用于治疗癌症的抗密蛋白-18的单克隆抗体
阅读：416发布：2023-01-16
专利汇可以提供用于治疗癌症的抗密蛋白-18的单克隆抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供 抗体 ，所述抗体可作为 治疗 剂用于治疗和／或 预防 与表达CLD18的细胞相关的 疾病 ，包括 肿瘤 相关疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、 肺 癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌及其转移形式。，下面是用于治疗癌症的抗密蛋白-18的单克隆抗体专利的具体信息内容。
1.能够结合CLD18A2之抗体用于制备用于诊断位于卵巢之转移肿瘤的组合物的用途，其中所述肿瘤之细胞的特征为表达CLD18A2。
2.权利要求1的用途，其中所述位于卵巢的肿瘤是胃的肿瘤转移。
3.权利要求2的用途，其中所述胃的肿瘤转移是库肯勃氏瘤。
4.能够结合CLD18A2并介导杀伤表达CLD18A2之细胞和/或抑制表达CLD18A2之细胞增殖的抗体用于制备用于预防库肯勃氏瘤之药物的用途，其中通过治疗受胃之肿瘤影响的癌症患者预防所述库肯勃氏瘤。
5.权利要求1或4的用途，其中所述抗体结合CLD18A2但不结合CLD18A1。
6.权利要求4的用途，其中所述对表达CLD18A2之细胞的杀伤和/或抑制其增殖是通过所述抗体与所述细胞表达之CLD18A2的结合来诱导的。
7.权利要求4的用途，其中所述对表达CLD18A2之细胞的杀伤是通过所述抗体与所述细胞表达之CLD18A2的结合来诱导的。
8.权利要求4的用途，其中所述对表达CLD18A2之细胞的杀伤和/或抑制其增殖不是通过所述抗体与所述细胞表达之CLD18A1的结合来诱导的。
9.权利要求4的用途，其中所述抗体通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用来介导所述对表达CLD18A2之细胞的杀伤。
10.权利要求4的用途，其中所述抗体通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解来介导所述对表达CLD18A2之细胞的杀伤。
11.权利要求4的用途，其中所述抗体不诱导所述细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解。
12.权利要求9或10的用途，其中所述抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解在效应细胞存在下发生，所述效应细胞选自单核细胞、单个核细胞、NK细胞和PMN。
13.权利要求9的用途，其中所述吞噬作用通过巨噬细胞来实现。
14.权利要求1或4的用途，其中所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或者抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自F(ab’)2、Fv或单链Fv片段，并且其中所述抗原结合片段与治疗剂相连。
15.权利要求1或4的用途，其中所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗体。
16.权利要求15的用途，其中所述IgG2选自IgG2a和IgG2b。
17.权利要求5的用途，其中所述CLD18A2的氨基酸序列为根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
18.权利要求5的用途，其中所述CLD18A1的氨基酸序列为根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
19.权利要求5的用途，其中所述抗体结合活细胞表面上存在的CLD18之天然表位。
20.权利要求1或4的用途，其中所述抗体可通过包括以下步骤的方法获得：用包含选自SEQ ID NO：2、4、6、16、18、20-23和26-31之氨基酸序列的蛋白质或肽或者表达所述蛋白质或肽的核酸或宿主细胞来免疫动物。
21.权利要求1或4的用途，其中所述抗体通过由以下列登记号在DSMZ中保藏的克隆所产生：
DSM ACC2737，
DSM ACC2738，DSM ACC2739，DSM ACC2740，DSM ACC2741，DSM ACC2742，DSM ACC2743，DSM ACC2745，DSM ACC2746，DSM ACC2747，DSM ACC2748，DSM ACC2808，DSM ACC2809或DSM ACC2810。
22.权利要求1或4的用途，其中所述抗体与治疗剂偶联。
23.权利要求22的用途，其中所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。
用于治疗癌症的抗密蛋白-18的单克隆抗体
技术领域
[0002] 与常规药物相比，基于抗体的癌症疗法具有较高特异性和较低副作用谱的潜力。其原因为抗体对正常细胞及赘生性细胞的精确区分以及以下事实，即其作用模式依赖于毒性较低的免疫学抗肿瘤机制，例如补体活化和细胞毒性免疫细胞的募集。
[0003] 基于抗体的疗法的靶标必须具有特定的性质，这形成了正确区分正常细胞及赘生性细胞的基础。显然，排他性地局限在肿瘤细胞中并且在正常组织中完全检测不到的靶标对于开发高效且安全的抗体疗法而言是很理想的。另一方面，高水平的过表达也可以是治疗窗和低副作用的基础，例如由于基因扩增而成为抗体曲妥珠单抗(trastuzumab，Herceptin，赫塞汀)优良靶标的2型人表皮生长因子受体(HER-2)。
[0004] 已获批准或正在临床开发的用于肿瘤疗法之抗体的其他靶标具有不基于靶分子在肿瘤细胞上数量性过表达的独特性质。对于针对蛋白聚糖MUC-1的抗体，靶标主链中的肽重复表位在肿瘤细胞中是低糖基化的，从而改变成其正常状态的对应物(counterpart)。对于针对CD20(利妥昔单抗(rituximab))、CD52(Campath-1H)和CD22(依帕珠单抗(epratuzumab))的抗体，抗体靶标在肿瘤细胞和正常淋巴细胞中的表达水平相当。这种情况下，抗体对正常细胞的去除可以被耐受，因为靶标阴性的干细胞恢复了正常的淋巴细胞谱。抗体靶标可接近性差异的另一些实例为癌胚抗原(carcinoembryonal antigen，CEA)和碳酸酐酶IX(carboanhydrase IX，CA9)。这两种抗原分别在结肠和肾的正常上皮中表达。然而，经放射性标记的成像抗体确实良好区分了肿瘤及正常组织，而且细胞毒性抗体可以被良好地耐受。这很可能是由于CA9和CEA在正常上皮组织中限制性表达在IgG抗体无法接近的腔侧。上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM)这种抗原也属于这一类别。作为上皮细胞的同型细胞粘附分子，它定位在细胞间隙中。有意思的是，尽管高亲和力抗Ep-CAM抗体毒性极高，但中等亲和力的抗体却可以被良好地耐受。这提示了Ep-CAM靶标在正常细胞上的可接近性，但也表明抗体结合动力学可能打开治疗窗。
[0005] 一种可能性是参与细胞／细胞粘附的其他上皮细胞特异性蛋白质对于抗体策略也可能有意义，因为它们在正常结构的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中却暴露出来。因此，我们对参与组织上皮组织结构的蛋白质作为治疗性抗体靶标的适用性进行了分析。一种特别引起我们注意的蛋白质是密蛋白18(claudin18)。
[0006] 密蛋白18(CLD18)分子(Genbank登记号：剪接变体1(CLD18A1)：NP_057453、NM_016369，以及剪接变体2(CLD18A2)：NM_001002026、NP_001002026)是分子量约为27.9／
27.72kD的整合型跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和内皮的紧密连接中的整合膜蛋白。紧密连接在相邻细胞之间组织起膜内颗粒互联链的网。在紧密连接中，闭合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白组分。由于其强的细胞间粘附特性，它们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的主要屏障。形成紧密连接的蛋白质关键性地参与了组织上皮组织结构。我们推测，这些蛋白质在构造良好的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中则开始暴露出来。
27.72kD的整合型跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和内皮的紧密连接中的整合膜蛋白。紧密连接在相邻细胞之间组织起膜内颗粒互联链的网。在紧密连接中，闭合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白组分。由于其强的细胞间粘附特性，它们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的主要屏障。形成紧密连接的蛋白质关键性地参与了组织上皮组织结构。我们推测，这些蛋白质在构造良好的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中则开始暴露出来。
[0007] CLD18是一种四次跨膜蛋白，因此具有四个疏水区。我们得出的数据表明CLD18展示若干不同构象，这些构象可被抗体选择性靶向。一种构象(CLD18-构象-1)显示，全部四个疏水区均作为常规跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，并形成两个细胞外环(环1由疏水区1和疏水区2环绕而成；环2由疏水区3和疏水区4环绕而成)，像对绝大多数密蛋白家族成员所描述的那样。另一种构象(CLD18-构象-2)显示，像对另一种四次跨膜家族成员PMP22所描述的那样(Taylor等，J.Neurosc.Res.62：15-27，2000)，第二个和第三个疏水结构域不完全跨过质膜，从而第一个和第四个跨膜结构域之间的部分(环D3)在细胞外。第三种构象(CLD18-构象-3)显示了被作为常规跨膜结构域的第一个和第四个疏水区所环绕并具有两个内部疏水区的大的细胞外结构域。由于环D3中存在典型的N-糖基化位点，密蛋白-18的拓扑学变体CLD18拓扑-2和CLD18拓扑-3带有额外的细胞外N-糖基化位点。
[0008] 两种不同剪接变体的存在给CLD18分子增添了另一层水平上的复杂性，这两种变体描述于小鼠和人中(Niimi，Mol.Cell.Biol.21：7380-90，2001)。剪接变体CLD18A1和CLD18A2在包括第一个TM和环1的N端前21个氨基酸中存在差异，而C端的一级蛋白质序列则相同。
[0009] CLD18A1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，而CLD18A2仅在胃细胞中表达(Niimi，Mol.Cell.Biol.21：7380-90，2001)。最重要的是，CLD18A2局限在已分化的胃上皮短寿细胞中，但在胃干细胞区中不存在。我们使用灵敏的RT-PCR显示，两种变体在任何其他正常人器官中均完全检测不到，但在若干癌症类型中强烈表达，包括胃、食管、胰腺和肺的肿瘤以及人癌症细胞系。表达主要是在这些适应症的腺癌亚型中。
[0010] 该蛋白质的分子量在一些癌症和邻近的正常组织中存在差异。在健康组织中观察到的较高分子量的蛋白质可以通过用去糖基化化合物PNGase F处理组织裂解液而转变成与癌症中所观察到相同的分子量。这提示与其正常组织对应物相比，CLD18在癌症中N-糖基化较少。这种结构差异很可能产生改变的表位。经典的N-糖基化基序在该分子环D3结构域的116位氨基酸中。
[0011] 本发明的术语“CLD18”和“CLD18变体”应包括(i)CLD18剪接变体；(ii)CLD18N-糖基化变体；(iii)CLD18构象变体；(iv)位于细胞间紧密连接中的游离CLD18和同型／异型相关变体以及(v)CLD18的癌症相关变体和CLD18非癌细胞相关变体。
[0012] CLD18的分子和功能特征使得该分子对基于抗体的癌症疗法非常有意义。特别是(i)绝大多数毒性相关正常组织中不存在CLD18；(ii)CLD18A2变体的表达局限在作为已分化胃细胞的可分散细胞群体中，这些细胞可由靶标阴性的胃干细胞进行补充；(iii)正常及赘生性细胞之间潜在差异性糖基化的线索；(iv)不同构象拓扑学情况的存在。此外，CLD18作为紧密连接蛋白的作用可能进一步促成良好的治疗窗。由于肿瘤细胞表达密蛋白，但经常不像正常上皮组织中可见的那样通过密蛋白的同型和异型相关联形成经典的紧密连接，因此肿瘤细胞具有适用于胞外抗体结合及免疫疗法的可观的游离密蛋白库。有可能在健康上皮中密蛋白的结合表位被屏蔽在紧密连接中，使这些抗体无法接近。
[0013] 另外，根据本发明所观察到的不仅由于原发肿瘤还由于来自表达CLD18A2的原发肿瘤(特别是胃肿瘤)之转移肿瘤的质膜高表达，使得CLD18A2特异性抗体成为用于预防、治疗和／或诊断癌症转移的有价值的工具，特别是来源于胃肿瘤的转移，例如淋巴结转移、腹膜转移和库肯勃氏瘤(Krukenberg tumor)。
[0014] 本发明的一个目的是提供可用于治疗其中有CLD18表达的疾病(例如肿瘤疾病)的抗体。本文所述抗体还可用于诊断这些疾病。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明一般地提供抗体，所述抗体可用作治疗剂用于治疗和／或预防与表达CLD18的细胞相关的疾病，包括肿瘤相关疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌及其转移，特别是胃癌转移例如库肯勃氏瘤、腹膜转移和淋巴结转移。
[0017] 本发明的一个方面涉及能够结合CLD18的抗体。优选地，该抗体能够结合细胞表面所表达的CLD18，优选地结合位于CLD18的细胞外部分的一个或多个表位，优选地在第一细胞外结构域中(CLD18的29至78位氨基酸)。优选地，本发明的抗体结合选自SEQ ID NO：151、153、155、156和157的一个或多个肽。优选地，所述抗体结合癌细胞，特别是上文所说癌症类型的细胞，优选地基本上不结合非癌细胞。优选地，所述抗体与表达CLD18的细胞(例如癌细胞)的结合介导杀伤表达CLD18的细胞。优选地，所述抗体结合CLD18A1和CDL18A2，更优选地结合CLD18A2，但不结合CLD18A1。优选地，本发明的抗体与CLD-构象-1的环1或环2结合并对其具有特异性。在另一些优选实施方案中，本发明的抗体与CLD-构象-2的环D3结合并对其具有特异性，特别是在环D3中116位的潜在N-糖基化位点处或其周围结合。在另一些实施方案中，本发明的抗体对环D3中116位潜在N-糖基化位点未发生糖基化的形式具有特异性。
[0018] 优选地，本发明的抗体与CLD18A2的结合涉及一个或多个选自下列的氨基酸：CLD18A2(SEQ ID NO：2)的42位Ala、45位Asn和56位Glu。优选地，本发明的抗体不结合CLD18A2变体或其片段，其中这些位置的一个或多个、优选全部氨基酸被不同氨基酸所替换，特别是被CLD18A1(SEQ ID NO：8)中对应位置的氨基酸(Ala42Ser,Asn45Gln和Glu56Gln)所替换。
[0019] 本发明抗体对细胞的杀伤优选通过该抗体与所述细胞表达之CLD18的结合来诱导，更优选通过该抗体与所述细胞表达之CLD18A2的结合来诱导。在一个实施方案中，本发明抗体与所述细胞表达之CLD18A1的结合不诱导杀伤所述细胞。这种对细胞的杀伤可如上所述在治疗上应用。特别地，对细胞的杀伤可用于治疗或预防癌症，特别是癌症转移和癌细胞的转移性散播。
[0020] 所述表达CLD18的细胞优选为癌细胞，特别是选自致瘤性的胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和膀胱癌细胞。
[0021] 优选地，本发明抗体通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡、同型粘附和／或吞噬作用来介导对细胞的杀伤，优选通过诱导CDC介导的裂解和／或ADCC介导的裂解来介导对细胞的杀伤。
[0022] 在一个实施方案中，本发明的抗体不诱导CDC介导的细胞裂解。
[0023] 优选地，ADCC介导的细胞裂解在效应细胞存在时发生，所述效应细胞在一些具体实施方案中选自单核细胞(monocyte)、单个核细胞(mononuclear cell)、NK细胞和PMN，吞噬作用是通过巨噬细胞来实现。
[0024] 本发明的抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或者是抗体片段，并且可选自IgG1、IgG2(优选IgG2a和IgG2b)、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗体。
[0025] 根据本发明的所有方面，CLD18优选为人CLD18，优选人CLD18A2，并且CLD18A2优选具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CLD18A1优选具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
[0026] 在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体与活细胞表面上存在的CLD18的天然表位结合。在另一些优选的实施方案中，本发明的抗体对癌细胞(优选胃癌细胞)具有特异性。
[0027] 在本发明的某些实施方案中，CLD18表达于细胞表面上。
[0028] 本发明的抗体可通过包括以下步骤的方法获得：用具有选自SEQ ID NO：2、4、6、16、18、20、21-23和26-31、151、153和155-157的氨基酸序列的蛋白质或多肽或者其免疫原性片段或衍生物、或者表达所述蛋白质或多肽或者其免疫原性片段或衍生物的核酸或宿主细胞来免疫动物。优选地，本发明的抗体对上述蛋白质、多肽或其免疫原性片段或衍生物具有特异性。对于免疫接种所用的蛋白质或肽来说，衍生物涉及这些蛋白质或肽的变体，其具有与其所来源的蛋白质或肽相同或相似的免疫原性。特别地，在用于免疫接种以产生抗体(特别是单克隆抗体)时，蛋白质或肽的衍生物提供具有与在免疫接种中使用所述蛋白质或肽时所获得抗体相同的特异性。例如，这些衍生物可包括一个或多个氨基酸的缺失、替换或添加。特别地，它可包括在N-端或C-端或两端添加一个或多个氨基酸(例如半胱氨酸)，或者用丝氨酸残基替换半胱氨酸残基。本文所示数据显示了CLD18内对抗体结合不重要的残基。
因此，本文所述用于免疫接种的CLD蛋白、肽、其免疫原性片段或衍生物可在对抗体结合不关键的所述氨基酸位置掺入一个或多个氨基酸替换。
因此，本文所述用于免疫接种的CLD蛋白、肽、其免疫原性片段或衍生物可在对抗体结合不关键的所述氨基酸位置掺入一个或多个氨基酸替换。
[0029] 在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体通过登记号为DSM ACC2737(182-D1106-055)、DSM ACC2738(182-D1106-056)、DSM ACC2739(182-D1106-057)、DSMACC2740(182-D1106-058)、DSM ACC2741(182-D1106-059)、DSM ACC2742(182-D1106-062)、DSM ACC2743(182-D1106-067)、DSM ACC2745(182-D758-035)、DSMACC2746(182-D758-036)、DSM ACC2747(182-D758-040)、DSM ACC2748(182-D1106-061)、DSM ACC2808(182-D1106-279)、DSM ACC2809(182-D1106-294)或DSMACC2810(182-D1106-362)的克隆来产生。
[0030] 在一个实施方案中，本发明的抗体与治疗剂如毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂偶联。
[0031] 本发明的另一方面涉及能产生本发明抗体的杂交瘤。优选杂交瘤的登记号为DSM ACC2737(182-D1106-055)、DSMACC2738(182-D1106-056)、DSM ACC2739(182-D1106-057)、DSM ACC2740(182-D1106-058)、DSM ACC2741(182-D1106-059)、DSM ACC2742(182-D1106-062)、DSMACC2743(182-D1106-067)、DSM ACC2745(182-D758-035)、DSM ACC2746(182-D758-036)、DSM ACC2747(182-D758-040)、DSM ACC2748(182-D1106-061)、DSMACC2808(182-D1106-279)、DSM ACC2809(182-D1106-294)或DSM ACC2810(182-D1106-362)。
[0032] 本发明的抗体在本文中通过参考该抗体的命名(如182-D758-035)和／或通过参考产生该抗体的克隆(如26D12)来命名。
[0033] 本发明还涉及包含本发明抗体和／或其与治疗剂的缀合物以及可药用载体的药物组合物。
[0034] 本发明的另一方面涉及杀伤表达CLD18(优选CLD18A2)的细胞和／或抑制其生长的方法，包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体和／或其与治疗剂的缀合物。CLD18优选在所述细胞的表面上表达。
[0035] 本发明的另一方面涉及治疗或预防与表达CLD18(优选CLD18A2)的细胞相关的疾病或病症的方法，包括对对象施用本发明的抗体、其与治疗剂的缀合物或者包含本发明抗体或其与治疗剂之缀合物的药物组合物。优选地，所述疾病或病症为肿瘤相关疾病，在一些具体实施方案中选自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，以及来自其转移。CLD18优选在所述细胞的表面上表达。
[0036] 优选地，本发明的抗体能够区分不同细胞类型(包括癌细胞和非恶性细胞)所表达的CLD18变体。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体能够与CLD18A2结合，但不与CLD18A1结合，或者与CLD18A1结合的特异性低于与CLD18A2结合的特异性。
[0037] 本发明的术语“结合”优选表示特异性结合。“特异性结合”指试剂(如抗体)与其特异性靶标(如表位)的结合强于与其他靶标的结合。如果试剂与第一靶标结合的解离常数(KD)低于与第二靶标结合的解离常数，则其与第一靶标的结合强于与第二靶标的结合。优选地，试剂特异性结合的靶标的解离常数(KD)低于该试剂非特异性结合的靶标的解离常数(KD)的1／10以下，优选1／20以下，更优选1／50以下，甚至更优选1／100、1／200、1／500或1／1000以下。
[0038] 优选地，本发明的抗体具有CLD18(优选CLD18A2)的解离常数，其为10-6M或更低，优选10-7M或更低，更优选10-8M或更低，或者优选10-9M或更低。优选地，本发明的抗体具有CLD18(优选CLD18A2)的解离常数，其在10-8M至10-9M的范围内。
[0039] 本发明的抗体通过结合CLD18(优选表达在所述细胞表面上)介导杀伤表达CLD18(优选表达CLD18A2)的细胞。在一个实施方案中，本发明的抗体诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，如CLD18表达细胞发生至少约20-40％的CDC介导裂解，优选约40-50％的CDC介导裂解，更优选高于50％的CDC介导裂解。这样的抗体在本文中通过以下抗体进行示例：37H8、38G5、38H3、39F11、61C2、26B5、26D12、28D10、163E12、175D10、45C1、125E1、ch-163E12和ch-
175D10。作为诱导CDC的替代或补充，本发明的抗体可在效应细胞(如单核细胞、单个核细胞、NK细胞和PMN)存在下诱导CLD18表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。这样的抗体在本文中通过以下抗体进行示例：37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、61C2、26B5、26D12、
28D10、42E12、163E12、175D10、45C1和125E1。本发明的抗体可具有以下能力：诱导CLD18表达细胞的凋亡、诱导CLD18表达细胞的同型粘附和／或在巨噬细胞存在下诱导CLD18表达细胞的吞噬作用。本发明的抗体可具有一种或多种上述功能特性。优选地，本发明的抗体诱导CLD18表达细胞的CDC介导之裂解和ADCC介导之裂解，更优选诱导CLD18表达细胞的ADCC介导之裂解，而不诱导所述细胞的CDC介导之裂解。本发明抗体的示例性靶细胞包括但不仅限于表达CLD18(优选CLD18A2)的癌细胞，如致瘤性的胃癌、胰腺癌、食管癌和肺癌细胞。在一个特别优选的实施方案中，本发明抗体介导的细胞杀伤是CLD18A2特异性的，即本发明抗体介导杀伤(优选CDC和／或ADCC介导的细胞裂解)表达CLD18A2的细胞，但是不介导杀伤表达CLD18A1而不表达CLD18A2的细胞。上述抗体可在例如以下癌症的治疗或预防中用于介导杀伤肿瘤细胞：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌和／或其转移。
175D10。作为诱导CDC的替代或补充，本发明的抗体可在效应细胞(如单核细胞、单个核细胞、NK细胞和PMN)存在下诱导CLD18表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。这样的抗体在本文中通过以下抗体进行示例：37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、61C2、26B5、26D12、
28D10、42E12、163E12、175D10、45C1和125E1。本发明的抗体可具有以下能力：诱导CLD18表达细胞的凋亡、诱导CLD18表达细胞的同型粘附和／或在巨噬细胞存在下诱导CLD18表达细胞的吞噬作用。本发明的抗体可具有一种或多种上述功能特性。优选地，本发明的抗体诱导CLD18表达细胞的CDC介导之裂解和ADCC介导之裂解，更优选诱导CLD18表达细胞的ADCC介导之裂解，而不诱导所述细胞的CDC介导之裂解。本发明抗体的示例性靶细胞包括但不仅限于表达CLD18(优选CLD18A2)的癌细胞，如致瘤性的胃癌、胰腺癌、食管癌和肺癌细胞。在一个特别优选的实施方案中，本发明抗体介导的细胞杀伤是CLD18A2特异性的，即本发明抗体介导杀伤(优选CDC和／或ADCC介导的细胞裂解)表达CLD18A2的细胞，但是不介导杀伤表达CLD18A1而不表达CLD18A2的细胞。上述抗体可在例如以下癌症的治疗或预防中用于介导杀伤肿瘤细胞：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌和／或其转移。
[0040] 本发明的抗体可根据其结合特性及其介导效应子对CLD18表达细胞的功能的能力分类到不同类别中。本发明抗体可根据以下特征分类：
[0041] ·对表达CLD18A1或CLD18A2之细胞的结合特性和／或介导的对所述细胞的效应子功能(区分CLD18剪接变体)，
[0042] ·对表达糖基化或非糖基化CLD18变体之细胞的结合特性和／或介导的对所述细胞的效应子功能(区分有无N糖基化的CLD18变体)，
[0043] ·对癌细胞或正常细胞类型的结合特性和／或介导的对所述细胞的效应子功能(区分肿瘤细胞表达的或正常非恶性细胞表达的CLD18变体)，
[0044] ·对被紧密连接的形成所屏蔽的CLD18表位的结合特性，
[0045] ·在活细胞上诱导CLD18聚集体形成的能力，和
[0046] ·与非人CLD18变体特别是来自小鼠、大鼠、兔和灵长类的CLD18结合的能力。
[0047] 本发明的抗体可具有一种或多种以下特性，其中给出本发明抗体(24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、
75B8、85A3、9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch-43A11、ch-45C1、ch-125E1、ch-163E12、ch-166E2、ch-175D10)的具体实例作为参考：
75B8、85A3、9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch-43A11、ch-45C1、ch-125E1、ch-163E12、ch-166E2、ch-175D10)的具体实例作为参考：
[0048] a)与CLD18A2以及CLD18A1结合(如26D12、28D10、37H8、38H3、39F11、61C2和41C6)[0049] b)与CLD18A2结合但不与CLD18A1结合(如26B5、37G11、38G5、42E12和43A11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch-43A11、ch-45C1、ch-125E1、ch-163E12、ch-166E2、ch-
175D10)
175D10)
[0050] c)与肿瘤细胞天然表达的CLD18结合但不与非癌细胞或组织(如胃和肺细胞)天然表达的CLD18结合(如26B5、75B8、24H5、39F11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10)[0051] d)介导CDC诱导的针对表达CLD18A2细胞的杀伤，而不针对表达CLD18A1的细胞(如26D12、28D10、37H8和39F11、163E12、ch-125E1、ch-163E12、ch-175D10)
[0052] e)介导ADCC诱导的对表达CLD18细胞的杀伤(如26B5、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、47D12和61C2、ch-163E12、ch-175D10)
[0053] f)介导ADCC诱导的对表达CLD18细胞的杀伤，但不介导CDC介导的杀伤(如37G11、42E12和43A11)
[0054] g)介导ADCC诱导的和CDC诱导的对表达CLD18A2细胞的杀伤(如37H8、38H3、39F11、ch-163E12、ch-175D10)。
[0055] 如本文所述示例的，本发明的抗体还包括以下分子，其
[0056] a)与已分化的正常胃细胞结合，但不与胃干细胞结合(如39F11)
[0057] b)不与正常胃组织以及其他正常器官结合，而是排他性地与癌细胞结合(如26B5)[0058] c)与包含CLD18第116位非糖基化Asn的表位结合
[0059] d)与人及小鼠CLD18结合，使得可以在小鼠中充分进行临床前毒性研究。
[0060] 本发明的抗体可来自不同物种，包括但不仅限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本发明的抗体还包括嵌合分子，其中来自一个物种(优选人)的抗体恒定区与来自另一物种的抗原结合位点相组合。此外，本发明的抗体包括人源化分子，其中来自非人物种的抗体的抗原结合位点与人来源的恒定区和框架区相组合。
[0061] 本发明的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，并包括IgG2a(如IgG2a、κ、λ)、IgG2b(如IgG2b、κ、λ)、IgG3(如IgG3、κ、λ)和IgM抗体。然而，本发明也包括其他抗体同种型，包括IgG1、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗体。所述抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段，包括如Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段，或者是双特异性抗体。此外，所述抗原结合片段包括包含以下部分的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白：(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽(如重链可变区或轻链可变区)，(ii)与该铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与该CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。这样的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003／0118592和US2003／0133939中有进一步公开。
[0062] 本发明的抗体优选以约1-100nM或更小的解离平衡常数(KD)与CLD18解离。优选地，本发明的抗体不与相关细胞表面抗原交叉反应，因此不抑制其功能。
[0063] 在一些优选的实施方案中，本发明的抗体可通过一种或多种以下特性进行表征：
[0064] a)对CLD18的特异性，特别是对CLD18A2的特异性；
[0065] b)对CLD18特别是CLD18A2的结合亲和性为约100nM或更小，优选约5-10nM或更小，更优选约1-3nM或更小，
[0066] c)介导对CD55／59阴性或CD55／59阳性细胞的高水平CDC的能力；
