的多核苷酸，其中所说的DNA是cDNA。
5.权利要求4的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2所示的多肽。
6.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。
7.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。
8.权利要求1的多核苷酸，所说的多核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。
9.权利要求1的多核苷酸，所说的多核苷酸包含如SEQ ID NO：1所示的从213至 683位核苷酸。
10.一种载体，所说的载体包含权利要求1的多核苷酸。
11.权利要求10的载体，所说的多核苷酸是cDNA。
12.权利要求10的载体，所说的多核苷酸是基因组DNA。
13.一种宿主细胞，所说的宿主细胞由权利要求10-12中的任一载体转化或者转染 过。
14.一种产生多肽的方法，所说的方法包括在权利要求13的宿主细胞中表达由权利 要求1的多核苷酸编码的多肽。
15.一种分离的多肽，它与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性， 并与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有相同的功能。
16.权利要求15的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
17.权利要求15或16的多肽的抗体。
18.一种药物组合物，所说的药物组合物包含有效量的权利要求1-9任一项所述的 多核苷酸和/或权利要求15或16的多肽，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
19.权利要求1-9任一项所述的多核苷酸和/或权利要求15或16的多肽在制备治疗 心脑血管疾病的药物组合物中的用途。
发明领域
本发明涉及最新鉴定的多核苷酸和由其编码的多肽，这种多核苷酸和多肽的生产 方法以及这些多核苷酸和多肽的用途。本发明的多肽已被鉴定为细胞增殖因子，下文 有时称为“Fwap10576”。本发明的多核苷酸和多肽是人类来源的。
发明背景
心脑血管病是威胁人类健康的重大疾病之-。据统计，每年约有260万中国人死 于此病，平均每12秒就有一位同胞被该病夺去生命。在中国，心脑血管病死亡人数占 总死亡人数的比率从1957年的12.1％上升至1990年的35.8％，升高了2.9倍。据世界 银行预测：到2020年，全世界心脑血管病死亡人数占总死亡人数的比率将从1990年 的28.9％升至36.3％，其中70％的心脑血管病发生在发展中国家。中国现有高血压患者 1亿多人，并以每年350万人的速度递增；脑中风致残者600万人，并以每年150万的 速度递增；冠心病患者100万人，并以每年50万的速度递增；此外，还有心肌病患者 300万人。因此，心脑血管病的防治对减轻人类经济负担，确保人体健康具有十分重要 的意义。
心脑血管病的治疗经历了四个大的阶段：1920年代，循环动力学的研究揭示了心 脏是一个“泵”，由此奠定了心力衰竭的治疗基础；60-70年代，对心血管病危险因素 的认识及处理，使西方国家心脏病的发病率下降了近40％；1970年，对心肌细胞电生 理学的研究，提供了抗心律失常、电生理检查及治疗的新方法；80年代末到90年代 初，对血管生物学的认识，产生了心脏介入治疗的新方法。
心衰、抗心律失常、及介入治疗对抢救心脑血管病人的生命，提高其生活质量起 到了积极作用。然而，由于这些方法仅针对症状进行治疗，没有从根本上触及病因， 所以治疗针对性不强。虽然延长了病人的寿命，但没有真正达到预防和治愈的目的。 因此，在分子生物学的水平进行研究，查明心脑血管病的致病因素及发病机理，有望 在该病的治疗方面取得突破性进展，达到从根本上遏制心脑血管病的目的。
cDNA文库是生物工程领域的重要研究工具之一。通常从细胞中提取mRNA， 通过反转录酶合成mRNA的DNA拷贝(即cDNA，Complementary DNA)。单链cDNA 分子在DNA聚合酶的作用转变成双链DNA分子，然后再插入载体，转化到宿主菌 中长成克隆。这样的每个克隆只包含特定的mRNA信息，这样的一套克隆就称为cDNA 文库。
由于cDNA不含内含子，从cDNA文库中可以直接筛选到相应的表达基因，故相 对基因库而言，cDNA文库具有操作简单、使用方便的优点。人体不同细胞表达基因 的差异决定了其组织和器官表型的差异，从人主动脉cDNA文库中分离和鉴定特异表 达基因，特别是分离和鉴定疾病相关基因，是研究遗传性心脑血管病的有效方法之一。
发明概述
按照本发明的一个方面，提供了一种新的成熟多肽Fwap10576以及具有生物学活 性并在诊断或治疗上有用途的Fwap10576的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是 人类来源的。
按照本发明的另一个方面，提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、 DNA、cDNA、基因组DNA，以及具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用途的该核酸 分子的片段、类似物和衍生物。
按照本发明的另一个方面，提供了用重组技术生产Fwap10576多肽的方法，该方 法包括培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
按照本发明的另一个方面，提供了将Fwap10576多肽或编码Fwap10576多肽的多 核苷酸用于治疗的方法。例如，治疗心脑血管增生性疾病，抑制肿瘤形成。
按照本发明的另一个方面，提供了这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面，提供了所述多肽的拮抗剂，其可用来抑制这些多肽的 作用。
按照本发明的另一个方面，提供了与本发明核酸序列中的突变、以及与本发明的 多肽异常表达有关的疾病或疾病易感性的诊断方法。
按照本发明的另一个方面，提供了将本发明的多肽或编码这种多肽的多核苷酸、 在体外用于科学研究、DNA合成以及人工构建DNA载体的方法。
根据本文的教导，上述方面及相关方面对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明是通过如下技术方案实现的。提取mRNA，反转录成cDNA，构建成人主动 脉cDNA文库。从文库中获取Fwap10576的基因片段，通过EST拼接得到Fwap10576的 全长cDNA序列。进而研究Fwap10576基因在不同组织的表达与分布，研究Fwap10576 多肽的活性与功能。
发明详述
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核酸(多核苷酸)序列，其编码 具有推定的、如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟多肽。本发明的多核苷酸是从成 人主动脉的cDNA文库中发现的。其定位于人体细胞的第16号染色体上。其包含一个 开放阅读框架，可以编码具有156个氨基酸残基的多肽。同源性分析表明Fwap10576 多肽与目前的已知蛋白没有序列同源性。
推测的Fwap10576多肽由156个氨基酸组成。其序列特征为：(A)1至34 Aa为 信号肽；(B)2至7 Aa(GSTWGS)，19至24 Aa(GLVLSL)，46至51 Aa(GTAISC)，96 至101 Aa(GVSPCC)，118至123 Aa(GGLQAL)为N-豆蔻酰化位点；(C)33至39 Aa (RARDRDY)为酪氨酸激酶磷酸化位点；(D)56至58 Aa(SSR)为蛋白激酶C磷酸化 位点；(E)77至80 Aa(NQSN)为N-糖基化位点。分析表明Fwap10576多肽的分子 量为：16700.5道尔顿，等电点为8.11( http：/www.expasy.ch/tools/protparam.html)，细 胞外的蛋白约占蛋白总量的33.3％( http：//psort.nibb.ac.jp/form2.html)。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA 和合成DNA。DNA可以是双链或单链的，如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反 义)链。编码成熟多肽的编码序列可以和SIQ ID NO：1(全长1083个核苷酸)所示的 编码序列(213至683位核苷酸)相同；或者，由于遗传密码的丰余性或简并性，编码 序列也可以不同与SIQ ID NO：1所示的编码序列。
编码SIQ ID NO：2所示成熟多肽的多核苷酸可以包括：成熟多肽的编码序列； 成熟多肽的编码序列和附加的编码序列，如编码多肽前导序列或分泌序列的多核苷酸； 成熟多肽的编码序列(以及任选的附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽 编码序列5’和/或3’端的非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有多肽编码序列的多核苷酸以及含 有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码推定的、具有SIQ ID NO：2所示 氨基酸序列的多肽片段、类似物及衍生物。所述变异体可以是天然产生的该多核苷酸 的等位基因变异体，或者是非天然产生的变异体。正如本领域已知的，等位基因变异 体是一段多核苷酸的另一种形式，其可以带有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加， 而实质上不改变所编码多肽的功能。
因此，本发明包括能够编码与SIQ ID NO：2所示成熟多肽具有相同氨基酸序列 的多核苷酸，还包括能够编码SIQ ID NO：2所示成熟多肽之片段、衍生物和类似物的 多核苷酸变异体。这些变异体包括缺失变异体、取代变异体、添加或插入变异体。
本发明也包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框架 中，与有助于多肽由宿主细胞表达及分泌的多核苷酸(如产生前导序列的多核苷酸)相 融合。前导序列作为分泌序列而控制多肽从细胞中转运。具有前导序列的多肽是前体 蛋白(preprotein)，由宿主细胞切割其前导序列后可以产生成熟多肽。本发明的多核 苷酸也可以编码蛋白原(proprotein)，蛋白原是具有原序列(prosequence)的成熟蛋 白，是5’端附加了氨基酸残基的成熟蛋白，是一种无活性形式。切除原序列后，可以 产生有活性的成熟蛋白。
因此，本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白，也可以编码具有原序列的蛋白， 还可以编码既有原序列(prosequence)又有前导序列(presequence)的蛋白质。
本发明的多核苷酸还包括在同一读框中与标记序列融合的编码序列，标记序列可 用于纯化本发明的多肽。例如，当宿主细胞为细菌时，标记序列可以是由pQE-9载体 提供的、用于纯化融合产物的六组氨酸。或者，当宿主为哺乳动物细胞(如COS-7细胞) 时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)，HA标记对应于从流感血凝集蛋白衍生的一个 表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。
术语“基因”是指与产生多肽有关的DNA片段，其包括编码区之前和之后的区域， 以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明全长基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长基因和与 该基因有高度同源性或相似生物活性的其它基因。所说的探针优选具有至少30个碱基， 并且可以含有50个或更多个碱基。所述探针也可以用来鉴别相应于全长转录物的cDNA 克隆和含有完整基因的一个或多个基因组克隆。其中，完整基因包括调节序列、启动 子序列、外显子和内含子。例如可以根据已知的DNA序列合成寡核苷酸探针，进而分 离出基因的编码部分。与本发明基因序列互补的、标记的寡核苷酸探针可以用来从人 类cDNA、基因组DNA或mRNA文库中筛选与其杂交的文库成员。
本发明还涉及与本发明的多核苷酸杂交的核酸序列。条件是两个序列间具有至少 85％，优选至少90％，更优选至少95％的同源性。本发明特别涉及在严格条件下与本发 明的多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严格条件”是指仅在序列间具有至少 95％，优选具有至少97％的同源性时杂交才会发生。与上述序列杂交的多核苷酸可以编 码与本发明成熟多肽具有相同生物学功能或活性的多肽。
此外，与本发明的多核苷酸具有同源性并能够杂交的多核苷酸可以具有至少20 个碱基，优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基，其可以保留或不保留活性。这 样的多核苷酸可以用作SEQ ID NO：1的探针，用于回收多核苷酸、作为诊断探针或作 为PCR引物。
因此，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少85％，优选 至少90％，更优选至少95％同源性的多核苷酸及其片段(所述片段具有至少30个碱基， 优选至少50个碱基)，以及由这些多核苷酸编码的多肽。
根据本发明的另一个发明，本发明涉及推定的、具有SIQ ID NO：2所示氨基酸序 列的多肽及其片段、类似物和衍生物。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，当涉及由SIQ ID NO：1编码的多肽或者具有 如SIQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽时，是指基本上保留了所述多肽生物学功能或 活性的多肽。所说的类似物可以包括蛋白原，蛋白原经部分切除后可以产生有活性的 成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
所说的多肽(SIQ ID NO：2)及其片段、衍生物或类似物可以是：(i)一种多肽，其 中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取 代，并且被取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码子编码的，或者(ii)一种多肽， 其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(iii)一种多肽，其中成熟多肽与另一 种化合物融合，如与增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)融合，或者(iv)一 种多肽，其中成熟多肽与附加氨基酸残基融合，例如与前导或分泌序列融合，又如与 用来纯化成熟多肽的序列融合。通过本文的教导，这样的片段、衍生物及类似物可视 为在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的多肽和多核苷酸优选以分离形式提供的，并且优选将其纯化成均一(同 质)物质。
术语“分离的”是指所述物质脱离了原始环境(例如，如果该物质是天然存在的，则 指天然环境)。例如，一种在活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从 天然系统中部分或全部共存物质中分离出同样的多核苷酸或多肽则是分离的。这样的 多核苷酸可以是载体的一部分，这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，只要 这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2所示的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ ID NO： 2的多肽具有至少85％的同源性，更优选90％的同源性，最优选95％的同源性的多肽。 本发明还包括上述多肽的片段，多肽片段通常包含至少30个，优选至少50个氨基酸。
如本领域所熟知的，两个多肽之间的“同源性”是通过将一个多肽的氨基酸序列 及其保守氨基酸取代与另一个多肽比较而确定的。
通过多肽合成，本发明的多肽片段(或部分多肽)可用于生产全长多肽。此片段 可用作产生全长多肽的中间体。同样的，本发明的多核苷酸片段可以用于合成本发明 的全长多核苷酸。
根据本发明的另一个方面，涉及含有本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体基 因工程化的宿主细胞，以及通过重组技术产生本发明多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程化(转导、转化或转染)而产生的。所说 的载体可以是克隆或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程宿 主细胞可以在经改良适于激活启动子、筛选转化体或扩增本发明Fwap10576基因的常 规营养培养基中培养。培养条件(如温度和pH值)是由不同的宿主细胞决定的，这些 对本领域技术人员而言是显而易见的。
通过重组技术，本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。多核苷酸可以包含在任何 一种适于表达多肽的载体中。这样的载体包括染色体来源的、非染色体来源的和合成 的DNA序列。例如SV40衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，杆状病毒，酵母质粒，从质 粒和噬菌体DNA结合得到的载体，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬 病病毒)。此外，还可以使用其它载体，只要其可以在宿主中复制并存活。
可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，是用本领域已知的 方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点中。
表达载体中的DNA序列可以与适当的表达控制序列(启动子)连接，以指导mRNA的 合成。启动子的例子有：LTR或SV 40启动子，大肠杆菌的lac或trp，噬菌体λPL 启动子，以及已知其它的、控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达 载体也以包含指导翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以包含用于扩 增表达的合适序列。
此外，优选的表达载体包含一个或多个选择标记基因，以便为转化后宿主细胞的 筛选提供表型特征。例如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者 如用于大肠杆菌的四环素和氨苄青霉素抗性。
含有上述合适的DNA序列以及合适的启动子或者调控序列的载体可以用于转化适 当的宿主，以使其表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子有：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏 菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如DrosorpHila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞 如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的教导，选择合适的宿 主可视作在本领域技术人员的知识范围内。
更具体地说，本发明还包括含有以上广泛描述的一种或多种序列的重组构建体。 构建体包括正向或反向插入了本发明核酸序列的载体，如质粒或病毒载体。在更为理 想的实施方案中，构建体还包含了可操作地与所述序列连接的调节序列，如启动子。 许多合适的载体和启动子是本领域技术人员熟知的，并可以通过商业途径获得。例如，细 菌载体：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、pHagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、 pDR540、pRITS(pHarmaca)；真核载体：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、 pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。此外，还可以使用其它的质粒或载体，只要它 们能够在宿主中复制并存活。
可以用带有CAT(氯霉素转移酶)或其它选择标记的载体从基因中选择启动子区。 两个合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、 gpt、λPR、PL、和trp。真核启动子包括CMV立即早期，SV胸苷激酶，早期和晚期SV40、 来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择适当的载体与启动子可视作在本领 域技术人员的知识范围内。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是 高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或者是原核细胞(如 细菌细胞)。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法可以实现构建体向 宿主细胞的导入(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法， (1986))。
宿主细胞中的构建体可以经由常规方式产生由重组序列编码的产物。而且，本发 明的多肽可以用常规的多肽合成仪合成。
在合适启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或 其它细胞中表达。用来源于本发明DNA构建体的RNA，通过无细胞翻译系统也可以产 生目的蛋白。Sambrook等人在《分子克隆实验室手册》中(1989，第二版，纽约冷泉 港实验室)描述了可用于原核和真核宿主的、合适的克隆及表达载体。
