使用大规模FET阵列测量分析物的方法和装置
阅读：138发布：2020-12-28
专利汇可以提供使用大规模FET阵列测量分析物的方法和装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且与用于分析物测量的非常大规模FET阵列有关的方法和装置。基于改进的FET 像素 和阵列设计，使用常规CMOS加工技术，可以制造chemFET(例如，ISFET)阵列，其会增加测量灵敏度和准确度，并同时促进明显小的像素尺寸和密集的阵列。改进的阵列控制技术会提供从大和密集阵列快速获取数据。这样的阵列可以用于检测在多种化学和/或 生物 过程中的不同分析物类型的存在和/或浓度变化。在一个实例中，chemFET阵列会促进DNA测序技术，这基于监测无机焦 磷酸 (PPi)、氢离子和三磷酸核苷酸的浓度的变化。，下面是使用大规模FET阵列测量分析物的方法和装置专利的具体信息内容。
1.一种测序核酸的方法，包括：
将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室中的每一个与chemFET阵列中的至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，并且其中所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，
通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过所述至少一个chemFET处的电参数变化并且所述反应室中没有可感知的pH变化来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
2.一种测序核酸的方法，包括：
将多个模板核酸安置在反应室中，其中所述多个模板核酸连接到单个珠子上，所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，且所述反应室与化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，
通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过检测在所述chemFET处的第一和第二电脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
3.一种测序核酸的方法，包括：
将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室中的每一个与chemFET阵列中的至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，且其中所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，
通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过非酶检测释放的无机焦磷酸来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
4.权利要求3的方法，其中所述检测步骤在所述反应室中不存在可感知的pH变化的情况下进行。
5.一种测序核酸的方法，包括：
将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室中的每一个与chemFET阵列中的至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，且其中所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，
通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过检测释放的无机焦磷酸和未引入的三磷酸核苷酸来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
6.权利要求5的方法，其中在t0检测释放的无机焦磷酸，且在不同的时间t1检测未引入的三磷酸核苷酸，并且所述方法还包括从时间差t1-t0测定所引入的已知三磷酸核苷酸的数目。
7.一种测序核酸的方法，包括：
使模板核酸接触测序引物和聚合酶，接触的时间和条件足以允许所述模板核酸结合所述测序引物以形成模板/引物杂合体，并允许所述聚合酶结合所述模板/引物杂合体，和通过在所述测序引物的3’末端依次引入三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过检测释放的无机焦磷酸和未引入的三磷酸核苷酸来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
8.权利要求7的方法，还包括在时间t0检测释放的无机焦磷酸，在时间t1检测未引入的三磷酸核苷酸，以及从时间差t1-t0测定所引入的已知三磷酸核苷酸的数目。
9.一种测序核酸的方法，包括：
使模板核酸接触测序引物和聚合酶，接触的时间和条件足以允许所述模板核酸结合所述测序引物以形成模板/引物杂合体，并允许所述聚合酶结合所述模板/引物杂合体，和通过在低离子强度环境中在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过用chemFET检测一个或多个相应的离子脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
10.权利要求9的方法，其中所述低离子强度环境包含小于1mM的MgCl2或MnCl2。
11.权利要求9的方法，其中所述低离子强度环境包含小于0.5mM的MgCl2或MnCl2。
12.权利要求9的方法，其中所述低离子强度环境包含小于100μM的MgCl2或MnCl2。
13.一种测定三磷酸核苷酸向新合成的核酸中引入的方法，包括：
在与chemFET相接触或电容式偶联的溶液中合并三磷酸核苷酸、模板/引物杂合体和聚合酶，并且
检测所述chemFET处的电脉冲，
其中第一和第二脉冲的检测表明三磷酸核苷酸的引入，并且
其中第一而非第二脉冲的检测表明未引入三磷酸核苷酸。
14.一种测定三磷酸核苷酸向新合成的核酸中引入的方法，包括：
在与chemFET相接触或电容式偶联的溶液中合并三磷酸核苷酸、模板/引物杂合体和聚合酶，并且
独立于在所述chemFET的钝化层处的结合事件，检测chemFET处的电脉冲/峰，其中第一和第二脉冲的检测表明三磷酸核苷酸的引入，并且
其中第一而非第二脉冲的检测表明未引入三磷酸核苷酸。
15.一种测定三磷酸核苷酸向新合成的核酸中引入的方法，包括：
在与chemFET相接触或电容式偶联的溶液中合并三磷酸核苷酸、模板/引物杂合体和聚合酶，并且
独立于在所述chemFET的钝化层处的结合事件，检测chemFET处的电脉冲/峰，其中第一和第二脉冲的检测表明至少一个三磷酸核苷酸的引入。
16.权利要求13、14或15的方法，其中所述第一脉冲发生在时间t0，所述第二脉冲发生在时间t1，且t1-t0表明所引入的三磷酸核苷酸的数目。
17.权利要求13、14或15的方法，其中所述三磷酸核苷酸是已知的。
18.权利要求13、14或15的方法，其中所述三磷酸核苷酸是多个相同的三磷酸核苷酸，所述模板/引物杂合体是多个模板/引物杂合体，并且所述聚合酶是多个聚合酶。
19.一种测序核酸的方法，包括：
将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室中的每一个与chemFET阵列中的化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，每个反应室留下至少一个chemFET，且其中所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过在所述至少一个chemFET处在时间t0检测高度为h0的第一脉冲和在时间t1检测高度为h1的第二脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中h0和h1各自比基线高至少约5mV，且t1-t0是10-50毫秒。
20.一种测序核酸的方法，包括：
将多个珠子安置在多个反应室中，其中每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，且其中所述多个反应室中的每一个与chemFET阵列中的化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，所述chemFET阵列对于每个反应室包含至少一个chemFET，
通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，和
通过在所述阵列内的至少一个chemFET处检测第一和第二电压脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，
其中所述chemFET阵列包含至少3个chemFET。
21.一种测序核酸的方法，包括：
将多个珠子安置在多个反应室中，其中每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，且其中所述多个反应室中的每一个与阵列中的化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，所述阵列对于每个反应室包含至少一个chemFET，
通过将多个已知的相同的三磷酸核苷酸引入到每个反应室中来引发新核酸链的合成，通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，并且
通过在所述阵列内的至少一个chemFET处检测第一和第二电压脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
22.权利要求21的方法，其中在将多个已知的三磷酸引入每个反应室之前，每个反应室包含三磷酸腺苷。
23.一种测序核酸的方法，包括：
(a)将多个珠子安置在多个反应室中，每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，且每个反应室与至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，
(b)将多个已知的相同的三磷酸核苷酸引入到每个反应室中，
(c)检测在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个三磷酸核苷酸是否与所述模板核酸中的相应核苷酸互补，
(d)从所述反应室中洗去未引入的三磷酸核苷酸，和
(e)使用不同的多个已知三磷酸核苷酸，在相同反应室中重复步骤(b)至(d)。
24.权利要求23的方法，其中通过所述chemFET处的第一和第二脉冲来检测一个或多个三磷酸核苷酸的依次引入。
25.权利要求23或24的方法，其中(e)包括，通过将每个不同的多个已知三磷酸核苷酸分开引入到每个反应室中来重复步骤(b)至(d)。
26.一种测序核酸的方法，包括：
将多个珠子安置在多个反应室中，其中每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，且其中所述多个反应室中的每一个与chemFET阵列中的至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，
通过将二价阳离子引入到每个反应室中来引发新核酸链的合成，
通过在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸来合成新核酸链，并且
通过在所述阵列内的至少一个chemFET处检测第一和第二电脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
2+ 2+
27.权利要求26的方法，其中所述二价阳离子是Mg 或Mn 。
28.权利要求26或27的方法，其中所述二价阳离子的浓度小于1mM。
29.权利要求26或27的方法，其中所述二价阳离子的浓度小于100μM。
30.权利要求26或27的方法，其中所述二价阳离子的浓度为约50μM。
31.一种测序核酸的方法，包括：
将多个相同的模板核酸安置在反应室中，其中所述反应室与化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，且其中所述模板核酸中的每一个与测序引物杂交并结合聚合酶，
在所述测序引物的3’末端依次引入一个或多个已知的三磷酸核苷酸，以及
通过所述chemFET处的电脉冲来检测所述一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中检测出10-1000个三磷酸核苷酸的引入。
32.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中检测出
250-750个三磷酸核苷酸的引入。
33.权利要求1、2、3、5、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述反应室包含多个填充珠子。
34.权利要求7、9、13、14或15的方法，其中在多个填充珠子存在下进行所述检测步骤。
35.权利要求1、2、3、5、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述反应室包含可溶性非核酸聚合物。
36.权利要求35的方法，其中所述可溶性非核酸聚合物是聚乙二醇。
37.权利要求7、8、13、14或15的方法，其中在可溶性非核酸聚合物存在下进行所述检测步骤。
38.权利要求37的方法，其中所述可溶性非核酸聚合物是聚乙二醇。
39.权利要求2、20、21、23或26的方法，其中所述单个珠子连接到聚乙二醇上。
40.权利要求39的方法，其中所述聚乙二醇是生物素化的聚乙二醇。
41.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述方法在约7-9的pH下进行。
42.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述方法在约8.5-9.5的pH下进行。
43.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述方法在约9的pH下进行。
44.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在弱缓冲液中进行。
45.权利要求44的方法，其中所述弱缓冲液包含Tris-HCl、硼酸、硼酸盐缓冲液、吗啉、醋酸盐、柠檬酸、碳酸或磷酸作为缓冲剂。
46.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在小于1mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中进行。
47.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在约1mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.9mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.8mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.7mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.6mMTris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.5mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.4mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、在约0.3mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中、或者在约0.2mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中进行。
48.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在约0.5mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中进行。
49.权利要求2、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述检测步骤在没有可检测的pH变化的情况下进行。
50.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述chemFET是相对pH不敏感的。
51.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在约0.5mM Tris-HCl或硼酸盐缓冲液中进行。
52.权利要求1、2、3、5、7、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在低离子强度环境中进行。
53.权利要求1、2、3、5、7、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在包含小于1mM MgCl2或MnCl2的低离子强度环境中进行。
54.权利要求1、2、3、5、7、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在包含小于0.5mM MgCl2或MnCl2的低离子强度环境中进行。
55.权利要求1、2、3、5、7、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在包含小于100μM MgCl2或MnCl2的低离子强度环境中进行。
56.权利要求1、2、3、5、7、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在包含小于0.5mM MgCl2或MnCl2的低离子强度环境中进行。
57.权利要求1、2、3、5、7、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在包含约100μM MgCl2或MnCl2、约75μM MgCl2或MnCl2、约50μM MgCl2或MnCl2、约40μM MgCl2或MnCl2、约30μM MgCl2或MnCl2、约20μM MgCl2或MnCl2、或者约
10μM MgCl2或MnCl2的低离子强度环境中进行。
58.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述合成和/或检测步骤在约0.5mM TRIS和约50μMMgCl2中进行。
59.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述三磷酸核苷酸未被封闭。
60.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述三磷酸核苷酸是三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。
61.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述chemFET包含氮化硅钝化层。
62.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述chemFET包含连接到无机焦磷酸(PPi)受体上的钝化层。
63.权利要求1、2、3、5、19、20、21、23、26或31的方法，其中每个反应室接触单个chemFET。
64.权利要求1、2、3、5、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述反应室的体积等于或小于约1皮升(pL)。
65.权利要求1、2、3、5、19、20、21、23、26或31的方法，其中反应室被1-10μm的中心-中心间距隔开。
66.权利要求1、2、3、5、19、20、21、23、26或31的方法，其中反应室被约9μm、约5μm或约2μm的中心-中心间距隔开。
67.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述三磷酸
2+ 2+
核苷酸预浸渍在Mg 或Mn 中。
68.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述聚合酶
2+ 2+
预浸渍在Mg 或Mn 中。
69.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述方法在包含单个捕获珠子的反应室中进行，其中反应室宽度与单个捕获珠子直径之比是至少0.7、至少0.8或至少0.9。
70.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述聚合酶游离在溶液中。
71.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述聚合酶被固定在珠子上。