[0067] d)抑制表达CLD18的细胞生长的能力；
[0068] e)诱导表达CLD18的细胞凋亡的能力；
[0069] f)对表达CLD18的细胞诱导同型粘附的能力；
[0070] g)在效应细胞存在下对表达CLD18的细胞诱导ADCC的能力；
[0071] h)延长具有表达CLD18之肿瘤细胞的对象存活的能力；
[0072] i)清除表达CLD18之细胞的能力；
[0073] j)清除表达低水平CLD18之细胞的能力，和／或
[0074] k)在活细胞表面聚集CLD18的能力。
[0075] 本发明的抗CLD18抗体可进行衍生、连接或共表达以得到其它的结合特异性。在一个具体实施方案中，本发明提供双特异性或多特异性分子，其包含至少一种对CLD18的第一结合特异性(如抗CLD18抗体或其模拟体)以及对效应细胞的第二结合特异性，如对Fc受体(例如Fc-γ受体，如Fc-γRI或其他Fc受体)或T细胞受体(如CD3)的结合特异性。
[0076] 因此，本发明包括与CLD18以及Fc受体或T细胞受体(如CD3)均结合的双特异性和多特异性分子。Fc受体的实例为IgG受体、Fc-γ受体(Fc-γR)如Fc-γRI(CD64)、Fc-γRII(CD32)和Fc-γRIII(CD16)。也可靶向其他Fc受体，如IgA受体(如FcαRI)。所述Fc受体优选位于效应细胞如单核细胞、巨噬细胞或活化单个核细胞的表面上。在一个优选的实施方案中，所述双特异性和多特异性分子在Fc受体中不同于免疫球蛋白Fc(如IgG或IgA)结合位点的位点处与该受体结合。因此，所述双特异性和多特异性分子的结合不被生理水平的免疫球蛋白所封闭。
[0077] 在另一方面中，本发明的抗CLD18抗体与其他功能分子如其他肽和蛋白质(如Fab′片段)进行衍生、连接或共表达。例如，本发明的抗体可以与一种或多种其他分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价连接等)，所述分子实体例如其他抗体(如用于产生双特异性或多特异性抗体)、毒素、细胞配体或抗原(如用于产生免疫缀合物，如免疫毒素)。本发明的抗体可以与其他治疗部分连接，如放射性同位素、小分子抗癌药物、重组细胞因子或趋化因子。因此，本发明包括多种抗体缀合物、双特异性和多特异性分子以及融合蛋白，它们均与CLD18表达细胞结合，并可用于将其他分子靶向到这些细胞。
[0078] 在另一个方面，本发明还包括来源于非免疫球蛋白结构域的CLD18-结合蛋白，特别是单链蛋白质。这些结合蛋白及其制备方法描述于例如Binz et al.(2005)Nature Biotechnology23(10)：1257-1268，其通过参考并入本文。应理解，本文提供的有关免疫球蛋白或免疫球蛋白来源结合分子的教导相应地也适用于来源于非免疫球蛋白结构域的结合分子。特别地，使用这些来源于非免疫球蛋白结构域的结合分子有可能阻断表达所述靶标的细胞的CLD18，由此带来如本文所述的本发明抗体的治疗作用，特别是抑制肿瘤细胞的增殖。尽管不是必须的，但是有可能将抗体的效应子功能赋予这些非免疫球蛋白结合分子，其通过例如与抗体的Fc区域融合来实现。
[0079] 在另一方面中，本发明提供组合物，如药物和诊断组合物／试剂盒，其包含与一种本发明抗体或本发明抗体组合配制在一起的可药用载体。在一个具体实施方案中，该组合物包含抗体组合，所述抗体与不同的表位结合，或者具有不同的功能特征，例如诱导CDC和／或ADCC以及诱导凋亡。在本发明的这一实施方案中，抗体可组合使用，例如作为包含两种或更多种抗CLD18单克隆抗体的药物组合物使用。例如，可将具有不同但互补的活性的抗CLD18抗体组合在单一治疗中，以实现所需疗效。在一个优选的实施方案中，该组合物包含介导CDC的抗CLD18抗体与诱导凋亡的其他抗CLD18抗体的组合。在另一实施方案中，该组合物包含在效应细胞存在下介导高效杀伤靶细胞的抗CLD18抗体与抑制CLD18表达细胞生长的其他抗CLD18抗体的组合。
[0080] 本发明还包括同时或依次施用两种或更多种本发明的抗CLD18抗体，其中至少一种所述抗体为嵌合抗CLD18抗体，且至少一种其他抗体为人抗CLD18抗体，所述抗体结合CLD18中相同或不同的表位。优选地，首先施用本发明的嵌合CLD18抗体，其后施用本发明的人抗CLD18抗体，其中所述人抗CLD18抗体优选长期施用，即作为维持疗法。
[0081] 本发明的抗体、免疫缀合物、双特异性和多特异性分子以及组合物可用于抑制表达CLD18(特别是CLD18A2)之细胞的生长和／或选择性杀伤表达CLD18(特别是CLD18A2)之细胞的多种方法中，所述方法通过使所述细胞接触有效量的抗体、免疫缀合物、双特异性／多特异性分子或组合物从而抑制细胞的生长和／或杀伤细胞来实现。在一个实施方案中，所述方法包括杀伤表达CLD18的细胞，任选地在效应细胞存在下进行杀伤，例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通过两种或更多种这些机制的组合。可以使用本发明抗体来抑制或杀伤的CLD18表达细胞包括癌细胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管、肺、卵巢、结肠、肝、头颈和胆囊细胞。
[0082] 因此，本发明的抗体可用于治疗和／或预防多种涉及CLD18表达细胞的疾病，这通过给患这些疾病的患者施用抗体来实现。可以治疗(如改善)或预防的示例性疾病包括但不仅限于致瘤性疾病。可以治疗和／或预防的致瘤性疾病的实例包括胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌及其转移。
[0083] 在本发明的一个具体实施方案中，施用抗体的对象还另外用化学治疗剂、放射或调节(如增强或抑制)Fc受体(如Fc-γ受体)表达或活性的药剂(如细胞因子)进行治疗。用于在治疗期间施用的典型细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。典型治疗剂包括抗肿瘤剂如阿霉素、顺铂、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、吉西他滨和环磷酰胺。
[0084] 在另一实施方案中，本发明涉及用人CLD18或其肽片段优选是CLD18A2或其肽片段免疫非人动物如小鼠以获得抗体的免疫策略。用于免疫的优选肽为选自SEQ ID NO：2、4、6、16、18、20-23、26-31、151、153和155-157的肽，或包含所述序列的肽。因此，在一些优选的实施方案中，本发明的抗体为通过用选自SEQ ID NO：2、4、6、16、18、20-23、26-31、151、153和
155-157，或使用包含所述序列的肽进行免疫而获得的抗体。类似地，可以在非人转基因动物如转基因小鼠中产生针对CLD18的抗体。所述非人转基因动物可以是基因组中包含编码全部或部分抗体的重链转基因和轻链转基因的小鼠。
155-157，或使用包含所述序列的肽进行免疫而获得的抗体。类似地，可以在非人转基因动物如转基因小鼠中产生针对CLD18的抗体。所述非人转基因动物可以是基因组中包含编码全部或部分抗体的重链转基因和轻链转基因的小鼠。
[0085] 可以用CLD18抗原和／或核酸和／或表达CLD18或其肽片段的细胞的经纯化或富集的制剂来免疫野生型以及非人转基因动物。优选地，所述非人动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生多种抗CLD18的人单克隆抗体同种型(如IgG、IgA和／或IgM)。同种型转换可通过如经典或非经典同种型转换而发生。
[0086] 因此，在另一方面中，本发明提供来自上述非人动物的分离的B细胞。接着可通过与永生化细胞融合而使所述分离的B细胞永生化，以提供本发明抗体的来源(如杂交瘤)。这样的杂交瘤(即产生本发明抗体的杂交瘤)也包括在本发明的范围中。
[0087] 如本文所示例的，本发明的抗体可直接得自表达该抗体的杂交瘤，或者可以克隆并在宿主细胞(如CHO细胞或淋巴细胞)中重组表达。宿主细胞的其他实例为微生物，如大肠杆菌，以及真菌，如酵母。作为替代，它们可在非人转基因动物或植物中重组产生。
[0088] 用于产生本发明抗体的优选杂交瘤为在DSMZ(Mascheroder Weg1b，31824Braunschweig，Germany；新地址：Inhoffenstr.7B，31824Braunschweig，Germany)测序或保藏的杂交瘤，其命名和登记号如下：
[0089] a.182-D1106-055，登记号DSM ACC2737，保藏于2005年10月19日
[0090] b.182-D1106-056，登记号DSM ACC2738，保藏于2005年10月19日
[0091] c.182-D1106-057，登记号DSM ACC2739，保藏于2005年10月19日
[0092] d.182-D1106-058，登记号DSM ACC2740，保藏于2005年10月19日
[0093] e.182-D1106-059，登记号DSM ACC2741，保藏于2005年10月19日
[0094] f.182-D1106-062，登记号DSM ACC2742，保藏于2005年10月19日
[0095] g.182-D1106-067，登记号DSM ACC2743，保藏于2005年10月19日
[0096] h.182-D758-035，登记号DSM ACC2745，保藏于2005年11月17日
[0097] i.182-D758-036，登记号DSM ACC2746，保藏于2005年11月17日
[0098] j.182-D758-040，登记号DSM ACC2747，保藏于2005年11月17日
[0099] k.182-D1106-061，登记号DSM ACC2748，保藏于2005年11月17日
[0100] l.182-D1106-279，登记号DSM ACC2808，保藏于2006年10月26日
[0101] m.182-D1106-294，登记号DSM ACC2809，保藏于2006年10月26日
[0102] n.182-D1106-362，登记号DSM ACC2810，保藏于2006年10月26日。
[0103] 本发明优选的抗体为通过上述杂交瘤产生并可得自上述杂交瘤的抗体(即对于182-D1106-055的情况为37G11，对于182-D1106-056的情况为37H8，对于182-D1106-057的情况为38G5，对于182-D1106-058的情况为38H3，对于182-D1106-059的情况为39F11，对于
182-D1106-062的情况为43A11，对于182-D1106-067的情况为61C2，对于182-D758-035的情况为26B5，对于182-D758-036的情况为26D12，对于182-D758-040的情况为28D10，对于182-D1106-061的情况为42E12，对于182-D1106-279的情况为125E1，对于182-D1106-294的情况为163E12，对于182-D1106-362的情况为175D10)及其嵌合及人源化形式。
182-D1106-062的情况为43A11，对于182-D1106-067的情况为61C2，对于182-D758-035的情况为26B5，对于182-D758-036的情况为26D12，对于182-D758-040的情况为28D10，对于182-D1106-061的情况为42E12，对于182-D1106-279的情况为125E1，对于182-D1106-294的情况为163E12，对于182-D1106-362的情况为175D10)及其嵌合及人源化形式。
[0104] 在一些优选的实施方案中，本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括含有如下重链恒定区(CH)的抗体，所述重链恒定区包含来自人重链恒定区的氨基酸序列，如SEQ ID NO：46或150所示氨基酸序列或其片段。在另一些优选的实施方案中，本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括含有如下轻链恒定区(CL)的抗体，所述轻链恒定区包含来自人轻链恒定区的氨基酸序列，如SEQ ID NO：41或148所示氨基酸序列或其片段。在一个具体的优选实施方案中，本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括含有如下重链恒定区(CH)并含有如下轻链恒定区(CL)的抗体，所述重链恒定区包含来自人重链恒定区的氨基酸序列，如SEQ ID NO：46或150所示氨基酸序列或其片段，所述轻链恒定区包含来自人轻链恒定区的氨基酸序列，如SEQ ID NO：41或148所示氨基酸序列或其片段。
[0105] 包含SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO：45所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：150所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO：149所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO：40所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：148所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO：147所示核酸序列的核酸编码。
[0106] 在某些优选的实施方案中，嵌合形式的抗体包括这样的抗体，其包含重链和／或轻链，所述重链含有选自SEQ ID NO：115、116、117、118、119、120及其片段的氨基酸序列，所述轻链含有选自SEQ ID NO：121、122、123、124、125、126、127、128、129及其片段的氨基酸序列。
[0107] 在某些优选的实施方案中，嵌合形式的抗体包括这样的抗体，其包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链和轻链的组合：
[0108] (i)包含SEQ ID NO：115所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：122所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0109] (ii)包含SEQ ID NO：116所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：121所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0110] (iii)包含SEQ ID NO：117所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：123所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0111] (iv)包含SEQ ID NO：119所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：126所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0112] (v)包含SEQ ID NO：118所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：125所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0113] (vi)包含SEQ ID NO：120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：124所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0114] (vii)包含SEQ ID NO：120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：127所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0115] (viii)包含SEQ ID NO：120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：128所示氨基酸序列或其片段的轻链，和
[0116] (ix)包含SEQ ID NO：120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO：129所示氨基酸序列或其片段的轻链。
[0117] 上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”涉及抗体序列的一部分，即代表N和／C端缩短的抗体序列的序列，其在替换抗体中的所述抗体序列时保留所述抗体对CLD18的结合，并优选保留所述抗体如本文所述的功能，例如CDC介导的裂解或ADCC介导的裂解。优选地，氨基酸序列的片段含有来自所述氨基酸序列的至少80％、优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸残基。选自SEQ ID NO：115、116、117、118、119、120、121、122、
123、124、125、126、127、128和129的氨基酸序列的片段优选涉及其中除去了N端17、18、19、
20、21、22或23个氨基酸的所述序列。本文所述氨基酸序列的片段可分别由编码所述氨基酸序列的核酸序列的片段编码。
123、124、125、126、127、128和129的氨基酸序列的片段优选涉及其中除去了N端17、18、19、
20、21、22或23个氨基酸的所述序列。本文所述氨基酸序列的片段可分别由编码所述氨基酸序列的核酸序列的片段编码。
[0118] 包含SEQ ID NO：115所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO：100所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：116所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO：101所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：117所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO：102所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：119所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO：104所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：118所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO：103所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：120所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO：105所示核酸序列的核酸编码。
[0119] 包含SEQ ID NO：122所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：107所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：121所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：106所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：108所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：126所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：111所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：125所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：110所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：109所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：127所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：112所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：113所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：129所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO：114所示核酸序列的核酸编码。
[0120] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，其含有选自SEQ ID NO：132、133、134、135、136、137及其片段的氨基酸序列。
[0121] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区(VL)，其含有选自SEQ ID NO：138、139、140、141、142、143、144、145、146及其片段的氨基酸序列。
[0122] 在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包括这样的抗体，其包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合：
[0123] (i)包含SEQ ID NO：132所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：139所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0124] (ii)包含SEQ ID NO：133所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：138所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0125] (iii)包含SEQ ID NO：134所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：140所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0126] (iv)包含SEQ ID NO：136所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：143所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0127] (v)包含SEQ ID NO：135所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：142所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0128] (vi)包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：141所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0129] (vii)包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：144所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0130] (viii)包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：145所示氨基酸序列或其片段的VL，和
[0131] (ix)包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO：146所示氨基酸序列或其片段的VL。
[0132] 包含SEQ ID NO：132所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO：55所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：133所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO：56所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO：57所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO：59所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：135所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO：58所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO：60所示核酸序列的核酸编码。
[0133] 包含SEQ ID NO：139所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：62所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：61所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：140所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：63所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：143所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：66所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：142所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：65所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：141所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：64所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：144所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：67所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：145所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：68所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO：146所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO：69所示核酸序列的核酸编码。
[0134] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含VH，其含有选自以下实施方案(i)至(vi)的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组：
[0135] (i)CDR1：SEQ ID NO：115的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：115的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：115的116-125位，
[0136] (ii)CDR1：SEQ ID NO：116的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：116的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：116的116-126位，
[0137] (iii)CDR1：SEQ ID NO：117的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：117的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：117的116-124位，
[0138] (iv)CDR1：SEQ ID NO：118的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：118的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：118的116-126位，
[0139] (v)CDR1：SEQ ID NO：119的44-51位，CDR2：SEQ ID NO：119的69-76位，CDR3：SEQ ID NO：119的115-125位，
[0140] (vi)CDR1：SEQ ID NO：120的45-53位，CDR2：SEQ ID NO：120的71-78位，CDR3：SEQ ID NO：120的117-128位。
[0141] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含VL，其含有选自以下实施方案(i)至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组：
[0142] (i)CDR1：SEQ IDNO：121的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：121的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：121的115-123位，
[0143] (ii)CDR1：SEQ ID NO：122的49-53位，CDR2：SEQ ID NO：122的71-73位，CDR3：SEQ ID NO：122的110-118位，
[0144] (iii)CDR1：SEQ ID NO：123的47-52位，CDR2：SEQ ID NO：123的70-72位，CDR3：SEQ ID NO：123的109-117位，
[0145] (iv)CDR1：SEQ ID NO：124的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：124的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：124的115-123位，
[0146] (v)CDR1：SEQ ID NO：125的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：125的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：125的115-123位，
[0147] (vi)CDR1：SEQ ID NO：126的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：126的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：126的115-122位，
[0148] (vii)CDR1：SEQ ID NO：127的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：127的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：127的115-123位，
[0149] (viii)CDR1：SEQ ID NO：128的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：128的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：128的115-123位，和
[0150] (ix)CDR1：SEQ ID NO：129的47-52位，CDR2：SEQ ID NO：129的70-72位，CDR3：SEQ ID NO：129的109-117位。
[0151] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含VH和VL，其分别含有选自以下实施方案(i)至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组：
[0152] (i)VH：CDR1：SEQ ID NO：115的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：115的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：115的116-125位，VL：CDR1：SEQ ID NO：122的49-53位，CDR2：SEQ ID NO：122的
