促使长dsRNA可用于哺乳动物和其他所选动物细胞中的基因寻靶
阅读：337发布：2023-01-27
专利汇可以提供促使长dsRNA可用于哺乳动物和其他所选动物细胞中的基因寻靶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供能够在 哺乳动物 细胞中使用长的dsRNA，通过细菌，优选细菌的非致病性或 治疗 性菌株，用于基因沉默的方法。编码长的双链RNA的DNA转化到细菌中并在所述细菌细胞中加工成更短RNA双链体的混合物，然后释放到靶细胞的 细胞质 中，导致在靶细胞中对基因表达的调节。所述方法通过排除或减轻非特异性先天免疫应答，克服了长的dsRNA和哺乳动物细胞之间的不相容性。所述真核细胞可以是哺乳动物、 鸟 类、细菌、真核或病毒基因。，下面是促使长dsRNA可用于哺乳动物和其他所选动物细胞中的基因寻靶专利的具体信息内容。
1.细菌，其包含由两条基本上互补的链组成的长的双链RNA(dsRNA)或由各自编码一条对应RNA链的两条互补链组成的DNA分子，和能够将所述dsRNA加工成更短RNA双链体混合物的酶，其中所述dsRNA包含与靶哺乳动物基因或病毒基因编码的信使RNA(mRNA)序列基本上互补的序列，其中所述dsRNA是非短发夹RNA，其中所述dsRNA的双链区长于70bp，其中所述短RNA双链体混合物能够调节哺乳动物基因或病毒基因的表达。
2.权利要求1的细菌，其中所述酶是核酸内切酶。
3.权利要求1的细菌，其中所述酶是细菌核糖核酸酶Ⅲ、切酶或切酶样酶。
4.权利要求1的细菌，其中所述细菌能够在引入哺乳动物细胞后调节哺乳动物细胞中的哺乳动物基因或病毒基因的表达。
5.权利要求1的细菌，其中所述dsRNA长度至少为100bp。
6.权利要求1的细菌，其中所述dsRNA长度至少为选自100bp、200bp、400bp和1000bp。
7.权利要求1的细菌，其中所述DNA分子包含控制所述dsRNA表达的一个或多个原核启动子。
8.权利要求7的细菌，其中所述一个或多个原核启动子中的至少一个是T7启动子。
9.权利要求7的细菌，其中所述一个或多个原核启动子中的至少一个对所述细菌是内源的。
10.权利要求1的细菌，其中所述DNA分子包含控制所述DNA分子两条链表达的两个原核启动子。
11.权利要求1的细菌，其中所述哺乳动物基因与哺乳动物疾病相关，所述疾病至少部分是由于所述基因表达的上调或下调引起的。
12.权利要求1的细菌，其中所述哺乳动物基因与癌症相关，即，所述基因的沉默或敲低影响细胞增殖。
13.权利要求1的细菌，其中所述哺乳动物基因是β-联蛋白。
14.权利要求1的细菌，其中所述哺乳动物基因是k-Ras。
15.权利要求1的细菌，其中所述病毒基因是HIV基因。
16.权利要求1的细菌，其中所述细菌能侵入哺乳动物细胞。
17.权利要求1的细菌，其中所述细菌是活的。
18.权利要求1的细菌，其中所述细菌是半失活的细菌。
19.权利要求1的细菌，其中所述细菌是非致病性的。
20.权利要求1的细菌，其中所述细菌是治疗性的细菌。
21.权利要求1的细菌，其中所述细菌是选自李斯特氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌和双歧杆菌的减毒菌株。
22.权利要求1的细菌，其中所述DNA分子包含环形双链质粒。
23.权利要求1的细菌，其中所述DNA分子整合到细菌染色体中。
24.权利要求1的细菌，其中所述dsRNA包含与哺乳动物基因或病毒基因编码的mRNA序列完全互补的序列。
25.细菌，其包含能调节哺乳动物基因或病毒基因表达的短RNA双链体混合物，其中所述短RNA双链体混合物从长的双链RNA(dsRNA)产生，所述dsRNA包含与靶哺乳动物基因或病毒基因编码的信使RNA(mRNA)序列基本上互补的序列，其中所述dsRNA是非短发夹RNA，其中所述dsRNA的双链区长于70bp。
26.权利要求25的细菌，其中所述长的双链RNA(dsRNA)长度至少为100bp。
27.权利要求25的细菌，其中所述长的双链RNA(dsRNA)长度至少为选自100bp、200bp、
400bp和1000bp。
28.权利要求1的细菌，其还包含酶，所述酶从所述细菌中释放到靶真核细胞的细胞质后帮助转运遗传物质。
29.权利要求28的细菌，其中所述酶是Hly蛋白质。
促使长dsRNA可用于哺乳动物和其他所选动物细胞中的基因
寻靶
[0001] 本申请为2008年6月30日提交的、发明名称为“促使长dsRNA可用于哺乳动物和其他所选动物细胞中的基因寻靶”的PCT申请PCT/US2008/068866的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年3月1日，申请号为200880105142.7。
[0002] 相关申请的交叉引用
背景技术
[0005] RNA干扰(RNAi)是真核生物中基因特异性沉默的催化机制，其对生物学和医学具有深远的意义。然而，此类基因寻靶的有效机制的诱导物在哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞中截然不同。
[0006] 长的双链RNA(dsRNA)引发线虫(C.elegans)和黑腹果蝇(Drosophila Melanogaster)中有效的序列特异性基因沉默。相反，由于干扰素相关途径的激活，长dsRNA在哺乳动物细胞中诱导非序列特异性应答。认为RNAi机制在哺乳动物细胞中没有功能，直至发现了siRNA双链体。
[0007] 使用短干扰RNA(siRNA)选择性靶向用于降解的信使RNA(mRNA)，导致通过降解目的mRNA沉默或敲减待表达的基因。通常siRNA为20-25个核苷酸长的双链RNA(dsRNA)，在其每条链上具有一些未配对的突出端碱基。基于该模型，使用siRNA的分子生物学技术已经成为研究工具和用于治疗的候选者(Dykxhoorn,Novina&Sharp.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4:457-467(2003)；Kim&Rossi,Nature Rev.Genet.8:173-184(2007)；de Fougerolle s,等Nature Rev.Drug Discov.6:443-453(2007))。
[0008] 在广泛用于哺乳动物细胞中基因沉默的同时，siRNA已经引起了限制RNAi在生物医学研究和RNA治疗开发中的潜力的许多问题。不像非哺乳动物细胞中的长dsRNA，设计siRNA已经证明是困难的。首先，在基因序列内，仅某些序列基序可以作为siRNA的模板起作用。尽管过去的这些年发展了许多算法，但鉴定这些基序几乎是反复试验的过程。第二，不像非哺乳动物细胞中的长dsRNA，siRNA在哺乳动物细胞中具有大体上很低的基因沉默效率(Reynolds A等Nature Biotech 22:326,2004；A.de Fougerolles等,Nat Rev Drug Discov 6,443(2007).)。找到沿mRNA的高效siRNA基序是困难的，并且对于一些mRNA是不可能的，因为在mRNA中含有几乎无限多的20-25nt的可能基序。第三，设计完siRNA后，负电荷siRNA到哺乳动物细胞的递送已经证明是一项艰巨的挑战(Li CX,等Cell Cycle 5:2103-2109(2006))。
[0009] 高度期望某技术是否能够在哺乳动物细胞中使用长dsRNA。由于强烈的细胞先天免疫应答，如非特异性干扰(IFN)应答，迄今为止没有报道过在直接向靶哺乳动物细胞中引入外源长dsRNA的成功事例。(Yang,S.等Mol.Cell.Biol.21:7807-7816(2001))。
[0010] 发明概述
[0011] 在一个实施方案中，本发明通过使用细菌介导系统为上述问题提供解决方案。细菌先天免疫应答不应答的长dsRNA，并可作为“屏蔽”起作用，以便预防或减轻哺乳动物细胞对长dsRNA的强烈先天免疫应答。根据本发明，细菌作为中间媒介，通过进行制备、处理并向靶哺乳动物细胞(例如哺乳动物或其他真核细胞)呈现加工的长dsRNA及其产物的工作来解决长dsRNA和哺乳动物细胞之间的不相容性，由此避免强烈的先天免疫应答。为了完成该过程，用分别编码长dsRNA的载体转化具有细胞侵入性质的细菌，所述长dsRNA包括与靶真核或病毒基因的信使RNA(mRNA)序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，所述dsRNA是非编码或不编码蛋白质的。当含有长dsRNA及其代谢产物的这些细菌侵入宿主细胞时，此类RNA双链体的混合物与细胞表面上的免疫感受器的识别隔离。当细菌最终向哺乳动物细胞的细胞质中释放表达的RNA时，一些或全部表达的长dsRNA很可能已经经过细菌和哺乳动物切酶和/或切酶样酶加工成了短RNA双链体的混合物。因为其具有覆盖mRNA的几乎所有基序的巨大多样性，已经通过哺乳动物酶和细胞器进一步加工的一些细菌内容物将开始作为产生多种程度基因沉默效应的基因沉默RNA起作用。因此，靶真核或病毒基因的表达被有效降低。在一个实施方案中，基因沉默可归因于由细菌转染引起的短RNA双链体的混合物，但本发明不应该解释为限制在该解释上。
[0012] 因为本发明的方法不需要针对mRNA内特定基因筛选有效的siRNA基序，并且能够同时合成和递送，本发明在基因功能研究和可应用细菌的基因寻靶治疗中通过RNAi进行显著简化并升级的基因寻靶。例如，使用合成siRNA引发RNAi，必须筛选靶基因的各mRNA的有效siRNA，这是反复试验过程。对于一些基因，鉴定有效的siRNA基序未成功。相反，本发明依赖于长dsRNA，其在一个实施方案中产生短RNA双链体的混合物，以发挥序列特异性基因沉默的作用，由此避免预筛选过程。
[0013] 因为来自细菌产生的长dsRNA的代谢产物覆盖了mRNA的几乎全部基序，本发明也保护免于频繁突变的疾病基因，如在一些病毒基因像HIV的情况中。在设计并发展有效的siRNA后，突变可在基因的靶基序中发生，其可致使siRNA完全失效。相反，因为加工的长dsRNA靶向疾病或病毒基因的许多基序，使用长dsRNA的细菌介导的基因寻靶可避开该问题。
[0014] 本发明也为靶标鉴定和确认提供强有力的工具，并且该工具称为Therapeutic Pathway Identification and Validation 技术。例如，本发明使基因组范围手段能够通过提供 文库(否则不可能构建)靶向发现。本发明也提供使用于体内基因寻靶的技术能够发现、确认并区分治疗靶标。来自本发明方法的RNAi效果证明比目前可获得的RNAi技术更有效并特异。例如，本发明的方法能够在众所周知难以进行遗传操作的癌干细胞中引起基因沉默。
[0015] 因此，一般而言，本发明提供与以下相关的系统、材料和方法：遗传改造细菌以转录非小发夹RNA(或非短发夹RNA，两者均缩写为“non-shRNA”)。该non-shRNA可以是长的双链RNA(dsRNA)、长的发夹RNA(lhRNA)或多顺反子shRNA，或任何上述的混合物。non-shRNA可以是非编码的或不编码蛋白质的。在一个实施方案中，将non-shRNA在呈递到靶真核细胞之前在细菌中加工成更短RNA双链体的混合物。在一个特征中，选择具有侵入性质的细菌进行本发明。来自细菌的代谢产物能够在靶细胞中调节基因表达。
[0016] 一方面，本发明提供编码在一个或多个原核启动子控制下的长的双链RNA(dsRNA)或lhRNA的原核载体。所述dsRNA包括与靶真核基因或病毒基因的信使RNA(mRNA)序列基本互补(包括完全互补)的序列。在一个实施方案中，dsRNA的原核代谢产物能够调节真核基因或病毒基因的表达。在一个实施方案中，所述载体包括可以相同的至少两个原核启动子(例如T7)。各启动子控制所述dsRNA的两条基本互补链的一条或另一条的表达。在一个实施方案中，所述载体是环形的双链质粒，并且所述两个原核启动子排列在质粒的互补链上。在另一实施方案中，所述载体可整合到细菌染色体中。在另一实施方案中，所述载体作为细菌中游离基因存在。例如，其表达被载体靶向的真核基因可以是癌基因或HIV基因。
[0017] 另一方面，本发明提供细菌，其包含(a)具有双链区的RNA分子，例如长的双链RNA(dsRNA)或lhRNA，或(b)编码所述RNA的DNA分子。单链DNA分子可由两条互补链组成，每条编码一条对应RNA链。所述RNA包括与靶真核基因或病毒基因的mRNA序列基本互补的序列。在一个特征中，RNA的双链区的长度是至少40bp、70bp、100bp、200bp、400bp或1000bp，在另一特征中，RNA的双链区的长度不超过2000bp。在一个实施方案中，细菌可是侵入性的、非致病性的，和/或治疗性的。在一个实施方案中，所述细菌能够将RNA加工成能够调节靶基因表达的更短RNA双链体的混合物。为此，所述细菌也含有能够将RNA加工成更短RNA双链体的混合物的酶或核酶，例如一种或更多种内切核酸酶，如细菌核糖核酸酶III或切酶或其两者。在实施方案中，所述细菌含有在其从细菌释放到靶真核细胞的细胞质中后帮助转运遗传物质的酶。该酶可以是Hly蛋白质(例如Hly A基因编码的利斯特氏菌溶素O)。编码RNA的相同DNA分子或不同DNA可编码Hly基因。在另一实施方案中，所述细菌能够在引入真核细胞后调节真核细胞中的真核基因或病毒基因的表达，即不需要通过短RNA双链体混合物的途径。编码RNA的DNA分子的一个具体实例是上文刚刚描述的载体。
[0018] 另一方面，本发明提供包含能够调节真核基因或病毒基因表达的短RNA双链体的混合物的细菌。可从非小发夹RNA(non-shRNA)产生短RNA双链体的混合物。在一个实施方案中，短RNA双链体的混合物能够有效降低真核或病毒基因的表达。所述non-shRNA可以是长的双链RNA、长的发夹RNA或多顺反子shRNA。
[0019] 另一方面，本发明提供称为 文库的文库，所述 文库包含多个载体，各载体包含来自cDNA库的一个cDNA分子或一个cDNA片段、第一个启动子和第二个启动子。所述第一个启动子控制cDNA分子或cDNA片段的一条链的表达，第二个启动子控制cDNA分子或cDNA片段的另一条链的表达。并且多个载体可转化细菌。所述cDNA库可来自哺乳动物细胞的总mRNA。在一个实施方案中，通过用限制性酶消化cDNA分子或通过PCR反应产生所述cDNA片段。本发明的发明方面也涉及在此文库中发现的一个或多个载体。
[0020] 本发明还提供包含细菌细胞的 文库的另一实施方案，所述细菌细胞含有多个上述载体。在一个实施方案中，cDNA分子或cDNA片段的转录物可形成长dsRNA。在一个实施方案中，将从cDNA分子或cDNA片段的两条链转录的双链RNA加工成更短RNA双链体的混合物。本发明的发明方面也涉及在此类文库中发现的一种或更多种细菌。