72.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述聚合酶被固定在捕获珠子上。
73.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中在检测核苷酸引入之前，无机焦磷酸(PPi)没有显著水解。
74.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中在检测第一电脉冲之前，无机焦磷酸(PPi)没有显著水解。
75.权利要求1、2、3、5、7、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述模板核酸连接到捕获珠子上。
76.权利要求1、2、3、5、9、13、14、15、19、20、21、23、26或31的方法，其中所述chemFET包含未结合到核酸上的钝化层。
77.一种测序核酸的方法，包括：
检测一个或多个已知的三磷酸核苷酸向测序引物3’末端的引入，所述测序引物与在反应室内的模板核酸杂交，所述反应室与包含至少3个chemFET的chemFET阵列中的化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联。
78.一种测序核酸的方法，包括：
使靶核酸片段化，以产生多个片段化核酸，
使所述多个片段化核酸中的每一个连接单个珠子，以产生各自连接单个片段化核酸的多个珠子，
扩增在每个珠子上的片段化核酸，产生在每个珠子上的多个相同的片段化核酸，将连接片段化核酸的多个珠子递送至反应室的阵列，每个反应室处于与电化学的非光学传感器的感知关系中，其中在每个反应室中仅放置一个珠子，以及
在所述多个反应室中同时进行测序反应。
79.权利要求78的方法，其中所述传感器是chemFET。
80.一种测序核酸的方法，包括：
使靶核酸片段化，以产生多个片段化核酸，
单个地扩增所述多个片段化核酸中的一个或多个，以及
使用chemFET阵列测序所述单个扩增的片段化核酸。
81.权利要求78的方法，其中所述chemFET阵列包含至少3个chemFET。
82.权利要求78的方法，其中所述chemFET阵列包含至少500个chemFET。
83.权利要求78的方法，其中所述chemFET阵列包含至少100,000个chemFET。
84.权利要求78的方法，其中使用油包水乳液扩增方法单个地扩增所述多个片段化核酸。
85.一种测序核酸的方法，包括：
使靶核酸片段化，以产生多个片段化核酸，
单个地扩增所述多个片段化核酸中的一个或多个，以及使用chemFET阵列在具有约
1-10μm的中心-中心距离的多个反应室中测序所述单个扩增的片段化核酸。
86.权利要求85的方法，其中所述中心-中心距离是约9μm、约5μm、或约2μm。
87.一种测序核酸的方法，包括：
在反应室中测序多个相同的模板核酸，所述反应室与包含至少3个chemFET的阵列中的chemFET相接触或电容式偶联。
88.一种检测三磷酸核苷酸向核酸中的引入的方法，包括：
在与化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联的反应室中检测三磷酸核苷酸向核酸的3’末端的引入，其中引入的发生速率大于反应室中未引入的三磷酸核苷酸的扩散速率。
89.权利要求88的方法，其中所述chemFET存在于chemFET阵列中。
90.一种测序基因组或其部分的方法，包括：
将来自基因组或其部分的片段化核酸递送至测序装置，所述测序装置包含反应室的二维阵列，其中所述反应室中的每一个偶联至至少一个chemFET；以及
通过来自所述反应室的chemFET的信号来检测至少一个所述反应室中的测序反应。
91.一种测序基因组或其部分的方法，包括：
将来自基因组或其部分的核酸递送至反应室的二维阵列，其中所述反应室中的每一个与chemFET电容式偶联；
基本上同时将第一dNTP递送至所述反应室中的每一个；以及
由来自所述chemFET的信号测定所述基因组或其部分的序列。
92.权利要求91的方法，其中递送包括基本上同时将所述第一dNTP递送至所述反应室中的每一个。
93.一种用于鉴别与病症有关的序列的方法，包括：
将来自多个具有所述病症之对象的核酸递送至包含反应室二维阵列的测序装置，其中所述反应室中的每一个与chemFET电容式偶联；
由来自所述chemFET的信号测定所述核酸的序列；以及鉴别来自所述多个对象的DNA之间的共有序列。
94.权利要求93的方法，其中所述病症是癌症、免疫抑制病症、神经病症或病毒感染。
95.一种用于鉴别与对特定活性剂之阳性响应有关的序列的方法，包括：
使用包含chemFET阵列的测序装置测序DNA，所述DNA来自多个已经对活性剂表现出阳性响应的对象和多个对活性剂具有阴性响应的对象；以及
鉴别在所述多个已经表现出阳性响应的对象或已经表现出在其它多个对象中不存在的阴性响应的对象中的共有DNA序列。
96.权利要求95的方法，其中所述测序装置包括多个装置，每个装置包含chemFET的阵列。
97.权利要求93或95的方法，其中所述对象是人。
98.权利要求93或95的方法，其中所述DNA从选自下述的体液或组织得到：血液、唾液、CSF、皮肤、毛发、组织、尿、粪便和粘液。
6 7 8
99.权利要求95或96的方法，其中每个测序装置每小时测序至少10、10 或10 个碱基对。
100.权利要求93或95的方法，其中将测序信息提供给个人计算机、个人数字助理、蜂窝电话、视频游戏系统或电视。
101.权利要求93或95的方法，其中通过机器人技术进行测序。
102.一种测序生物聚合物的方法，包括：测量单个单体引入到延伸聚合物中的反应时间，以测定所述生物聚合物的序列。
103.权利要求102的方法，其中所述生物聚合物是核酸模板，且所述单体是核苷酸。
104.权利要求102的方法，其中所述生物聚合物是具有200-700个碱基对的核酸模板。
105.权利要求102的方法，其中所述测量包括检测离子脉冲。
106.权利要求102的方法，其中所述聚合物是核酸模板，且在测定所述序列之前扩增所述核酸模板。
107.权利要求102的方法，其中所述测量包括检测电变化。
108.权利要求102的方法，其中所述单个单体是预先确定的。
109.权利要求102的方法，其中所述测量包括检测PPi的释放。
6 7 8
110.权利要求102的方法，其中所述测序以每小时至少10、10 或10 个碱基的速率进行。
111.一种测定核酸序列的方法，包括：
同时进行至少100个测序反应；
测定所述序列，不使用标记，且不使用光学检测。
112.权利要求111的方法，其中所述核酸序列是哺乳动物基因组。
113.权利要求111的方法，其中所述核酸序列是人基因组。
114.权利要求111的方法，其中所述测定步骤包括测量一个或多个第一单体引入到延伸中的序列中所花费的时间的量。
115.权利要求111的方法，其中所述测序在约1、5、10、15、20或24小时内完成。
116.权利要求111的方法，其中测序所需要的起始材料是小于3μg的核酸。
117.权利要求111的方法，其中所述核酸序列在测序之前扩增，并任选地结合到一个或多个珠子上。
118.权利要求111的方法，其中所述测序包括检测离子脉冲。
119.权利要求111的方法，其中所述测序包括检测PPi的释放。
120.一种使用chemFET测序核酸模板的方法，包括在离子强度高达500μM、400μM或
300μM的反应混合物中进行测序反应。
2+ 2+
121.权利要求120的方法，其中反应混合物具有不高于100μM的Mg 或Mn 浓度。
122.权利要求120的方法，其中所述测序反应在由聚合材料、光可界定材料或诸如SiO2的玻璃制成的与chemFET偶联的孔中进行。
123.一种测序生物聚合物的方法，包括：
将包含单体的流体导向至反应室的阵列，其中所述流体的流体流动雷诺数最大为
2000、1000、200、100、50或20。
124.权利要求123的方法，还包括在所述反应室中检测离子脉冲。
125.权利要求123的方法，其中所述导向包括在与反应室下面的基质平行的流中递送所述流体。
126.权利要求123的方法，其中所述导向造成所述流体扩散通过所述反应室的每一个。
127.权利要求123的方法，其中进行所述导向而基本上不混合来自第一反应室和第二反应室的流体。
128.一种用于检测离子脉冲的装置，其包含层流流动系统。
129.权利要求128的装置，其中所述装置用于测序多个核酸模板。
130.权利要求128的装置，其中所述装置用于测序安置在阵列上的多个核酸模板。
131.权利要求128的装置，其中所述装置用于测序多个核酸模板。
132.一种制造测序装置的方法，包括：使用光刻，在晶体管阵列上面的玻璃材料中产生孔。
133.一种制造FET阵列的方法，其中每个FET具有浮动栅或被偶联至浮动栅，所述方法包括：
制造包含多个场效应晶体管(FET)的半导体芯片，其中多个FET包括浮动栅或被偶联至浮动栅；
在切割步骤之前对所述半导体进行混合气体退火；
切割所述半导体；以及
在所述切割步骤之后对所述半导体进行混合气体退火；
选择的退火足以将所述浮动栅中的捕获电荷降低至这样的水平：在该水平下，其存在不造成所述FET的阈值电压变动超过标称量，不显著影响阵列性能。
134.权利要求133的方法，其中所述半导体芯片包含至少100,000个FET。
135.权利要求133的方法，其中所述多个FET是化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。
136.权利要求133的方法，还包括将电介质材料层沉积在所述半导体芯片上。
137.权利要求133的方法，还包括在所述电介质材料中形成反应室的阵列。
138.权利要求136的方法，其中所述电介质材料是聚合材料、玻璃、光可界定的材料或可蚀刻的薄膜材料。
139.一种制造测序装置的方法，包括：
制造chemFET的阵列；
将电介质材料沉积在所述阵列上；
在chemFET阵列上面，在所述电介质材料中形成反应室阵列；
在切割步骤之前对所述阵列进行混合气体退火；
切割所述阵列；
在所述切割步骤之后进行混合气体退火。
140.一种测序生物体的整个基因组的方法，包括：将来自所述生物体的至多3μg DNA递送至化学敏感的场效应晶体管(chemFET)的阵列，并基于来自所述chemFET的信号测定所述基因组的序列。
141.一种测序核酸模板的方法，包括：
将第一dNTP单体施加于包含所述核酸模板的反应混合物；
施加酶，以降解未使用的dNTP；
基本上去除所有的所述酶。
142.权利要求141的方法，其中所述酶还降解PPi。
143.权利要求141的方法，其中所有的所述步骤在微流体室中进行。
144.权利要求141的方法，其中所述去除步骤还去除任何降解的dNTP。
145.权利要求141的方法，其中所有的所述步骤在层流中进行。
146.权利要求141的方法，其中去除所有的所述酶而不使用机械泵。
147.一种测定来自多个样品的序列的方法，包括：
使第一引物与来自第一样品的核酸退火；
使第二引物与来自第二样品的核酸退火；
将带有所述第一和第二引物的所述第一和第二核酸施加于chemFET的阵列；以及测定来自所述第一和第二样品的核酸序列。
148.权利要求147的方法，其中所述第一样品来自第一生物体，且所述第二样品来自第二生物体。
149.权利要求147的方法，其中所述测定操作包括：(a)测定第一脉冲和第二脉冲之间的时间差，表明引入的三磷酸核苷酸的数目，(b)测定从测序反应释放的PPi的水平；或(c)测定由测序反应导致的pH的变化。
150.一种装置，其包含：
化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列，其包含多个chemFET传感器，每个传感器具有安置在其表面上或附近的PPi受体，其中所述阵列包含至少3个chemFET传感器。
151.权利要求150的装置，其中所述阵列中的相邻chemFET传感器被小于约10μm的中心-中心距离隔开。
152.权利要求151的装置，其中所述中心-中心距离小于约9μm、约5μm、或约2μm。
153.一种装置，其包含：
化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列，所述阵列具有反应室的重叠阵列，其中每个反应室与至少一个chemFET相接触或电容式偶联。
154.权利要求153的装置，其中至少90％的所述反应室包含珠子。
155.权利要求154的装置，其中至少95％的所述反应室包含珠子。
156.权利要求153-155中任一项的装置，还包括流动池部件，其构造和排列成接收所述反应室阵列并将所述所述反应室阵列暴露给横跨流过每个反应室的开放部分的流体。
157.权利要求156的装置，其中所述流动基本上是层流。
2
158.权利要求156的装置，其中每个反应室的开放表面积不大于100、70、50或30μm。
159.权利要求158的装置，其中所述chemFET集成在一个或多个半导体芯片中的一个或多个阵列中，且所述反应室阵列安置在至少一个chemFET阵列上，并与其形成单元组件。
160.权利要求158的系统，其中所述反应室阵列包含至少100、1,000、10,000、100,000或1,000,000个反应室。
161.权利要求158的系统，其中所述系统构造成在至多1、5、10、15、20或24小时内测序整个人基因组。
162.一种适用于不经光学检测而测序未标记聚合物的测序装置，其包含至少100个室的阵列，在所述室中能够进行测序反应。
163.权利要求162的装置，其中所述室与chemFET偶联。
164.权利要求162的装置，其中所述室包含微流体孔。
6 7 8
165.权利要求162的装置，其中所述装置适合每小时测序至少10、10 或10 个碱基对。
166.一种用于检测离子脉冲的装置，其包含层流流动系统。
167.权利要求166的装置，其中所述装置用于测序多个核酸模板。
168.权利要求166的装置，其中所述装置用于测序沉积在阵列上的多个核酸模板。
169.权利要求166的装置，其中所述装置用于测序多个核酸模板。
170.用于聚合物测序的计算机装置，所述计算机装置包含用于测定离子脉冲的逻辑电路，所述离子脉冲与和PPi或dNTP或此二者的离子相互作用有关。
171.权利要求170的计算机装置，其中所述逻辑电路将离子脉冲特征转化成聚合物测序信息。
172.计算机装置，其包含用于基于离子脉冲间的时间来测定核酸模板序列的逻辑电路。
173.权利要求172的计算机装置，还包含用于测定chemFET阵列上离子脉冲的空间位置的逻辑电路。
174.计算机装置，其包含用于测定核酸模板序列的逻辑电路，所述测定基于在测序反应中使用的特定dNTP所需的持续时间。
175.权利要求170-174中任一项的计算机装置，其中所述测序基本上实时地进行。
176.权利要求170-174中任一项的计算机装置，其中所述逻辑电路接收来自一个或多个chemFET的信号。
177.一种电子芯片，其构造成用于在其上进行生物反应，所述电子芯片包含用于将信息递送至接收器的一个或多个针，所述接收器鉴别要在所述芯片上进行的反应的类型或在所述芯片上进行的反应的数目。
178.权利要求177的芯片，其中要进行的反应的类型是短核苷酸多态性检测、短串联重复检测或测序。
179.权利要求177的芯片，其中要进行的反应的数目是100、1,000、10,000、100,000或
1,000,000个。
180.一种适合在芯片上进行多于一个生物反应的系统，所述系统包含：
适合接收所述芯片的芯片接收模块；和
用于检测来自所述电子芯片的信息的接收器，其中所述信息决定选择哪个生物反应在所述芯片上进行或所述芯片的一个或多个参数。
181.权利要求180的系统，还包含用于进行所述选择生物反应的一种或多种试剂。
182.一种用于测序聚合物模板的装置，包含：至少一个集成电路，其构造成传送关于下述的信息：反应室的空间位置、加入到所述空间位置中的单体的类型、完成试剂的反应所需的时间，其中所述试剂包含具有延伸聚合物的多个单体。
183.一种至少100个微流体孔的阵列，每个孔与一个或多个chemFET偶联。
184.权利要求183的阵列，其中所述孔形成于电介质材料中。
185.权利要求184的阵列，其中所述电介质材料是玻璃、SiO2、聚合材料、光可界定的材料、离子可蚀刻的薄膜材料或反应性离子可蚀刻的薄膜材料。
186.一种包含孔的阵列的核酸测序装置，其中每个孔与用于感知所述孔中活动的传感器相结合，且每个孔具有水平宽度和垂直深度，其中所述宽度等于或小于所述深度。
187.权利要求186的装置，其中每个传感器包含一个或多个场效应晶体管(FET)。
188.一种包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)的阵列的装置，其中所述chemFET中的每一个占据至多10平方微米的阵列面积。
189.一种包含至少2个场效应晶体管的装置，其中所述晶体管中的至少一个是与PPi受体偶联的chemFET。
190.一种测序装置，其包含与电介质材料集成的半导体晶片层。
191.权利要求190的装置，其中所述电介质材料是玻璃、SiO2、聚合材料、光可界定的材料、离子可蚀刻的薄膜材料或反应性离子可蚀刻的薄膜材料。
192.权利要求190的测序装置，其中电介质材料是玻璃，且其中所述玻璃与所述半导体晶片集成。
193.权利要求192的测序装置，还包含聚合层。
194.权利要求193的测序装置，其中所述聚合层是注塑材料。
195.权利要求190的测序装置，其中所述聚合层是聚碳酸酯。
196.权利要求190的测序装置，其中所述玻璃是SiO2。
197.权利要求190的测序装置，其中所述玻璃层是非结晶的。
198.一种制造测序装置的方法，包括：使用光刻，在晶体管阵列上面的玻璃材料中产生孔。
199.一种半导体装置，其具有至少一个电介质层和浮动栅，它们以将过程诱导的捕获电荷限制至下述程度的方式进行制造和装配：其存在不造成所述装置的阵列中晶体管的阈值电压变动超过标称量。
200.权利要求199的半导体装置，其中所述浮动栅和电介质层具有零或基本上零的捕获电荷。
2
201.权利要求199的半导体装置，其中所述浮动栅的表面积大于45μm。
202.一种制备FET的阵列的方法，每个FET具有浮动栅或与浮动栅偶联，所述方法包括：
制造包含多个场效应晶体管(FET)的半导体芯片，其中多个FET包括浮动栅或与浮动栅偶联；
在切割步骤之前对所述半导体进行混合气体退火；
切割所述半导体；以及
在所述切割步骤之后对所述半导体进行混合气体退火；
选择的退火足以将所述浮动栅中的捕获电荷降低至这样的水平：在该水平下，其存在不造成所述FET的阈值电压变动超过标称量，不显著影响阵列性能。
203.权利要求202的方法，其中所述半导体芯片包含至少100,000个FET。
204.权利要求202的方法，其中所述多个FET是化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。
205.权利要求202的方法，还包括将电介质材料层沉积在所述半导体芯片上。
206.权利要求202的方法，还包括在所述电介质材料中形成反应室的阵列。
207.权利要求206的方法，其中所述电介质材料是聚合材料、玻璃、光可界定的材料或可蚀刻的薄膜材料。
208.一种制造测序装置的方法，包括：
制造chemFET的阵列；
将电介质材料沉积在所述阵列上；
在所述chemFET阵列上面，在所述电介质材料中形成反应室的阵列；
在切割步骤之前对所述阵列进行混合气体退火；
切割所述阵列；以及
在所述切割步骤之后进行混合气体退火。
209.一种流体组件，其包含具有一个或多个孔的元件，所述孔用于引导流体流至至少
100K、500K或1M个微流体反应室的阵列，从而所述流体同时或基本上同时到达所有的所述微流体反应室。
210.权利要求209的流体组件，其中所述流体组件构造成用于层流流动。
211.权利要求209的流体组件，其中所述流体流平行于支持所述反应室的基质。
212.权利要求209的流体组件，其中所述组件具有高达1000、500、200、100、50、20或
10的雷诺数。
213.权利要求209的流体组件，其中所述元件包含用于引导流体离开所述传感器阵列的第二孔。
214.权利要求209的流体组件，其中所述元件构造成基本上同时将所述流体递送至所述微流体反应室中的每一个。
215.权利要求209的流体组件，其中所述反应室中的每一个与chemFET电容式偶联。
216.权利要求209的流体组件，还包括用于移动所述流体的非移动压力供给。
217.一种组件，其包括孔的阵列和流体递送系统，所述每个孔与具有入口和出口的盖子偶联，所述流体递送系统用于从所述入口和出口递送和除去流体。
218.权利要求217的组件，还包含用于移动所述流体的非移动压力供给。
219.一种装置，其适合使用来自基因组的至多3μg DNA测序整个人基因组，而不需要利用光学或标记。
220.权利要求219的装置，其中所述装置包含chemFET的阵列。
221.权利要求219的装置，其中所述装置包含微流体反应室的阵列。
222.权利要求219的装置，其中所述装置包含与电介质材料偶联的半导体材料，所述装置包括在所述半导体材料中形成的chemFET阵列和在所述电介质材料中形成的相应的反应室阵列。
223.一种装置，其包含微流体反应室的阵列，所述阵列与包含chemFET阵列的半导体产品集成地装配。
224.权利要求223的装置，其中所述阵列包含至少100,000个室。
225.权利要求223的装置，其中所述半导体材料包含chemFET阵列。