通过向载体中插入增强子序列，可以提高高等真核生物细胞对编码本发明多肽的 DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，一般约10至300bp，它作用于启动子以 增强其转录。增强子的例子有：复制起点上游100至270bp的SV40增强子、多形瘤 增强子以及腺病毒增强子。
一般地，重组表达载体包括复制起点和筛选标记基因(如大肠杆菌的氨苄青霉素 抗性基因和啤酒糖酵母的TRP1基因)，以及从高度表达的基因中得到、能够指导下游 结构基因转录的启动子。这样的启动子可以从编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶 (PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子中得到。异源序列以恰当的方 式与翻译起始序列及终止序列装配。优选地，与能够指导蛋白向细胞周质或细胞外培 养基分泌的前导序列装配。异源序列可以编码含有N-末端识别肽的融合蛋白，该识别 肽具有理想的特征，如稳定表达的重组产物或者简化纯化步骤。
将编码目的蛋白的结构基因，合适的翻译起始和终止信号，以及有功能的启动子 一起插入，可以构建适用于细菌的表达载体。所说载体包含一个或多个选择标记和一 个复制起点，以维持载体并在必要时在宿主中扩增载体。适合转化的原核宿主包括大 肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的多 个种。
作为代表性但非限制性的例子，用于细菌的表达载体可以含有源自市售载体的选 择标记和复制起点，这些市售载体包含公知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元 件。这样的市售载体包括，pKK223-3(pHarmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和 GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动 子和待表达的结构序列相结合。
转化合适的宿主菌株，待其生长至合适的细胞密度后，用恰当的方法(例如温度 变换或化学诱导)诱导选择的启动子，并继续培养细胞一段时间。常用离心法收获细胞， 用物理或化学方法破碎细胞，保留得到的粗产物以进一步纯化。可以用任一种常规的 方法破碎微生物细胞，所述方法包括冻融法、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂， 这些方法是本领域技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子 有由Gluzman(细胞，23：175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和能够表达相 容载体的其它细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载 体包含复制起点、适合的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷 酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。从SV40病毒基 因组中得到的DNA序列，如SV40复制起点、早期启动子、增强子、剪接及多聚腺苷酸 化位点可用来提供所需要的非转录遗传元件。
可以用多种方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫 酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层 析、亲和层析、羟基磷灰石层析、植物凝集素层析和高效液相色谱层析(HPLC)。
本发明的多肽可以是天然纯化的，或是化学合成的，或是用重组技术从原核或真 核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)制备的。根据重组 方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽也可 以包含一个起始的甲硫氨酸残基。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料。 Fwap10576具有促进细胞增殖的作用，可能被用于心脑血管疾病的治疗。
根据本发明的另一方面，提供了鉴定本发明多肽激活剂或拮抗剂的方法。方法之 一是在某种化合物存在的情况下，将表达Fwap10576受体的哺乳动物细胞或膜制剂与 Fwap10576多肽一起培养，检测该化合物增强或阻断Fwap10576多肽与受体相互作用后 产生第二信使的能力。第二信使系统包括但不限于：蛋白酪氨酸激酶系统(PTK)，cAMP 鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解作用。鉴定多肽拮抗剂的另一种方法是竞争 抑制法。该法将某化合物不存在时，与受体结合的Fwap10576多肽分子数设为对照， 通过检测该化合物存在时，与受体结合的Fwap10576多肽分子数的变化来确定潜在的 拮抗剂。
潜在的拮抗剂包括抗体，或者在某些情况下包括与本发明多肽结合的寡肽，它们 与所述多肽结合并有效地消除其功能。
另一个潜在的拮抗剂化合物是用反义技术制备的反义构建体。通过三股螺旋形成 反义DNA或RNA从而控制基因的表达，上述方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。 例如，可以依据编码本发明成熟多肽的核酸序列5’端，设计长约10至40个碱基对的 反义RNA。又如设计一种与转录涉及的基因区互补的DNA(三螺旋-参见Lee等，核酸 研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学， 251：1360(1991))，从而阻止转录以及本发明多肽的产生。反义RNA在体内和mRNA杂 交，并阻断mRNA分子翻译成为本发明的多肽(反义-Okano，J.神经化学杂志， 56：560(1991)；作为基因表达反义抑制剂的脱氧寡核苷酸(CRC出版社，Boca Raton， FL(1988))。可以将上述寡核苷酸传送至细胞，从而在体内表达反义RNA和DNA以抑制 本发明多肽的产生。
拮抗剂还包括一些小分子，这些小分子通过与本发明的多肽结合而阻止多肽与其 受体的相互作用，从而阻断其正常的生物活性。小分子包括但不限于小肽或类肽分子。
本发明的多肽、其激活剂和拮抗剂可以与合适的载体结合形成药物组合物。这样 的组合物包含治疗有效量的多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。载体包括但不限于 盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及上述物质的组合。其配方应与给药的方 式相宜。
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有 本发明药物组合物的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审 核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。本发明的药物组合物还可以与 其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以按常规方式给药，如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、 鼻内或真皮内途径。以治疗和/或预防特定疾病有效的剂量施用药物组合物。通常以至 少大约10微克/千克体重的量给药。在大多数情况下，以不超过每天约8毫克/千克体 重的量给药。在大多数情况之下，考虑到用药途径和症状等因素，给药剂量从每日大 约10微克/千克到1毫克/千克体重。
根据本发明的另一方面，可以通过在体内表达的方式使用本发明的多肽及其激活 剂和拮抗剂，这种方式常被称作“基因治疗”。
因此，可以在体外用编码本发明多肽的核酸(DNA或者RNA)对患者细胞进行基因 工程化处理，再将工程化的细胞提供给需要治疗的患者。上述方法是本领域熟知的。 例如，可以用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒对细胞进行基因工程化处理。
类似的，可以通过本领域已知的方法在体内基因工程化细胞，以便在体内表达多 肽。例如，用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒转导包装细胞，以使其能够产 生含有目的基因的感染性病毒颗粒。将这种生产细胞用于患者，从而在体内工程化细胞 并表达所说的多肽。根据本发明的教导，通过上述方法或其它方式施用本发明的多肽 对本领域技术人员而言是显而易见的。
可以得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏(Moloney) 鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏(Rous)肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、 禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒 和乳房肿瘤病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可使用的合适启动子包括但不限于：反转录病 毒LTR；SV 40启动子；人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller等，生物技术，Vol.7，No. 9，980-990(1989)描述)；或其它启动子(例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、 pol III和β-肌动蛋白启动子)。其它可采用的病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动 子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的教导，选择载体上合适 的启动子对本领域技术人员而言是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列应当有合适的启动子控制。可以使用的合适的启动子 包括但不限于：腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞 病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、 金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动 子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描 述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子和人类生长激素启动子。启动子也 可以是编码所述多肽的基因的天然启动子。
可以用反转录病毒质粒载体转导包装细胞以产生生产细胞。可被转染的包装细胞 包括但不限于：PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、 GP+E-86、GP+envAml2和DNA细胞系(Miller、人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990) 描述的，其全部内容本文一并参考)。载体可以用任何本领域已知的方法转导包装细胞。 这些方法包括但不限于：电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，逆转录病毒质粒载 体可以包埋在脂质体中，或者偶联到脂类上，然后引入宿主中。
生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，该颗粒包含能够编码所述多肽的核 酸序列。可以用这些逆转录病毒载体在体内或体外转导真核细胞。被转导的真核细胞 将表达编码所述多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于：胚胎茎干细 胞、胚胎癌细胞、以及造血茎干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、 内皮细胞和支气管上皮细胞。
根据本发明的另一方面，本发明涉及Fwap10576基因在诊断或检测中的用途，通 过检测Fwap10576核酸序列中的突变可以诊断出相关疾病或对疾病的易感性。
可以用多种技术在DNA水平上检测出携带Fwap10576基因突变的个体。可以从患 者的细胞，如来自血液，尿，唾液，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。基因组DNA 可以直接用于检测，或者在分析前可以用PCR扩增(Saiki等，自然，324：163- 166(1986))。RNA或cDNA也可用于相同目的。例如，与本发明多核苷酸互补的PCR引 物可于鉴别和分析突变。如通过与正常的基因型相比较，根据扩增产物的大小改变来 检测缺失及插入。可以经与可以用放射性标记的RNA或反义DNA与扩增后的核酸序列 杂交，以鉴别点突变。用RNaseA消化或通过解链温度的差异，可以辨别完全配对序列 和错配的双链。
通过DNA测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异。此外，克 隆的DNA片段可以作为探针检测特异的DNA区段。当与PCR结合使用时，这种方法的 灵敏性大大提高，例如，将测序引物和双链PCR产物、或者由改良的PCR法产生的单 链模板分子一起使用。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在含有或不含变性剂的凝胶中，DNA 片段电泳迁移率的变化来实现。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示。 不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上进行区分，根据其特定的熔点或部 分解链温度，不同的DNA片段将停滞在凝胶的不同位置(参见Myers等，科学， 230：1242(1985))。
用RNase和S1保护的核酸酶保护分析法或化学裂解法也可以检测特殊位置上的 序列变化，(如Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。
因此，可以用杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶 (如限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法来检测DNA序列的 差异。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序之外，突变也可以用原位分析法检测。
根据本发明的另一方面，本发明涉及一种通过检测不同组织中Fwap10576多肽含 量的改变而进行的诊断分析方法。这是基于与正常对照组织相比，某组织中该多肽的 过量表达可以检测疾病或疾病易感性的存在。检测取自宿主的样品中本发明多肽之含 量的分析方法是本领域技术人员熟知的，方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、 Western印迹分析、酶联免疫吸附(ELISA)测定和“夹心”测定，优选ELISA检测。 ELISA测定包括首先制备本发明多肽的特异性抗体，优选单克隆抗体。然后制备该单 克隆抗体的报导抗体。将报导抗体与一种可检测试剂相结合，所说试剂如放射性试剂、 荧光试剂或者辣根过氧化物酶。从宿主取样，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支 持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如牛血清清蛋白)一起温育，将 覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来，在单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上 的本发明任何多肽结合期间，将单克隆抗体在皿中温育。用缓冲液将所有未结合的单 克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的受体抗体放入皿中，结果导致受体 抗体和任何结合到本发明多肽上的单克隆抗体结合。然后将未结合的单克隆抗体洗掉。 接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即 是给定体积的患者样品中存在的蛋白质的量。
也可以用竞争测定法检测多肽含量。方法包括将Fwap10576多肽的特异性抗体结 合到固相支持物上，然后标记(如放射性标记)本发明的多肽，将取自宿主的样品通 过固相支持物，然后通过检测标记量，确定样品竞争性结合抗体的量，从而确定样品 中本发明多肽的含量。
本发明的多核苷酸序列对染色体的鉴别也极有价值。该序列特异性地靶向于人染 色体的特定位置，并与之杂交。目前，仅有少数几种基于实际序列数据(重复多形性) 的染色体标识试剂可用于标记染色的体位置。基于本发明DNA的染色体作图是将这些 序列和疾病相关基因关联的首要的步骤。
简言之，通过由cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)可以进行序列的染色体定位。 通过计算机分析基因的3’非翻译区，可以快速选择引物。引物不应跨越基因组DNA的 第一个外显子，否则将使扩增复杂化。然后，将引物用于PCR以筛选含有单个的人染 色体的体细胞杂和体。只有含有与该引物相应的基因的杂和体才会产生扩增片段。
体细胞杂合体的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的快捷方法。根据本发 明，用相同的寡核苷酸引物和来自特定染色体或大基因组克隆的一组片段，依照类似 方法可以完成亚定位。可以用于染色体作图的其它作图方法包括原位杂交、用标记的、 经流式分选的染色体进行预筛选以及用杂交进行预筛选，从而构建染色体特异性的cDNA 文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以实现更精确的染色体位 置。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。详见Verma等人的综述，人类染色 体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦完成了基因在染色体上的精确定位，则可以将该基因在染色体上的物理位置 与遗传图谱数据联系起来。这些数据可以在例如V.McKusick，人类孟德尔式遗传中找 到(可通过互联网在Johns Hopkins大学的Welch医学文库中得到)。然后通过连锁 分析(物理相邻基因的共遗传)，确定基因与已定位到染色体相同区域的疾病之间的关 系。
随后需要确定患病个体和正常个体之间cDNA或者基因组序列的差异。如果在部 分或全部患病个体中观察到突变，但在正常个体中观察不到，则所述突变可能是疾病 的病因。
所说的多肽、其片段、其衍生物或类似物，或表达上述物质的细胞可用作免疫原 而产生抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人源化 的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法均可用于产生 这些抗体和片段。
通过向动物体(优选非人体)直接注射或者施用本发明的多肽可以获得相应的抗 体。这样获得的抗体会与所述多肽结合。这样，即使是编码多肽片段的序列也可以产 生能够结合整个天然多肽的抗体。进而用这种抗体从表达该多肽的组织中分离多肽。
为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养而生产抗体的技 术。例如杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、三体杂交瘤 技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，4：72)和EBV-杂交瘤技术 (Cole，等，1985，单克隆抗体和癌癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以将所述生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)加以改进，以生产抗本 发明多肽(具免疫原性)的单链抗体。也可以用转基因小鼠表达抗本发明多肽(具免 疫原性)的人源化抗体。
为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列附图和实施例对其进行解释。附图 和实施例是为了说明而不以任何方式限制本发明。
在以上所述的教导下，本发明的许多改良和变化是可能的，因此，在附属权利要 求的范围内，可以以不同于以上特定描述的方式实施本发明。
附图简述
图1显示了Fwap10576在正常组织的分布。
图2显示了Fwap10576在不同肿瘤细胞系中的分布。
图3显示了Fwap10576在正常成人和胎儿心肌组织，以及在陈旧性心肌梗塞病人 室壁瘤组织表达的情况。
图4为原位杂交观察Fwap10576在正常动物模型脑组织的表达。
图5为重组蛋白TRXSX576表达条件的优化。其中，
A显示不同活化时间对重组蛋白TRXSX576表达量的影响；B显示不同诱导时间对 重组蛋白TRXSX576表达量的影响。
图6为原位杂交法检测Fwap10576在正常动物脑组织中表达的情况。
图7为原位杂交法检测Fwap10576在脑卒中动物脑组织中表达的情况。
图8为免疫组化分析结果(光镜×100)。A.非脑卒中病人的脑组织切片，I抗为 Fwap10576-SE3McAb；B.脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576-SE3McAb；C.非 脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576-SE3McAb；D.脑卒中病人的脑组织切片， I抗为Fwap10576-SE3McAb；E.脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576- 6H10McAb；F.脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576-6B11McAb。