71-73位，CDR3：SEQ ID NO：122的110-118位，
71-73位，CDR3：SEQ ID NO：122的110-118位，
[0153] (ii)VH：CDR1：SEQ ID NO：116的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：116的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：116的116-126位，VL：CDR1：SEQ ID NO：121的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：121的
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：121的115-123位，
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：121的115-123位，
[0154] (iii)VH：CDR1：SEQ IDNO：117的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：117的70-77位，CDR3：SEQ IDNO：117的116-124位，VL：CDR1：SEQ ID NO：123的47-52位，CDR2：SEQ ID NO：123的
70-72位，CDR3：SEQ ID NO：123的109-117位，
70-72位，CDR3：SEQ ID NO：123的109-117位，
[0155] (iv)VH：CDR1：SEQ ID NO：119的44-51位，CDR2：SEQ ID NO：119的69-76位，CDR3：SEQ ID NO：119的115-125位，VL：CDR1：SEQ ID NO：126的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：126的
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：126的115-122位，
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：126的115-122位，
[0156] (v)VH：CDR1：SEQ ID NO：118的45-52位，CDR2：SEQ ID NO：118的70-77位，CDR3：SEQ ID NO：118的116-126位，VL：CDR1：SEQ ID NO：125的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：125的
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：125的115-123位，
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：125的115-123位，
[0157] (vi)VH：CDR1：SEQ ID NO：120的45-53位，CDR2：SEQ ID NO：120的71-78位，CDR3：SEQ ID NO：120的117-128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：124的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：124的
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：124的115-123位，
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：124的115-123位，
[0158] (vii)VH：CDR1：SEQ ID NO：120的45-53位，CDR2：SEQ ID NO：120的71-78位，CDR3：SEQ ID NO：120的117-128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：127的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：127的
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：127的115-123位，
76-78位，CDR3：SEQ ID NO：127的115-123位，
[0159] (viii)VH：CDR1：SEQ ID NO：120的45-53位，CDR2：SEQ ID NO：120的71-78位，CDR3：SEQ ID NO：120的117-128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：128的47-58位，CDR2：SEQ ID NO：128的76-78位，CDR3：SEQ ID NO：128的115-123位，和
[0160] (ix)VH：CDR1：SEQ ID NO：120的45-53位，CDR2：SEQ ID NO：120的71-78位，CDR3：SEQ ID NO：120的117-128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：129的47-52位，CDR2：SEQ ID NO：129的
70-72位，CDR3：SEQ ID NO：129的109-117位。
70-72位，CDR3：SEQ ID NO：129的109-117位。
[0161] 在另一些优选的实施方案中，本发明的抗体优选包含针对CLD18的单克隆抗体(优选本文所述针对CLD18的单克隆抗体)中重链可变区(VH)和／或轻链可变区(VL)的一个或多个互补性决定区(CDR)，优选至少包含CDR3可变区，并且优选包含本文所述重链可变区(VH)和／或轻链可变区(VL)的一个或多个互补性决定区(CDR)，优选至少包含CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或多个互补性决定区(CDR)选自本文所述的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体优选包含针对CLD18的单克隆抗体(优选本文所述针对CLD18的单克隆抗体)重链可变区(VH)和／或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3，并优选包含本文所述重链可变区(VH)和／或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3。
[0162] 在一个实施方案中，如本文所述包含一个或多个CDR、一组CDR或CDR组的组合的本发明抗体包含与其介入构架区(intervening framework region)在一起的所述CDR。优选地，该部分还将包含第一个和第四个构架区中其一或其二的至少约50％，所述50％为第一个构架区的C端50％和第四个构架区的N端50％。构建通过重组DNA技术产生的本发明抗体可能导致在可变区的N端或C端引入接头编码的残基，所述接头的引入是为了便于克隆或其他操作步骤，包括引入接头以连接本发明的可变区与其他蛋白质序列，所述其他序列包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在双抗体的产生中)或蛋白质标签。
[0163] 在一个实施方案中，如本文所述包含一个或多个CDR、一组CDR或CDR组的组合的本发明抗体在人抗体构架中包含所述CDR。
[0164] 本文中提到的在其重链中包含特定链或特定区域或特定序列的抗体优选涉及所述抗体的所有重链均包含所述特定链、区域或序列的情况。相应地，这也适用于抗体的轻链。
[0165] 本发明还涉及核酸，其包含编码如本文所述抗体或其部分(如抗体链)的基因或核酸序列。该核酸可以包含在载体中，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者例如在遗传工程中常规使用的其他载体。所述载体可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所公知，可包括启动子、剪接盒以及翻译起始密码子。
[0166] 优选地，本发明的核酸与允许在真核或原核细胞中表达的上述表达控制序列有效连接。确保在真核或原核细胞中表达的控制元件为本领域技术人员所熟知。
[0167] 用于构建本发明核酸分子、构建包含上述核酸分子的载体、将载体引入正确选择的宿主细胞、引起或实现表达的方法在本领域中是公知的。
[0168] 本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸或载体的宿主细胞
[0171] 图1显示转染了与绿色荧光染料偶联的CLD18A2的HEK293细胞的免疫荧光分析，所述细胞与用SEQ ID NO：15进行DNA免疫后的小鼠血清进行了反应，所述SEQ ID NO：15是与辅助表位(helper epitope)相融合的。
[0172] 图2显示转染了CLD18A2-myc(SEQ ID NO：3)的HEK293细胞及未转染的HEK293细胞的Western印迹分析，所述分析使用单克隆小鼠抗c-myc抗体9E11(Serotec，CRL MCA2200)进行。
[0173] 图3显示使用转染了CLD18A2的CHO细胞和多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)进行的免疫荧光分析。
[0174] 图4A和B显示通过流式细胞术测定的杂交瘤上清液24H5和85A3与瞬时转染了人CLD18A2和荧光标记的HEK293细胞的结合。图4C显示杂交瘤上清液45C1、125E1、163E12、166E2和175D10与稳定转染了人CLD18A2并用碘化丙锭(propidium iodide)复染的HEK293细胞的结合。
[0175] 图5显示通过流式细胞术测定的杂交瘤上清液24H5(A)、9E8(B)、26B5(C)和19B9(D)与瞬时转染了荧光标记以及人CLD18A2或CLD18A2-Myc或CLD18A2-HA的HEK293细胞的结合。
[0176] 图6A和B显示通过流式细胞术测定的杂交瘤上清液37H8、43A11、45C1和163E12与稳定转染了人CLD18A2或CLD18A1的HEK293细胞的结合。
[0177] 图7显示CLD18A2同工型(isoform)特异性单克隆抗体37G11的免疫荧光分析，所述分析通过在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)条件下染色分别转染了CLD18A2(A、C)和CLD18A1(B、D)的HEK293细胞来进行。
[0178] 图8显示CLD18单克隆抗体26B5的免疫荧光分析，所述分析通过在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)条件下染色分别转染了CLD18A2(A、C)和CLD18A1(B、D)的HEK293细胞来进行。
[0179] 图9.细胞系RT-PCR
[0180] 使用CLD18A2特异性引物的RT-PCR分析显示在4／5的测试细胞系中有明确的表达。
[0181] 图10显示DAN-G细胞(亚克隆F2)和多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)的免疫荧光分析。
[0182] 图11显示KATO-III细胞(亚克隆3B94D5)和多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)的免疫荧光分析。
[0183] 图12A显示SNU-16细胞(亚克隆G5)与多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)的免疫荧光分析。图12B显示KATO-III细胞与本发明单克隆抗体的免疫荧光分析。
[0184] 图13显示CLD18在KATO-III和NUGC-4细胞表面的表达，其通过用单克隆抗体61C2和163E12染色随后进行流式细胞术来进行分析。
[0185] 图14.人CLD18A1(NP057453)、人CLD18A2(NP_001002026)、小鼠CLD18A1(NP_062789)和小鼠CLD18A2(AAL15636)的蛋白质比对。
[0186] 图15A和B显示通过流式细胞术分析的杂交瘤上清液38G5、38H3、37G11、45C1和163E12分别与瞬时转染了荧光标记以及鼠CLD18A1或鼠CLD18A2的HEK293细胞的结合。
[0187] 图16.使用多克隆抗体p105进行的免疫组化分析
[0188] 对正常组织亚组(胃、肺、骨髓和前列腺)的免疫组化染色证实了胃组织特异性(A)。还在胃癌(上面一行)和肺癌(B)中检测到了表达。仅分化细胞表达CLD18A2，但干细胞不表达(C)。
[0189] 图17.使用单克隆抗体39F11D7进行的免疫组化分析
[0190] (A)在正常胃粘膜中检测到特异性蛋白质表达，而测试的所有其他正常组织均为阴性。
[0191] (B)在胃癌和肺癌中发现强CLD18A2表达。
[0192] 图18.使用单克隆抗体26B5(A)、175D10(B)、43A11(C)、163E12(D)和45C1(E)进行的免疫组化分析。所有抗体均显示HEK293-CLD18A2异种移植肿瘤和胃癌标本的强染色，而用HEK293-模拟对照转染的肿瘤则不然。
[0193] 图19是比较通过85A3、28D10、24H5或26D12诱导针对稳定转染了人CLD18A2的HEK293的CDC之后死细胞百分比的图，使用流式细胞术测定。
[0194] 图20是通过24H5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12或61C2诱导针对稳定转染了人CLD18A2或人CLD18A1的贴壁CHO细胞的CDC之后特异性细胞裂解百分比的图，通过荧光测量来测定。
[0195] 图21显示75B8(A)、28D10(B)或37H8(C)浓度依赖性诱导针对稳定转染了人CLD18A2的CHO细胞的CDC，通过荧光测量来测定。
[0196] 图22显示在MNC存在下分别由26B5、37H8、38G5、47D12和61C2诱导的HEK293-CLD18A2细胞裂解。
[0197] 图23显示在MNC存在下分别由26B5、37H8、38G5、47D12和61C2诱导的HEK293-CLD18A1细胞裂解。
[0198] 图24显示在使用HEK293-CLD18A2细胞的早期治疗异种移植模型中本发明抗体对肿瘤生长的抑制。
[0199] 图25A和B显示在两种使用HEK293-CLD18A2细胞的早期治疗异种移植模型中通过使用本发明抗体治疗的存活延长。
[0200] 图26显示在使用HEK293-CLD18A2细胞的深度治疗(advanced treatment)异种移植模型中通过本发明抗体的存活延长。
[0201] 图27A显示在早期治疗异种移植模型中通过本发明抗体的肿瘤生长抑制。图27B显示在早期治疗异种移植模型中通过本发明抗体的存活延长。使用内源表达CLD18A2的DAN-G细胞。
[0202] 图28显示小鼠组织中的CLD18A2mRNA表达。使用CLD18A2特异性引物的RT-PCR研究显示，在除胃以外的所有所测试正常组织中均无显著表达。分析了以下正常组织：1：小肠，2：脾，3：皮肤，4：胃，5：肺，6：胰腺，7：淋巴结，8：胸腺，9：阴性对照。
[0203] 图29显示正常胃中的CLD18表达。使用CLD18特异性抗体的小鼠胃免疫组化分析显示了保守的表达模式。尽管表面上皮和更深处的隐窝(crypt)在其表面表达CLD18，但中央颈部(central neck region)为CLD18阴性。
[0204] 图30显示小鼠胃组织的苏木精和伊红染色。显示了用37G11处理的小鼠与仅用PBS处理的对照小鼠(C和D)相比较的胃的概况(A)和细节(B)。
[0205] 图31A和B显示使用本发明抗体(43A11、125E1、163E12、166E2和175D10)对分别稳定转染了CLD18A1和A2的HEK293细胞以及内源性表达的KATO-III细胞进行的流式细胞染色。
[0206] 图32显示本发明嵌合抗体介导的对CLD18A2表达细胞的CDC。
[0207] 图33显示本发明嵌合抗体介导的对KATO-III细胞的ADCC。
[0208] 图34显示在早期治疗异种移植模型中用嵌合抗体ch-175D10和ch-163E12治疗得到的延长存活。
[0209] 图35显示在高级治疗异种移植模型中用嵌合抗体ch-175D10和ch-163E12治疗得到的延长存活。
[0210] 图36显示使用抗体ch-175D10和ch-163E12的表位作图实验。分析了CLD18A2的第一细胞外结构域无修饰的氨基酸序列(上面一排，无Cys-Ser替换)或具有半胱氨酸-丝氨酸替换的氨基酸序列(下面一排，有Cys-Ser替换)。
[0211] 图37显示CLD18A2的第一细胞外结构域的三个不同蛋白质折叠模型。
[0212] 图38A、B和C显示，通过流式细胞术所分析的ch-175D10、ch-163E12和ch-125E1与瞬时转染荧光标志物以及鼠CLD18A1／CLD18A2或人CLD18A1／CLD18A2的HEK293细胞的结合。仅仅分析转染的细胞，通过PI染色从分析中排除死细胞。
[0213] 图39显示CLD18A2在原发胃肿瘤和胃肿瘤转移中的质膜高水平表达。用GC182特异性兔抗血清对来自原发胃癌和胃癌转移(库肯勃氏瘤和淋巴结)的非选择样本进行染色。由专业临床病理医师进行免疫组化和染色强度评价(阴性、弱=1，中等=2，强=3)和显示质膜染色的肿瘤细胞比例(0-100％)。每个圆圈代表独立的肿瘤样品。观察到转移中统计学显著性增加的染色强度(p=0.034，Fisher确切检验)。
[0214] 发明详述
[0215] 本文所述抗体可以是与CLD18上存在的表位优选位于CLD18细胞外结构域(特别是第一细胞外结构域)中的表位特异性结合的分离的单克隆抗体。本发明涵盖的分离的单克隆抗体包括IgA、IgG1-4、IgE、IgM和IgD抗体。在一个实施方案中，所述抗体为IgG1抗体，更具体地为IgG1κ或IgG1λ同种型。在另一实施方案中，所述抗体为IgG3抗体，更具体地为IgG3κ或IgG3λ同种型。在另一实施方案中，所述抗体为IgG4抗体，更具体地为IgG4κ或IgG4λ同种型。在另一实施方案中，所述抗体为IgA1或IgA2抗体。在另一实施方案中，所述抗体为IgM抗体。
[0216] 在一个实施方案中，本发明涉及这样的抗体，其与表达CLD18的细胞特异性结合，并且优选地(i)与表达CLD18A2的细胞结合，并且(ii)不与不表达CLD18A2但表达CLD18A1的细胞结合。本发明的抗体优选地(i)介导杀伤表达CLD18A2的细胞，并且(ii)不介导杀伤不表达CLD18A2但表达CLD18A1的细胞。
[0217] 在另一实施方案中，本发明涉及这样的抗体，其(i)与表达CLD18的肿瘤细胞结合，(ii)不与表达CLD18的正常胃粘膜细胞结合，和／或(iii)不与表达CLD18的非癌肺组织细胞结合。
[0218] 本发明还包括这样的抗体，其(i)介导杀伤表达CLD18的肿瘤细胞，(ii)不介导杀伤表达CLD18的正常胃粘膜细胞，和／或(iii)不介导杀伤表达CLD18的非癌肺组织细胞。
[0219] 在一些具体的实施方案中，本发明的抗体(i)结合存在于CLD18A2上但不存在于CLD18A1上的表位，优选SEQ ID NO：21、22和23，(ii)结合位于CLD18A2环1上的表位，优选SEQ ID NO：28，(iii)结合位于CLD18A2环2上的表位，优选SEQ ID NO：30，(iv)结合位于CLD18A2环D3上的表位，优选SEQ ID NO：31，(v)结合包括CLD18A2环1和CLD18A2环D3的表位，(vi)结合位于CLD18A2环D3上的非糖基化表位，优选SEQ ID NO：29，或者(vii)结合人和小鼠CLD18中存在的表位(分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37)。
[0220] 在一些特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合存在于CLD18A2上但不存在于CLD18A1上的表位。
[0221] 本发明的抗体包括全人抗体。这样的抗体可以在非人转基因动物(如转基因小鼠)中产生，所述转基因动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生多种针对CLD18的人单克隆抗体同种型。这样的转基因动物还可以是如US2003／0017534所公开的用于产生多克隆抗体的转基因兔。
[0222] 本发明抗体与CLD18抗原的结合可介导杀伤表达CLD18的细胞(如肿瘤细胞)，例如通过激活补体系统来介导。对表达CLD18的细胞的杀伤可通过一种或多种以下机制发生：表达CLD18的细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)；表达CLD18的细胞的凋亡；表达CLD18的细胞的效应细胞吞噬作用；或者表达CLD18的细胞的效应细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
[0223] 为了更易于理解本发明，首先定义一些术语。其他定义在详述全文中公开。
[0224] 术语定义
[0225] 术语“CLD18”指密蛋白-18，并包括细胞天然表达的或转染了CLD18基因的细胞所表达的CLD18的任何变体(包括CLD18A1和CLD18A2)、构象、同工型和种间同源物(species homologs)。优选地，“CLD18”指人CLD18，特别是人CLD18A2和／或人CLD18A1，更优选人CLD18A2。人CLD18A2优选涉及(i)包含编码SEQ ID NO：2之氨基酸序列的核酸序列的核酸，例如包含SEQ ID NO：1核酸序列的核酸，或者(ii)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质，并且包括细胞天然表达的或转染了CLD18A2基因的细胞所表达的其任何变体、构象、同工型和种间同源物。
[0226] 人CLD18A1优选涉及(i)包含编码SEQ ID NO：8之氨基酸序列的核酸序列的核酸，例如包含SEQ ID NO：7核酸序列的核酸，或者(ii)包含SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质，并且包括细胞天然表达的或转染了CLD18A1基因的细胞所表达的其任何变体、构象、同工型和种间同源物。
[0227] “CLD18的变体”还包括基本由CLD18的细胞外结构域或胞外域组成的CLD18形式。CLD18“细胞外结构域”或“胞外域”指基本不含跨膜和胞质结构域的CLD18多肽形式。应理解，所鉴定的本发明CLD18多肽的任何跨膜结构域是根据本领域中用于鉴定疏水结构域类型的常规标准所鉴定的。跨膜结构域的确切边界可有所不同，但是大部分是相似的，在本文最初所鉴定的结构域的任一端不超过约5个氨基酸。因此，如实施例或说明书中所鉴定的，任选地，CLD18多肽的细胞外结构域可在跨膜结构域／细胞外结构域边界的任一侧含有约5个或更少的氨基酸，本发明涵盖了带有或不带相关信号肽的这些多肽，以及编码它们的核酸。
[0228] 术语“CLD18变体”应包括(i)CLD18剪接变体，(ii)CLD18翻译后修饰变体，特别是包括N-糖基化状态不同的变体，(iii)CLD18构象变体，特别是包括CLD18-构象-1、CLD18-构象-2和CLD18-构象-3，(iv)位于胞间紧密连接处的游离CLD18和同型／异型相关联变体，(v)CLD18癌症相关变体和CLD18非癌症相关变体。
[0229] 术语“脂筏(raft)”指位于细胞质膜外小叶区中的富含鞘脂和胆固醇的膜微结构域。某些蛋白质结合到这些结构域中的能力及其形成“聚集体”或“病灶聚集体”的能力可影响该蛋白质的功能。例如，CLD18分子在结合本发明抗体后迁移到这些结构中，这在质膜中产生高密度的CLD18抗原-抗体复合物。这些高密度的CLD18抗原-抗体复合物能在CDC过程中有效活化补体系统。
[0230] 术语“构象”和“拓扑”描述整合的膜分子如何定位在细胞表面的膜中，特别地，其哪个区域在胞外并因而适合结合抗体。例如，CLD18可以三种不同构象存在，这很可能取决于它是否以同聚体或异聚体为优势，或者它是整合在超分子紧密连接结构中还是“游离的”。这些不同的状态导致适于结合抗体的不同表位。
[0231] 根据本发明，术语“疾病”指任何病理状态，包括癌症，特别是本文所述的癌症形式。本文中任何对癌症或特定癌症形式的引用还包括其癌转移。
[0232] “肿瘤”指一组异常的细胞或组织，它们通过快速、不受控制的细胞增殖来生长，并在引发该新生物生长的刺激停止后仍继续生长。肿瘤显示出部分或完全缺失结构的组织以及与正常组织的功能协调，并通常形成可以为良性或恶性的独特组织块。
[0233] “转移”指癌细胞从其初始部位传播到身体的其他部位。转移的形成是非常复杂的过程，依赖于恶性细胞从原发肿瘤中脱离、侵袭胞外基质、透过内皮基底膜以进入体腔和血管以及其后由血转运后浸润靶器官。最后，新肿瘤在靶部位的生长依赖于血管发生。肿瘤转移经常甚至在切除原发肿瘤后发生，因为肿瘤细胞或组分可能残留并发展出转移潜力。在一个实施方案中，本发明的术语“转移”指“远端转移”，这是指远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。可使用本发明抗体治疗的一个具体转移形式是来自以胃癌为原发部位的转移。在一些优选实施方案中，这些胃癌转移是库肯勃氏瘤、腹膜转移和／或淋巴结转移。
[0234] 库肯勃氏瘤是不常见的卵巢转移肿瘤，其占所有卵巢肿瘤的1％到2％。库肯勃氏瘤的预后仍然非常差，尚没有针对库肯勃氏瘤的成熟治疗。库肯勃氏瘤是卵巢的转移性印戒细胞腺癌。在大部分库肯勃氏瘤病例中(70％)，胃是其原发部位。结肠、阑尾和乳腺(主要是浸润性小叶癌)是第二常见的原发部位。很少见报道来自胆囊、胆管、胰腺、小肠、肝胰壶腹、子宫颈和膀胱／脐尿管的库肯勃氏瘤的病例。原发癌症的诊断和随后发现卵巢转移的间隔通常是6个月或更短，但是也报道有更长的间隔。在许多病例中，原发肿瘤非常小，可能检测不到。仅在20％至30％的病例中得到之前的胃癌或其它器官癌症史。
[0235] 库肯勃氏瘤是癌症选择性散播的例子，最常见为胃-卵巢轴线。此肿瘤散播轴线在历史上引起了许多病理学家的注意，尤其是当发现胃癌选择性转移到卵巢而不涉及其它组织时。胃癌向卵巢的转移途径在很长时间中曾经是一个谜，但现在已经清楚逆行性淋巴散播是转移的最可能途径。
[0236] 患有库肯勃氏瘤的女性相对于患转移性癌症的患者来说趋向于非常年轻，其通常为40多岁，平均45岁。这种年轻的年龄分布可部分地与年轻女性中胃印戒细胞瘤的频率增加有关。常见症状通常涉及卵巢累及，最常见的是腹部疼痛和膨胀(主要是由于一般位于两侧并且经常较大的卵巢实体)。其余患者具有非特异性的胃肠症状，或者无症状。另外，据报道库肯勃氏瘤与卵巢基质所产生的激素导致的男性化有关。50％的病例中存在腹水，并且通常显示出恶性细胞。
[0237] 在超过80％的报告病例中，库肯勃氏瘤是两侧的。卵巢经常不对称地增大，具有圆凸的外形。切片表面是黄色或白色，它们通常是实心的，尽管它们有时是囊性的。重要的是，具有库肯勃氏瘤的卵巢的囊表面通常是光滑的，并且没有粘连和腹膜沉积。值得注意的是，其它转移到卵巢的肿瘤倾向于与表面植入有关。这可以解释为什么库肯勃氏瘤的大致形态令人迷惑地好似原发卵巢肿瘤。但是，库肯勃氏瘤中的两侧对称与其转移的特性相一致。
[0238] 患有库肯勃氏瘤的患者总致死率非常高。大部分患者在两年内死去(存活期中值：14个月)。一些研究表明在原发肿瘤是在卵巢转移被发现后才鉴定出时，预后很差，并且如果始终未检查出原发肿瘤的话，预后更差。
[0239] 文献中对于库肯勃氏瘤尚未明确地建立最优的治疗策略。是否应该手术切除尚未得到充分地认识。化学疗法或放射疗法对库肯勃氏瘤患者的预后没有显著作用。
[0240] 术语“治疗疾病”包括疾病或其症状的治疗、持续时间的缩短、改善、预防、延缓或抑制其发展或恶化，或者延缓其发作。
[0241] 根据本发明，样品可以是根据本发明可用的任何样品，特别是生物样品如组织样品(包括体液)和／或细胞样品，并可以常规方式获得，例如通过组织活检(包括钻孔活检)和通过收集血、支气管吸出物、痰、尿、排泄物或其他体液来获得。根据本发明，术语“生物样品”还包括生物样品的级分。
[0242] 术语“抗体”指包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合部分的糖蛋白。术语“抗体”还包括抗体(特别是本文所述抗体)的所有重组形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及任何与抗原结合的抗体片段和下文所述的衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL区可进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守区域中。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
[0243] 术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和／或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
[0244] 术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中每个重链和轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。一般地，轻链和重链的可变区均模拟来自一个哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种的抗体序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点是可使用易于获得的B细胞或来自非人宿主生物的杂交瘤从目前已知的来源中方便地产生可变区，而与其组合的恒定区来自例如人细胞制备物。所述可变区具有易于制备的优点，并且特异性不受来源的影响，而由于恒定区为人类，因此该抗体在注射时引发人对象免疫应答的可能性将比恒定区来自非人来源时更低。然而，定义不限于此具体实例。
[0245] 本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部位”)指抗体中保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。属于抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)；(vi)独立的互补性决定区(CDR)，和(vii)可任选地通过合成接头连接的两个或更多个独立的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接在一起，所述接头使它们成为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成一价分子(称为单链Fv(scFv)，参阅如Bird等(1988)Science242：423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这样的单链抗体还旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。另一实例为包含以下部分的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白：(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与该铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。所述结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003／
0118592和US2003／0133939中有进一步描述。这些抗体片段使用本领域技术人员公知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选所述片段。
0118592和US2003／0133939中有进一步描述。这些抗体片段使用本领域技术人员公知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选所述片段。
[0246] 术语“表位”指能够与抗体结合的蛋白质决定簇，其中术语“结合”在本文中优选指特异性结合。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位与非构象表位的区别在于在变性剂存在下前者丧失结合，而后者则不然。
[0247] 本文使用的术语“不连续表位”指蛋白质抗原上由蛋白质一级序列中至少两个分开区域组成的构象表位。
