多能干细胞增殖促进剂
阅读：675发布：2020-05-11
专利汇可以提供多能干细胞增殖促进剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的课题在于将多能干细胞等多能干细胞在不损害其多能性的情况下进一步促进增殖的原材料。即，本发明提供一种多能干 细胞增殖 促进剂以及多能干细胞的培养方法。所述多能干细胞增殖促进剂的特征在于，以β－烟酰胺单核苷酸(β－NMN)或其药理学上可接受的盐、以及它们的 溶剂 化物作为有效成分；所述多能干细胞的培养方法的特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的 溶剂化物 。，下面是多能干细胞增殖促进剂专利的具体信息内容。
1.一种多能干细胞增殖促进剂，其特征在于，以β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物为有效成分。
2.如权利要求1所述的多能干细胞增殖促进剂，其以β－烟酰胺单核苷酸换算计为
0.01mM～5mM的方式添加于多能干细胞的培养基中。
3.如权利要求1或2所述的多能干细胞增殖促进剂，其用于促进多能干细胞的增殖，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及间充质干细胞中的一种以上。
4.一种多能干细胞的培养方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
5.如权利要求4所述的培养方法，其中，所述培养基的β－烟酰胺单核苷酸浓度为
0.01mM～5mM。
6.如权利要求4或5所述的培养方法，其中，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及间充质干细胞中的一种以上。
7.一种多能干细胞的增殖促进方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
多能干细胞增殖促进剂
[0001] 技术分野
[0002] 本发明涉及一种将多能干细胞在不损害其多能性的情况下进一步促进增殖的原材料及使用该原材料的多能干细胞的培养方法。
背景技术
[0004] 多能干细胞是具有自我更新能力的未分化细胞，是能够分化为各种细胞的细胞。近年来，人们正在积极地研究将多能干细胞、由多能干细胞分化诱导而成的细胞移植到患者受损的组织而实现其功能再生的再生医疗。再生医疗中，由于需要大量准备多能干细胞、其分化细胞，因此，也在积极地开发使多能干细胞高效增殖的方法。特别是多能干细胞在培养的过程中失去其多能性的情况较多，因此，寻求一种将多能干细胞在保持其多能性的状态下进行增殖的方法。
[0005] 作为多能干细胞的培养方法，例如，报告了通过将间充质干细胞在含有烟酰胺(NAM)和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中进行培养，能够使间充质干细胞高效增殖(例如参照专利文献1)。另外，也报告了NAM消除多能干细胞的多能性的缺失、重编程的障碍(例如参照非专利文献1)。此外，报告了如果将诱导性多能干细胞(iPS细胞)在NAM存在下进行培养，则NAM抑制去乙酰化酶(sirtuin)或PARP的功能，从而能够有效地制造基因表达模式与胚胎干细胞(ES细胞)非常类似的iPS细胞(例如参照专利文献2)。
[0006] 另一方面，烟酰胺单核苷酸(NMN)为辅酶NAD+的生物合成中间代谢产物。近年来，有报告称NMN具有改善衰老小鼠的胰岛素分泌能力的效果，在因高脂饮食、衰老而引起的2型糖尿病的小鼠模型中具有显著改善胰岛素敏感性、分泌的效果(例如，参照专利文献3)，具有显著提高衰老的肌肉的线粒体功能的效果等。进而，还有报告称通过给药NMN，在伴随年龄增长的肥胖、血脂浓度上升、胰岛素敏感性降低、记忆力降低以及黄斑变性等眼功能恶化等各种疾病的症状的改善、预防方面是有用的(例如，参照专利文献4)。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1：日本特表2015－507921号公报
[0010] 专利文献2：国际公开第2011/102333号
[0011] 专利文献3：美国专利第7737158号说明书
[0012] 专利文献4：国际公开第2014/146044号
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献1：Son，et al.，STEM CELLS，2013，vol.31，p.1121-1135.发明内容
