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抑制肝星状细胞增殖的方法

阅读：265发布：2020-05-13

专利汇可以提供抑制肝星状细胞增殖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了抑制肝星状细胞增殖的方法，包括直接下调肝星状细胞中连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性以治疗肝纤维化或相关疾病。本方法主要涉及用试剂如针对连接蛋白43转录物的Snai1、siRNA、反义RNA和DNA酶下调连接蛋白43。因此，引起活化肝星状细胞增殖下调。，下面是抑制肝星状细胞增殖的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抑制肝星状细胞增殖的方法，包括：
直接下调肝星状细胞中连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝星状细胞是体外的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝星状细胞是体内的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述肝星状细胞是受肝纤维化或肝纤维化相关疾病影响的肝星状细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述肝星状细胞是活化肝星状细胞。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述下调包括递送Snai1或编码Snai1的核酸分子给肝星状细胞。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述下调包括递送针对Cx43转录物的siRNA或针对Cx43转录物的siRNA编码核酸分子给肝星状细胞。
8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述下调包括递送针对Cx43转录物的反义RNA或针对Cx43转录物的反义RNA编码核酸分子给肝星状细胞。
9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述下调包括递送针对Cx43转录物的DNA酶或针对Cx43转录物的DNA酶的编码核酸分子给肝星状细胞。
10.下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码下调连接蛋白43肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子在抑制肝星状细胞增殖中的应用。
11.下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码下调连接蛋白43肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子在生产抑制肝星状细胞增殖药物中的应用。
12.下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码下调连接蛋白43肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子在治疗对象的肝纤维化或肝纤维化相关疾病中的应用。
13.下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码下调连接蛋白43肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子在生产治疗对象的肝纤维化或肝纤维化相关疾病药物中的应用。
14.用于抑制肝星状细胞增殖的下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码下调连接蛋白43肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子。
15.用于治疗对象的肝纤维化或肝纤维化相关疾病的下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码下调连接蛋白43肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子。

说明书全文

抑制肝星状细胞增殖的方法

[0001] 相关申请交叉参考

[0002] 本申请要求2009年1月16日提交的美国临时专利申请第61/193,998号的优先权和权益，其内容通过引用纳入本文。发明领域

[0003] 本发明涉及抑制肝星状细胞增殖的方法。

[0004] 发明背景

[0005] 肝星状细胞(HSC)通过促进胞外基质(ECM)蛋白的积累而在肝损伤后的修复过程中起重要作用。基本上，HSC被激活成增殖性的收缩态肌成纤维细胞样表型。这一激活过程由涉及大量细胞因子的旁分泌和自分泌信号转导共同启动和维持(Gressner等，2007)。旁分泌刺激取决于肝中多种不同细胞类型，例如肝细胞、内皮细胞、血小板和库普弗细胞。这些细胞分泌不同细胞因子，如TGF-β1、PDGF、bFGF和EGF(Friedman，2008)。

[0006] HSC据信在多种重要临床症状的发病中起作用，例如，肝纤维化、肝硬化、肝门高血压和肝癌(Geerts(2004)，J.Hepatol.40(2)：331)。因此，HSC也已成为抗纤维化治疗开发的靶标(Bataller等，(2001)，Semin Liver Dis.21(3)：437；Bataller等，(2005)，J.Clin Invest.115(2)：209；Friedman(2003)，J.Hepatol.38 Suppl 1：S38)。

[0007] HSC激活是纤维发生中的主导事件。激活过程中，静息的维生素A贮存细胞转化成增殖性、纤维发生、促炎性收缩态“肌成纤维细胞”(Friedman(2003)，J.Hepatol.38 Suppl 1：S38；Bataller等，(2005)，J.Clin Invest.115(2)：209；Cassiman等，(2002)，J.Hepatol.36(2)：200)。HSC激活连续推进，涉及细胞功能的渐变。在体内，激活的HSC迁移并积累到组织修复位点，分泌大量ECM成分并调控ECM降解(Cassiman等，(2002)，J.Hepatol.36(2)：200)。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明的一个方面提供了抑制肝星状细胞增殖的方法，包括直接下调肝星状细胞中连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性。

[0010] 所述肝星状细胞可以是体外或体内的，可以受到肝纤维化或肝纤维化相关疾病影响。所述肝星状细胞可以是激活的肝星状细胞。

[0011] 下调可以包括递送下列物质之一到肝星状细胞内：Snai1、编码Snai1的核酸分子、针对Cx43转录物的siRNA、编码针对Cx43转录物的siRNA的核酸分子、针对Cx43转录物的反义RNA、编码针对Cx43转录物的反义RNA的核酸分子、针对Cx43转录物的DNA酶或者编码针对Cx43转录物的DNA酶的核酸分子。

[0012] 本发明的另一方面提供了可下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码可下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子在抑制肝星状细胞增殖中的应用，包括在生产抑制肝星状细胞增殖药物中的应用。

[0013] 本发明的另一方面提供了可下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码可下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子在治疗对象的肝纤维化或肝纤维化相关疾病中的应用，包括在生产治疗对象的肝纤维化或肝纤维化相关疾病药物中的应用。

[0014] 本发明的另一方面提供了可下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂或编码可下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性的试剂的核酸分子用于抑制肝星状细胞增殖，或治疗对象的肝纤维化或肝纤维化相关疾病。

[0015] 所述试剂可包含Snai1、针对Cx43转录物的siRNA、针对Cx43转录物的反义RNA或针对Cx43转录物的DNA酶。

[0016] 本领域技术人员根据本发明下面特定实施方式的描述以及附图将会明白本发明的其它方面和特征。

[0017] 附图简要说明

[0018] 下列附图仅以举例方式说明了本发明的实施方式：

[0019] 图1.不同浓度hTGF-β1对Cx43mRNA和蛋白质表达的影响。将HSC-2和10天体外激活原代HSC(pHSC)分别用1和10ng/ml hTGF-β1处理10和24小时以用于mRNA和蛋白质分析。(A)通过定量实时PCR获得Cx43的mRNA表达，所述数据分析为相对于对照的* **倍数变化。数据表示3个独立实验的均值±SD(P＜0.05，P＜0.005)。(B)在Western印迹中用10微克总蛋白进行Cx43分析。显示了β-肌动蛋白表达作为加样对照。显示了每个细胞来源的代表性印迹。(C)采用ImageJ评估条带强度并根据β-肌动蛋白进行标准* **
化。数据表示2-3个独立实验的均值±SD(P＜0.05，P＜0.005)。

[0020] 图2.hTGF-β1提高了HSC-2中的Cx43磷酸化。(A)用10ng/mlhTGF-β1处理6小时后，收集细胞获取总细胞裂解物。在Western印迹中分别用10和40微克总蛋白进行Cx43和pCx43分析。显示了3个独立实验之一的代表性印迹。采用ImageJ 软件评估条带强度。**
将pCx43的表达根据Cx43进行标准化。数据表示3个独立实验的均值±SD( P＜0.005)。
(B)HSC-2细胞用5μM PKC抑制剂(BIM I)处理30分钟后进行10ng/mlhTGF-β1处理，或只用BIM I处理。在Western印迹中用10微克总蛋白进行pCx43分析。显示了2个独立实验之一的代表性印迹图。采用ImageJ软件评估条带强度。(C)盖玻片上的HSC-2细胞用Cx43和pCx43 S368抗体染色进行免疫荧光分析。Cx43主要位于膜中(顶部)，而pCx43 S368显示一些膜染色而大部分为胞质染色(底部右侧)。底部左侧显示细胞仅用二抗染色的图像(对照)。