[0248] 术语“双特异性分子”旨在包括具有两种不同结合特异性的任何试剂，如蛋白质、肽或者蛋白质或肽复合物。例如，该分子可与(a)细胞表面抗原，和(b)效应细胞表面的Fc受体结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“异种特异性分子”旨在包括具有多于两种不同结合特异性的任何试剂，如蛋白质、肽或者蛋白质或肽复合物。例如，例如，该分子可与(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面的Fc受体，和(c)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，本发明包括但不仅限于针对CLD18并针对其他靶标(如效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“双特异性抗体”还包括双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，以至于不允许同一链上的两个结构域配对，从而迫使结构域与另一链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参阅如Holliger,P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure2：1121-1123)。
[0249] 本发明还包括本文所述抗体的衍生物。术语“抗体衍生物”指抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一试剂或抗体的缀合物。在如下情况下本文中使用抗体“来自”特定生殖系序列：即如果抗体通过免疫动物或通过筛选免疫球蛋白基因文库而得自一系统，并且其中所选抗体的氨基酸序列与该生殖系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，来自特定生殖系序列的抗体将与该生殖系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列显示不多于10个氨基酸差异，更优选不多于5个氨基酸差异，或者甚至更优选不多于4、3、2或1个氨基酸差异。
[0250] 本文使用的术语“异源抗体”指连接在一起的两个或更多个抗体、其衍生物或抗原结合区，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞表面的Fc受体的结合特异性以及对靶细胞(如肿瘤细胞)上的抗原或表位的结合特异性。
[0251] 本文所述的抗体可以是人抗体。本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有来自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含不是由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
[0252] 本文使用的术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。在一个实施方案中，单克隆抗体通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的得自非人动物(例如小鼠)的B细胞。
[0253] 本文使用的术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(如转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
[0254] 本文使用的术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS／0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞或真菌(包括酵母细胞)。
[0255] 本文使用的术语“异源抗体”就产生这种抗体的转基因生物进行定义。该术语指这样的抗体，其氨基酸序列或编码核酸序列对应于不包括该转基因生物的生物，并且通常来自与该转基因生物不同的物种。
[0256] 本文使用的术语“异源杂合抗体(heterohybrid antibody)”指具有生物来源不同的轻链和重链的抗体。例如，具有与小鼠轻链连接的人重链的抗体是异源杂合抗体。
[0257] 本文所述抗体优选是分离的。本文使用的术语“分离的抗体”旨在指基本不含抗原特异性不同之其他抗体的抗体(例如，特异性结合CLD18的分离抗体基本不含特异性结合除CLD18以外抗原的抗体)。然而，与人CLD18的表位、同工型或变体特异性结合的分离的抗体可与其他相关抗原(如来自其他物种的抗原，如CLD18种间同源物)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和／或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合指具有不同特异性并组合在明确定义的组合物中的抗体。
[0258] 根据本发明，术语“结合”优选指“特异性结合”。本文使用的术语“特异性结合”指与预定抗原结合的抗体。通常，抗体结合的亲和力对应于约1×10-7M或更小的KD，并且与预定抗原结合的亲和力所对应的KD比其结合除该预定抗原以外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)或密切相关抗原的亲和力低至少两个数量级。
[0259] 本文使用的术语“KD”(M)旨在指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0260] 本文使用的术语“同种型”(isotype)指重链恒定区基因所编码的抗体类别(如IgM或IgG1)。
[0261] 本文使用的术语“同种型转换”(isotype switching)指抗体的类别或同种型由一个Ig类别变成另一Ig类别的现象。
[0262] 应用于某对象时，本文使用的术语“天然存在的”指该对象可见于自然界这一事实。例如，存在于可从自然界来源分离的生物(包括病毒)中，并且在实验室中未有意进行人工修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0263] 本文使用的术语“重排”指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段在编码基本完整VH或VL结构域的构象中分别位于紧邻D-J或J区段的位置。重排的免疫球蛋白(抗体)基因座可通过与生殖系DNA的比较来鉴定，重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体／九聚体同源性元件。
[0264] 涉及V区段时，本文使用的术语“未重排的”或“生殖系构型”指V区段未重组为与D或J区段紧邻的构象。
[0265] 本文使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。
[0266] 本发明所述的核酸优选是分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”指该核酸是(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是可通过重组DNA技术操作的核酸。
[0267] 根据本发明，核酸单独存在或与其他核酸组合存在，所述其他核酸可以是同源或异源的。在一些优选的实施方案中，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列对于所述核酸可以是同源或异源的。术语“同源”指还天然地与表达控制序列功能性连接的核酸，术语“异源”指核酸不是天然地与该表达控制序列功能性连接。
[0268] 如果表达RNA和／或蛋白质或肽的核酸与表达控制序列以所述核酸的表达或转录处在所述表达控制序列的控制或影响之下的方式彼此共价连接，则它们彼此“功能性”连接。如果该核酸待翻译成功能性蛋白质，而其带有与编码序列功能性连接的表达控制序列，所述表达控制序列的诱导引起所述核酸的转录，而不导致编码序列中的移码或导致所述序列不能翻译成所需蛋白质或肽。
[0269] 根据本发明，术语“表达控制序列”包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。在本发明的一些具体实施方案中，所述表达控制序列可受到调节。表达控制序列的确切结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5′非转录序列和5′及3′非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5′非转录表达控制序列包含启动子区，启动子区包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。
[0270] 根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”指这样的核酸序列：其位于所表达核酸序列的上游(5′)，并通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点来控制该序列的表达。“启动子区”可包括用于参与基因转录调节的其他因子的其他识别和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以为“诱导型”，可应答于诱导物而起始转录，或者如果转录不受诱导物的控制则可以为“组成型”。如果诱导剂不存在，则诱导型启动子控制下的基因不表达，或表达程度很低。存在诱导物时，该基因开始转录，或者转录水平提高。一般而言，这通过特异性转录因子的结合来介导。
[0271] 本发明优选的启动子包括用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，并包含或不包含额外的内含子。
[0272] 根据本发明，术语“表达”以其最普遍的含义使用，包括产生RNA或者RNA和蛋白质／肽。还包括核酸的部分表达。此外，表达可瞬时进行或稳定进行。
[0273] 在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子存在于载体中，适当时还带有控制该核酸表达的启动子。术语“载体”在本文中以其最普遍的意义使用，包括用于核酸的任何中间载体，所述载体使得所述核酸能够例如引入原核和／或真核细胞中，并且适当时整合进基因组。这类载体优选在该细胞中复制和／或表达。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。本文使用的术语“质粒”一般指能独立于染色体DNA进行复制的染色体外遗传物质的构建体，通常为环状DNA双链体。
[0274] 就用于表达抗体的载体而言，抗体重链及轻链存在于不同载体中的载体类型和重链及轻链存在于同一载体中的载体类型均可使用。
[0275] 本文就特定核酸和氨基酸序列(如序列表中所示)而言提供的教导应理解为还涉及对所述特定序列的修饰，所述修饰产生与所述特定序列功能等价的序列，例如显示与该特定氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列，以及编码显示与该特定核酸序列所编码氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列的核酸序列。一个重要的特性是保留抗体与其靶标的结合，或者维持抗体的效应子功能。优选地，就特定序列而言进行了修饰的序列在替换抗体中的该特定序列时保留所述抗体与CLD18的结合，并优选保留所述抗体如本文所述的功能，例如CDC介导的裂解作用或ADCC介导的裂解作用。
[0276] 本领域技术人员会理解，特别是可以修饰CDR、高变区和可变区的序列而不丧失结合CLD18的能力。例如，CDR区可以与本文所述的抗体区域相同或高度同源。“高度同源”认为是可以在CDR中产生1至5、优选1至4例如1至3或1或2个替换。此外，高变区和可变区可被修饰，从而与本文具体公开的抗体区域显示显著的同源性。
[0277] 应该理解，本文所述的特定核酸还包括为了优化特定宿主细胞或生物中的密码子使用而进行了修饰的核酸。生物之间密码子使用的差异可引起多种关于异源基因表达的问题。通过改变原始序列中的一个或多个核苷酸而进行密码子优化可在待表达所述核酸的同源或异源宿主中引起核酸表达的优化，特别是翻译效率的优化。例如，如果根据本发明需使用来自人并编码抗体恒定区和／或构架区的核酸，例如用于制备嵌合或人源化抗体，则为了优化密码子使用而修饰所述核酸可能是优选的，特别是在如果所述核酸(任选地与异源核酸如来自本文所述其他生物的核酸融合)需在不同于人的生物(如小鼠或仓鼠)细胞中表达的情况下。例如，分别编码人轻链和重链恒定区的核酸序列(如SEQ ID NO：40和45的序列)可经修饰，以包含一个或多个、优选至少1、2、3、4、5、10、15、20个并优选多达10、15、20、25、30、50、70或100个或更多核苷酸替换，所述替换引起密码子使用的优化，但不引起氨基酸序列的改变。这样的核苷酸替换优选指分别将SEQ ID NO：40和45中的核苷酸替换为不引起所编码氨基酸序列改变的经修饰的对应物，所述核苷酸替换分别选自下文SEQ ID NO：40和45之比对中所示的替换；或者指分别编码人轻链和重链恒定区的其他核酸序列中相应位置的相应替换。优选地，在编码人轻链和重链恒定区的核酸序列中分别实现下文SEQ ID NO：40和45的比对中所示的全部替换，所述替换使用不引起所编码氨基酸序列改变的经修饰对应物。
[0278] SEQ ID NO：40与SEQ ID NO：147的比对：
[0279]
[0280] SEQ ID NO：45与SEQ ID NO：149的比对：
[0281]
[0282]
[0283] 此外，根据本发明，可能需要修饰本文所述氨基酸序列，特别是人重链恒定区的序列，以使该序列适用于所期望的同种异型，例如可见于白种人中的同种异型。这样的修饰优选选自以下SEQ ID NO：46中的氨基酸替换，或者其他人重链恒定区中相应位置的替换：K93R、D235E和L237M。优选地，所有这些修饰均包含在人重链恒定区的氨基酸序列中。
[0284] 根据本发明，术语“相应位置”指两核酸或蛋白质序列的序列比对中彼此对应的位置。
[0285] 优选地，本文所述特定核酸序列与对所述特定核酸序列进行了修饰的核酸序列之间的同一性至少为70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，或者最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。对于CLD18核酸变体，同一性优选针对至少约300、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约780个核苷酸区域给出。在一些优选实施方案中，同一性是针对参考核酸序列(例如序列表中的核酸序列)的全长给出。优选地，两序列能够彼此杂交并形成稳定的双链体，所述杂交优选在允许多核苷酸特异性杂交的条件(严格条件)下进行。严格条件描述于例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor,New York，1989或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.，New York，其指例如在65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中杂交。SSC为0.15M氯化钠／0.15M柠檬酸钠，pH7。杂交后，洗涤已转移有DNA的膜，例如室温下在2×SSC中洗涤，接着在高达68℃下在0.1-0.5×SSC／0.1×SDS中洗涤。
[0286] 优选地，本文所述特定氨基酸序列与对所述特定氨基酸序列进行了修饰或其变体的氨基酸序列之间(例如显示显著同一性的氨基酸序列之间)的相似性(优选同一性)至少为70％，优选至少80％，甚至更优选至少90％，或者最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。对于CLD18多肽变体，相似性或同一性优选针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180、至少约200、至少约220、至少约240、至少约250或260个氨基酸区域给出。在一些优选实施方案中，同一性是针对参考氨基酸序列(例如序列表中的氨基酸序列)的全长给出。
[0287] 所有上述修饰序列或序列变体均在本发明的范围之内。
[0288] “序列相似性”指相同或显示保守性氨基酸替换的氨基酸的百分比。两多肽或核酸序列之间的“序列同一性”指所述序列间相同的氨基酸或核苷酸的百分比。
[0289] “百分比同一性”在最佳比对之后获得，这一百分比完全是统计学意义上的，两序列之间的差异随机分布在其全长上。两核苷酸或氨基酸序列之间的序列比较通过在对其进行最佳比对后比较其序列来常规地进行，所述比较通过区段或“比较窗”来进行，以鉴定和比较序列相似的局部区域。除了手工产生以外，用于比较的序列最佳比对还可通过以下手段产生：Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法，Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA85,2444的相似性检索法或者使用这些算法的计算机程序(GAP，BESTFIT，FASTA，BLAST P，BLAST N和TFASTA，在威斯康辛遗传软件包中，遗传计算组，575Science Drive，Madison，Wis.)。
[0290] 通过以下方法计算百分比同一性：测定进行比较的两序列之间相同的位置数，用该数除以进行比较的位置数，用结果乘以100，从而得到这两个序列之间的百分比同一性。
[0291] “保守性替换”可以基于如所涉及残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和／或两亲性质方面的相似性来进行。例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；(d)带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。替换一般可在(a)-(d)组内进行。此外，甘氨酸和脯氨酸可基于其破坏α螺旋的能力而彼此替换。可以在下列组中进行一些优选的替换：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。在已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术的条件下，技术人员可容易地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。
[0292] 本发明包括在Fc区中进行了修改以改变该抗体功能或药代动力学特性的抗体。这样的修改可引起C1q结合和CDC的降低或提高，或者FcγR结合和ADCC的降低或提高。例如，可以在重链恒定区的一个或多个氨基酸残基中进行替换，从而与修饰抗体相比引起效应子功能的改变同时保留结合抗原的能力，参阅US5,624,821和US5,648,260。
[0293] 可以修饰Ig恒定结构域或Ig样恒定结构域的补救受体表位以使该分子不包含完整的CH2结构域或完整的Ig Fc区，从而提高抗体的体内半衰期，参阅US6,121,022和US6,194,551。还可以通过在Fc区中产生突变来提高体内半衰期，例如用苏氨酸替换252位的亮氨酸、用苏氨酸替换254位的丝氨酸或者用苏氨酸替换256位的苯丙氨酸，参阅US6,277,
375。
375。
[0294] 此外，可以改变抗体的糖基化模式，以改变该抗体的效应子功能。例如，可以在不加入通常附着在Fc区297位Ash上的岩藻糖的转染瘤中表达抗体，以增强该Fc区对Fc受体的亲和力，这继而将引起NK细胞存在下该抗体ADCC的提高，参阅Shield等(2002)JBC，277：26733。此外，可以改变糖基化以改变CDC。
[0295] 或者，在另一实施方案中，可以在全部或部分抗CLD18抗体编码序列中随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，可针对结合活性对得到的经修饰抗CLD18抗体进行筛选。
[0296] 本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指其中引入了重组表达载体的细胞。应该理解，这样的术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且指这些细胞的后代。在后续世代中由于突变或环境影响而可能发生某些改变，这些后代事实上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。例如，重组宿主细胞包括转染瘤，如CHO细胞，NS／0细胞和淋巴细胞。
[0298] 术语“转基因动物”指这样的动物：其基因组中包含一个或多个转基因(优选重链和／或轻链转基因)或者转染色体(整合或未整合进该动物的天然基因组DNA)，并且优选能够表达该转基因。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因以及人重链转基因或人重链转染色体，从而所述小鼠在用CLD18抗原和／或表达CLD18的细胞进行免疫时产生人抗CLD18抗体。所述人重链转基因可整合进该小鼠的染色体DNA中，像转基因小鼠的情况那样，例如HuMAb小鼠如HCo7或HCo12小鼠，或者所述人重链转基因可以在染色体外维持，像WO02／43478所述转染色体(如KM)小鼠的情况那样。这样的转基因和转染色体小鼠可能能够通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生针对CLD18的多种人单克隆抗体同种型(如IgG、IgA和／或IgE)。
[0299] 本文使用的“减少”或“抑制”指使得水平(例如细胞扩增的水平)整体降低优选5％或更多、10％或更多、20％或更多，更优选50％或更多，最优选75％或更多的能力。
[0300] mAb的作用机制
[0301] 尽管下文提供了关于本发明抗体疗效背后的机制方面的一些考虑，但这不应认为是以任何方式限制本发明。
[0302] 本文所述抗体优选与免疫系统的组分相互作用，优选通过ADCC或CDC发生。本发明的抗体还可用于靶向载荷(如放射性同位素、药物或毒素)以直接杀伤肿瘤细胞，或者可与常规化学治疗剂协同使用，通过补充性作用机制攻击肿瘤，所述机制可包括由于化学治疗对T淋巴细胞的细胞毒性副作用而受损的抗肿瘤免疫应答。但是，本发明的抗体还可简单地通过结合细胞表面上的CLD18发挥作用，从而，例如阻断细胞的增殖。
[0303] 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
[0304] ADCC描述本文所述效应细胞特别是淋巴细胞的细胞杀伤能力，这优选地需要靶细胞被抗体标记。
[0305] ADCC优选在抗体结合肿瘤细胞上的抗原并且抗体Fc结构域结合免疫效应细胞表面的Fc受体(FcR)时发生。已经鉴定了若干Fc受体家族，特定的细胞群特征性地表达确定的Fc受体。ADCC可以看作是直接诱导不同程度的直接肿瘤破坏的机制，所述破坏引起抗原呈递并诱导指向肿瘤的T细胞应答。优选地，ADCC的体内诱导将引起指向肿瘤的T细胞应答和来自宿主的抗体应答。
[0306] 补体依赖性细胞毒性
[0307] CDC是抗体指导的另一细胞杀伤方法。对于补体活化，IgM是最有效的同种型。IgG1和IgG3在通过经典补体活化途径指导CDC方面也都非常有效。优选地，在这一级联中，抗原-抗体复合物的形成导致紧邻参与抗体分子(例如IgG分子)CH2结构域的多个C1q结合位点暴露出来(C1q是补体C1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前低亲和力的C1q-IgG相互作用转变成高亲合力相互作用，这触发了包括一系列其他补体蛋白的级联事件，并引起效应细胞趋化／活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，该补体级联最终形成膜攻击复合物，它在细胞膜中产生孔，有利于水和溶质自由穿行于细胞内外。
[0308] 抗体的产生
[0309] 本发明的抗体可通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体法，例如Kohler和Milstein，Nature256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方案，但也可以利用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化，或者使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
[0310] 用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是小鼠系统。小鼠中杂交瘤的产生是已经非常成熟的方案。分离用于融合的免疫脾细胞的免疫操作和技术为本领域所公知。融合配偶体(fusion partner)(如小鼠骨髓瘤细胞)和融合操作也是已知的。
[0311] 用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他动物系统为大鼠和兔系统(如Spieker-Polet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)所述，还可参阅Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。
[0312] 在另一优选的实施方案中，针对CLD18的人单克隆抗体可使用带有部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，在本文中总称为“转基因小鼠”。可按照WO2004035607中对CD20的详细描述在这些转基因小鼠中产生人抗体。
[0313] 产生单克隆抗体的另一策略是从产生确定策略抗体的淋巴细胞中直接分离编码抗体的基因，参阅如Babcock等，1996；A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy。重组抗体工程的细节还可参阅Welschof和Kraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.Lo Antibody Engineering ISBN1-58829-092-1。
[0314] 免疫
[0315] 为了产生针对CLD18的抗体，可以如所述用来自CLD18序列的载体缀合肽、重组表达的CLD18抗原或其片段的富集制备物和／或表达CLD18的细胞来免疫小鼠。或者，可以用编码全长人CLD18的DNA(如SEQ ID NO：1)或其片段(特别是SEQ ID NO：15、17和19的片段)免疫小鼠。在使用纯化或富集的CLD18抗原制备物进行的免疫不产生抗体的事件中，还可以用表达CLD18的细胞(如细胞系)免疫小鼠，以促进免疫应答。
[0316] 可以用通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品在免疫方案的全程中监测免疫应答。可将抗CLD18免疫球蛋白效价足够的小鼠用于融合。可以在处死并摘除脾之前3天用表达CLD18的细胞腹腔内或静脉内对小鼠进行加强免疫，以提高分泌特异性抗体的杂交瘤的比率。
[0317] 产生生产单克隆抗体的杂交瘤
[0318] 为了产生生产CLD18单克隆抗体的杂交瘤，可从免疫小鼠中分离脾细胞和淋巴结细胞，并与适当的永生化细胞系(如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。接着可针对抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。接着可以通过ELISA对单个孔筛选分泌抗体的杂交瘤。通过使用CLD18表达细胞进行的免疫荧光和FACS分析，可以鉴定对CLD18具有特异性的抗体。可将分泌该抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且如果抗CLD18单克隆抗体仍为阳性则可以通过有限稀释进行亚克隆。接着可以体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生抗体用于表征。
[0319] 产生生产单克隆抗体的转染瘤
[0320] 本发明的抗体还可以在宿主细胞转染瘤中产生，例如使用本领域熟知的重组DNA技术与基因转染技术的组合来进行(Morrison，S.(1985)Science229：1202)。
[0321] 例如，在一个实施方案中，可将目的基因(如抗体基因)连接进表达载体如真核表达质粒中，例如通过WO87／04462、WO89／01036和EP 338 841中所述GS基因表达系统或本领域熟知的其他表达系统来进行。可将带有所克隆抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞中，例如CHO细胞、NS／0细胞、HEK293T细胞或HEK293细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞。用于引入这些基因的方法可以是本领域已描述过的方法，如电穿孔、lipofectine、lipofectamine或其他。将这些抗体基因引入宿主细胞后，可以鉴定并选择表达该抗体的细胞。这些细胞代表其后可扩增其表达水平并扩大规模以生产抗体的转染瘤。重组抗体可从这些培养物上清液和／或细胞中分离和纯化。或者，克隆的抗体基因可以在其他表达系统中表达，包括原核细胞如微生物，例如大肠杆菌。此外，抗体也可以在非人转基因动物中产生，例如在绵羊和兔的乳中或在鸡蛋中产生，或者在转基因植物中产生，参阅如Verma，R.，等(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，等(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157以及Fischer,R.，等(1999)Biol.Chem.380：825-839。
[0322] 使用部分抗体序列表达完整抗体(即人源化和嵌合)
[0323] a)嵌合
[0324] 用毒素或放射性同位素进行标记时，小鼠单克隆抗体可在人中用作治疗性抗体。未标记的小鼠抗体在重复应用时在人中具有高免疫原性，导致疗效降低。主要的免疫原性由重链恒定区介导。如果对各个抗体进行嵌合或人源化，则小鼠抗体在人中的免疫原性可以降低或者完全避免。嵌合抗体是不同部分来自不同动物物种的抗体，例如具有来自小鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。抗体的嵌合通过将小鼠抗体重链和轻链可变区与人重链和轻链恒定区连接在一起来实现(如Kraus等，Methods in Molecular Biology series，Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8所述)。在一个优选的实施方案中，嵌合抗体通过将人κ轻链恒定区与小鼠轻链可变区连接来产生。在另一优选的实施方案中，嵌合抗体可通过将人λ轻链恒定区与小鼠轻链可变区连接来产生。用于产生嵌合抗体的优选重链恒定区为IgG1、IgG3和IgG4。用于产生嵌合抗体的其他优选的重链恒定区为IgG2、IgA、IgD和IgM。
[0325] b)人源化
[0326] 抗体主要通过位于六个重链及轻链互补性决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，在单个抗体之间CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更为多样。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含来自所述特定天然存在抗体的CDR序列，其移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参阅如Riechmann，L.等(1998)Nature332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature321：522-525以及Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的框架序列可得自包含生殖系抗体基因序列的公共DNA数据库。这些生殖系序列将不同于成熟的抗体基因序列，因为它们不包含完整装配的可变基因，该基因是在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形成的。生殖系基因序列还将在均匀穿过可变区的个别处不同于高亲和力次级抗体谱(secondary repertoire antibody)的序列。例如，体细胞突变在框架区1的氨基端部分和构架区4的羧基端部分中相对少见。此外，许多体细胞突变不显著改变抗体的结合特性。因此，为了重建具有与原始抗体相似的结合特性的完整重组抗体，没有必要获得特定抗体的完整DNA序列(参阅WO99／
45962)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列对于该目的而言通常是足够的。所述部分序列用于确定那些生殖系可变并连接对重组抗体可变基因有贡献的基因区段。接着使用生殖系序列填补该可变区中缺少的部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切割掉，对最终抗体的特性没有贡献。为了加入缺少的序列，可通过连接或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸组合。或者，可以将整个可变区合成为一组短的重叠寡核苷酸，并通过PCR扩增组合以产生全合成的可变区克隆。这种方法具有一些优点，例如消除或包含特定的限制性位点，或者优化特定的密码子。