图9为高表达Fwap10576诱发细胞增殖的情况。
实施例
实施例一、成人主动脉cDNA文库的构建
1.1 RNA的提取
RNA gentsTotal RNA Isolation System kit购自美国Promega公司(Cat No.Z5110)。 操作如下；称取0.3g液氮中保存的成人主动脉组织，加入10ml变性液(4M异硫氰酸 胍、25mM柠檬酸三钠)和1ml 2M乙酸钠(pH4.0)匀浆。加入等体积水饱和酚和0.2 倍体积氯仿，剧烈振荡15秒，冰上放置15分钟。10,000rpm，4℃离心20分钟。取 上清，加等体积异丙醇，-20℃放置2小时，离心。再用变性液5ml悬浮沉淀，重复上 述步骤。用1ml冰预冷的75％乙醇洗涤沉淀，室温下蒸发痕量乙醇5-10分钟，用焦碳酸 二乙脂(diethyl pyrocarbonate，以下简称DEPC)处理的去离子水溶解RNA。
1.2 mRNA的分离
成熟的mRNA的3′端有一条由20-250个腺苷酸组成的Poly(A)。根据该特征，可 用亲和层析法分离mRNA和其它的RNA。本实验使用的oligo(dT)纤维素含有12-18个 核苷酸(T)的多聚链。在多盐条件下，带有oligo(A)尾巴的mRNA与oligo(dT)结合并 留在柱子上，而无oligo(A)尾巴的rRNA与tRNA被洗掉，然后用低盐液洗脱挂在柱子 上的mRNA。
Quick prepmicro mRNA purification kit购自瑞典pHarmacia公司。在1.5ml无RNA 酶的离心管1#内加入1ml oligo(dT)纤维素悬液；另取1.5ml离心管2#，加入用上样缓冲 液稀释的总RNA 1ml；管2#和管2#室温离心1分钟，12000rpm；吸去管1#上清，将管 2#的上清加入管1#，轻摇5-10分钟；室温离心10秒，12000rpm；用1ml高盐缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.5M NaCl)洗涤5次，离心；用1ml低盐缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.1M NaCl)洗涤5次，离心；用0.3ml低盐缓冲液悬浮 oligo(dT)沉淀并转移到微量离心柱，12,000rpm，离心5秒；用0.5ml低盐缓冲液洗涤 3次，离心；用2×0.2ml洗脱液收集mRNA；用分光光度计测定光密度，计算OD260/280 的比值；得到300μl mRNA，加入7.5μl糖原，30μl 2.5M乙酸钾(pH5.0)，750μl无 水乙醇在-70℃保存备用；使用前离心5分钟，75％乙醇洗涤，DEPC水溶解mRNA。
1.3 cDNA的合成
合成步骤参照ZAP ExpressTmcDNA Synthesis Kit*and ZAP ExpressTmcDNA GigapackII Gold Cloning Kit*(美国Stregene公司，Catalog No.200403和200404)的 说明书。
在0.5ml离心管中依次加入5μl 10×第一链缓冲液，3μl甲基化的dNTP混合物， 2μl Xho I连接子oligo(dT)18引物(1.4μg/μl)，32.5μl用DEPC处理的去离子水， 1μl RNA酶抑制剂(40u/μl)，5μg mRNA，置室温10分钟。再加入1.5μl莫洛尼氏 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(50u/μl)，总反应体积50μl。从中取出5μl转入 另一离心管，加入0.5μl α-32P三磷酸脱氧腺苷(dATP)(800ci/mmol)以鉴定第一链 合成质量。上述反应均在37℃进行。
得到的DNA/RNA杂交分子在DNA聚合酶I的作用下，以第一链为模板合成第二 链。在冰浴中依次加入45μl第一链cDNA，20μl 10X第二链缓冲液，6μl dNTP混合 物，114μl去离子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，1μl DNA 聚合酶I(9.0u/μl)，总体积200μl。混匀，16℃孵育2.5小时。反应结束后，用酚∶ 氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀。
1.4 cDNA与载体的连接
从试剂盒中取出9μl EcoRI连接子(序列分别为5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’ -GCCGTGCTC-5’)溶解沉淀。取1μl电泳，鉴定第一和第二链合成质量。在剩余 的8μl第二链cDNA中依次加入1μl 10X连接酶缓冲液，1μl 10mmol/Lγ-三磷酸腺 苷(γ-ATP)，1μl T4 DNA连接酶(4u/μl)，8℃水浴16小时后，70℃孵育30分钟。用 限制酶XhoI消化1.5小时。琼脂糖凝胶(SepHarose)C1-2B过柱分离，除去小于400碱 基的核苷酸，以提高全长cDNA在cDNA文库中的比例。
1.5 cDNA克隆入ZAP噬菌体载体
ZAP噬菌体载体(美国Stratagene公司)上的多克隆位点允许插入长达10Kb的核 酸片段，进入宿主后质粒部分可从载体上切开，形成质粒载体Bluescript。该载体多克 隆位点两侧有T7和T3噬菌体的启动子，可以用于序列分析和探针合成。插入载体的 cDNA片段可以表达具抗原性和生物活性的融合蛋白。实验详述如下：
在离心管内加入100ng cDNA，0.5μl 10×连接酶缓冲液，0.5μl 10mmol/Lγ-ATP (pH7.5)，1ul ZAP噬菌体载体(1ug/ul)，0.5ul T4 DNA连接酶(4u/ul)，加去离子水至总 体积5μl。12℃连接16小时。
连接产物需包装外壳蛋白以产生有转染活性的重组噬菌体。快速从-70℃取出包装 蛋白，溶解后，在25ul包装蛋白内加1ul连接反应物，混匀，22℃反应2小时，加入500ul SM缓冲液(0.1M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.05M Tris-HCl，0.01％明胶)，20ul氯 仿。此混合物即为原始的cDNA文库。
1.6 计算阳性克隆的效价
取5ul原始的cDNA文库，用45ul SM缓冲液稀释。将10ul稀释后的溶液，加入 200ul感受态XL1-Blue MRF′宿主菌中(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分钟，加入3ml 上层琼脂糖，混匀，铺于NZY(0.09M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.5％酵母提取液， 1％NZ胺A)平板上，倒置，37℃培养过夜，计算平板上的克隆数。
cDNA文库的效价用噬菌斑成斑数(pfu/ml)表示。pfu/ml＝(噬菌斑数×稀释倍数)× 1000/稀释液用量(ul)。容量大于1×106个克隆的cDNA文库，能够保证其中含有每一 个单拷贝的mRNA.本发明成人主动脉cDNA文库的库容量为2.4×106个独立重组克 隆。
1.7 cDNA文库的扩增和保存
构建的cDNA文库可直接用于筛选，但不稳定。因为非野生型的噬菌体易失活， 故需要扩增以方便多次筛选。取5×104个噬菌体转染XL1-Blue MRF′宿主菌，铺板，37 ℃孵育8～10小时，然后在150mm平皿中加入8ml SM缓冲液，4℃培养过夜。离心， 收集上清，即得到扩增后的cDNA文库。加入0.3％氯仿，4℃保存。长期保存需加入 7％的二甲基亚砜(DMSO)，-70℃冻存。
实施例二、新全长cDNA的克隆
2.1 随机克隆的多聚酶链反应(PCR)扩增
cDNA文库铺盘，噬菌斑密度为200-500个克隆/培养皿(150mm)，挑取清亮的单 个噬菌斑转入含有75ul SM缓冲液和5ul氯仿的无菌离心管中，置于4℃。用前混匀离 心，取上清液5ul，用ZAP噬菌体载体3′端引物(5′CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC 3′)和5′端引物(5′CAGTCAATTGTAATACGACTCACT 3′)进行PCR扩增，反应总体 积50ul。扩增参数为94℃预变性3分钟；再94℃45秒，55℃30秒，72℃3分钟，共30 个循环；72℃延伸5-10分钟。根据1％琼脂糖凝胶中电泳带的亮度估算PCR产物的产 量。
2.2 表达序列标签(EST)的序列测定
ABI377自动测序仪(ABI PRISMTM377DNA sequencer)和自动测序试剂盒 (BigDyeTM Terminator Ready Reaction Mix)购自美国PE公司。依照推荐的使用条件， 用双脱氧链终止法测序。
用非放射性CY5荧光素(CY5-fluoroscein)作标记物，通用测序引物T3(5′ATTAAC CCT CAC TAA AGG GA 3′)和T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′)进行测序， 每份样品中引物用量为5pmol/ul。测序模板为PCR产物，用量约30-100ng。PCR扩增 参数为94℃3-5分钟；再94℃30秒，50℃15秒，72℃1分钟，20个循环；94℃30 秒，72℃1分钟，15个循环；再72℃延伸5分钟。DNA产物在8mol/L尿素、6％聚 丙烯酰胺凝胶板上电泳。电压1500V，功率34W，电泳250-300分钟(ALF ExpressTMDNA sequence，瑞典pHarmacia公司)。
2.3 EST的生物信息学分析
用美国生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将每 个cDNA克隆的EST与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较 ( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov).根据BLAST的判断标准(国内外大多数实验室的通 用标准)；同源序列小于100-200个碱基，Score值小于100的序列为新的EST。本发 明Fwap10576的EST为新EST。
2.4 EST引物步移法测序
2.4.1 ZAP噬菌体的体内环化
ZAP噬菌体载体能将目的片段在宿主内直接从λ噬菌体载体转移到质粒，环化为 PBK-CMV(带有CMV病毒早期启动子)噬菌粒。环化步骤参照说明书(ZAP Express cDNA Synthesis kit and ZAP Express cDNA Gigapackm Gold Doning kit)。
用3ul保存在4℃携带新EST的噬菌体和1ul辅助噬菌体(一类自身复制能力极 低的噬菌体突变体，可以为寄主细胞中质粒DNA的复制与包装提供蛋白酶和外壳蛋 白质)共转染300ul大肠杆菌XL1-Blue MRF’株(OD600＝1.0)。获得单链DNA后，再 转染大肠杆菌XLOLR株(试剂盒提供)，在试管内加5mlLB培养液，25ul卡那霉素， 37℃培养12-16小时。
2.4.2 质粒的提取和鉴定
用德国QIAGEN公司的“QIAPrep Spin Miniprep kit″提取质粒。2400rpm，4℃离 心10分钟，收集过夜培养的细菌。弃上清，加入25ul缓冲液P1(100ul/ml RNaseA，50mM Tris/HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮细菌，移至灭菌的1.5ml离心管内。加250ul缓 冲液P2(200mM NaOH，1％SDS)，颠倒上清几次，充分混匀。加350ul缓冲液P3(3.0M KAc，pH5.5)，立刻摇管4-6次。12000rpm，离心10分钟(SORVALLMc12V台式离 心机)。收集上清，将其移至底部套有收集管的微型纯化柱(QIA prep Spin Miniprep) 内，12000rpm，离心30-60秒。加0.75ul缓冲液TE(10mM Tris/HCL，1mM EDTA，pH8.0)， 离心30-60秒。去掉收集管，在QLAprep微型纯化柱底部套一个灭菌的离心管，加50ul 缓冲液EB(10mM Tris-HCL pH8.5)或去离子水，在柱床内保留1分钟后离心1分钟， 收集纯化的DNA。
在离心管内加入3ul酶切缓冲液(10×)，1ul NotI内切酶(15u/ul)，1ul ECoRI 内切酶(15u/ul)，1ulBSA，2ulDNA，22ul去离子水，总体积30ul。37℃温育4-6小时。 酶切后鉴定质粒大小。
2.4.3 新的全长cDNA的测定
用美国PE公司的ABI377自动测序仪和测序试剂盒BigDyeTM Terminator Ready Reaction Mix测定PBK-CMV阳性克隆的序列。
反应液中有BD 4ul，BOB 2ul(400mM Tris-HCl，pH9.0，10mM MgCl2)，引物2 ul(5pmol/ul)，DNA模板30-100ng，用H2O补足至终体积20ul。用步移法(逐级引物 法)测定cDNA全长序列，即下一轮的测序引物由上轮测序所得产物的末端碱基确定。 用oligo 14.0软件设计PCR引物。
结果：
如SEQ ID NO：1所示，Fwap10576 cDNA全长1083个碱基对。推测其起始密码子 为213至215核苷酸(ATG)，终止密码子为681至683位核苷酸。开放读码框架为213 至683位核苷酸，编码一个由156个氨基酸残基组成的多肽。BLAST分析表明该基因定 位与16号染色体。
蛋白同源性分析表明：Fwap10576蛋白与目前抑制的蛋白无序列同源性。其蛋白 序列特征为；(A)1至34 Aa为信号肽。(B)2至7 Aa(GSTWGS)，19至24 Aa(GLVLSL)， 46至51 Aa(GTAISC)，96至101 Aa(GVSPCC)，118至123 Aa(GGLQAL)为N-豆蔻 酰化位点。(C)33至39 Aa(RARDRDY)为络氨酸激酶磷酸化位点。(D)56至58 Aa(SSR) 为蛋白激酶C磷酸化位点。(E)77至80 Aa(NQSN)为N-糖基化位点。
实施例三、Fwap10576在正常组织的分布
3.1 实验材料
含12种组织的mRNA的多组织膜(MTN膜)购自美国Clontech公司，用其检测 Fwap10576基因在正常组织中的分布。β-actin是一种管家基因，在多种组织中表达均 一，本实验中用作对照。
3.2 Northern杂交
方法参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编，中国协和医科大学出版社， 第二版，1999)147-149，202-205，207-213页。详述如下：
3.2.1 总RNA提取
称取0.5g(成人心脏，胎儿心脏，室壁瘤组织)组织于50ml离心管中，加入10ml GTC，匀浆。加等体积水饱和酚及0.2体积氯仿，剧烈振荡15秒，冰上放置20分钟。 4℃，12,000rpm离心25分钟。取上清置于另一离心管，加等体积异丙醇，-20℃沉淀 1小时。4℃12,000rpm离心25分钟，弃上清。用5mlGTC重新溶解沉淀后，重复其它 操作。用1ml预冷的75％乙醇洗涤，晾干，用DEPC处理过的水溶解。测OD(光密度)260 及OD280。
3.2.2 甲醛变性凝胶电泳
称取0.6g琼脂糖凝胶加入52.2ml DEPC处理过的水中，加热溶解，待胶冷到65 ℃，加入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，灌胶。取4.5ul(40-60ug)总RNA，加入2.0ul10 ×MOPS，3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混匀，65℃变性15分钟，冰上冷却2分钟。加入 2.0ul上样缓冲液，混匀。50伏预电泳5分钟，上样。待染料全部进入胶后，电压降 为40伏，每10分钟混合电泳缓冲液1次。
3.2.3 转膜
待溴酚兰泳动到凝胶底部，停止电泳，照相。用DEPC处理过的水洗胶数次，用50mM NaOH处理45分钟，用20×SSC处理45分钟。尼龙膜先用去离子水浸湿，再用20×SSC 处理45分钟。在胶托上铺一层滤纸，用20×SSC浸湿，除去气泡；将胶倒置于胶托上， 其上面放一中间挖空的塑料薄片。小心将膜置于胶上，除去气泡，在膜上铺两张20×SSC 浸湿的滤纸，除去气泡。在滤纸上铺上10cm高的吸水纸，压一500克的重物。转膜16 小时，中间换吸水纸2-3次。小心取下膜，照相，用6×SSC泡膜5分钟。紫外交联， 80℃烤膜1小时，4℃保存备用。
3.2.4 制备杂交模板
上游引物：5’-CC GAATTC ATGCACCGGCTCATCTTTGTC-3’，斜体所示为保护碱基， 黑体所示为EcoRI酶切位点，划线部分与Fwap10576核酸序列107-127位互补；下游 引物：5’-GC CTCGAG TCTTATCGAGGTGGTCTTGAGCTG-3’，斜体所示为保护碱基，黑体 所示为XhoI酶切位点，划线部分与Fwap10576核酸序列1198-1221位互补。
PCR反应体系：10倍缓冲液5.0ul，脱氧核糖核酸2.0ul，上游、下游引物各3.0ul， Taq酶1.0ul，Fwap10576测序质粒(模板)2.0ul，无菌水34ul。PCR参数：94℃预 变性3分钟；94℃3分钟，94℃20秒，60℃30秒，72℃80秒，30个循环。72℃7分钟。 用醋酸铵/乙醇(1∶5)纯化PCR产物，溶于50ulTE，用琼脂糖定量，将其稀释至25ng/ μl。
3.2.5 杂交
标记探针：在0.5ml离心管中加入PCR产物(在98℃加热4分钟变性，冰上冷 却2分钟)25ng，5×标记缓冲液10ul，dNTP(无dCTP)2.0ul，BSA 2.0ul，Klenow酶 1.0ul，[α-32P]dCTP 5.0ul，用无核酸酶的水补至总体积50ul。室温反应1-3小时。
预杂交：将膜用6×SSC浸5分钟，贴于杂交管壁，除去气泡。加入6ml购于Clontech 的杂交液，68℃1小时。
杂交：倒掉杂交液，加入预热的杂交液6ml，加入探针(探针需在98℃加热4分 钟变性，冰上冷却2分钟)，68℃3小时。
洗膜：先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在室温洗膜四次，每次10分钟。 再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在50℃洗20分钟，56℃洗20分钟。
压片：用滤纸吸去液体，用保鲜膜包好，贴于一张与X光片相同大小的滤纸上， 压片。-70℃曝光适当时间。洗片。
结果：如图1所示：β-actin在多种组织中的表达水平均一(图1A)；Fwap10576 选择性地在肝脏、肾脏和心脏中表达，表达水平依次降低(图1B)。
实施例四、Fwap10576基因在肿瘤细胞株中的表达
4.1 实验材料
含8种肿瘤细胞系的杂交膜购自美国Clontech公司，用其检测Fwap10576基因 在不同肿瘤细胞株中的分布。β-actin作为本实验的对照。
4.2 Northern杂交
参见实施例3.2。
结果：如图2所示，在所检查的8种肿瘤细胞株中，下列组织表达Fwap10576基 因：肺癌A549细胞株，Burkitt’s淋巴瘤，黑色素瘤G-361细胞株，淋巴细胞白血病 MDL-4细胞株，慢性粒细胞白血病K-562细胞株，其表达水平依次降低。而结构直肠 腺癌SW480细胞株不表达Fwap10576基因。
实例五、Fwap10576基因在不同心肌细胞中表达的差异
5.1 实验材料
来自成人、胎儿和陈旧行心肌梗塞室壁瘤患者的心肌细胞。
5.2 Northern杂交
参见实施例3.2。
结果：正常成人心脏几乎不表达Fwap10576，胎儿心脏表达Fwap10576，成人心 脏室壁瘤组织较胎儿心脏20倍高表达Fwap10576。结果提示，Fwap10576与心脏发育 有关。当出生后，由于心肌细胞成为G0期静息细胞，胎儿期很多与心脏有关的基因不 表达，当心脏因缺血而心肌凋亡坏死时，心脏修复，胚胎期表达的基因再度表达。
实施例六、Fwap10576基因在正常、慢性心衰和亚急性心衰动物心脏中的表达
6.1 慢性心衰模型的建立
50只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300克/只)购自本院动物房。标准块 料由北京动物中心提供，饮水为自来水，水与饲料由动物随意摄取。
称重，根据体重以氯胺酮和安定腹腔内注射全麻大鼠。行气管内插管并接小型动 物呼吸机。在心电监护仪的监护下左侧开胸，以6-10手术缝线结扎左冠状动脉前降支， 关胸。以心电监护仪上有明显ST段升高为结扎成功的标志。待其苏醒后撤除呼吸机。 术后饲养条件同术前，50天后模型即建成。
6.2 亚急性心衰模型的建立
10只雄性Wistar大鼠(250克/只)购自解放军301医院，饲养条件同慢性心衰模 型。
腹腔注射去甲肾上腺素30mg/日/只，连续注射4天，第5天模型即可以使用。
6.3 RNA-RNA原位杂交
原位杂交技术基于碱基互补的原理，通过探针特异性地与细胞内特定的mRNA或 DNA杂交，而显现出细胞内的基因及表达产物。该反应灵敏度极高，而且可检测出组 织分化过程中仅瞬间表达的基因。杂交试剂盒DIG RNA Labeling kit(Cat.No.1175025) 购自德国Boehringer Mannheim公司。
6.3.1 探针制备
特异引物PCR，将200-300bp Fwap10576的核酸片段(第248至508位核苷酸) 克隆入T Vector；重组质粒扩增，纯化；用T7和SP6引物进行PCR扩增；特异引物 和载体T7和SP6引物PCR定基因插入方向，测序(mRNA和Anti-mRNA)。加T7RNA聚 合酶合成反义探针，SP6 RNA聚合酶正义探针(检查杂交系统的可靠性)。
6.3.2 探针标记
先用酚/氯仿抽提被转录的线形DNA，再用酒精沉淀。将无RNA酶的离心管置冰上， 向管内加入1μl纯化的线性DNA，2μl NTP标记混合液，2μl 10×转录缓冲液，1μl RNA 酶抑制剂，2μl(40u)SP6或T7 TNA聚合酶，共20μL。混匀，稍加离心，加入20u不 含RNA的DNA酶I，37℃15分钟。加入2μl 0.2mol/l EDTA(pH8.0)以终止聚合反应。
在上述物质中加入2。5μl 4mol/L Licl、和75μl酒精(-20℃)的充分混匀，-70 ℃放置至少30分钟(或-20℃放置至少2小时)。12000rpm离心，70％冷乙醇洗涤，干 燥后。加100μL DEPC水和20u RNase，37℃静置30分钟后分装，-20℃保存。
6.3.3 玻片处理及标本制备
彻底清洗玻片，高压消毒30分钟，将玻片在含有多聚赖氨酸(0.01％)的溶液中 浸蘸几下，干燥，4℃备用。
新鲜标本(鼠冰冻切片)0.4cm×0.4cm，用1×PBS冲洗两次，置于冰冻切片机固 定头上。8-10μm切片，置有1mg/ml多聚赖氨酸的载玻片上晾干，4％多聚甲醛固定15-20 分钟。1×PBS冲冼2次，每次5分钟.