[0015] 发明想要解决的课题
[0016] 本发明的目的在于提供将多能干细胞在不损害其多能性的情况下进一步促进增殖的原材料及使用该原材料的多能干细胞的培养方法。
[0017] 用于解决课题的手段
[0018] 为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现，在β－烟酰胺单核苷酸(β－NMN)的存在下，多能干细胞的增殖得到促进，并且还不会损害其多能性，由此完成了本发明。
[0019] 即，本发明提供以下的多能干细胞增殖促进剂、多能干细胞的培养方法及多能干细胞的增殖促进方法。
[0020] [1]一种多能干细胞增殖促进剂，其特征在于，以β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物为有效成分。
[0021] [2]根据上述[1]的促进剂，其以β－烟酰胺单核苷酸换算计为0.01mM～5mM的方式添加于多能干细胞的培养基中。
[0022] [3]根据上述[1]或[2]的促进剂，其用于促进多能干细胞的增殖，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及间充质干细胞中的一种以上。
[0023] [4]一种多能干细胞的培养方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
[0024] [5]根据上述[4]的培养方法，其中，所述培养基的β－烟酰胺单核苷酸浓度为0.01mM～5mM。
[0025] [6]根据上述[4]或[5]的培养方法，其中，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及间充质干细胞中的一种以上。
[0026] [7]一种多能干细胞的增殖促进方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β－烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
[0027] 发明效果
[0028] 本发明的多能干细胞增殖促进剂通过作用于诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞，能够在保持其多能性的状态下促进增殖。因此，通过使该多能干细胞增殖促进剂含有在培养基中，能够高效地制备更大量的多能干细胞。附图说明
[0029] 图1是示出实施例1中对将iPS细胞201B7株在添加有β－NMN的培养基中进行培养的孔进行WST测定并按培养基的β－NMN浓度表示吸光度值(450－595nm)的测定结果的图。
[0030] 图2是示出实施例2中对将iPS细胞201B7株在添加有β－NMN或NAM的培养基中进行培养的孔进行WST测定并按培养基的β－NMN浓度或NAM浓度表示吸光度值(450－595nm)的测定结果的图。
[0031] 图3是示出实施例3中对将iPS细胞253G1株在添加有β－NMN或NAM的培养基中进行培养的孔进行WST测定并按培养基的β－NMN浓度或NAM浓度表示吸光度值(450－595nm)的测定结果的图。
[0032] 图4是示出实施例4中对将iPS细胞201B7株在同时添加有ROCK抑制剂和β－NMN的培养基中进行培养的孔进行WST测定并按培养基的β－NMN浓度表示吸光度值(450－595nm)的测定结果的图。
[0033] 图5是示出实施例4中对将iPS细胞201B7株在同时添加ROCK抑制剂和β－NMN的培养基中进行培养的孔进行碱性磷酸酶测定试验并按培养基的β－NMN浓度表示405nm的吸光度值的测定结果的图。
[0035] 图7是示出实施例6中在含有0.25mM的β－NMN的培养基中进行培养后用抗SSEA4抗体染色后的iPS细胞201B7株的流式细胞仪的结果的图。
[0036] 图8是示出实施例6中在含有1mM的β－NMN的培养基中进行培养后用抗SSEA4抗体染色后的iPS细胞201B7株的流式细胞仪的结果的图。
[0038] 图10是示出实施例6中在含有0.25mM的β－NMN的培养基中进行培养后用抗低硫酸化硫酸角质素抗体(R10G)染色后的iPS细胞201B7株的流式细胞仪的结果的图。
[0039] 图11是示出实施例6中在含有1mM的β－NMN的培养基中进行培养后用抗低硫酸化硫酸角质素抗体(R10G)染色后的iPS细胞201B7株的流式细胞仪的结果的图。
具体实施方式