[0021] 图3.HSC-2中间隙连接细胞间通信的FRAP分析。细胞在不含酚红的培养基中用5，6-羧基二乙酸荧光素孵育30分钟。冲洗后，在室温下分析细胞。左侧：漂白前的靶细胞图像(箭头)。中间：漂白后的靶细胞图像。右侧：荧光恢复15分钟后的靶细胞图像。(A)在孤立的细胞中未观察到荧光的恢复。(B)检查了接触细胞。由于从邻近细胞流入染料引起靶细胞的荧光恢复。(C)代表性实验曲线描述了接触细胞在漂白后荧光逐渐增强。数据拟合到恢复功能以计算恢复时间常数(τ)。(D)细胞单独用10ng/mlhTGF-β1、5μM BIM I和10ng/ml hTGF-β1或40μM甘珀酸处理6小时，然后进行FRAP分析。由k＝1/τ计*
算转移常数(k)，并通过除以与靶细胞接触的细胞数量(N)标准化。数据表示均值±SD(P**
＜0.05，P＜0.005)。

[0022] 图4.hTGF-β1处理或转染Snai1 siRNA后的Cx43和Snai1转录物与蛋白水平分析。通过定量实时PCR获得Cx43和Snai1的mRNA表达，并分析为相对于对照的倍数变化。通过Western印迹测定蛋白表达。显示了3个独立实验之一的代表性印迹。数字表示采用ImageJ软件评估的根据β-肌动蛋白标准化的条带强度。(A)HSC-2和10天体外激活原代HSC(pHSC)用1和10ng/ml hTGF-β1处理10小时。数据表示3个独立实验的均值* **±SD(P＜0.05，P＜0.005)。(B)HSC-2细胞用Snai1 siRNAs 1或3转染24小时。在
mRNA和蛋白水平，都有Snai1降低和相关的Cx43升高。mRNA数据表示3个独立实验的均*
值±SD(P＜0.005)。(C)HSC-2细胞用10ng/mlhTGF-β1处理。在2、6和10小时后收集* **
细胞作mRNA研究。mRNA数据表示3个独立实验的均值±SD(与0小时相比 P＜0.05，P＜0.005，ANOVA)。(D)HSC-2细胞用10ng/ml hTGF-β1处理。在10、24和30小时后收集细胞用于Snai1和Cx43的Western印迹分析。显示了2个实验之一的代表性印迹。数字表示了采用ImageJ软件评估的根据β-肌动蛋白标准化的条带强度。

[0023] 图5.Snai1与大鼠Cx43启动子中潜在Snai1识别序列(CAGGTG)的结合。(A)使用12天体外激活HSC的5μg核提取物进行EMSA。泳道1：观察到Snai1与寡核苷酸探针结合后的较高分子量条带。泳道2：在采用200倍过量未标记寡核苷酸的竞争反应中，未观察到条带迁移。泳道3：在反应中没有核提取物时未观察到迁移。泳道4：突变寡核苷酸探针不能结合核提取物中的Snai1。(B)使用经10ng/ml hTGF-β1处理2小时或经Snai1 siRNA处理24小时的HSC-2的5μg核提取物进行EMSA。经hTGF-β1处理的HSC-2与未处理HSC-2相比，Snai1-寡核苷酸复合物所对应条带的强度增加。另一方面，转染了Snai1 siRNA的细胞与模拟转染细胞相比，凝胶迁移条带的强度减弱。用TATA结合蛋白(TBP)的表达作为加样对照。

[0024] 图6.通过细胞数和增殖标记PCNA表达评估表明hTGF-β1降低HSC-2细胞增殖。细胞在分析前用10ng/ml hTGF-β1处理48小时。(A)细胞用胰蛋白酶消化并如材料和方*
法所述计数。数据表示3个独立实验的均值±SD(P＜0.05)。(B)在Western印迹中用
10微克总蛋白进行Cx43和PCNA分析。显示了3个独立实验之一的代表性印迹。(C)采用ImageJ评估条带强度并根据加样对照β-肌动蛋白进行标准化。数据表示3个独立实验的* **
均值±SD(P＜0.05，P＜0.005)。

[0025] 图7.通过细胞数和增殖标记PCNA表达评估表明转染Cx43 siRNA降低HSC-2细胞增殖。在分析前，用两种Cx43 siRNA单独转染细胞48小时。(A)通过定量PCR分析Cx43mRNA表达，表示为相对模拟转染细胞的倍数变化。(B)细胞用胰蛋白酶消化并如材料*和方法所述计数。(A)和(B)的所有数据表示3个独立实验的均值±SD(P＜0.005)。(C)在Western印迹中分别用10和1微克总蛋白进行Cx43和PCNA分析。显示了代表性的印迹。
*
(D)图是Western印迹的密度计量分析。数据表示3个独立实验的均值±SD(P＜0.05，**
P＜0.005)。

[0026] 图8.Snai1 siRNA对TGF-β1依赖性细胞增殖调节的影响。用Snai1siRNA 1或3独立转染细胞，在细胞计数和PCNA免疫印迹分析前48小时加入10ng/ml hTGF-β1。(A)使用10微克总蛋白进行PCNA表达研究。β-肌动蛋白作为加样对照。显示了2个实验的代表性印迹图。数字表示了采用ImageJ软件评估的根据β-肌动蛋白标准化的条带强度。
*
(B)细胞用胰蛋白酶消化并如材料和方法所述计数。数据表示3个独立实验的均值±SD(P＜0.005)。

[0027] 发明详述

[0028] 本发明涉及发现连接蛋白43(Cx43)影响肝星状细胞的增殖速率以及细胞内Cx43水平或活性下调抑制HSC的增殖。

[0029] 发明人发现TGF-β1通过转录抑制蛋白Snai1影响HSC中Cx43的下调。TGF-β1是最为深入研究的信号转导分子之一，其对HSC有多种效应，包括调节胶原代谢、收缩和增殖(Hellerbrand等，1999；Kato等，2004；Kharbanda等，2004；Saile等，1999；Verrecchia和Mauviel，2007)。TGF-β1在肝纤维化期间上调，并引起HSC激活(Hellerbrand等，1999；Kanzler等，1999)。Saile等和Shen等的研究表明，TGF-β1通过使细胞停止在G1期并同时抑制凋亡而降低HSC的增殖(Saile等，1999；Shen等，2003)。尽管TGF-β1是促纤维产生的细胞因子，在非受控HSC激活的情况下具有引起ECM蛋白积累的“不需要”效果，但它在抑制HSC增殖方面可具有积极的一面。

[0030] 然而，由于TGF-β1有不同的效果包括促纤维效果，为了开发直接抑制增殖而不通过TGF-β1的方法，发明人对HSC中TGF-β1的下游靶标进行了鉴定。本方法利用TGF-β1对HSC的下游抗增殖效果，无需给予TGF-β1，从而避免了TGF-β1可能引起的任何促纤维化效果。连接蛋白43鉴别为HSC增殖的调控子提供了抑制HSC生长的方便方法，特别是与肝纤维化和肝纤维化相关疾病有关的HSC生长。

[0031] 连接蛋白43是HSC中表达的间隙连接蛋白。间隙连接是相邻细胞间形成的微观2+ +
通道，允许通过交换小分子和离子(循环核苷酸、肌醇磷酸酯、Ca 、K)进行细胞间通信。每个间隙连接通道由相邻细胞间的两个半通道(连接子)形成。连接子本身由称为连接蛋白的蛋白亚基构成(Goodenough等，1996)，目前已知道超过20种不同的连接蛋白(Eyre等，
2006)。在肝中，肝细胞表达连接蛋白26和32(Cx26、Cx32)，而非实质细胞(内皮细胞、星状细胞、椭圆形细胞、库普弗细胞)表达连接蛋白43(Cx43)(Gonzalez等，2002)。