6.3.4 杂交前处理
用0.2N HCl浸泡25分钟。0.3％的Triton X-100浸泡5分钟。用1×PBS洗两次， 每次5分钟。用4％的多聚甲醛后固定6分钟。用1×PBS洗两次，每次5分钟。在1000ml 0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)溶液中加入5ml乙酸酐，待其完全溶解将切片置于10分钟。 以上反应均在室温下进行。
6.3.5 杂交反应
杂交液含有5ml去离子甲酰胺，2.5ml 20×SSC，500μl 100×Denhardt’s液(10g 聚蔗糖，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白，500ml消毒双蒸水)，500μl 10％SDS， 100μl 10mg/ml变性的鲑鱼精子DNA，400μl DEPC水。
将切片从乙酰化溶液中捞出，用滤纸吸干标本四周液体，用在标本周围画一小圈。 加预杂交液30ul在小圈内，湿盒内42℃温育2小时。甩去预杂交液，用25ul杂交液 覆盖Parafilm膜，湿盒内42℃温育16小时，封闭湿盒。
6.3.6 杂交后处理
将玻片从温盒取出，去掉Parafilm膜。2×SSC室温冲洗三次，每次10分钟。1 ×SSC室温冲洗三次，每次10分钟。0.1×SSC 50℃冲洗两次，每次15分钟。
若本底过高，将玻片置于含20μg/ml RNA酶的溶液(0.5mol/L Nacl，10mmol/L Tris-Cl，pH8.0)中，37℃消化30分钟。再用不含RNA酶的上述溶液于37℃冲洗30分 钟，洗膜。
6.3.7 显色反应
玻片浸泡于清洗液(1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；0.3％(V/V)Tween-20)。在100ml 封闭液(试剂盒中的阻断剂按10％(W/V)加入顺丁烯二酸缓冲液(0.1mol/L顺丁烯 二酸，0.15mol/l NaCl)，使用时1∶10稀释)中温育30分钟。加20ml抗体溶液，温 育30分钟。用100ml清洗液洗两次，每次15分钟。加20ml检测液(0.1M Tris-HCl， 0.1M NaCl，pH9.5)平衡2-5分钟。在10ml新配制的显色液(10ml检测液中加 200ulNBT/BCIP)中温育，避光，勿摇动。用消毒双蒸水或TE冲洗。
结果：在鼠大脑的神经胶质细胞的胞浆中呈阳性表达，特别在脑卒中模型中呈阳 性表达，这说明该基因不仅在进化中具有保守性，而且对机体的重要脏器(肝脏、肾 脏和脑)有重要的功能作用。提示该基因可能与心脑血管细胞的炎性反应及肿瘤的分 化、增殖有关。
实例七、免疫组织化学分析
7.1 人心肌梗塞并发症室壁瘤组织
7.1.1 实验材料
人心肌梗塞并发症室壁瘤组织。
7.1.2 免疫组织化学分析
用重组正确的原核表达(ptrxfus)质粒，从上清液中提取表达融合蛋白，经10％变 性聚丙烯酰胺电泳，确定目的基因条带，Western印迹鉴定目的蛋白后，免疫动物所 获得的血清。
石蜡切片5微米，贴附于包被有多聚赖氨酸的APES玻片上，75℃烤片2小时。 二甲苯脱蜡后经梯度酒精后切片入水。3％H2O2内10分钟。蒸馏水洗三遍，放入EDTA 抗原修复液内(pH8.0)，置微波炉中烘烤(96℃-98℃)10分钟。室温冷却20-30分 钟，蒸馏水洗三遍。入1×PBS缓冲液5分钟。10％正常兔血清20分钟。加适当稀释的 一抗，4℃内孵育过夜。1×PBS洗三次后，加生物素标记的羊抗兔二抗，室温10分钟。 1×PBS洗三次，加酶联链霉亲和素三抗，室温10分钟。1×PBS洗三次，DAB显色。蒸 馏水三次，苏木素浅染胞核、脱水、封片。
结果：室壁瘤心肌高表达Fwap10576基因。
7.2 脑卒中病人和非脑卒中病人的脑组织
7.2.1 组织来源：
脑卒中病人和非脑卒中病人的脑组织。脑组织切片福尔马林浸泡7天后，脱水， 制成石蜡切片。
7.2.2 免疫组织化学分析
参照7.1.2免疫组织化学分析方法。
结果：
如图8所示。用3株Fwap10576基因单克隆抗体(McAb)为I抗的免疫组化，A、B、 C、D的I抗为Fwap10576-SE3McAb，E的I抗为Fwap10576-6H10McAb，F的I抗为 Fwap10576-6B11McAb。从图B，D，E，F中均可见到该基因在脑卒中病人的神经细胞核内 有明显的表达。
实施例八、Fwap10576基因的体外重组及蛋白表达
8.1 构建重组载体
载体pTrxFus(购自Invitrogen公司)。取20ul pTrxFus载体，10×缓冲液4.0ul， 1.0ul XhoI，1.0ul SmaI，14ul无菌水，37℃酶切16小时。纯化酶切产物。
PCR引物由上海生工生物公司合成，聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化、OD260＝5)。正向 引物：5’CGG GAC CGG GAT TAC C 3’，反向引物5’ATG TCT AGA TCA TAG AGC ACG AA 3’。
取10ul PCR纯化产物，10×缓冲液2.0ul，1.0ul XhoI，7ul无菌水，37℃酶 切16小时。纯化酶切产物。
8.1.2 连接
1.0ul pTrxFus酶切产物，3.0ul PCR酶切产物，1.0ul 10X缓冲液，1.0ul T4 连接酶，4ul无菌水，16℃连接6小时。
8.1.3 转化
取上述连接产物5ul，加入100ul GI724感受态细胞。混匀，置于冰上30分钟。 42℃60秒，冰上2分钟。加入800ul SOC培养基37℃摇菌(小于225RPM)45分钟。 取100ul涂于含Amp(氨卞青霉素)抗性的LB平板上。30℃培养16小时。挑单克隆置于 5ml含50ug Amp的LB培养基中37℃摇16小时。
8.1.4 质粒提取
挑取单克隆菌落接种5ml RM-Amp培养基(含有氨苄青霉素的丰富培养基，组分为 6g Na2HPO4(无水)，3g KH2PO4，，0.5g NaCl，1g NH4Cl，20g Casamino Acids(酸水解酪素)， 0.095g MgCl2)，30℃摇(220-250rpm)过夜。
取菌液，2,000RPM离心10分钟，弃上清。沉淀中加预冷的溶液I(25mM Tris-HCl， pH8.0，2.0mM EDTA，50mM glucose)140ul，悬浮细菌。用280ul新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)裂解细菌。再加入450ul预冷的溶液III(4.0M Potassium acatate)， 混匀。离心4,000 RPM 10分钟，12,000 RPM 10分钟。取上清，加入0.6倍体积的 异丙醇，同上离心。用100ul TE(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)和20ug/ml的 RNA酶溶解沉淀，37℃30分钟。加600ul醋酸铵/乙醇(1∶5)，-70℃放置30分钟。 离心后用75％乙醇洗涤。用TE 100ul溶解提取的质粒，测OD260/280定量。
8.1.5 挑选阳性克隆
用PCR的方法鉴定阳性克隆。
8.1.6 序列测定
对限制性内切酶切割及PCR鉴定为阳性的克隆进行测序。引物由上海生工生物公 司合成，聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化、OD260＝5。pTRXFUS正向测序引物：5’-TTC CTC GAC GCT AAC CTG-3’，pTRXFUS反向测序引物：5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT GC-3’。引物的终 浓度为5uM。
将测序鉴定为阳性的克隆(pTrxSX576)保存在15％甘油中，-20℃存放。
8.2 重组蛋白的诱导表达
接种50ul菌液(pTrxSX576)于5ml RM-Amp培养基中，30℃摇(220-250rpm) 过夜。取250ul过夜菌接种5ml IM诱导培养基(6g无水Na2HPO4，3gKH2PO4.0.5gNaGl， 1g NH4Cl，2g酸水解酪素，0.095g MgCl2)，30℃摇(220-250rpm)3小时，取出，测 量OD550约为0.5。加900ml去离子水溶解，加水使终体积为1升，高压20分钟(15psi， 121℃)，冷却到室温，加1ml 100mg/ml ampicillin，25ml 20％无菌葡萄糖，20℃-25℃调 节pH＝7.0±0.2，+4℃保存。加色氨酸(Trp)至终浓度为100ug/ml，37℃摇(220- 250rpm)4小时，加10mg/ml色氨酸(Trp)，加热500ml玻璃蒸馏水至80℃，加入5g L- 色氨酸，搅拌至完全溶解，用0.45um滤膜过滤溶液除菌，于4℃避光最多保存6个月； 取出菌液，测量OD550；4300g离心收获菌体，立即超声释放蛋白或-20℃保存。
8.3 超声释放融合蛋白
诱导表达融合蛋白，+4℃，4300g离心10分钟，弃去上清，保留沉淀。用溶液II (20mM Tris-HCl，pH8，2.5mM EDTA)重悬菌体，使其OD550为100，放置于冰上。 菌液放在冰上，3×10秒脉冲，立即放到液氮中速冻，然后迅速放到37℃水浴中速溶； 重复两次；4℃，4300g离心10分钟，上清转移到新管中，冰上保存。
8.4 聚丙烯酰氨凝胶电泳及蛋白质免疫印迹
8.4.1 聚丙烯酰氨凝胶电泳
取20ul超声释放的融合蛋白溶液加适量的蛋白载样缓冲液，沸水浴中煮沸5分 钟，5000rpm离心5分钟，取20ul上清上样.60V恒压进浓缩胶(5％)，120V恒压进15％ 分离胶；卸胶，考马斯亮兰染色1-2小时，脱色分析结果。
8.4.2 蛋白质免疫印迹
半干系统(Bio-Rad产品)转膜1小时，转移缓冲液：(参见《精编分子生物学实 验指南》)。取下硝酸纤维素膜，10ml封闭液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，pH＝7.5，3％BSA)， 室温，摇动1个小时。20mlTBST(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，pH＝7.5，0.05％ Tween-20(w/v))洗膜5分钟，室温轻轻摇动.重复一次。将膜转移到1∶20,000稀释的 一抗缓冲液中，室温，浸润1-2个小时。20mlTBST室温洗膜5分钟.重复1次；在10ml 1∶5000稀释的二抗缓冲液中室温浸润1小时；20ml TBST室温洗膜2次，每次5分钟； 20ml TBS室温洗膜2次，每次5分钟；准备新鲜的底物溶液：66ul NBT(nitro-blue tetrazolium，氮蓝四唑，Promega)+10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-Cl，100mM NaCl，5mM MgCl2，pH＝9.5)混匀，再加33ul BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl- pHospHate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸，Promega)，混匀(1小时内使用)备用；20ml碱性 磷酸酶缓冲液室温洗膜2次，每次5分钟；10ml底物溶液，室温轻轻摇动显色.10-30 分钟；终止显色：20ml高压水5分钟。
8.5 重组蛋白TRXSX576表达条件的优化
8.5.1 不同活化时间重组蛋白TRXSX576表达量的变化
TRXSX576表达菌株30℃ 220-250rpm分别活化1小时，2小时，3小时，4小时，5小 时，6小时，然后加色氨酸至终浓度为100ug/ml，37℃摇(220-250rpm)诱导4小时，聚 丙烯酰氨凝胶电泳检测重组蛋白表达量的变化，结果图5A所示。
8.5.2 不同诱导时间重组蛋白TRXSX576表达量的变化
据上选取最佳活化时间活化TRXSX576表达菌株，然后加色氨酸至终浓度为 100ug/ml，37℃ 220-250rpm诱导0小时，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时， 聚丙烯酰氨凝胶电泳检测重组蛋白TRXSX576表达量的变化。结果如图5B所示。
8.6 亲和层析纯化融合蛋白TRXSX576
释放融合蛋白：在最佳活化时间和诱导时间下，表达融合蛋白，超声释放，测 OD280，粗算蛋白浓度。
平衡树脂：取2ml Resin(加乙醇共4ml)自然沉淀，弃去乙醇；用4-8ml RB(20mM βME，β巯基乙醇)重悬，静置使其自然沉积，小心弃去缓冲液；加4-8ml RB(20mM βME)重悬，室温轻轻摇动30-60分钟，小心弃去上清；用4-8ml RB(没有βME)重悬， 静置使其自然沉积，小心弃去缓冲液；重复上述步骤。
填柱：向柱中加2ml RB；以RB重悬Resin，小心加到柱中；待Resin自然沉积，打 开控制阀使缓冲液以约1滴/7秒的速度流下。
纯化：加样：约2ml融合蛋白溶液，以2ml/12×75试管收集，每管取5ul稀释 到500ul测OD280，洗柱：8ml RB(1mMβME)，简称1mMβME，洗脱：分别以6ml 5mMβ ME，10mMβME，50mMβME，100mMβME，200mMβME，500mMβME，1000mMβME洗脱。大 多数情况下目的蛋白在10-200mMβME之间洗脱下来。
聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定：每管取20ul聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定(方法同上)。
8.7 融合蛋白的透析与浓缩
1×EK(enterokinase，肠激酶)缓冲液，+4℃，磁力搅拌透析，4小时换一次透析 液，至少换4次透析液；用PEG浓缩至1ml，4℃保存。
实施例九、高表达Fwap10576诱发细胞增殖
9.1 表达载体的构建
利用分子克隆技术并参照前述实施例的方法分别构建了pcDNA-Fwap10576的正义、 pcDNA-Fwap10576的反义核酸重组表达载体。PcDNA3.1B载体购自CLONTECH公司。
9.2 获得稳定表达的克隆株
选用CLONTECH公司的Lipfectintm试剂盒。取1ul DNA质粒和1ug脂质体，转染 人肺癌A549细胞(购自医学科学院基础所细胞中心)，转染后24小时加G418(200μg/ml) 选择培养，2周后筛选到稳定表达的细胞株。
9.3 用细胞计数和MTT染色法观察细胞的生物学效应
9.3.1 胰蛋白酶消化方法：
倒掉细胞培养液，用1XPBS洗细胞2次(0.5ml/cm2培养皿)，加入含0.125％胰蛋 白酶的1XPBS消化细胞5分钟，反复用吸管吹打，混匀。然后用血球计数板计数。
9.3.2 细胞计数：
将细胞滴入血球计数板内，放置在光学显微镜(Nikon日本)上数细胞，细胞数的计算 公式为：细胞数的计算公式为：
细胞数/毫升＝4大格细胞数/4×10,000×稀释倍数
结果：
从图9可见，pcDNA3.1-p10576正义载体刺激细胞的增生，而其反义载体则明显抑 制细胞的增生。MTT活细胞染色的结果与细胞计数相同。
本发明并不限于上述具体的实施例，实施例仅用于说明本发明的某些方面。功能 上等同的方法和物质已包括在本发明的范围内。事实上，根据本文的描述和附图，基 于本发明的各种改变对本领域的技术人员而言是显而易见的。这样的改变已包括在本 发明权利要求的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110>中国医学科学院阜外心血管病医院
<120>细胞增殖因子Fwap10576
<130>PD0202026
<150>CN01109261.0
<151>2001-02-28
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1083
<212>DNA
<213>成人主动脉eDNA文库
<220>
<221>CDS
<222>(213)..(683)
<220>
<221>polyA_signal
<222>(1044)..(1049)
<400>1
cttacccgct tcactagtcc cggcattctt cgctgttttc ctaactcgcc cgcttgacta 60
gcgccctgga acagccattt gggtcgtgga gtgcgagcac ggccggccaa tcgccgagtc 120
agagggccag gaggggctgc ggccattcgc cgcccggccc ctgctccgtg gctggttttc 180
tccgcgggcg cctcgggcgg aacctgaaga ta atg ggc agc acc tgg ggg agc 233
Met Gly Ser Thr Trp Gly Ser
1 5
cct ggc tgg gtg cgg ctc gct ctt tgc ctg acg ggc tta gtg ctc tcg 281
Pro Gly Trp Val Arg Leu Ala Leu Cys Leu Thr Gly Leu Val Leu Ser
10 15 20
ctc tac gcg ctg cac gtg aag gcg gcg cgc gcc cgg gac cgg gat tac 329
Leu Tyr Ala Leu His Val Lys Ala Ala Arg Ala Arg Asp Arg Asp Tyr
25 30 35
cgc gcg ctc tgc gac gtg ggc acc gcc atc agc tgt tcg cgc gtc ttc 377
Arg Ala Leu Cys Asp Val Gly Thr Ala Ile Ser Cys Ser Arg Val Phe
40 45 50 55
tcc tcc agg tgg ggc agg ggt ttc ggg ctg gtg gag cat gtg ctg gga 425
Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Val Glu His Val Leu Gly
60 65 70
cag gac agc atc ctc aat caa tcc aac agc ata ttc ggt tgc atc ttc 473
Gln Asp Ser Ile Leu Asn Gln Ser Asn Ser Ile Phe Gly Cys Ile Phe
75 80 85
tac aca cta cag cta ttg tta gat ggt gtc tcg cca tgt tgc cca ggc 521
Tyr Thr Leu Gln Leu Leu Leu Asp Gly Val Ser Pro Cys Cys Pro Gly
90 95 100
tgg tct caa gca atc tgt ctg cct cag cct ccc aaa gtg ctg ggg gga 569
Trp Ser Gln Ala Ile Cys Leu Pro Gln Pro Pro Lys Val Leu Gly Gly
105 110 115
tta cag gcg ttg cct gcg gac acg ctg ggc ctc tgt cct gat gct gct 617
Leu Gln Ala Leu Pro Ala Asp Thr Leu Gly Leu Cys Pro Asp Ala Ala
120 125 130 135
gag ctc cct ggt gtc tct cgc tgg ttc tgt cta cct ggc ctg gat cct 665
Glu Leu Pro Gly Val Ser Arg Trp Phe Cys Leu Pro Gly Leu Asp Pro
140 145 150
gtt ctt cgt gct cta tga tttctgcatt gtttgtatca ccacctatgc 713
Val Leu Arg Ala Leu
155
tatcaacgtg agcctgatgt ggctcagttt ccggaaggtc caagaacccc agggcaaggc 773
taagaggcac tgagccctca acccaagcca ggctgacctc atctgctttg ctttggcatg 833
tgagccttgc ctaagggggc atatctgggt ccctagaagg ccctagatgt ggggcttcta 893
gattaccccc tcctcctgcc atacccgcac atgacaatgg accaaatgtg ccacacgctc 953
gctctttttt acacccagtg cctctgactc tgtccccatg ggctggtctc caaagctctt 1013
tccattgccc agggagggaa ggttctgagc aataaagttt cttagatcaa tcaaaaaaaa 1073
aaaaaaaaaa 1083
<210>2
<211>156
<212>PRT
<213>成人主动脉cDNA文库
<400>2
Met Gly Ser Thr Trp Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Leu Ala Leu Cys
1 5 10 15
Leu Thr Gly Leu Val Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Val Lys Ala Ala
20 25 30
Arg Ala Arg Asp Arg Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Val Gly Thr Ala
35 40 45
Ile Ser Cys Ser Arg Val Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly
50 55 60
Leu Val Glu His Val Leu Gly Gln Asp Ser Ile Leu Asn Gln Ser Asn
65 70 75 80