226.权利要求223的装置，还包含与所述玻璃反应室顶部偶联的聚合层。
227.权利要求223的装置，其中每个室具有水平宽度或跨度和垂直深度，且其具有
1∶1或更小的比。
228.权利要求223的装置，其中所述玻璃反应室之间的间距高达10微米。
229.一种试剂盒，其包含权利要求223的装置和一种或多种扩增试剂。
230.一种测序装置，其包含叠加在chemFET上面的电介质层，所述电介质层具有在所述chemFET上面的偏心凹陷。
231.权利要求230的测序装置，还包含叠加在所述电介质层上面的聚合材料层。
232.权利要求230的测序装置，其中所述电介质层由二氧化硅形成。
233.一种计算机可执行的逻辑电路，其用于将生物体的整个基因组显示在手持式计算装置上。
234.一种计算机可执行的逻辑电路，其适合将来自chemFET阵列的数据发送至手持式计算装置。
235.一种计算机可执行的逻辑电路，其用于处理来自chemFET阵列的离子脉冲，以测定目标聚合物的序列。
236.权利要求235的计算机可执行的逻辑电路，其中所述序列基本上实时地显示。
237.权利要求235的计算机可执行的逻辑电路，还包含用于文件管理、文件存储和显示的逻辑电路。
238.权利要求235的计算机可执行的逻辑电路，还包含用于将所述离子脉冲转化成核苷酸序列的逻辑电路。
239.权利要求238的计算机可执行的逻辑电路，还包含用于将所述核苷酸序列递送至手持式计算装置的逻辑电路。
240.一种装置，其包含：
至少100个的多个反应室，其中所述多个反应室中的每一个与至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，和
读数器，其适合测定在所述chemFET中感知的pH变化。
241.一种系统，其包含：
多个反应室，其中所述多个反应室中的每一个与至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，和
流体递送模块，用于在扩散受限条件下将一种或多种试剂递送至所述多个反应室。
242.权利要求241的系统，其中所述流体递送模块平行于所述chemFET的钝化层的表面递送流体。
243.一种系统，其包含：
多个反应室，其中所述多个反应室中的每一个与至少一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)相接触或电容式偶联，和
读数器，其适合测定在时间t0的第一脉冲和在时间t1的第二脉冲之间的时间差，其中所述差表明在所述反应室的反应中引入的三磷酸核苷酸的数目。
244.一种测定来自多个样品之序列的方法，包括：
使第一引物与来自第一样品的核酸退火；
使第二引物与来自第二样品的核酸退火；
将带有所述第一和第二引物的所述第一和第二核酸施加于chemFET阵列；以及测定来自所述第一和第二样品的核酸序列。
245.权利要求244的方法，其中第一样品来自第一生物体，且所述第二样品来自第二生物体。
246.权利要求245的方法，其中所述测定操作包括：(a)测定第一脉冲和第二脉冲之间的时间差，其表明引入的三磷酸核苷酸的数目，(b)测定从测序反应释放的PPi的水平；或(c)测定由测序反应导致的pH的变化。
使用大规模FET阵列测量分析物的方法和装置
[0001] 相关申请
技术领域
背景技术
[0004] 电子装置和组件已经在化学和生物学(更一般地，“生命科学”)中得到众多应用，特别是用于检测和测量不同的化学和生物反应，以及鉴别、检测和测量不同的化合物。一种这样的电子装置被称作离子敏感的场效应晶体管，在相关文献中经常表示为ISFET(或pHFET)。ISFET常规地主要在科学和研究团体中采用，用于便利溶液的氢离子浓度(通常表示为“pH”)的测量。
[0005] 更具体地，ISFET是一种阻抗转化装置，其以类似于MOSFET(金属氧化物半导体场效应晶体管)的方式运行，且为选择性地测量溶液中的离子活性而特别构建(例如，溶液中的氢离子是“分析物”)。在“Thirty years of ISFETOLOGY：what happened in the past30 years and what may happen in the next 30 years，”P.Bergveld，Sens.Actuators，
88(2003)，第1-20页(所述出版物通过引用并入本文，在下文中称作“Bergveld”)中，给出了ISFET的详细运行理论。
88(2003)，第1-20页(所述出版物通过引用并入本文，在下文中称作“Bergveld”)中，给出了ISFET的详细运行理论。
[0006] 图1解释了使用常规CMOS(互补金属氧化物半导体)方法制造的p-型(p-通道)ISFET 50的横截面。但是，也可以使用biCMOS(即，两极的和CMOS)加工，诸如包括PMOS FET阵列的方法，所述阵列具有在外围上的两极结构。以CMOS为例，P-型ISFET制造基于p-型硅基质52，其中形成n-型孔54，它构成晶体管“主体”。在n-型孔54内形成高度掺杂的p-型(p+)区域S和D，它们构成ISFET的源56和排出装置58。在n-型孔内还形成高度掺杂的n-型(n+)区域B，以提供与n-型孔的传导体(或“块”)连接62。氧化物层
65安置在源、排出装置和主体连接区域上面，穿过它们制作开口，以提供与这些区域的电连接(通过电导体)；例如，金属接触体66用作提供与排出装置58的电连接的导体，且金属接触体68用作提供与源56和n-型孔54的普通连接(通过高传导的体连接62)的导体。
在源56和排出装置58之间，在n-型孔54的区域60上面的位置，在氧化物层上面形成多晶硅栅64。因为它安置在多晶硅栅64和晶体管主体(即，n-型孔)之间，氧化物层65经常被称作“栅氧化物”。
65安置在源、排出装置和主体连接区域上面，穿过它们制作开口，以提供与这些区域的电连接(通过电导体)；例如，金属接触体66用作提供与排出装置58的电连接的导体，且金属接触体68用作提供与源56和n-型孔54的普通连接(通过高传导的体连接62)的导体。
在源56和排出装置58之间，在n-型孔54的区域60上面的位置，在氧化物层上面形成多晶硅栅64。因为它安置在多晶硅栅64和晶体管主体(即，n-型孔)之间，氧化物层65经常被称作“栅氧化物”。
[0007] 类似于MOSFET，ISFET的运行基于由MOS(金属氧化物半导体)电容造成的电荷浓度的调节，所述MOS电容由多晶硅栅64、栅氧化物65和在源和排出装置之间的n-型孔54的区域60组成。当施加通过栅和源区域的负电压(VGS＜0伏特)时，通过剥夺该区域的电子，在区域60和栅氧化物65的界面处建立“p-通道”63。该p-通道63在源和排出装置之间延伸，且当栅-源负电势VGS足以从源吸收孔进入通道时，传导电流穿过p-通道。通道63开始传导电流时的栅-源电势称作晶体管的阈值电压VTH(当VGS具有大于阈值电压VTH的绝对值时，晶体管传导)。源因此得名，因为它是流过通道63的电荷载体(p-通道的孔)的源；类似地，排出装置是电荷载体离开通道63的地方。
[0008] 在图1的ISFET 50中，通过主体连接62，n-型孔54(晶体管主体)被施加与源56相同电势的偏压(即，VSB＝0伏特)，这从连接到源56和主体连接62上的金属接触体
68可以看出。该连接阻止p+源区域和n-型孔的正向偏压，并从而便利地将电荷载体限制于可以在其中形成通道63的区域60的范围。源56和主体/n-型孔54之间的任意电势差(非零源-至-主体电压VSB)会根据非线性关系影响ISFET的阈值电压VTH，且通常称作“主体效应”，这在许多应用中是不希望的。
68可以看出。该连接阻止p+源区域和n-型孔的正向偏压，并从而便利地将电荷载体限制于可以在其中形成通道63的区域60的范围。源56和主体/n-型孔54之间的任意电势差(非零源-至-主体电压VSB)会根据非线性关系影响ISFET的阈值电压VTH，且通常称作“主体效应”，这在许多应用中是不希望的。
[0009] 也如图1所示，ISFET 50的多晶硅栅64偶联到多个金属层上，所述金属层安置在一个或多个额外的氧化物层75内，所述氧化物层安置在栅氧化物65的上面，以形成“浮动栅”结构70。浮动栅结构由此得名，这是因为它与其它的ISFET相关导体在电学上分离；也就是说，它夹在栅氧化物65和钝化层72之间。在ISFET 50中，钝化层72构成离子-敏感的膜，其产生装置的离子灵敏度；即，与钝化层72(尤其在浮动栅结构70上面的敏感区域78中)相接触的分析物(诸如离子)在“分析物溶液”74(即，含有目标分析物(包括离子)或被测试目标分析物的存在的溶液)中的存在，会改变ISFET的电特征，从而调节流过源56和排出装置58之间的p-通道63的电流。钝化层72可以包含多种不同材料中的任一种，以促进对特定离子的灵敏度；例如，包含氮化硅或氮氧化硅以及金属氧化物(诸如硅、铝或钽氧化物)的钝化层通常会提供对分析物溶液74中氢离子浓度(pH)的灵敏度，而包含聚氯乙烯的钝化层(含有缬氨霉素)会提供对分析物溶液74中钾离子浓度的灵敏度。适用于钝化层且对其它离子(诸如钠、银、铁、溴、碘、钙和硝酸盐)敏感的物质是已知的。
[0010] 关于离子灵敏度，通常称作“表面电势”的电势差出现在钝化层72和分析物溶液74的固/液界面处，随敏感区域78中的离子浓度而变化，这是由于化学反应(例如，通常包含在敏感区域78附近的分析物溶液74中的离子对氧化物表面基团的解离)。该表面电势又影响ISFET的阈值电压VTH；因而，ISFET的阈值电压VTH随着在敏感区域78附近的分析物溶液74中的离子浓度的变化而变化。
[0011] 图2解释了图1所示的p-通道ISFET 50的电路简图。再次参照图1，在分析物溶液74中的参比电极76(常规Ag/AgCl电极)测定分析物溶液74主体的自身的电势，且类似于常规MOSFET的栅末端(gate terminal)，如图2所示。在ISFET的线性的或不饱和的运行区域，排出电流ID给出为：
[0012]
[0013] 其中VDS是排出装置和源之间的电压，且β是下式给出的跨导参数(单位为安培/伏特2)：
[0014]
[0015] 其中μ表示载体迁移率，Cox是每单位面积的栅氧化物电容，且比例W/L是通道63的宽度/长度比。根据方程(1)，如果参比电极76提供了电参照或基础(VG＝0伏特)，且排出电流ID和排出-至-源电压VDS保持恒定，ISFET的源电压VS的变化会直接跟踪阈值电压VTH的变化；这可以通过如下重排方程(1)来观察：
[0016]
[0017] 如上讨论的，由于ISFET的阈值电压VTH对离子浓度敏感，根据方程(3)，源电压VS提供与在ISFET敏感区域78附近的分析物溶液74的离子浓度直接有关的信号。更具体地，下式给出了阈值电压VTH：
[0018]
[0019] 其中VFB是平带电压(flatband voltage)，QB是硅中的耗竭电荷(depletion charge)，且 是费米电势(Fermi-potential)。平带电压又与材料性质有关，诸如逸出功和电荷积累。在ISFET的情况下，参照图1和2，平带电压含有反映下述界面的术语：1)参比电极76(作为晶体管门G)和分析物溶液74之间的界面；和2)分析物溶液74和敏感区域78中的钝化层72之间的界面(它又模仿浮动栅结构70的多晶硅栅64和栅氧化物65之间的界面)。因而，下式给出了平带电压VFB：
[0020]
[0021] 其中Eref是相对于真空的参比电极电势，Ψ0是在分析物溶液/钝化层界面处的化学反应(例如，钝化层中表面基团的解离)产生的表面电势，且χsol是分析物溶液74的表面偶极电势。方程(5)中的第四个术语涉及硅逸出功(q是电荷)，且最后一个术语涉及在硅表面处和在栅氧化物中的电荷密度。方程(5)中唯一对分析物溶液74的离子浓度敏感的术语是Ψ0，因为分析物溶液74的离子浓度控制在分析物溶液/钝化层界面处的化学反应(表面基团的解离)。因而，将方程(5)替换为方程(4)，可以容易地发现，表面电势Ψ0会提供对分析物溶液74的离子浓度敏感的阈值电压VTH。
[0022] 关于在分析物溶液/钝化层界面处的化学反应，用于钝化层72的给定材料的表面可以包括这样的化学基团，其可以为分析物溶液74捐献质子，或接受来自分析物溶液74的质子，在任意给定的时间在分析物溶液74界面处的钝化层72的表面上留下带负电荷的、带正电荷的和中性的位点。在分析物溶液/钝化层界面处的该质子捐献/接受过程的模型在相关文献中称作“位点解离模型”或“位点结合模型”，且作为该过程基础的概念可以普遍地用于表征包含不同材料(例如，金属氧化物、金属氮化物、金属氮氧化物)的钝化层的表面活性。
[0023] 为了解释目的使用金属氧化物的实例，任意金属氧化物的表面含有羟基，所述羟基可以为分析物捐献质子，或接受来自分析物的质子，分别在表面上留下带负电荷的或带正电荷的位点。在这些位点处的平衡反应可以描述为：
[0024] AOH□AO-+Hs+ (6)
[0025] AOH2+□AOH+Hs+ (7)
[0026] 其中A表示示例性的金属，Hs+示分析物溶液74中的质子，方程(6)描述了表面基团的质子捐献，且方程(7)描述了表面基团的质子接受。应当理解，在方程(6)和(7)中给出的反应，以及下述平衡反应，在包含金属氮化物的钝化层的分析中也存在，且需要考虑：
[0027]
[0028] 其中方程(7b)描述了另一个质子接受平衡反应。但是，为了本文讨论的目的，最初仅考虑在方程(6)和(7)中给出的质子捐献和接受反应，以阐明相关概念。
[0029] 基于每个平衡反应的各个正向和反向反应速率常数，可以计算描述平衡反应的固有解离常数Ka(对于方程(6)的反应)和Kb(对于方程(7)的反应)。这些固有解离常数又可以用于根据下式确定钝化层72的表面电荷密度σ0(单位为库仑/单位面积)：
[0030] σ0＝-qB， (8)
[0031] 其中术语B表示(带负电荷的表面基团的数目-带正电荷的表面基团的数目)/单位面积，它又依赖于在钝化层表面上每单位面积的质子供体/受体位点的总数NS，乘以与各个质子捐献和接受平衡反应的固有解离常数Ka和Kb和表面质子活性(或pHS)有关的因子。表面质子活性(pHS)的微小变化对表面电荷密度的影响由下式给出：
[0032]
[0033] 其中βint称作表面的“固有缓冲容量”。应当理解，由于NS、Ka和Kb的值是材料依赖性的，表面的固有缓冲容量βint同样是材料依赖性的。
[0034] 分析物溶液74中的离子物质具有有限的尺寸且不能接近到钝化层表面比离子半径更近的事实，导致在分析物溶液/钝化层界面附近的称作“双层电容”的现象。在Bergveld所述的双层电容的Gouy-Chapman-Stern模型中，表面电荷密度σ0被在与钝化层72表面的某一位置处的分析物溶液74的等量但是相反的电荷密度平衡。这两种平行的相反电荷形成所谓的“双层电容”Cdl(每单位面积)，根据下式，将跨电容Cdl的电势差定义为表面电势Ψ0：
[0035] σ0＝CdlΨ0＝-σdl (10)
[0036] 其中σdl是在双层电容的分析物溶液侧上的电荷密度。该电荷密度σdl又随分析物溶液74主体中的所有离子物质或其它分析物种类(即，不仅质子)的浓度而变化；具体地，表面电荷密度不仅可以被分析物溶液主体中的氢离子平衡，而且可以被其它离子物质+ +(例如，Na，K)平衡。
[0037] 在相对更低的离子强度(例如，＜1摩尔/升)的情况(regime)下，根据下式，可以使用Debye理论来描述双层电容Cdl：
[0038]
[0039] 其中k是介电常数ε/ε0(对于相对更低的离子强度，可以使用水的介电常数)，且λ是Debye筛选长度(即，可以发生显著电荷分离的距离)。Debye长度λ又与分析物溶液中离子物质的强度的平方根成反比，且在水中、在室温，由下式给出：
[0040]
[0041] 分析物主体的离子强度I随存在的所有离子物质的浓度而变化，且由下式给出：
[0042]
[0043] 其中zs是离子物质s的电荷数，且cs是离子物质s的摩尔浓度。因此，从方程(10)至(13)可以看出，Debye筛选长度越大(即，离子强度越小)，表面电势越大。
[0044] 在分析物溶液/钝化层界面处和在溶液主体中的pH值之间的关系，被Boltzman统计学表示在相关文献中，其中表面电势Ψ0作为参数：
[0045]
[0046] 从方程(9)、(10)和(14)，表面电势Ψ0特别地对分析物溶液的主体pH变化的灵敏度(即，“pH灵敏度”)由下式给出：
[0047]
[0048] 其中参数α是无因次的灵敏度因子，其在0-1之间变化，且依赖于如上面关于方程(9)所讨论的双层电容Cdl和表面βint的固有缓冲容量。一般而言，具有高固有缓冲容量βint的钝化层材料会提供对分析物溶液74中除了质子以外的离子物质的浓度的灵敏度更低的表面电势Ψ0(例如，α被大βint最大化)。从方程(15)，在298绝对温度的温度T，可以理解，在α＝1可以达到59.2mV/pH的理论最大pH灵敏度。从如上所述的方程(4)和(5)，ISFET阈值电压VTH的变化直接跟踪表面电势Ψ0的变化；因此，为了方便，由方程(15)给出的ISFET的pH灵敏度也可以在本文中表示为并称作ΔVTH。在采用氮化硅或氮氧化硅钝化层72(对于pH-灵敏度)的示例性常规ISFET中，已经在实验中在约30mV/pH至60mV/pH的范围内观察到pH灵敏度ΔVTH(即，阈值电压随着分析物溶液74的pH变化而变化)。
[0049] 与ISFET pH灵敏度有关的另一个值得注意的度量涉及分析物溶液74的主体pH，在此时不存在净表面电荷密度σ0，且因此表面电势Ψ0为零伏特。该pH称作“零电荷点”，并表示为pHpzc。再次参考方程(8)和(9)，类似于固有缓冲容量βint，pHpzc是材料依赖性的参数。从前述内容可以理解，根据下式可以计算在分析物溶液74的任意给定主体pHB处的表面电势：
[0050]
[0051] 下面的表1列出了不同的金属氧化物和金属氮化物和它们的对应的零电荷点(pHpzc)、pH灵敏度(ΔVTH)和在pH9处的理论最大表面电势：
[0052] 表1
[0053]
[0054] 基于常规CMOS加工技术的制造用于pH测量的ISFET的现有研究工作，通常以在1-14的pH范围实现高信号线性为目标。使用大约50mV/pH的示例性的阈值灵敏度，并考虑上面的方程(3)，这需要大约700mV的源电压VS线性运行范围。如上面关于图1所讨论的，ISFET(以及MOSFET)的阈值电压VTH受到源和主体(n-型孔54)之间的任意电压VSB的影响。更具体地，阈值电压VTH是非零的源-至-主体电压VSB的非线性函数。因此，为了避免由于图1所示的源和主体电压之间的电势差而损害线性(即，减轻“主体效应”)，ISFET
50的源56和主体连接62经常通过金属接触体68偶联到共同电势上。该主体-源偶联也显示在图2所示的ISFET 50的电路简图中。
50的源56和主体连接62经常通过金属接触体68偶联到共同电势上。该主体-源偶联也显示在图2所示的ISFET 50的电路简图中。
[0055] 尽管前面的讨论主要涉及ISFET响应的稳态分析(基于在方程(6)和(7)中给出的平衡反应)，在某些研究工作中已经探讨了常规ISFET对分析物溶液74离子强度的基本上瞬时的变化(例如，质子或其它离子物质浓度的逐步变化)的暂时或动态响应。
ISFET暂时或动态响应的一种示例性处理，参见“ISFET responses on a stepwise change in electrolyte concentration at constant pH，”J.C.van Kerkof，J.C.T.Eijkel和P.Bergveld，Sensors and Actuators B，18-19(1994)，第56-59页，其通过引用并入本文。
ISFET暂时或动态响应的一种示例性处理，参见“ISFET responses on a stepwise change in electrolyte concentration at constant pH，”J.C.van Kerkof，J.C.T.Eijkel和P.Bergveld，Sensors and Actuators B，18-19(1994)，第56-59页，其通过引用并入本文。
[0056] 对于ISFET暂时响应，分析物溶液中的一个或多个离子物质的浓度的逐步变化又基本上瞬时地改变在双层电容Cdl的分析物溶液侧上的电荷密度σdl。因为电荷密度σdl的瞬时变化比在钝化层72的表面处的反应动力学更快，表面电荷密度σ0最初保持恒定，且离子浓度的变化有效地导致双层电容Cdl的突然变化。从方程(10)可以理解，电容Cdl在恒定表面电荷密度σ0处的这种突然变化，导致对应的表面电势Ψ0的突然变化。图2A解释了该现象，其中分析物溶液的离子浓度的基本上瞬时的或逐步的增加(如上图所示)导致表面电势Ψ0的对应变化(如图2A的下图所示)。在一些时间后，随着钝化层表面基团对刺激物反应(即，随着表面电荷密度调节)，该系统返回某个平衡点，如图2A的下图所示的ISFET响应“脉冲”79的衰减所解释的。前述现象在相关文献中(和在本公开内容的下文中)称作“离子-阶跃”响应。
[0057] 如图2A的下图所示，离子-阶跃响应79的波幅ΔΨ0可以用下式表征：
[0058]
[0059] 其中Ψ1是在分析物溶液的最初离子浓度处的平衡表面电势，Cdl，1是在最初离子浓度处每单位面积的双层电容，Ψ2是与离子-阶跃刺激相对应的表面电势，且Cdl，2是基于离子-阶跃刺激的每单位面积的双层电容。与响应79有关的时间衰减特性81至少部分地由分析物溶液/钝化层界面处的平衡反应的动力学决定(例如，对于金属氧化物，由方程(6)和(7)给出，对于金属氮化物，还由方程(7b)给出)。在这方面，“Modeling the short-time response of ISFET sensors，”P.Woias等人，Sensors and Actuators B，24-25(1995)211-217(在下文中称作“Woias”)提供了一种有益的处理，所述出版物通过引用并入本文。