45962)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列对于该目的而言通常是足够的。所述部分序列用于确定那些生殖系可变并连接对重组抗体可变基因有贡献的基因区段。接着使用生殖系序列填补该可变区中缺少的部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切割掉，对最终抗体的特性没有贡献。为了加入缺少的序列，可通过连接或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸组合。或者，可以将整个可变区合成为一组短的重叠寡核苷酸，并通过PCR扩增组合以产生全合成的可变区克隆。这种方法具有一些优点，例如消除或包含特定的限制性位点，或者优化特定的密码子。
[0327] 使用来自杂交瘤的重链及轻链转录物的核苷酸序列来设计合成寡核苷酸的重叠组，以产生与天然序列的氨基酸编码容量相同的合成V序列。合成的重链和κ链序列可以三种方式不同于天然序列：破坏了重复核苷酸碱基串，以便于寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则掺入了最佳翻译起始位点(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)；以及改造得到翻译起始位点上游的HindIII位点。
[0328] 对于重链和轻链可变区而言，经优化的编码链及相应非编码链的序列在相应非编码寡核苷酸的大致中点处打断成约30-50个核苷酸。因此，对于每条链，可将所述寡核苷酸装配成为跨越150-400个核苷酸的区段的重叠双链组合。接着将该库用作模板产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常将单个可变区寡核苷酸组分为两个库，它们各自扩增以产生两个重叠的PCR产物。接着通过PCR扩增来组合这些重叠产物，以形成完整的可变区。在PCR扩增中可能需要包括重链或轻链恒定区的重叠片段，以产生可容易地克隆进表达载体构建体的片段。
[0329] 接着将重建的嵌合或人源化重链及轻链可变区与克隆的启动子、前导序列、翻译起始序列、恒定区、3’非翻译序列、多腺苷酸化序列和转录终止序列组合，以形成表达载体构建体。接着可将重链及轻链表达构建体组合进单个载体，共转染、连续转染或分别转染进宿主细胞中，接着所述宿主细胞融合形成表达两种链的宿主细胞。下文描述了用于构建人IgGκ表达载体的质粒。构建所述质粒使得PCR扩增的V重链及Vκ轻链cDNA序列可用于重建完整的重链及轻链小基因(minigene)。这些质粒可用于表达全人抗体或者嵌合IgG1κ或IgG4κ抗体。可以构建类似的质粒用于表达其他重链同种型，或者表达包含λ轻链的抗体。
[0330] 因此，在本发明的另一方面中，使用本发明抗CLD18抗体的结构特征来产生结构上相关的人源化抗CLD18抗体，所述人源化抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如结合CLD18。更具体地，可通过重组方式将小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR区与已知的人框架区和CDR组合，以产生本发明另外的经重组改造的人源化抗CLD18抗体。
[0331] 与抗原表达细胞结合
[0332] 抗体结合CLD18的能力可使用标准结合测定进行测定，例如实施例中公开的测定(如ELISA、Western印迹、免疫荧光和流式细胞术)。
[0333] 对抗体结合的表征
[0334] 为了纯化抗CLD18抗体，可以在2升离心瓶中培养选定的杂交瘤，以纯化单克隆抗体。或者，可以在基于透析的生物反应器中产生抗CLD18抗体。可以过滤上清液并在必要时进行浓缩，其后用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析。可通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。缓冲液可交换成PBS，并使用1.43的消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体分成等分试样并保存于-80℃。
[0335] 为了确定选定的抗CLD18单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用定点诱变或多点定向诱变。
[0336] 确定同种型
[0337] 为了确定所纯化抗体的同种型，可以使用多种商品试剂盒(如Zymed、Roche Diagnostics)进行同种型ELISA。可使用抗小鼠Ig包被微量滴定板的孔。封闭后，在环境温度下使板与单克隆抗体或纯化的同种型对照反应2小时。接着使孔与小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3、IgA或小鼠IgM特异性过氧化物酶缀合探针反应。洗涤后，用ABTS底物(1mg／ml)使板显色并在405-650处分析OD。或者，可以如生产商所述使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche，目录号1493027)。
[0338] 流式细胞术分析
[0339] 为了证明免疫小鼠的血清中存在抗CLD18抗体或者证明单克隆抗体结合表达CLD18的活细胞，可以使用流式细胞术。可将天然表达或在转染CLD18后表达的细胞系以及缺乏CLD18表达的阴性对照(在标准生长条件下培养)与杂交瘤上清液中或含1％FBS的PBS中不同浓度的单克隆抗体混合，并可在4℃下孵育30分钟。洗涤后，可在与第一抗体染色相同的条件下使APC或Alexa647标记的抗IgG抗体与结合了CLD18的单克隆抗体结合。可通过使用FACS装置的流式细胞术分析样品，其中使用光散射和侧散射特性对单个活细胞设置门控。为了在单个测量中区分CLD18特异性单克隆抗体与非特异性结合物，可以使用共转染法。可以如上述对瞬时转染了编码CLD18和荧光标记的质粒的细胞进行染色。转染细胞可在与抗体染色细胞不同的荧光通道中检测到。由于大部分转染细胞同时表达两种转基因，因此CLD18特异性单克隆抗体优先与表达荧光标记的细胞结合，而非特异性抗体以相当的比率与未转染细胞结合。作为流式细胞术测定的补充或替代，可以使用利用荧光显微术的替代性测定。可以完全按上述染色细胞，并通过荧光显微术来检查细胞。
[0340] 如果特定贴壁细胞失去(通过例如细胞脱离)与临近细胞的细胞-细胞接触，则紧密连接蛋白通常被内化。可通过以下手段优化CLD18的细胞表面表达：a)调整培养条件，如按标准方式以更高的细胞密度进行培养；使用温和的脱离条件(如2mM EDTA／PBS或accutase酶)、在室温下处理以及添加内吞作用的抑制剂(如叠氮化钠)或CLD18转录或翻译的激活剂，以及b)选择并克隆在细胞表面维持高水平CLD18的细胞，例如通过对转染细胞使用抗生素进行选择，通过免疫磁性或FACS细胞分选以及通过有限稀释克隆。
[0341] 免疫荧光显微术
[0342] 为了证明免疫小鼠的血清中存在抗CLD18抗体或者证明单克隆抗体结合表达CLD18的活细胞，可以使用免疫荧光显微术分析。例如，在标准生长条件下，在补充了10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酸、100IU／ml青霉素和100μg／ml链霉素的DMEM／F12培养基中在室玻片(chamber slide)中培养自发表达或在转染CLD18后表达的细胞系以及缺乏CLD18表达的阴性对照。接着将细胞用甲醇或多聚甲醛固定，或者不作处理。接着可在25℃下使细胞与针对CLD18的单克隆抗体反应30分钟。洗涤后，可在相同条件下使细胞与Alexa555标记的抗小鼠IgG第二抗体(Molecular Probes)反应。接着可通过荧光显微术检查细胞。
[0343] 当细胞用甲醇固定或多聚甲醛固定并用Triton X-100进行透化后，可观察细胞中的总CLD18水平。在活细胞和非透化的多聚甲醛固定细胞中，可以检查CLD18的表面定位。此外，可以通过用紧密连接标记如ZO-1共染色来分析CLD18对紧密连接的靶向。此外，可以检查抗体结合以及细胞膜中CLD18定位的效果。
[0344] Western印迹
[0345] 还可以通过Western印迹测试抗CLD18IgG与CLD18抗原的反应性。简言之，可以制备来自CLD18表达细胞的细胞提取物和适当的阴性对照，并进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分开的抗原转移至硝酸纤维素膜，封闭并用待测试的单克隆抗体进行检测。可以使用抗小鼠IgG过氧化物酶检测IgG结合，并用ECL底物显色。
[0346] 免疫组化
[0347] 还可以按技术人员熟知的方式通过免疫组化来检测抗CLD18小鼠IgG与CLD18抗原的反应性，例如使用来自非癌组织或癌组织样品的多聚甲醛或丙酮固定的冷冻切片或石蜡包埋的组织切片，所述样品在常规手术过程中得自患者，或者得自接种了自主表达(如DAN-G、SNU-16或KATO-III)或在转染后表达(如HEK293)CLD18的细胞系的带有异种移植肿瘤的小鼠。为进行免疫染色，可以接种与CLD18反应的抗体，其后按照生产商的说明接种缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体(DAKO)。
[0348] 抗体在体外的吞噬及细胞杀伤活性
[0349] 除了特异性结合CLD18以外，还可以对抗CLD18抗体测试其介导吞噬和杀伤CLD18表达细胞的能力。单克隆抗体活性的体外测试将在体内模型测试之前提供初步筛选。
[0350] 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)：
[0351] 简言之，可以通过Ficoll Hypaque密度离心随后裂解污染红细胞来纯化来自健康供体的多形核细胞(polymorphonuclear cell，PMN)、NK细胞、单核细胞、单个核细胞或其他效应细胞。可将经洗涤的效应细胞悬于补充了10％热灭活胎牛血清或5％热灭活人血清的RPMI中，并按效应细胞与靶细胞的不同比例与用51Cr标记的CLD18表达靶细胞混合。或者，可以用荧光增强配体(BATDA)标记靶细胞。可通过荧光计测量死细胞所释放的增强配体与铕形成的高荧光螯合物。另一种替代技术可利用以萤光素酶转染靶细胞。接着，加入的荧光黄仅可被活细胞氧化。接着可以多种浓度加入纯化的抗CLD18IgG。可使用无关人IgG作为阴性对照。测定可在37℃进行4至20小时，取决于所使用的效应细胞类型。可通过测量培养物上清液中51Cr的释放或EuTDA螯合物的存在情况来测定样品的细胞裂解。或者，由荧光黄氧化所产生的发光可作为活细胞的度量。
[0352] 还可以多种组合测试抗CLD18单克隆抗体，以确定用多种单克隆抗体是否增强细胞裂解。
[0353] 补体依赖性细胞毒性(CDC)：
[0354] 可以使用多种已知技术来测试单克隆抗CLD18抗体介导CDC的能力。例如，可以技术人员已知的方式从血中获得补体血清。为了测定mAb的CDC活性，可以使用不同的方法。例如，可以测量51Cr释放，或者可以使用碘化丙锭(PI)排除测定来评估膜通透性的升高。简言5
之，可洗涤靶细胞并可在室温或37℃下将5×10个／ml与多种浓度的mAb孵育10-30分钟。接着可加入血清或血浆至终浓度为20％(体积／体积)，接着在37℃下孵育细胞20-30分钟。可将来自每个样品的所有细胞均加入FACS管中的PI溶液中。接着可立即使用FACSArray通过流式细胞术分析来分析该混合物。在一种替代性测定中，可以对贴壁细胞测定CDC的诱导。
4
在这种测定的一个实施方案中，在测定前24小时以3×10个细胞／孔的密度将细胞接种进平底组织培养微量滴定板。第二天除去生长培养基，并一式三份将细胞与抗体一起孵育。为测定背景裂解和最大裂解，将对照细胞分别与生长培养基或含0.2％皂苷的生长培养基一起孵育。室温孵育20分钟后，除去上清液，并将DMEM中20％(体积／体积)的人血浆或血清(预热至37℃)加入细胞，在37℃再孵育20分钟。将来自每个样品的所有细胞加入碘化丙锭溶液(10μg／ml)中。接着用含2.5μg／ml溴化乙锭的PBS替换上清液，并在520nm激发后使用Tecan Satire在600nm处测量荧光发射。特异性裂解百分比计算如下：％特异性裂解=(样品荧光／背景荧光)／(最大裂解荧光-背景荧光)×100。
之，可洗涤靶细胞并可在室温或37℃下将5×10个／ml与多种浓度的mAb孵育10-30分钟。接着可加入血清或血浆至终浓度为20％(体积／体积)，接着在37℃下孵育细胞20-30分钟。可将来自每个样品的所有细胞均加入FACS管中的PI溶液中。接着可立即使用FACSArray通过流式细胞术分析来分析该混合物。在一种替代性测定中，可以对贴壁细胞测定CDC的诱导。
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在这种测定的一个实施方案中，在测定前24小时以3×10个细胞／孔的密度将细胞接种进平底组织培养微量滴定板。第二天除去生长培养基，并一式三份将细胞与抗体一起孵育。为测定背景裂解和最大裂解，将对照细胞分别与生长培养基或含0.2％皂苷的生长培养基一起孵育。室温孵育20分钟后，除去上清液，并将DMEM中20％(体积／体积)的人血浆或血清(预热至37℃)加入细胞，在37℃再孵育20分钟。将来自每个样品的所有细胞加入碘化丙锭溶液(10μg／ml)中。接着用含2.5μg／ml溴化乙锭的PBS替换上清液，并在520nm激发后使用Tecan Satire在600nm处测量荧光发射。特异性裂解百分比计算如下：％特异性裂解=(样品荧光／背景荧光)／(最大裂解荧光-背景荧光)×100。
[0355] 通过单克隆抗体抑制细胞增殖：
[0356] 为了测试诱导凋亡的能力，例如，可将单克隆抗CLD18抗体与CLD18阳性肿瘤细胞(如SNU-16、DAN-G、KATO-III)或转染了CLD18的肿瘤细胞在37℃孵育约20小时。可以收获细胞、用Annexin-V结合缓冲液(BD biosciences)洗涤，并与缀合了FITC或APC的Annexin V(BD biosciences)在黑暗中孵育15分钟。可将来自每个样品的所有细胞加入FACS管中的PI溶液(PBS中10μg／ml)中，并立即通过流式细胞术(如上述)进行评估。或者，可以用市售的试剂盒检测单克隆抗体对细胞增殖的一般性抑制。DELFIA细胞增殖试剂盒(Perkin-Elmer,目录号AD0200)是基于测量微孔板中增殖细胞的DNA合成过程中5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)掺入的非同位素免疫测定。使用铕标记的单克隆抗体来检测掺入的BrdU。为进行抗体检测，使用固定液固定细胞并变性DNA。洗去未结合抗体并加入DELFIA诱导物，以将铕离子从标记抗体上解离到溶液中，它们在溶液中与DELFIA诱导物的组分形成高荧光螯合物。(在检测中使用时间分辨荧光术)测量的荧光与每个孔中细胞的DNA合成成比例。
[0357] 临床前研究
[0358] 还可以在体内模型(如接种了表达(如DAN-G、SNU-16或KATO-III)或在转染后表达(如HEK293)CLD18的细胞系的带有异种移植肿瘤的免疫缺陷小鼠)中测试与CLD18结合的单克隆抗体，以确定其控制表达CLD18的肿瘤细胞生长的效力。
[0359] 可以在将表达CLD18的肿瘤细胞异种移植进免疫受损小鼠或其他动物之后使用本发明抗体进行体内研究。可以对无肿瘤的小鼠施用抗体，其后注射肿瘤细胞，以测量该抗体预防肿瘤形成或肿瘤相关症状的效果。可以对带有肿瘤的小鼠施用抗体，以测定各个抗体降低肿瘤生长、转移或肿瘤相关症状的疗效。可将抗体应用与其他物质如细胞抑制药物、生长因子抑制剂、细胞周期阻断剂、血管发生抑制剂或其他抗体的应用相组合，以测定组合的协同效应和潜在毒性。为了分析本发明抗体介导的有毒副作用，可用抗体或对照试剂接种动物，并彻底研究可能与CLD18抗体疗法相关的症状。体内应用CLD18抗体可能的副作用具体包括对表达CLD18的组织(包括胃和肺)的毒性。在人和其他物种(如小鼠)中识别CLD18的抗体对于预测在人中应用单克隆CLD18抗体所介导的潜在副作用特别有用。
[0360] 表位作图
[0361] 可以如Glenn E.Morris的″Epitope Mapping Protocols(Methods in Molecular Biology)″ISBN-089603-375-9和Olwyn M.R.Westwood，Frank C.Hay的“Epitope Mapping：A Practical Approach″Practical Approach Series，248中的详细描述进行本发明抗体所识别表位的作图。
[0362] I.结合CLD18的双特异性／多特异性分子
[0363] 在本发明的另一实施方案中，针对CLD18的抗体可被衍生或与其他功能性分子(如其他肽或蛋白质，如Fab’片段)相连接，以产生结合多个结合位点或靶表位的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体可与一个或多个其他结合分子(如其他抗体、肽或结合模拟体)功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式连接)。
[0364] 因此，本发明包括双特异性和多特异性分子，其包含至少一种对CLD18的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。在本发明的一个具体实施方案中，所述第二靶表位为Fc受体，如人Fc-γRI(CD64)或人Fc-α受体(CD89)，或者为T细胞受体，如CD3。因此，本发明包括与表达Fc-γR、Fc-αR或Fc-εR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达CLD18的靶细胞均能反应的双特异性和多特异性分子。这些双特异性和多特异性分子可使表达CLD18的细胞靶向效应细胞，并可触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如CLD18表达细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧负离子的产生。
[0365] 除了抗Fc结合特异性和抗CLD18结合特异性以外，本发明的双特异性和多特异性分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，所述第三结合特异性为抗增强因子(EF)部分，例如与涉及细胞毒活性的表面蛋白结合并由此提高针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是抗体、功能性抗体片段或与给定分子(如抗原或受体)结合的配体，由此导致增强Fc受体或靶细胞抗原中结合决定簇的效应。“抗增强因子部分”可与Fc受体或靶细胞抗原结合。或者，所述抗增强因子部分可结合不同于第一和第二结合特异性所结合实体的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒T细胞(如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的免疫应答提高的其他免疫细胞)。
[0366] 在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，包括如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。该抗体还可以是轻链或重链二聚体或者任何其最小片段，如Fv或Ladner等，US4,946,778所述的单链构建体。所述抗体还可以是US2003／0118592和US2003／0133939中公开的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。
[0367] 在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性抗体包含对效应细胞表面上存在的Rc-γR或Rc-αR的结合特异性以及对靶细胞抗原(如CLD18)的第二结合特异性。
[0368] 在一个实施方案中，对Fc受体的结合特异性由单克隆抗体提供，所述抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。本文使用的术语“IgG受体”指位于1号染色体上的八个γ链基因中的任一个。这些基因编码共12种跨膜或可溶性受体同种型，分为3个Fc-γ受体类别：Fc-γRI(CD64)、Fc-γRII(CD32)和Fc-γRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，所述Fc-γ受体为人高亲和力Fc-γRI。
[0369] 这些优选单克隆抗体的产生和表征由Fanger等描述于WO88／00052和US4,954,617。这些抗体在不同于受体Fc-γ结合位点的位点处与Fc-γRI、Fc-γRII或Fc-γRIII的表位结合，因此其结合不被生理水平的IgG显著阻断。可用于本发明的特异性抗Fc-γRI抗体为mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。在另一些实施方案中，所述抗Fc-γ受体抗体为单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano，R.E等(1995)J.Immunol.155(10)：4996-5002和WO94／10332。产生H22抗体的细胞系于1992年11月4日以保藏号HA022CL1保藏于美国典型培养物保藏中心，登记号为CRL11177。
[0370] 在另一些优选的实施方案中，对Fc受体的结合特异性由结合人IgA受体(如Fc-α受体(Fc-αRI(CD89)))的抗体提供，其结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于19号染色体上的一个α基因的基因产物(Fc-αRI)。已知该基因编码55至110kDa的若干替代性剪接的跨膜同工型。Fc-αRI(CD89)在单核细胞／巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群中表达。Fc-αRI对IgA1和IgA2均具中等亲和力，这在接触细胞因子如G-CSF或GM-CSF后有所提高(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。描述了在IgA配体结合结构域之外与Fc-αRI结合的四种Fc-αRI特异性单克隆抗体，鉴定为A3、A59、A62和A77(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.148：1764)。
[0371] Fc-αRI和Fc-γRI是用于本发明的优选触发受体，因为它们(1)主要表达在免疫效应细胞上，如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞；(2)以高水平表达(如5,000-100,000／细胞)；(3)是细胞毒活性(如ADCC、吞噬作用)的介导者；(4)介导对靶向它们的抗原(包括自身抗原)增强的抗原呈递。
[0372] 在另一实施方案中，所述双特异性分子由具有互补性功能活性的两个本发明单克隆抗体组成，例如一个抗体主要通过诱导CDC来发挥作用，另一抗体主要通过诱导凋亡来发挥作用。
[0373] 本文使用的“效应细胞特异性抗体”指与效应细胞的Fc受体结合的抗体或功能性抗体片段。用于本发明的优选抗体在不结合内源免疫球蛋白的位点上与效应细胞的Fc受体结合。
[0374] 本文使用的术语“效应细胞”指参与免疫应答的效应阶段而不是免疫应答的识别和活化阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，如淋巴细胞，(如B细胞和T细胞，包括细胞裂解性T细胞(CTL)、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体，并执行特定的免疫功能。在一些优选的实施方案中，效应细胞能诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如嗜中性粒细胞能诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与特异性杀伤靶细胞和将抗原呈递至免疫系统的其他组分，或者与呈递抗原的细胞结合。在其他一些实施方案中，效应细胞能吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。特定FcR在效应细胞上的表达可受到体液因子如细胞因子的调节。例如，已发现干扰素γ(IFN-γ)上调Fc-γRI的表达。这种增强的表达提高了带有Fc-γRI的细胞对靶标的细胞毒活性。效应细胞可吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。
[0375] “靶细胞”应指本发明抗体能够靶向的任何对象(如人或动物)中不想要的细胞。在一些优选的实施方案中，所述靶细胞为表达或过表达CLD18的细胞。表达CLD18的细胞一般包括肿瘤细胞。
[0376] 可以使用化学技术(参阅如D.M.Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：5807)、“多瘤(polydoma)”技术(参阅US4,474,893)或重组DNA技术来产生本发明的双特异性和多特异性分子。
[0377] 具体地，可以使用本领域已知的方法，通过缀合成分结合特异性(如抗FcR和抗CLD18结合特异性)来制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，可以分别产生双特异性和多特异性分子的每种结合特异性，然后彼此缀合。当结合特异性为蛋白质或肽时，可将多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参阅如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78,118-132)；Brennan等(Science(1985)229：81-
83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所述的方法。优选的缀合剂为SATA和磺基-SMCC，均可得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所述的方法。优选的缀合剂为SATA和磺基-SMCC，均可得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
[0378] 当结合特异性为抗体时，它们可通过两重链C端铰链区的巯基键合而发生缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合前修饰铰链区以包含奇数个巯基残基，优选1个。
[0379] 或者，两种结合特异性可以均在同一载体中编码，并且在同一宿主细胞中表达并装配。这种方法在双特异性和多特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab′)2或配体×Fab融合蛋白时特别有用。本发明的双特异性和多特异性分子(如双特异性分子)可以是单链分子，例如单链双特异性抗体、包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异性分子或者包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子还可以是单链分子或者可以包含至少两个单链分子。产生双特异性和多特异性分子的方法描述于例如US5,260,203；US5,455,030；US4,881,175；US5,132,405；US5,091,513；US5,476,786；US5,013,653；US5,258,498和US5,482,858。
[0380] 双特异性和多特异性分子与其特异性靶标的结合可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或Western印迹测定来证实。这些测定中的每一种一般都通过使用对目的复合物具有特异性的带标记的试剂(如抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可使用如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测。或者，该复合物可使用多种其他免疫测定中的任一种来检测。例如，可对抗体进行放射性标记，并用于放射性免疫测定(RIA)(参阅如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986)。放射性同位素可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法来检测，或者通过放射性自显影来检测。
[0381] II.免疫缀合物
[0382] 在另一方面中，本发明的特征为缀合了治疗部分或药剂(如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性同位素)的抗CLD18抗体。这样的缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害特别是杀伤细胞的任何药剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽毒素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
[0383] 用于形成本发明免疫缀合物的合适的治疗剂包括但不仅限于抗代谢物(如氨甲喋呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(如氮芥、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP，顺铂)、蒽环类(如柔红霉素(daunorubicin，以前称为daunomycin)和阿霉素)、抗生素(如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨曲霉素(AMC)以及抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。在一个优选的实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一个实施方案中，所述治疗剂为免疫抑制剂。在另一实施方案中，所述治疗剂为GM-CSF。在一个优选的实施方案中，所述治疗剂为阿霉素、顺铂、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒素A。
[0384] 本发明的抗体还可与放射性同位素(如碘131、钇90或铟111)缀合，以产生用于治疗CLD18相关疾病如癌症的细胞毒性放射性药物。本发明的抗体缀合物可用于改变给定的生物应答，并且药物部分不应理解为仅限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者生物应答调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
[0385] 将这些治疗部分与抗体缀合的技术为本领域所熟知，参阅如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等编辑，243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等编辑，623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等编辑，475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等编辑，303-16页(Academic Press1985)以及Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
[0386] 在另一实施方案中，本发明的抗体附着在接头-螯合剂(如替坦异贝莫单抗(tiuxetan))上，其允许该抗体与放射性同位素缀合。
[0387] III.药物组合物
[0388] 在另一方面中，本发明提供包含本发明抗体之一或其组合的组合物，例如药物组合物。可按照常规技术将所述药物组合物与可药用载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂配制在一起，例如按照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版，Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995中公开的技术。在一个实施方案中，所述组合物包含通过不同机制作用的多种(例如两种或更多种)分离的本发明抗体的组合，例如将主要通过诱导CDC发挥作用的一种抗体与主要通过诱导凋亡发挥作用的另一抗体组合。
[0389] 本发明的药物组合物还可以在组合疗法中施用，即与其他药剂组合。例如，所述组合疗法可包括本发明的组合物以及至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂。在一个实施方案中，这样的治疗剂包括一种或多种抗炎剂，例如甾类药物或NSAID(非甾类抗炎药物，nonsteroidal anti-inflammatory drug)。优选的药剂包括如阿司匹林和其他水杨酸盐／酯、Cox-2抑制剂例如罗非考昔(Vioxx)和塞来考昔(Celebrex)、NSAID类例如布洛芬(Motrin，Advil)、非诺洛芬(Nalfon)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(Clinoril)、双氯芬酸(Voltaren)、吡罗昔康(Feldene)、酮洛芬(Orudis)、二氟尼酸(Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、依托度酸(Lodine)、奥沙普秦(Daypro)和吲哚美辛(Indocin).