[0040] 本发明及本申请说明书中，多能干细胞是具有自我更新能力且具备多能性(能够分化为多种细胞类型的能力)的未分化细胞，优选为也能够分化为外胚层、中胚层、内胚层中的任一细胞的多能干细胞。多能干细胞可举出ES细胞、iPS细胞、间充质干细胞等。
[0041] 本发明的多能干细胞增殖促进剂(以下，有时称为“本发明的增殖促进剂”)以NMN(化学式：C11H15N2O8P)作为有效成分，在培养多能干细胞时添加在其培养基中。通过在NMN的存在下培养多能干细胞，能够使多能干细胞在保持多能性的状态下更高效地进行增殖。
[0042] 对于NMN而言，作为光学异构体，存在α、β这两种，作为本发明的增殖促进剂的有效成分的NMN为β－NMN(CAS编号：1094－61－7)。将β－NMN的结构示于以下。
[0043]
[0044] 作为β－NMN，可以通过任一方法制备。例如可以使用将通过化学合成法、酶法、发酵法等人工合成的β－NMN纯化而成的物质作为有效成分。另外，由于β－NMN是广泛存在于生物体的成分，因此，也可以使用通过从动物、植物、微生物等天然原料中提取·纯化而得到的β－NMN作为有效成分。另外，也可以使用市售的经纯化的β－NMN。
[0045] 作为合成β－NMN的化学合成法，例如可以通过使NAM与L-四乙酰核糖反应并将得到的烟酰胺单核苷进行磷酸化而制造β－NMN。另外，作为酶法，例如可以利用烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)由NAM和5’－磷酸核糖－1’－焦磷酸(PRPP)制造β－NMN。作为发酵法，例如可以利用表达NAMPT的微生物的代谢系统由NAM制造β－NMN。
[0046] 作为本发明的增殖促进剂的有效成分，也可以是β－NMN的药理学上可接受的盐。作为β－NMN的药理学上可接受的盐，可以是无机酸盐，也可以是具有胺这样的碱性部位的有机酸盐。作为构成这样的酸盐的酸，例如可举出乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。另外，作为β－NMN的药理学上可接受的盐，可以是碱盐，也可以是具有羧酸这样的酸性部位的有机盐。
作为构成这样的酸盐的碱，例如可举出：作为碱金属盐或碱土金属盐的碱的氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌，以及由氨、三甲基氨、三乙基氨、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’－二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、N－苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)－氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等碱衍生的碱。
作为构成这样的酸盐的碱，例如可举出：作为碱金属盐或碱土金属盐的碱的氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌，以及由氨、三甲基氨、三乙基氨、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’－二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、N－苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)－氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等碱衍生的碱。
[0047] 作为本发明的增殖促进剂的有效成分，也可以是游离的β－NMN或其药理学上可接受的盐的溶剂化物。作为形成该溶剂化物的溶剂，可举出水、乙醇等。
[0048] 本发明的增殖促进剂除β－NMN以外还可以含有其它有效成分。作为前述其它有效成分，例如可以从已知提高多能干细胞的存活效率、增殖效率的成分、已知具有保持多能干细胞的未分化状态的作用的成分等中适当选择而使用。作为提高多能干细胞的存活效率的成分，例如可举出Rho激酶(ROCK)抑制剂。另外，作为保持多能干细胞的未分化状态的成分，例如可举出FGF－2、TGFβ超家族。作为TGFβ超家族，可举出TGF－β1、激活素、NODAL等。与β－NMN并用的其它有效成分可以仅为一种也可以是两种以上的组合。