Ser Ile Phe Gly Cys Ile Phe Tyr Thr Leu Gln Leu Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Val Ser Pro Cys Cys Pro Gly Trp Ser Gln Ala Ile Cys Leu Pro Gln
100 105 110
Pro Pro Lys Val Leu Gly Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ala Asp Thr Leu
115 120 125
Gly Leu Cys Pro Asp Ala Ala Glu Leu Pro Gly Val Ser Arg Trp Phe
130 135 140
Cys Leu Pro Gly Leu Asp Pro Val Leu Arg Ala Leu
145 150 155
心脑血管病的治疗经历了四个大的阶段：1920年代，循环动力学的研究揭示了心 脏是一个“泵”，由此奠定了心力衰竭的治疗基础；60-70年代，对心血管病危险因素 的认识及处理，使西方国家心脏病的发病率下降了近40％；1970年，对心肌细胞电生 理学的研究，提供了抗心律失常、电生理检查及治疗的新方法；80年代末到90年代 初，对血管生物学的认识，产生了心脏介入治疗的新方法。
心衰、抗心律失常、及介入治疗对抢救心脑血管病人的生命，提高其生活质量起 到了积极作用。然而，由于这些方法仅针对症状进行治疗，没有从根本上触及病因， 所以治疗针对性不强。虽然延长了病人的寿命，但没有真正达到预防和治愈的目的。 因此，在分子生物学的水平进行研究，查明心脑血管病的致病因素及发病机理，有望 在该病的治疗方面取得突破性进展，达到从根本上遏制心脑血管病的目的。
cDNA文库是生物工程领域的重要研究工具之一。通常从细胞中提取mRNA， 通过反转录酶合成mRNA的DNA拷贝(即cDNA，Complementary DNA)。单链cDNA 分子在DNA聚合酶的作用转变成双链DNA分子，然后再插入载体，转化到宿主菌 中长成克隆。这样的每个克隆只包含特定的mRNA信息，这样的一套克隆就称为cDNA 文库。
由于cDNA不含内含子，从cDNA文库中可以直接筛选到相应的表达基因，故相 对基因库而言，cDNA文库具有操作简单、使用方便的优点。人体不同细胞表达基因 的差异决定了其组织和器官表型的差异，从人主动脉cDNA文库中分离和鉴定特异表 达基因，特别是分离和鉴定疾病相关基因，是研究遗传性心脑血管病的有效方法之一。
发明概述
按照本发明的一个方面，提供了一种新的成熟多肽Fwap10576以及具有生物学活 性并在诊断或治疗上有用途的Fwap10576的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是 人类来源的。
按照本发明的另一个方面，提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、 DNA、cDNA、基因组DNA，以及具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用途的该核酸 分子的片段、类似物和衍生物。
按照本发明的另一个方面，提供了用重组技术生产Fwap10576多肽的方法，该方 法包括培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
按照本发明的另一个方面，提供了将Fwap10576多肽或编码Fwap10576多肽的多 核苷酸用于治疗的方法。例如，治疗心脑血管增生性疾病，抑制肿瘤形成。
按照本发明的另一个方面，提供了这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面，提供了所述多肽的拮抗剂，其可用来抑制这些多肽的 作用。
按照本发明的另一个方面，提供了与本发明核酸序列中的突变、以及与本发明的 多肽异常表达有关的疾病或疾病易感性的诊断方法。
按照本发明的另一个方面，提供了将本发明的多肽或编码这种多肽的多核苷酸、 在体外用于科学研究、DNA合成以及人工构建DNA载体的方法。
根据本文的教导，上述方面及相关方面对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明是通过如下技术方案实现的。提取mRNA，反转录成cDNA，构建成人主动 脉cDNA文库。从文库中获取Fwap10576的基因片段，通过EST拼接得到Fwap10576的 全长cDNA序列。进而研究Fwap10576基因在不同组织的表达与分布，研究Fwap10576 多肽的活性与功能。
发明详述
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的核酸(多核苷酸)序列，其编码 具有推定的、如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟多肽。本发明的多核苷酸是从成 人主动脉的cDNA文库中发现的。其定位于人体细胞的第16号染色体上。其包含一个 开放阅读框架，可以编码具有156个氨基酸残基的多肽。同源性分析表明Fwap10576 多肽与目前的已知蛋白没有序列同源性。
推测的Fwap10576多肽由156个氨基酸组成。其序列特征为：(A)1至34 Aa为 信号肽；(B)2至7 Aa(GSTWGS)，19至24 Aa(GLVLSL)，46至51 Aa(GTAISC)，96 至101 Aa(GVSPCC)，118至123 Aa(GGLQAL)为N-豆蔻酰化位点；(C)33至39 Aa (RARDRDY)为酪氨酸激酶磷酸化位点；(D)56至58 Aa(SSR)为蛋白激酶C磷酸化 位点；(E)77至80 Aa(NQSN)为N-糖基化位点。分析表明Fwap10576多肽的分子 量为：16700.5道尔顿，等电点为8.11( http：/www.expasy.ch/tools/protparam.html)，细 胞外的蛋白约占蛋白总量的33.3％( http：//psort.nibb.ac.jp/form2.html)。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA 和合成DNA。DNA可以是双链或单链的，如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反 义)链。编码成熟多肽的编码序列可以和SIQ ID NO：1(全长1083个核苷酸)所示的 编码序列(213至683位核苷酸)相同；或者，由于遗传密码的丰余性或简并性，编码 序列也可以不同与SIQ ID NO：1所示的编码序列。
编码SIQ ID NO：2所示成熟多肽的多核苷酸可以包括：成熟多肽的编码序列； 成熟多肽的编码序列和附加的编码序列，如编码多肽前导序列或分泌序列的多核苷酸； 成熟多肽的编码序列(以及任选的附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽 编码序列5’和/或3’端的非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有多肽编码序列的多核苷酸以及含 有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码推定的、具有SIQ ID NO：2所示 氨基酸序列的多肽片段、类似物及衍生物。所述变异体可以是天然产生的该多核苷酸 的等位基因变异体，或者是非天然产生的变异体。正如本领域已知的，等位基因变异 体是一段多核苷酸的另一种形式，其可以带有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加， 而实质上不改变所编码多肽的功能。
因此，本发明包括能够编码与SIQ ID NO：2所示成熟多肽具有相同氨基酸序列 的多核苷酸，还包括能够编码SIQ ID NO：2所示成熟多肽之片段、衍生物和类似物的 多核苷酸变异体。这些变异体包括缺失变异体、取代变异体、添加或插入变异体。
本发明也包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框架 中，与有助于多肽由宿主细胞表达及分泌的多核苷酸(如产生前导序列的多核苷酸)相 融合。前导序列作为分泌序列而控制多肽从细胞中转运。具有前导序列的多肽是前体 蛋白(preprotein)，由宿主细胞切割其前导序列后可以产生成熟多肽。本发明的多核 苷酸也可以编码蛋白原(proprotein)，蛋白原是具有原序列(prosequence)的成熟蛋 白，是5’端附加了氨基酸残基的成熟蛋白，是一种无活性形式。切除原序列后，可以 产生有活性的成熟蛋白。
因此，本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白，也可以编码具有原序列的蛋白， 还可以编码既有原序列(prosequence)又有前导序列(presequence)的蛋白质。
本发明的多核苷酸还包括在同一读框中与标记序列融合的编码序列，标记序列可 用于纯化本发明的多肽。例如，当宿主细胞为细菌时，标记序列可以是由pQE-9载体 提供的、用于纯化融合产物的六组氨酸。或者，当宿主为哺乳动物细胞(如COS-7细胞) 时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)，HA标记对应于从流感血凝集蛋白衍生的一个 表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。
术语“基因”是指与产生多肽有关的DNA片段，其包括编码区之前和之后的区域， 以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明全长基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长基因和与 该基因有高度同源性或相似生物活性的其它基因。所说的探针优选具有至少30个碱基， 并且可以含有50个或更多个碱基。所述探针也可以用来鉴别相应于全长转录物的cDNA 克隆和含有完整基因的一个或多个基因组克隆。其中，完整基因包括调节序列、启动 子序列、外显子和内含子。例如可以根据已知的DNA序列合成寡核苷酸探针，进而分 离出基因的编码部分。与本发明基因序列互补的、标记的寡核苷酸探针可以用来从人 类cDNA、基因组DNA或mRNA文库中筛选与其杂交的文库成员。
本发明还涉及与本发明的多核苷酸杂交的核酸序列。条件是两个序列间具有至少 85％，优选至少90％，更优选至少95％的同源性。本发明特别涉及在严格条件下与本发 明的多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严格条件”是指仅在序列间具有至少 95％，优选具有至少97％的同源性时杂交才会发生。与上述序列杂交的多核苷酸可以编 码与本发明成熟多肽具有相同生物学功能或活性的多肽。
此外，与本发明的多核苷酸具有同源性并能够杂交的多核苷酸可以具有至少20 个碱基，优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基，其可以保留或不保留活性。这 样的多核苷酸可以用作SEQ ID NO：1的探针，用于回收多核苷酸、作为诊断探针或作 为PCR引物。
因此，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2所示多肽的多核苷酸具有至少85％，优选 至少90％，更优选至少95％同源性的多核苷酸及其片段(所述片段具有至少30个碱基， 优选至少50个碱基)，以及由这些多核苷酸编码的多肽。
根据本发明的另一个发明，本发明涉及推定的、具有SIQ ID NO：2所示氨基酸序 列的多肽及其片段、类似物和衍生物。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，当涉及由SIQ ID NO：1编码的多肽或者具有 如SIQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽时，是指基本上保留了所述多肽生物学功能或 活性的多肽。所说的类似物可以包括蛋白原，蛋白原经部分切除后可以产生有活性的 成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
所说的多肽(SIQ ID NO：2)及其片段、衍生物或类似物可以是：(i)一种多肽，其 中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取 代，并且被取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码子编码的，或者(ii)一种多肽， 其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(iii)一种多肽，其中成熟多肽与另一 种化合物融合，如与增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)融合，或者(iv)一 种多肽，其中成熟多肽与附加氨基酸残基融合，例如与前导或分泌序列融合，又如与 用来纯化成熟多肽的序列融合。通过本文的教导，这样的片段、衍生物及类似物可视 为在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的多肽和多核苷酸优选以分离形式提供的，并且优选将其纯化成均一(同 质)物质。
术语“分离的”是指所述物质脱离了原始环境(例如，如果该物质是天然存在的，则 指天然环境)。例如，一种在活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从 天然系统中部分或全部共存物质中分离出同样的多核苷酸或多肽则是分离的。这样的 多核苷酸可以是载体的一部分，这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，只要 这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2所示的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ ID NO： 2的多肽具有至少85％的同源性，更优选90％的同源性，最优选95％的同源性的多肽。 本发明还包括上述多肽的片段，多肽片段通常包含至少30个，优选至少50个氨基酸。
如本领域所熟知的，两个多肽之间的“同源性”是通过将一个多肽的氨基酸序列 及其保守氨基酸取代与另一个多肽比较而确定的。
通过多肽合成，本发明的多肽片段(或部分多肽)可用于生产全长多肽。此片段 可用作产生全长多肽的中间体。同样的，本发明的多核苷酸片段可以用于合成本发明 的全长多核苷酸。
根据本发明的另一个方面，涉及含有本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体基 因工程化的宿主细胞，以及通过重组技术产生本发明多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程化(转导、转化或转染)而产生的。所说 的载体可以是克隆或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程宿 主细胞可以在经改良适于激活启动子、筛选转化体或扩增本发明Fwap10576基因的常 规营养培养基中培养。培养条件(如温度和pH值)是由不同的宿主细胞决定的，这些 对本领域技术人员而言是显而易见的。
通过重组技术，本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。多核苷酸可以包含在任何 一种适于表达多肽的载体中。这样的载体包括染色体来源的、非染色体来源的和合成 的DNA序列。例如SV40衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，杆状病毒，酵母质粒，从质 粒和噬菌体DNA结合得到的载体，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬 病病毒)。此外，还可以使用其它载体，只要其可以在宿主中复制并存活。
可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，是用本领域已知的 方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点中。
表达载体中的DNA序列可以与适当的表达控制序列(启动子)连接，以指导mRNA的 合成。启动子的例子有：LTR或SV 40启动子，大肠杆菌的lac或trp，噬菌体λPL 启动子，以及已知其它的、控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达 载体也以包含指导翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以包含用于扩 增表达的合适序列。
此外，优选的表达载体包含一个或多个选择标记基因，以便为转化后宿主细胞的 筛选提供表型特征。例如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者 如用于大肠杆菌的四环素和氨苄青霉素抗性。
含有上述合适的DNA序列以及合适的启动子或者调控序列的载体可以用于转化适 当的宿主，以使其表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子有：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏 菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如DrosorpHila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞 如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。通过本文的教导，选择合适的宿 主可视作在本领域技术人员的知识范围内。
更具体地说，本发明还包括含有以上广泛描述的一种或多种序列的重组构建体。 构建体包括正向或反向插入了本发明核酸序列的载体，如质粒或病毒载体。在更为理 想的实施方案中，构建体还包含了可操作地与所述序列连接的调节序列，如启动子。 许多合适的载体和启动子是本领域技术人员熟知的，并可以通过商业途径获得。例如，细 菌载体：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、pHagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、 pDR540、pRITS(pHarmaca)；真核载体：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、 pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。此外，还可以使用其它的质粒或载体，只要它 们能够在宿主中复制并存活。
可以用带有CAT(氯霉素转移酶)或其它选择标记的载体从基因中选择启动子区。 两个合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、 gpt、λPR、PL、和trp。真核启动子包括CMV立即早期，SV胸苷激酶，早期和晚期SV40、 来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择适当的载体与启动子可视作在本领 域技术人员的知识范围内。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是 高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或低等真核细胞(如酵母细胞)，或者是原核细胞(如 细菌细胞)。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法可以实现构建体向 宿主细胞的导入(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法， (1986))。
宿主细胞中的构建体可以经由常规方式产生由重组序列编码的产物。而且，本发 明的多肽可以用常规的多肽合成仪合成。
在合适启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或 其它细胞中表达。用来源于本发明DNA构建体的RNA，通过无细胞翻译系统也可以产 生目的蛋白。Sambrook等人在《分子克隆实验室手册》中(1989，第二版，纽约冷泉 港实验室)描述了可用于原核和真核宿主的、合适的克隆及表达载体。
通过向载体中插入增强子序列，可以提高高等真核生物细胞对编码本发明多肽的 DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，一般约10至300bp，它作用于启动子以 增强其转录。增强子的例子有：复制起点上游100至270bp的SV40增强子、多形瘤 增强子以及腺病毒增强子。
一般地，重组表达载体包括复制起点和筛选标记基因(如大肠杆菌的氨苄青霉素 抗性基因和啤酒糖酵母的TRP1基因)，以及从高度表达的基因中得到、能够指导下游 结构基因转录的启动子。这样的启动子可以从编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶 (PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子中得到。异源序列以恰当的方 式与翻译起始序列及终止序列装配。优选地，与能够指导蛋白向细胞周质或细胞外培 养基分泌的前导序列装配。异源序列可以编码含有N-末端识别肽的融合蛋白，该识别 肽具有理想的特征，如稳定表达的重组产物或者简化纯化步骤。
将编码目的蛋白的结构基因，合适的翻译起始和终止信号，以及有功能的启动子 一起插入，可以构建适用于细菌的表达载体。所说载体包含一个或多个选择标记和一 个复制起点，以维持载体并在必要时在宿主中扩增载体。适合转化的原核宿主包括大 肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的多 个种。