[0021] 在另一方面，本发明还提供使用载体、细菌和本发明文库用于治疗和研究用途的多种方法。例如，一方面，提供方法用于鉴定治疗剂，所述方法包括用本发明文库感染细胞群体并选择具有表型变化的细胞以鉴定治疗靶标。
[0022] 一方面，本发明提供体外研究途径组分的方法，所述方法包括：提供能够进行目的生物学途径的真核细胞；用其靶真核基因或病毒基因怀疑是目的途径组分的本发明细菌感染细胞；并随后分析所述细胞对所述目的途径的任何影响。在一个实施方案中，在细菌中表达的长dsRNA并且其在细菌中的产物干扰所怀疑组分的mRNA，由此调节所述途径。在一个实施方案中，所述途径影响细胞存活、生长、分化、衰老、自噬、分裂或死亡。在另一实施方案中，靶标影响传染性生物，如病毒的存活、增殖和致病性。真核细胞可以是动物细胞、干细胞、癌细胞等。在一个实施方案中，细胞是癌干细胞。
[0023] 一方面，本发明提供体内研究治疗靶标的方法，所述方法包括：提供具有显示疾病的细胞的活动物；向那些动物细胞递送本发明细菌用于细菌感染(bactofection)；并随后收集感染细胞，以检测治疗效果。所述动物细胞可包含异种移植物和/或肿瘤细胞。
[0024] 一方面，本发明提供向动物细胞中引入短RNA双链体的混合物的方法，所述方法包括产生、加工并向动物细胞呈递至少一条长双链RNA(dsRNA)，而不引发来自动物的显著免疫应答。可将所述dsRNA加工成更短RNA双链体的混合物。在一个实施方案中，所述方法包括在细菌内产生并加工所述dsRNA，用细菌感染动物细胞，并溶解细菌以释放其内容物。根据本方法，可在动物细胞中进一步加工细菌的内容物以变成更短RNA双链体的混合物。
[0025] 本发明还提供在靶真核细胞中调节基因表达的方法，所述靶真核细胞可以是哺乳动物、鸟类或其他真核细胞。所述方法包括用本发明细菌感染靶细胞，其中细菌靶向的真核基因或病毒基因是待调节的基因。
[0026] 本发明进一步提供在受试者中治疗或预防癌或细胞增殖疾病的方法，所述方法包括用本发明细菌感染受试者的细胞，其中所述细菌靶向的真核基因或病毒基因是已知上调细胞增殖的基因。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物、鸟类或其他类型的真核生物。
[0027] 本发明进一步提供在受试者中治疗或预防病毒感染引起的疾病的方法。所述方法包括步骤：用本发明细菌感染受试者细胞，其中在病毒的致病性中涉及细菌靶向的真核基因或病毒基因。
[0028] 本发明进一步提供在受试者中治疗或预防由改变的基因引起的疾病的方法，所述方法包括用本发明细菌感染受试者细胞，其中细菌靶向的真核基因或病毒基因是改变的基因。在一个实施方案中，所述疾病至少部分由该基因表达的上调或下调引起。在另一实施方案中，所述疾病至少部分由基因中的一个或多个突变引起。
[0029] 本发明的其他特征和优势可显而易见于本文提供的，包括于不同实施例中的额外描述。提供的实施例阐明了用于实践本发明的不同成分和方法。所述实施例不限于要求本发明。基于本公开内容，技术人员可鉴定并使用用于实践本发明的其他成分和方法，而不背离本发明的原则。所有实施方案可彼此结合使用。
[0031] 图1是本发明实施方案的示意图。
[0032] 图2是显示根据本发明实施方案怎样构建并使用 文库的示意图。
[0033] 图3是根据本发明实施方案构建双链 质粒 的示意图。
[0034] 图4包括左图中的FACS图表和右图中的显微图像，表明根据本发明实施方案对癌干细胞(CSC)的分离。
[0035] 图5显示在用本发明细菌靶向CSCP1(右图)和对照(左图)处理的CSC中的CSCP1蛋白质表达分析的免疫荧光图像。
[0036] 图6包括用本发明细菌靶向CSCP3(右图)和对照(左图)处理的CSC中的CSCP3蛋白质表达分析的单通道图像(上图)和强度谱(下图)。
[0037] 图7包括用本发明细菌靶向CSCP3(右图)和对照(左图)处理的CSC群体中膜联蛋白V-FITC染色测定的显微图像。
[0038] 图8显示了用本发明细菌靶向CSCP3(右图)和对照(左图)处理的CSC群体中膜联蛋白V-FITC染色测定的另一组显微图像。
[0039] 图9包括加入台盼蓝前(左上图)和加入台盼蓝后(左下图)用本发明细菌靶向CSCP3处理的CSC球(sphere)的显微图像。右边的图表定量说明了本发明细菌对左边画出的CSC群体的影响。
[0040] 图10包括左边CSCP3蛋白质表达western印迹图像，和右边显示来自根据一个实验用本发明细菌靶向CSCP3处理后分化癌细胞的生存力统计的图表。
[0041] 发明详述
[0042] 如本文所用，“调节”指升高或降低(例如沉默)，换言之，上调或下调。如本文所用，向靶细胞“引入”或“递送”微生物指用所述微生物(例如细菌)感染所述靶细胞的过程，并且在某些情况下可能通过裂解所述微生物向靶细胞期望位置(例如细胞质)释放该微生物内的遗传物质。
[0043] 本发明为靶标发现和基因沉默治疗提供平台技术。一方面，本发明系统产生并使用侵入性细菌向哺乳动物细胞或其他类型的真核细胞递送编码长dsRNA或长dsRNA或其两者的DNA，以在真核细胞中发挥RNA干扰(RNAi)作用。本发明的RNA是非小发夹RNA(non-shRNA)。在一个实施方案中，所述RNA是非编码的。如本文所用“非编码的”或“不编码蛋白质的”表示序列不翻译成蛋白质。在一个实施方案中，所述非小发夹RNA是长的双链RNA(dsRNA)、长的发夹RNA(lhRNA)或多顺反子shRNA(Kim&Rossi,Nature Rev.Genet.8:173-184(2007))。在优选实施方案中，所述non-shRNA是非编码的长dsRNA，其在细菌细胞中可消化或加工成更短片段。在一种机制中，所述长dsRNA加工成更短RNA双链体的混合物。通过细菌从长dsRNA加工的遗传物质可引入动物宿主，而不被宿主细胞免疫系统检测到，并继续通过有效的转录后沉默和其他机制调节宿主细胞中的基因表达。真核细胞可以是哺乳动物、鸟类细胞或其他真核细胞。目的基因可以是哺乳动物、鸟类、细菌、真核或病毒基因。
[0044] 通过采取新的基因沉默技术，本发明为在体外和体内分析基因功能提供了强有力的工具；该工具称作Therapeutic Pathway Identification and Validation 技术。
[0045] 在一个特征中，本发明提供用于体外靶标发现和确认的研究工具 本发明的该方面在任何细胞群体包括癌干细胞(CSC)或具有未知或仍未完全明确的生物途径的其他细胞群体(包括非癌干细胞)中发现了应用。因为本发明能够在CSC中引起基因沉默，其确认的效能对于用于微小细胞群体、不能培养的细胞群体或不易于进行常规遗传操作的那些细胞群体特别有利。
[0046] 在另一特征中，本发明提供有效鉴定、确认和/或区分治疗靶标的体内基因敲减技术。本发明可应用于其中可施用细菌的任何体内疾病模型，然而目前的敲减技术不能用于任何已建立的疾病模型。
[0047] 在另一特征中，本发明也使基因组范围手段能够进行靶标发现。使用 技术构建的RNAi文库可以是基因组范围上的或是基因家族的文库。与目前的合成siRNA文库和RNAi载体文库相比， 文库具有更低的劳动强度和更低的花费。此外， 文库能够发现新基因而其他那些文库则不能。因此，本发明为在全基因组范围上为系统探测基因功能提供强有力的工具，并也为筛选与疾病相关的潜在治疗靶标提供强有力的方法。
[0048] 在一个有利的方面，本发明提供产生并使用细菌，优选细菌的非致病性或治疗性菌株向真核细胞中呈递non-shRNA的代谢产物，以在真核细胞中发挥RNA干扰(RNAi)作用的方法，所述non-shRNA的代谢产物在一些情况下是短RNA双链体的混合物。所述non-shRNA可以是长的双链RNA(dsRNA)、长的发夹RNA(lhRNA)或多顺反子shRNA。所述non-shRNA具有双链RNA区域。所述双链区域比siRNA双链体长，其通常为20-25bp。在一个实施方案中，所述双链区域长度至少为40bp、70bp、100bp、200bp、400bp、1000bp，并且在另一特征中，长度不超过2000bp。
[0049] 如本文所用，“混合物”、“多种”或“混合物”表示至少两种不同序列。例如，在一个实施方案中，短RNA双链体的混合物包含超过2、、4、8、16、50、100、200、500、1000、2000或4000个在序列上彼此不相同的短RNA双链体。相反，“多个”表示多于一个，无论它们是否是相同的序列。
[0050] 在一个实施方案中，通过酶或核酶消化non-shRNA前体产生短RNA双链体。所述酶可以是内切核酸酶。所述内切核酸酶可以是核糖核酸酶III家族的成员，如细菌核糖核酸酶III或切酶，或切酶样酶。
[0051] 在优选的实施方案中，non-shRNA是长的双链RNA(dsRNA)，或长的发夹RNA(lhRNA)。在一个实施方案中，所述non-shRNA包含与靶真核细胞中目的基因mRNA序列基本互补的序列。因为是基本互补，所以两条序列不必具有相同或类似的长度，并且100％或完全的互补性是基本互补性的一个实例。在一个实施方案中，所述non-shRNA前体包含针对目的基因的有效的RNAi序列。在特定实例中，所述有效RNAi序列是siRNA序列，但也不总是这样。不是与靶基因互补的每一siRNA在引发RNAi降解基因转录物中都有效。的确，费时的筛选对鉴定有效的siRNA序列通常是必须的。包含“基因的有效RNAi(或在一个实施方案中为siRNA)序列”或可以“有效沉默基因”的遗传物质能够基本降低基因表达的至少20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或高于90％，例如导致可观察到的表型改变。
[0052] 本发明还提供细菌，优选非致病性或治疗性细菌用于“屏蔽”或产生并将non-shRNA加工成有效的基因沉默产物以避开高等生物的免疫系统。本发明的细菌包含(a)non-shRNA，(b)编码所述non-shRNA的DNA，或(c)其两者。在一个实施方案中，所述前体包含非编码的长dsRNA。所述细菌还可包含能够将前体加工成siRNA的酶或核酶。所述酶可以是内切核酸酶如细菌核糖核酸酶III或切酶。在一个实施方案中，所述酶对细菌是内源的。在另一实施方案中，所述酶对细菌是外源的并通过表达该酶，例如切酶样酶的载体引入。
[0053] 细菌递送比病毒递送更具吸引力，因为其可以受抗生素和不能繁殖的减毒细菌菌株的控制。同样地，细菌更易于进行遗传操作，其允许产生特异用于某些应用的载体菌株。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法用于产生细菌，其以组织特异性方式引起基因寻靶。
[0054] 本发明的无毒菌可通过多种机制进入哺乳动物宿主细胞。与通过专门吞噬细胞吸收相反，其通常通过专门化溶酶体导致细菌的破坏，侵入性细菌菌株具有侵入非吞噬宿主细胞的能力。此类细菌的天然实例是细胞内病原体如利斯特氏菌(Listeria)、志贺氏菌(Shigella)和沙门氏菌(Salmonella)，但该性质也可通过转移侵入相关基因转移到其他细菌如大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌(Bifidobacteriae)，包括益生菌(P.Courvalin,S.Goussard,C.Grillot-Courvalin,C.R.Acad.Sci.Paris 318,1207(1995))。在本发明的其他实施方案中，用于向宿主细胞递送干扰RNA的细菌包括弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(D.R.Sizemore,A.A.Branstrom,J.C.Sadoff,Science 270,299(1995))、侵入性大肠杆菌(P.Courvalin,S.Goussard,C.Grillot-Courvalin,C.R.Acad.Sci.Paris 318,1207(1995),C.Grillot-Courvalin,S.Goussard,F.Huetz,D.M.Ojcius,P.Courvalin,Nat Biotechnol 16,862(1998))、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)(A.Al-Mariri A,A.Tibor,P.Lestrate,P.Mertens,X.De Bolle,J.J.Letesson Infect Immim
70,1915(2002))和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(M.Hense,E.Domann,S.Krusch,P.Wachholz,K.E.Dittmar,M.Rohde,J.Wehland,T.Chakraborty,S.Weiss,Cell Microbiol 3,599(2001),S.Pilgrim,J.Stritzker,C.Schoen,A.Kolb-Maurer,G.Geginat,M.J.Loessner,I.Gentschev,W.Goebel,Gene Therapy 10,2036(2003))。任何侵入性细菌用于DNA向真核细胞中转移(S.Weiss,T.Chakraborty,Curr Opinion Biotechnol 12,467(2001))。
70,1915(2002))和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(M.Hense,E.Domann,S.Krusch,P.Wachholz,K.E.Dittmar,M.Rohde,J.Wehland,T.Chakraborty,S.Weiss,Cell Microbiol 3,599(2001),S.Pilgrim,J.Stritzker,C.Schoen,A.Kolb-Maurer,G.Geginat,M.J.Loessner,I.Gentschev,W.Goebel,Gene Therapy 10,2036(2003))。任何侵入性细菌用于DNA向真核细胞中转移(S.Weiss,T.Chakraborty,Curr Opinion Biotechnol 12,467(2001))。
[0055] 在本发明实施方案中参考图1，在侵入性细菌并优选非致病性细菌中产生多种短RNA双链体的混合物，然后通过靶真核细胞进行吸收。首先，构建编码包含与靶基因mRNA序列基本互补的序列的non-shRNA的原核载体，例如质粒，并将其转化到细菌中。non-shRNA的表达受一个或多个原核启动子(例如T7)的控制。图1所示的质粒具有两个原核启动子。在其中non-shRNA是长dsRNA的实施方案中，各启动子控制dsRNA一条互补链的表达。将在实施例部分中并参考图3进一步详细描述示例性质粒。一旦non-shRNA前体在细菌中转录，其即被内源细菌核糖核酸酶III或外源切酶样酶消化成多个片段，例如短RNA双链体。当然，在任何给定时间，所述细菌可含有non-shRNA、消化片段(例如短RNA双链体)和编码RNA的DNA的混合物。