[0060] 在Woias出版物中，考虑了具有氮化硅钝化层的示例性的ISFET。基于方程(6)、(7)和(7a)给出的平衡反应的偶联的非线性微分方程系统，被用于描述ISFET对pH的逐步(基本上瞬时的)变化的动态响应；更具体地，这些方程描述了参与平衡反应的不同表面物质随时间的浓度变化(基于涉及的质子接受和质子捐献反应的正向和反向速率常数)，以及分析物pH的变化如何影响一个或多个反应速率常数。为随着时间而变化的每个表面离子物质的浓度，提供了示例性的溶液，其中的一些包括多个指数函数和有关的时间常数。在Woias提供的一个实例中，假定由方程(6)给出的质子捐献反应控制氮化硅钝化层表面对pH的相对小的逐步变化的暂时响应，由此根据下式促进响应79的时间衰减特性81的单-指数逼近：
[0061] Ψ0(t)＝ΔΨ0e-t/τ， (18)
[0062] 其中指数函数实质上表示随时间而变化的表面电荷密度的变化。在方程(16)中，时间常数τ是主体pH和钝化层的材料参数的函数，根据：
[0063] τ＝τ0×10pH/2， (19)
[0064] 其中τ0表示理论最小响应时间，其仅依赖于材料参数。对于氮化硅，Woias提供了τ0的示例值，其量级是60微秒至200微秒。为了提供一个解释性实例的目的，使用τ0＝60微秒和主体pH 9，由方程(19)给出的时间常数τ是1.9秒。其它类型的钝化材料的示例值可以参见相关文献和/或根据经验确定。
[0065] 以前基于图1的ISFET设计来制造ISFET的二维阵列的工作，已经在阵列中产生了最多256个ISFET传感元件(或“像素”)(即，16像素x 16像素阵列)。ISFET阵列制造的示例研究记载在下述出版物中：“A large transistor-based sensor array chip for direct extracellular imaging，”M.J.Milgrew，M.O.Riehle，和D.R.S.Cumming，Sensors and Actuators，B：Chemical，111-112，(2005)，第 347-353 页，和“The development of scalable sensor arrays using standard CMOS technology，”M.J.Milgrew，P.A.Hammond， 和 D.R.S.Cumming，Sensors and Actuators，B：Chemical，103，(2004)，第37-42页，所述出版物通过引用并入本文，且在下文中共同称作“Milgrew等人”。与ISFET阵列的实现有关的其它研究工作记载在下述出版物中：“A very large integrated pH-ISFET sensor array chip compatible with standard CMOS processes，”T.C.W.Yeow，M.R.Haskard，D.E.Mulcahy，H.I.Seo和D.H.Kwon，Sensors and Actuators B：Chemical，44，(1997)，第434-440页和“Fabrication of a two-dimensional pH image sensor using a charge transfer technique，”Hizawa，T.，Sawada，K.，Takao，H.，Ishida，M.，Sensors and Actuators，B：Chemical 117(2)，2006，第509-515页，所述出版物也通过引用并入本文。
[0066] 图3解释了根据Milgrew等人的设计的二维ISFET阵列的一列85j。该列85j包括十六(16)个像素801至8016，且如下面关于图7进一步讨论的，完整的二维阵列包括十六(16)个这样的列85j(j＝1，2，3，....16)，它们肩并肩地排列。如图3所示，给定列85j包括该列的所有像素共有的电流源ISOURCEj和该列的所有像素也共有的ISFET偏压/读出电路82j(包括电流吸收器ISINKj)。每个ISFET像素801至8016包括具有电偶联的源和主体的p-通道ISFET 50(如图1和2所示)以及2个开关S1和S2，所述开关对16个行选择信号(RSEL1至RSEL16和它们的补码)之一做出响应。如下面关于图7讨论的，行选择信号及其补码同时产生，以“实现”或选择列85j的给定像素，且这样的信号对以某种次序产生，以连续实现该列的不同像素，每次一个。
[0067] 如图3所示，在Milgrew等人的设计中，每个像素80的开关S2作为常规n-通道MOSFET来执行，其在接受对应的行选择信号后，将电流源ISOURCEj与ISFET 50的源相偶联。每个像素80的开关S1作为传输门来执行，即，包括n-通道MOSFET和p-通道MOSFET的
CMOS对，其在接受对应的行选择信号及其补码后，将ISFET 50的源与偏压/读出电路82j相偶联。像素801的开关S11的一个实例如图4所示，其中传输门的p-通道MOSFET指示为S11P，且n-通道MOSFET指示为S11N。在Milgrew等人的设计中，为每个像素的开关S1使用传输门，所以对于实现的像素，可以将在电源供给范围VDD至VSS内的任意ISFET源电压施加于偏压/读出电路82j，并由该列输出为信号VSj。从前述内容可以理解，在Milgrew等人的ISFET传感器阵列设计中的每个像素80包括4个晶体管，即，p-通道ISFET、包括n-通道MOSFET的CMOS-对传输门和开关S1的p-通道MOSFET以及开关S2的n-通道MOSFET。
CMOS对，其在接受对应的行选择信号及其补码后，将ISFET 50的源与偏压/读出电路82j相偶联。像素801的开关S11的一个实例如图4所示，其中传输门的p-通道MOSFET指示为S11P，且n-通道MOSFET指示为S11N。在Milgrew等人的设计中，为每个像素的开关S1使用传输门，所以对于实现的像素，可以将在电源供给范围VDD至VSS内的任意ISFET源电压施加于偏压/读出电路82j，并由该列输出为信号VSj。从前述内容可以理解，在Milgrew等人的ISFET传感器阵列设计中的每个像素80包括4个晶体管，即，p-通道ISFET、包括n-通道MOSFET的CMOS-对传输门和开关S1的p-通道MOSFET以及开关S2的n-通道MOSFET。
[0068] 也如图3所示，偏压/读出电路82j利用开尔文电桥形式的源-排出装置输出器结构，以维持恒定的排出装置-源电压VDSj，并将源电压VSj与列85j中实现的像素的ISFET的恒定排出电流ISOURCEj相分离。为此目的，偏压/读出电路82j包括2个运算放大器A1和A2、电流吸收器ISINKj和电阻器RSDj。由于流过电阻器的电流ISINKj而跨电阻器RSDj形成的电压被运算放大器呈现跨过实现的像素的ISFET的排出装置和源，作为恒定的排出装置-源电压VDSj。因而，再次参考方程(3)，由于恒定VDSj和恒定ISOURCEj，实现的像素的ISFET的源电压VSj会提供与ISFET阈值电压VTH相对应的信号，由此测量在ISFET敏感区域附近的pH(参见图1)。由传输门S1提供的源电压VSj的宽动态范围确保可以测量1-14的整个pH值范围，且每个ISFET的源-主体连接确保ISFET阈值电压在整个pH测量范围内的足够的线性。
[0069] 在图3所示的Milgrew等人的列设计中，应当理解，为了使列偏压/读出电路82j的开尔文电桥结构适当工作，在每个像素中必须采用图1所示的p-通道ISFET 50；更具体地，使用n-通道ISFET的基于开尔文电桥结构的替代方案是不可能的。再次参考图1，对于基于常规CMOS工艺的n-通道ISFET，不需要n-型孔54，且排出装置和源的高度掺杂的n-型区域直接形成在p-型硅基质52(其构成晶体管主体)中。对于n-通道FET装置，通常将晶体管主体偶联到电地线上。鉴于下述要求，即在Milgrew等人的设计中的ISFET的源和主体被电偶联到一起以减轻由于主体效应导致的非线性表现，这会导致n-通道ISFET的源也连接到电地线(即，VS＝VB＝0伏特)，由此排除来自实现的像素的任何有用的输出信号。因此，图3所示的Milgrew等人的列设计要求p-通道ISFET适当工作。
[0070] 还应当理解，在图3所示的Milgrew等人的列设计中，在每个像素中执行开关S1和S2所需要的2个n-通道MOSFET，不能在图1所示的n-型孔54中形成，其中形成像素的p-通道ISFET；相反，n-通道MOSFET直接形成在p-型硅基质52中，超出ISFET的n-型孔54的界限。图5是类似于图1的简图，它解释了与图3所示列85j的一个像素80相对
应的p-型硅基质52的一部分的更宽横截面，其中沿着与开关S2相对应的第一个n-通道MOSFET和构成图4所示的传输门S11的2个晶体管之一的第二个n-通道MOSFET S11N，显示含有ISFET 50的排出装置58、源56和主体连接62的n-型孔54。
应的p-型硅基质52的一部分的更宽横截面，其中沿着与开关S2相对应的第一个n-通道MOSFET和构成图4所示的传输门S11的2个晶体管之一的第二个n-通道MOSFET S11N，显示含有ISFET 50的排出装置58、源56和主体连接62的n-型孔54。
[0071] 此外，在Milgrew等人的设计中，在每个像素中执行传输门S1所需要的p-通道MOSFET(例如，参见图4中的S11P)，不能在与形成像素的p-通道ISFET 50的相同n-型孔中形成。具体地，因为p-通道ISFET的主体和源被电偶联到一起，在与p-通道ISFET 50相同的n-孔中执行p-通道MOSFET S11P会导致不可预测的传输门运行，或完全阻止运行。因此，需要2个分开的n-型孔来执行在Milgrew等人的设计中的每个像素。图6是类似于图5的简图，它显示了与一个像素80相对应的p-型硅基质52的另一部分的横截面，其中沿着在其中形成p-通道MOSFET S11P(其构成图4所示的传输门S11的2个晶体管之一)的第二个n-型孔55，显示与ISFET 50相对应的n-型孔54。应当理解，图5和6的图不是按照比例尺绘制，不能精确地表示在Milgrew等人的设计中的特定像素的实际布局；相反，这些图在性质上是概念性的，且其提供主要是为了解释在Milgrew等人的设计中对多个n-孔和在n-孔外制造的单独的n-通道MOSFET的要求。
[0072] 使用0.35微米(μm)常规CMOS制造工艺，执行Milgrew等人的阵列设计。在该工艺中，不同的设计规则决定了特征之间的最小分隔距离。例如，根据0.35μm CMOS设计规则，参考图6，邻近的n-孔之间的距离“a”必须是至少三(3)微米。在图6中，也指出了在n-孔54的左侧和在n-孔55的右侧的距离“a/2”，以指示使图6所示的像素80与分别在左侧和右侧的其它列中的邻近像素分离所需的最小距离。另外，根据典型的0.35μmCMOS设计规则，在图6所示的代表n-型孔54的横截面宽度的距离“b”和代表n-型孔55的横截面宽度的距离“c”各自是在大约3μm至4μm的量级(在n-型孔内，在n-孔的边缘和每个源和排出装置之间允许1.2μm，且源和排出装置本身具有0.7μm量级的宽度)。因此，在图6所示的代表横截面中像素80的宽度的总距离“d”是大约12μm至14μm的量级。在一个实现中，Milgrew等人报道了基于图3所示的列/像素设计的阵列，其包含几何学上正方形的像素，每个像素具有12.8μm x 12.8μm的尺寸。
[0073] 总之，Milgrew等人的ISFET像素设计的目的在于，确保在1-14的pH范围内准确的氢离子浓度测量。为了确保测量线性，每个像素的ISFET的源和主体被电偶联到一起。为了确保pH测量的整个范围，在每个像素中使用传输门S1来传递实现的像素的源电压。
因而，Milgrew的阵列的每个像素需要4个晶体管(p-通道ISFET、p-通道MOSFET和2个n-通道MOSFET)和2个分开的n-孔(图6)。基于0.35微米常规CMOS制造工艺和对应的
设计规则，这样的阵列的像素具有略大于10μm的最小尺寸，即，在大约12μm至14μm的量级。
因而，Milgrew的阵列的每个像素需要4个晶体管(p-通道ISFET、p-通道MOSFET和2个n-通道MOSFET)和2个分开的n-孔(图6)。基于0.35微米常规CMOS制造工艺和对应的
设计规则，这样的阵列的像素具有略大于10μm的最小尺寸，即，在大约12μm至14μm的量级。
[0074] 图7解释了根据Milgrew等人的设计的完整二维像素阵列95，以及伴随的行和列解码器电路和测量读出电路。阵列95包括像素的16个列851至8516，每个列具有在上面关于图3所讨论的16个像素(即，16像素x 16像素阵列)。行解码器92提供了16对互补的行选择信号，其中每对行选择信号同时实现每个列851至8516中的一个像素，以基于ISFET的实现的行的各个源电压VS1至VS16，提供来自阵列95的列输出信号集合。行解码器92作4
为常规的4-至-16解码器(即，4-位二进制输入ROW1-ROW4，以选择2 个输出中的一个)来执行。阵列的实现的行的列输出信号VS1至VS16的集合被施加于开关逻辑96，它包括16个传输门S1至S16(每个输出信号1个传输门)。如上所述，使用p-通道MOSFET和n-通道
MOSFET执行开关逻辑96的每个传输门，以确保每个输出信号VS1至VS16的足够的动态范围。
象行解码器92一样，列解码器94作为常规的4-至-16解码器来执行，且通过4-位二进制输入COL1-COL4来控制，以实现在任意给定时间开关逻辑96的传输门S1至S16之一，从而提供来自开关逻辑96的单个输出信号VS。该输出信号VS被施加于10-位模拟-数字转换器(ADC)98，以提供与阵列的给定像素相对应的输出信号VS的数字表示D1-D10。
为常规的4-至-16解码器(即，4-位二进制输入ROW1-ROW4，以选择2 个输出中的一个)来执行。阵列的实现的行的列输出信号VS1至VS16的集合被施加于开关逻辑96，它包括16个传输门S1至S16(每个输出信号1个传输门)。如上所述，使用p-通道MOSFET和n-通道
MOSFET执行开关逻辑96的每个传输门，以确保每个输出信号VS1至VS16的足够的动态范围。
象行解码器92一样，列解码器94作为常规的4-至-16解码器来执行，且通过4-位二进制输入COL1-COL4来控制，以实现在任意给定时间开关逻辑96的传输门S1至S16之一，从而提供来自开关逻辑96的单个输出信号VS。该输出信号VS被施加于10-位模拟-数字转换器(ADC)98，以提供与阵列的给定像素相对应的输出信号VS的数字表示D1-D10。
[0075] 如早前指出的，与上面讨论的那些类似的单个ISFET和ISFET阵列已经在多种化学和生物学用途中被用作传感装置。具体地，ISFET已经被用作pH传感器，用于监测包含诸如DNA等核酸的不同过程。在下面的出版物中，给出了在不同的生命科学相关用途中采用ISFET的一些实例，每篇出版物通过引用并入本文：Massimo Barbaro，Annalisa Bonfiglio，Luigi Raffo，Andrea Alessandrini，Paolo Facci和Imrich Barák，“Fully electronic DNA hybridization detection by a standard CMOS biochip，”Sensors and Actuators B：Chemical，第118卷，Issues 1-2，2006，第41-46页；Toshinari Sakurai和Yuzuru Husimi，“Real-time monitoring of DNA polymerasereactions by a micro ISFET pH sensor，”Anal.Chem.，64(17)，1992，第1996-1997页；S.Purushothaman，C.Toumazou，J.Georgiou，“Towards fast solid state DNA sequencing，”Circuits and Systems，第4卷，2002，第IV-169至IV-172页；S.Purushothaman，C.Toumazou，C.P.Ou，“Protons and single nucleotide polymorphism detection：A simple use for the Ion Sensitive Field Effect Transistor，”Sensors and Actuators B：Chemical，第114卷，no.2，2006，第 964-968 页；A.L.Simonian，A.W.Flounders，J.R.Wild，“FET-Based Biosensors for The Direct Detection of Organophosphate Neurotoxins，”Electroanalysis，第 16卷，No.22，2004，第 1896-1906页；C.Toumazou，S.Purushothaman，“Sensing Apparatus and Method，”2004年7月15日公开的美国专利申请2004-0134798；和T.W.Koo，S.Chan，X.Su，Z.Jingwu，M.Yamakawa，V.M.Dubin，“Sensor Arrays and Nucleic Acid Sequencing Applications，”2006年9月7日公开的美国专利申请2006-0199193。
[0076] 一般而言，使用自动化的DNA测序仪的快速且灵敏的核酸测序方法的发展，已经显著地推进了生物学的理解。术语“测序”表示无分支的生物聚合物的一级结构(或基本序列)的测定，其产生象征性的线性描绘，称作“序列”，它简洁地总结了测序的分子的许多原子-水平结构。“DNA测序”具体地表示测定给定DNA片段的核苷酸次序的过程。病毒、细菌、真菌、动物和植物的整个基因组的分析现在是可能的，但是这样的分析通常由于测序如此大的基因组所需的成本和时间而受到限制。此外，现有的常规测序方法受到下述因素的限制：它们的准确度，可以测序的单个模板的长度和序列测定速度。
[0077] 尽管样品制备和测序技术有所提高，现有的常规测序策略(包括迄今为止可能包含ISFET的那些)都没有提供将通量增加到分析大量单个人基因组所需水平所需的成本缩减。对许多人基因组测序的能力，会促进对例如疾病(例如，癌症)和老化的遗传基础的分析。一些近期的工作已经在用于测序的基因组的制备和同时对大量模板测序的能力方面取得重大进展。但是，这些和其它工作仍然受到下述因素的限制：制备这些系统可检测的模板所需的相对大尺寸的反应体积，以及对特殊核苷酸类似物的需要，和“读出”核苷酸序列的复杂的酶方法或荧光方法。
发明内容
[0078] 我们已经认识到并理解，可以特别地构造和采用ISFET的大阵列来促进DNA测序技术，所述技术基于监测化学过程(包括DNA合成)中的变化。更一般地，申请人已经认识到并理解，化学-敏感的FET(即，chemFET)的大阵列可以用于检测和测量在众多化学和/或生物学过程(例如，生物学或化学反应、细胞或组织培养或监测、神经活性、核酸测序等)中的多种分析物(例如，氢离子、其它离子、非离子型分子或化合物等)的静态和/或动态浓度/水平，其中基于这样的分析物测量可以得到有价值的信息。
[0079] 因此，本公开内容的不同实施方案一般地涉及与用于测量一种或多种分析物的大规模FET阵列有关的发明方法和装置。在本文公开的不同实施方案中，FET阵列包括多个chemFET，它们作为化学传感器。上面讨论的ISFET是为离子检测构造的一种具体的chemFET类型，且ISFET可以用于本文公开的不同实施方案中。本公开内容预见到的其它chemFET类型包括酶FET(EnFET)，其采用酶来检测分析物。但是，应当理解，本公开内容不限于ISFET和EnFET，而是更一般地涉及为某类化学灵敏度构造的任意FET。本文使用的化学灵敏度广义地包括对任意目标分子的灵敏度，该目标分子包括但不限于：有机的、无机的、天然存在的、非天然存在的和合成的化学和生物化合物，诸如离子、小分子、聚合物诸如核酸、蛋白、肽、多糖等。
[0080] 根据其它实施方案，本公开内容一般地涉及与上述大规模chemFET阵列在化学或生物样品分析中的应用有关的发明方法和装置。这些样品通常是液体(或溶于液体中)，且具有小体积，以便利对分析物(例如，离子或其它组分)存在、浓度的高速度、高密度测定或对分析物的其它测量。
[0081] 例如，某些实施方案涉及“非常大规模”二维chemFET传感器阵列(例如，大于256个传感器)，其中构成这种阵列的传感器的一个或多个含有chemFET的元件或“像素”被用于监测发生于阵列像素附近的一个或多个独立的生物或化学反应或事件。在一些示例性实现中，可以将阵列偶联到在阵列的单个传感器或传感器组上面的一个或多个微流体结构(其形成一个或多个反应室或“孔”或“微孔”)和将分析物样品(即，分析物溶液)递送至孔并在测量之间将它们从孔取出的装置上。甚至当没有采用微孔时，可以将传感器阵列偶联到一个或多个微流体结构上，所述微流体结构用于将一种或多种分析物递送至像素和用于在测量之间取出分析物。因此，在下面将更详细地讨论希望获得保护的本公开内容的发明方面，包括：不同的微流体结构，其可以用于使分析物和例如在分析物的检测和测量中有用的其它试剂(在适当时)流向孔或像素和从孔或像素流出；孔阵列的生产方法、使阵列化的孔与阵列化的像素相偶联的方法和结构和用于给孔装载待分析样品的方法和装置，包括例如，当所述装置用于DNA测序或相关分析时，给孔装载携带DNA的珠子。