[0032] 细胞间通信是细胞用于有效调节协同应答的重要工具。HSC通过由Cx43组成的功能性间隙连接彼此通信。发明人发现，外源人TGF-β1(hTGF-β1)，一种促纤维化刺激物，在HSC细胞系和原代HSC中降低Cx43的mRNA和蛋白水平。此外，hTGF-β1提高了Cx43在丝氨酸368的磷酸化。如间隙-FRAP分析所示，这些效果导致HSC之间间隙连接细胞间通信降低。还观察到来自HSC核提取物的锌指转录因子Snai1与Cx43启动子中Snai1共有序列的结合。在相同背景下，Snai1 siRNA转染导致Cx43上调表明TGF-β1可通过Snai1调节Cx43。通过siRNA转染敲减Cx43导致HSC增殖减慢。这些发现说明在HSC中新鉴定的TGF-β1的下游效应，即通过Snai1信号转导影响Cx43的表达水平和磷酸化状态从而调节细胞间通信，本方法中探索了该效应而避免使用TGF-β1本身。

[0033] 所观察到的TGF-β1在HSC中对Cx43的效应可能与TGF-β1在其它各种细胞类型中对Cx43的效应不同。例如，Pimentel等的研究显示，外源TGF-β1在心肌细胞中上调Cx43表达(Pimentel等，2002)。Wyatt等证明了TGF-β1本身对Cx43表达没有影响，但改变了成骨样细胞中的Cx43磷酸化状态(Wyatt等，2001)，另一出版物(Neuhaus等，2008)显示TGF-β1在尿平滑肌细胞中下调Cx43。这些不同细胞类型中的不同应答支持了细胞特异性应答不同的观点，以及TGF-β1对多种细胞类型发挥多效性作用的想法。

[0034] 因此，提供了抑制肝星状细胞增殖的方法。所述方法包括直接下调连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性。下调可以包括将下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸递送到HSC内。

[0035] 本文所用的连接蛋白43是指需要抑制增殖的肝星状细胞表达的天然连接蛋白43，或可包括由递送到细胞内的载体编码的连接蛋白43或者是递送给细胞的蛋白质。由载体或作为蛋白质递送给细胞的连接蛋白43可与所述细胞表达的连接蛋白43相同，或者它可以是来自另一物种的同源物。

[0036] 所述Cx43可以是人Cx43，例如包括以下序列、基本由其组成或者由其组成：[SEQ ID NO：1]：

[0037] MGDWSALGKLLDKVQAYSTAGGKVWLSVLFIFRILLLGTAVESAWGDE

[0038] QSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVRFWVLQIIFVSVPTLLYLAHVFY

[0039] VMRKEEKLNKKEEELKVAQTDGVNVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGKVK

[0040] MRGGLLRTYIISILFKSIFEVAFLLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVD

[0041] CFLSRPTEKTIFIIFMLVVSLVSLALNIIELFYVFFKGVKDRVKGKSDPYHA

[0042] TSGALSPAKDCGSQKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRNNSSC

[0043] RNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFPDDNQNSKK

[0044] LAAGHELQPLAIVDQRPSSRASSRASSRPRPDDLEI

[0045] 或者，所述Cx43可以是大鼠Cx43，例如包括以下序列、基本由其组成或者由其组成：[SEQ ID NO：2]：

[0046] MGDWSALGKLLDKVQAYSTAGGKVWLSVLFIFRILLLGTAVESAWGDE

[0047] QSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVRFWVLQIIFVSVPTLLYLAHVFY

[0048] VMRKEEKLNKKEEELKVAQTDGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGKVK

[0049] MRGGLLRTYIISILFKSVFEVAFLLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVD

[0050] CFLSRPTEKTIFIIFMLVVSLVSLALNIIELFYVFFKGVKDRVKGRSDPYHA

[0051] TTGPLSPSKDCGSPKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRNNSSCR

[0052] NYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFPDDNQNAKK

[0053] VAAGHELQPLAIVDQRPSSRASSRASSRPRPDDLEI

[0054] 本文所用的“基本由……组成”或“基本组成为”是指在所述蛋白质序列的一端或两端包括1个、2个、3个、5个、10个或更多氨基酸的蛋白质序列，或者是在所述核酸序列的一端或两端包括1个、2个、3个、5个、10个或更多核苷酸的核酸分子，但补充的氨基酸或核苷酸不对所述蛋白质或核酸的活性有实质性影响。

[0055] 活性Cx43是经翻译、折叠、翻译后修饰并在细胞内定位的Cx43，其具有Cx43的生物学功能或活性，包括Cx43的HSC增殖活性。在Cx43蛋白未经或未适当翻译、折叠、翻译后修饰或在细胞内定位的任何情况下，即使所述基因被转录，可能出现增殖阻断。活性连接蛋白43是指能上调其表达所在的HSC增殖的连接蛋白43，包括未被抑制性磷酸化的连接蛋白43，例如在Ser368或在物种同源物的类似位置未被磷酸化的连接蛋白43。应认识到，抑制性磷酸化是指丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸残基上的磷酸化，其导致蛋白质与该位置未被磷酸化的蛋白质相比活性下调。活性Cx43还可具有组装入连接子并在其中发挥作用的能力，包括当连接子组装到细胞间间隙连接中时。

[0056] 因此，提及连接蛋白43的肝星状细胞增殖活性是指活性连接蛋白43抑制肝星状细胞增殖的效应，这是细胞内表达连接蛋白43并维持活性状态(即非抑制的)连接蛋白43表达的结果。

[0057] 在上下文允许的情况下，除非另有说明，本文所用术语细胞(包括在HSC的情况下)是指并包括单个细胞、多个细胞或细胞群体。类似地，在上下文允许的情况下，除非另有说明，提及细胞也包括提及单个细胞。

[0058] 肝星状细胞是任何肝星状细胞，包括静息或活化的HSC，并包括肝纤维化或肝纤维化相关疾病中涉及的HSC。所述HSC可以是体外HSC，包括原代或永生化的，和从对象移植出来的离体HSC，或者可以是在体内情况下包括人对象的内源性HSC。所述HSC可以是转基因HSC，包括在体内情况下例如包括转基因HSC的动物模型中，或者是在体外情况下。

[0059] 所述HSC可以是需要抑制增殖或分裂的任何HSC，包括肝纤维化或肝纤维化相关疾病中涉及的激活HSC，所述疾病包括其中HSC增殖上调的疾病。本文所用的细胞增殖是指DNA复制、生长和分裂的过程，该过程引起细胞总数的增加。例如通过细胞计数，包括与增殖未受抑制的HSC群体比较，或者通过检测增殖特异性细胞标记如增殖特异性标记PCNA，可以容易地测定增殖或增殖抑制。

[0060] 抑制增殖或者细胞增殖的抑制包括使细胞不能复制DNA、生长或分裂，或不能适当复制DNA、生长或分裂，或者降低或阻滞DNA复制、细胞生长或分裂，加之通过细胞凋亡或其它细胞死亡机制引发细胞死亡。抑制可以在体外或体内进行。