[0056] 仍然参考图1，在细菌侵入过程(“细菌感染”)中，通过靶真核生物的，例如通过内体吸收细菌。包括non-shRNA的消化产物(例如短RNA片段)的细菌内容物通过细菌裂解后在细胞质中释放，导致靶基因敲减或沉默。可通过表达切酶基因并在细菌中缺失核糖核酸酶III基因，用切酶替代细菌核糖核酸酶III。已经报道切酶使用所谓的“尺寸机理”将长dsRNA切割成12-30个核苷酸的更短片段。
[0057] 或者，将non-shRNA前体及其细菌消化产物引入真核细胞后，可将它们进一步加工并通过真核生物酶(包括真核细胞中的切酶)进行消化。这可通过来自non-shRNA的代谢产物促进有效RNAi。
[0058] 细菌DNA和RNA从细胞内细菌中的释放可根据细菌菌株通过多种机制发生。在一个实施方案中，所述细菌DNA和RNA可包含长dsRNA、短RNA双链体和/或dsRNA编码质粒的混合物。一种机制涉及鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中的III类输出系统，其为横跨细菌细胞膜的专门化多蛋白复合体，其功能包括向细胞外分泌毒力因子，以允许向靶细胞发放信号，但其也可用于向靶细胞中递送抗原(Rüssmann H.Int J Med Microbiol,293:107-12(2003))或通过细菌裂解并向细胞质中释放细菌内容物。通过加入细胞内活性抗生素(四环素)引发细胞内细菌的裂解，或通过细菌代谢衰减(营养缺陷型)或通过细胞内体或溶酶体自然发生。释放真核转录物质粒后，在靶细胞内产生dsRNA或siRNA，依次引发mRNA降解的高度特异过程，其导致靶基因的沉默。
[0059] 可使用天然侵入性病原体鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)进行本发明。在该实施方案的一方面，鼠伤寒沙门氏菌的菌株包括SL 7207和VNP20009(S.K.Hoiseth,B.A.D.Stacker,Nature 291,238(1981)；Pawelek JM,Low KB,Bermudes D.Cancer Res.57(20):4537-44(1997年10月15日))。
[0060] 在本发明的另一实施方案中，使用减毒大肠杆菌进行本发明。在该实施方案的一个实例中，大肠杆菌的菌株是BM 2710(C.Grillot-Courvalin,S.Goussard,F.Huetz,D.M.Ojcius,P.Courvalin,Nat Biotechnol 16,862(1998))。在该实施方案的一个特征中，通过侵入性质粒例如编码Inv基因的一个质粒来改造所述BM 2710菌株，以具有细胞侵入性质。根据本发明的另一特征，本发明的细菌含有具有Hly(利斯特氏菌溶素(listeria lysine)O)基因的载体，因为认为Hly蛋白质对遗传物质从输入小泡中逃逸是重要的。显然，所述载体可以是相同的侵入质粒。因此，在一个实施方案中，所述细菌具有编码Inv和Hly基因的质粒。在本发明的一方面，该质粒是pGB2inv-hly。在一个实例中，用于本发明的大肠杆菌菌株是BL21(DE3)pLysE。
[0061] 本发明还包括编码non-shRNA前体的原核载体或质粒与侵入性细菌一起使用，以在真核细胞中引起RNA干扰(RNAi)。在一个特征中，所述质粒还包括至少一个原核启动子，其控制non-shRNA(例如非编码长dsRNA)的表达。
[0062] 本发明还提供使用细菌，优选细菌的非致病性或治疗性菌株向真核细胞中引入短RNA双链体的混合物以在真核细胞中发挥RNA干扰(RNAi)作用的方法。该方法可通过有效的转录后沉默调整或调节靶细胞内的基因表达。所述真核细胞可以是哺乳动物细胞或鸟类细胞。目的基因可以是哺乳动物、鸟类、细菌、真核或病毒基因。
[0063] 本发明作为在体外和体内鉴定并确认途径组分和治疗靶标的研究工具，具有广泛的应用。本发明可用于所有类型的细胞，包括难以研究的细胞，如癌干细胞(CSC)。本发明系统也可用于产生RNAi文库，作为基因组范围或基因家族特异性靶标发现的工具。
[0064] 本发明还可用于开发治疗剂和药物。可通过本发明方法治疗的疾病和病征包括癌、细胞增殖疾病、病毒干扰、基因突变引起的疾病等。
[0065] 1.RNA干扰
[0066] RNA干扰(缩写为RNAi)是双链RNA(dsRNA)诱导的用于靶向降解单链RNA(ssRNA)的细胞过程。所述ssRNA是基因转录物，如信使RNA(mRNA)。RNAi是(大多数)转录后基因沉默的形式，其中dsRNA可特异性干扰具有与dsRNA互补的序列的基因的表达。dsRNA的反义RNA链靶向互补基因转录物，如信使RNA(mRNA)，用于通过RNA诱导沉默复合体(RISC)(其为含有多个蛋白质复合体的核糖核酸酶)中的核糖核酸酶进行切割。
[0067] RNAi已经显示为许多真核生物中的常见细胞过程。RISC以及切酶在真核结构域上保守。相信RNAi在对病毒和其他外源遗传物质的免疫应答中起作用。
[0068] 双链RNA(或dsRNA)是具有两条互补链的RNA。dsRNA形成一些病毒的遗传物质。在非哺乳动物细胞中，长dsRNA作为起始RNA干扰过程的引发剂起作用，在哺乳动物细胞中，更短RNA双链体必须用于避免非特异性先天免疫应答。在本发明的一个实施方案中，non-shRNA具有至少40bp的双链区域。在另一实施方案中，本发明的长dsRNA等于或长于30bp、40bp、45bp、50bp、70bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、1000bp或2000bp。
在一个实施方案中，所述长dsRNA不超过600bp、800bp、1500bp或2000bp。在一个实施方案中，本发明的dsRNA不含有任何错配或凸出。在另一实施方案中，本发明的dsRNA含有错配和/或凸出(bulge)。
在一个实施方案中，所述长dsRNA不超过600bp、800bp、1500bp或2000bp。在一个实施方案中，本发明的dsRNA不含有任何错配或凸出。在另一实施方案中，本发明的dsRNA含有错配和/或凸出(bulge)。
[0069] 小的干扰RNA(siRNA)是一类短双链RNA(dsRNA)分子，其在生物学中起多种作用。更值得注意的是，其参与RNA干扰(RNAi)途径，其中所述siRNA干扰特定基因的表达。此外，siRNA还在诸如抗病毒机制或形成基因组染色质结构的过程中起作用。siRNA具有相对短的具有2-3个核苷酸突出端(其具有5'-磷酸和3'-羟基末端)的双链RNA(dsRNA)区域。如本文所用，siRNA长约20-25个核苷酸。从non-shRNA(例如长dsRNA)产生的一些短RNA双链体可以是siRNA。
[0070] 发夹RNA(hRNA)是单链RNA分子，其含有两条互补序列形式的茎，和互补片段之间的环序列。由于正义和反义片段的互补性，此类RNA分子趋向处于具有单链RNA(环)区和双链RNA(dsRNA)区的发夹形状形式。(参阅例如Svoboda&Di Cara,Cell.Mol.Life Sci.63:901-918(2006))。
[0071] 如本文所用，短的发夹RNA(shRNA)是长度为50nt或更短的发夹RNA。可通过切酶将所述shRNA加工成siRNA，其然后整合到siRNA诱导沉默复合体(RISC)中。
[0072] 如本文所用，长发夹RNA(lhRNA)是长度超过60nt的发夹RNA。可通过切酶将所述lhRNA加工成多种更短RNA双链体，其可包含siRNA。在一个实施方案中，所述lhRNA的长度等于或长于70nt、80nt、100nt、150nt、200nt、400nt、700nt、1000nt、1500nt、2000、4000或8000nt。在可选实施方案中，所述lhRNA的dsRNA区域的长度等于或长于25bp、30bp、40bp、
50bp、70bp、100bp、200bp、300bp、500bp、600bp、700bp、1000bp、2000bp或4000bp。在一个实施方案中，本发明所述lhRNA的dsRNA区域不含有任何错配或凸出。在另一实施方案中，本发明所述lhRNA的dsRNA区域含有错配和/或凸出。(如上)
50bp、70bp、100bp、200bp、300bp、500bp、600bp、700bp、1000bp、2000bp或4000bp。在一个实施方案中，本发明所述lhRNA的dsRNA区域不含有任何错配或凸出。在另一实施方案中，本发明所述lhRNA的dsRNA区域含有错配和/或凸出。(如上)
[0073] 切酶是核糖核酸酶III核糖核酸酶家族的成员。切酶将长的双链RNA(dsRNA)、前microRNA(miRNA)和其他短发夹RNA(shRNA)切割成包括siRNA的短双链RNA片段。切酶催化RNA干扰途径中的第一步并起始RNA诱导沉默复合体(RISC)的形成，所述RNA诱导沉默复合体的催化组分argonaute是能够降解信使RNA(mRNA)的内切核酸酶，所述信使RNA(mRNA)的序列与siRNA引导链的序列互补。
[0074] 也在细菌中发现了核糖核酸酶III。细菌核糖核酸酶III将长的双链RNA(dsRNA)切割成约12-30个核苷酸长的siRNA，其具有与切酶产生的那些末端相同的末端。用细菌核糖核酸酶III产生的siRNA当递送到动物细胞中时也可起始RNA诱导沉默复合体(RISC)的形成，并引发RNAi。(Wang&Bechhofer,J Bacteriol.179:7379–7385(1997)；http://www.uni-giessen.de/～gf1265/GROUPS/KLUG/klug1_2.html)
[0075] 本发明提供消化产物，例如来自切酶/长dsRNA的核糖核酸酶III消化物的短RNA双链体的混合物(或“多样性”、“混合物”)，所述长dsRNA包含与靶信使RNA(mRNA)序列基本互补的序列。短RNA双链体的混合物在引发RNAi中与使用具有有效siRNA序列的单一类型siRNA分子至少一样有效。本发明由此一方面有利地排除了费时筛选的需要，所述筛选通常对鉴定有效的siRNA序列是必须的，并去除了对siRNA的递送挑战。
[0076] 2.产生、加工并向真核细胞递送RNA或编码RNA的DNA的细菌
[0077] 在本发明中，细菌不是简单的递送工具。更确切的，细菌可以进行合成、加工并递送基因寻靶RNA。能够合成并将诸如RNA分子的分子通过穿过细胞膜并进入细胞的细胞质，而递送到靶细胞的细胞质中的任何微生物可以用于向此类细胞中递送RNA。在优选的实施方案中，所述微生物是原核生物。在甚至更优选的实施方案中，所述原核生物是细菌。也处于本发明范围内的是除可用于向细胞递送RNA的细菌以外的微生物。例如，所诉微生物可以是真菌，例如Cryptococciis neoformans，原生动物，例如克鲁兹锥虫(Trypanosoma cruzi)、鼠弓浆虫(Toxoplasma gondii)、多氏利什曼虫(Leishmania donovani)和疟虫(plasmodia)。
[0078] 如本文所用，当指微生物，例如细菌时，术语“侵入性的”指能够向靶细胞递送至少一种分子，例如RNA或编码RNA的DNA分子的微生物。侵入性微生物可以是能够穿过细胞膜，由此进入所述细胞的细胞质，并向靶细胞递送至少一些其内容物，例如RNA或编码RNA的DNA的微生物。向靶细胞递送至少一种分子的过程优选不显著修饰侵入装置。在优选的实施方案中，所述微生物是细菌。优选的侵入性细菌是能够如通过进入真核细胞的细胞质向靶细胞递送至少一种分子，例如RNA或编码RNA的DNA分子的细菌。优选的侵入性细菌是或的细菌，例如活的侵入性细菌。侵入性微生物包括天然能够如通过穿过细胞膜，例如真核细胞膜并进入细胞质，而向靶细胞递送至少一种分子的微生物，以及非天然侵入性的但已经被修饰，例如遗传修饰而变得具侵入性的微生物。在另一优选实施方案中，可通过将细菌连接到“侵入因子”，也称为“进入因子”或“细胞质靶向因子”上来修饰非天然侵入性的微生物，使其变得有侵入性。如本文所用，“侵入因子”是当非侵入性细胞表达时致使细菌具有侵入性的因子，例如蛋白质或一组蛋白质。如本文所用，“侵入因子”由“细胞质靶向基因”编码。天然侵入性微生物，例如细菌可具有某些向性，即趋向优选的靶细胞。或者，可修饰，例如遗传修饰微生物，例如细菌，以模拟第二种微生物的向性。
[0079] 可根据本领域已知的方法测定至少一种分子向靶细胞的递送。例如，可通过杂交或PCR方法，或通过包括使用抗体的免疫方法检测分子的存在，由此沉默的RNA或蛋白质的表达降低。测定微生物是否具有用于本发明的足够的侵入性可包括测定相对于与宿主细胞接触的微生物数量，是否有足够的RNA向宿主细胞递送。如果RNA的量相对于所用微生物的数量较低，可期望进一步修饰微生物以提高其侵入性潜力。
[0080] 可通过多种方法测定细菌进入细胞。细胞内细菌在氨基糖苷类抗生素处理下存活，而细胞外细菌被快速杀死。可通过用抗生素庆大霉素处理单层细胞来灭活细胞外细菌，然后在用温和去污剂释放存活的细胞内生物并在标准细菌学培养基上测定有活力的数量前除去该抗生素，来完成对细菌吸收的定量评估。此外，例如通过细胞层的thin-section-transmission电子显微镜或通过免疫荧光技术直接观察细菌进入细胞(Falkow等(1992)Annual Rev.Cell Biol.8:333)。因此，多种技术可用于测定特定细菌是够能够侵入特定类型的细胞，或用于如修饰细菌的向性以模拟第二种细菌的向性的细菌修饰后，验证细菌的侵入。根据本发明方法递送RNA的细菌优选为非致病性的。然而，只要它们的致病性已经减毒，由此致使所述细菌对向其施用的受试者无害，也可使用病原菌。如本文所用，术语“减毒的细菌”指已经被修饰来显著减少或消除其对受试者的损害的细菌。可通过下文所述的多种方法减毒病原菌。
[0081] 不想受限于作用的特定机理，根据细菌类型，向真核细胞中递送RNA的细菌可进入细胞的多个区室。例如，所述细菌可以在小泡中，例如吞噬小泡中。一旦进入细胞，细菌可被破坏或裂解，并且其内容物可递送到真核细胞中。也可改造细菌表达吞噬体降解酶，以允许RNA从所述吞噬体中泄漏。在一些实施方案中，所述细菌在真核细胞中可保持活力不同时间，并可继续产生RNA。RNA或编码RNA的DNA然后可从细菌中例如通过泄漏释放到细胞中。在本发明的某些实施方案中，所述细菌也可以在真核细胞中复制。在优选的实施方案中，细菌复制对宿主细胞没有明显的毒性。本发明不限于通过特定机制递送RNA或编码RNA的DNA并且旨在包括允许通过不依赖的细菌递送机制合成和/或递送RNA或编码RNA的DNA的方法和组合物。