[0390] 在另一实施方案中，这样的治疗剂包括引起调节性T细胞清除或功能失活的药剂，例如低剂量的环磷酰胺、抗CTLA4抗体、抗IL2或抗IL2受体抗体。
[0391] 在另一实施方案中，这样的治疗剂包括一种或多种化学治疗剂，例如紫杉醇衍生物、多烯紫杉醇、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿霉素(Adriamycin)、顺铂(Platinol)、环磷酰胺(Cytoxan、Procytox、Neosar)。在另一个实施方案中，本发明的抗体可与化学治疗剂组合施用，所述化学治疗剂优选在患胃癌、食管癌、胰腺癌和肺癌的患者中显示疗效。
[0392] 在另一实施方案中，本发明的抗体可与放射疗法和／或自体外周血干细胞或骨髓移植联合施用。
[0393] 在另一实施方案中，本发明的抗体可与选自以下的一种或多种抗体组合施用：抗CD25抗体、抗EPCAM抗体、抗EGFR、抗Her2／neu和抗CD40抗体。
[0394] 在另一实施方案中，本发明的抗体可与抗C3b(i)抗体组合施用，以增强补体活化。
[0395] 本文使用的“可药用载体”包括生理相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮给药(如通过注射或输注)。取决于给药途径，可将活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)包裹在一定材料中，以保护化合物免受可能使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
[0396] “可药用盐”指保留母体化合物的期望生物活性而不导致任何不期望之毒理作用的盐(参阅如Berge，S.M.，等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。
[0397] 这样的盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐，以及来自无毒有机酸如脂肪单羧酸和二羧酸、苯取代链烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪及芳香磺酸等的盐。碱加成盐包括来自碱土金属如钠、钾、镁、钙等的盐以及来自无毒有机胺如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。
[0398] 本发明的组合物可通过本领域已知的多种方法施用。本领域技术人员会理解，给药途径和／或模式将根据所期望的结果而变化。活性化合物可与保护该化合物不迅速释放的载体制备在一起，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法为本领域技术人员所公知。参阅如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.，New York，1978。
[0399] 为了通过某些给药途径施用本发明的化合物，可能必须用一定材料包裹化合物或与其共施用，以防止其失活。例如，化合物可在适当的载体如脂质体或稀释剂中施用于对象。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲液。脂质体包括水包油包水型CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
[0400] 可药用载体包括无菌水溶液或分散剂以及用于在临用时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途为本领域公知。除了任何常规介质或药剂与活性化合物相容以外，还考虑了它们在本发明药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可掺入该组合物中。
[0401] 治疗性组合物通常必须是无菌的，并在生产和贮藏条件下稳定。该组合物可配制成溶液、微乳剂、脂质体或其他适用于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包封(如卵磷脂)、通过维持所需颗粒大小(对于分散剂的情况)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(如单硬脂酸盐和明胶)来引起注射用组合物的延长吸收。
[0402] 无菌注射液可通过将所需量的活性化合物与所需上述成分中的一种或组合一起掺入适当的溶剂随后进行无菌微滤来制备。
[0403] 一般通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散剂，所述无菌载体中含有碱性分散介质和上述其他所需成分。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从之前经无菌过滤的溶液中获得活性成分加任何额外所需成分的粉末。
[0404] 对给药方案进行调整以提供最佳的期望应答(如治疗应答)。例如，可以进行单次推注，可随时间施用若干分开的剂量，或者可以根据治疗情况紧急程度的指示，按比例降低或提高剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以便于施用和实现剂量的均一性。本文使用的剂量单位形式指适于作为受治对象单位剂量的物理分开的单位；每个单位中含有与所需药用载体相结合的预定量的活性化合物，所述预定量为经计算产生所需疗效的量。本发明剂量单位形式的规格由以下因素决定，并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和意图实现的具体疗效，和(b)调配用于在个体中进行灵敏治疗的这些活性化合物的内在限制因素。
[0405] 可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如维生素C、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如维生素C棕榈酸酯、丁羟茴醚(butylated hydroxyanisole，BHA)、丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0406] 就治疗组合物而言，本发明的制剂包括适用于经口、经鼻、局部(topical)(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和／或肠胃外给药的制剂。所述制剂可以常规地以剂量单位形式存在，并可通过药学领域中任何已知方法来制备。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分的量将根据受治的对象以及具体给药模式而变化。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分的量通常将是产生疗效的组合物量。
[0407] 一般地，在总计100％中，此量的范围将为约0.01％至约99％活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％。
[0408] 适用于阴道给药的本发明制剂还包括含有本领域已知适用载体的阴道栓剂、卫生棉条、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。用于局部或透皮施用本发明组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与可药用载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。
[0409] 本文使用的术语“肠胃外给药”和“肠胃外施用”指非肠内和非局部给药的给药模式，通常是通过注射，包括但不仅限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内注射和输注。
[0410] 可用于本发明药物组合物的适当水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当的混合物、植物油(如橄榄油)以及注射用有机酯(如油酸乙酯)。可通过如使用包封材料(如卵磷脂)、通过维持期望的颗粒大小(对于分散剂的情况)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
[0411] 这些组合物还可含有辅助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作和通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)均可防止存在微生物。还可能期望在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠。此外，可以通过包含延缓吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现注射用药物形式的延长吸收。
[0412] 在一个实施方案中，通过皮下注射施用结晶形式的本发明单克隆抗体，参阅Yang等(2003)PNAS，100(12)：6934-6939。当本发明的组合物作为药物施用于人和动物时，它们可单独给药或作为药物组合物给药，所述药物组合物包含如0.01％至99.5％(更优选0.1至90％)的活性成分与可药用载体的组合。
[0413] 无论选择什么给药途径，可以适当水合形式使用的本发明组合物，和／或本发明的药物组合物均通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用剂型。
[0414] 可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而针对具体的患者、组合物和给药模式获得有效实现理想的治疗应答而又对患者无毒的活性成分量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括具体使用的本发明组合物的活性、给药途径、给药时间、具体使用的化合物的排泄速率、治疗持续时间、与具体使用的组合物组合使用的其他药物、化合物和／或材料、受治患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前病史以及医学领域熟知的类似因素。
[0415] 本领域普通医师或兽医能够容易地确定所需药物组合物的有效量并开出处方。例如，医师或兽医可从低于获得理想疗效所需剂量的水平开始给予药物组合物中所用本发明化合物的剂量，并逐渐提高剂量直至实现理想的疗效。一般而言，适当的本发明组合物的每日剂量将是有效产生疗效的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量一般将取决于上述因素。优选静脉内、肌内、腹膜内或皮下给药，优选施用至靶部位附近。必要时，治疗组合物的有效日剂量可以以2、3、4、5、6或更多的小剂量以适当的间隔在一天中分开施用，任选地以单位剂量形式施用。尽管可单独施用本发明化合物，但优选将化合物作为药物制剂(组合物)施用。
[0416] 在一个实施方案中，本发明的抗体可通过输注施用，优选在长时间(如长于24小时)中慢速连续输注，从而降低毒性副作用。施用可通过在2至24小时(如2至12小时)的时间中连续输注来进行。这样的方案可在必要时重复一次或多次，例如在6个月或12个月后重复。可通过使用靶向抗CLD18抗体的抗独特型抗体在施用后在生物样品中测量循环单克隆抗CLD18抗体的量来确定或调整剂量。
[0417] 在另一实施方案中，通过维持疗法(如在6个月或更长时间中每周一次)施用抗体。
[0418] 在另一实施方案中，可通过包括以下的方案施用本发明的抗体：输注针对CLD18的抗体一次，其后输注缀合有放射性同位素的针对CLD18的抗体。该方案可在例如7至9天后重复进行。
[0419] 治疗组合物可使用本领域已知的医疗装置施用。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可使用无针皮下注射装置施用，例如US5,399,163、US5,383,851、US5,312,335、US5,064,413、US4,941,880、US4,790,824或US4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知植入物和模块的实例包括以下文献中所述的那些：US4,487,603，其公开了用于以受控速率分散药物的可植入微输注泵；US4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；US4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；US4,447,
224，其公开了用于连续药物递送的可变流速可植入输注装置；US4,439,196，其公开了具有多腔隔间的渗透性药物递送系统；以及US4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。
224，其公开了用于连续药物递送的可变流速可植入输注装置；US4,439,196，其公开了具有多腔隔间的渗透性药物递送系统；以及US4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。
[0420] 许多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，本发明的抗体可配制成确保合适的体内分布。例如，血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(必要时)，可将其例如配制在脂质体中。生产脂质体的方法参阅如US4,522,811、US5,374,548和US5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性转运到特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向药物的递送(参阅如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸盐／酯或生物素(参阅如Low等的US5,416,016)、甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)、抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)和表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)。
[0421] 在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物配制在脂质体中。在一个更优选的实施方案中，所述脂质体包含靶向部分。在一个最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过推注递送至邻近目标部位(如肿瘤部位)的部位。该组合物的流动性必须达到易于注射的程度。它必须在生产和贮藏条件下稳定，并且必须在防止微生物(如细菌和真菌)污染作用的条件下保存。
[0422] 在另一实施方案中，本发明的抗体可配制成防止或降低其穿越胎盘的转运。这可通过本领域已知方法来实现，例如通过抗体的PEG化或通过使用F(ab)2′片段。还可参考″Cunningham-Rundles C，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conj ugates.Resistance to enzymatic degradation.J.Immunol.Methods，152：177-190以及″Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins，Ann.Allergy Asthma Immunol.74：279-283。
[0423] 肿瘤治疗的“治疗有效剂量”可通过目标肿瘤应答来衡量，所述应答可以是完全或部分的。完全应答(complete response，CR)定义为没有疾病的临床、放射性或其他迹象。部分应答(partial response，PR)是指肿瘤大小的总体降低超过50％。疾病发展的中位数时间是表征目标肿瘤应答耐久性的一个度量。
[0424] 肿瘤治疗的“治疗有效剂量”还可通过其稳定疾病发展的能力来衡量。化合物抑制癌症的能力可在预测其在人肿瘤中效力的动物模型系统中进行评价。或者，化合物的这一特性可通过使用技术人员已知的体外测定检查该化合物抑制细胞生长或凋亡的能力来评价。治疗有效量的治疗化合物能减小肿瘤尺寸，或者改善对象的症状。本领域技术人员能够基于以下因素确定这样的量：例如对象的体重、对象症状的严重程度以及选择的具体组合物或给药途径。
[0425] 所述组合物必须无菌，并且其流动性达到可通过注射递送的程度。除了水以外，载体还可以是等渗缓冲的盐水溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当的混合物。可以例如通过使用包封(如卵磷脂)、通过维持理想的颗粒大小(对于分散剂的情况)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇以及氯化钠。可通过在组合物中包含延缓吸收的药剂(如单硬脂酸铝或明胶)来实现注射用组合物的长期吸收。
[0426] 当活性化合物如上述进行了适当的保护时，该混合物可经口给药，例如与惰性稀释剂或能吸收的可食用载体一起给药。
[0427] IV.本发明的用途和方法
[0428] 本发明所述抗体(包括本文所述免疫缀合物、双特异性／多特异性分子、组合物和其他衍生物)具有多种治疗效用，包括治疗与CLD18表达细胞相关的病症。例如，该抗体可施用于培养物中的细胞(如体外或离体)或人对象(如体内)，以治疗或预防多种病症，如本文所述病症。本文使用的术语“对象”旨在包括应答于针对CLD18的抗体的人和非人动物。优选的对象包括患有可通过杀伤患病细胞(特别是特征为与正常细胞相比CLD18表达模式改变的细胞)来治疗或改善的病症的人患者。
[0429] 本文所讨论治疗的疗效优选通过本发明抗体介导细胞杀伤的功能特性来实现，例如通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡、同型粘附和／或吞噬作用介导的杀伤，优选诱导CDC介导的裂解和／或ADCC介导的裂解介导的杀伤。
[0430] 例如，在一个实施方案中，本发明的抗体可用于治疗患致瘤性病症的对象，例如患特征为存在表达CLD18的肿瘤细胞的疾病(包括如胃癌)的对象。可治疗和／或预防的致瘤性疾病的实例包括所有表达CLD18的癌症和肿瘤实体，包括胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胆囊癌和头颈癌。这些癌症可以为早期、中期或晚期，例如转移。
[0431] 本发明所述药物组合物和治疗方法还可用于免疫或疫苗接种，以预防本文所述疾病。
[0432] 在另一实施方案中，本发明的抗体可用于检测CLD18或特定CLD18形式的水平，或者检测在其膜表面上含有CLD18的细胞的水平，接着可将所述水平与某些疾病或疾病症状(如上述)相关联。或者，上述抗体可用于消除CLD18表达细胞的功能或与其相互作用，由此使这些细胞成为这些疾病的重要中介体。这可以通过使样品以及对照样品与抗CLD18抗体在允许所述抗体与CLD18形成复合物的条件下接触来实现。对样品以及对照样品(即参照样品)抗体与CLD18之间形成的任何复合物进行检测，并进行比较。
[0433] 可首先在体外对本发明的抗体测试其与治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，可使用如本文所述的流式细胞术来测定该抗体。
[0434] 此外，可测定抗体在触发至少一种效应子介导的效应细胞活性上(包括抑制表达CLD18的细胞生长和／或杀伤所述细胞)的活性。例如，可测定抗体触发CDC和／或凋亡的能力。测定CDC、同型粘附、分子聚簇或凋亡的操作如本文所述。
[0435] 本发明的抗体可用于在体内或体外引发一种或多种以下生物学活性：抑制表达CLD18的细胞生长和／或分化；杀伤表达CLD18的细胞；在效应细胞存在下介导表达CLD18的细胞的吞噬作用或ADCC；在补体存在下介导表达CLD18的细胞的CDC；介导表达CLD18的细胞的凋亡；诱导同型粘附；和／或诱导在结合CLD18后迁移至脂筏。
[0436] 在一个具体的实施方案中，所述抗体用于在体内或体外治疗、预防或诊断多种CLD18相关疾病。CLD18相关疾病的实例包括癌症等，例如胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌和上文列出的癌症。
[0437] CLD18A2也在分化的正常胃细胞中表达。有可能通过平行施用胃保护性药物如抗酸剂或者胃质子泵抑制剂如奥美拉唑或相关药物来降低或避免抗体通过杀伤这些细胞而诱导的临床副作用。
[0438] 本发明抗体组合物在体内和体外的合适给药途径为本领域所熟知，并可由普通技术人员进行选择。
[0439] 如上文所述，本发明的抗CLD18抗体可与一种或多种其他治疗剂(如细胞毒剂、放射性毒剂、抗血管发生剂或／和免疫抑制剂)共施用，以降低诱导针对本发明抗体的免疫应答。抗体可与所述药剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与所述药剂分开施用。对于后一种情况(分开施用)，抗体可以在该药剂之前、之后或同时施用，或者可与其他已知疗法(例如抗癌疗法，如放射)共施用。这样的治疗剂包括上文列出的抗肿瘤剂等。本发明抗CLD18抗体与化学治疗剂的共施用提供了两种抗癌剂，它们通过不同机制发挥作用，获得对肿瘤细胞的细胞毒效应。这样的共施用可解决由于产生对药物的抗性或者肿瘤细胞抗原性发生变化而导致的问题，所述问题可使得它们不与所述抗体发生反应。
[0440] 在本发明的另一具体实施方案中，对施用抗体的对象额外使用抗血管发生剂进行治疗，所述抗血管发生剂包括靶向VEGF或VEGFR的抗体以及抑制血管发生的一种或多种化合物。用这些药物进行预治疗或平行应用这些药物可改善抗体在大块肿瘤中的渗透。
[0441] 在本发明的另一具体实施方案中，对施用抗体的对象额外使用抑制生长因子受体信号传递的化合物进行治疗，所述化合物包括与EGFR受体结合的单克隆抗体以及抑制EGFR、Her1或Her2／neu受体所起始的信号的化合物。
[0442] 也可以使用靶标特异性效应细胞(例如与组合物(如抗体、多特异性和双特异性分子)连接的效应细胞)作为治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞及其他带有IgG或IgA受体的细胞。必要时，效应细胞可得自待治疗的对象。靶标特异性效应细胞可以在生理可接受溶液中作为细胞悬液施用。所施用的细胞数可以为108至109的数量级，但可根据治疗目的而变化。一般而言，该量将足以获得在靶细胞(如表达CLD18的肿瘤细胞)处的定位，并通过例如吞噬作用实现细胞杀伤。给药途径也可以变化。
[0443] 使用靶标特异性效应细胞的疗法可以与用于除去靶细胞的其他技术联合进行。例如，使用本发明组合物的抗肿瘤疗法和／或带有这些组合物的效应细胞可以与化学疗法联合使用。此外，可以使用联合免疫疗法将两种不同的细胞毒效应子群体导向肿瘤细胞排斥。例如，与抗Fc-RI或抗CD3连接的抗CLD18抗体可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。
[0444] 本发明的双特异性和多特异性分子还可用于调节效应细胞上的Fc-γR或Fc-αR水平，例如通过掩盖和清除细胞表面的受体来进行。抗Fc受体的混合物也可用于此目的。
[0445] 还可以在补体存在下使用具有补体结合位点(如来自IgG1、2或3或IgM的与补体结合的部分)的本发明组合物(如抗体、双特异性和多特异性分子和免疫缀合物)。在一个实施方案中，可通过加入补体或含有补体的血清对使用本发明结合剂和适当的效应细胞对包含靶细胞的细胞群进行的离体治疗进行补充。包裹了本发明结合剂的靶细胞的吞噬作用可通过结合补体蛋白而得到改善。在另一实施方案中，包裹本发明组合物的靶细胞还可被补体裂解。在另一实施方案中，本发明的组合物不活化补体。
[0446] 本发明的组合物还可与补体一起施用。因此，本发明的范围内包括包含抗体、多特异性或双特异性分子以及血清或补体的组合物。这些组合物的优点在于补体位于紧挨着抗体、多特异性或双特异性分子的附近。
[0447] 或者，本发明的抗体、多特异性或双特异性分子以及补体或血清可分开施用。本发明组合物与靶细胞的结合导致CLD18抗原-抗体复合物迁移至细胞膜的脂筏中。这样的迁移产生可有效激活和／或增强CDC的高密度抗原-抗体复合物。
[0448] 本发明的范围内还包括包含本发明组合物(如抗体和免疫缀合物)及其使用说明的试剂盒。所述试剂盒还可含有一种或多种其他试剂，例如免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或者一种或多种其他的本发明抗体(如具有补充性活性的抗体)。
[0449] 因此，使用本发明抗体进行治疗的患者还可另外施用(在施用本发明抗体之前、同时或之后)增强或增进本发明抗体疗效的其他治疗剂，例如细胞毒剂或放射性毒剂。
[0450] 在另一些实施方案中，可以另外通过如用细胞因子治疗对象来使用其他药剂来治疗该对象，所述药剂调节(如增强或抑制)Fc-γ或Fc-α受体的表达或活性。优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-GSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。用于提高本文所述抗体和药物组合物疗效的其他重要药剂为β-葡聚糖，它是支化葡萄糖残基的同聚多糖，由多种植物和微生物产生，例如细菌、藻类、真菌、酵母和谷物。还可使用生物产生的β-葡聚糖片段。优选地，所述β-葡聚糖是β(1，3)葡萄糖的多聚体，其中至少一些主链葡萄糖单元(如3-6％的主链葡萄糖单元)具有分支，如β-(1，6)分支。
[0451] 在一个具体的实施方案中，本发明提供用于检测样品中CLD18抗原的存在或测量CLD18抗原量的方法，包括使样品和对照样品在允许抗体或其部分与CLD18形成复合物的条件下接触特异性结合CLD18的抗体。接着检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比在复合物形成上的差异指示样品中存在CLD18抗原。
[0452] 在另一实施方案中，本发明提供用于在体内或体外检测CLD18表达细胞或对其定量的方法。
[0453] 所述方法包括(i)对对象施用缀合了检测标记的本发明组合物；(ii)使该对象接触检测所述检测标记的手段，以鉴定含有CLD18表达细胞的部位。
[0454] 特别地，如上述的方法可用于诊断CLD18相关疾病和／或定位CLD18相关疾病，如癌症。优选地，样品中CLD18(优选CLD18-A2)的量高于对照样品中CLD18(优选CLD18-A2)的量指示该样品的来源对象(特别是人)中存在CLD18相关疾病。
[0455] 在另一实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于将化合物(如治疗剂、标记、细胞毒剂、放射性毒剂、免疫抑制剂等)靶向表面表达CLD18的细胞，这通过将这些化合物与该抗体连接来实现。因此，本发明还提供定位表达CLD18的离体或体外细胞(如循环的肿瘤细胞)的方法。
[0456] 本发明通过以下实施例进一步进行说明，实施例不应理解为限制本发明的范围。实施例
[0457] 1.产生针对CLD18的小鼠抗体
[0458] a.免疫：
[0459] 用编码人CLD18片段(SEQ ID NO：15、16、17、18)的真核表达载体免疫Balb／c或C57／BL6小鼠。在佐剂(如CpG)存在下，在第1天和第10天将50μg或25μg质粒DNA注射进四头肌(肌内，i.m.)，用于产生第1组单克隆抗体，或者在第1天和第9天、第1天和第11天或者第1天、第16天和第36天进行，用于产生第2组抗体(详细情况见表1b)。肌内注射CpG以及仅转染CLD18A2(SEQ ID NO：1)或共转染CLD18A2和小鼠可溶性CD40L编码RNA的细胞，肌内或腹膜内注射PEI-Man。取决于所用的具体免疫方案，在第16天和第43天之间通过免疫荧光显微术监测小鼠血清中针对人CLD18的抗体的存在情况。使用HEK293细胞测定免疫荧光，所述细胞瞬时转染有编码包含人CLD18A2(SEQ ID NO：1、2)和荧光报告蛋白的融合构建体的核酸。通过腹膜内注射5×107个或1×108个瞬时转染了编码人CLD18A2(SEQ ID NO：1、2)的核酸的HEK293细胞，在脾摘除术之前3天对具有可检测免疫应答(图1)的小鼠进行加强，以产生第1组单克隆抗体，或者在脾摘除术之前3天、3天和2天对小鼠进行加强，或者在脾摘除术之前4天、3天和2天对小鼠进行加强，以产生第2组单克隆抗体(详细情况见表1b)。在表1a中，所使用的免疫方案用于各个单克隆抗体。
[0460] 表1a：用于产生单克隆抗体的免疫方案
[0461]
[0462] ＊具体的免疫方案见表1b
[0463]
[0464] b.产生生产针对CLD18的人单克隆抗体的杂交瘤：
[0465] 基于标准方案分离小鼠脾细胞，并使用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。接着使用转染了编码人CLD18的核酸的HEK293细胞，通过FACS分析针对CLD18特异性的免疫球蛋白的产生筛选得到的杂交瘤。使用50％PEG(Roche Diagnostics，CRL738641)，以2：1的比例将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬液与P3X63Ag8U.1非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1597)融合。将细胞以约3×104个／孔铺到平底微量滴定板中，其后在含有10％胎牛血清、2％杂交瘤融合及克隆补充剂(HFCS，Roche Diagnostics，CRL1363735)加10mM HEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50μg／ml庆大霉素和1×HAT(Sigma，CRL H0262)的选择培养基中孵育2周。10至14天后，通过流式细胞术对单个细胞筛选抗CLD18单克隆抗体。将分泌抗体的杂交瘤再铺板，再次筛选，仍为阳性的抗CLD18单克隆抗体则通过有限稀释进行亚克隆。接着体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。从每个杂交瘤中选择至少一个保留亲本细胞反应性(通过FACS测定)的克隆。对每个克隆产生9管细胞库，并保存在液氮中。
[0466] c.选择与CLD18结合的单克隆抗体：
[0467] 为了确定抗体的同种型，进行同种型ELISA。使用小鼠monoAB ID试剂盒(Zymed，CRL90-6550)或者IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche，目录号1493027)来测定所鉴定CLD18反应性单克隆抗体的Ig亚类。产生了定义为第1组的19个杂交瘤细胞系，6个来自以CLD18A2-环D3(SEQ ID NO：17、18)免疫的C57／BL6小鼠细胞的融合物，13个来自以CLD18A2-环1(SEQ ID NO：15、16)免疫的Balb／c小鼠细胞的融合物，它们表达以下抗体：