[0061] Cx43的HSC增殖活性下调是指破坏、打断、降低、限制、阻断或预防Cx43促进或上调增殖、复制或细胞周期进展从而导致抑制增殖的任何机制。下调包括Cx43的物理改变，例如通过翻译后修饰，包括抑制性磷酸化，或者失去或缺乏必要的翻译后修饰。下调还包括遗传修饰，包括显著降低或阻断Cx43的表达，包括提高Snai1表达或通过阻断Cx43的转录或翻译。显著降低是指Cx43的表达水平是HSC增殖活性未被下调的细胞中应产生Cx43表达水平的，例如，约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％。所述遗传修饰包括Cx43编码核酸的修饰，例如，部分或全部的开放阅读框被去除、替换或打断，使得基因产品显著减少或没有、没有稳定的基因产品、或没有功能性基因产品得以表达。所述遗传修饰还包括Cx43编码核酸的修饰，使得部分或全部Cx43基因调控区被去除、替换、打断或抑制，导致Cx43编码基因表达的蛋白质显著减少或没有。所述遗传修饰进一步包括修饰所述细胞以转录与Cx43基因转录的mRNA分子至少一个片段互补的反义RNA转录物，导致Cx43转录物没有翻译或翻译降低。所述遗传修饰进一步包括修饰细胞以转录或表达小干扰RNA(siRNA)分子，该分子靶向Cx43基因转录物，导致Cx43转录物没有翻译或翻译降低。

[0062] 直接下调是指通过直接作用而不是通过其它效应物影响Cx43的水平或Cx43的活性。即，直接下调Cx43的HSC增殖活性的分子可与Cx43直接相互作用，或与Cx43的编码核酸如Cx43基因的上游调控区或Cx43转录物直接相互作用。因此，细胞接触TGF-β1不构成直接下调，因为TGF-β1通过激活信号级联途径发挥其对Cx43的HSC增殖活性的影响，其本身并不直接与Cx43基因的调控区、Cx43转录物或Cx43本身相互作用。

[0063] Cx43的HSC增殖活性可以通过下调Cx43的HSC增殖活性的试剂来下调，意味着所述试剂一旦递送入细胞就能下调所述活性。下调可包括递送所述试剂到需要抑制增殖的HSC内，包括使HSC与所述试剂接触使所述试剂被所述细胞摄取或进入所述细胞。

[0064] 所述试剂能递送入细胞内，例如，通过主动或被动转运进入细胞，或者通过扩散进入细胞。例如，若所述试剂是小分子，它可在细胞膜上溶解，并因而能渗透细胞。所述试剂也可经过修饰以包括促进其运输进入细胞的转运标记。为了指导所述试剂被特定靶细胞摄取，可以使用特异性传输标记。例如，所述试剂可修饰成包括半乳糖残基以提高肝细胞对所述试剂的摄取，如US 6,844,319中所述，其全文通过引用纳入本文。或者，所述试剂可以包含在生物材料中，该材料提高或引起细胞对所述试剂的摄取，例如通过将所述试剂包封在胶束或脂质体制品中。已知胶束和脂质体递送肽和蛋白质给细胞。或者，可以采用递送核酸分子给细胞的技术，包括转染技术或转导技术，其中所述核酸是病毒载体，或者递送裸露DNA给细胞。

[0065] 下调Cx43的HSC增殖活性的试剂可以是Cx43HSC增殖活性的抑制剂，例如抑制、干扰、与之竞争或打断Cx43HSC增殖活性的化合物，包括引起、刺激或增强Cx43的抑制性丝氨酸磷酸化的分子。

[0066] 所述试剂可以是小分子、肽、蛋白质、抗体或其功能性片段、或在Ser368或类似氨基酸上抑制性磷酸化Cx43的蛋白激酶，例如蛋白激酶C。

[0067] 或者，所述试剂可以是抑制或干扰Cx43编码核酸转录的分子，例如转录抑制蛋白包括转录因子Snai1。所述试剂可以是抑制或干扰编码Cx43的RNA转录物翻译的分子，例如干扰编码Cx43的RNA转录物翻译的DNA酶或siRNA或者针对Cx43转录物的反义RNA分子。

[0068] 或者，下调可包括递送编码所述试剂的核酸分子到要抑制增殖的HSC内，包括使HSC与所述核酸分子接触从而所述核酸分子被所述细胞摄取或进入所述细胞。一旦进入HSC，所述核酸分子将能表达所述试剂，因此应包含必需的调节组件影响以实现所述试剂在所述HSC内的表达。

[0069] 因此，所述核酸分子可以编码Cx43的抑制剂，例如编码抑制性磷酸化Cx43的蛋白激酶，或者抑制Cx43编码基因转录的转录抑制蛋白。所述核酸分子可编码能够抑制或干扰编码Cx43的RNA转录物翻译的分子，例如DNA酶，针对编码Cx43蛋白的转录物的反义RNA或siRNA分子。

[0070] 如上所述，应当了解编码Cx43转录、翻译或Cx43蛋白的抑制剂的任何核酸分子将包含实现表达所需的任何必要调节元件，该表达包括所述抑制剂在所述要表达所述抑制剂并抑制增殖的HSC中的转录。已知用于产生包含特定编码序列的核酸分子的分子生物学和克隆技术，并且可以采用常规实验方法方便地产生所述核酸分子。

[0071] 例如，可以递送Snai1或编码Snai1的核酸分子给HSC。如下文实施例中所示，Snai1是锌指转录因子，已经证实与Cx43编码区上游启动子区域内的Snai1共有序列结合，并且显示下调Cx43基因的转录。

[0072] Snai1可包含以下氨基酸序列、基本由其组成或由其组成[SEQ ID NO：3]：

[0073] MPRSFLVRKPSDPNRKPNYSELQDSNPEFTFQQPYDQAHLLAAIPPPEILN

[0074] PTASLPMLIWDSVLAPQAQPIAWASLRLQESPRVAELTSLSDEDSGKGSQ

[0075] PPSPPSPAPSSFSSTSVSSLEAEAYAAFPGLGQVPKQLAQLSEAKDLQARK

[0076] AFNCKYCNKEYLSLGALKMHIRSHTLPCVCGTCGKAFSRPWLLQGHVRT

[0077] HTGEKPFSCPHCSRAFADRSNLRAHLQTHSDVKKYQCQACARTFSRMSL

[0078] LHKHQESGCSGCPR

[0079] 或者，Snai1可包含以下氨基酸序列、基本由其组成或由其组成[SEQ IDNO：4]：

[0080] MPRSFLVRKPSDPRRKPNYSELQDACVEFTFQQPYDQAHLLAAIPPPEVL

[0081] NPAASLPTLIWDSLLVPQVQPVAWATLPLRESPRAAELTSLSDEDSGKSS

[0082] QPPSPPSPAPSSFSSTSASSLEAEAFIAFPGLGQLPKQLARLSVAKDPQSRK

[0083] AFNCKYCNKEYLSLGALKMHIRSHTLPCVCTTCGKAFSRPWLLQGHVRT

[0084] HTGEKPFSCSHCNRAFADRSNLRAHLQTHSDVKRYQCQACARTFSRMSL

[0085] LHKHQESGCSGGPR

[0086] 可以采用向细胞内递送蛋白质或小分子的标准方法，包括采用胶束或脂质体包埋技术实现利用Snai1、其它蛋白试剂、或小分子抑制剂的下调。

[0087] 可以向HSC内递送靶向Cx43编码基因的转录物的DNA酶。DNA酶是由DNA组成的镁依赖性催化核酸，其能通过沃森克里克碱基配对选择性结合RNA底物，并在任何嘌呤-嘧啶连接处切割所述RNA底物主链的磷酸二酯键(Santiago，F.S.等，(1999)Nat Med
5：1264-1269)。DNA酶由两种不同功能性结构域组成；可完成磷酸二酯键切割的15个核苷酸的催化核心，以及与催化核心侧接的两个杂交臂；可以调整臂的序列相同性以实现与靶RNA底物的互补碱基配对。