[0082] 下文所述的是在文献中已经描述为天然侵入性的细菌(部分2.1)，以及在文献中已经描述为天然非侵入性的细菌(部分2.2)，以及天然非致病性的或减毒的细菌的实例。尽管已经将一些细菌描述为非侵入性的(部分2.2)，这些根据本发明仍然是侵入性足够使用的。无论是否常规描述为天然侵入性的或非侵入性的，可修饰任何的细菌菌株以进行调节，尤其是增加其侵入性特征(例如在部分2.3中所述)。
[0083] 2.1天然侵入性细菌
[0084] 本发明使用的特定天然侵入性细菌并不是至关重要的。此类天然发生的侵入性细菌的实例包括，但不限于志贺氏菌属物种,沙门氏菌属物种,利斯特氏菌属物种,立克次氏体属物种(Rickettsia spp.)，和肠侵染性大肠杆菌。所用的特定志贺氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。
[0085] 可用于本发明的志贺氏菌株的实例包括弗氏志贺氏菌2a(ATCC No.29903)、Shigella sonnet(ATCC No.29930)，和Shigella disenteriae(ATCC No.13313)。减毒志贺氏菌株，如弗氏志贺氏菌2a 2457T aroA virG突变体CVD 1203(Noriega等，上文)、弗氏志贺氏菌M90T icsA突变体(Goldberg等Infect Immun.,62:5664-5668(1994))、弗氏志贺氏菌Y SFLl 14aroD突变体(Karnell等Vacc,10:167-174(1992))和弗氏志贺氏菌aroA aroD突变体(Verma等Vacc,9:6-9(1991))优选用于本发明。或者，可通过单独引入减毒突变或与其他一种或更多种额外减毒突变结合构建新的减毒志贺氏菌属物种菌株。
[0086] 志贺氏菌RNA疫苗载体的至少一个优势是其对结肠黏膜表面中淋巴组织的向性。此外，认为志贺氏菌复制的初始位点位于树状突细胞和巨噬细胞内，其通常见于黏膜淋巴组织中M细胞的基底侧面(McGhee,J.R.等Reproduction,Fertility,&Development 6:369(1994)；Pascual,D.W.等Immunomethods 5:56(1994)综述)。像这样，志贺氏菌载体可提供手段以在这些专门抗原呈递细胞中表达抗原的工具。志贺氏菌载体的另一优势是减毒的志贺氏菌菌株在体外和体内递送核酸报告基因(Sizemore,D.R.等Science 270:299(1995)；
Courvalin,P.等Comptes Rendus de 1Academie des Sciences Serie Ill-Sciences de Ia Vie-Life Sciences 318:1207(1995)；Powell,R.J.等在:Molecular approaches to the control of infectious diseases(1996)中.，F.Brown,E.Norrby,D.Burton和J.Mekalanos,编著Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.183；Anderson,R.J.等Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society for Microbiology:E.(1997))。在实践方面，志贺氏菌的严格限制的宿主特异性支持通过中间宿主防止志贺氏菌载体扩散到食物链中。此外，已经在啮齿类、灵长类和自生自长型(植物)中开发了高度减毒的减毒菌株(Anderson等(1997)上文；Li,A.等Vaccine 10:395(1992)；
Li,A.等Vaccine 11:180(1993)；Karnell,A.等Vaccine 13:88(1995)；Sansonetti,P.J.和J.Arondel Vaccine 7:443(1989)；Fontaine,A.等Research in Microbiology 141:907(1990)；Sansonetti,P.J.等(1991)Vaccine 9:416；Noriega,F.R.等Infection&Immunity
62:5168(1994)；Noriega,F.R.等Infection&Immunity 64:3055(1996)；Noriega,F.R.等Infection&Immunity 64:23(1996)；Noriega,F.R.等Infection&Immunity 64:3055(1996)；Kotloff,K.L.等Infection&Immunity 64:4542(1996))。该近来的认识将允许开发用于人的良好耐受的志贺氏菌载体。
Courvalin,P.等Comptes Rendus de 1Academie des Sciences Serie Ill-Sciences de Ia Vie-Life Sciences 318:1207(1995)；Powell,R.J.等在:Molecular approaches to the control of infectious diseases(1996)中.，F.Brown,E.Norrby,D.Burton和J.Mekalanos,编著Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.183；Anderson,R.J.等Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society for Microbiology:E.(1997))。在实践方面，志贺氏菌的严格限制的宿主特异性支持通过中间宿主防止志贺氏菌载体扩散到食物链中。此外，已经在啮齿类、灵长类和自生自长型(植物)中开发了高度减毒的减毒菌株(Anderson等(1997)上文；Li,A.等Vaccine 10:395(1992)；
Li,A.等Vaccine 11:180(1993)；Karnell,A.等Vaccine 13:88(1995)；Sansonetti,P.J.和J.Arondel Vaccine 7:443(1989)；Fontaine,A.等Research in Microbiology 141:907(1990)；Sansonetti,P.J.等(1991)Vaccine 9:416；Noriega,F.R.等Infection&Immunity
62:5168(1994)；Noriega,F.R.等Infection&Immunity 64:3055(1996)；Noriega,F.R.等Infection&Immunity 64:23(1996)；Noriega,F.R.等Infection&Immunity 64:3055(1996)；Kotloff,K.L.等Infection&Immunity 64:4542(1996))。该近来的认识将允许开发用于人的良好耐受的志贺氏菌载体。
[0087] 可使用化学性非特异性诱变，如使用试剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍；或使用重组DNA技术、经典的遗传技术(如Tn10诱变、P22-介导的转导、λ噬菌体介导的交换和接合转移)的非特异性诱变；或使用定点诱变的重组DNA技术，将减毒突变引入细菌性病原菌中。因为对重组DNA技术构建的菌株进行了更明确的定义，所以优选重组DNA技术。此类减毒突变的实例包括，但不限于：(i)营养缺陷性突变，如aro(Hoiseth等Nature,291:238-239(1981))、gua(McFarland等Microbiol.Path.,3:129-141(1987))、nad(Park等J.Bact,170:
3725-3730(1988)、thy(Nnalue等Infect.Immun.,55:955-962(1987))和asd(Curtiss,上文)突变；
3725-3730(1988)、thy(Nnalue等Infect.Immun.,55:955-962(1987))和asd(Curtiss,上文)突变；
[0088] (ii)灭活球形调节功能的突变，如cya(Curtiss等Infect.Immun.,55:3035-3043(1987))、crp(Curtiss等(1987),上文)、phoP/phoQ(Groisman等Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:7077-7081(1989)；和Miller等Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:5054-5058(1989))、phop(Miller等J.Bact,172:2485-2490(1990))或ompR(Dorman等Infect.Immun.,57:2136-2140(1989))突变；
[0089] (iii)修饰应激应答的突变，如recA(Buchmeier等MoI.Micro.,7:933-936(1993))、htrA(Johnson等Mol.Micro.,5:401-407(1991))、htpR(Neidhardt等
Biochem.Biophys.Res.Com.,100:894-900(1981))、hsp(Neidhardt等Ann.Rev.Genet,18:
295-329(1984))和groEL(Buchmeier等Sci.,248:730-732(1990))突变；
Biochem.Biophys.Res.Com.,100:894-900(1981))、hsp(Neidhardt等Ann.Rev.Genet,18:
295-329(1984))和groEL(Buchmeier等Sci.,248:730-732(1990))突变；
[0090] (iv)特定毒力因子中的突变，如IsyA(Libby等Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:489-493(1994))、pag或prg(Miller等(1990),上文；和Miller等(1989),上文)、iscA或virG(d'Hauteville等Mol.Micro.,6:833-841(1992))、plcA(Mengaud等Mol Microbiol.,5:
367-72(1991)；Camilli等J.Exp.Med,173:751-754(1991))，和act(Brundage等
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894(1993))突变；(v)影响DNA拓扑结构的突变，如top A(Galan等Infect.Immun.,58:1879-1885(1990))；
367-72(1991)；Camilli等J.Exp.Med,173:751-754(1991))，和act(Brundage等
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894(1993))突变；(v)影响DNA拓扑结构的突变，如top A(Galan等Infect.Immun.,58:1879-1885(1990))；
[0091] (vi)阻断或修饰细胞周期的突变，如min(de Boer等Cell,56:641-649(1989))。
[0092] (vii)引入编码自杀系统的基因，如sacB(Recorbet等App.Environ.Micro.,59:1361-1366(1993)；Quandt等Gene,127:15-21(1993))、nuc(Ahrenholtz等
App.Environ.Micro.,60:3746-3751(1994))、hok、gef、kil或phlA(Molin等
Ann.Rev.Microbiol.,47:139-166(1993))；
App.Environ.Micro.,60:3746-3751(1994))、hok、gef、kil或phlA(Molin等
Ann.Rev.Microbiol.,47:139-166(1993))；
[0093] (viii)改变脂多糖和/或脂类A的生物起源的突变，如rFb(Raetz in Esherishia coli and Salmonella typhimurium,Neidhardt等编著,ASM Press,Washington D.C.第1035-1063页(1996))、galE(Hone等J.Infect.Dis.,156:164-167(1987))和htrB(Raetz,上文)、msbB(Reatz,上文)
[0094] (ix)引入噬菌体溶解系统，如P22编码的溶源体(Rennell等Virol,143:280-289(1985))、λ胞壁质转糖基酶(Bienkowska-Szewczyk等Mol.Gen.Genet.,184:111-114(1981))或S基因(Reader等Virol,43:623-628(1971))；
[0095] 和
[0096] 减毒突变可组成型表达或处于诱导性启动子控制下，如启动子的温度敏感型热激家族(Neidhardt等上文)，或厌氧诱导的nirB启动子(Harbome等Mol Micro.,6:2805-2813(1992))或抑制型启动子，如uapA(Gorfinkiel等J.Biol.Chem.,268:23376-23381(1993))或gcv(Stauffer等J.Bact,176:6159-6164(1994))。
[0097] 所用的特定利斯特氏菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的利斯特氏菌菌株的实例包括单核细胞增生利斯特氏菌(ATCC No.15313)。减毒的利斯特氏菌株，如单核细胞增生利斯特氏菌actA突变体(Brundage等上文)或单核细胞增生利斯特氏菌plcA(Camilli等J.Exp.Med.,173:751-754(1991))优选用于本发明。或者，可通过引入上文描述志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒利斯特氏菌株。所用的特定沙门氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。