[0049] 在培养多能干细胞时，通过在该培养基中含有本发明的增殖促进剂，能够在保持其多能性的状态下促进多能干细胞的增殖。作为在培养基中含有本发明的增殖促进剂的量，只要是达到与在不含该增殖促进剂的培养基进行培养的情况相比足以促进多能干细胞增殖的浓度的量，就没有特别限定；可以考虑多能干细胞的种类、与培养基的其它成分的平衡等而适当调整。培养基的β－NMN浓度过低时，对多能干细胞的增殖促进效果有可能弱，另外，过量含有β－NMN时，有可能反而抑制增殖。作为培养基的本发明的增殖促进剂的含量，优选是β－NMN浓度成为0.01～5mM的量，更优选是β－NMN浓度成为0.05～2mM的量，进一步优选是β－NMN浓度成为0.1～1mM的量。通过β－NMN浓度达到上述范围，能够在保持多能性的同时充分地促进多能干细胞的增殖。应予说明，由β－NMN带来的该增殖促进效果比NAM、烟酸、烟酰胺核苷之类的其它NAM相关物质优异。
[0050] 在本发明的增殖促进剂的存在下的多能干细胞的培养除在培养基中含有本发明的增殖促进剂以外，还可以通过常规方法进行。例如，作为培养基，一般可以使用为了多能干细胞的保持或增殖而使用培养基、用于动物细胞的培养的培养基。另外，也可以使用市售的各种用于多能干细胞的培养基。本发明中，作为含有本发明的增殖促进剂而用于多能干细胞的培养的培养基，例如可举出伊格尔极限必需培养基(MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、α伊格尔极限必需培养基(αMEM)、Iscove改良杜尔贝科培养基(IMDM)、F－12培养基、F－10培养基、DMEM/F12培养基、RPMI－1640培养基、间充质细胞基础培养基(MSCBM)、E8(Essential 8)培养基、TeSR－E8培养基、mTeSR1培养基等。也可以根据需要在这些培养基中添加氨基酸、无机盐类、维生素类、抗生素等。
[0051] 这些培养基中，除本发明的增殖促进剂以外，还可以适当含有：已知提高多能干细胞的存活效率、增殖效率的成分，已知具有保持多能干细胞的未分化状态的作用的成分等。作为这些成分，可以使用上述那些物质。
[0052] 另外，培养条件可以是一般培养动物细胞的培养条件，也可以根据需要来适当改变。例如，可以在培养温度为30～40℃、CO2浓度为1～10体积％、O2浓度为0.1～25体积％条件下进行培养。
[0053] 作为通过本发明的增殖促进剂进行增殖促进的多能干细胞，优选源自哺乳类的多能干细胞，进一步优选源自人的多能干细胞，特别优选源自人的多能干细胞。另外，作为通过本发明的增殖促进剂进行增殖促进的多能干细胞，优选为ES细胞、iPS细胞或间充质干细胞，更优选为源自人的ES细胞、iPS细胞或间充质干细胞，进一步优选为源自人的ES细胞或iPS细胞。
[0054] 实施例
[0055] 接着，通过举出实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[0056] [实施例1]
[0057] 将iPS细胞在含有β－NMN的培养基中进行培养，调查β－NMN对增殖的效果。
[0058] 作为iPS细胞，使用人iPS细胞即201B7株。另外，作为iPS细胞的基本培养基，使用在作为基础培养基的DMEM/F12中含有19.4mg/L的胰岛素、10.7mg/L的转铁蛋白、100μg/L的bFGF、2μg/L的TGFβ、14μg/L的亚硒酸钠、64mg/L的抗坏血酸、543mg/L的NaHCO3的E8培养基(LTC)。
[0059] 首先，利用细胞剥离液将已在基本培养基中培养了的iPS细胞从培养容器剥离并回收。对回收的细胞进行计数，以成为1000～2000个/孔的方式接种于已用基质胶涂布过的96孔板的各孔。此时，在各孔中添加ROCK抑制剂。将该96孔板在37℃培养1天使细胞粘附后，从各孔去除含有ROCK抑制剂的培养基，更换为在基本培养基中以最终浓度成为0～2mM的方式添加β－NMN(东方酵母工业公司制)而成的培养基并培养3～4天。
[0060] 然后，通过WST(水溶性四唑鎓盐，Water soluble Tetrazolium salts)测定来测定在各孔内存活的细胞增殖能力。具体而言，在各孔中添加WST－1(Nacalai Tesque公司制)，在37℃孵育1～4小时后，使用微孔板读数仪〔BMG Labtech公司制〕测定吸光度值(450－595nm)。应予说明，“吸光度值(450－595nm)”是以595nm的吸光度值为参照值的450nm的吸光度值，具体而言，是从450nm的吸光度值减去595nm的吸光度值而得的值。