[0088] 因此，所述DNA酶具有的互补区段能与Cx43基因转录物上位于嘌呤-嘧啶连接侧翼的区段退火，从而DNA酶的催化核心能在连接处切割所述转录物，使得转录物不能被翻译生成功能性Cx43蛋白。在某些实施方式中，所述DNA酶设计成在AUG起始密码子的A和U残基之间切割Cx43转录物。

[0089] 例如，所述Cx43转录物可包括以下序列[SEQ ID NO：5]：

[0090] GGCUUUUAGC GUGAGGAAAG UACCAAACAG CAGCGGAGUU

[0091] UUAAACUUUA AAUAGACAGG UCUGAGUGCC UGAACUUGCC

[0092] UUUUCAUUUU ACUUCAUCCU CCAAGGAGUU CAAUCACUUG

[0093] GCGUGACUUC ACUACUUUUA AGCAAAAGAG UGGUGCCCAG

[0094] GCAACAUGGG UGACUGGAGC GCCUUAGGCA AACUCCUUGA

[0095] CAAGGUUCAA GCCUACUCAA CUGCUGGAGG GAAGGUGUGG

[0096] CUGUCAGUAC UUUUCAUUUU CCGAAUCCUG CUGCUGGGGA

[0097] CAGCGGUUGA GUCAGCCUGG GGAGAUGAGC AGUCUGCCUU

[0098] UCGUUGUAAC ACUCAGCAAC CUGGUUGUGA AAAUGUCUGC

[0099] UAUGACAAGU CUUUCCCAAU CUCUCAUGUG CGCUUCUGGG

[0100] UCCUGCAGAU CAUAUUUGUG UCUGUACCCA CACUCUUGUA

[0101] CCUGGCUCAU GUGUUCUAUG UGAUGCGAAA GGAAGAGAAA

[0102] CUGAACAAGA AAGAGGAAGA ACUCAAGGUU GCCCAAACUG

[0103] AUGGUGUCAA UGUGGACAUG CACUUGAAGC AGAUUGAGAU

[0104] AAAGAAGUUC AAGUACGGUA UUGAAGAGCA UGGUAAGGUG

[0105] AAAAUGCGAG GGGGGUUGCU GCGAACCUAC AUCAUCAGUA

[0106] UCCUCUUCAA GUCUAUCUUU GAGGUGGCCU UCUUGCUGAU

[0107] CCAGUGGUAC AUCUAUGGAU UCAGCUUGAG UGCUGUUUAC

[0108] ACUUGCAAAA GAGAUCCCUG CCCACAUCAG GUGGACUGUU

[0109] UCCUCUCUCG CCCCACGGAG AAAACCAUCU UCAUCAUCUU

[0110] CAUGCUGGUG GUGUCCUUGG UGUCCCUGGC CUUGAAUAUC

[0111] AUUGAACUCU UCUAUGUUUU CUUCAAGGGC GUUAAGGAUC

[0112] GGGUUAAGGG AAAGAGCGAC CCUUACCAUG CGACCAGUGG

[0113] UGCGCUGAGC CCUGCCAAAG ACUGUGGGUC UCAAAAAUAU

[0114] GCUUAUUUCA AUGGCUGCUC CUCACCAACC GCUCCCCUCU

[0115] CGCCUAUGUC UCCUCCUGGG UACAAGCUGG UUACUGGCGA

[0116] CAGAAACAAU UCUUCUUGCC GCAAUUACAA CAAGCAAGCA

[0117] AGUGAGCAAA ACUGGGCUAA UUACAGUGCA GAACAAAAUC

[0118] GAAUGGGGCA GGCGGGAAGC ACCAUCUCUA ACUCCCAUGC

[0119] ACAGCCUUUU GAUUUCCCCG AUGAUAACCA GAAUUCUAAA

[0120] AAACUAGCUG CUGGACAUGA AUUACAGCCA CUAGCCAUUG

[0121] UGGACCAGCG ACCUUCAAGC AGAGCCAGCA GUCGUGCCAG

[0122] CAGCAGACCU CGGCCUGAUG ACCUGGAGAU CUAG

[0123] 可以采用本领域已知的标准技术合成所述DNA酶，例如可采用标准亚磷酰胺化学连接法在固相载体上以3’到5’方向合成DNA分子，包括使用自动化核酸合成仪。或者，可以通过转录编码DNA酶的核酸分子来合成所述DNA酶。所述核酸分子可以包含在用于递送到细胞表达系统内的DNA或RNA载体中，例如病毒载体。合适的病毒载体包括疫苗病毒载体和腺病毒载体。

[0124] 可以通过将HSC暴露于DNA酶使DNA酶被细胞摄取并能在细胞内靶向并切割Cx43转录物，导致细胞内功能性Cx43蛋白表达降低或没有表达，从而实现所述下调。暴露可包括本领域已知的转染技术，或者通过微注射技术将DNA直接注入细胞。暴露还可包括将细胞暴露于裸露DNA酶，因为细胞在体内会摄取裸露DNA。或者，若DNA酶是包括在核酸载体中，如病毒载体，可以用所述病毒载体感染所述细胞。

[0125] 或者，可以递送抑制Cx43编码核酸表达的反义RNA分子或小干扰RNA(siRNA)分子进入HSC。

[0126] 反义RNA分子可包含与Cx43基因RNA转录物的至少一个片段互补的序列，其能与Cx43转录物结合，从而减少或防止体内Cx43基因的表达。反义RNA分子应当与靶mRNA有足够程度的互补性，以避免反义分子与非靶向序列在特异性结合所需条件下，例如在生理条件下的非特异性结合。

[0127] siRNA分子可以是能引起细胞内的基因特异性RNA干扰，导致体内Cx43基因表达减少或没有表达的任何双链RNA分子，包括能自身折返形成双链siRNA的自体互补单链分子。siRNA通常靶向靶mRNA内19-23个碱基的核苷酸序列，如Elbashir等(2001)EMBO J20：6877-6888所述，其内容通过引用纳入本文。通常，siRNA一条链的序列与部分靶转录物mRNA互补，本文中靶转录物为Cx43转录物。设计siRNA的指南是本领域已知的，或者可购得设计与特定靶标杂交的siRNA(Ambion、Qiagen)。例如，具有3’UU双核苷酸突出端的siRNA往往在引发RNA干扰(RNAi)上更有效。针对特定序列的siRNA分子已有市售，或可以设计并且购得。同样，已有用于设计siRNA序列的计算机程序(例如，Invitrogen)。

[0128] 例如，所述siRNA可包含具有序列r(CAG UGC ACA UGU AAC UAA U)dTdT[SEQ ID NO：6]的有义链和具有序列r(AUU AGU UAC AUG UGC ACU G)dTdT[SEQ ID NO：7]的反义链，该siRNA针对转录物中的序列AAC AGU GCA CAU GUA ACU AAU[SEQ ID NO：8](Rn_Gja1_1_HPsiRNA，德国凯杰公司(Qiagen))。或者，所述siRNA可包含具有序列r(GGU AAG CUU CCC UGG UCU A)dTdT[SEQ ID NO：9]的有义链和具有序列r(UAG ACC AGG GAA GCU UAC C)dTdT[SEQ ID NO：10]的反义链，该siRNA针对转录物中的序列CAG GUA AGC UUC CCU GGU CUA[SEQ ID NO：11](Rn_Gja1_5_HP siRNA，德国凯杰公司)。