[0098] 可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(ATCC No.7251)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.13311)。减毒的沙门氏菌株优选用于本发明并包括伤寒沙门氏菌(S.typhi)-aroC-aroD(Hone等Vacc.9:810(1991)和鼠伤寒沙门氏菌-axoA突变体(Mastroeni等Micro.Pathol.13:477(1992))。或者，可通过引入上文描述志贺氏菌属物种的一个或多个减毒突变构建新的减毒沙门氏菌菌株。
[0099] 所用的特定立克次氏体菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的立克次氏体菌株的实例包括立氏立克次氏体(Rickettsia Rickettsiae)(ATCC No.VR149和VR891)、普氏立克次氏体(Ricketsia prowaseckii)(ATCC No.VR233)、恙虫热立克次氏体(Rickettsia tsutsugamuchi)(ATCC No.VR312,VRl 50和VR609)、摩氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)(ATCC No.VR144)、西伯利亚立克次氏体(Rickettsia )(ATCC No.VR151)和五日热立克次氏体(Rochalimaea quitana)(ATCC No.VR358)。减毒的立克次体菌株优选用于本发明，并可通过引入上文描述志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0100] 所用的特定肠侵染性大肠杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的肠侵染性大肠杆菌的实例包括大肠杆菌菌株4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和6-81(Sansonetti等Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur),132A:351-355(1982))。
[0101] 减毒的肠侵染性大肠杆菌菌株优选用于本发明并可通过引入上文描述志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0102] 此外，因为除细菌之外的某些微生物也可与整联蛋白分子(其为某些侵入因子的受体)相互作用用于细胞吸收，此类微生物也可用于向靶细胞中引入RNA。例如，病毒，例如口蹄病病毒、艾柯病毒和腺病毒，和真菌病原体，例如荚膜组织孢浆菌(Histoplasma capsulatum)和硕大利什曼原虫(Leishmania major)与整联蛋白分子相互作用。
[0103] 2.2较低侵入性的细菌
[0104] 可用于本发明并已经在文献中描述为非侵入性的或至少比前文部分(2.1)中列出的细菌侵入性弱的细菌的实例包括，但不限于耶尔森菌属物种(Yersinia spp.)、大肠杆菌属物种(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)、博德特氏菌属物种(Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌属物种(Neisseria spp.)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp.)、弗朗西丝氏菌属物种(Franciesella spp.)、棒杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、柠檬酸细菌属物种(Citrobacter spp.)、衣原体属物种(Chlamydia spp.)、嗜血菌属物种(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium spp.)、军团杆菌属物种(Legionella spp.)、红球菌属物种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、缠绕杆菌属物种(Helicobacter spp.)、弧菌属物种(Vibrio spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)和丹毒丝菌属物种
(Erysipelothrix spp.)。修饰这些细菌以增加它们的侵入潜力是必需的。细菌也可处于半活状态用于提高稳定性和/或效率。所用的特定耶尔森菌菌株对本发明并非是至关重要的。
(Erysipelothrix spp.)。修饰这些细菌以增加它们的侵入潜力是必需的。细菌也可处于半活状态用于提高稳定性和/或效率。所用的特定耶尔森菌菌株对本发明并非是至关重要的。
[0105] 可用于本发明的耶尔森菌菌株的实例包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(ATCC No.9610)或鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)(ATCC No.19428)。减毒的耶尔森菌菌株如小肠结肠炎耶尔森氏菌YeO3-R2(al-Hendy等Infect.Immun.,60:870-
875(1992))或小肠结肠炎耶尔森氏菌aroA(O'Gaora等Micro.Path.,9:105-116(1990))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒耶尔森菌菌株。
875(1992))或小肠结肠炎耶尔森氏菌aroA(O'Gaora等Micro.Path.,9:105-116(1990))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒耶尔森菌菌株。
[0106] 所用的特定大肠杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的大肠杆菌菌株的实例包括大肠杆菌H10407(Elinghorst等Infect.Immun.,60:2409-2417(1992))和大肠杆菌EFC4、CFT325和CPZ005(Donnenberg等J.Infect.Dis.,169:831-838(1994))。减毒的大肠杆菌菌株，如减毒的火鸡病原体大肠杆菌02carAB突变体(Kwaga等Infect.Immun.,62:3766-3772(1994))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒大肠杆菌菌株。
[0107] 所用的特定克雷伯氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。
[0108] 可用于本发明的克雷伯氏菌菌株的实例包括肺炎雷伯氏菌(K.pneumoniae)(ATCC No.13884)。减毒的克雷伯氏菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0109] 所用的特定博德特氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。
[0110] 可用于本发明的博德特氏 菌菌株的实例包括气管炎博德特氏 菌(B.bronchiseptica)(ATCC No.19395)。减毒的博德特氏菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0111] 所用的特定奈瑟氏球菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的奈瑟氏球菌菌菌株的实例包括脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(ATCC No.13077)和淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)(ATCC No.19424)。减毒的奈瑟氏球菌菌株，如淋病奈瑟氏球菌MS11 aro突变体(Chamberlain等Micro.Path.,15:51-63(1993))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒奈瑟氏球菌菌株。所用的特定气单胞菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的气单胞菌菌株的实例包括A.eucrenophila(ATCC No.23309)。或者可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒气单胞菌菌株。
[0112] 所用的特定弗朗西丝氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的弗朗西丝氏菌菌株的实例包括土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)(ATCC No.15482)。减毒的弗朗西丝氏菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0113] 所用的特定棒杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的棒杆菌菌株的实例包括假结核病棒杆菌(C.pseudotuberculosis)(ATCC No.19410)。减毒的棒杆菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0114] 所用的特定柠檬酸细菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的柠檬酸细菌菌株的实例包括弗氏柠檬酸细菌(C.freundii)(ATCC No.8090)。减毒的柠檬酸细菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0115] 所用的特定衣原体菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的衣原体菌株的实例包括C.pneumoniae(ATCC No.VRl 310)。减毒的衣原体菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0116] 所用的特定嗜血杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的嗜血杆菌菌株的实例包括H.sornmis(ATCC No.43625)。减毒的嗜血杆菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0117] 所用的特定布鲁氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的布鲁氏菌菌株的实例包括流产布鲁氏菌(B.abortus)(ATCC No.23448)。减毒的布鲁氏菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0118] 所用的特定分枝杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的分枝杆菌菌株的实例包括胞内分枝杆菌(M.intracelhilare)(ATCC No.13950)和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(ATCC No.27294)。减毒的分枝杆菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0119] 所用的特定军团杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的军团杆菌菌株的实例包括L.pneumophila(ATCC No.33156)。减毒的军团杆菌菌株，如L.pneumophila mip突变体(Ott,FEMS Micro.Rev.,14:161-176(1994))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒军团杆菌菌株。
[0120] 所用的特定红球菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的红球菌菌株的实例包括R.equi(ATCC No.6939)。减毒的红球菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0121] 所用的特定假单胞菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的假单胞菌菌株的实例包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(ATCC No.23267)。减毒的假单胞菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0122] 所用的特定缠绕杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的缠绕杆菌菌株的实例包括H.mustelae(ATCC No.43772)。减毒的缠绕杆菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。
[0123] 所用的特定沙门氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括伤寒沙门氏菌(ATCC No.7251)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.13311)。减毒的沙门氏菌菌株优选用于本发明并包括伤寒沙门氏菌aroC aroD(Hone等Vacc,9:810-816(1991))和鼠伤寒沙门氏菌aroA突变体(Mastroeni等Micro.Pathol,13:477-491(1992)))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒沙门氏菌菌株。所用的特定弧菌菌株对本发明并非是至关重要的。