作为代表性但非限制性的例子，用于细菌的表达载体可以含有源自市售载体的选 择标记和复制起点，这些市售载体包含公知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元 件。这样的市售载体包括，pKK223-3(pHarmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和 GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动 子和待表达的结构序列相结合。
转化合适的宿主菌株，待其生长至合适的细胞密度后，用恰当的方法(例如温度 变换或化学诱导)诱导选择的启动子，并继续培养细胞一段时间。常用离心法收获细胞， 用物理或化学方法破碎细胞，保留得到的粗产物以进一步纯化。可以用任一种常规的 方法破碎微生物细胞，所述方法包括冻融法、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂， 这些方法是本领域技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子 有由Gluzman(细胞，23：175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和能够表达相 容载体的其它细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载 体包含复制起点、适合的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷 酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。从SV40病毒基 因组中得到的DNA序列，如SV40复制起点、早期启动子、增强子、剪接及多聚腺苷酸 化位点可用来提供所需要的非转录遗传元件。
可以用多种方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫 酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层 析、亲和层析、羟基磷灰石层析、植物凝集素层析和高效液相色谱层析(HPLC)。
本发明的多肽可以是天然纯化的，或是化学合成的，或是用重组技术从原核或真 核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)制备的。根据重组 方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽也可 以包含一个起始的甲硫氨酸残基。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料。 Fwap10576具有促进细胞增殖的作用，可能被用于心脑血管疾病的治疗。
根据本发明的另一方面，提供了鉴定本发明多肽激活剂或拮抗剂的方法。方法之 一是在某种化合物存在的情况下，将表达Fwap10576受体的哺乳动物细胞或膜制剂与 Fwap10576多肽一起培养，检测该化合物增强或阻断Fwap10576多肽与受体相互作用后 产生第二信使的能力。第二信使系统包括但不限于：蛋白酪氨酸激酶系统(PTK)，cAMP 鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解作用。鉴定多肽拮抗剂的另一种方法是竞争 抑制法。该法将某化合物不存在时，与受体结合的Fwap10576多肽分子数设为对照， 通过检测该化合物存在时，与受体结合的Fwap10576多肽分子数的变化来确定潜在的 拮抗剂。
潜在的拮抗剂包括抗体，或者在某些情况下包括与本发明多肽结合的寡肽，它们 与所述多肽结合并有效地消除其功能。
另一个潜在的拮抗剂化合物是用反义技术制备的反义构建体。通过三股螺旋形成 反义DNA或RNA从而控制基因的表达，上述方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。 例如，可以依据编码本发明成熟多肽的核酸序列5’端，设计长约10至40个碱基对的 反义RNA。又如设计一种与转录涉及的基因区互补的DNA(三螺旋-参见Lee等，核酸 研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学， 251：1360(1991))，从而阻止转录以及本发明多肽的产生。反义RNA在体内和mRNA杂 交，并阻断mRNA分子翻译成为本发明的多肽(反义-Okano，J.神经化学杂志， 56：560(1991)；作为基因表达反义抑制剂的脱氧寡核苷酸(CRC出版社，Boca Raton， FL(1988))。可以将上述寡核苷酸传送至细胞，从而在体内表达反义RNA和DNA以抑制 本发明多肽的产生。
拮抗剂还包括一些小分子，这些小分子通过与本发明的多肽结合而阻止多肽与其 受体的相互作用，从而阻断其正常的生物活性。小分子包括但不限于小肽或类肽分子。
本发明的多肽、其激活剂和拮抗剂可以与合适的载体结合形成药物组合物。这样 的组合物包含治疗有效量的多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。载体包括但不限于 盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及上述物质的组合。其配方应与给药的方 式相宜。
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有 本发明药物组合物的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审 核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。本发明的药物组合物还可以与 其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以按常规方式给药，如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、 鼻内或真皮内途径。以治疗和/或预防特定疾病有效的剂量施用药物组合物。通常以至 少大约10微克/千克体重的量给药。在大多数情况下，以不超过每天约8毫克/千克体 重的量给药。在大多数情况之下，考虑到用药途径和症状等因素，给药剂量从每日大 约10微克/千克到1毫克/千克体重。
根据本发明的另一方面，可以通过在体内表达的方式使用本发明的多肽及其激活 剂和拮抗剂，这种方式常被称作“基因治疗”。
因此，可以在体外用编码本发明多肽的核酸(DNA或者RNA)对患者细胞进行基因 工程化处理，再将工程化的细胞提供给需要治疗的患者。上述方法是本领域熟知的。 例如，可以用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒对细胞进行基因工程化处理。
类似的，可以通过本领域已知的方法在体内基因工程化细胞，以便在体内表达多 肽。例如，用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒转导包装细胞，以使其能够产 生含有目的基因的感染性病毒颗粒。将这种生产细胞用于患者，从而在体内工程化细胞 并表达所说的多肽。根据本发明的教导，通过上述方法或其它方式施用本发明的多肽 对本领域技术人员而言是显而易见的。
可以得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏(Moloney) 鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏(Rous)肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、 禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒 和乳房肿瘤病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可使用的合适启动子包括但不限于：反转录病 毒LTR；SV 40启动子；人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller等，生物技术，Vol.7，No. 9，980-990(1989)描述)；或其它启动子(例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、 pol III和β-肌动蛋白启动子)。其它可采用的病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动 子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的教导，选择载体上合适 的启动子对本领域技术人员而言是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列应当有合适的启动子控制。可以使用的合适的启动子 包括但不限于：腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子)；或者异源启动子(如巨细胞 病毒(CMV)启动子)；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子(如MMT启动子、 金属硫蛋白启动子)；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动 子；病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子)；反转录病毒LTRs(包括上文描 述的修饰的反转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子和人类生长激素启动子。启动子也 可以是编码所述多肽的基因的天然启动子。
可以用反转录病毒质粒载体转导包装细胞以产生生产细胞。可被转染的包装细胞 包括但不限于：PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、 GP+E-86、GP+envAml2和DNA细胞系(Miller、人类基因治疗，Vol.1，pgs.5-14(1990) 描述的，其全部内容本文一并参考)。载体可以用任何本领域已知的方法转导包装细胞。 这些方法包括但不限于：电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，逆转录病毒质粒载 体可以包埋在脂质体中，或者偶联到脂类上，然后引入宿主中。
生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，该颗粒包含能够编码所述多肽的核 酸序列。可以用这些逆转录病毒载体在体内或体外转导真核细胞。被转导的真核细胞 将表达编码所述多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于：胚胎茎干细 胞、胚胎癌细胞、以及造血茎干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、 内皮细胞和支气管上皮细胞。
根据本发明的另一方面，本发明涉及Fwap10576基因在诊断或检测中的用途，通 过检测Fwap10576核酸序列中的突变可以诊断出相关疾病或对疾病的易感性。
可以用多种技术在DNA水平上检测出携带Fwap10576基因突变的个体。可以从患 者的细胞，如来自血液，尿，唾液，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。基因组DNA 可以直接用于检测，或者在分析前可以用PCR扩增(Saiki等，自然，324：163- 166(1986))。RNA或cDNA也可用于相同目的。例如，与本发明多核苷酸互补的PCR引 物可于鉴别和分析突变。如通过与正常的基因型相比较，根据扩增产物的大小改变来 检测缺失及插入。可以经与可以用放射性标记的RNA或反义DNA与扩增后的核酸序列 杂交，以鉴别点突变。用RNaseA消化或通过解链温度的差异，可以辨别完全配对序列 和错配的双链。
通过DNA测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异。此外，克 隆的DNA片段可以作为探针检测特异的DNA区段。当与PCR结合使用时，这种方法的 灵敏性大大提高，例如，将测序引物和双链PCR产物、或者由改良的PCR法产生的单 链模板分子一起使用。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在含有或不含变性剂的凝胶中，DNA 片段电泳迁移率的变化来实现。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示。 不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上进行区分，根据其特定的熔点或部 分解链温度，不同的DNA片段将停滞在凝胶的不同位置(参见Myers等，科学， 230：1242(1985))。
用RNase和S1保护的核酸酶保护分析法或化学裂解法也可以检测特殊位置上的 序列变化，(如Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。
因此，可以用杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶 (如限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法来检测DNA序列的 差异。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序之外，突变也可以用原位分析法检测。
根据本发明的另一方面，本发明涉及一种通过检测不同组织中Fwap10576多肽含 量的改变而进行的诊断分析方法。这是基于与正常对照组织相比，某组织中该多肽的 过量表达可以检测疾病或疾病易感性的存在。检测取自宿主的样品中本发明多肽之含 量的分析方法是本领域技术人员熟知的，方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、 Western印迹分析、酶联免疫吸附(ELISA)测定和“夹心”测定，优选ELISA检测。 ELISA测定包括首先制备本发明多肽的特异性抗体，优选单克隆抗体。然后制备该单 克隆抗体的报导抗体。将报导抗体与一种可检测试剂相结合，所说试剂如放射性试剂、 荧光试剂或者辣根过氧化物酶。从宿主取样，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支 持物(如聚苯乙烯皿)中温育。通过和非特异性蛋白质(如牛血清清蛋白)一起温育，将 覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来，在单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上 的本发明任何多肽结合期间，将单克隆抗体在皿中温育。用缓冲液将所有未结合的单 克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的受体抗体放入皿中，结果导致受体 抗体和任何结合到本发明多肽上的单克隆抗体结合。然后将未结合的单克隆抗体洗掉。 接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即 是给定体积的患者样品中存在的蛋白质的量。
也可以用竞争测定法检测多肽含量。方法包括将Fwap10576多肽的特异性抗体结 合到固相支持物上，然后标记(如放射性标记)本发明的多肽，将取自宿主的样品通 过固相支持物，然后通过检测标记量，确定样品竞争性结合抗体的量，从而确定样品 中本发明多肽的含量。
本发明的多核苷酸序列对染色体的鉴别也极有价值。该序列特异性地靶向于人染 色体的特定位置，并与之杂交。目前，仅有少数几种基于实际序列数据(重复多形性) 的染色体标识试剂可用于标记染色的体位置。基于本发明DNA的染色体作图是将这些 序列和疾病相关基因关联的首要的步骤。
简言之，通过由cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)可以进行序列的染色体定位。 通过计算机分析基因的3’非翻译区，可以快速选择引物。引物不应跨越基因组DNA的 第一个外显子，否则将使扩增复杂化。然后，将引物用于PCR以筛选含有单个的人染 色体的体细胞杂和体。只有含有与该引物相应的基因的杂和体才会产生扩增片段。
体细胞杂合体的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的快捷方法。根据本发 明，用相同的寡核苷酸引物和来自特定染色体或大基因组克隆的一组片段，依照类似 方法可以完成亚定位。可以用于染色体作图的其它作图方法包括原位杂交、用标记的、 经流式分选的染色体进行预筛选以及用杂交进行预筛选，从而构建染色体特异性的cDNA 文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以实现更精确的染色体位 置。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。详见Verma等人的综述，人类染色 体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦完成了基因在染色体上的精确定位，则可以将该基因在染色体上的物理位置 与遗传图谱数据联系起来。这些数据可以在例如V.McKusick，人类孟德尔式遗传中找 到(可通过互联网在Johns Hopkins大学的Welch医学文库中得到)。然后通过连锁 分析(物理相邻基因的共遗传)，确定基因与已定位到染色体相同区域的疾病之间的关 系。
随后需要确定患病个体和正常个体之间cDNA或者基因组序列的差异。如果在部 分或全部患病个体中观察到突变，但在正常个体中观察不到，则所述突变可能是疾病 的病因。
所说的多肽、其片段、其衍生物或类似物，或表达上述物质的细胞可用作免疫原 而产生抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人源化 的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法均可用于产生 这些抗体和片段。
通过向动物体(优选非人体)直接注射或者施用本发明的多肽可以获得相应的抗 体。这样获得的抗体会与所述多肽结合。这样，即使是编码多肽片段的序列也可以产 生能够结合整个天然多肽的抗体。进而用这种抗体从表达该多肽的组织中分离多肽。
为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养而生产抗体的技 术。例如杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、三体杂交瘤 技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，4：72)和EBV-杂交瘤技术 (Cole，等，1985，单克隆抗体和癌癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以将所述生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)加以改进，以生产抗本 发明多肽(具免疫原性)的单链抗体。也可以用转基因小鼠表达抗本发明多肽(具免 疫原性)的人源化抗体。
为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列附图和实施例对其进行解释。附图 和实施例是为了说明而不以任何方式限制本发明。
在以上所述的教导下，本发明的许多改良和变化是可能的，因此，在附属权利要 求的范围内，可以以不同于以上特定描述的方式实施本发明。
附图简述
图1显示了Fwap10576在正常组织的分布。
图2显示了Fwap10576在不同肿瘤细胞系中的分布。
图3显示了Fwap10576在正常成人和胎儿心肌组织，以及在陈旧性心肌梗塞病人 室壁瘤组织表达的情况。
图4为原位杂交观察Fwap10576在正常动物模型脑组织的表达。
图5为重组蛋白TRXSX576表达条件的优化。其中，
A显示不同活化时间对重组蛋白TRXSX576表达量的影响；B显示不同诱导时间对 重组蛋白TRXSX576表达量的影响。
图6为原位杂交法检测Fwap10576在正常动物脑组织中表达的情况。
图7为原位杂交法检测Fwap10576在脑卒中动物脑组织中表达的情况。
图8为免疫组化分析结果(光镜×100)。A.非脑卒中病人的脑组织切片，I抗为 Fwap10576-SE3McAb；B.脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576-SE3McAb；C.非 脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576-SE3McAb；D.脑卒中病人的脑组织切片， I抗为Fwap10576-SE3McAb；E.脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576- 6H10McAb；F.脑卒中病人的脑组织切片，I抗为Fwap10576-6B11McAb。
图9为高表达Fwap10576诱发细胞增殖的情况。
实施例
实施例一、成人主动脉cDNA文库的构建
1.1 RNA的提取
RNA gentsTotal RNA Isolation System kit购自美国Promega公司(Cat No.Z5110)。 操作如下；称取0.3g液氮中保存的成人主动脉组织，加入10ml变性液(4M异硫氰酸 胍、25mM柠檬酸三钠)和1ml 2M乙酸钠(pH4.0)匀浆。加入等体积水饱和酚和0.2 倍体积氯仿，剧烈振荡15秒，冰上放置15分钟。10,000rpm，4℃离心20分钟。取 上清，加等体积异丙醇，-20℃放置2小时，离心。再用变性液5ml悬浮沉淀，重复上 述步骤。用1ml冰预冷的75％乙醇洗涤沉淀，室温下蒸发痕量乙醇5-10分钟，用焦碳酸 二乙脂(diethyl pyrocarbonate，以下简称DEPC)处理的去离子水溶解RNA。