[0468] 24H5，26B5，26D12，28D10，37G11，37H8，38G5，38H3，39F11，41C6,42E12，43A11，44E10，47D12，61C2，75B8，85A3，9E8，19B9
[0469] 24H5：小鼠单克隆IgG2b，κ抗体，182-D758-034
[0470] 26B5：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D758-035，DSM ACC2745
[0471] 26D12：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D758-036，DSM ACC2746
[0472] 28D10：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D758-040，DSM ACC2747
[0473] 37G11：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D1106-055，DSM ACC2737
[0474] 37H8：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，1g2-D1106-056，DSM ACC2738
[0475] 38G5：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1106-057，DSM ACC2739
[0476] 38H3：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1106-058，DSM ACC2740
[0477] 39F11：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1106-059，DSM ACC2741
[0478] 41C6：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D1106-060
[0479] 42E12：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D1106-061，DSM ACC2748
[0480] 43A11：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D1106-062，DSM ACC2742
[0481] 44E10：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1106-063
[0482] 47D12：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1106-064
[0483] 61C2：小鼠单克隆IgG2b，κ抗体，182-D1106-067，DSMACC2743
[0484] 75B8：小鼠单克隆IgM，κ抗体，182-D756-001
[0485] 85A3：小鼠单克隆IgM，κ抗体，182-D756-002
[0486] 9E8：小鼠单克隆IgM，κ抗体，182-D758-011
[0487] 19B9：小鼠单克隆IgM，κ抗体，182-D758-024
[0488] 产生了定义为第2组的5个杂交瘤细胞系，1个来自以CLD18A2-环D3(SEQ ID NO：17、18)和CLD18A2-环D1(SEQ ID NO：15、16)免疫的Balb／c小鼠细胞的融合物，4个来自以CLD18A2-环D1(SEQ ID NO：15、16)免疫的Balb／c小鼠细胞的融合物，它们表达以下抗体：
[0489] 45C1，125E1，163E12，166E2，175D10
[0490] 45C1：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D758-187
[0491] 125引：小鼠单克隆IgG2a，κ抗体，182-D1106-279，DSM ACC2808
[0492] 163E12：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1105-294，DSM ACC2809
[0493] 166E2：小鼠单克隆IgG3，κ抗体，182-D1106-308
[0494] 175D10：小鼠单克隆IgG1，κ抗体，182-D1106-362，DSM ACC2810
[0495] 2.产生单克隆抗体
[0496] 产生并纯化对CLD18具有反应性的单克隆抗体：
[0497] 为了产生mg量的抗体用于功能表征，以2×106个细胞／ml将杂交瘤细胞接种到基于透析的生物反应器(CELLine CL1000，Integra，Chur,CH)中。每周收获一次含有抗体的上清液。使用Melon凝胶(Pierce，Rockford，USA)纯化小鼠单克隆抗体并通过硫酸铵沉淀进行浓缩，或者使用FPLC通过蛋白A进行纯化。通过BCA测定来确定抗体浓度和纯度，并通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳和考马斯染色来检查纯度。
[0498] 3.单克隆抗体的结合特征
[0499] a.WB、IF中转染子的质量控制：
[0500] 为了产生表达CLD18A2的细胞，用编码CLD18A2(SEQ ID NO：1、2)或CLD18A2-myc(SEQ ID NO：3、4)的核酸转染HEK293或CHO细胞。
[0501] 用CLDN18A2-myc(SEQ ID NO：3、4)转染HEK293细胞，或者不进行转染。转染后24小时收获细胞，裂解并进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳。对凝胶进行印迹并用小鼠抗myc抗体染色。与过氧化物酶标记的抗小鼠抗体孵育后，用ECL试剂使印迹显色，并使用LAS-3000成像仪(Fuji)显影。具有CLD18-myc预计分子量的条带仅在转染细胞中观察到，而阴性对照中则没有(图2)。
[0502] 用CLD18A2(SEQ ID NO：1，2)转染CHO细胞并在室玻片上培养24小时。用甲醇固定细胞，并在25℃用1μg／ml针对CLD18的兔多克隆抗体染色60分钟。洗涤后，用Alexa488标记的山羊抗兔IgG(Molecular Probes)染色细胞，并通过荧光显微术进行评价。图3显示转染的CHO细胞像未转染细胞一样在细胞膜上表达CLD18。将这些异源CLD18表达细胞用于以下测定，以测试抗体结合的特异性。
[0503] b.选择与CLD18结合的单克隆抗体／通过流式细胞术进行初步筛选：
[0504] 在测定前40小时用编码人CLD18A2(SEQ ID NO：1、2)和荧光报告蛋白的表达载体共转染HEK293细胞，或者使用稳定表达人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)的HEK293细胞并用碘化丙锭(PI)复染。使用2mM EDTA／PBS使细胞脱离后，用完全生长培养基洗涤细胞，并以约1-5×105个细胞／孔将细胞铺到U型底微量滴定板中。在4℃将细胞与杂交瘤上清液孵育30分钟，其后用1％热灭活的FBS／PBS进行两次洗涤步骤，最后与APC或Alexa647缀合的抗小鼠IgG特异性第二抗体一起孵育。两次洗涤步骤之后，用CellFIX(BD Biosciences)固定共转染的细胞。使用BD FACSArray，通过流式细胞术评估结合。以荧光标记的表达作为横轴，对纵轴的抗体结合进行作图。所有的小鼠抗体24H5，26B5，26D12，28D10，37G11，37H8，38G5，
38H3，39F11，41C6，42E12，43A11，44E10，47D12，61C2，75B8，85A3，9E8，19B9，45C1，125E1，
163E12，166E2和175D10均检测到与荧光标记表达细胞之表面的特异性结合(图4，Q2中的细胞)，例如含有单克隆抗体24H5(Fig.4A，Q2中的细胞)、85A3(Fig.4B)、175D10、125E1、
163E12、166E2和45C1(Fig.4C，Q1中的细胞)的杂交瘤上清液。
38H3，39F11，41C6，42E12，43A11，44E10，47D12，61C2，75B8，85A3，9E8，19B9，45C1，125E1，
163E12，166E2和175D10均检测到与荧光标记表达细胞之表面的特异性结合(图4，Q2中的细胞)，例如含有单克隆抗体24H5(Fig.4A，Q2中的细胞)、85A3(Fig.4B)、175D10、125E1、
163E12、166E2和45C1(Fig.4C，Q1中的细胞)的杂交瘤上清液。
[0505] c.比较抗体与Myc或HA标记的CLD18A2的结合：
[0506] 进一步说明了所鉴定的CLD18特异性单克隆抗体的结合特征。因此，分析了单克隆抗体与通过插入表位标签产生的CLD18A2突变体的结合。CLD18A2-HA(SEQ ID NO：6)在CLD18A2-环1中含有HA表位标签，而CLD18A2-Myc(SEQ ID NO：4)含有插入CLD18A2-环2中的Myc表位标签。由于这些标签的插入引起表位的破坏，因此所鉴定的单克隆抗体可根据丧失与任何突变体的结合来进行分组。在4℃将瞬时共转染了荧光标记和人CLD18A2、荧光标记和CLD18A2-HA或者荧光标记和CLD18A2-Myc的HEK293细胞与含有CLD18特异性单克隆抗体的杂交瘤上清液孵育30分钟，其后与Alexa647缀合的抗小鼠IgG第二抗体孵育。在BD FACSArray上进行分析之前，用CellFIX固定细胞。如图5中24H5、9E8、26B5和19B9所示例的，可以基于其结合特征将单克隆抗体分成四个不同的组：(i)与未修饰CLD18A2以及CLD18A2-HA和CLD18A2-Myc结合的抗体，如24H5，(图5A)，或者(ii)不与CLD18A2-HA结合的抗体，如9E8，(图5B)，或者(iii)不与CLD18A2-Myc结合的抗体，如26B5，(图5C)，或者(iv)不与CLD18A2-HA结合，也不与CLD18A2-Myc结合的抗体，如19B9，(图5D)。
[0507] d.通过流式细胞术比较抗体与人CLD18A1及CLD18A2转化子的结合：
[0508] 通过流式细胞术分析所鉴定的单克隆抗体与CLD18A2同工型的结合特异性。在4℃将稳定表达人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)的HEK293细胞和稳定表达人CLD18A1(SEQ ID NO：7、8)(HEK293-CLD18A1)的HEK293细胞与含有单克隆抗体的杂交瘤上清液孵育30分钟，其后与Alexa647缀合的抗小鼠IgG第二抗体孵育，并固定细胞，或者不固定细胞而用PI复染。使用BD FACSArray，通过流式细胞术评估结合。图6显示在由24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、
37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9、
45C1、125E1、163E12、166E2、175D10组成的组中鉴定的两组单克隆抗体的实例：(i)单克隆抗体43A11，45C1和163E12特异性结合人CLD18A2，但不结合人CLD18A1(图6A、B)，以及(ii)单克隆抗体37H8与两种人同工型均结合(图6A)。
37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9、
45C1、125E1、163E12、166E2、175D10组成的组中鉴定的两组单克隆抗体的实例：(i)单克隆抗体43A11，45C1和163E12特异性结合人CLD18A2，但不结合人CLD18A1(图6A、B)，以及(ii)单克隆抗体37H8与两种人同工型均结合(图6A)。
[0509] e.通过免疫荧光显微术比较抗体与人CLD18A1及CLD18A2转染子的结合：
[0510] 用编码CLD18A1(SEQ ID NO：8)或CLD18A2(SEQ ID NO：2)与荧光报告子的融合蛋白的表达载体瞬时转染HEK293细胞，并在室玻片上培养。不固定或在多聚甲醛固定后，在37℃用含有单克隆抗体的组织培养上清液染色细胞30分钟。洗涤后，用Alexa555标记的抗小鼠Ig抗体(Molecular Probes)染色细胞。通过荧光显微术评估抗体结合。如图7所示，抗体37G11与CLD18A2特异性发生反应(图7A)，但不与CLD18A1反应(图7B)。相反，抗体26B5与CLD18A2及CLD18A1均发生反应(图8)。
[0511] 对于抗体24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9，观察到活细胞与多聚甲醛固定细胞之间明显的染色差异。当细胞经固定时，所述抗体形成均一的膜染色(图7C、8C、8D)。相反，将活细胞与这些抗体孵育引起蛋白质簇的产生，可见斑点样染色模式(图7A、8A、8B)。这显示，所有抗体均与活细胞表面所见天然表位结合。
[0512] f.确定内源表达细胞系：
[0513] 在RT-PCR分析中使用CLD18A2基因特异性引物对(SEQ ID NO：11，12)，以筛选表达CLD18A2的细胞系。发现人胃癌细胞系NCI-SNU-16(ATCC CRL-5974)、NUGC-4(JCRB0834)和KATO-III(ATCC HTB-103)和人胰腺癌细胞系DAN-G(DSMZ ACC249)显示CLD18的强内源表达(图9)。通过用针对CLD18的兔多克隆血清进行染色在蛋白质水平证实表达。
[0514] g.用CLD18特异性抗体染色内源表达细胞系并进行免疫荧光分析：
[0515] 在标准条件下在室玻片上培养DAN-G、SNU-16、NUGC-4和KATO-III细胞。细胞不进行固定或使用甲醇固定，并用各个抗体染色。对抗体24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9观察到细胞表面染色，如图10、11和12A所示。对抗体45C1、125E1、163E12、166E2和175D10测定了天然表位识别，并在未固定细胞中观察到细胞表面染色，如图12B所示。抗体亚组显示了主要在细胞-细胞界面或者在不毗邻其他细胞的膜游离部分的细胞膜同源染色。其他抗体染色了细胞膜上的离散点和聚集体，总之，证明各个抗体与不同表位结合，包括CLD18同型或异型联合所掩盖的表位以及在已形成的紧密连接中易于接近的CLD18表位。
[0516] h.通过流式细胞术染色内源表达细胞系：
[0517] 通过流式细胞术分析KATO-III和NUGC-4活细胞上组成型表达的CLD18A2的表面表达。例如，用单克隆抗体61C2或163E12染色KATO-III和NUGC-4细胞，其后与Alexa647缀合的抗小鼠IgG第二抗体一起孵育，固定细胞或者不进行固定。使用BD FACSArray，通过流式细胞术评估结合。图13显示61C2与至少70.3％的KATO-III细胞结合，163E12与KATO-III和NUGC-4细胞上的CLD18A2结合。
[0518] i.小鼠和人CLD18A1及CLD18A2的序列比对：
[0519] 人CLD18A2(NP_001002026)和人CLD18A1(NP_057453)在序列比较中在N端存在差异，小鼠CLD18变体(NP_062789和AAL15636)显示分子间的高同源性和序列变异位点(见图14)。
[0520] j.通过流式细胞术分析抗体与小鼠CLD18A1和小鼠CLD18A2的反应性：
[0521] 通过流式细胞术分析所鉴定的单克隆抗体与小鼠CLD18A2及CLD18A1的结合。将瞬时共转染了荧光标记和小鼠CLD18A2(SEQ ID NO：33、35)或者荧光标记和小鼠CLD18A1(SEQ ID NO：36、37)的HEK293细胞在4℃下与分别含有人CLD18特异性单克隆抗体38G5、38H3、37G11、45C1和163E12的杂交瘤上清液孵育30分钟，随后与Alexa647缀合的抗小鼠IgG第二抗体孵育并固定细胞。使用BD FACSArray，通过流式细胞术评估结合。图15显示三种不同的结合谱：38G5和45C1不与任何一种小鼠CLD18同工型结合，37G11和163E12与小鼠CLD18A2结合但不与小鼠CLD18A1结合，以及38H3与小鼠CLD18A1和CLD18A2结合。这些抗体是在临床前研究中确定CLD18单克隆抗体潜在毒性的很有价值的工具。
[0522] 总之，这些数据显示，针对CLD18产生的本发明单克隆抗体24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、
9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2和175D10代表了与人CLD18不同表位和拓扑学情况的多种结合特征。
9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2和175D10代表了与人CLD18不同表位和拓扑学情况的多种结合特征。
[0523] 实施例3b、c、d、e、g、h和j中所示不同特性的组合可用于将单克隆抗体归类到这些不同类中。
[0524] 4.免疫组化(IHC)
[0525] 将通过用SEQ ID NO：21肽进行免疫而产生的CLD18A2表位特异性抗体用于CLD18A2表达的免疫组化表征。将来自一组详尽的正常及肿瘤组织的石蜡包埋组织切片用于蛋白质表达及定位分析。在除胃以外的任何其他正常器官组织中均未检测到显著表达(见表2、图16A)。相反，通过免疫组化证实了CLD18A2在不同癌症中的表达，包括胃癌和肺癌(图16B)。
[0526] 有趣的是，CLD18A2蛋白在胃粘膜中的表达局限在基部和凹陷区(pit region)胃上皮的终末分化细胞中。相反，胃粘膜颈区中的细胞(特别是峡区中补充整个粘膜的胃干细胞)不表达CLD18A2(图16C)。
[0527] 表2：通过IHC分析的CLD18A2在正常及肿瘤组织中的表达
[0528]
[0529]
[0530] 将单克隆抗体39F11用于免疫组化CLD18A2特异性研究。如图17A所示，在除胃以外的所有测试的正常组织中均未检测到显著的反应性(图17A)，而胃癌和肺癌仍为强阳性(图17B)。
[0531] 另一组本发明抗体显示特异性癌症染色模式，与胃癌结合但对正常胃组织无反应性。图18A中的单克隆抗体26B5显示这样的染色模式。
[0532] 在来自HEK293肿瘤细胞系的切片上使用免疫组织化学对175D10(图18B)、43A11(图18C)、163E12(Fig.l8D)和45C1(图18E)进行特异性分析：将稳定表达人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)或CLD18A1(HEK293-CLD18A1)或者转染了表达对照质粒(HEK293-模拟)的HEK293肿瘤细胞系异种移植到小鼠中，以形成实体瘤，所述表达对照质粒中仅含有用于选择的抗生素抗性基因。在模拟转染的HEK293异种移植肿瘤中未检测到表达。相反，在HEK293-CLD18A2异种移植肿瘤和胃癌样品中观察到了强且均质的膜染色。
[0533] 5.补体依赖性细胞毒性(CDC)
[0534] a.通过流式细胞术测量的第1组单克隆抗体的CDC：
[0535] 通过从健康志愿者中抽血至S-Monovette-EDTA真空管(Sarstedt，Ntirmbrecht，Germany)接着以600g离心20分钟来制备用于补体裂解的血浆。收获血浆并保存在-20℃。
[0536] 在第一组实验中，对杂交瘤上清液分析其针对稳定表达人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)的HEK293细胞诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。室温下将细胞与分别含有单克隆抗体85A3、28D10、24H5或26D12的杂交瘤上清液孵育20分钟。离心(450g，5分钟)后除去上清液，将DMEM中20％的人血浆(预热至37℃)加入细胞中，并在37℃下再孵育20分钟。其后，通过使用碘化丙锭(PI)染色法以FACS测定细胞裂解。加入PI至终浓度2.5μg／ml。对于流式细胞术，使用BD FACSArray流式细胞仪(BD Biosciences，Mountain View，CA)。收集至少10000个事件用于分析，通过调整前侧向散射(forward sideward scatter,FCS)阈值来排除细胞碎片。裂解细胞(PI阳性细胞)的百分比示于图19。单克隆抗体85A3、28D10和26D12分别诱导HEK293-CLD18A2细胞中33.5％、38.2％和39.2％的裂解，而24H5介导的CDC仅为
19.3％。
19.3％。
[0537] b.第1组单克隆抗体的CDC：
[0538] 在第二组实验中，分析了单克隆抗体对CLD18A2表达细胞诱导CDC的特异性。因此，对于一组特异性结合人CLD18A2或者还结合人CLD18A1的抗体，测试其针对稳定表达人CLD18A2(CHO-CLD18A2)或人CLD18A1(CHO-CLD18A1)的CHO细胞的CDC诱导。在测定前24小时，以3×104个／孔的密度将CHO-CLD18A2和CHO-CLD18A1细胞接种到组织培养平底微量滴定板中。第二天除去生长培养基，将细胞一式三份与调整至含有10μg／ml浓度单克隆抗体的杂交瘤上清液一起孵育，所述单克隆抗体分别是24H5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12和61C2。对照细胞与生长培养基或含0.2％皂苷的生长培养基一起孵育，分别用于测定背景裂解和最大裂解。孵育20分钟后，室温下除去上清液，并将DMEM中20％的人血浆(预热至37℃)加入细胞，在37℃下再孵育20分钟。接着用含有2.5μg／ml溴化乙锭的PBS替换上清液，在520nm激发后使用Tecan Safire测量荧光发射。特异性裂解百分比如下计算：特异性裂解％=(样品荧光-背景荧光)／(最大裂解荧光-背景荧光)×100。图20显示，单克隆抗体26D12、28D10、37H8、38H3和39F11介导针对CHO-CLD18A2细胞的高度CDC，单克隆抗体38G5介导中度CDC，单克隆抗体41C6和61C2介导低度CDC，单克隆抗体24H5、37G11、42E12、43A11、44E10和47D12不介导CDC。相反，所有抗体均不能诱导针对CHO-CLDA1细胞的CDC，尽管如通过流式细胞术和免疫荧光测定的，26D12、
28D10、37H8、38H3、39F11、41C6、47D12和61C2也结合CLD18A1。
28D10、37H8、38H3、39F11、41C6、47D12和61C2也结合CLD18A1。
[0539] c.单克隆抗体滴定和使用第1组单克隆抗体的CDC：
[0540] 为了测量抗CLD18抗体在低浓度下诱导CDC的能力，进行了滴定三种不同抗体的实验。将在微量滴定板中生长的CHO-CLD18A2细胞在室温下与一系列浓度的75B8(100、30、10、3和1μg／mD、37H8(10、3.3和1μg／ml)和28D10(10、1和0.1μg／ml)分别孵育20分钟。除去上清液，将DMEM中20％的人血浆(预热至37℃)加入细胞，并在37℃下再孵育20分钟。在使用Tecan Safire进行分析之前，用含有2.5μg／ml溴化乙锭的PBS替换上清液。图21A-C显示，特异性裂解百分比是抗体浓度的函数。单克隆抗体75B8在10μg／ml时诱导CHO-CLD18A2细胞中
31.0％的裂解，在1μg／ml时下降到6.2％(图21A)，而单克隆抗体28D10和37H8在1μg／ml时仍分别诱导39％和26.5％的特异性裂解(图21B、C)。
31.0％的裂解，在1μg／ml时下降到6.2％(图21A)，而单克隆抗体28D10和37H8在1μg／ml时仍分别诱导39％和26.5％的特异性裂解(图21B、C)。
[0541] d.通过流式细胞术测量第2组单克隆抗体的CDC：
[0542] 通过从健康志愿者中抽血至Serum-Monovette真空管(Sarstedt，Nurmbrecht，Germany)中接着以600g离心20分钟来制备用于补体裂解的血清。收获血清并保存在-20℃。对照血清在保存前在56℃下热灭活30分钟。
[0543] 分析杂交瘤上清液针对内源表达人CLD18A2的KATO-III细胞诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在37℃下，将细胞与粗制或纯化的杂交瘤上清液孵育30分钟，所述杂交瘤上清液中分别含有单克隆抗体45C1、125E1、163E12、166E2和175D10。将RPMI中20％的人血清加入细胞，并在37℃下再孵育30分钟。其后，使用碘化丙锭(PI)染色法，以FACS测定细胞裂解。加入PI至终浓度2.5μg／ml。对于流式细胞术，使用BD FACS Array流式细胞仪(BDBiosciences、Mountain View、CA)。收集至少10000个事件用于分析，通过调整前侧向散射(FSC／SSC)阈值来排除细胞碎片。通过下式计算特异性裂解：特异性裂解=(％样品中的PI阳性细胞-％使用热灭活血清的样品中的PI阳性细胞)。特别是对于163E12观察到了CDC介导的强裂解。
[0544] 6.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
[0545] 对杂交瘤上清液分析其针对稳定表达人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)或人CLD18A1(HEK293-CLD18A1)的HEK293细胞诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。
[0546] a.富集人外周血单个核细胞：
[0547] 将来自健康供体的人血在磷酸缓冲液(PBS)中稀释两次，血细胞在Ficoll(淋巴细胞分离培养基1077g／ml，PAALaboratories，目录号J15-004)上分层。从界面中收集外周血单个核细胞(MNC)，洗涤并重悬在补充了10％热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中。
[0548] b.ADCC设置：
[0549] 用荧光增强配体(BADTA，Perkin Elmer细胞毒性测定试剂盒DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents，目录号AD0116)标记靶细胞30分钟。用补充了10mM丙磺舒(Sigma，目录号P8761)、10-20mM HEPES和10％热灭活胎牛血清的RPMI-10中彻底洗涤后，将细胞调整至1×105个细胞／ml。将已标记的靶细胞、效应细胞(MNC)和调整至10μg／ml浓度的含有单克隆抗体的上清液加入圆底微量滴定板中。对于分离的效应细胞，使用100：1的效应细胞与靶细胞(E：T)比例(50：1和25：1的数据未显示)。孵育(2小时，37℃)后，通过离心中止测定，并在时间分辨荧光计中以铕计数来测量双链体中的荧光配体释放。使用下式计算细胞毒性百分比：特异性裂解％=(实验释放计数-自发释放计数)／(最大释放计数-自发释放计数)×100，最大配体释放通过在靶细胞中加入Triton X-100(0.25％终浓度)来测定，在不存在抗体和效应细胞的情况下测量自发释放。图22显示，单克隆抗体26B5、37H8、38G5、47D12和
61C2介导针对HEK293-CLD18A2细胞的ADCC。相反，这些抗体对CLD18A1靶标未诱导显著细胞毒性或仅诱导低水平细胞毒性，证明了CLD18A2特异性的ADCC(图23)。
61C2介导针对HEK293-CLD18A2细胞的ADCC。相反，这些抗体对CLD18A1靶标未诱导显著细胞毒性或仅诱导低水平细胞毒性，证明了CLD18A2特异性的ADCC(图23)。
[0550] 7.增殖抑制
[0551] 对纯化的小鼠单克隆抗体分析其抑制内源表达人CLD18A2的KATO-III细胞生长的能力。
[0552] 在约10μg单克隆抗体存在下培养1×104个内源表达CLD18A2的靶细胞(KATO-III)。
[0553] DELFIA细胞增殖试剂盒(Perkin-Elmer,目录号AD0200)是基于测量微孔板中增殖细胞DNA合成过程中5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)掺入的非同位素免疫测定。掺入的BrdU使用铕标记的单克隆抗体进行检测。为进行抗体检测，使用固定液固定细胞并变性DNA。洗去未结合抗体，并加入DELFIA诱导物以从标记抗体上将铕离子解离到溶液中，它们在溶液中与DELFIA诱导物的组分形成高荧光螯合物。所测量的荧光(在检测中使用时间分辨荧光术)与每个孔中细胞的DNA合成成比例。
[0554] 对于抗体125E1、163E12、45C1、37G11、37H8、28D10和166E2分别观察到了强增殖抑制。对于小鼠抗体43A11、175D10、42E12、26D12、61C2和38H3分别观察到了中度增殖抑制。
[0555] 8.在治疗性小鼠异种移植模型中的表现
[0556] 在治疗性异种移植模型中研究了所鉴定的特异性结合CLD18A2的单克隆抗体的治疗潜力。
[0557] a.在小鼠中早期治疗高CLD18A2表达的肿瘤
[0558] 用1×107个稳定表达高水平人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)的HEK293细胞皮下接种SCID小鼠。人CLD18A2在HEK293-CLD18A2细胞中的表达水平与在来自患者的原发性胃癌中的表达水平相当。每个实验治疗组包括10只小鼠(每组中的小鼠数n=10)。对小鼠的治疗在肿瘤接种后3天开始。在4周中，每周一次静脉内注射200μg纯化的杂交瘤上清液，其代表小鼠单克隆抗体26B5，26D12，28D10，37G11，37H8，38G5，39F11，42E12，43A11，38H3或61C2。或者，在6周中每周两次通过静脉内和腹膜内交替注射来施用含有小鼠单克隆抗体45C1，125E1，163E12，166E2或175D10的200μg纯化的杂交瘤上清液。每周两次监测受治小鼠的肿瘤生长(肿瘤体积=长度×宽度×宽度／2，以mm3计)。如果肿瘤体积到达500mm3，或者在发病严重的情况下，则处死小鼠。图24示例了通过本发明抗体强烈抑制HEK293-CLD18A2肿瘤细胞的生长。图25A和25B显示，在施用HEK293-CLD18A2的早期治疗异种移植模型中，通过用本发明抗体进行治疗延长了存活。
[0559] b.小鼠中晚期高CLD18A2表达肿瘤的迟发治疗
[0560] 设计同样的基于HEK293-CLD18A2的肿瘤异种移植模型作为迟发治疗方案，而不是上述早期治疗。在肿瘤细胞接种后第27天将小鼠随机化到各含有5-6只小鼠的测试组中，并使用200μg纯化的杂交瘤上清液起始治疗，所述杂交瘤上清液分别含有小鼠单克隆抗体43A11、163E12和175D10。在六周中，每周两次通过静脉内和腹膜内交替注射来施用抗体。在这一模型中，本发明的抗体也显示抑制肿瘤生长。对于一些抗体，这引起了存活的延长(图
26)。
26)。
[0561] c.表达低水平CLD18A2的肿瘤的早期治疗