[0124] 可用于本发明的弧菌菌株的实例包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(ATCC No.14035)和辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis)(ATCC No.35912)。减毒的弧菌菌株优选用于本发明并包括霍乱弧菌RSI毒力突变体(Taylor等J.Infect.Dis.,170:1518-1523(1994))和霍乱弧菌ctxA、ace、zot、cep突变体(Waldor等J.Infect.Dis.,170:278-283(1994))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒弧菌菌株。
[0125] 所用的特定杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的杆菌菌株的实例包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC No.6051)。减毒的杆菌菌株优选用于本发明并包括B.anthracis突变体pX01(Welkos等Micro.Pathol,14:381-388(1993))和减毒的BCG菌株(Stover等Nat,351:456-460(1991))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒杆菌菌株。
[0126] 所用的特定丹毒丝菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的丹毒丝菌菌株的实例包括猪丹毒丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(ATCC No.19414)和扁桃体丹毒丝菌(Erysipelothrix tonsillarum)(ATCC No.43339)。减毒的沙门氏菌菌株优选用于本发明并包括猪丹毒丹毒丝菌Kg-Ia和Kg-2(Watarai等J.Vet.Med.Sci.,55:595-600(1993))和猪丹毒丹毒丝菌ORVAC突变体(Markowska-Daniel等
Int.J.Med.Microb.Virol.Parisit.Infect.Dis.,277:547-553(1992))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒丹毒丝菌菌株。
Int.J.Med.Microb.Virol.Parisit.Infect.Dis.,277:547-553(1992))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒丹毒丝菌菌株。
[0127] 2.3用于增加菌株侵入性性质的方法
[0128] 无论已经将生物常规描述为侵入性的还是非侵入性的，可改造这些生物以增加它们的侵入性性质，例如通过模拟志贺氏菌属物种、利斯特氏菌属物种、立克次体属物种或肠侵染性大肠杆菌属物种的侵入性质。例如，可向微生物中引入使微生物能够进入细胞(例如所述非侵入性细菌的天然宿主中的细胞)的细胞质中的一个或多个基因。
[0129] 本文称为“细胞质靶向基因”的此类基因的实例包括编码能够通过志贺氏菌，或肠侵染性大肠杆菌的类似侵入基因，或利斯特氏菌的利斯特氏菌溶素O侵入的蛋白质的基因，像已知此类技术产生广泛的能够侵袭并进入动物细胞的细胞质中的侵入细菌一样(Foπnal等Infect.Immun.,46:465(1984)；Bielecke等Nature,345:175-176(1990)；Small等:Microbiology-1986,第121-124页,Levine等编著,American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1986)；Zychlinsky等Molec.Micro.,11:619-627(1994)；Gentschev等(1995)Infection&Immunity 63:4202；Isberg,R.R.和S.Falkow(1985)Nature 317:262；和Isberg,R.R.等(1987)Cell 50:769)。用于向细菌菌株中转移上述细胞质靶向基因的方法为本领域所熟知。可向细菌引入另一优选基因以增加其侵入特征，该基因编码来自假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵染素蛋白质，(Leong等EMBO J.,9:1979(1990))。侵染素也可与listeriolysin组合引入，由此，相对于引入任一这些基因，进一步增加细菌的侵入特征。为说明性目的，已经对上述基因做了描述；然而，对于本领域技术人员显而易见的是来自一种或更多种来源的任何基因或基因组合将足够，所述基因或基因组合参与将分子，尤其是RNA或编码RNA的DNA分子从微生物递送到细胞，例如动物细胞的细胞质中。因此，此类基因不限于细菌基因，并包括病毒基因，如流感病毒血凝素HA-2，其促进胞内体裂解作用(endosmolysis)(Plank等J.Biol.Chem.,269:12918-12924(1994))。也可通过例如PCR扩增从DNA获得上述靶向细胞质的基因，从携带期望的靶向细胞质的基因的侵入性细菌中分离所述DNA。可从本领域，例如上文列出的参考文献和/或在因特网
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)上可公开获得的GenBank中获得的核苷酸序列设计PCR的引物。
可设计PCR引物以扩增细胞质靶向基因、细胞质靶向操纵子、细胞质靶向基因簇或细胞质靶向基因调节子。所用的PCR策略将依赖于细胞质靶向基因或靶侵入性细菌中基因的遗传结构。设计PCR引物，使其含有与靶DNA序列开始和末端的DNA序列同源的序列。然后可以例如通过使用Hfr转移或质粒活动(Miller,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1992)；Bothwell等上文；
和Ausubel等上文)、噬菌体介导转导(de Boer,上文；Miller,上文；和Ausubel等上文)、化学转化(Bothwell等上文；Ausubel等上文)、电穿孔(Bothwel等上文；Ausubel等上文；和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)和物理转化技术(Johnston等上文；和Bothwell,上文)将细胞质靶向基因引入靶细菌菌株中。细胞质靶向基因可整合到可溶性噬菌体中(de Boer等Cell,56:641-649(1989)),质粒载体s(Curtiss等上文)或剪接到靶菌株的染色体中(Hone等上文)。
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)上可公开获得的GenBank中获得的核苷酸序列设计PCR的引物。
可设计PCR引物以扩增细胞质靶向基因、细胞质靶向操纵子、细胞质靶向基因簇或细胞质靶向基因调节子。所用的PCR策略将依赖于细胞质靶向基因或靶侵入性细菌中基因的遗传结构。设计PCR引物，使其含有与靶DNA序列开始和末端的DNA序列同源的序列。然后可以例如通过使用Hfr转移或质粒活动(Miller,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1992)；Bothwell等上文；
和Ausubel等上文)、噬菌体介导转导(de Boer,上文；Miller,上文；和Ausubel等上文)、化学转化(Bothwell等上文；Ausubel等上文)、电穿孔(Bothwel等上文；Ausubel等上文；和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)和物理转化技术(Johnston等上文；和Bothwell,上文)将细胞质靶向基因引入靶细菌菌株中。细胞质靶向基因可整合到可溶性噬菌体中(de Boer等Cell,56:641-649(1989)),质粒载体s(Curtiss等上文)或剪接到靶菌株的染色体中(Hone等上文)。
[0130] 如上所述，除了遗传改造细菌提高其侵入性性质外，也可通过将侵入因子与细胞连接，以修饰细菌。因此，在一个实施方案中，通过用侵入因子，例如具有足够侵入力的蛋白质侵染素、侵染素衍生物或其片段共价或非共价包被细菌致使细菌更具侵入性。事实上，已经显示用来自假结核耶尔森氏菌的纯化侵染素包被非侵入性细菌细胞或侵染素的羧基末端192个氨基酸能够进入哺乳动物细胞(Leong等EMBO J.9:1979(1990))。此外，侵染素的羧基末端区包被的乳胶球被哺乳动物细胞有效内化，如用抗体固定的侵染素包被的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株(综述见于Isberg和Trail van Nhieu Ann.Rev.Genet.27:395(1994))。或者，也可用特异性结合细菌进入因子识别的表面分子的抗体、其变体或其片段包被细菌。例如，已经显示如果用针对整联蛋白分子，例如α5β1(称作与细菌侵染素蛋白质相互作用的表面分子)的单克隆抗体包被细菌，那么它们则被内化(Isberg和Tran van Nhieu,上文)。可根据本领域已知的方法制备此类抗体。通过例如用抗体包被细菌，使细菌与具有抗体识别的表面受体的真核细胞接触，并根据上述方法监测细胞内细菌的存在来检测抗体在调节细菌侵入力中的功效。用于连接侵入因子与细菌表面的方法为本领域所知，包括交联。
[0131] 3.靶细胞
[0132] 本发明提供用于合成、加工并向任何类型的靶细胞递送RNA的方法。如本文所用，术语“靶细胞”指细菌侵入的细胞，即具有用于细菌识别必需的表面受体的细胞。
[0133] 优选地，靶细胞是真核细胞。甚至更优选地，靶细胞是动物细胞。将“动物细胞”定义为来自或存在于多细胞生物中的有核的，不含叶绿体细胞，所述多细胞生物的分类(taxanomic)位置位于动物国界。该细胞可以存在于完整动物、原代细胞培养物、外植体培养物或转化的细胞系中。该细胞的特定组织来源并非对本发明至关重要。用于本发明的受体动物细胞对其并非至关重要，并包括出现在动物国界内的所有生物中的或来自动物国界内的所有生物，如哺乳类、鱼类、鸟类、爬行类的那些生物。
[0135] 在优选的实施方案中，靶细胞是黏膜表面。某些肠病原体，例如大肠杆菌、志贺氏菌、利斯特氏菌和沙门氏菌自然适合用于该应用，因为这些生物具有粘着并侵入宿主黏膜表面的能力(Kreig等上文)。因此，在本发明中，此类细菌可向宿主黏膜区室中的细胞递送RNA分子或编码RNA的DNA。
[0136] 尽管某些类型的细菌具有某一向性，即趋向优选的靶细胞，可通过选择对期望的细胞类型具有向性的细菌或被修饰以能够侵入期望细胞类型的细菌完成RNA或编码RNA的DNA向某一类型细胞的递送。因此，如上讨论，例如可遗传改造细菌以模拟黏膜组织向性和侵入性性质，由此允许所述细胞侵入黏膜组织，并向这些位点中的细胞递送RNA或编码RNA的DNA。
[0137] 细菌也可靶向其他类型的细胞。例如，可通过修饰细菌以在其表面上表达间日疟虫(Plasmodium vivax)网织红细胞结合蛋白质-1或-2，或-1和-2(其特异性结合人和灵长类中的红细胞)，而使细菌靶向人和灵长类的红细胞(Galinski等Cell,69:1213-1226(1992))。在另一实施方案中，修饰细菌以在其表面上具有脱唾液酸血清类黏蛋白，其为肝细胞上脱唾液酸糖蛋白受体的配体(Wu等J.Biol.Chem.,263:14621-14624(1988))。在另一实施方案中，用已经显示靶向质粒吸收到具有胰岛素受体的细胞的胰岛素多聚L赖氨酸包被细菌(Rosenkranz等Expt.Cell Res.,199:323-329(1992))。还在本发明范围内的是被修饰以在其表面上具有允许肝细胞具有向性的单核细胞增生利斯特氏菌的p60(Hess等Infect.Immun.,63:2047-2053(1995))或来自通过结合肝素、硫酸肝素和胶原引起特异性结合哺乳动物细胞外基质的克鲁兹锥虫(Trypanosoma cruzi)的60kD表面蛋白(Ortega-Barria等Cell,67:411-421(1991))的细菌。
[0138] 在另一实施方案中，细胞可被修饰以变成递送RNA的细菌的靶细胞。因此，可修饰细胞以表达细菌识别的表面抗原(即侵入因子的受体)，用于其进入细胞。可通过向细胞中引入编码侵入因子的受体的核酸修饰细胞，使得表面抗原在期望条件下表达。或者，可用侵入因子的受体包被细胞。侵入因子的受体包括属于整联蛋白受体超家族的蛋白质。多种细菌和其他微生物识别的整联蛋白受体类型的列表可见于例如Isberg和Tran Van Nhieu Ann.Rev.Genet.27:395(1994)。用于整联蛋白亚基的核苷酸序列可见于例如在因特网上可公共获得的GenBank。
[0139] 如上所述，其他靶细胞包括鱼类、鸟类和爬行类动物细胞。下文中描述了对鱼类、鸟类和爬行类动物细胞具有天然侵入性的细菌的实例。
[0140] 可天然进入鱼类细胞细胞质的细菌的实例包括，但不限于气单胞菌(Aeromonassalminocida)(ATCC No.33658)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas schuberii)(ATCC No.43700)。减毒的细菌优选用于本发明，并包括A.salmonicidia vapA(Gustafson等J.MoI.Biol.,237:452-463(1994))或A.salmonicidia芳香族依赖性突变体(Vaughan等Infect.Immun.,61:2172-2181(1993))。
[0141] 可天然进入鸟类细胞细胞质的细菌的实例包括，但不限于鸡沙门氏菌(Salmonella galinarum)(ATCC No.9184)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)(ATCC No.4931)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.6994)。减毒的细菌优选于本发明并包括减毒的沙门氏菌菌株如鸡沙门氏菌(S.galinarum)cya crp突变体(Curtiss等(1987)上文)或肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)aroA芳香族依赖性突变体CVL30(Cooper等Infect.Immun.,
62:4739-4746(1994))。
62:4739-4746(1994))。
[0142] 可天然进入爬行类动物细胞细胞质的细菌的实例包括，但不限于鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No.6994)。减毒的细菌优选用于本发明并包括减毒的菌株如鼠伤寒沙门氏菌芳香族依赖性突变体(Hormaeche等上文)。