[0082] 与微流体相关联地，也显示了独特的参比电极和它们与流动池的偶联。
[0083] 在本发明的不同方面，特别感兴趣的分析物是核酸合成的副产物。这样的副产物可以作为通过合成测序(sequencing-by-synthesis)的方法的读出来监测。一种特别重要的副产物是无机焦磷酸(PPi)，其在三磷酸脱氧核苷酸(在本文中也称作dNTP)添加(或掺入)到核酸(诸如测序引物)的3’末端上以后释放。在有水存在下(和任选地，且远远更+快地，在有焦磷酸酶存在下)，PPi可以水解成正磷酸盐(Pi)和游离的氢离子(H)。结果，+
通过检测PPi、Pi和/或H，可以监测核苷酸掺入和因而监测通过合成测序的反应。常规地，尚未通过chemFET检测或测量PPi。基于光学的通过合成测序的方法已经检测了PPi，其通过它的硫酸化酶-介导的向三磷酸腺苷(ATP)的转化和随后在有以前产生的ATP存在下萤光素酶-介导的萤光素向氧化萤光素的转化(伴随光释放)进行。这种检测在本文中称作PPi的“酶”检测。本发明提供了使用无酶方法检测PPi的方法。本文使用的PPi的非酶检测是这样的PPi检测，其不需要除了在第一种情况下生成或释放PPi所需的任意酶(例如，聚合酶)以外的酶。PPi的非酶检测的实例是这样的检测方法，其不需要将PPi转化成ATP。
通过检测PPi、Pi和/或H，可以监测核苷酸掺入和因而监测通过合成测序的反应。常规地，尚未通过chemFET检测或测量PPi。基于光学的通过合成测序的方法已经检测了PPi，其通过它的硫酸化酶-介导的向三磷酸腺苷(ATP)的转化和随后在有以前产生的ATP存在下萤光素酶-介导的萤光素向氧化萤光素的转化(伴随光释放)进行。这种检测在本文中称作PPi的“酶”检测。本发明提供了使用无酶方法检测PPi的方法。本文使用的PPi的非酶检测是这样的PPi检测，其不需要除了在第一种情况下生成或释放PPi所需的任意酶(例如，聚合酶)以外的酶。PPi的非酶检测的实例是这样的检测方法，其不需要将PPi转化成ATP。
[0084] 已经通过使用标准的pH计或ISFET(在某些情况下)测量pH变化，检测H+。重要的是，许多或全部现有的使用ISFET来检测核苷酸掺入的尝试，仅仅聚焦于pH变化，而不聚焦于释放的PPi的检测或测量。
[0085] 本发明预见到并从而提供了监测核酸测序反应并从而测定核酸的核苷酸序列的方法，其通过检测在没有PPi(或Pi)特异性受体存在下的H+(或pH的变化)、PPi(或Pi)、未掺入的dNTP或其某种组合来进行。因此，某些方面的目的是监测pH，而其它方面的目的是监测(和检测)在FET表面处的离子脉冲，其源自接触这种表面的溶液中的离子物质的变化。
[0086] 因而，本发明的不同方面提供了用于直接检测释放的PPi(作为核苷酸向核酸中的掺入的指示指标)的方法和装置。本发明通过使用本文所述的chemFET阵列来实现。在有些实施方案中，核酸合成反应在接触chemFET的溶液中进行，且通过chemFET表面检测(或感知)释放的PPi。重要的是，鉴于本发明的chemFET直接检测PPi的能力，可以执行这种合成和/或测序反应，且在某些情况下优选地在基本上pH不敏感的环境(即，由于例如环境的强缓冲容量而不检测其中的pH变化的环境)中执行。
[0087] 在其它实施方案中，目标分析物是氢离子，且根据本公开内容的大规模ISFET阵+列特别地构造成测量H 浓度的变化(即，pH的变化)。
[0088] 在其它实施方案中，可以监测其它生物或化学反应，且chemFET阵列可以特别地构造成测量氢离子和/或一种或多种其它分析物，所述分析物提供关于感兴趣的特定生物或化学过程的发生和/或进展的相关信息。
[0089] 在不同方面，使用常规的CMOS(或biCMOS或其它合适的)加工技术，可以制造chemFET阵列，且特别地用于便利从整个阵列快速获取数据(扫描所有像素，以获得对应的像素输出信号)。
[0090] 关于分析物检测和测量，应当理解，在下面更详细地讨论的不同实施方案中，根据本公开内容的chemFET阵列所测量的一种或多种分析物可以包括多种生物或化学物质中的任一种，所述物质提供关于生物或化学过程(例如，结合事件，诸如核酸彼此的杂交、抗原-抗体结合、受体-配体结合、酶-抑制剂结合、酶-底物结合等)的相关信息。在某些方面，除了仅仅测定分析物的存在与否以外，测量一种或多种分析物的绝对或相对以及静态和/或动态水平和/或浓度的能力，会提供关于生物和化学过程的有价值的信息。在其它方面，仅仅测定一种或多种目标分析物的存在与否，可以提供足够的有价值的信息。
[0091] 可以针对对多种分析物中的任意一种或多种的灵敏度，构造根据本公开内容的不同发明实施方案的chemFET阵列。在一个实施方案中，可以针对对一种或多种分析物的灵敏度，特别地构造阵列的一个或多个chemFET，且在其它实施方案中，可以针对对不同分析物的灵敏度，构造给定阵列的不同的chemFET。例如，在一个实施方案中，阵列的一个或多个传感器(像素)可以包括构造成对第一种分析物敏感的第一类chemFET，且阵列的一个或多个其它传感器可以包括构造成对不同于第一种分析物的第二种分析物敏感的第二类chemFET。在一个实施方案中，第一种和第二种分析物可以彼此相关。作为一个实例，第一种和第二种分析物可以是相同生物或化学反应/过程的副产物，因此可以同时检测它们，以证实反应的发生(或其缺少)。这种冗余在某些分析物检测方法中是优选的。当然，应当理解，超过2种不同类型的chemFET可以用于任意给定的阵列中，以检测和/或测量不同类型的分析物，和任选地监测生物或化学过程，诸如结合事件。一般而言，应当理解，在本文讨论的传感器阵列的任意实施方案中，给出的传感器阵列可以是“同类的”，并因此由基本上类似或相同类型的检测和/或测量相同分析物(例如，pH或其它离子浓度)的chemFET组成，或者传感器阵列可以是“异类的”，且包括用于检测和/或测量不同分析物的不同类型的chemFET。在另一个实施方案中，阵列中的传感器可以构造成检测和/或测量单一类型(或种类)的分析物，尽管检测和/或测量的物质的类型(或种类)在传感器之间可能不同。作为一个实例，阵列中的所有传感器可以构造成检测和/或测量核酸，但是每个传感器检测和/或测量不同的核酸。
[0092] 在其它方面，申请人已经特别地改进了上面关于图1-7所讨论的Milgrew等人的ISFET阵列设计以及其它常规ISFET阵列设计，从而显著减小了像素尺寸，并由此增加了给定半导体管芯尺寸(die size)中的chemFET阵列的像素数目(即，增加像素密度)。在不同实施方案中，在实现这种像素密度的增加的同时，增加了与监测的生物和化学过程相对应的输出信号的信噪比(SNR)和从阵列读出这种输出信号的速度。具体地，申请人已经认识到并理解，通过放松对chemFET线性的要求和聚焦于更有限的测量输出信号范围(例如，与大约7-9或更小的pH范围(而不是1-14)相对应的输出信号，以及不一定与pH明显相关的输出信号)，可以显著降低单个像素复杂性和尺寸，由此促进非常大规模密集的chemFET阵列的实现。申请人还已经认识到并理解，chemFET阵列中的替代性的复杂性更低的像素选择方案(例如，在图7所示的Milgrew等人的设计中采用的行和列解码器方案的替代方案，其复杂性随着阵列尺寸而增大)，以及不同的数据处理技术(包含ISFET响应建模和基于这种建模的数据外推)，会便利从明显大且密集的阵列快速获取数据。
[0093] 关于chemFET阵列制造，申请人已经进一步认识到并理解，在常规CMOS制造工艺中采用的不同技术，以及不同的制造后加工步骤(晶片处理、清洁、切割、包装等)，在某些情况下可能不利地影响得到的chemFET阵列的性能。例如，再次参考图1，一个潜在的问题涉及捕获的电荷(其可能在蚀刻与浮动栅结构70有关的金属的过程中在栅氧化物65中诱导)，以及这种捕获的电荷可能如何影响chemFET阈值电压VTH。另一个潜在的问题涉及chemFET钝化层的密度/孔隙度(例如，参见图1中的ISFET钝化层72)，其源自在基于铝金属的CMOS制造中常用的低温材料沉积工艺。尽管这样的低温工艺通常会为常规CMOS装置提供足够的钝化层，它们可能在一定程度上导致低密度且多孔的钝化层，它们可能成为接触分析物溶液的chemFET的潜在问题；具体地，低密度多孔的钝化层可能随着时间吸附分析物或溶液中的其它物质，并被它们饱和，这又可能造成不希望的chemFET阈值电压VTH随时间变化的漂移。该现象又可能阻碍一种或多种特定目标分析物的准确测量。鉴于前述内容，本文公开的其它发明实施方案涉及这样的方法和装置，它们潜在地减轻对chemFET性能的不良作用，所述不良作用可能源自chemFET阵列的制造和制造后加工/处理的不同方面。
[0094] 因此，本发明的一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS-制造的传感器的阵2
列，每个传感器包含一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，并占据10μm 或更小的阵列表面积。
列，每个传感器包含一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，并占据10μm 或更小的阵列表面积。
[0095] 另一个实施方案涉及这样的传感器阵列，其包含电子传感器的二维阵列，所述阵列包括至少512行和至少512列电子传感器，每个传感器包含一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，其构造成提供至少一个输出信号，所述信号表示在二维阵列表面附近的分析物的存在和/或浓度。
[0096] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS-制造的传感器的阵列，每个传感器包含一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。CMOS-制造的传感器的阵列包括超过256个传感器，且来自该阵列所有chemFET的chemFET输出信号的集合构成数据帧(frame)。该装置另外包含控制电路，该电路与阵列偶联，并构造成产生至少一个阵列输出信号，以提供多个来自该阵列的数据帧，帧率为至少1帧/秒。在一个方面，帧率可以是至少10帧/秒。在另一个方面，帧率可以是至少20帧/秒。在其它方面，帧率可以是至少30、40、50、70或多达100帧/秒。
[0097] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS-制造的传感器的阵列，每个传感器包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。所述chemFET包含浮动栅结构，和具有第一种半导体类型的源和排出装置，并制造在具有第二种半导体类型的区域中，其中没有电学地连接具有第二种半导体类型的区域与源或排出装置的电导体。
[0098] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含电子传感器的阵列，每个传感器由3个场效应晶体管(FET)组成，所述FET包括一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。
[0099] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含电子传感器的阵列，每个传感器包含3个或更少的场效应晶体管(FET)，其中所述3个或更少的FET包括一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。
[0100] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含电子传感器的阵列，每个传感器包含多个场效应晶体管(FET)(包括一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET))和电学地连接到多个FET上的多个电导体，其中所述多个FET排列成使得多个电导体包括不超过4个穿越每个传感器占据的区域并互连阵列的多个传感器的导体。
[0101] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS-制造的传感器的阵列，每个传感器包含多个场效应晶体管(FET)，包括包括一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，其中每个传感器中的所有FET都属于相同通道类型，且在阵列基质的单个半导体区域中执行。
[0102] 另一个实施方案涉及这样的传感器阵列，其包含多个电子传感器，它们排列成多行和多列。每个传感器包含一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，所述chemFET构造成提供至少一个、且在某些情况下提供至少2个输出信号，所述输出信号表示在阵列表面附近的分析物的存在和/或浓度。对于多个列中的每个列，所述阵列另外包含列电路，所述列电路构造成为该列中的各个chemFET提供恒定排出电流和恒定排出-至-源电压，所述列电路包括2个运算放大器和二极管-连接的FET，其与各个chemFET排列成开尔文电桥结构，以提供恒定排出-至-源电压。
[0103] 另一个实施方案涉及这样的传感器阵列，其包含多个电子传感器，它们排列成多行和多列。每个传感器包含一个化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，所述chemFET构造成提供至少一个输出信号、并在某些情况下提供至少2个输出信号，所述信号表示在阵列表面附近的溶液中的离子浓度。所述阵列另外包含至少一行选择移位寄存器(以实现多个行中的各个行)和至少一列选择移位寄存器(以从多个列中的各个列获得chemFET输出信号)。
[0104] 另一个实施方案涉及这样的装置，其包含CMOS-制造的传感器的阵列，每个传感器包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。所述chemFET包含浮动栅结构，和具有第一种半导体类型的源和排出装置，并制造在具有第二种半导体类型的区域中，其中没有电学地连接具有第二种半导体类型的区域与源或排出装置的电导体。所述阵列包括至少512行和至少512列CMOS-制造的传感器的二维阵列。每个传感器由3个场效应晶体管(FET)(包括chemFET)组成，且每个传感器包括电学地连接3个FET的多个电导体。3个FET排列成使得多个电导体包括不超过4个穿越每个传感器占据的区域并互连阵列的多个传感器的导体。每个传感器中的所有FET都属于相同通道类型，并在阵列基质的单个半导体区域中执行。来自阵列所有chemFET的chemFET输出信号的集合构成数据帧。所述装置另外包含控制电路，该电路与阵列偶联，并构造成产生至少一个阵列输出信号，以提供多个来自该阵列的数据帧，帧率为至少20帧/秒。
[0105] 另一个实施方案涉及加工CMOS-制造的传感器阵列的方法，每个传感器包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)。所述方法包括：A)切割包括阵列的半导体晶片，以形成至少一个包括阵列的切割的部分；和B)在至少一个切割的部分上进行混合气体退火(forming gas anneal)。
[0106] 另一个实施方案涉及制备chemFET阵列的方法。所述方法包括：制造chemFET阵列；将电介质材料沉积在所述阵列上；在切割步骤之前将混合气体退火施加于阵列上；切割阵列；以及在切割步骤之后进行混合气体退火。所述方法可以另外包括，在一个或多个沉积步骤之间测试半导体晶片。
[0107] 另一个实施方案涉及加工CMOS-制造的传感器阵列的方法。每个传感器包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，所述chemFET具有通过等离子体增强的化学气相沉积(PECVD)而沉积的化学-敏感的氮化硅和/或氮氧化硅钝化层。所述方法包括，将至少一种额外的钝化材料沉积在化学-敏感的钝化层上，从而减少钝化层的孔隙度和/或增加钝化层的密度。
[0108] 本发明的其它方面涉及监测核酸合成反应的方法，包括但不限于通过合成测序的方法构成整体所必需的那些。因而，本发明的不同方面提供了监测核酸合成反应的方法、测定或监测核苷酸向核酸中掺入的方法、测定核苷酸掺入的存在与否的方法、测定掺入的核苷酸的数目的方法等。
[0109] 在一个这样的方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置(例如，放置或定位)在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交(由此形成模板/引物杂合体)并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸(在本文中也属类地称作dNTP)依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过在至少一个chemFET处电压和/或电流的变化来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。chemFET的阵列(和因而多个)可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少4 5 6 7
500个、至少1000个、至少10 个、至少10 个、至少10 个、至少10 个或更多个chemFET(或chemFET传感器或传感器，作为在本文中互换使用的术语)。类似地，所述多个反应室可以是至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少
10个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少
4 5 6 7
10 个、至少10 个、至少10 个、至少10 个或更多个反应室。
500个、至少1000个、至少10 个、至少10 个、至少10 个、至少10 个或更多个chemFET(或chemFET传感器或传感器，作为在本文中互换使用的术语)。类似地，所述多个反应室可以是至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少
10个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少
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10 个、至少10 个、至少10 个、至少10 个或更多个反应室。
[0110] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触chemFET阵列，其中至少一个chemFET接触每个反应室，且其中每个模板核酸与测序引物杂交(由此形成模板/引物杂合体)并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过在至少一个chemFET处电压和/或电流的变化来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中所述chemFET阵列是前述阵列中的任一种。
[0111] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交(由此形成模板/引物杂合体)并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过在阵列内的至少一个chemFET处电压和/或电流的变化来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中邻近反应室之间的中心-中心距离(或“间距(pitch)”)是1-10μm。
[0112] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交(由此形成模板/引物杂合体)并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过测序反应副产物的产生来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中(a)所述chemFET阵列包含超过256个传感器，或(b)邻近反应室之间的中心-中心距离是1-10μm。在一个重要的实施方案中，测序反应副产物是PPi。
[0113] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，片段化(或分离，例如在富集的外显子分离的情况中)靶核酸，以产生多个片段化的(或分离的)核酸，将多个片段化的(或分离的)核酸中的每一个连接到单个珠子上以产生多个珠子，每个珠子连接单个片段化的(或分离的)核酸，扩增在每个珠子上的片段化的(或分离的)核酸的数目，将连接扩增的片段化的(或分离的)核酸的多个珠子递送至chemFET阵列，所述阵列具有对于阵列中的每个传感器的单独反应室，其中在每个反应室中仅放置一个珠子，并在多个反应室中进行同时的测序反应。