[0129] 因此，为了实现下调，所述细胞可暴露于反义RNA、编码反义RNA的核苷酸、siRNA或编码siRNA的核苷酸，例如含有核酸分子的核酸载体，该核酸分子能转录反义转录物或能形成双链siRNA的单链、自体互补siRNA分子。可以采用上述核酸化学合成方法和标准分子生物学克隆技术合成这种反义分子、siRNA分子或载体。

[0130] 因此，可以通过递送所述试剂进入细胞实现HSC增殖的抑制，其包括使所述细胞与所述试剂接触，使细胞摄取试剂，使试剂与Cx43或编码Cx43的DNA或RNA相互作用，从而下调Cx43的HSC增殖活性。

[0131] 所述方法可以在受肝纤维化或肝纤维化相关疾病影响的HSC中进行，包括导致肝纤维化或肝纤维化相关疾病或与其产生有关的HSC，或者由于肝纤维化或肝纤维化相关疾病引起或者在其发生期间被激活的HSC。

[0132] 因此，要抑制增殖的HSC可以是需要治疗肝纤维化或肝纤维化相关疾病的对象的体内HSC，对象包括哺乳动物，包括人。

[0133] 肝纤维化相关疾病是指可能造成、引起肝纤维化、或与肝纤维化相关的任何疾病、失调或症状，所述肝纤维化包括原发性纤维化和继发性纤维化。所述疾病包括肝纤维化，包括例如，肝硬化、丙肝感染、乙肝感染、与酒精或肥胖相关的脂肪性肝炎、威尔逊病、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝癌。

[0134] 因此，递送所述试剂或编码所述试剂的核酸给细胞包括将有效量的所述试剂给予对象。本文所用术语“有效量”是指在剂量上和实现所需结果必需的时间段内，例如能有效抑制对象内HSC增殖和/或治疗肝纤维化或肝纤维化相关疾病的量。

[0135] 可以采用本领域已知的标准技术将所述试剂或编码所述试剂的核酸给予对象。所述试剂或编码所述试剂的核酸可以全身给予，或者可以直接在HSC的位点给予。给药到所述位点包括注射到所述位点、或手术植入，还可包括经肝的传入和传出血管，例如肝门静脉、肝静脉或胆管，通过水力递送所述试剂或编码所述试剂的核酸。

[0136] 所述试剂或编码所述试剂的核酸的给药浓度和量可以不同，取决于需治疗的肝纤维化或肝纤维化相关疾病、与肝纤维化或肝纤维化相关疾病有关的细胞类型、将给予的分子类型、给药模式、以及对象的年龄和健康状况。

[0137] 为协助给药，所述下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸可以配制成药物组合物的组分。

[0138] 因此，提供了药物组合物，包含下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸，以及可选地包含药学上可接受的稀释剂。这种药物组合物可用于治疗肝纤维化或肝纤维化相关疾病。

[0139] 所述组合物可常规包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种相容载体。对于所有形式的递送，所述下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸可以配制在生理盐水溶液中。由于多肽在给药时可能不稳定，当所述下调Cx43 HSC增殖活性的试剂是多肽或蛋白质时，可能需要将所述肽或蛋白质包括在有助于保护和/或保存所述肽或蛋白质的脂质体或其它生物材料中直至递送给靶细胞。

[0140] 所述药学上可接受稀释剂的比例和特性由选定的给药途径、与肝细胞的相容性和标准药学实践所决定。通常，所述药物组合物用某些组分配制，这些组分不会杀伤或显著损伤所述下调Cx43 HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸的生物学性质。

[0141] 可以用制备适于给予对象的药学上可接受组合物的已知方法制备所述药物组合物，例如将有效量的下调Cx43 HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸，与任何一种或多种补充活性物质，用药学上可接受的载剂组合在混合物中。例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》，麦克出版公司，美国宾夕法尼亚州伊斯顿，1985)中描述了合适的载剂。在此基础上，所述药物组合物包括但不限于，下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸的溶液、加有一种或多种药学上可接受的载剂或稀释剂，并包含在有合适pH且与生理液体等渗的缓冲溶液中。

[0142] 本领域技术人员应当理解，所述药物组合物可取决于选定的给药途径以多种形式给予对象。本发明的组合物可以局部给药、经手术给药或者通过注射给予所需位点。

[0143] 所述下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸的溶液可以配制在生理合适的缓冲液中。在常规储存和使用条件下，这些制品含有防腐剂以避免微生物生长，这将维持所述下调Cx43的HSC增殖活性的试剂的功能。本领域技术人员知道如何制备合适的制剂。例如，在《雷明顿药物科学》和1999年出版的The United States Pharmacopeia：The National Formulary(《美国药典：国家处方集》)(USP 24 NF19)中描述了可供选择和制备合适制剂的常规步骤和成分。

[0144] 药物组合物需使用的剂量取决于需治疗的具体病症，所述病症的严重程度，包括年龄、身体状况、尺寸和重量等对象个体参数，治疗的持续时间，同时治疗(如果有)的特性、特定给药途径和卫生专业人员知识和技能范围内的其它类似因素。这些因素是本领域技术人员已知的，并可用最少的常规实验解决。

[0145] 还考虑了下调Cx43的HSC增殖活性的试剂或编码所述试剂的核酸的用途，包括在生产抑制HSC增殖或治疗肝纤维化或肝纤维化相关疾病的药物中的应用，包括根据本文所述方法的各种应用。

[0146] 本发明的方法和用途用以下非限制性实施例进一步举例说明。实施例

[0147] 材料和方法

[0148] 细胞培养条件：按已公开的步骤(Weiskirchen和Gressner，2005)从雄性Wistar大鼠中分离原代肝星状细胞。采用的方案已得到新加坡生物医学研究理事会(Biomedical Research Council of Singapore)的动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)的批准。通过分离后1天的维生素A自荧光评估原代HSC的纯度。细胞系HSC-2另有描述(Maubach等，2008)。所有细胞在37℃、5％CO2循环的潮湿培养箱中培养。在细胞培养中使用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml 链霉素的高葡萄糖达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(D-MEM)。胰蛋白酶-EDTA从Biochrome公司(德国)购得。所有其它细胞培养试剂来自Invitrogen(美国加州)。

[0149] 用重组人TGF-β1处理肝星状细胞：在处理前24小时，将HSC接种入75cm2组织培养瓶。在60-70％细胞汇合时，加入重组人TGF-β1(hTGF-β1)到1或10ng/ml的终浓度，并孵育2、6、10、24或30小时。对照处理中，仅将磷酸缓冲盐水(PBS)给予细胞。在一些实验中，HSC-2细胞用终浓度为5μM的双吲哚基马来酰亚胺(BIM I)处理30分钟，然后用10ng/ml hTGF-β1处理。

[0150] 逆转录和定量PCR：根据生产商方案(RNA II试剂盒，德国Machery-Nagel公司)从细胞中分离总RNA。逆转录和实时PCR的所有试剂来自Applied Biosystems(美国加州)。将1微克总RNA在50μl的总反应体积中以RT试剂盒(N8080234)所述条件逆转录成cDNA。用Fast Real Time PCR System(快速实时PCR系统，Applied Biosystems公司)进行实时PCR反应。在10μl的PCR反应体积中使用3μl cDNA。针对目标基因Cx43和Snai1以及针对内源对照β-肌动蛋白的Taqman探针分别是Rn01433957_m1、Rn00441533_g1和4352341E。PCR条件为95℃20秒，40个扩增循环：95℃3秒和60℃30秒。