[0143] 本发明还提供向其他真核细胞例如植物细胞递送RNA，只要具有天然或已被修饰变得具有侵入性后能够侵入此类细胞的微生物。可侵入植物细胞的微生物的实例包括根瘤农杆菌(Agrobacterium tumerfacium)，其使用通过特异受体结合植物细胞的菌毛样结构，然后通过与细菌结合类似的过程向植物细胞中递送至少一些其内容物。
[0144] 下文说明的是根据本发明方法可向其中递送RNA的细胞系。
[0145] 人类细胞系的实例包括但不限于ATCC No.CCL 62、CCL 159、HTB 151、HTB 22、CCL 2、CRL 1634、CRL 8155、HTB 61和HTB104。
[0146] 牛细胞系的实例包括ATCC No.CRL 6021、CRL 1733、CRL 6033、CRL 6023、CCL 44和CRL 1390。绵羊细胞系的实例包括ATCC No.CRL 6540、CRL 6538、CRL 6548和CRL 6546。
[0147] 猪细胞系的实例包括ATCC No.CL 184、CRL 6492和CRL 1746。
[0148] 猫细胞系的实例包括CRL 6077、CRL 6113、CRL 6140、CRL 6164、CCL 94、CCL 150、CRL 6075和CRL 6123。
[0149] 水牛细胞系的实例包括CCL 40和CRL 6072。
[0150] 犬细胞系的实例包括ATCC No.CRL 6213、CCL 34、CRL 6202、CRL 6225、CRL 6215、CRL 6203和CRL 6575。
[0151] 山羊来源细胞系的实例包括ATCC No.CCL 73和ATCC No.CRL 6270。
[0152] 马来源细胞系的实例包括ATCC No.CCL 57和CRL 6583。
[0153] 鹿细胞系的实例包括ATCC No.CRL 6193-6196。
[0154] 灵长类来源细胞系的实例包括来自黑猩猩的那些细胞系，如ATCC No.CRL 6312、CRL 6304和CRL 1868；猴细胞系如ATCC No.CRL 1576、CCL 26和CCL 161；猩猩(orangautan)细胞系ATCC No.CRL 1850；和大猩猩细胞系ATCC No.CRL 1854。
[0155] 3.1癌干细胞和非癌干细胞
[0156] 癌干细胞(CSC)是癌细胞的亚群，所述癌细胞具有通常与干细胞相关的特征，如自我更新以及分化成多种细胞类型的能力。近期研究揭示CSC是高度致瘤的，而大量癌细胞是非致瘤的。根据这些研究，CSC尽管仅占肿瘤细胞的一小部分(通常低于1％)，但却是持续恶性瘤生长的根本原因并经常成为转移的引发剂。CSC易于对抗医院中目前常用的化学治疗及其他肿瘤靶向治疗。
[0157] CSC也难以分离，而且还难以培养用于实验室目的。需要特殊的分离方法，并且该细胞易于在培养中极其快地失去干细胞特性。因此，通常仅有窄的面用于体外CSC实验。然而，如下文实施例部分中所述的实例中所示，本发明的方法甚至在分离的干细胞中引起基因沉默中显示令人惊讶的潜能和特异性。
[0158] 具体地，携带根据本发明构建的载体的细菌显著降低了靶基因(分别为CSCP1和CSCP3)的表达。靶细胞的表型变化，例如凋亡(实施例3和4)和球形成(spherogenesis)抑制(实施例5)也起因于本发明细菌对细胞的处理，提供所述靶基因在细胞存活、分裂和死亡程序中起重要作用的确证。
[0159] 因为在微小细胞群和不可培养细胞群中具有引起基因沉默的确证能力， 技术为体外靶向/途径发现并为在包括癌干细胞和共有一些CSC特性的非癌干细胞的任何细胞群中设计治疗方案提供平台。
[0160] 本发明还提供这样的实例，其中非CSC癌细胞，即“正常”或分化癌细胞中的实质细胞死亡起因于本发明(实施例6)的细菌的处理，进一步证实了本发明的治疗潜力。
[0161] 4.体内和体外研究和药物开发
[0162] 本发明的RNAi方法也可用于产生暂时的“敲减”遗传动物模型，例如小鼠模型，这与遗传改造以在体内发现和/或确认基因功能的敲除模型相反。
[0163] 目前，没有用于体内靶标确认的好系统。目前的敲除动物模型费时，劳动强度大，并需要在胚胎期进行基因寻靶。此外，目前的敲除动物模型不能用于检测体内确定的肿瘤。目前的RNAi递送方法也不适合于体内靶标确认。相反，本发明的细菌介导的RNAi方法利用适合于例如在确定肿瘤中快速并有效的体内靶标确认的系统。具体地，细菌比病毒载体容易控制并靶向。此外，本发明方法模仿治疗干涉。
[0164] 例如，具有异种移植的人肿瘤的转基因小鼠可用作敲减动物模型以通过使用本发明载体和细菌确认候选治疗的效率。此类非致病性菌一旦引入动物模型，将产生non-shRNA的加工产物，例如肿瘤细胞中针对靶基因的mRNA的短RNA双链体的混合物。这提供进行基因敲减分析和检测候选治疗的抗肿瘤活性的工具。
[0165] 可使用本发明容易地完成体外靶标确认。在一个实施方案中，测定在已经鉴定表型(例如癌生长)的靶标后包括以下步骤：构建编码non-shRNA(例如长dsRNA)的载体，所述non-shRNA包含与该靶基因的mRNA基本互补的序列；用所述载体转化活的侵入性细菌；用所述活的侵入性细菌体外转染癌细胞；并观察细胞增殖是否受到影响。
[0166] 本发明的方法也可用作研究和药物开发的体外转染工具。
[0167] 这些体内和体外方法使用具有期望性质(侵入力、减毒、可控性)的细菌。例如双歧杆菌(Bifidobacteria)和利斯特氏菌用于进行本发明的细菌介导的RNAi方法。使用质粒将侵入力以及一个或几个dsRNA的真核或原核转录物赋予细菌。
[0168] 5.药物组合物
[0169] 在本发明优选的实施方案中，含有RNA分子和/或编码此类分子的DNA的侵入性细菌通过静脉、肌内、皮内、腹膜内、经口、鼻内、眼内、直肠内、阴道内、骨内、口腔、浸入和尿道内灌输(inoculation)途径引入动物内。
[0170] 待向受试者施用的本发明的活的侵入性细菌的量根据受试者的类别，以及待治疗的疾病或病征不同而不同。通常，所用的剂量将是每个受试者约103到1015活菌，优选约104到1012活菌。可以冻干或孢子形式制备细菌，用于储存或药学用途。
[0171] 本发明的侵入性细菌通常与可药用载体和/或稀释剂一起施用。所用的特定可药用载体和/或稀释剂对本发明并非至关重要。稀释剂的实例包括磷酸缓冲盐水、缓冲胃中胃酸的缓冲液，如含有蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0)、单独的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)(Levine等J.Clin.Invest,79:888-902(1987)；和Black等J.Infect.Dis.,155:1260-1265(1987))，或含抗坏血酸、乳糖和任选地天冬苯丙二肽酯的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)(Levine等Lancet,11:467-470(1988))。载体的实例包括例如在脱脂牛奶中发现的蛋白质、糖(例如蔗糖)或聚乙烯吡咯烷酮。通常将以约0.1-30％(w/v)，但优选1-10％(w/v)范围内的浓度内使用这些载体。
[0172] 下文所示是可用于递送特异途径的其他可药用载体或稀释剂。任何此类载体或稀释剂可用于施用本发明的细菌，只要所述细菌仍然能够侵入靶细胞。可进行体外或体内测试侵入力来确定适当的稀释剂和载体。可配制本发明的组合物用于多种类型的施用，包括全身和局部施用或定域施用。也可包括冻干形式，只要细菌在接触靶细胞或向受试者施用后具有侵入性。技术和配制通常可见于Remmington's Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Pa。对于全身施用，优选注射，包括肌内、静脉、腹膜内和皮下施用。对于注射，可在液体溶液中，优选在生理学相容的缓冲液如Hank's溶液或Ringer's溶液中配制本发明的组合物，例如细菌。
[0173] 对于口服给药，药物组合物可以采取例如通过利用可药用赋形剂，如结合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)的常规手段制备的片剂或胶囊剂形式。可通过本领域所熟知的方法包被所述片剂。用于口服给药的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式，或者它们可呈现为干产品，在使用前用水或其他合适的载体构建。可通过利用可药用添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油酯类(oily esters)、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)，用常规方法制备此类液体制剂。所述制剂也含有缓冲盐、增味剂、着色剂，适当时还含有甜味剂。
[0174] 可适当地配制用于口服施用的制剂，以给出活性化合物的可控释放。对于口腔施用，所述组合物可采取常规方式配制的片剂或锭剂形式。
[0175] 对于吸入施用，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体，以呈现自加压包装或喷雾器的喷雾剂形式常规递送根据本发明使用的药物组合物。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门递送测定量来确定剂量单元。可配制用于吸入器或吹出器中例如明胶的胶囊和药筒，所述吸入器或吹出器含有组合物的粉剂混合物，例如细菌和合适的粉剂基质，如乳糖或淀粉。
[0176] 可配制药物组合物用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注来进行肠胃外施用。可以单位剂量形式，例如在安瓿或含有添加防腐剂的多剂量容器中提供用于注射的制剂。所述组合物可采取这样的形式，如油载体或水载体中的悬浮液、溶液或乳剂，并可含有配制剂(fomiulatory agent)，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使用前用合适载体，例如灭菌注射用水构建的粉剂形式。
[0177] 也可在直肠、阴道内或尿道内组合物中配制药物组合物，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯类的栓剂或保留灌肠剂。全身施用也可通过经黏膜或经皮途径。对于经黏膜或经皮施用，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常为本领域所知，并包括例如用于经黏膜施用胆汁盐和夫西地酸衍生物。此外，去污剂也用于促进渗透。经黏膜施用可通过鼻腔喷雾或使用栓剂。对于局部施用，本发明细菌可配制成本领域通常已知的软膏剂、药膏、凝胶或膏状物，只要所述细菌在接触靶细胞后仍然具有侵入性。
[0178] 如果需要，可在含有一个或多个单位剂量形式的包装或分配装置和/或药盒中提供组合物，所述单位剂量形式含有活性成分。所述包装例如包含金属或塑料薄片，如泡罩包装。所述包装或分配装置可具有用于施用的说明书。
[0179] 含有待引入的RNA或编码RNA的DNA的侵入性细菌可用于感染在体外培养的动物细胞，如从受试者获得的细胞。然后可将这些体外感染的细胞经过静脉内、肌内、皮内或腹膜内，或通过允许细胞进入宿主组织的任何灌输途径引入动物，例如所述细胞最初来源的受试者。当向个体细胞中递送RNA时，所施用的活生物的剂量是每个细胞约0.1到106，优选约102到104细菌的多重性感染。
[0180] 在本发明的另一实施方案中，细菌也可向细胞，例如然后可从中收集或纯化蛋白质的动物细胞中递送编码蛋白质的RNA分子。例如，可在组织培养细胞中产生蛋白质。
[0181] 6.治疗和预防用途
[0182] 本发明的RNAi方法可用于治疗和/或预防多种疾病，包括总结于Dykxhoorn,Novina&Sharp.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4:457-467(2003)；Kim&Rossi,Nature Rev.Genet.8:173-184(2007)；de Fougerolles,等Nature Rev.Drug Discov.6:443-453(2007)中的疾病。
[0183] 在一个实施方案中，本发明可用作癌治疗或预防癌。该方法受沉默或敲减基因的影响，所述基因参与细胞增殖或其他癌表型。用于癌治疗的本发明的细菌优选为改造以安全搜出并杀死肿瘤的细菌(Forbes,Nature Biot echnology 24:1484-1485(2006)。所述细菌可以是专性厌氧菌，如梭菌(Clostridium)novyi-NT，或兼性厌氧菌，如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌(如上)。
[0184] 这些基因的实例是k-Ras和β-联蛋白。具体地，k-Ras和β-联蛋白是基于RNAi的结肠癌的治疗的靶标。这些致癌基因是有活力的并在大多数临床情况中是相关的。本发明的细菌介导的RNAi方法应用于到达肠道的结肠癌的治疗和预防。这些方法也用于治疗携带异种移植肿瘤的动物，以在肠肿瘤发生的k-RasV12模型中治疗和预防癌，并在腺瘤性结肠息肉病min小鼠模型(APC-min模型)中预防和治疗肿瘤。在该模型中，所述小鼠具有有缺陷的APC基因，导致许多肠息肉和结肠息肉的形成，其用作人熟悉的肠肿瘤发生的腺瘤性结肠息肉病(FAP)的动物模型。
[0185] 本发明的RNAi方法也可用于治疗或预防病毒性疾病(例如肝炎)和遗传病征。
[0186] 本发明的RNAi方法也可用于产生用于待使用的癌预防性“益生菌”，其尤其具有GI道或肝的靶标。本发明的RNAi方法用作针对炎症疾病，例如肝炎、炎性肠病(IBD)或结肠炎的治疗。这些方法用于沉默或敲减非癌基因靶标(病毒基因，用于治疗和预防乙肝、丙肝；炎性基因，用于治疗和预防炎性肠病)和其他基因靶标。
[0187] 本发明的RNAi方法可用于向消化道和结肠中递送基因沉默(称为结肠癌治疗和预防)，并在多种疾病的治疗中用于经口应用。在该实施方案的另一方面，基因沉默的递送是经肠外的。
[0188] 细菌产生和/或递送的dsRNA可用于治疗病毒感染，如HIV、HBV、HCV或其他疾病，其中可鉴定引起特定疾病的基因。因为本发明不需要鉴定对引起特定疾病的基因有效的精确siRNA序列，无论该基因是内源的还是病毒的，本发明的方法针对治疗经常突变或具有许多亚基因型的疾病基因或菌株尤其有利。典型的实例是携带经常突变的基因的HIV。