[0114] 应当理解，如本文更详细地描述地，可以从更长的核酸衍生出要测序的核酸，然后将其片段化(即，转化成更短的核酸)，或可以在适合本文预见到的反应的长度处分离它们，因而没有必要截短(或片段化)。因此应当理解，对于本文讨论的涉及使靶核酸片段化的方法的每个方面和限制，所述方法也可以通过在没有片段化的情况下分离靶核酸来实现。
[0115] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，使靶核酸片段化以产生多个片段化核酸，在有珠子存在下单独扩增每个片段化核酸，和使片段化核酸的扩增拷贝结合珠子，由此生产多个各自结合多个相同的片段化核酸的珠子，将多个各自结合多个相同的片段化核酸的珠子递送至chemFET阵列，所述阵列具有阵列中的每个chemFET传感器的单独反应室，其中在每个反应室中仅放置一个珠子，并在多个反应室中进行同时的测序反应。
[0116] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交(由此形成模板/引物杂合体)并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并检测测序副产物水平的变化，作为一个或多个已知的三磷酸核苷酸掺入的指示指标。
[0117] 所述水平的变化可以是，与一个或多个已知的三磷酸核苷酸掺入之前的水平相比，水平的升高或降低。所述水平的变化可以解读为在chemFET传感器处电压和/或电流的变化或pH的变化，但是不限于此。
[0118] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链，直接检测PPi的释放，作为一个或多个已知的三磷酸核苷酸掺入的指示指标。
[0119] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，片段化模板核酸以产生多个片段化核酸，使来自多个片段化核酸中的每一个的一条链单个地连接到珠子上，以产生多个各自具有与其连接的单链片段化核酸的珠子，将多个具有与其连接的单链片段化核酸的珠子递送至chemFET阵列，所述阵列具有该区域中的每个传感器的单独反应室，且其中在每个反应室中仅放置一个珠子，并在多个室中进行同时的测序反应。
[0120] 在一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，在接触chemFET的反应室中测序多个相同的模板核酸，所述chemFET在包含至少3个(且多达数百万个)这样的反应室和chemFET组件(assembly)的阵列中。
[0121] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，检测一个或多个已知的三磷酸核苷酸向测序引物的3’末端的掺入，所述测序引物与在反应室内的模板核酸杂交，所述反应室接触包含至少3个chemFET的chemFET阵列的chemFET。
[0122] 在一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，使靶核酸片段化以产生多个片段化核酸，单个地扩增多个片段化核酸中的一个或多个，并使用chemFET阵列测序单个地扩增的片段化核酸。在一个实施方案中，所述chemFET阵列包含至少3个chemFET。在有些实施方案中，所述chemFET阵列包含至少500个chemFET或至少100,000个chemFET。
[0123] 在有些实施方案中，使用油包水乳液扩增方法单个地扩增多个片段化核酸。
[0124] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，使靶核酸片段化以产生多个片段化核酸，将多个片段化核酸中的每一个连接到单个珠子上，以产生每个连接单个片段化核酸的多个珠子，扩增在每个珠子上的片段化核酸，产生多个在每个珠子上的相同的片段化核酸，将多个连接片段化核酸的珠子递送至chemFET阵列，所述阵列具有对于阵列中的每个传感器的单独反应室，其中在每个反应室中仅放置一个珠子，并在多个反应室中同时进行测序反应。
[0125] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，使靶核酸片段化以产生多个片段化核酸，单个地扩增多个片段化核酸中的一个或多个，并使用chemFET阵列在多个反应室中测序单个地扩增的片段化核酸，所述反应室具有约1-10μm的中心-中心距离。在不同实施方案中，中心-中心距离是约9μm、约5μm或约2μm。
[0126] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链，并通过在没有可检测的pH变化存在下阵列内至少一个chemFET处电压的变化，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0127] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在反应室中，其中所述多个模板核酸连接到单个珠子上，每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，且所述反应室接触chemFET，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链，并通过检测在chemFET处的第一个和第二个电压脉冲，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0128] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链，并通过非酶检测释放的无机焦磷酸来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。在一个实施方案中，在没有可检测的pH变化存在下，进行所述检测步骤。
[0129] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链，并通过检测释放的无机焦磷酸和未引入的三磷酸核苷酸来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0130] 在一个实施方案中，在t0检测释放的无机焦磷酸，并在时间t1检测未引入的三磷酸核苷酸。在一个有关的实施方案中，t1-t0的时间差指示掺入的已知三磷酸核苷酸的数目。
[0131] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，使模板核酸接触测序引物和聚合酶，所述接触的时间和条件足以允许模板核酸结合测序引物以形成模板/引物杂合体，并允许聚合酶结合模板/引物杂合体，并通过使三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链，以及通过检测释放的无机焦磷酸和未引入的三磷酸核苷酸来检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0132] 在一个实施方案中，在t0检测释放的无机焦磷酸，并在时间t1检测未引入的三磷酸核苷酸。在一个有关的实施方案中，t1和t0之间的时间差(即，t1-t0)指示掺入的已知三磷酸核苷酸的数目。
[0133] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，使模板核酸接触测序引物和聚合酶，所述接触的时间和条件足以允许模板核酸结合测序引物以形成模板/引物杂合体，并允许聚合酶结合模板/引物杂合体，和通过在低离子强度环境中将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过检测在chemFET处的一个或多个电压脉冲，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0134] 根据该实施方案，所述低离子强度环境可以包含小于1mM MgCl2、小于0.5mM MgCl2、小于100μM MgCl2或小于50μM MgCl2。在其它实施方案中，所述低离子强度环境可以包含小于1mM MnCl2、小于0.5mM MnCl2、小于100μM MnCl2或小于50μM MnCl2。在其它2+ 2+ 2+ 2+
实施方案中，所述盐可以是另一种含有Mg 或Mn 的盐，或它可以是含有Ca 或Co 的盐，或它可以是一种或多种这样的盐的组合。
实施方案中，所述盐可以是另一种含有Mg 或Mn 的盐，或它可以是含有Ca 或Co 的盐，或它可以是一种或多种这样的盐的组合。
[0135] 在另一个方面，本发明提供了测定三磷酸核苷酸向新合成的核酸中(或到诸如测序引物等引物上)的掺入的方法，包括，在接触chemFET的溶液中合并三磷酸核苷酸、模板/引物杂合体和聚合酶，并检测在chemFET处的电压脉冲，其中第一个和第二个电压脉冲的检测表明三磷酸核苷酸的引入，且其中第一个而非第二个电压脉冲的检测表明未引入三磷酸核苷酸。
[0136] 在一个实施方案中，独立于在chemFET的钝化层处的结合事件，在chemFET处检测电压脉冲。
[0137] 在另一个方面，本发明提供了测定三磷酸核苷酸向新合成的核酸中(或到诸如测序引物等引物上)的掺入的方法，包括，在接触chemFET的溶液中，混合三磷酸核苷酸、模板/引物杂合体和聚合酶，并独立于在chemFET的钝化层处的结合事件，检测在chemFET处的电压脉冲，其中第一个和第二个电压脉冲的检测指示至少一个三磷酸核苷酸的引入。
[0138] 在某些前述方面的不同实施方案中，第一个电压脉冲发生在时间t0，且第二个电压脉冲发生在时间t1，且t1-t0指示掺入的三磷酸核苷酸的数目。在不同实施方案中，掺入的三磷酸核苷酸是已知的。在不同实施方案中，所述三磷酸核苷酸是多个相同的三磷酸核苷酸，所述模板/引物杂合体是多个相同的模板/引物杂合体，且所述聚合酶是多个相同的聚合酶。或者，所述聚合酶可以是多个不同的聚合酶，而且是包含2、3或更多类聚合酶。在某些情况下，可以使用2种聚合酶的混合物，其中一种具有合适的持续合成能力(processivity)，另一种具有合适的掺入速率。不同聚合酶的化例可以变化，且本发明在这方面不受限制。同样地，所述模板/引物杂合体可以是多个彼此可能不同的模板/引物杂合体，条件是，在单个反应室中或连接到单个珠子上的任意模板/引物杂合体彼此相同。
[0139] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置(例如，放置或定位)在多个反应室中，其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过在至少一个chemFET处在时间t0检测具有高度h0的第一个电压脉冲和在时间t1检测具有高度h1的第二个脉冲，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中h0和h1各自比基线高至少约5mV，且t1-t0是至少1毫秒。在有些实施方案中，t1-t0是至少5毫秒、至少10毫秒、至少20毫秒、至少30毫秒、至少40毫秒或至少50毫秒。
[0140] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个珠子安置在多个反应室中，其中每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，且其中所述多个反应室接触对于每个反应室包含至少一个chemFET的chemFET阵列，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端来合成新核酸链(或延伸测序引物)，并通过在阵列内的至少一个chemFET处检测第一个和第二个电压脉冲，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中所述chemFET阵列包含至少3个chemFET。
[0141] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个珠子安置在多个反应室中，其中每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，且其中所述多个反应室接触化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列，所述阵列包含至少一个chemFET(对于每个反应室而言)，通过将多个已知的相同的三磷酸核苷酸引入到每个反应室中来引发新核酸链的合成(或测序引物的延伸)，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端，合成新核酸链，并通过在阵列内的至少一个chemFET处检测第一个和第二个电压脉冲，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0142] 在一个实施方案中，在将多个已知的三磷酸引入每个反应室之前，每个反应室包含三磷酸腺苷。
[0143] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，(a)将多个珠子安置在多个反应室中，每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，且每个反应室接触至少一个chemFET，(b)将多个已知的相同的三磷酸核苷酸引入每个反应室中，(c)检测依次引入在测序引物的3’末端的一个或多个三磷酸核苷酸是否与模板核酸中的对应核苷酸互补，(d)从反应室洗去未引入的三磷酸核苷酸，和(e)使用不同的多个已知三磷酸核苷酸在相同反应室中重复步骤(b)至(d)。
[0144] 在一个实施方案中，通过在chemFET处的第一个和第二个电压脉冲，检测一个或多个三磷酸核苷酸的依次引入。在有些实施方案中，步骤(e)包括，通过将每个不同的多个已知三磷酸核苷酸单独地引入每个反应室，重复步骤(b)至(d)。
[0145] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个珠子安置在多个反应室中，其中每个反应室包含单个珠子，每个珠子连接多个相同的模板核酸，每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，且其中多个反应室中的每一个接触chemFET阵列中的至少一个chemFET，通过将二价阳离子引入每个反应室来开始新核酸链的合成，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端，合成新核酸链，并通过在阵列内的至少一个chemFET处检测第一个和第二个电压脉冲，检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入。
[0146] 在一个实施方案中，所述二价阳离子是Mg2+。在另一个实施方案中，所述二价阳离2+ 2+ 2+
子是Mn 。在其它实施方案中，所述二价阳离子是Mg 和Mn 的混合物。根据该实施方案，所述二价阳离子是在小于1mM或小于100μM或约50μM的浓度。
子是Mn 。在其它实施方案中，所述二价阳离子是Mg 和Mn 的混合物。根据该实施方案，所述二价阳离子是在小于1mM或小于100μM或约50μM的浓度。
[0147] 在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个相同的模板核酸安置在反应室中，其中所述反应室接触chemFET，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合聚合酶，将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端，并通过在chemFET处的电压脉冲检测一个或多个已知三磷酸核苷酸的引入，其中检测出10-1000个三磷酸核苷酸的引入。
[0148] 本发明的不同前述方面可以包括不同的实施方案，为了方便和简洁，在下面阐述它们一次。
[0149] 应当理解，尽管本发明的不同的前述方面和实施方案阐述了测序引物与模板的杂交(或结合)，本发明也预见到与自身杂交(即，在分子内)的测序引物和/或模板核酸的使用，由此产生游离3’末端，在所述末端上面可以掺入三磷酸核苷酸。这样的模板(在本文中称作自身引发模板)可以用于任意的前述方法中。
[0150] 类似地，本发明同样预见到双链模板的使用，所述双链模板工程化成在它们的游离端具有可以被切口酶(诸如DNA切口酶)作用的特定序列。以此方式，聚合酶在切口部位掺入三磷酸核苷酸。在这些实例中，不需要单独的测序引物。
[0151] 在有些实施方案中，检测出至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个三磷酸核苷酸的引入。在其它实施方案中，检测出100-1000个三磷酸核苷酸的引入。在其它的某些实施方案中，检测出250-750个三磷酸核苷酸的引入。
[0152] 在有些实施方案中，所述反应室包含多个填充珠子。在有些实施方案中，在有多个填充珠子存在下进行检测步骤。
[0153] 在有些实施方案中，所述反应室包含可溶性非核酸聚合物。在有些实施方案中，在有可溶性非核酸聚合物存在下进行检测步骤。在有些实施方案中，所述可溶性非核酸聚合物是聚乙二醇或PEA或葡聚糖或丙烯酰胺或纤维素(例如，甲基纤维素)。在有些实施方案中，所述非核酸聚合物(诸如聚乙二醇)连接在单个珠子上。在有些实施方案中，所述非核酸聚合物连接在反应室的一个或多个(或所有)侧面上，除了在某些情况下作为FET表面的反应室底面以外。在有些实施方案中，所述非核酸聚合物是生物素化的，诸如但不限于生物素化的聚乙二醇。
[0154] 在有些实施方案中，在约7-9或在约8.5-9.5或在约9的pH实现所述方法。
[0156] 在有些实施方案中，在约1mM Tris-HCl中进行所述合成和/或检测步骤。在有些实施方案中，在小于1mM Tris-HCl中进行所述合成和/或检测步骤。在有些实施方案中，在约0.9mM Tris-HCl、约0.8mM Tris-HCl、约0.7mM Tris-HCl、约0.6mM Tris-HCl、约0.5mM Tris-HCl、约0.4mM Tris-HCl、约0.3mM Tris-HCl或约0.2mM Tris-HCl中，进行所述合成和/或检测步骤。
[0157] 在有些实施方案中，在约1mM硼酸盐缓冲液中进行所述合成和/或检测步骤。在有些实施方案中，在小于1mM硼酸盐缓冲液中进行所述合成和/或检测步骤。在有些实施方案中，在约0.9mM硼酸盐缓冲液、约0.8mM硼酸盐缓冲液、约0.7mM硼酸盐缓冲液、约0.6mM硼酸盐缓冲液、约0.5mM硼酸盐缓冲液、约0.4mM硼酸盐缓冲液、约0.3mM硼酸盐缓冲液或约0.2mM硼酸盐缓冲液中，进行所述合成和/或检测步骤。
[0158] 在有些实施方案中，在没有可检测的pH变化存在下，进行所述检测步骤。在有些实施方案中，在恒定pH的环境中，进行所述检测步骤。在有些实施方案中，所述chemFET是相对pH不敏感的。在有些实施方案中，在约0.5mM Tris-HCl中进行所述合成和/或检测步骤。
[0159] 在有些实施方案中，在低离子强度环境中进行所述合成和/或检测步骤。在有些实施方案中，在低离子强度环境中进行所述合成和/或检测步骤，所述低离子强度环境包含小于1mM MgCl2或MnCl2、小于0.5mM MgCl2或MnCl2、或小于100μM MgCl2或MnCl2。在有些实施方案中，在低离子强度环境中进行所述合成和/或检测步骤，所述低离子强度环境包含约100μM MgCl2或MnCl2、约75μM MgCl2或MnCl2、约50μM MgCl2或MnCl2、约40μM MgCl2或MnCl2、约30μM MgCl2或MnCl2、约20μM MgCl2或MnCl2、或约10μM MgCl2或MnCl2。应当理解，本发明同样地预见到其它二价阳离子的量，因此不仅限于MgCl2或MnCl2。同样地，应当理解，本发明预见到2种或更多种二价阳离子(和/或它们的对应盐)的使用，只要总离子浓度是在上述水平。
[0160] 在有些实施方案中，在约0.5mM TRIS和约50μM MgCl2或MnCl2中进行所述合成和/或检测步骤。
[0161] 在不同实施方案中，三磷酸核苷酸未被封闭。本文使用的未封闭的三磷酸核苷酸是这样的三磷酸核苷酸，其具有未修饰的末端，所述末端可以掺入核酸(在它的3’末端)，且在掺入后，可以连接到以后的掺入的三磷酸核苷酸上。相反，封闭的dNTP不能添加到核酸上，或它们向核酸中的掺入会阻止任何其它核苷酸掺入。在不同实施方案中，所述三磷酸核苷酸是三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。
[0162] 在不同实施方案中，所述chemFET包含氮化硅钝化层。在有些实施方案中，所述chemFET包含连接到无机焦磷酸(PPi)受体上的钝化层。在有些实施方案中，所述chemFET包含没有结合核酸的钝化层。
[0163] 在有些实施方案中，每个反应室接触单个chemFET。