[0562] 对SCID小鼠皮下接种2×105个DAN-G肿瘤细胞系，该细胞系是组成型表达低水平CLD18A2蛋白的浸润性人胰腺癌细胞系。在肿瘤移植后3天起始小鼠的治疗(10只／组)：在六周中每周两次通过静脉内和腹膜内交替注射来施用200μg纯化的杂交瘤上清液，所述杂交瘤上清液含有小鼠单克隆抗体45C1、125E1、163E12、166E2或175D10。由于胰腺DAN-G肿瘤细胞系在体内的侵略性以及迅速的肿瘤生长，小鼠发生肿瘤恶病质，并在几天内死亡。尽管因此测量疗效的窗口非常狭窄，但在此模型中也观察到了本发明抗体介导的肿瘤生长抑制以及存活延长(图27A和27B)。
[0563] d.本发明的抗体在小鼠中不引发副作用
[0564] 在RT-PCR分析中使用小鼠CLD18A2特异性引物对(正义：CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC，反义：GCA CCGAAG GTG TAC CTG GTC)从一组广泛的正常小鼠组织中扩增cDNA(见图28)。
[0565] 除了胃以外，所测试的任何正常组织中均检测不到小鼠CLD18A2表达(见图28)。此外，使用与人及小鼠CLD18A2交叉反应的CLD18A2特异性抗体在多种正常小鼠组织中进行CLD18A2表达的免疫组织化学分析(见表3)。除了正常胃组织以外，所有测试的正常组织均未显示CLD18A2表达。像我们对人CLD18A2所观察到的那样，我们对于小鼠对应物也发现，尽管表面上皮和更深处的隐窝细胞在其细胞表面表达CLD18A2，但中央的颈部却为CLD18A2阴性(见图29A-C)。总之，CLD18A2的组织分布看来在人和小鼠中相同。
[0566] 表3：通过免疫组织化学分析的CLD18在小鼠正常组织中的表达
[0567]
[0568] 我们还研究了抗体125E1、163E12、166E2和175D10在小鼠中介导的潜在副作用。所有这些抗体均先前通过FACS分析显示与小鼠CLD18A2和人蛋白反应。
[0569] 使用这些抗体治疗过程中和治疗后未观察到任何可见的副作用，用抗体治疗的小鼠与未治疗(PBS处理)小鼠相比，胃粘膜中也没有观察到任何与毒性相关的组织形态学情况(见图30)。
[0570] e.用嵌合单克隆抗体进行小鼠中CLD18A2高表达肿瘤的早期治疗
[0571] 与实施例8类似但是使用嵌合单克隆抗体，评估了用本发明抗体进行的小鼠中高CLD18A2表达肿瘤的早期治疗。简言之，SCID小鼠皮下接种1x107个稳定表达高水平人CLD18A2的HEK293细胞(HEK293-CLD18A2)。每个实验治疗组包括10小鼠。小鼠的治疗在肿瘤接种后3天开始。通过交替的静脉内和腹膜内注射一周两次施用200μg进行瞬时转染以产生嵌合单克隆抗体ch-163E12或ch-175D10(参考实施例9，下文)的HEK293T细胞的纯化细胞培养上清，共6周。可观察到本发明的嵌合抗体有力地抑制HE K293-CLD18A2肿瘤细胞生长。图34显示了在使用HEK293-CLD18A2细胞的早期治疗异种移植模型中用本发明嵌合抗体治疗使得存活延长。
[0572] f.用嵌合单克隆抗体进行小鼠中晚期CLD18A2高表达肿瘤的后期治疗
[0573] 将如上所述的基于HEK293-CLD18A2细胞的相同肿瘤异种移植模型设计成后期治疗方案，与如上所述的早期治疗相反。在肿瘤细胞接种后第8天，将小鼠随机分为每个包含9只小鼠的试验组，用200μg的瞬时转染以产生嵌合单克隆抗体ch-163E12或ch-175D10(参考实施例9，下文)的HEK293T细胞的纯化细胞培养上清开始治疗。通过交替的静脉内和腹膜内注射一周两次来施用抗体，共6周。在此模型中，本发明的嵌合抗体也显示出抑制肿瘤生长。对于一些嵌合抗体，这导致存活的延长(图35)。
[0574] 9.抗体的嵌合
[0575] a.产生小鼠／人嵌合单克隆抗体
[0576] 通过本领域技术人员已知的标准方法，从人外周血单个核细胞(PBMC)和人脾组织中制备总RNA，其后制备单链eDNA，例如使用RNeasy小量试剂盒(Qiagen)和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)。
[0577] 通过PCR从PBMC cDNA中扩增人κ轻链的恒定区。正义寡聚物(SEQ ID NO：38)在恒定区的5′末端加入BamHI限制性位点，并将编码恒定区前两个氨基酸(Arg-Thr)的原始核酸序列5′-CGAACT-3′变成5′-CGTACG-3′，产生BsiWI限制性位点而不改变氨基酸序列。反义寡聚物(SEQ ID NO：39)包含终止密码子，并在所扩增恒定区的3′末端加入NotI限制性位点。将PCR产物和标准表达载体(如pcDNA3.1(+)，Invitrogen)依次与BamHI和NotI限制性酶一起孵育。另外用牛肠碱性磷酸酶处理载体，以防止重新环化。最后将恒定区连接进载体中，从而其后可变区在恒定区之前的任何融合现在均有可能通过残留的载体多克隆位点中的HindIII限制性位点(5′-AAGCTT-3′)和PCR产物中产生的BsiWI限制性位点(5′-CGTACG-3′)来进行。插入该载体中的人κ轻链恒定区的序列如SEQ ID NO：40所列，该人κ恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所列。
[0578] 通过PCR从脾cDNA中扩增人γ-1重链的恒定区。将5′磷酸化的正义寡聚物(SEQ ID NO：42)置于位于恒定区起点下游11个核苷酸的天然存在的ApaI限制性位点上，并在所扩增的恒定区部分的5′末端加入HindIII限制性位点。5′磷酸化的反义寡聚物(SEQ ID NO：43)包含终止密码子，并在这样扩增的恒定区的3′末端加入NotI限制性位点。使这样产生的PCR产物变为平末端，并5′磷酸化。通过使用区分性反义寡聚物(SEQ ID NO：44)的PCR以及通过测序证实扩增的γ恒定区为IgG1亚类。将带有不同于表达轻链所用载体中抗生素抗性(如新霉素)的抗生素抗性(如潮霉素)的标准表达载体(例如pcDNA3.1(+)／Hygro，Invitrogen)与PmeI限制性酶孵育，以完全除去多克隆位点，留下平末端。另外用牛肠碱性磷酸酶处理载体，以防止重新环化。最后将恒定区连接进载体中，从而其后可变区在恒定区之前的任何融合现在均有可能通过PCR产物产生的HindIII限制性位点(5′-AAGCTT-3′)和通过ApaI限制性位点(5′-GGGCCC-3′)来实现。通过测序证实了恒定区在载体中正确的取向，即适于该载体中上述启动子的取向。由于ApaI限制性位点的位置，用于此目的的任何可变区扩增均需包含除ApaI位点以外的人γ-1恒定区序列中前11个核苷酸。插入载体中的这样扩增的人γ-1重链恒定区序列如SEQ ID NO：45所列，这样表达的人γ-1恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：46所列。
[0579] 表4：用于抗体克隆的小鼠杂交瘤细胞系
[0580]
[0581] 对应于其小鼠对应物，嵌合单克隆抗体通过加前缀“ch-”来命名，例如ch-43A11、ch-163E12、ch-125E1、ch-166E2、ch-175D10、ch-45C1。
[0582] 小鼠轻链及重链可变区的扩增按照Matz等(Nucleic Acids Research，1999，第27卷，No.6)描述的“step-out PCR”法进行。为此，通过本领域技术人员已知的标准方法从单克隆杂交瘤细胞系(见表4)中制备总RNA，例如使用RNeasy小量试剂盒(Qiagen)。根据“模板-转换”法制备单链cDNA，其也描述于Matz等(Nucleic Acids Research，1999，第27卷，No.6，1558)。除了(dT)30寡聚物(SEQ ID NO：47)以外，它还包括DNA／RNA杂交寡聚物(SEQ ID NO：48)作为5′接头，用于在cDNA链的聚合过程中的模板转换。在这种接头寡聚物中，最后3个核苷酸以核糖核苷酸代替脱氧核糖核苷酸。其后的“step-out PCR”使用靶向小鼠κ链恒定区或者靶向γ链1、2a或3亚类(分别为SEQ ID NO：49至52)恒定区的反义寡聚物。通过杂交瘤细胞系产生的IgG亚类小鼠单克隆抗体先前以IsoStrip进行了免疫学分析(见实施例1)，相应地选择适当的反义寡聚物(见表4)。引物混合物在“step-out PCR”中作为正义寡聚物，其包含SEQ ID NO：53及54所列出的两种寡聚物。一些杂交瘤细胞系表达多于一个重链或轻链(除了用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞系所表达的链以外)。表4总结了克隆并测序的小鼠抗体链可变区(SEQ ID NO：55至69和SEQ ID NO：132至146)和克隆并测序的全长嵌合抗体链(SEQ IDNO：100至129)的SEQ ID NO。
[0583] 接着通过省略5′UTR和3′小鼠恒定区并在末端加入限制性位点的PCR来扩增所鉴定的小鼠可变区，所述限制性位点允许亚克隆进所制备的带有人恒定区的表达载体中。此外，正义寡聚物提供共有的Kozak序列(5′-GCCGCCACC-3′或5′-AGCCACC-3′)，用于重链可变区的反义寡聚物包含除ApaI限制性位点以外的人γ-1恒定区前11个核苷酸(见表4，SEQID NO：70至99)。使用HindIII和BsiWI限制性酶克隆κ轻链可变区，γ重链可变区需要HindIII和ApaI限制性酶。单克隆抗体45C1的γ重链可变区含有内部的HindIII限制性位点-在此使用相容的BsaI酶来代替(见SEQ ID NO：80)。SEQ ID NO：100至114显示所得嵌合抗体的核酸序列(见表4)。SEQ ID NO：115至129显示相应表达的嵌合抗体的氨基酸序列(见表4)。
[0584] b.产生并生产针对CLD18的嵌合抗体
[0585] 产生了生产具有CLD18特异性的嵌合抗体的哺乳动物细胞系。该细胞系来源于HEK293T细胞(ATCC CRL-11268)。转染前一天，将2.5×107个细胞铺在14.5cm组织培养皿中并在20ml完全培养基中培养，或者将1×107个细胞铺在10cm组织培养皿中并在10ml完全培6
养基中培养，或者将0.6×10 个细胞铺在12孔组织培养板中并在2-3ml完全培养基中培养(完全培养基：补充了10％FBS的无抗生素DMEM：F12培养基)。转染时推荐的细胞密度应为
90％汇合。在临转染前将培养基替换为新鲜培养基。用转染试剂例如Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668-019)或者Polyethylenimine(Sigma-Aldrich，408727)转染HEK293T细胞。HEK293T细胞的转染的示例为，将量为110μg或296μg的总DNA用于14.5cm培养皿，转染剂与DNA的比例对于Lipofectamine 2000和PEI分别为1：2.5和1：12。转染后24小时将培养基替换为GMP适用培养基，如X-Vivo15(Cambrex)，或者化学成分确定的培养基，如无血清的Pro293a(Cambrex)。将产生针对CLD18的嵌合单克隆抗体的转染HEK293T细胞再培养96小时。收获粗制上清液，无菌过滤并通过蛋白A-琼脂糖纯化。通过BCA测定来测定抗体浓度，通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳和考马斯染色检查纯度。
养基中培养，或者将0.6×10 个细胞铺在12孔组织培养板中并在2-3ml完全培养基中培养(完全培养基：补充了10％FBS的无抗生素DMEM：F12培养基)。转染时推荐的细胞密度应为
90％汇合。在临转染前将培养基替换为新鲜培养基。用转染试剂例如Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668-019)或者Polyethylenimine(Sigma-Aldrich，408727)转染HEK293T细胞。HEK293T细胞的转染的示例为，将量为110μg或296μg的总DNA用于14.5cm培养皿，转染剂与DNA的比例对于Lipofectamine 2000和PEI分别为1：2.5和1：12。转染后24小时将培养基替换为GMP适用培养基，如X-Vivo15(Cambrex)，或者化学成分确定的培养基，如无血清的Pro293a(Cambrex)。将产生针对CLD18的嵌合单克隆抗体的转染HEK293T细胞再培养96小时。收获粗制上清液，无菌过滤并通过蛋白A-琼脂糖纯化。通过BCA测定来测定抗体浓度，通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳和考马斯染色检查纯度。
[0586] c.嵌合单克隆抗体的结合特征
[0587] 如实施例3所述，通过流式细胞术分析了克隆并产生的针对CLD18A2的嵌合单克隆抗体。在4℃下将稳定表达人CLD18A2(HEK293-CLD18A2)的HEK293活细胞和稳定表达人CLD18A1(SEQ ID NO：7、8)(HEK293-CLD18A1)的HEK293细胞与含有嵌合单克隆抗体的经纯化的HEK293T细胞培养上清液孵育30分钟，其后与APC缀合的F(ab′)2片段山羊抗人IgG Fcγ第二抗体孵育，并用PI复染。使用BD FACSArray，通过流式细胞术评估结合。
[0588] 类似地，通过流式细胞术分析内源CLD18A2表达人肿瘤细胞系，例如KATO-III和NUGC-4细胞。
[0589] 图31A和B显示嵌合抗体ch-43A11、ch-125E1、ch-163E12、ch-166E2和ch-175D10的流式细胞术分析。它们均显示天然表位识别，并显示对CLD18A2而不是CLD18A1表达细胞的强且特异性的结合。
[0590] d.补体依赖性细胞毒性(CDC)
[0591] 通过从健康志愿者中抽血至Serum-Monovette真空管(Sarstedt，Nurmbrecht，Germany)中接着以600g离心20分钟来制备用于补体裂解的血清。收获血清并保存在-20℃。对照血清在保存前在56℃下热灭活30分钟。
[0592] 对经蛋白A-琼脂糖纯化的本发明嵌合抗体分析其针对内源表达人CLD18A2的KATO-III细胞以及稳定转染的CHO-CLD18A2细胞诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在37℃下将细胞与终浓度2.5μg／ml至35μg／ml的单克隆抗体ch-163E12、ch-166E2和ch-
175D10分别孵育30分钟。将RPMI中20％的人血清加入细胞中，在37℃下再孵育30分钟。其后，通过终浓度为2.5μg／mi的PI染色来区分死细胞和活细胞，通过流式细胞术测定抗体介导的细胞裂解百分比。对于流式细胞术，使用BD FACSArray流式细胞仪(BD Biosciences，Mountain View，CA)。收集至少10000个事件用于分析，通过调整前侧向散射(FSC／SSC)阈值来排除细胞碎片。通过下式计算特异性裂解：特异性裂解=(％样品中的PI阳性细胞-％使用热灭活血清的样品中的PI阳性细胞)。对若干抗体显示了CDC介导的特异性裂解。全部三种抗体均对CHO-CLD18A2细胞介导强CDC(图32)。对于KATO-III细胞，抗体ch-163E12和ch-
175D10是强CDC的诱导物。
175D10分别孵育30分钟。将RPMI中20％的人血清加入细胞中，在37℃下再孵育30分钟。其后，通过终浓度为2.5μg／mi的PI染色来区分死细胞和活细胞，通过流式细胞术测定抗体介导的细胞裂解百分比。对于流式细胞术，使用BD FACSArray流式细胞仪(BD Biosciences，Mountain View，CA)。收集至少10000个事件用于分析，通过调整前侧向散射(FSC／SSC)阈值来排除细胞碎片。通过下式计算特异性裂解：特异性裂解=(％样品中的PI阳性细胞-％使用热灭活血清的样品中的PI阳性细胞)。对若干抗体显示了CDC介导的特异性裂解。全部三种抗体均对CHO-CLD18A2细胞介导强CDC(图32)。对于KATO-III细胞，抗体ch-163E12和ch-
175D10是强CDC的诱导物。
[0593] e.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
[0594] 对经FPLC纯化的本发明嵌合抗体分析其针对内源表达人CLD18A2的KATO-III细胞诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。
[0595] 将来自健康供体的人血在磷酸缓冲液(PBS)中稀释两次，血细胞在Ficoll(1077g／ml，Pharmacia)上分层。离心后，从界面中收集外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤并重悬在补充了5％热灭活胎牛血清的X-Vivo-15培养基中。
[0596] 测定前15小时，用萤光素酶转染KATO-III细胞，并以5×104个细胞／孔铺在白色微孔板中。
[0597] 对于此测定，以效应细胞与靶细胞(E：T)比例20：1加入效应细胞(PBMC，如上述制备)和FPLC纯化的嵌合抗体，并在37℃、5％CO2下孵育2-3小时。抗体在孔中的终浓度为50μg／ml。预孵育2-3小时后，以1mg／ml加入荧光黄(BDBiosciences，San Jose USA)。使用微孔板读数器(Infinite200，Tecan，Switzerland)连续测量活细胞萤光素酶氧化荧光黄所产生的发光多达6小时。使用下式计算细胞毒性百分比：特异性裂解％=100-((样品发光计数-自发发光计数)／(最大发光计数-自发发光计数)×100)，自发发光通过加入Triton X-100(0.2％终浓度)来测定，在不存在抗体的情况下测量最大信号。
[0598] 使用此测定显示，单克隆抗体ch-163E12和ch-175D10对KATO-III细胞介导强ADCC(图33)。
[0599] f.增殖抑制
[0600] 对FPLC纯化的本发明嵌合抗体分析其抑制内源表达CLD18A2的KATO-III细胞的细胞生长的能力。在各个嵌合抗体存在下培养靶细胞(KATO-III)(见小鼠抗体的增殖抑制，实施例7)。显示FPLC纯化的嵌合抗体ch-163E12和ch-166E2抑制细胞增殖。
[0601] 10.选择抗体作为候选临床先导药物
[0602] 理想的临床先导药物可涵盖多种治疗和诊断应用(还参阅第IV部分-本发明的用途和方法)。根据本发明，提供了针对CLD18-A2的抗体。已经显示，根据本发明提供的抗体在特异性、在特定肿瘤细胞中诱导CDC和ADCC以及抑制表达CLD18的细胞增殖的方面提供广谱的特性。此外，已经证明，抗体的嵌合可使之获得亲本小鼠分子中不存在的另外的Fc依赖性效应子功能。例如，本文已经显示，带有小鼠IgG1的抗体175D10不诱导补体依赖性细胞毒性(见实施例5)，而带有人IgG1的ch-175D10诱导特异性裂解组成型表达CLD18的肿瘤细胞(见表5和表6)。
[0603] 本发明提供的抗体可根据其结合特性及其对表达CLD18的细胞介导效应子功能的能力而归类为不同的类别。可以基于其功能特征而在本发明提供的抗体中选择候选临床先导药物。所选择的本发明小鼠及嵌合抗体的特性概述分别在表5和表6中给出。
[0604] 本发明的候选临床先导药物可具有一种或多种以下特性：
[0605] a)结合人CLD18A2，但不结合人CLD18A1(例如43A11、45C1、125E1、163E12、166E2和175D10，以及ch-43A11、ch-45C1、ch-125E1、ch-163E12、ch-166E2和ch-175D10)。实例见图
6A和6B。
6A和6B。
[0606] b)结合小鼠CLD18A2，但不结合小鼠CLD18A1(例如125E1、163E12、166E2和175D10)。实例见图15A和15B。
[0607] c)结合肿瘤细胞天然表达的CLD18(例如45C1、43A11、125E1、163E12、166E2和175D10，以及ch-45Cl、ch-43A11、ch-125E1、ch-163E12、ch-166E2和ch-175D10)。实例见图
13。
13。
[0608] d)结合胞间接触区中的CLD18(例如45C1、43A11、125E1、163E12、166E2和175D10)。实例见图12A和12B。
[0609] e)介导CDC诱导的杀伤表达CLD18的细胞(例如45C1、125E1、163E12、166E2和175D10，以及ch-163E12和ch-175D10)。实例见图32。
[0610] f)介导ADCC诱导的杀伤表达CLD18的细胞(例如ch-163E12和ch-175D10)。实例见图33。
[0611] g)抑制表达CLD18的细胞增殖(例如45C1、125E1、163E12、166E2和175D10，以及ch-163E12和ch-166E2)。
[0612] h)在使用表达CLD18的细胞的异种移植模型中抑制肿瘤生长(例如43A11、125E1、163E12、166E2和175D10)。实例见图24。
[0613] i)在使用表达CLD18的细胞的异种移植模型中延长存活(例如43A11、125E1、163E12、166E2和175D10)。实例见图25B。
[0614] 用于针对选择候选先导药物之特性的示例性概述
[0615] 表5：鼠抗体
[0616]
[0617] 图例：+性能优秀，(+)在不同设置中的性能。
[0618] 表6：嵌合抗体
[0619]
[0620]
[0621] 图例：+性能优秀，(+)在不同设置中的性能，n.d.未进行
[0622] 11.表位分析
[0623] 如“Epitope Mapping Protocols(Methods in Molecular Biology)by Glenn E.Morris ISBN-089603-375-9”和“Epitope Mapping：A Practical Approach”Practical Approach Series，248by Olwyn M.R.Westwood，Frank C.Hay.中详述地对本发明抗体所识别表位进行作图。
[0624] 简言之，对于表位作图来说，可通过合成来源于所述抗原氨基酸序列的重叠肽(由SPOT-Synthesis制备)建立肽扫描。可以用TBS清洗肽扫描膜，用10％牛奶／吐温20-TBS封闭，与在5％牛奶／吐温20-TBS中稀释的缀合了过氧化物酶的本发明抗体一起在4℃下孵育过夜，然后用吐温20-TBS和TBS清洗，用例如ECL Lumi-light(Roche)显色，通过Lumi Imager检测。
[0625] a.分子表位分析
[0626] 人CLD18的第一细胞外结构域(ECD1)显示两个同工型的高度同源性，只有氨基酸序列的第8位具有差异(参见图14)。
[0627] 选择单克隆抗体仅选择性识别胃特异性同工型CLD18A2(参见实施例1)。为了测定在两个同工型中有差异的关键氨基酸，通过用一个同工型中的氨基酸替换另一个同工型相应位置的氨基酸来在CLD18蛋白质中建立氨基酸替换。具体地，产生了8个变体，在每个变体中，CLD18A2 ECD1中与CLD18A1氨基酸序列不同的8个氨基酸之一被CLD18A1中对应位置的氨基酸所替换。产生3个CLD18A2变体，在每个变体中，2个氨基酸被CLD18A1中对应位置的氨基酸所替换：所述8个氨基酸的第二和第三个，第三和第四个，以及第五和第六个氨基酸。通过用CLD18A2中的氨基酸替换CLD18A1中的对应氨基酸产生其它同工型CLD18A1的对应11个构建物。
[0628] 通过诱变编码各个CLD18同工型的核酸并将诱变的核酸克隆进标准表达载体中来产生改变的CLD18蛋白质。
[0629] 通过流式细胞术分析监测所测试的针对所产生CLD18A2变体的抗体结合减少，以及针对所产生的CLD18A1变体的结合增加。分析中还包括未修饰的野生型CLD18A1和CLD18A2。
[0630] 为此，用编码野生型CLD18A1或CLD18A2或其突变变体的核酸瞬时转染HEK293细胞，以产生表达人CLD18A1或CLD18A2的细胞。转染子与所测试的本发明抗体一起孵育，通过流式细胞术分析结合特征。
[0631] 小鼠单克隆抗体44E4D3F11(182-D1106-179，IgG2a，κ)识别细胞表面上的CLD18A1和CLD18A2。抗体ch-175D10显示强且特异性结合野生型CLD18A2(参见表7)。抗体ch-175D10不结合具有下述氨基酸替换的CLD18A2变体3、4和6：变体3：A42S；变体4：N45Q；变体6：E56Q。另外，未观察到结合含有变体3和4的至少一个单氨基酸替换的CLD18A2双变体。
[0632] 表7诱变概述和结果
[0633]
[0634]
[0635] b.通过肽扫描的表位作图
[0636] 为了鉴定本发明抗体所识别的表位并对其作图，通过合成重叠肽(由SPOT-Synthesis制备)建立肽扫描，所述肽来源于CLD18A2第一细胞外结构域的氨基酸序列。由Jerini AG，Berlin，Germany将整个抗原序列合成为线性15个氨基酸的肽(有11个氨基酸重叠)，然后测试与本发明抗体的结合。另外，所述线性肽的所有半胱氨酸均被丝氨酸所替换，以避免在线性肽之间形成二硫键。根据制造商的说明(Pierce，EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit)将本发明的嵌合单克隆抗体与过氧化物酶缀合，将其与所述肽扫描一起孵育。通过荧光监测针对CLD18A2的特异性表位识别。在表8中，显示了嵌合单克隆抗体ch-175D10和ch-163E12与来源于CLD18A2第一细胞外结构域的氨基酸序列的合成肽的结合强度。
[0637] 表8嵌合抗体与CLD18A2的特异性结合和表位识别
[0638]
[0639]
[0640] 抗体ch-175D10和ch-163E12都识别具有至少两个结合位点的不连续(构象)表位，其表明关键氨基酸残基分布在一级蛋白质结构上分离的两个或更多结合区域。折叠后，这些结合区域在蛋白质表面集合在一起，形成组合表位。抗体ch-175D10与没有半胱氨酸替换的肽1和7强结合，但是与含有(替换两个半胱氨酸的)丝氨酸的肽7微弱结合，表明半胱氨酸在表位识别以及可能在蛋白质折叠中的中心作用(图36)。我们的数据给出了含有两种嵌合抗体表位的CLD18A2的第一细胞外结构域的三个不同的蛋白质折叠模型(图37)。图37中所示的第一模型描绘了含有两个半胱氨酸的线性肽7，第二模型显示导致环的分子内二硫键，第三模型描述了形成两个分子间二硫键的两个半胱氨酸。
[0641] 12.抗体亲合性测定
[0642] 对于通过Scatchard分析的结合常数测定，可在稳定表达CLD18A2的HEK293细胞上滴定本发明抗体与人CLD18A2的结合，并通过流式细胞术分析。通过非缀合小鼠抗人IgG和FITC缀合的山羊抗小鼠IgG的夹心法检测本发明的人抗体或嵌合抗体。每个抗体孵育步骤可在4℃下进行30分钟，然后用FACS缓冲液洗两遍。本发明的小鼠抗体可直接被缀合了FITC的二抗山羊抗小鼠抗体检测。使用二抗和三抗的夹心法检测本发明抗体可能是通过使用QIFIKIT试剂盒(DAKO，Glostrup，Denmark)定量所结合的本发明抗体数所必需的。使用此试剂盒，可根据制造商的说明通过流式细胞术测定结合的抗体数。可获得平均荧光强度与所结合IgG的严格线性关系。可通过Scatchard作图和通过直接来自结合曲线的KD判定分析数据。根据Krause et al.，Behring Inst.Mitt.87：56-67，1990和Nauendorf et al.，Int J Cancer100：101-120，2002.计算解离常数。
[0643] 根据本发明，通过基于流式细胞术的结合分析测定本发明抗体的解离常数，其使用稳定表达CLD18A2的HEK293-CLD18A2细胞。对于小鼠和嵌合175D10和163E12，细胞结合数据的Scatchard分析得到的解离常数范围为10-8M至10-9M。根据Krause et al.，Behring Inst.Mitt.87：56-67，1990和Nauendorf et al.，Int J Cancer100：101-120，2002.计算解离常数。
[0644] 13.直系同源交叉反应性
[0645] 通过流式细胞术分析与人和小鼠CLD18A2和CLD18A1的结合。将瞬时共转染了荧光标志物和小鼠CLD18A2(SEQ ID NO：33，35)或者瞬时共转染了荧光标志物和小鼠CLD18A1(SEQ ID NO：36，37)或者共转染了荧光标志物和人CLD18A2(SEQ lD NO：1，2)或者共转染了荧光标志物和人CLD18A1(SEQ ID NO：7，8)的HEK293细胞与ch-175D10、ch-163E12和ch-125E1一起在4℃下孵育30分钟，然后与偶联别藻蓝素的抗人IgG二抗一起孵育(4℃，30分钟)。
[0646] 图38显示抗体ch-175D10、ch-163E12和ch-125E1的结合特征图。这些抗体是在临床前研究中确定CLD18单克隆抗体潜在毒性的有价值工具，如实施例3j中针对其小鼠对应物所述。
[0647] 14.在原发胃癌和胃癌转移中CLD18A2显示质膜高表达
[0648] 用GC182特异性兔抗血清对来自原发胃癌和胃癌转移(库肯勃氏瘤和淋巴结)的非选择样本染色。由专业临床病理学家进行免疫组织化学分析和染色强度评价(阴性、弱=1、中等=2、强=3)以及显示质膜染色的肿瘤细胞百分比(0-100％)，参见图39。在图39中，每个圈代表独立肿瘤样本。在转移中观察到统计学显著的染色强度增加(p=0.034，Fisher准确性检验)。
[0650]
[0651] PCT／RO／134表(1998年7月，2004年1月重印)
[0652] 新国际专利申请
[0653] 加尼梅德制药公司等
[0654] “用于治疗癌症的抗密蛋白-18的单克隆抗体”
[0655] 案号：342-38PCT
[0656] 生物材料附加页
[0657] 其他保藏物的证明：
[0658] 1)保藏物(DSM ACC2738，DSM ACC2739，DSM ACC2740，DSM ACC2741，DSM ACC2742，DSM ACC2743，DSMACC-2745，DSM ACC2746，DSM ACC2747，DSM ACC2748)
[0659] 保藏机构的名称及地址为：
[0660] DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心
[0661] Mascheroder Weg 1b
[0662] 38124 Braunschweig
[0663] DE
[0664] 2)保藏物(DSM ACC2808，DSM ACC2809，DSM ACC2810)
[0665] 保藏机构的名称及地址为：
[0666] DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心
[0667] GmbH Inhoffenstr.7B
[0668] 38124Braunschweig
[0669] DE
[0670]
[0671] 对所有上文提到保藏物的其他说明
[0672] -与小鼠(Mus musculus)脾细胞融合的小鼠(Mus musculus)骨髓瘤P3X63Ag8U.1[0673] -分泌针对人密蛋白-18A2的抗体的杂交瘤
[0674] 3)保藏人：所有上述保藏均由以下保藏人进行：
[0675] 加尼梅德制药公司
[0676] Freiligrathstrafle12
[0677] 55131Mainz
[0678] DE
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