1.2 mRNA的分离
成熟的mRNA的3′端有一条由20-250个腺苷酸组成的Poly(A)。根据该特征，可 用亲和层析法分离mRNA和其它的RNA。本实验使用的oligo(dT)纤维素含有12-18个 核苷酸(T)的多聚链。在多盐条件下，带有oligo(A)尾巴的mRNA与oligo(dT)结合并 留在柱子上，而无oligo(A)尾巴的rRNA与tRNA被洗掉，然后用低盐液洗脱挂在柱子 上的mRNA。
Quick prepmicro mRNA purification kit购自瑞典pHarmacia公司。在1.5ml无RNA 酶的离心管1#内加入1ml oligo(dT)纤维素悬液；另取1.5ml离心管2#，加入用上样缓冲 液稀释的总RNA 1ml；管2#和管2#室温离心1分钟，12000rpm；吸去管1#上清，将管 2#的上清加入管1#，轻摇5-10分钟；室温离心10秒，12000rpm；用1ml高盐缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.5M NaCl)洗涤5次，离心；用1ml低盐缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.1M NaCl)洗涤5次，离心；用0.3ml低盐缓冲液悬浮 oligo(dT)沉淀并转移到微量离心柱，12,000rpm，离心5秒；用0.5ml低盐缓冲液洗涤 3次，离心；用2×0.2ml洗脱液收集mRNA；用分光光度计测定光密度，计算OD260/280 的比值；得到300μl mRNA，加入7.5μl糖原，30μl 2.5M乙酸钾(pH5.0)，750μl无 水乙醇在-70℃保存备用；使用前离心5分钟，75％乙醇洗涤，DEPC水溶解mRNA。
1.3 cDNA的合成
合成步骤参照ZAP ExpressTmcDNA Synthesis Kit*and ZAP ExpressTmcDNA GigapackII Gold Cloning Kit*(美国Stregene公司，Catalog No.200403和200404)的 说明书。
在0.5ml离心管中依次加入5μl 10×第一链缓冲液，3μl甲基化的dNTP混合物， 2μl Xho I连接子oligo(dT)18引物(1.4μg/μl)，32.5μl用DEPC处理的去离子水， 1μl RNA酶抑制剂(40u/μl)，5μg mRNA，置室温10分钟。再加入1.5μl莫洛尼氏 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(50u/μl)，总反应体积50μl。从中取出5μl转入 另一离心管，加入0.5μl α-32P三磷酸脱氧腺苷(dATP)(800ci/mmol)以鉴定第一链 合成质量。上述反应均在37℃进行。
得到的DNA/RNA杂交分子在DNA聚合酶I的作用下，以第一链为模板合成第二 链。在冰浴中依次加入45μl第一链cDNA，20μl 10X第二链缓冲液，6μl dNTP混合 物，114μl去离子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，1μl DNA 聚合酶I(9.0u/μl)，总体积200μl。混匀，16℃孵育2.5小时。反应结束后，用酚∶ 氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀。
1.4 cDNA与载体的连接
从试剂盒中取出9μl EcoRI连接子(序列分别为5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’ -GCCGTGCTC-5’)溶解沉淀。取1μl电泳，鉴定第一和第二链合成质量。在剩余 的8μl第二链cDNA中依次加入1μl 10X连接酶缓冲液，1μl 10mmol/Lγ-三磷酸腺 苷(γ-ATP)，1μl T4 DNA连接酶(4u/μl)，8℃水浴16小时后，70℃孵育30分钟。用 限制酶XhoI消化1.5小时。琼脂糖凝胶(SepHarose)C1-2B过柱分离，除去小于400碱 基的核苷酸，以提高全长cDNA在cDNA文库中的比例。
1.5 cDNA克隆入ZAP噬菌体载体
ZAP噬菌体载体(美国Stratagene公司)上的多克隆位点允许插入长达10Kb的核 酸片段，进入宿主后质粒部分可从载体上切开，形成质粒载体Bluescript。该载体多克 隆位点两侧有T7和T3噬菌体的启动子，可以用于序列分析和探针合成。插入载体的 cDNA片段可以表达具抗原性和生物活性的融合蛋白。实验详述如下：
在离心管内加入100ng cDNA，0.5μl 10×连接酶缓冲液，0.5μl 10mmol/Lγ-ATP (pH7.5)，1ul ZAP噬菌体载体(1ug/ul)，0.5ul T4 DNA连接酶(4u/ul)，加去离子水至总 体积5μl。12℃连接16小时。
连接产物需包装外壳蛋白以产生有转染活性的重组噬菌体。快速从-70℃取出包装 蛋白，溶解后，在25ul包装蛋白内加1ul连接反应物，混匀，22℃反应2小时，加入500ul SM缓冲液(0.1M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.05M Tris-HCl，0.01％明胶)，20ul氯 仿。此混合物即为原始的cDNA文库。
1.6 计算阳性克隆的效价
取5ul原始的cDNA文库，用45ul SM缓冲液稀释。将10ul稀释后的溶液，加入 200ul感受态XL1-Blue MRF′宿主菌中(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分钟，加入3ml 上层琼脂糖，混匀，铺于NZY(0.09M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.5％酵母提取液， 1％NZ胺A)平板上，倒置，37℃培养过夜，计算平板上的克隆数。
cDNA文库的效价用噬菌斑成斑数(pfu/ml)表示。pfu/ml＝(噬菌斑数×稀释倍数)× 1000/稀释液用量(ul)。容量大于1×106个克隆的cDNA文库，能够保证其中含有每一 个单拷贝的mRNA.本发明成人主动脉cDNA文库的库容量为2.4×106个独立重组克 隆。
1.7 cDNA文库的扩增和保存
构建的cDNA文库可直接用于筛选，但不稳定。因为非野生型的噬菌体易失活， 故需要扩增以方便多次筛选。取5×104个噬菌体转染XL1-Blue MRF′宿主菌，铺板，37 ℃孵育8～10小时，然后在150mm平皿中加入8ml SM缓冲液，4℃培养过夜。离心， 收集上清，即得到扩增后的cDNA文库。加入0.3％氯仿，4℃保存。长期保存需加入 7％的二甲基亚砜(DMSO)，-70℃冻存。
实施例二、新全长cDNA的克隆
2.1 随机克隆的多聚酶链反应(PCR)扩增
cDNA文库铺盘，噬菌斑密度为200-500个克隆/培养皿(150mm)，挑取清亮的单 个噬菌斑转入含有75ul SM缓冲液和5ul氯仿的无菌离心管中，置于4℃。用前混匀离 心，取上清液5ul，用ZAP噬菌体载体3′端引物(5′CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC 3′)和5′端引物(5′CAGTCAATTGTAATACGACTCACT 3′)进行PCR扩增，反应总体 积50ul。扩增参数为94℃预变性3分钟；再94℃45秒，55℃30秒，72℃3分钟，共30 个循环；72℃延伸5-10分钟。根据1％琼脂糖凝胶中电泳带的亮度估算PCR产物的产 量。
2.2 表达序列标签(EST)的序列测定
ABI377自动测序仪(ABI PRISMTM377DNA sequencer)和自动测序试剂盒 (BigDyeTM Terminator Ready Reaction Mix)购自美国PE公司。依照推荐的使用条件， 用双脱氧链终止法测序。
用非放射性CY5荧光素(CY5-fluoroscein)作标记物，通用测序引物T3(5′ATTAAC CCT CAC TAA AGG GA 3′)和T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′)进行测序， 每份样品中引物用量为5pmol/ul。测序模板为PCR产物，用量约30-100ng。PCR扩增 参数为94℃3-5分钟；再94℃30秒，50℃15秒，72℃1分钟，20个循环；94℃30 秒，72℃1分钟，15个循环；再72℃延伸5分钟。DNA产物在8mol/L尿素、6％聚 丙烯酰胺凝胶板上电泳。电压1500V，功率34W，电泳250-300分钟(ALF ExpressTMDNA sequence，瑞典pHarmacia公司)。
2.3 EST的生物信息学分析
用美国生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将每 个cDNA克隆的EST与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较 ( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov).根据BLAST的判断标准(国内外大多数实验室的通 用标准)；同源序列小于100-200个碱基，Score值小于100的序列为新的EST。本发 明Fwap10576的EST为新EST。
2.4 EST引物步移法测序
2.4.1 ZAP噬菌体的体内环化
ZAP噬菌体载体能将目的片段在宿主内直接从λ噬菌体载体转移到质粒，环化为 PBK-CMV(带有CMV病毒早期启动子)噬菌粒。环化步骤参照说明书(ZAP Express cDNA Synthesis kit and ZAP Express cDNA Gigapackm Gold Doning kit)。
用3ul保存在4℃携带新EST的噬菌体和1ul辅助噬菌体(一类自身复制能力极 低的噬菌体突变体，可以为寄主细胞中质粒DNA的复制与包装提供蛋白酶和外壳蛋 白质)共转染300ul大肠杆菌XL1-Blue MRF’株(OD600＝1.0)。获得单链DNA后，再 转染大肠杆菌XLOLR株(试剂盒提供)，在试管内加5mlLB培养液，25ul卡那霉素， 37℃培养12-16小时。
2.4.2 质粒的提取和鉴定
用德国QIAGEN公司的“QIAPrep Spin Miniprep kit″提取质粒。2400rpm，4℃离 心10分钟，收集过夜培养的细菌。弃上清，加入25ul缓冲液P1(100ul/ml RNaseA，50mM Tris/HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮细菌，移至灭菌的1.5ml离心管内。加250ul缓 冲液P2(200mM NaOH，1％SDS)，颠倒上清几次，充分混匀。加350ul缓冲液P3(3.0M KAc，pH5.5)，立刻摇管4-6次。12000rpm，离心10分钟(SORVALLMc12V台式离 心机)。收集上清，将其移至底部套有收集管的微型纯化柱(QIA prep Spin Miniprep) 内，12000rpm，离心30-60秒。加0.75ul缓冲液TE(10mM Tris/HCL，1mM EDTA，pH8.0)， 离心30-60秒。去掉收集管，在QLAprep微型纯化柱底部套一个灭菌的离心管，加50ul 缓冲液EB(10mM Tris-HCL pH8.5)或去离子水，在柱床内保留1分钟后离心1分钟， 收集纯化的DNA。
在离心管内加入3ul酶切缓冲液(10×)，1ul NotI内切酶(15u/ul)，1ul ECoRI 内切酶(15u/ul)，1ulBSA，2ulDNA，22ul去离子水，总体积30ul。37℃温育4-6小时。 酶切后鉴定质粒大小。
2.4.3 新的全长cDNA的测定
用美国PE公司的ABI377自动测序仪和测序试剂盒BigDyeTM Terminator Ready Reaction Mix测定PBK-CMV阳性克隆的序列。
反应液中有BD 4ul，BOB 2ul(400mM Tris-HCl，pH9.0，10mM MgCl2)，引物2 ul(5pmol/ul)，DNA模板30-100ng，用H2O补足至终体积20ul。用步移法(逐级引物 法)测定cDNA全长序列，即下一轮的测序引物由上轮测序所得产物的末端碱基确定。 用oligo 14.0软件设计PCR引物。
结果：
如SEQ ID NO：1所示，Fwap10576 cDNA全长1083个碱基对。推测其起始密码子 为213至215核苷酸(ATG)，终止密码子为681至683位核苷酸。开放读码框架为213 至683位核苷酸，编码一个由156个氨基酸残基组成的多肽。BLAST分析表明该基因定 位与16号染色体。
蛋白同源性分析表明：Fwap10576蛋白与目前抑制的蛋白无序列同源性。其蛋白 序列特征为；(A)1至34 Aa为信号肽。(B)2至7 Aa(GSTWGS)，19至24 Aa(GLVLSL)， 46至51 Aa(GTAISC)，96至101 Aa(GVSPCC)，118至123 Aa(GGLQAL)为N-豆蔻 酰化位点。(C)33至39 Aa(RARDRDY)为络氨酸激酶磷酸化位点。(D)56至58 Aa(SSR) 为蛋白激酶C磷酸化位点。(E)77至80 Aa(NQSN)为N-糖基化位点。
实施例三、Fwap10576在正常组织的分布
3.1 实验材料
含12种组织的mRNA的多组织膜(MTN膜)购自美国Clontech公司，用其检测 Fwap10576基因在正常组织中的分布。β-actin是一种管家基因，在多种组织中表达均 一，本实验中用作对照。
3.2 Northern杂交
方法参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编，中国协和医科大学出版社， 第二版，1999)147-149，202-205，207-213页。详述如下：
3.2.1 总RNA提取
称取0.5g(成人心脏，胎儿心脏，室壁瘤组织)组织于50ml离心管中，加入10ml GTC，匀浆。加等体积水饱和酚及0.2体积氯仿，剧烈振荡15秒，冰上放置20分钟。 4℃，12,000rpm离心25分钟。取上清置于另一离心管，加等体积异丙醇，-20℃沉淀 1小时。4℃12,000rpm离心25分钟，弃上清。用5mlGTC重新溶解沉淀后，重复其它 操作。用1ml预冷的75％乙醇洗涤，晾干，用DEPC处理过的水溶解。测OD(光密度)260 及OD280。
3.2.2 甲醛变性凝胶电泳
称取0.6g琼脂糖凝胶加入52.2ml DEPC处理过的水中，加热溶解，待胶冷到65 ℃，加入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，灌胶。取4.5ul(40-60ug)总RNA，加入2.0ul10 ×MOPS，3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混匀，65℃变性15分钟，冰上冷却2分钟。加入 2.0ul上样缓冲液，混匀。50伏预电泳5分钟，上样。待染料全部进入胶后，电压降 为40伏，每10分钟混合电泳缓冲液1次。
3.2.3 转膜
待溴酚兰泳动到凝胶底部，停止电泳，照相。用DEPC处理过的水洗胶数次，用50mM NaOH处理45分钟，用20×SSC处理45分钟。尼龙膜先用去离子水浸湿，再用20×SSC 处理45分钟。在胶托上铺一层滤纸，用20×SSC浸湿，除去气泡；将胶倒置于胶托上， 其上面放一中间挖空的塑料薄片。小心将膜置于胶上，除去气泡，在膜上铺两张20×SSC 浸湿的滤纸，除去气泡。在滤纸上铺上10cm高的吸水纸，压一500克的重物。转膜16 小时，中间换吸水纸2-3次。小心取下膜，照相，用6×SSC泡膜5分钟。紫外交联， 80℃烤膜1小时，4℃保存备用。
3.2.4 制备杂交模板
上游引物：5’-CC GAATTC ATGCACCGGCTCATCTTTGTC-3’，斜体所示为保护碱基， 黑体所示为EcoRI酶切位点，划线部分与Fwap10576核酸序列107-127位互补；下游 引物：5’-GC CTCGAG TCTTATCGAGGTGGTCTTGAGCTG-3’，斜体所示为保护碱基，黑体 所示为XhoI酶切位点，划线部分与Fwap10576核酸序列1198-1221位互补。
PCR反应体系：10倍缓冲液5.0ul，脱氧核糖核酸2.0ul，上游、下游引物各3.0ul， Taq酶1.0ul，Fwap10576测序质粒(模板)2.0ul，无菌水34ul。PCR参数：94℃预 变性3分钟；94℃3分钟，94℃20秒，60℃30秒，72℃80秒，30个循环。72℃7分钟。 用醋酸铵/乙醇(1∶5)纯化PCR产物，溶于50ulTE，用琼脂糖定量，将其稀释至25ng/ μl。
3.2.5 杂交
标记探针：在0.5ml离心管中加入PCR产物(在98℃加热4分钟变性，冰上冷 却2分钟)25ng，5×标记缓冲液10ul，dNTP(无dCTP)2.0ul，BSA 2.0ul，Klenow酶 1.0ul，[α-32P]dCTP 5.0ul，用无核酸酶的水补至总体积50ul。室温反应1-3小时。
预杂交：将膜用6×SSC浸5分钟，贴于杂交管壁，除去气泡。加入6ml购于Clontech 的杂交液，68℃1小时。
杂交：倒掉杂交液，加入预热的杂交液6ml，加入探针(探针需在98℃加热4分 钟变性，冰上冷却2分钟)，68℃3小时。
洗膜：先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在室温洗膜四次，每次10分钟。 再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在50℃洗20分钟，56℃洗20分钟。
压片：用滤纸吸去液体，用保鲜膜包好，贴于一张与X光片相同大小的滤纸上， 压片。-70℃曝光适当时间。洗片。
结果：如图1所示：β-actin在多种组织中的表达水平均一(图1A)；Fwap10576 选择性地在肝脏、肾脏和心脏中表达，表达水平依次降低(图1B)。
实施例四、Fwap10576基因在肿瘤细胞株中的表达
4.1 实验材料
含8种肿瘤细胞系的杂交膜购自美国Clontech公司，用其检测Fwap10576基因 在不同肿瘤细胞株中的分布。β-actin作为本实验的对照。
4.2 Northern杂交
参见实施例3.2。
结果：如图2所示，在所检查的8种肿瘤细胞株中，下列组织表达Fwap10576基 因：肺癌A549细胞株，Burkitt’s淋巴瘤，黑色素瘤G-361细胞株，淋巴细胞白血病 MDL-4细胞株，慢性粒细胞白血病K-562细胞株，其表达水平依次降低。而结构直肠 腺癌SW480细胞株不表达Fwap10576基因。
实例五、Fwap10576基因在不同心肌细胞中表达的差异
5.1 实验材料
来自成人、胎儿和陈旧行心肌梗塞室壁瘤患者的心肌细胞。
5.2 Northern杂交
参见实施例3.2。
结果：正常成人心脏几乎不表达Fwap10576，胎儿心脏表达Fwap10576，成人心 脏室壁瘤组织较胎儿心脏20倍高表达Fwap10576。结果提示，Fwap10576与心脏发育 有关。当出生后，由于心肌细胞成为G0期静息细胞，胎儿期很多与心脏有关的基因不 表达，当心脏因缺血而心肌凋亡坏死时，心脏修复，胚胎期表达的基因再度表达。
实施例六、Fwap10576基因在正常、慢性心衰和亚急性心衰动物心脏中的表达
6.1 慢性心衰模型的建立
50只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300克/只)购自本院动物房。标准块 料由北京动物中心提供，饮水为自来水，水与饲料由动物随意摄取。
称重，根据体重以氯胺酮和安定腹腔内注射全麻大鼠。行气管内插管并接小型动 物呼吸机。在心电监护仪的监护下左侧开胸，以6-10手术缝线结扎左冠状动脉前降支， 关胸。以心电监护仪上有明显ST段升高为结扎成功的标志。待其苏醒后撤除呼吸机。 术后饲养条件同术前，50天后模型即建成。
6.2 亚急性心衰模型的建立
10只雄性Wistar大鼠(250克/只)购自解放军301医院，饲养条件同慢性心衰模 型。
腹腔注射去甲肾上腺素30mg/日/只，连续注射4天，第5天模型即可以使用。
6.3 RNA-RNA原位杂交
原位杂交技术基于碱基互补的原理，通过探针特异性地与细胞内特定的mRNA或 DNA杂交，而显现出细胞内的基因及表达产物。该反应灵敏度极高，而且可检测出组 织分化过程中仅瞬间表达的基因。杂交试剂盒DIG RNA Labeling kit(Cat.No.1175025) 购自德国Boehringer Mannheim公司。
6.3.1 探针制备
特异引物PCR，将200-300bp Fwap10576的核酸片段(第248至508位核苷酸) 克隆入T Vector；重组质粒扩增，纯化；用T7和SP6引物进行PCR扩增；特异引物 和载体T7和SP6引物PCR定基因插入方向，测序(mRNA和Anti-mRNA)。加T7RNA聚 合酶合成反义探针，SP6 RNA聚合酶正义探针(检查杂交系统的可靠性)。
6.3.2 探针标记
先用酚/氯仿抽提被转录的线形DNA，再用酒精沉淀。将无RNA酶的离心管置冰上， 向管内加入1μl纯化的线性DNA，2μl NTP标记混合液，2μl 10×转录缓冲液，1μl RNA 酶抑制剂，2μl(40u)SP6或T7 TNA聚合酶，共20μL。混匀，稍加离心，加入20u不 含RNA的DNA酶I，37℃15分钟。加入2μl 0.2mol/l EDTA(pH8.0)以终止聚合反应。
在上述物质中加入2。5μl 4mol/L Licl、和75μl酒精(-20℃)的充分混匀，-70 ℃放置至少30分钟(或-20℃放置至少2小时)。12000rpm离心，70％冷乙醇洗涤，干 燥后。加100μL DEPC水和20u RNase，37℃静置30分钟后分装，-20℃保存。
6.3.3 玻片处理及标本制备
彻底清洗玻片，高压消毒30分钟，将玻片在含有多聚赖氨酸(0.01％)的溶液中 浸蘸几下，干燥，4℃备用。
新鲜标本(鼠冰冻切片)0.4cm×0.4cm，用1×PBS冲洗两次，置于冰冻切片机固 定头上。8-10μm切片，置有1mg/ml多聚赖氨酸的载玻片上晾干，4％多聚甲醛固定15-20 分钟。1×PBS冲冼2次，每次5分钟.