[0061] 将培养基的每个β－NMN浓度的吸光度值(450－595nm)的测定结果示于图1。与将iPS细胞在未添加β－NMN的培养基(β－NMN：0mM)中进行培养的孔相比，在以成为0.1mM以上的方式添加β－NMN的培养基中进行培养的孔的吸光度值(450－595nm)大，可知在β－NMN存在下促进iPS细胞的增殖。特别是观察到如下趋势：当β－NMN浓度为0.1～0.2mM时，该吸光度值浓度依赖性地变大；当0.2～0.6mM时，该吸光度值为相同程度；当0.8mM以上时，该吸光度值β－NMN浓度依赖性地稍微降低。
[0062] [实施例2]
[0063] 将iPS细胞在含有β－NMN或NAM的培养基中进行培养，比较β－NMN和NAM对增殖的作用。作为iPS细胞，使用201B7株。
[0064] 具体而言，使在去除含有ROCK抑制剂的培养基后添加的培养基为以最终浓度成为0、0.2或0.4mM的方式添加β－NMN而成的培养基或者以最终浓度成为0、0.2或0.4mM的方式添加NAM而成的培养基，除此以外，与实施例1同样地培养iPS细胞，进行WST测定。
[0065] 将各培养基的吸光度值(450－595nm)的测定结果示于图2。图2中，“E8+NMN”为添加各浓度的β－NMN的培养基的结果，“E8+NAM”为添加各浓度的NAM的培养基的结果。如图2所示，在添加有β－NMN的培养基中进行培养的孔和在添加有NAM的培养基中进行培养的孔，与在基本培养孔中进行培养的孔相比，该吸光度值均高，β－NMN和NAM这两者均具有iPS细胞的增殖促进效果，但培养基的最终浓度为0.2mM和0.4mM中的任一者时，在添加有β－NMN的培养基中进行培养的孔与在添加有NAM的培养基中进行培养的孔相比，该吸光度值均显著高，确认了β－NMN的增殖促进效果比NAM高。
[0066] [实施例3]
[0067] 将iPS细胞在含有β－NMN或NAM的培养基中进行培养，比较β－NMN和NAM对增殖的作用。作为iPS细胞，使用253G1株。
[0068] 具体而言，除此使用253G1株代替201B7株以外，与实施例1同样地培养iPS细胞并进行WST测定。
[0069] 将各培养基的吸光度值(450－595nm)的测定结果示于图3。图3中，“E8+NMN”为添加各浓度的β－NMN的培养基的结果，“E8+NAM”为添加各浓度的NAM的培养基的结果。0mM的图表为E8培养基中的结果。如图3所示，在添加有β－NMN的培养基中进行培养的孔与在基本培养基中进行培养的孔相比，该吸光度值高，β－NMN对253G1株也具有增殖促进效果。另一方面，在添加有NAM的培养基中进行培养的孔与在基本培养基中进行培养的孔相比，虽然吸光度值稍高，但无法确认到β－NMN这样的明显的增殖促进效果，可知基于NAM的增殖促进效果因菌株的不同而得不到充分的增殖促进效果。另外，与实施例2的结果同样地，培养基的最终浓度为0.2mM和0.4mM中的任一者时，在添加有β－NMN的培养基中进行培养的孔与在添加有NAM的培养基中进行培养的孔相比，该吸光度值均显著高，由此确认：对于253G1株而言β－NMN的增殖促进效果也比NAM高。根据这些结果，明确了β－NMN对各种iPS细胞具有比NAM显著优异的增殖促进作用。
[0070] [实施例4]
[0071] 将iPS细胞在含有β－NMN的培养基中进行培养后，调查多能性和β－NMN对增殖的效果。作为iPS细胞，使用201B7株。多能性以未分化性的标记物即碱性磷酸酶的酶活性为指标进行调查。
[0072] ＜对增殖的效果＞
[0073] 利用细胞剥离液将已在实施例1中使用的基本培养基中进行了培养的iPS细胞从培养容器剥离并回收。对回收的细胞进行计数，以成为1000～2000个/孔的方式接种于已用基质胶涂布过的96孔板的各孔。此时，在各孔中添加ROCK抑制剂和最终浓度为0～1mM的β－NMN。将该96孔板在37℃培养1天使细胞粘附后，从各孔去除含有ROCK抑制剂的培养基，更换为在基本培养基中以最终浓度成为0～1mM的方式添加β－NMN而成的培养基并培养3～4天。
[0074] 然后，与实施例1同样地进行WST测定。将在同时添加有ROCK抑制剂和β－NMN的培养基中进行培养的孔的各培养基的吸光度值(450－595nm)的测定结果示于图4。如图4所示，不论β－NMN的添加时期，均β－NMN浓度依赖性地得到iPS细胞的增殖促进效果。
[0075] ＜碱性磷酸酶测定试验＞
[0076] 首先，利用细胞剥离液将已在实施例1中使用的基本培养基中培养了的iPS细胞从培养容器剥离并回收。对回收的细胞进行计数，以成为2000个/孔的方式接种于已用基质胶涂布过的96孔板的各孔。此时，在各孔中添加ROCK抑制剂和最终浓度为0～1mM的β－NMN。将该96孔板在37℃培养1天使细胞粘附后，从各孔去除含有ROCK抑制剂的培养基，更换为在基本培养基中以最终浓度成为0～1mM的方式添加β－NMN的培养基并培养3～4天。在此期间，每天进行培养基更换。