[0151] SDS-PAGE和Western印迹：如最近所描述的(Lim等，2008)进行细胞裂解和随后的SDS-PAGE总蛋白分离，然后是Western印迹。膜用含5％脱脂奶的TBS-Tween(TBS-T)封闭。Cx43(sc-9059，美国圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))、在丝氨酸368磷酸化的Cx43(pCx43 Ser368，3511S，美国细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technology))、PCNA(Ab29，英国Abcam公司)和β-肌动蛋白(A2228，美国Sigma公司)的一抗分别以1∶1000、1∶750、1∶5000和1∶7500的稀释度应用于封闭溶液。在TBS-T中清洗3遍后，偶联有马辣根过氧化物酶的适当二抗(美国圣克鲁斯生物技术公司)以1∶2000的稀释度加入封闭溶液中。在TBS-T中清洗3遍后，用ECL Plus(RPN2132，英国GE健康护理公司(GE Healthcare))将膜显影。在4℃用pCx43抗体孵育过夜。所有其它孵育在室温下进行1小时。用ImageJ软件(W.Rasband，NIH；rsb.info.nih.gov/ij/)进行Western印迹的半定量密度计量分析。

[0152] 免疫荧光染色：按别处所述(Maubach等，2002)进行HSC-2细胞的免疫荧光染色，以1∶50的稀释度使用抗体Cx43(C-6219，美国Sigma公司)和在丝氨酸368磷酸化的Cx43(pCx43 Ser368，3511S美国细胞信号转导技术公司)。二次抗体抗兔Alexa488和抗兔Alexa555(美国Invitrogen公司)以1∶200的稀释度使用。用LEICA RMB-DM落射荧光显微镜(德国LEICA公司)获取图像。

[0153] 间隙连接细胞间通信的分析：HSC-2在60mm细胞培养皿中生长过夜。在90％细胞汇合时，加入hTGF-β1(终浓度10ng/ml)或甘珀酸(终浓度40μM)并孵育6小时。对照细胞中仅给予PBS。或者，在添加hTGF-β1前30分钟加入BIM I(终浓度5μM)。在PBS快速冲洗后，细胞在无酚红、含50μg/ml终浓度5，6-羧基二乙酸荧光素(美国Research Organics公司)的D-MEM中孵育，37℃潮湿培养箱中孵育30分钟。然后用PBS冲洗细胞2次，加入无酚红的D-MEM，再继续进行光漂白后的荧光恢复(FRAP)试验。使用装有DM6000的LEICA TCS SP2(德国LEICA公司)软件包中所含的FRAP应用程序。使用63x浸没物镜(Leica HCX APO L U-V-I 63x/0.90Water UV)。488nm的氩气激光用作激发，捕捉500和535nm之间的荧光信号。条件如下：在10％激光能量下进行5次漂白前扫描，以15秒的间隔在100％激光能量下进行40次漂白扫描，之后进行60次漂白后扫描。在漂白期间，采用缩放(Zoom)模式以漂白感兴趣区域(ROI)内确定的单个细胞(靶细胞)。在漂白后获取期间用全扫描面积对所有数据作光漂白的校正。将校正的实验数据(OriginPro 7 SR4，美国-t/τ
OriginLab公司)拟合到函数F(t)＝F0+(F∞-F0)(1-e )，来评估恢复时间常数τ，其中F(t)是校正的荧光强度，F∞是荧光强度的渐近值。由k＝1/τ计算转移常数(k)，并通过除以与靶细胞接触的细胞数量来标准化。各细胞的荧光恢复约为50％。

[0154] 电泳迁移率变动分析：根据大鼠Cx43基因(NW_001084790)，合成(新加坡Research Biolabs)具有Snai1共有序列(下划线)的生物素化双链寡核苷酸探针TGCTCAACCCAGTCAGGTGATGCCTGAACAAA-3[SEQ ID NO：12]。在突变的双链寡核苷酸探针中，Snai1的共有序列改变为CAGGAA。用NE-PER核与胞质提取试剂盒(美国Pierce公司)获得核蛋白提取物。用Snai1试剂盒中的试剂根据其操作方案(AY1398，美国Panomics公司)进行电泳迁移率变动分析。简而言之，在添加1μl探针(存液20nM)前，5μg核蛋白提取物在由聚d(I-C)、5x结合缓冲液和无核酸酶的水组成的反应混合物中孵育5分钟。总反应体积为10μl。对于竞争实验，在添加标记探针前5分钟加入2μl未标记的探针(存液2μM)。反应在15℃孵育30分钟。在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)中分离样品，并转移到尼龙膜上。

[0155] Snai1和连接蛋白43 siRNA转染：临转染前，将1-2x106 HSC-2细胞接种入100mm细胞培养皿并37℃孵育。向1ml无血清的D-MEM中加入siRNA至终浓度10nM，再加入120μl HiPerfect转染试剂(德国Qiagen公司)并孵育10分钟。将siRNA/转染试剂溶液滴加到细胞中并孵育24或48小时。对于模拟对照，细胞中仅加入HiPerfect试剂。所用Snai1 siRNA是Rn_Snai1_1和Rn_Snai1_3，所用Cx43 siRNA是Rn_Gja1_1和Rn_Gja1_5(德国Qiagen公司)。

[0156] 细胞计数：处理后，细胞用PBS清洗1次，并用胰蛋白酶/EDTA脱离。800rpm离心4分钟后，细胞团重悬浮在1ml D-MEM中，细胞用GUAVAPCA-96(美国加州Guava技术公司)的前向散射功能计数。

[0157] 统计学分析：所有定量结果均表示为均值±SD。在适当的情况下，用假定相等方差的双尾斯氏t检验和单向ANOVA Scheffé事后检验分析实验数据。数据显著性的标准是p值＜0.05。除非另有说明，图例所示p值是基于斯氏t检验。

[0158] 结果

[0159] hTGF-β1下调Cx43转录物和蛋白表达：为检查Cx43 mRNA的调节，用促纤维化hTGF-β1刺激HSC-2细胞10分钟。实时PCR数据显示，1ng/ml和10ng/ml hTGF-β1引起Cx43转录物分别降低30％和45％(图1A)。此外，还观察到hTGF-β1下调Cx43蛋白(图1B和C)。当10天体外激活原代HSC经受hTGF-β1处理时，观察到Cx43 mRNA和蛋白调节的趋势相似(图1A、B和C)。

[0160] hTGF-β1提高Cx43的磷酸化：补充hTGF-β1后，观察到Cx43在丝氨酸368磷酸化的提高(图2A)，这归因于Cx43总库(下降)中pCx43 S368的比例提高。pCx43条带的真实性通过在λ-磷酸酶处理后该条带的消失得到证实(图2A)。用蛋白激酶C(PKC)抑制剂BIM I预处理细胞和随后的hTGF-β1处理，降低了Cx43在丝氨酸368位的磷酸化(图2B)。

[0161] 还进行了Cx43和pCx43 S368的免疫荧光染色，以研究pCx43 S368在HSC-2细胞内的细胞分布。Cx43很大程度上沿细胞膜分布，而pCx43 S368显示胞质内扩散或散点染色和一些膜定位(图2C，箭头)。