6.3.4 杂交前处理
用0.2N HCl浸泡25分钟。0.3％的Triton X-100浸泡5分钟。用1×PBS洗两次， 每次5分钟。用4％的多聚甲醛后固定6分钟。用1×PBS洗两次，每次5分钟。在1000ml 0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)溶液中加入5ml乙酸酐，待其完全溶解将切片置于10分钟。 以上反应均在室温下进行。
6.3.5 杂交反应
杂交液含有5ml去离子甲酰胺，2.5ml 20×SSC，500μl 100×Denhardt’s液(10g 聚蔗糖，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白，500ml消毒双蒸水)，500μl 10％SDS， 100μl 10mg/ml变性的鲑鱼精子DNA，400μl DEPC水。
将切片从乙酰化溶液中捞出，用滤纸吸干标本四周液体，用在标本周围画一小圈。 加预杂交液30ul在小圈内，湿盒内42℃温育2小时。甩去预杂交液，用25ul杂交液 覆盖Parafilm膜，湿盒内42℃温育16小时，封闭湿盒。
6.3.6 杂交后处理
将玻片从温盒取出，去掉Parafilm膜。2×SSC室温冲洗三次，每次10分钟。1 ×SSC室温冲洗三次，每次10分钟。0.1×SSC 50℃冲洗两次，每次15分钟。
若本底过高，将玻片置于含20μg/ml RNA酶的溶液(0.5mol/L Nacl，10mmol/L Tris-Cl，pH8.0)中，37℃消化30分钟。再用不含RNA酶的上述溶液于37℃冲洗30分 钟，洗膜。
6.3.7 显色反应
玻片浸泡于清洗液(1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；0.3％(V/V)Tween-20)。在100ml 封闭液(试剂盒中的阻断剂按10％(W/V)加入顺丁烯二酸缓冲液(0.1mol/L顺丁烯 二酸，0.15mol/l NaCl)，使用时1∶10稀释)中温育30分钟。加20ml抗体溶液，温 育30分钟。用100ml清洗液洗两次，每次15分钟。加20ml检测液(0.1M Tris-HCl， 0.1M NaCl，pH9.5)平衡2-5分钟。在10ml新配制的显色液(10ml检测液中加 200ulNBT/BCIP)中温育，避光，勿摇动。用消毒双蒸水或TE冲洗。
结果：在鼠大脑的神经胶质细胞的胞浆中呈阳性表达，特别在脑卒中模型中呈阳 性表达，这说明该基因不仅在进化中具有保守性，而且对机体的重要脏器(肝脏、肾 脏和脑)有重要的功能作用。提示该基因可能与心脑血管细胞的炎性反应及肿瘤的分 化、增殖有关。
实例七、免疫组织化学分析
7.1 人心肌梗塞并发症室壁瘤组织
7.1.1 实验材料
人心肌梗塞并发症室壁瘤组织。
7.1.2 免疫组织化学分析
用重组正确的原核表达(ptrxfus)质粒，从上清液中提取表达融合蛋白，经10％变 性聚丙烯酰胺电泳，确定目的基因条带，Western印迹鉴定目的蛋白后，免疫动物所 获得的血清。
石蜡切片5微米，贴附于包被有多聚赖氨酸的APES玻片上，75℃烤片2小时。 二甲苯脱蜡后经梯度酒精后切片入水。3％H2O2内10分钟。蒸馏水洗三遍，放入EDTA 抗原修复液内(pH8.0)，置微波炉中烘烤(96℃-98℃)10分钟。室温冷却20-30分 钟，蒸馏水洗三遍。入1×PBS缓冲液5分钟。10％正常兔血清20分钟。加适当稀释的 一抗，4℃内孵育过夜。1×PBS洗三次后，加生物素标记的羊抗兔二抗，室温10分钟。 1×PBS洗三次，加酶联链霉亲和素三抗，室温10分钟。1×PBS洗三次，DAB显色。蒸 馏水三次，苏木素浅染胞核、脱水、封片。
结果：室壁瘤心肌高表达Fwap10576基因。
7.2 脑卒中病人和非脑卒中病人的脑组织
7.2.1 组织来源：
脑卒中病人和非脑卒中病人的脑组织。脑组织切片福尔马林浸泡7天后，脱水， 制成石蜡切片。
7.2.2 免疫组织化学分析
参照7.1.2免疫组织化学分析方法。
结果：
如图8所示。用3株Fwap10576基因单克隆抗体(McAb)为I抗的免疫组化，A、B、 C、D的I抗为Fwap10576-SE3McAb，E的I抗为Fwap10576-6H10McAb，F的I抗为 Fwap10576-6B11McAb。从图B，D，E，F中均可见到该基因在脑卒中病人的神经细胞核内 有明显的表达。
实施例八、Fwap10576基因的体外重组及蛋白表达
8.1 构建重组载体
载体pTrxFus(购自Invitrogen公司)。取20ul pTrxFus载体，10×缓冲液4.0ul， 1.0ul XhoI，1.0ul SmaI，14ul无菌水，37℃酶切16小时。纯化酶切产物。
PCR引物由上海生工生物公司合成，聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化、OD260＝5)。正向 引物：5’CGG GAC CGG GAT TAC C 3’，反向引物5’ATG TCT AGA TCA TAG AGC ACG AA 3’。
取10ul PCR纯化产物，10×缓冲液2.0ul，1.0ul XhoI，7ul无菌水，37℃酶 切16小时。纯化酶切产物。
8.1.2 连接
1.0ul pTrxFus酶切产物，3.0ul PCR酶切产物，1.0ul 10X缓冲液，1.0ul T4 连接酶，4ul无菌水，16℃连接6小时。
8.1.3 转化
取上述连接产物5ul，加入100ul GI724感受态细胞。混匀，置于冰上30分钟。 42℃60秒，冰上2分钟。加入800ul SOC培养基37℃摇菌(小于225RPM)45分钟。 取100ul涂于含Amp(氨卞青霉素)抗性的LB平板上。30℃培养16小时。挑单克隆置于 5ml含50ug Amp的LB培养基中37℃摇16小时。
8.1.4 质粒提取
挑取单克隆菌落接种5ml RM-Amp培养基(含有氨苄青霉素的丰富培养基，组分为 6g Na2HPO4(无水)，3g KH2PO4，，0.5g NaCl，1g NH4Cl，20g Casamino Acids(酸水解酪素)， 0.095g MgCl2)，30℃摇(220-250rpm)过夜。
取菌液，2,000RPM离心10分钟，弃上清。沉淀中加预冷的溶液I(25mM Tris-HCl， pH8.0，2.0mM EDTA，50mM glucose)140ul，悬浮细菌。用280ul新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)裂解细菌。再加入450ul预冷的溶液III(4.0M Potassium acatate)， 混匀。离心4,000 RPM 10分钟，12,000 RPM 10分钟。取上清，加入0.6倍体积的 异丙醇，同上离心。用100ul TE(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)和20ug/ml的 RNA酶溶解沉淀，37℃30分钟。加600ul醋酸铵/乙醇(1∶5)，-70℃放置30分钟。 离心后用75％乙醇洗涤。用TE 100ul溶解提取的质粒，测OD260/280定量。
8.1.5 挑选阳性克隆
用PCR的方法鉴定阳性克隆。
8.1.6 序列测定
对限制性内切酶切割及PCR鉴定为阳性的克隆进行测序。引物由上海生工生物公 司合成，聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化、OD260＝5。pTRXFUS正向测序引物：5’-TTC CTC GAC GCT AAC CTG-3’，pTRXFUS反向测序引物：5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT GC-3’。引物的终 浓度为5uM。
将测序鉴定为阳性的克隆(pTrxSX576)保存在15％甘油中，-20℃存放。
8.2 重组蛋白的诱导表达
接种50ul菌液(pTrxSX576)于5ml RM-Amp培养基中，30℃摇(220-250rpm) 过夜。取250ul过夜菌接种5ml IM诱导培养基(6g无水Na2HPO4，3gKH2PO4.0.5gNaGl， 1g NH4Cl，2g酸水解酪素，0.095g MgCl2)，30℃摇(220-250rpm)3小时，取出，测 量OD550约为0.5。加900ml去离子水溶解，加水使终体积为1升，高压20分钟(15psi， 121℃)，冷却到室温，加1ml 100mg/ml ampicillin，25ml 20％无菌葡萄糖，20℃-25℃调 节pH＝7.0±0.2，+4℃保存。加色氨酸(Trp)至终浓度为100ug/ml，37℃摇(220- 250rpm)4小时，加10mg/ml色氨酸(Trp)，加热500ml玻璃蒸馏水至80℃，加入5g L- 色氨酸，搅拌至完全溶解，用0.45um滤膜过滤溶液除菌，于4℃避光最多保存6个月； 取出菌液，测量OD550；4300g离心收获菌体，立即超声释放蛋白或-20℃保存。
8.3 超声释放融合蛋白
诱导表达融合蛋白，+4℃，4300g离心10分钟，弃去上清，保留沉淀。用溶液II (20mM Tris-HCl，pH8，2.5mM EDTA)重悬菌体，使其OD550为100，放置于冰上。 菌液放在冰上，3×10秒脉冲，立即放到液氮中速冻，然后迅速放到37℃水浴中速溶； 重复两次；4℃，4300g离心10分钟，上清转移到新管中，冰上保存。
8.4 聚丙烯酰氨凝胶电泳及蛋白质免疫印迹
8.4.1 聚丙烯酰氨凝胶电泳
取20ul超声释放的融合蛋白溶液加适量的蛋白载样缓冲液，沸水浴中煮沸5分 钟，5000rpm离心5分钟，取20ul上清上样.60V恒压进浓缩胶(5％)，120V恒压进15％ 分离胶；卸胶，考马斯亮兰染色1-2小时，脱色分析结果。
8.4.2 蛋白质免疫印迹
半干系统(Bio-Rad产品)转膜1小时，转移缓冲液：(参见《精编分子生物学实 验指南》)。取下硝酸纤维素膜，10ml封闭液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，pH＝7.5，3％BSA)， 室温，摇动1个小时。20mlTBST(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，pH＝7.5，0.05％ Tween-20(w/v))洗膜5分钟，室温轻轻摇动.重复一次。将膜转移到1∶20,000稀释的 一抗缓冲液中，室温，浸润1-2个小时。20mlTBST室温洗膜5分钟.重复1次；在10ml 1∶5000稀释的二抗缓冲液中室温浸润1小时；20ml TBST室温洗膜2次，每次5分钟； 20ml TBS室温洗膜2次，每次5分钟；准备新鲜的底物溶液：66ul NBT(nitro-blue tetrazolium，氮蓝四唑，Promega)+10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-Cl，100mM NaCl，5mM MgCl2，pH＝9.5)混匀，再加33ul BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl- pHospHate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸，Promega)，混匀(1小时内使用)备用；20ml碱性 磷酸酶缓冲液室温洗膜2次，每次5分钟；10ml底物溶液，室温轻轻摇动显色.10-30 分钟；终止显色：20ml高压水5分钟。
8.5 重组蛋白TRXSX576表达条件的优化
8.5.1 不同活化时间重组蛋白TRXSX576表达量的变化
TRXSX576表达菌株30℃ 220-250rpm分别活化1小时，2小时，3小时，4小时，5小 时，6小时，然后加色氨酸至终浓度为100ug/ml，37℃摇(220-250rpm)诱导4小时，聚 丙烯酰氨凝胶电泳检测重组蛋白表达量的变化，结果图5A所示。
8.5.2 不同诱导时间重组蛋白TRXSX576表达量的变化
据上选取最佳活化时间活化TRXSX576表达菌株，然后加色氨酸至终浓度为 100ug/ml，37℃ 220-250rpm诱导0小时，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时， 聚丙烯酰氨凝胶电泳检测重组蛋白TRXSX576表达量的变化。结果如图5B所示。
8.6 亲和层析纯化融合蛋白TRXSX576
释放融合蛋白：在最佳活化时间和诱导时间下，表达融合蛋白，超声释放，测 OD280，粗算蛋白浓度。
平衡树脂：取2ml Resin(加乙醇共4ml)自然沉淀，弃去乙醇；用4-8ml RB(20mM βME，β巯基乙醇)重悬，静置使其自然沉积，小心弃去缓冲液；加4-8ml RB(20mM βME)重悬，室温轻轻摇动30-60分钟，小心弃去上清；用4-8ml RB(没有βME)重悬， 静置使其自然沉积，小心弃去缓冲液；重复上述步骤。
填柱：向柱中加2ml RB；以RB重悬Resin，小心加到柱中；待Resin自然沉积，打 开控制阀使缓冲液以约1滴/7秒的速度流下。
纯化：加样：约2ml融合蛋白溶液，以2ml/12×75试管收集，每管取5ul稀释 到500ul测OD280，洗柱：8ml RB(1mMβME)，简称1mMβME，洗脱：分别以6ml 5mMβ ME，10mMβME，50mMβME，100mMβME，200mMβME，500mMβME，1000mMβME洗脱。大 多数情况下目的蛋白在10-200mMβME之间洗脱下来。
聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定：每管取20ul聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定(方法同上)。
8.7 融合蛋白的透析与浓缩
1×EK(enterokinase，肠激酶)缓冲液，+4℃，磁力搅拌透析，4小时换一次透析 液，至少换4次透析液；用PEG浓缩至1ml，4℃保存。
实施例九、高表达Fwap10576诱发细胞增殖
9.1 表达载体的构建
利用分子克隆技术并参照前述实施例的方法分别构建了pcDNA-Fwap10576的正义、 pcDNA-Fwap10576的反义核酸重组表达载体。PcDNA3.1B载体购自CLONTECH公司。
9.2 获得稳定表达的克隆株
选用CLONTECH公司的Lipfectintm试剂盒。取1ul DNA质粒和1ug脂质体，转染 人肺癌A549细胞(购自医学科学院基础所细胞中心)，转染后24小时加G418(200μg/ml) 选择培养，2周后筛选到稳定表达的细胞株。
9.3 用细胞计数和MTT染色法观察细胞的生物学效应
9.3.1 胰蛋白酶消化方法：
倒掉细胞培养液，用1XPBS洗细胞2次(0.5ml/cm2培养皿)，加入含0.125％胰蛋 白酶的1XPBS消化细胞5分钟，反复用吸管吹打，混匀。然后用血球计数板计数。
9.3.2 细胞计数：
将细胞滴入血球计数板内，放置在光学显微镜(Nikon日本)上数细胞，细胞数的计算 公式为：细胞数的计算公式为：
细胞数/毫升＝4大格细胞数/4×10,000×稀释倍数
结果：
从图9可见，pcDNA3.1-p10576正义载体刺激细胞的增生，而其反义载体则明显抑 制细胞的增生。MTT活细胞染色的结果与细胞计数相同。
本发明并不限于上述具体的实施例，实施例仅用于说明本发明的某些方面。功能 上等同的方法和物质已包括在本发明的范围内。事实上，根据本文的描述和附图，基 于本发明的各种改变对本领域的技术人员而言是显而易见的。这样的改变已包括在本 发明权利要求的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110>中国医学科学院阜外心血管病医院
<120>细胞增殖因子Fwap10576
<130>PD0202026
<150>CN01109261.0
<151>2001-02-28
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1083
<212>DNA
<213>成人主动脉eDNA文库
<220>
<221>CDS
<222>(213)..(683)
<220>
<221>polyA_signal
<222>(1044)..(1049)
<400>1
cttacccgct tcactagtcc cggcattctt cgctgttttc ctaactcgcc cgcttgacta 60
gcgccctgga acagccattt gggtcgtgga gtgcgagcac ggccggccaa tcgccgagtc 120
agagggccag gaggggctgc ggccattcgc cgcccggccc ctgctccgtg gctggttttc 180
tccgcgggcg cctcgggcgg aacctgaaga ta atg ggc agc acc tgg ggg agc 233
Met Gly Ser Thr Trp Gly Ser
1 5
cct ggc tgg gtg cgg ctc gct ctt tgc ctg acg ggc tta gtg ctc tcg 281
Pro Gly Trp Val Arg Leu Ala Leu Cys Leu Thr Gly Leu Val Leu Ser
10 15 20
ctc tac gcg ctg cac gtg aag gcg gcg cgc gcc cgg gac cgg gat tac 329
Leu Tyr Ala Leu His Val Lys Ala Ala Arg Ala Arg Asp Arg Asp Tyr
25 30 35
cgc gcg ctc tgc gac gtg ggc acc gcc atc agc tgt tcg cgc gtc ttc 377
Arg Ala Leu Cys Asp Val Gly Thr Ala Ile Ser Cys Ser Arg Val Phe
40 45 50 55
tcc tcc agg tgg ggc agg ggt ttc ggg ctg gtg gag cat gtg ctg gga 425
Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Val Glu His Val Leu Gly
60 65 70
cag gac agc atc ctc aat caa tcc aac agc ata ttc ggt tgc atc ttc 473
Gln Asp Ser Ile Leu Asn Gln Ser Asn Ser Ile Phe Gly Cys Ile Phe
75 80 85
tac aca cta cag cta ttg tta gat ggt gtc tcg cca tgt tgc cca ggc 521
Tyr Thr Leu Gln Leu Leu Leu Asp Gly Val Ser Pro Cys Cys Pro Gly
90 95 100
tgg tct caa gca atc tgt ctg cct cag cct ccc aaa gtg ctg ggg gga 569
Trp Ser Gln Ala Ile Cys Leu Pro Gln Pro Pro Lys Val Leu Gly Gly
105 110 115
tta cag gcg ttg cct gcg gac acg ctg ggc ctc tgt cct gat gct gct 617
Leu Gln Ala Leu Pro Ala Asp Thr Leu Gly Leu Cys Pro Asp Ala Ala
120 125 130 135
gag ctc cct ggt gtc tct cgc tgg ttc tgt cta cct ggc ctg gat cct 665
Glu Leu Pro Gly Val Ser Arg Trp Phe Cys Leu Pro Gly Leu Asp Pro
140 145 150
gtt ctt cgt gct cta tga tttctgcatt gtttgtatca ccacctatgc 713
Val Leu Arg Ala Leu
155
tatcaacgtg agcctgatgt ggctcagttt ccggaaggtc caagaacccc agggcaaggc 773
taagaggcac tgagccctca acccaagcca ggctgacctc atctgctttg ctttggcatg 833
tgagccttgc ctaagggggc atatctgggt ccctagaagg ccctagatgt ggggcttcta 893
gattaccccc tcctcctgcc atacccgcac atgacaatgg accaaatgtg ccacacgctc 953
gctctttttt acacccagtg cctctgactc tgtccccatg ggctggtctc caaagctctt 1013
tccattgccc agggagggaa ggttctgagc aataaagttt cttagatcaa tcaaaaaaaa 1073
aaaaaaaaaa 1083
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<211>156
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<213>成人主动脉cDNA文库
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Met Gly Ser Thr Trp Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Leu Ala Leu Cys
1 5 10 15
Leu Thr Gly Leu Val Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Val Lys Ala Ala
20 25 30
Arg Ala Arg Asp Arg Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Val Gly Thr Ala
35 40 45
Ile Ser Cys Ser Arg Val Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly
50 55 60
Leu Val Glu His Val Leu Gly Gln Asp Ser Ile Leu Asn Gln Ser Asn
65 70 75 80
Ser Ile Phe Gly Cys Ile Phe Tyr Thr Leu Gln Leu Leu Leu Asp Gly
85 90 95
Val Ser Pro Cys Cys Pro Gly Trp Ser Gln Ala Ile Cys Leu Pro Gln
100 105 110
Pro Pro Lys Val Leu Gly Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ala Asp Thr Leu
115 120 125
Gly Leu Cys Pro Asp Ala Ala Glu Leu Pro Gly Val Ser Arg Trp Phe
130 135 140
Cys Leu Pro Gly Leu Asp Pro Val Leu Arg Ala Leu
145 150 155
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