[0077] 接着，去除各孔的培养基后，添加乙醇·丙酮固定液，将各孔内的细胞固定。使孔干燥后，添加含有作为碱性磷酸酶测定试剂的对硝基苯基磷酸(p-Nitrophenol tryphosphate acid)的碳酸氢盐缓冲液(Bicarbonate buffer)，在37℃孵育30分钟后，利用微孔板读数仪测定405nm的吸光度。
[0078] 将在同时添加有ROCK抑制剂和β－NMN的培养基中进行培养的孔的各培养基的405nm的吸光度值的测定结果示于图5。如图5所示，不论β－NMN的添加时期，在添加有β－NMN的培养基中进行培养的孔与在未添加β－NMN的培养基中进行培养的孔相比，405nm的吸光度值高，确认了能够在保持未分化性的状态下使iPS细胞增殖。
[0079] [实施例5]
[0080] 将人间充质干细胞(人MSC)在含有β－NMN的培养基中进行培养，调查β-NMN对增殖的效果。
[0081] 作为人MSC，使用Lonza公司制的细胞。另外，作为人MSC的基本培养基，使用Lonza公司制的专用保持培养基。
[0082] 将人MSC以2×103个/孔的方式接种于96孔板(Nunc公司制)(n＝3～4)。将该96孔板在37℃、CO2恒温箱内进行培养使细胞粘附后，以最终浓度成为1.0、0.1、0.01或0.001mM的方式添加β-NMN(东方酵母工业公司制)，进一步在37℃、CO2恒温箱内培养72小时。
[0083] 然后，通过WST测定来测定在各孔内存活的细胞增殖能力。具体而言，在各孔中添加活细胞数测定试剂SF(Nacalai Tesque公司制)，在37℃孵育1～4小时后，使用微孔板读数仪(BMG Labtech公司制)测定吸光度值(450-620nm)。应予说明，“吸光度值(450-620nm)”是以620nm的吸光度值为参照值的450nm的吸光度值，具体而言，是从450nm的吸光度值减去620nm的吸光度值而得的值。
[0084] 将培养基的每个β-NMN浓度的吸光度值(450-620nm)的测定结果示于表1。与iPS细胞同样地，对于人MSC，该吸光度值也因添加β-NMN而变高，促进了细胞增殖。
[0085] 表1
[0086]β-NMN浓度[mM] 吸光度值(450-620nm)
0(无添加) 0.569±0.0126
0.001 0.573±0.0312
0.01 0.604±0.0587
0.1 0.634±0.0411
1 0.615±0.0340
0(无添加) 0.569±0.0126
0.001 0.573±0.0312
0.01 0.604±0.0587
0.1 0.634±0.0411
1 0.615±0.0340
[0087] [实施例6]
[0088] 对在β-NMN存在下保持并增殖的iPS细胞的多能性进行确认。作为iPS细胞，使用201B7株。
[0089] 具体而言，将iPS细胞以成为1.5×104个/皿的方式播种于已用基质胶(康宁公司)涂布了的35mm皿。培养基使用在iPS细胞的基本培养基(E8培养基)中以最终浓度成为0、0.25或1mM的方式添加β-NMN而成的培养基。其中，在接种时，进一步使用以最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而成的培养基来抑制Rho依赖性细胞凋亡。每天实时培养基更换，在第5～6天进行传代。将在添加有β－NMN的培养基中培养5代以上的iPS细胞用未分化标记物即SSEA4及针对低硫酸化硫酸角质素的抗体分别进行染色，利用流式细胞仪对表达各未分化标记物的细胞进行分析。
[0090] 图6～8分别是示出以0、0.25及1mM的β－NMN浓度进行培养后，用抗SSEA4抗体染色后的iPS细胞的流式细胞仪的结果的图。图9～11分别是示出用0、0.25及1mM的β－NMN浓度进行培养后，用抗低硫酸化硫酸角质素抗体(R10G)染色后的iPS细胞的流式细胞仪的结果的图。在0.25mM或1mM的β－NMN存在下进行培养的iPS细胞与在β－NMN非存在下(β－NMN浓度0mM)进行培养的iPS细胞同样地保持了SSEA4及低硫酸化硫酸角质素的表达。根据这些结果，确认了通过将iPS细胞在β－NMN存在下进行培养，能够在保持多能性的状态下促进细胞增殖。
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