[0164] 在有些实施方案中，所述反应室具有等于或小于约1皮升(pL)的体积，包括小于0.5pL、小于0.1pL、小于0.05pL、小于0.01pL、小于0.005pL。在有些实施方案中，所述反应室被1-10μm的中心-中心间距隔开。在有些实施方案中，所述反应室被约9μm、约5微米或约2微米的中心-中心间距隔开。所述反应室可以具有正方形横截面，例如在它们的底部或底面。实例包括8μm x 8μm横截面、4μm x 4μm横截面或1.5μm x 1.5μm横截面。
或者，它们可以具有矩形横截面，例如在它们的底部或底面。实例包括8μm x 12μm横截面、4μm x 6μm横截面或1.5μm x 2.25μm横截面。
或者，它们可以具有矩形横截面，例如在它们的底部或底面。实例包括8μm x 12μm横截面、4μm x 6μm横截面或1.5μm x 2.25μm横截面。
[0165] 在有些实施方案中，所述三磷酸核苷酸预浸渍在Mg2+(例如，在有MgCl2存在下)或2+ 2+
Mn (例如在有MnCl2存在下)中。在有些实施方案中，所述聚合酶预浸渍在Mg (例如，在
2+
有MgCl2存在下)或Mn (例如在有MnCl2存在下)中。
Mn (例如在有MnCl2存在下)中。在有些实施方案中，所述聚合酶预浸渍在Mg (例如，在
2+
有MgCl2存在下)或Mn (例如在有MnCl2存在下)中。
[0166] 在有些实施方案中，所述方法在包含单个捕获珠子的反应室中实现，其中反应室宽度与单个捕获珠子直径之比是至少0.7、至少0.8或至少0.9。
[0167] 在有些实施方案中，所述聚合酶游离在溶液中。在有些实施方案中，所述聚合酶固定化在珠子上。在有些实施方案中，所述聚合酶固定化在捕获珠子上。在有些实施方案中，所述模板核酸连接到捕获珠子上。
[0168] 在有些实施方案中，在检测核苷酸掺入之前，无机焦磷酸(PPi)没有显著水解。在有些实施方案中，在检测第一个电压脉冲之前，无机焦磷酸(PPi)没有显著水解。
[0169] 在一个方面，本发明提供了这样的装置，其包含chemFET阵列，所述阵列包含多个chemFET传感器，每个传感器具有安置在它的表面上的PPi受体，其中所述阵列包含至少3个chemFET传感器。
[0170] 在一个方面，本发明提供了这样的装置，其包含chemFET阵列，所述阵列包含多个chemFET传感器，每个传感器具有安置在它的表面上的PPi受体，其中阵列中的邻近的chemFET传感器被小于约10μm的中心-中心距离隔开(例如，使用0.18μm CMOS制造，所述间距可以是约2.8μm)。
[0171] 在另一个方面，本发明提供了这样的装置，其包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，所述chemFET具有安置在它的表面上的PPi选择性受体。所述PPi受体可以固定化在chemFET表面上。
[0172] 在另一个方面，本发明提供了这样的装置，其包含化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列，所述阵列包含多个chemFET传感器，每个传感器具有安置在它的表面上的PPi受体，其中所述多个是阵列中的chemFET传感器的子集。在一个有关的实施方案中，所述阵列包含至少3个chemFET传感器。所述子集可以代表阵列中的10％、25％、33％、50％、75％或更多的传感器。所述PPi选择性受体可以固定化在每个chemFET的表面上。
[0173] 在有些实施方案中，所述邻近反应室之间的中心-中心距离是约1-9μm或约2-9μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm或约9μm。在有些实施方案中，所述chemFET阵列包含超过256个传感器(和任选地超过256个对应的反应室(或孔))、超过300个传感器(和任选地超过300个对应的反应室)、超过400个传感器(和任选地超过400个对应的反应室)、超过500个传感器(和任选地超过500个对应的反应室)、超过600个传感器(和任选地超过600个对应的反应室)、超过700个传感器(和任选地超过700个对应的反应室)、超过800个传感器(和任选地超过800个对应的反
3
应室)、超过900个传感器(和任选地超过900个对应的反应室)、超过10 个传感器(和任
3 4 4
选地超过10 个对应的反应室)、超过10 个传感器(和任选地超过10 个对应的反应室)、
5 5 6
超过10 个传感器(和任选地超过10 个对应的反应室)或超过10 个传感器(和任选地
6
超过10 个对应的反应室)。在有些实施方案中，所述chemFET阵列包含至少512行和至少
512列的传感器。
3
应室)、超过900个传感器(和任选地超过900个对应的反应室)、超过10 个传感器(和任
3 4 4
选地超过10 个对应的反应室)、超过10 个传感器(和任选地超过10 个对应的反应室)、
5 5 6
超过10 个传感器(和任选地超过10 个对应的反应室)或超过10 个传感器(和任选地
6
超过10 个对应的反应室)。在有些实施方案中，所述chemFET阵列包含至少512行和至少
512列的传感器。
[0174] 在有些实施方案中，所述测序副产物是PPi。在有些实施方案中，直接测量PPi。在有关的实施方案中，通过它与固定化在chemFET传感器表面上的PPi选择性受体的结合，检测PPi。在另一个实施方案中，在没有PPi选择性受体存在下检测PPi。在其它实施方案中，在独立于pH的或pH不敏感的环境中检测PPi。
[0175] 在有些实施方案中，所述测序反应副产物是氢离子。在有些实施方案中，所述测序反应副产物是Pi。在其它实施方案中，所述chemFET检测副产物的任意组合的变化，任选地与本文所述的其它参数相组合。
[0176] 在有些实施方案中，所述PPi选择性受体是图11B所示的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9或化合物10。在有些实施方案中，所述chemFET存在于chemFET阵列中，它们各自已经在其表面上安置(包括固定化)了PPi选择性受体。在有些实施方案中，将相同的PPi选择性受体安置在所述阵列的每个chemFET上。在有些实施方案中，所述阵列包含超过256个传感器。在有些实施方案中，所述阵列包含至少512行和至少512列的传感器。在有些实施方案中，所述chemFET位于反应室底面处。
[0177] 在另一个方面，本发明提供了这样的装置，其包含chemFET阵列，所述阵列已经在其表面上安置了生物阵列或化学阵列。
[0178] 所述生物阵列可以是核酸阵列、蛋白阵列(包括但不限于酶阵列、抗体阵列和抗体片段阵列)、细胞阵列等。所述化学阵列可以是有机小分子阵列或无机分子阵列，但是不2 3 4 5
限于此。chemFET阵列可以包含至少5、至少10、至少10、至少10、至少10、至少10、至少
6
10 或更多个传感器。在某些实施方案中，所述生物或化学阵列可以排列成多个“单元”或空间上确定的区域，且每个这样的区域位于chemFET阵列中的不同传感器上。
限于此。chemFET阵列可以包含至少5、至少10、至少10、至少10、至少10、至少10、至少
6
10 或更多个传感器。在某些实施方案中，所述生物或化学阵列可以排列成多个“单元”或空间上确定的区域，且每个这样的区域位于chemFET阵列中的不同传感器上。
[0179] 在另一个方面，本发明提供了检测核酸的方法，包括，使安置在chemFET阵列上的核酸阵列接触样品，并检测来自样品的核酸与核酸阵列上的一个或多个区域的结合。
[0180] 在另一个方面，本发明提供了检测蛋白的方法，包括，使安置在chemFET阵列上的蛋白阵列接触样品，并检测来自样品的蛋白与蛋白阵列上的一个或多个区域的结合。
[0181] 在另一个方面，本发明提供了检测核酸的方法，包括，使安置在chemFET阵列上的蛋白阵列接触样品，并检测来自样品的核酸与蛋白阵列上的一个或多个区域的结合。
[0182] 在另一个方面，本发明提供了检测抗原的方法，包括，使安置在chemFET阵列上的抗体阵列接触样品，并检测来自样品的抗原与抗体阵列上的一个或多个区域的结合。
[0183] 在另一个方面，本发明提供了检测酶底物或抑制剂的方法，包括，使安置在chemFET阵列上的酶阵列接触样品，并检测来自样品的实体与酶阵列上的一个或多个区域的结合。
[0184] 应当理解，预见到在下面更详细地讨论的前述概念和其它概念的所有组合(只要这些概念不互相矛盾)，作为本文公开的发明主题的一部分。具体地，预见到出现在本公开内容的末尾的要求保护的主题的所有组合，作为本文公开的发明主题的一部分。还应当理解，也可能出现在通过引用并入的任意公开内容中的本文明确采用的术语，应当具有本文公开的具体概念最一致的含义。附图说明
[0185] 在附图中，索引字符等通常表示在不同视图中的相同部分。另外，附图不一定按照比例尺绘制，但是重点在于一般地阐述本文讨论的不同概念。
[0186] 图1解释了使用常规CMOS工艺制造的p-型(p-通道)离子敏感的场效应晶体管(ISFET)的横截面。
[0187] 图2解释了图1所示的p-通道ISFET的电路简图。
[0188] 图2A解释了针对分析物离子浓度的阶跃变化的一种示例性的ISFET暂时响应。
[0189] 图3解释了基于图1所示的ISFET的二维ISFET阵列的一个列。
[0190] 图4解释了包括p-通道MOSFET和n-通道MOSFET的传输门，其用于在图3所示的阵列列的每个像素中。
[0191] 图5是与图1类似的简图，其解释了与图3所示的阵列列的一个像素相对应的基质部分的更宽的横截面，其中沿着所述像素也包括的2个n-通道MOSFET显示了ISFET。
[0192] 图6是与图5类似的简图，其解释了与图3所示的阵列列的一个像素相对应的基质另一部分的横截面，其中沿着图4所示的传输门的p-通道MOSFET显示了ISFET。
[0193] 图7解释了基于图3的列设计的完整二维ISFET像素阵列的一个实例，以及伴随的行和列解码器电路和测量读出电路。
[0194] 图8一般地解释了根据本公开内容的一个发明实施方案的核酸加工系统，其包含大规模chemFET阵列。
[0195] 图8A的图解释了根据本发明的一个实施方案在chemFET的分析物/钝化层界面附近的离子化物质浓度随着示例性核酸测序/合成反应的时间而变化的图。
[0196] 图8B的图解释了根据本发明的一个实施方案chemFET输出电压随着与图8A所示那些类似的示例性核酸测序/合成反应的时间而变化的多幅图。
[0197] 图9解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，与图8所示类似的chemFET阵列的一列。
[0198] 图9A解释了在图9所示的阵列列中采用的一个示例性放大器的电路简图。
[0199] 图9B是根据本公开内容的一个发明实施方案的放大器偏压相对于带宽的图。
[0200] 图10解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，图9所示的chemFET阵列列的像素的芯片布局设计顶视图。
[0201] 图10-1解释了根据本公开内容的另一个发明实施方案，图9所示的chemFET阵列的4个邻近像素簇的芯片布局设计顶视图。
[0202] 图11A显示了沿着图10所示的像素的线I-I的复合横截面视图，包括在线II--II和III-III之间在图10的右一半上额外元件，其解释了根据本公开内容的一个发明实施方案的像素制造的叠层视图。
[0203] 图11A-1显示了沿着图10-1所示像素之一的线I-I的多个邻近像素的复合横截面视图，包括在线II--II之间的像素的额外元件，其解释了根据本公开内容的另一个发明实施方案的像素制造的叠层视图。
[0204] 图11B(1)-(3)提供了10种PPi受体的化学结构(化合物1至10)。
[0205] 图11C(1)是来自图11B(3)的化合物7的合成方法的简图。
[0206] 图11C(2)是来自图11B(3)的化合物8的合成方法的简图。
[0207] 图11C(3)是来自图11B(3)的化合物9的合成方法的简图。
[0208] 图11D(1)和(2)的简图解释了为了结合分子识别化合物(诸如但不限于PPi受体)而可以施加于钝化层上的多种化学试剂。
[0209] 图11E是来自图11B(3)的化合物7向金属氧化物表面的结合的简图。
[0210] 图12A至12L提供了根据本公开内容的一个发明实施方案，图11A所示的每个制造层的顶视图。
[0211] 图12-1A至12-1L提供了根据本公开内容的另一个发明实施方案，图11A-1所示的每个制造层的顶视图。
[0212] 图13解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，基于图9-12所示的列和像素设计，与图8所示类似的chemFET传感器阵列的一种示例性CMOS IC芯片实现的方框图。
[0213] 图14解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，图13所示的阵列的行选择移位寄存器。
[0214] 图15解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，图13所示的阵列的2个列选择移位寄存器之一。
[0216] 图17解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，与阵列控制器偶联的图13的chemFET传感器阵列的方框图。
[0217] 图18解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，由图17的阵列控制器提供的不同信号的一个示例性定时简图。
[0218] 图18A解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，由图17的阵列控制器提供的不同信号的另一个示例性定时简图。
[0219] 图18B显示的流程图解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，处理和校正以高获取速率获得的阵列数据的一种示例性方法。
[0220] 图18C和18D解释了根据本公开内容的一个实施方案，显示给定阵列输出信号的像素-至-像素跃迁的示例性像素电压。
[0221] 图19-20解释了根据本公开内容的其它发明实施方案，chemFET传感器阵列的替代性CMOS IC芯片实现的方框图。
[0222] 图20A解释了根据本公开内容的另一个发明实施方案，图20所示的chemFET阵列的像素的芯片布局设计顶视图。
[0223] 图21-23解释了根据本公开内容的其它发明实施方案，chemFET传感器阵列的其它替代性CMOS IC芯片实现的方框图。
[0224] 图24解释了根据本公开内容的另一个发明实施方案，用n-通道chemFET和伴随的n-通道MOSFET执行的图9的像素设计。
[0225] 图25-27解释了根据本公开内容的其它发明实施方案，chemFET阵列的替代性像素设计和有关的列电路。
[0226] 图28A和28B是本文采用的微孔阵列的一部分的等长解释(isometricillustration)，其显示了圆孔和矩形孔，以辅助阵列结构的三维显影。
[0227] 图29是芯片布局的一个角(即，左下角)的顶视图的图解，其显示了在CMOS管芯上的单个ISFET传感器的阵列。
[0228] 图30解释了与图29所示的管芯部分相对应的，上述传感器阵列的每孔一个传感器(one-sensor-per-well)实施方案的(通常是铬)掩蔽物的一部分的布局的实例。
[0229] 图31是每孔4个传感器(4-sensors-per-well)实施方案的掩蔽物的对应布局。
[0230] 图32解释了第二种掩蔽物，其用于掩蔽在阵列周围的区域，以在基质上构筑围绕传感器的有效阵列的抵抗环或壁(或盆地，使用该术语的地质学含义)，如图33A所示。
[0231] 图33解释了得到的盆地。
[0232] 图33A解释了用于制备微孔阵列的三层PCM方法。
[0233] 图33B是具有蚀刻进底面中的“隆起物”特征的微孔的图解横截面。
[0235] 图33B-2图解了横截面中的微孔，所述微孔按照本文教导进行制备，且具有斜面，并显示比孔底直径相对更大的适当直径的珠子如何可以通过孔侧壁的阻碍而和孔底隔开。
[0236] 图33B-3是这种微孔的另一个图解，其中显示了不同直径的珠子，并指示在携带核酸的珠子(诸如携带DNA的珠子)下面的填充珠子的任选使用。
[0237] 图34-37用图解释了合适的实验装置的第一个实例，其合并了流体界面和传感器阵列，其中图35提供了穿过图34装置的沿着截面线35-35′的横截面，图36透视地放大了图35的一部分，且图37进一步放大了该结构的一部分，以使流体流动更可见。
[0238] 图38图解了具有蚀刻的光刻胶层的基质，开始形成某种结构的一个实例流动池。
[0239] 图39-41的简图是适用于制备与图38相一致的流动池的第一种结构的掩蔽物。
[0240] 图42-54(但不包括图42A-42L)和57-58是实例装置的部分等长的成对截面图和放大，显示了使用诸如塑料和PDMS等材料，将参比电极导入流动池和流动室中以及形成流动池和流动室的方式。
[0241] 图42A解释了非-矩形流动室前室(antechamber)(扩散段)的可能的横截面结构，所述前室用于促进进入流动池的层流，如以本文所示的排列使用；
[0242] 图42B-42F图解了统一流体流动的流动池结构的实例。
[0243] 图42F1图解了流动池的内顶挡板排列的一个实例，其中流体在芯片的一个角处引入，并在对角线角处退出，挡板排列促进希望的经过阵列的流体流动。
[0244] 图42F2-42F8包含一种示例性流动池部件以及用作参比电极的金属化表面的图解集合，所述流动池部件可以通过注射模塑来制备，且可以掺入挡板来促进流体流动，该图解集合包括固定在传感器阵列上面的传感器阵列包上的所述部件的图解，以形成在其上面的流动室。
[0245] 图42G和42H图解了流动池的替代性实施方案，其中将流体流动引入芯片组件的中央。
[0246] 图42I和42J是固定在芯片组件上的图42G和42H所示的流动池实施方案类型的横截面图解。
[0247] 图42K和42L图解了流动池，其中在芯片组件的角处引入流体。
[0248] 图42M图解了在诸如图42K和42L所示的装置中从芯片组件阵列的一个角向相对角的流体流动。
[0249] 图55和56是用于制备流体装置的双层玻璃(或塑料)排列的示意性的横截面视图，所述流体装置固定在用于本文教导的用途中的芯片上。
[0250] 图57和58是流体组件的示意实施方案。
[0251] 图59A-59C是用于形成流动池的2片注射模塑部件的2个实例片的图解。
[0253] 图61的简图解释了dNTP向合成的核酸链中的掺入，伴随无机焦磷酸(PPi)的释放。
[0254] 图61A和B是在珠沉积之后的微孔阵列的数据捕获图像。白色斑点是珠子。图61A是光学显微镜图像，且图61B是使用作为微孔阵列的基础的chemFET传感器捕获的图像。
[0255] 图62-70解释了装载进本发明的微流体阵列中的珠子。
[0256] 图71解释了一种示例性的测序方法。
[0257] 图72A-C提供了聚合酶测定(A)的简图，和不同聚合酶的延伸数据。
[0258] 图73提供了与低离子强度中的聚合酶亲和力有关的数据。
[0259] 图74A-C提供了与随时间而变化的聚合酶活性有关的数据。
具体实施方式
[0261] 下面是与发明方法和装置有关的不同概念和它们的实施方案的更详细的描述，所述方法和装置与用于分析物检测和/或测量的大规模chemFET阵列有关。应当理解，在上面介绍的和在下面更详细地讨论的不同概念，可以以多种方式中的任一种来实现，所以公开的概念不限于任何具体实现方式。主要为了解释目的提供具体实现和应用的实例。
[0262] 根据本公开内容的不同的发明实施方案至少部分地涉及基于半导体的/微流体杂合系统，其组合了微电子学的能力(power)和微流体系统的生物相容性。在下面的一些实施例中，为了解释目的，在CMOS技术中实现杂合系统的微电子学部分。但是，应当理解，公开内容无意在这方面受到限制，因为其它基于半导体的技术可以用于实现本文讨论的系统的微电子学部分的不同方面。
[0263] 本文公开的一个实施方案涉及化学敏感的场效应晶体管(chemFET)的大传感器阵列(例如，二维阵列)，其中所述阵列的单个chemFET传感器元件或“像素”构造成检测未操纵的样品中的分析物存在(或缺失)、分析物水平(或量)和/或分析物浓度，或作为在阵列附近发生的化学和/或生物过程(化学反应、细胞培养、神经活性、核酸测序过程等)的结果。下面更详细地讨论的不同实施方案所预见到的chemFET的实施例包括、但不限于：离子敏感的场效应晶体管(ISFET)和酶-敏感的场效应晶体管(EnFET)。在一个示例性实现中，将一个或多个微流体结构制造在chemFET传感器阵列的上面，以提供生物或化学反应的控制和/或限制，其中可以产生或消耗(视情况而定)目标分析物。例如，在一个实现中，所述微流体结构可以构造成一个或多个“孔”(例如，小反应室或“反应孔”)，其安置在阵列的一个或多个传感器上面，使得在其上面安置给定孔的一个或多个传感器检测和测量在给定孔中的分析物存在、水平和/或浓度。
[0264] 在另一个示例性实现中，本发明包括用于高通量测序的系统，所述系统包含反应室的至少一个二维阵列，其中每个反应室偶联至化学敏感的场效应晶体管(“chemFET”)，3