[0189] 7. 文库
[0190] 本发明还提供称为“ 文库”的RNAi文库，其可以是基因组范围的或是基因家族特异性的。 文库是随机构建、双链、自混合、大小可控的RNAi文库。体外细胞系统RNAi文库筛选基于本发明的细菌RNAi系统及显微镜成像分析。与目前的siRNA/shRNA文库(需要关于“好的”siRNA序列的先验知识并且对某些细胞类型(例如分裂细胞和具有病毒受体的细胞)的应用有限)相比，本发明的 文库可以靶向已知或未知的基因，并可应用于宽范围的细胞类型。此外，本发明的 文库适合于体内确认。
[0191] 在实施方案中，参考图2，本发明的 文库包含多个载体，各载体包含来自cDNA文库的一个cDNA分子或cDNA片段、第一个启动子和第二个启动子；其中所述第一个启动子控制所述cDNA分子或cDNA片段的一条链的表达，第二个启动子控制所述cDNA分子或cDNA片段的另一条链的表达。cDNA片段可获自cDNA分子的酶消化。在一个实施方案中，通过酶消化产生约500bp的cDNA片段。所构建的载体可用于转化细菌细胞。一旦载体转录来自cDNA序列或cDNA片段的dsRNA，所述细菌细胞将dsRNA加工成如前所述的更短的RNA双链体的混合物。在细菌感染靶细胞后，可选择显示期望的表型变化的细胞用于进一步鉴定遗传靶标。cDNA库或文库可来自哺乳动物细胞的总mRNA，或基因家族或基因的mRNA。
[0192] 本发明进一步提供筛选RNAi文库的方法。本发明包含用 文库感染哺乳动物细胞，并鉴定具用至少一种表型变化的哺乳动物细胞。所述至少一种表型变化选自细胞核数目、细胞核形态、细胞死亡、细胞增殖、DNA片段化、细胞表面标记和有丝分裂指数。本发明还包括在鉴定的哺乳动物细胞内对载体的cDNA分子进行测序。
[0193] RNAi文库可用于大范围上筛选疾病相关的药物靶标并确认潜在的治疗性分子药物靶标。它能够用于评估所有人基因的功能并在对靶向基因未知的前体下进行功能性基因组学实验。它也可用于在横跨不同疾病的相关细胞测定中进行无偏差分析，并推论疾病中基因功能多维关系。
[0194] 目前该领域中使用的RNAi文库包括混合的化学合成siRNA文库、基于病毒载体的shRNA文库；和双链RNA(dsRNA)体外消化混合物。这些文库需要针对已知基因逐一构建或合成。它们通常大小受限，并且其中大部分甚至不可更新。在筛选时，需将这些文库转染至细胞体系中。
[0195] 本发明提供产生并筛选RNAi文库的简易方法。它将文库构建过程简单化。为了构建RNAi文库，不需要逐一构建质粒。本发明还去除了费时且令人厌烦的产物纯化步骤。此外，本发明可直接通过细胞感染递送RNAi，由此大大降低了文库筛选的成本。
[0196] 文库可以是在整个基因组或基因家族上可操作的。对于各靶标，它具有短RNA双链体的自混合混合物，而不是单一siRNA。因此，不需要逐一合成siRNA，并不需验证siRNA的有效序列。(Zhao HF,等,Nature Methods 2:967–973(2005))。本发明可避免N末端功能，并由此导致彻底的功能敲减。 文库的筛选是基于选择的双盲筛选，且无偏差，即充分平衡遗传信息。此外，使用 文库易于回踪以找到候选基因。在一个在实施方案中，可使用 文库在转基因及野生型动物中筛选用于治疗性实验的不同的癌症相关靶标。
[0197] 通过以下不应以任何形式解释为限制的实施例来进一步说明本发明。包括该申请全文中引用的文献、授权的专利、公开的专利申请的所有引用参考文献的内容因此明确地引入作为参考，但不认为它们是本发明之前的现有技术。除非另行说明，本发明的实践将使用本领域技术中的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。在参考文献中详细解释了此类技术。参阅，例如由Sambrook,Fritsch和Maniatis编著的Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)；DNA Cloning,第I卷和第II卷(D.N.Glover编著,1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编著,1984)；Mullis等美国专利号:4,683,195；
Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins 编著1984)；Culture Of Animal Cells
(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,
1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos编著,1987,Cold Spring Harbor
Laboratory)；Methods In Enzymology,第154卷和第155卷(Wu等编著),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker,编著,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和
C.C.Blackwell,编著,1986)；Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
实施例
Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins 编著1984)；Culture Of Animal Cells
(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,
1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos编著,1987,Cold Spring Harbor
Laboratory)；Methods In Enzymology,第154卷和第155卷(Wu等编著),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker,编著,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和
C.C.Blackwell,编著,1986)；Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
实施例
[0198] 下文提供实施例，以进一步说明本发明的不同特征。所述实施例也阐明用于实践本发明的有用方法。这些实施例不限制本发明。
[0199] 材料和方法
[0200] 质粒
[0201] 参考图3，构建 质粒以包括具有两个T7启动子的RNAi表达盒。通过两个XbaI位点将期望的DNA分子克隆至质粒中。
[0202] 例如，从Origene Technologies购买CSCP3/STAT3和CSCP1/β联蛋白质粒。将人STAT3基因(GenBank登录号NM_139276)的782bp片段(从1至782位核苷酸)或CSCP3/STAT3的约300bp片段(从11至311位核苷酸)插入到RNAi盒中。在以下实施例中使用的特定质粒构建体包含CSCP3/STAT3基因的300bp片段，使用如下引物将其克隆至
基础 质粒中：
基础 质粒中：
[0203] CSCP3/STAT3-TPIV正向5’-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC-3’(SEQ ID NO:1)[0204] CSCP3/STAT3-TPIV反向5’-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG-3’(SEQ ID NO:2)[0205] 对于CSCP1/β 质粒，使用标准分子克隆技术将全长人β联蛋白基因(GenBank登录号NM_001904)的567 bp片段(215至783位核苷酸)插入到 质粒的
RNAi表达盒中。
RNAi表达盒中。
[0206] 对于载体构建，按照标准分子生物学技术将T7终止子复性，并用BamHI/XbaI或XbaI/SalI消化。随后使用以下引物将终止子克隆至 载体的BamHI/XbaI或XbaI/SalI位点：
[0207] BamHI正向：
[0208] 5′ACGGATCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGGATCCAC 3’(SEQ ID NO：3)
[0209] BamHI反向：
[0210] 5’GTGGATCCTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGATCCGT 3’(SEQ ID NO：4)
[0211] SalI正向：
[0212] 5’GCGTCGACTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGTCGACCG 3’(SEQ ID NO：5)
[0213] SalI反向：
[0214] 5’CGGTCGACTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGTCGACGC 3’(SEQ ID NO：6)
[0215] CSC分离
[0216] 通过选择如CD44的某些表面标记的存在及如CD24的其他特定表面标记的缺失来分离癌干细胞(CSCs)。参考图4，通过荧光激活细胞分选(FACS)从FaDu人头与颈癌细胞中分离CD44-细胞和CD24-/CD44高细胞(左图)。随后将细胞在缺乏吸附和血清的情况下培养指定的时间周期以检测其形成球的能力(右图)。
[0217] 右图中的显微照相图像说明CD44-细胞不具有形成球的能力，而CD24-/CD44高细胞具有该能力，证实了CD24-/CD44高细胞确实是癌干细胞。
[0218] 实施例1：癌干细胞(CSC)中针对CSCP1的RNAi
[0219] 用携带有如上描述的 质粒的大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysE处理选自副群体(side population)的SW480人结肠癌Hoechst副群体(SP)癌干细胞。用携带对照质粒的细菌处理对照癌干细胞。细菌进入48小时后，将细胞固定并通过标准免疫荧光技术对CSCP1/β联蛋白蛋白质染色。对照细胞(图5，左图)包含正常水平的CSCP1/β联蛋白，而CSCP1靶向细菌通过RNAi引发了CSCP1/β联蛋白的特异性丢失(右图)。
[0220] 实施例2：通过副群体选择的癌干细胞(CSC)中针对CSCP3的RNAi
[0221] 用携带 质粒的大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysE处理如实施例1中制备的SW480人结肠癌Hoechst副群体(SP)癌干细胞。细菌进入24小时后，将细胞固定并通过标准免疫荧光技术对CSCP3/STAT3蛋白质染色。在图6中，上两图显示单通道免疫荧光图像。
下两图显示远右图中提供的具有像素强度量表的CSCP3的强度谱。用靶向细菌CSCP3/STAT3处理的细胞(右图)显示降低的CSCP3/STAT3水平，证明通过该细菌介导系统有效地进行了RNAi。
下两图显示远右图中提供的具有像素强度量表的CSCP3的强度谱。用靶向细菌CSCP3/STAT3处理的细胞(右图)显示降低的CSCP3/STAT3水平，证明通过该细菌介导系统有效地进行了RNAi。
[0222] 实施例3：癌干细胞(CSC)中针对CSCP3引起的凋亡的RNAi
[0223] 将与实施例2中相同细胞及类似处理的细胞固定并在细菌进入24小时后用膜联蛋白V-FITC 24染色，以鉴定凋亡(膜联蛋白V阳性)细胞。如图7中所示，显著数目的处理细胞进入凋亡(右图)，而对照细胞保持健康(左图)。这说明了使用本发明处理癌干细胞和癌的一般治疗潜能。
[0224] 实施例4：在通过表面标记选择的癌干细胞(CSC)中针对CSCP3的RNAi
[0225] 使用FACS通过表面标记CD133选择癌干细胞。随后用 或对照处理所获得的SW480人结肠癌CD133+癌干细胞。24小时后，将细胞固定并用膜联蛋白V-FITC染色以鉴定凋亡细胞。观察到与实施例3相似的结果，相对于对照(左图)多得多的处理细胞(图8，右图)出现了凋亡。
[0226] 实施例5：在癌干细胞(CSC)中针对CSCP3抑制的球形成的RNAi
[0227] 使用本发明方法的CSCP3/STAT3RNA沉默还抑制了CSC球形成的多达60％(图9，右图)。用 或对照TPIV处理通过FACS分离的CD44高FaDu细胞。然后，在缺乏附着和血清的情况下培养细胞5天以形成球。在加入台盼蓝之前(左上图)或之后(左下图)捕捉代表性球体图像以鉴定死亡细胞。通过对具有超过50个细胞的球进行计数来对球体生长进行记分。
[0228] 实施例6：非CSC细胞中针对CSCP3的RNAi
[0229] 用 或对照 质粒处理U2OS人骨肉瘤细胞。收集细胞并在细胞感染24小时后通过蛋白质印迹分析测定CSCP3/STAT3蛋白质的水平(图10，左图)。在处理72小时后，通过常规MTT检测测定细胞生存力(右图)，其在MOI为300的癌细胞中显示70％的死亡率并在MOI为600的癌细胞中显示高于80％的细胞死亡率。这为本发明细菌介导的RNAi方法针对分化的非癌干细胞的高效率提供了证据。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法 | 2020-05-12 | 1042 |
| 用于抗原特异性T细胞增殖的方法 | 2020-05-13 | 501 |
| 皮肤角质干细胞增殖用组合物 | 2020-05-13 | 692 |
| 细胞增殖因子Fwap10576 | 2020-05-11 | 981 |
| 检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法 | 2020-05-12 | 77 |
| 细胞增殖袋及细胞增殖装置 | 2020-05-11 | 302 |
| 细胞增殖剂 | 2020-05-11 | 875 |
| 抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法 | 2020-05-13 | 116 |
| 抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法 | 2020-05-13 | 646 |
| 上皮系细胞增殖促进剂 | 2020-05-12 | 293 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