[0162] hTGF-β1降低了HSC之间的间隙连接细胞间通信：Cx43是HSC中表达的主要间隙连接蛋白质，已显示形成功能性的间隙连接(Fischer等，2005)。本发明使用间隙-FRAP技术(Abbaci等，2007)分析HSC之间的GJIC(间隙连接细胞间通信)。为证实这一方法，证明了在分离的漂白细胞中没有自发的荧光恢复(图3A，箭头)，而接触的细胞恢复其荧光的约50％(图3B，箭头)。这表明，确实检测到染料从未漂白细胞经间隙连接转移到漂白细胞，而不是荧光信号本身的恢复。图3C是描述实验数据所拟合的恢复功能的示意图。甘珀酸是已确立的GJIC(间隙连接细胞间通信)抑制剂(Doll等，1968)。在本文情况中，甘珀酸使染料转移速率(k)降低几乎50％(图3D)。这一结果用作间隙-FRAP技术检测GJIC变化可靠性的阳性对照。这些发现显示，在hTGF-β1处理的HSC细胞中的荧光染料5，6-羧基二乙酸荧光素的转移速率显著降低(图3D)，提示与PBS处理的HSC(对照)相比，这些细胞中的GJIC降低。发现当在添加TGF-β1前用PKC抑制剂BIM I处理细胞时，减弱了TGF-β1诱导的GJIC下调(图3D)。

[0163] hTGF-β1通过Snai1下调Cx43表达：已知TGF-β1上调Snai1的表达，Snai1是一种参与上皮-间质转化(EMT)的锌指转录因子(Peinado等，2003)。另一方面，Snai1对于抑制E-钙粘着蛋白在上皮肿瘤细胞中的转录和Cx43在EMT期间的转录是必需的(Batlle等，2000；de Boer等，2007)。图4A显示，hTGF-β1在HSC-2细胞系和体外激活的原代HSC内诱导Snai1 mRNA。用两种Snai1特异性siRNA(1和3)转染HSC-2引起Snai1 mRNA和蛋白下调几乎50％(图4B)。同时，观察到Snai1 siRNA 1和3转染后，Cx43的mRNA(31％和43％)和蛋白(18％和23％)水平分别上调(图4B)。为进一步支持Cx43调节可部分通过Snai1介导的主张，证实了hTGF-β1处理最多30小时后，与Cx43的减少相对应，Snai1在转录物和蛋白表达上都有增加(图4，C和D)。

[0164] HSC的核提取物与Cx43启动子上的Snai1共有序列结合：为进一步评估Snai1调节Cx43基因表达的可能性，采用基于大鼠Cx43启动子的含Snai1共有序列(CAGGTG)的生物素化寡核苷酸探针和12天体外激活HSC的核提取物进行了电泳迁移率变动分析。该共有序列在转录起始位点上游的1412bp。通过寡核苷酸探针在6％聚丙烯酰胺凝胶上的迁移率改变显现Snai1与其共有序列的结合(图5A，泳道1)。该结合可以用200倍过量的冷(未标记)探针竞争掉(5A，泳道2)。此外，没有核提取物时(图5A，泳道3)，和使用在Snai1共有序列中有2个碱基对突变的突变生物素化探针(CAGGAA)时(图5A，泳道4)，检测不到信号，表明观察到的是核提取物中的Snai1蛋白和探针之间的特异性结合。用细胞系HSC-2的核提取物也获得相似结果(数据未显示)。类似地，使用经10ng/ml hTGF-β1处理的HSC-2核提取物产生更强的条带，而转染了Snai1 siRNA的细胞产生了较弱的条带(图5B)，进一步示范了Snai1和其在Cx43启动子上的共有序列之间的结合特异性。

[0165] 连接蛋白43调节HSC增殖：已知TGF-β1可调节细胞增殖。用细胞计数和增殖标记增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫印迹分析证实了对HSC-2增殖的影响。用hTGF-β1处理HSC-2引起细胞数量显著减少(图6A)，PCNA和Cx43的表达也降低(图6，B和C)。除GJIC以外，通过用Cx43 siRNA减弱Cx43 mRNA水平来研究了Cx43在HSC增殖的TGF-β1依赖性调节中的相关性。将Cx43特异性siRNA 1和5转染到HSC-2引起Cx43 mRNA在两个情况中都下调约65％，表明了siRNA的功效(图7A)。在用Cx43 siRNA 1和5处理48小时后，进行细胞计数以评估细胞增殖。图7B清楚说明，与模拟转染细胞相比，转染Cx43 siRNA后细胞总数显著减少。类似的，Cx43 siRNA也引起Cx43蛋白表达的下降(图7，C和D)，证明了Cx43蛋白可能是该减少的原因。此外，Cx43 siRNA转染细胞中的PCNA表达低于模拟转染细胞(图7，C和D)。还发现，TGF-β1下调细胞增殖被用Snai1 siRNA转染HSC-2细胞所减弱(图8，A和B)。

[0166] 总结

[0167] 数据显示，外源hTGF-β1减少了HSC细胞系和体外活化原代HSC中Cx43转录物和蛋白(图1)。此外，在经hTGF-β1处理的细胞中，Cx43(Ser368)的磷酸化增加(图2A)。结果表明，PKC负责Cx43在丝氨酸368位的磷酸化(图2B和3D)。这一观察和先前发现PKC使Cx43中丝氨酸368位磷酸化相一致(Lampe等，2000)。由免疫荧光显示的pCx43(S368)的胞质和部分膜分布(图2C)也提示，磷酸化可能不仅影响通道门控(Lampe等，2000)，还影响运输和装配入连接子。(Solan和Lampe，2005)。总之，如间隙-FRAP实验所示，结果是hTGF-β1处理的HSC细胞与对照相比GJIC降低(图3D)。换而言之，TGF-β1对Cx43的调节似乎分两部分，分别由短期(6小时)的pCx43(Ser368)升高和长期(24小时)的Cx43表达下调所引起。

[0168] 已确定TGF-β1在HSC-2和体外活化原代HSC中上调Snai1(图4A)。使用Snai1 siRNA导致Snai1下调并同时上调Cx43(图4B)。EMSA结果表明Snai1能特异性识别其在大鼠Cx43启动子上的结合位点(图5A)。该结合特异性由Snai1不能结合突变共有序列而得到进一步支持。另一方面，用siRNA下调Snai1减弱了结合(图5B)。此外，结果表明TGF-β1处理不但提高了Snai1，还增加Snai1与其共有序列的结合(图5B)。

[0169] TGF-β1降低了细胞数量(图6A)和HSC细胞增殖能力标记PCNA的表达(图6，B和C)，这与Shen等的结果一致。Cx43 siRNA转染到HSC中(图7A)，细胞数量(图7B)和PCNA表达(图7，C和D)的降低显示，HSC在Cx43 siRNA转染后增殖比模拟转染的对照慢，提示TGF-β1对HSC增殖的影响可能在某种程度上通过Cx43介导实现。TGF-β1引起的细胞数量和PCNA表达降低被Snai1 siRNA对Snai1的抑制而减弱(图8)。

[0170] 本说明书引用的所有出版物和专利申请通过引用纳入本文，就如各出版物或专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。任何出版物的引用针对申请日之前的公开而不应解释为承认本发明不具有先于这些出版物的权利。

[0171] 在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明确说明。在本说明书和所附权利要求书中所用的术语“包含”“含有”“包括”以及其它这些术语形式具有非限制性包含的意义，即，包括具体引用的元素或成分，但不排除任何其它元素或成分。除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。

[0172] 虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以作出某些改变和修改而不背离所附权利要求书的精神和范围。

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