且每个反应室的体积不大于10μm(即，1pL)。优选地，每个反应室的体积不大于0.34pL，
2 2
更优选不大于0.096pL，或甚至0.012pL。反应室在顶部的横截面面积可以任选地是2、3、
2 2 2 2 2 2 2
4、5、6、7、8、9 或10 平方微米。优选地，所述阵列具有至少100、1,000、10,000、100,000，或1,000,000个反应室。反应室可以电容地与chemFET偶联，且优选地，电容地与chemFET偶联。
且每个反应室的体积不大于10μm(即，1pL)。优选地，每个反应室的体积不大于0.34pL，
2 2
更优选不大于0.096pL，或甚至0.012pL。反应室在顶部的横截面面积可以任选地是2、3、
2 2 2 2 2 2 2
4、5、6、7、8、9 或10 平方微米。优选地，所述阵列具有至少100、1,000、10,000、100,000，或1,000,000个反应室。反应室可以电容地与chemFET偶联，且优选地，电容地与chemFET偶联。
[0265] 在有些实施方案中，这样的chemFET阵列/微流体杂合结构可以用于分析含有核酸的目标溶液/物质。例如，这样的结构可以用于监测核酸的测序。可以进行核酸的测序，以测定核酸的部分或完整的核苷酸序列、检测核酸中单核苷酸多态性的存在和在某些情况下核酸中单核苷酸多态性的性质、确定哪个治疗方案会最有效地治疗具有特定病症的对象(这可以通过对象的基因组成来确定)、测定和对比2个或更多个状态的核酸表达图谱(例如，对比患病和正常组织的表达图谱，或对比未处理的组织和用药物、酶、辐射或化学治疗处理过的组织的表达图谱)、进行样品的单倍型分析(例如，对比在人对象中存在的2个等位基因中每一个的基因或基因变化)、进行样品的染色体组型分析(例如，分析细胞或诸如胚胎等组织的染色体组成，以检测总染色体异常或其它基因组异常)以及进行基因分型(例如，分析一个或多个遗传基因座，以确定例如载体状态和/或种-属关系)。
[0266] 本文所述的系统可以用于测序整个基因组的核酸或其任意部分。可以测序的基因组包括哺乳动物基因组，且优选人基因组。因而，在一个示例性的实施方案中，本发明包括测序基因组或其部分的方法，包括：将来自基因组或其部分的片段化核酸递送给用于高通量测序的系统，所述系统包含反应室的至少一个二维阵列，其中每个反应室偶联至化学敏感的场效应晶体管(“chemFET”)，且每个反应室的体积不大于1pL；并通过来自反应室的chemFET的信号来检测至少一个反应室中的测序反应。
[0267] 在一个替代性示例性实施方案中，所述方法包括：将来自基因组或其部分的片段化核酸递送给测序装置，所述装置包含反应室的二维阵列，其中每个反应室与有关的chemFET安置成感知关系；并通过来自有关的chemFET的信号，检测至少一个反应室中的测序反应。
[0268] 优选地，通过将第一个三磷酸脱氧核糖核苷酸(“dNTP”)递送至每个反应室，进行测序反应。优选地，所述递送步骤包含，将第一个dNTP基本上同时递送至每个反应室。在将第一个dNTP递送至反应室以后，通常将酶递送至反应室，以降解任何未使用的dNTP，随后洗涤以从反应室基本上去除所有酶。优选地，所述酶也降解PPi。洗涤也可以去除任何降解的dNTP或降解的PPi。
[0269] 要测序的核酸可以是天然或非天然存在的核酸，且优选天然存在的核酸。核酸可以从几种来源中的任一种得到，包括、但不限于：脱氧核糖核酸(“DNA”)(例如，信使DNA、互补的DNA或核DNA)、核糖核酸(“RNA”)(例如，微RNA、转移RNA、信使RNA或小干扰RNA)或肽。当来源是DNA时，所述DNA可以从含有DNA的任意体液或组织得到，包括、但不限于：血液、唾液、脑脊髓液(“CSF”)、皮肤、毛发、尿、粪便和粘液。要测序的核酸的起始量决定了最小样品需求。考虑到下述珠子尺寸、在单条链中具有平均450个碱基、每个碱基具有
325g/mol的平均分子量，我们具有下述的：
325g/mol的平均分子量，我们具有下述的：
[0270]珠子尺寸(um) DNA的飞克
0.2 0.124
0.3 0.279
0.7 1.52
1.05 3.42
2.8 24.3
5.9 108
0.2 0.124
0.3 0.279
0.7 1.52
1.05 3.42
2.8 24.3
5.9 108
[0271] 鉴于为用于阵列所预见到的珠子和微孔的数目，因而应当明白，从待测对象采取的样品只需要是3μg的量级。6 7
[0272] 使用上述方法，优选每小时测序至少10 个碱基对、更优选每小时测序至少10 个8 9
碱基对、更优选每小时测序至少10 个碱基对、更优选每小时测序至少10 个碱基对以及最
10
优选每小时测序至少10 个碱基对。因而，所述方法可以用于在约24小时内测序整个人基因组，更优选在约20小时内、更优选在约15小时内、更优选在约10小时内、更优选在约5小时内以及最优选在约1小时内。
碱基对、更优选每小时测序至少10 个碱基对、更优选每小时测序至少10 个碱基对以及最
10
优选每小时测序至少10 个碱基对。因而，所述方法可以用于在约24小时内测序整个人基因组，更优选在约20小时内、更优选在约15小时内、更优选在约10小时内、更优选在约5小时内以及最优选在约1小时内。
[0273] 本文所述的系统可以用于从约3μgDNA或更少测序生物体的整个基因组。在一个实施方案中，本发明包括测序生物体的整个基因组的方法，包括，将来自生物体的约3μgDNA或更少递送至化学敏感的场效应晶体管的阵列，并测定基因组序列。在另一个实施方案中，本发明包括这样的装置，其适合从约1ng DNA或更少测序整个人基因组，不需要使用光学或标记。典型地，所述装置包含chemFET的阵列和/或微流体反应室的阵列和/或与电介质材料偶联的半导体材料。
[0274] 上述测序可以在具有高达500μM、400μM或300μM的离子强度的反应混合物中进行。溶液的离子强度I是在溶液中存在的所有离子的浓度的函数。
[0275]
[0276] 其中cB是离子B的摩尔浓度(mol dm-3)，zB是该离子的电荷数，且总和是用溶液中+2 2+的所有离子来计算。Mg 或Mn 浓度可以是1000μM、500μM、200μM、100μM、50μM、10μM、
5μM或甚至1μM。
5μM或甚至1μM。
[0277] 可以使上述方法自动化，从而通过机器人技术实现测序反应。另外，可以将通过来自反应室的chemFET的信号而得到的测序信息提供给个人计算机、个人数字助理、蜂窝电话、视频游戏系统或电视，使得用户可以远程监测测序反应的进展。该过程解释在例如图71中。
[0278] 本文所述的系统也可以用于辅助鉴别和治疗疾病。例如，所述系统可以用于鉴别与特定疾病有关的序列，或用于鉴别与对特定活性成分的阳性响应有关的序列。
[0279] 在一个实施方案中，本发明包括用于鉴别与病症有关的序列的方法，包括：将来自多个具有病症的对象的核酸递送给包含反应室二维阵列的测序装置，其中每个反应室电容地与chemFET偶联；由来自所述chemFET的信号，测定核酸的序列；和鉴别来自多个对象的DNA之间的共有序列。优选地，所述对象是哺乳动物，且更优选人。优选地，所述病症是癌症、免疫抑制病症、神经病症或病毒感染。
[0280] 在另一个实施方案中，本发明包括用于鉴别与对特定活性剂的阳性响应有关的序列的方法，包括：使用一个或多个测序装置来测序DNA，所述DNA来自多个已经对活性剂表现出阳性响应的对象和来自多个对活性剂具有阴性响应的对象，其中每个测序装置包含chemFET的阵列；和鉴别在多个已经表现出阳性响应的对象或已经表现出在其它多个对象中不存在的阴性响应的对象的共有DNA序列。优选地，所述对象是哺乳动物，且更优选人。
[0281] 但是，应当理解，尽管本文公开的概念的一些例证性实施例聚焦于核酸加工，本发明预见到这些概念的更广泛应用，且无意限于这些实施例。
[0282] 图8一般地解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，包含大规模chemFET阵列的核酸加工系统1000。核酸加工系统的一个实施例是核酸测序系统。在下面的讨论中，为了作为ISFET进行解释的目的，描述了阵列的chemFET传感器，所述ISFET针对对静态和/或动态离子浓度的灵敏度进行构建，所述离子浓度包括但不限于氢离子浓度和/或在核酸加工中涉及的其它离子物质的浓度。但是，应当理解，本公开内容在这方面不受限制，且在本文讨论的其中采用ISFET作为例证实施例的任意实施方案中，其它类型的chemFET可以同样地用于替代性实施方案中，如下面进一步详细讨论的。同样地，应当理解，本发明的不同方面和实施方案可以采用ISFET作为传感器，但是检测除了氢离子以外的一个或多个离子物质。
[0283] 系统1000包括半导体/微流体杂合结构300，其包含ISFET传感器阵列100和微流体流动池200。在一个方面，流动池200可以包含许多孔(在图8中未显示)，所述孔安置在ISFET阵列100的对应传感器的上面。在另一个方面，将流动池200构建成便利一个或多个相同模板核酸的测序，所述模板核酸安置在流动池中，所述测序通过向流动池受控地且有序地进入(或引入)许多测序试剂272(例如，碱基dATP、dCTP、dGTP、dTTP(在本文2+
中属类地称作dNTP)、二价阳离子诸如但不限于Mg 、洗涤溶液等)来实现。
中属类地称作dNTP)、二价阳离子诸如但不限于Mg 、洗涤溶液等)来实现。
[0284] 如图8所示，测序试剂向流动池200的进入可以通过一个或多个阀门270和一个或多个泵274来实现，所述阀门和泵由计算机260控制。许多技术可以用于使不同的加工材料(即，溶液、样品、反应试剂、洗涤溶液等)进入(即，引入)这种流动池的孔。如图8所示，可以使包括碱基的试剂进入流动池(例如，通过计算机控制的阀门270和泵274)，它们从流动池扩散进孔中，或可以通过其它方式(诸如喷墨)将试剂加入流动池。在另一个实施例中，流动池200可以不含有任何孔，可以利用试剂的扩散性质来限制ISFET阵列100的各个传感器之间的串扰(cross-talk)。
[0285] 如本文将更详细地讨论的，根据本发明提供的测序方法的不同实施方案使用这样的珠子，其已经在它们的表面上连接多个相同的模板核酸拷贝。这种珠子在本文中一般地称作核酸“负载的”。优选地，每个反应孔仅包含单个珠子。核酸负载的珠子(它们可能是数十个、数百个、数千个或更多)首先进入流动池，然后单个珠子进入单个孔。珠子可以被动地或以其它方式进入孔。例如，珠子可以通过重力进入孔，不需要施加任何外力。珠子可以通过施加的外力进入孔，所述外力包括但不限于磁力或离心力。在有些实施方案中，如果施加外力，在与孔高度/深度平行(而不是与孔高度/深度横向)的方向施加外力，其目的是“捕获”尽可能多的珠子。优选地，不搅动所述孔(或孔阵列)，因为例如可以通过施加与孔高度/深度垂直的外力来实现。此外，在这样装载孔以后，对它们不施加会使珠子脱离孔的任何其它力。
[0286] 此外，如本文将讨论的，除了核酸负载的珠子以外，每个孔也可以包含多个更小的珠子，在本文中称作“填充珠子”。填充珠子可以由不与孔中存在的分析物、试剂、反应参数等相互作用或干扰的任意惰性物质组成。填充珠子可以放置在chemFET表面和核酸负载的珠子之间，在该情况下，它们可以在核酸负载的珠子之前引入孔中。或者，它们可以都放置在核酸负载的珠子周围，在该情况下，它们可以在核酸负载的珠子之前、期间和/或之后加入孔中。在其它实施方案中，大多数填充珠子可以放置在核酸负载的珠子上面，在该情况下，它们可以在核酸负载的珠子之后加入孔中。
[0287] 填充珠子可以起一种或多种不同的功能。例如，填充珠子的作用可以是，使核酸负载的珠子对孔的脱离最小化或完全避免，尤其是如果它们中的一部分放置在核酸负载的珠子上面。填充珠子的作用可以是，降低孔中溶液的一种或多种组分的扩散速率，所述组分包括但不限于PPi和未掺入的核苷酸。在有些实施方案中，所述填充珠子是顺磁珠子。填充珠子可从诸如Bangs Laboratories等来源商业得到。
[0288] 通过在反应室中包括增粘剂也可以影响扩散。这种试剂的一个实例是非核酸的聚合物(即，非核酸聚合物)。所述聚合物可以天然或非天然存在的，且它可以具有任意性质，只要它不干扰核苷酸掺入及其检测，除了减慢PPi、未掺入的核苷酸和/或其它反应副产物或试剂向反应室底面的扩散以外。合适的聚合物的一个实例是聚乙二醇(PEG)。其它实例包括PEA、葡聚糖、丙烯酰胺、纤维素(例如甲基纤维素)等。所述聚合物可以游离在溶液中，或它可以固定化(共价地或非共价地)在反应室的一个或多个侧壁上、捕获珠子上和/或可能存在的任意填充珠子。非共价连接可以通过生物素-抗生物素蛋白相互作用来实现。
[0289] 在其它测序实施方案中，替代采用捕获珠子，可以给孔包被一种或多种核酸，包括例如一对引物核酸，且可以将具有与引物核苷酸序列互补的接头核苷酸序列的模板核酸引入孔中。可用于固定化分析物或模板核酸的这些和其它试剂，可以提供给传感器阵列100、作为芯片包装的一部分的单个管芯、或孔(在即将加工样品之前)。包含溶胶的其它方法可以用于将诸如核酸等试剂固定化在ISFET阵列100的表面附近。
[0290] 如本文将更详细地讨论的，在本发明预见到的测序方法的一些方面，可以在放入孔中之前或之后扩增模板核酸。存在扩增核酸的各种方法。因而，在一个方面，在将模板核酸装载进流动池200的孔中之后，可以在孔中进行扩增，使得到的扩增产物变性，然后进行通过合成测序。扩增方法包括、但不限于，桥扩增、滚环扩增或使用等温或非等温扩增技术的其它策略。
[0291] 总之，可以以多种方式构建图8系统中的流动池200，以在ISFET阵列100附近提供一种或多种分析物(或一种或多种反应溶液)。例如，模板核酸可以直接连接或施加于传感器阵列100的一个或多个像素的适当附近，或在位于传感器阵列上面的支持材料(例如，一个或多个“珠子”)上。加工试剂(例如，诸如聚合酶等酶)也可以直接放置在传感器上，或在传感器附近的一种或多种固体支持物上。应当理解，所述装置可以没有孔或珠子地用于许多生物传感器用途，包括检测和/或测量至少一种传感器-可检测的产物(例如，离子浓度变化)。
[0292] 在图8的系统1000中，根据一个实施方案，ISFET传感器阵列100监测离子物质，且具体地，离子物质的水平/量和/或浓度的变化。在重要的实施方案中，所述物质是源自核酸合成或测序反应的那些。一种特别重要的离子物质是PPi，其作为核苷酸掺入的结果而释放。另一种重要的物质是，在合成或测序反应结束后，加入和保留在反应室中的过量核苷酸。这样的核苷酸在本文中称作“未掺入的核苷酸”。
[0293] 如本文将更详细地讨论的，本发明的不同实施方案可以涉及监测/测量技术，所述技术包含ISFET的静态和/或动态响应。在一个与核酸合成或测序反应期间核苷酸掺入的检测有关的实施方案中，检测/测量技术特别依赖于上面关于图2A讨论的ISFET的暂时或动态响应(离子-阶跃响应或“离子脉冲”输出)、检测与核酸合成或测序反应有关的不同离子物质的浓度变化。尽管提供了核酸合成或测序反应的具体实施例来解释ISFET的暂时或动态响应，应当理解，根据其它实施方案，下面讨论的ISFET的暂时或动态响应可以用于监测/感知除了核酸合成或测序反应的具体实施例以外的其它类型的化学和/或生物活性。
[0294] 在一个示例性实现中，除了现有研究工作预见到的分析物溶液中的逐步或基本上瞬时的pH变化以外，根据本发明某些实施方案的依赖于ISFET的动态响应的检测/测量技术，至少部分地基于在ISFET的分析物/钝化层界面附近的不同离子物质的差别扩散(例如，在ISFET上面的反应孔的底面处)。具体地，申请人已经认识到并理解，如果在分析物/钝化层界面附近的离子强度的变化构成的给定刺激(由于各个目标物质的适当扩散)的发生速率显著快于钝化层响应于浓度变化刺激而调节它的表面电荷密度的能力(例如，快于与钝化层表面有关的特征响应时间常数τ)，观察来自ISFET的离子脉冲输出不一定需要离子强度的逐步或基本上瞬时的变化。该原理不仅适用于DNA测序的实例，而且也适用于其它类型的化学和化学反应感知。
[0295] 为了本公开内容的目的，以足够快的时间尺度发生的ISFET对刺激(由分析物溶液的离子强度的任何显著变化构成)的脉冲响应，被称作“离子脉冲”，其中脉冲的波幅由上面的方程(17)来描述，且其中脉冲的宽度和形状(脉冲随时间的升高和衰减)涉及与离子物质有关的扩散参数，导致在分析物/钝化层界面处的离子强度变化和平衡反应动力学(如反映在一个或多个特征时间常数τ中，如上面关于方程(18)所讨论的)。在本文讨论的不同实施方案中，在ISFET输出信号中可以观察到在分析物/钝化层表面附近的离子物质浓度变化导致的一个或多个离子脉冲，如果这种浓度变化的发生速率快于钝化层响应于浓度变化刺激而调节它的表面电荷密度的能力(例如，在＜＜τ的时间t内发生离子强度变化)。另外，从前述内容可以理解，观察来自ISFET的离子脉冲输出，不需要离子强度的逐步或瞬时变化(例如，垂直于ISFET钝化层表面的高流速)。
[0296] 更具体地，再次参考方程(10)和(11)(假设Debye理论适用于相对更低的离子强度(例如，＜1摩尔/升)的情况(regime))，认为在离子强度变化后，ISFET重新平衡至相同的表面电势。这暗示，如果Debye筛选长度变化为λ’，表面电荷密度变化相反量，以保持表面电势恒定，即：
[0297]
[0298] 如上面关于方程(18)所讨论的，可以将表面电荷密度σ大致描述为时间的指数函数，具有时间常数τ。因此，如果存在随时间变化的Debye筛选长度λ(t)(由于分析物溶液中随时间变化的离子强度I(t))(参见方程(12)和(13))，表面电荷密度服从微分方程：
[0299]
[0300] 从方程(21)可以看出，随着Debye筛选长度随时间变化，表面电荷密度继续尝试恢复产生最初表面电势的值。从方程(10)和(11)，随时间而变化的表面电势可以表示为Debye筛选长度，为：
[0301]
[0302] 引入新变量g(t)，其包括σ(t)，且参考方程(12)，方程(22)可以改写为随时间变化的离子强度I(t)，为：
[0303]
[0304] 从它可以得到：
[0305]
[0306] 方程(23)和(24)表明，ISFET输出信号中离子脉冲的产生和总特性依赖于与分析物/钝化层界面的表面动力学有关的时间常数τ和随时间I(t)而变化的离子强度，后者由反应孔中各个离子物质的浓度给出，因为它们随时间而变化(由于反应和扩散)。如上所述，从前述内容，申请人已经认识到并理解，只要I(t)的变化速率快于表面电荷密度的重新平衡的能力(通过时间常数τ来表征)，就可以观察到离子脉冲输出，其中脉冲的开始特性主要由I(t)决定，且脉冲的衰减特性主要由时间常数τ决定。另外，前述分析通常适用于在分析物溶液中存在的基本上任意离子物质，且因此，ISFET的暂时或动态响应可以用于监测多种化学和/或生物活性。
[0307] 关于核酸合成或测序反应的具体实施例，在一个实施方案中，阵列100的一种示例性的ISFET可以用于提供包括一个或多个离子脉冲的输出信号，其响应于合成或测序试剂向对应的反应孔中的添加，所述反应孔与ISFET有关，且含有预先装载的模板。参考图8A和8B，在根据该实施方案的一种示例性方法中，将已知的核苷酸(即，dNTP，其中N表示A、C、G或T之一)引入具有适当扩散参数(下面进一步讨论)的反应孔中，从而开始合成或测序反应，在ISFET输出信号中检测出的离子脉冲的数目和连续脉冲之间的时间间隔(如果产生多个脉冲)会提供关于核苷酸掺入的有价值的信息。
[0308] 更具体地，在根据用于检测核苷酸掺入的一个实施方案的方法中，如果引入反应孔中的一种或多种核苷酸在它们引入之后掺入，生成PPi。图8A的图显示了在一个示例性实现中，在核酸合成或测序反应过程中，在ISFET分析物/钝化层界面附近的分析物中的不同离子物质的浓度(μM)随时间而变化。在图8A所示的具体实施例中，曲线41指示随时间而变化的PPi浓度，且曲线43指示随时间(秒)而变化的dNTP浓度。使用与PPi的最初浓度增加基本上对应的时间t＝0秒，使用所述目标物质的具体扩散参数，可以观察到，在大约15秒＜t＜17.5秒，PPi的浓度突然降低，且存在dNTP的浓度的对应增加。为了讨论的目的，给定核苷酸类型dNTP在进入反应孔后的各自掺入，被称作“掺入事件”。在图
8A的实施例中，如下面进一步讨论的，多个掺入事件发生在时间段0＜t＜17.5，其中PPi浓度升高。
8A的实施例中，如下面进一步讨论的，多个掺入事件发生在时间段0＜t＜17.5，其中PPi浓度升高。
[0309] 图8B的图解释了与图8A所示的那些类似的示例性核酸测序/合成反应的随时间而变化的ISFET输出电压的多条曲线。参考上面的表1和方程(3)、(4)、(5)和(16)，可以理解，例如，基于二氧化硅或氮化硅的钝化层，和大约8-9的分析物pH，预见到大约-200mV量级的“基线”ISFET输出电压，如图8B所示。在给出涉及的离子物质的适当扩散参数的情况下，由于一个或多个掺入事件在ISFET的分析物/钝化层界面附近最初产生的PPi构成足够快的离子强度变化刺激I(t)，由此造成表面电势Ψ0根据上述方程(23)的变化和由上面方程(3)、(4)和(5)给出的对应的ISFET输出信号的变化，导致ISFET输出信号的离子脉冲。换而言之，不论由于一个或多个掺入事件而产生PPi的持续时间，在构成足够快的刺激的最初PPi产生之后，分析物/钝化层界面恢复某种稳态平衡，由此结束对最初刺激的暂时响应，并产生ISFET信号脉冲，在图8B中解释了其实施例。从图8B可以一般地看出，在一个示例性实现中，给定离子脉冲的衰减特性的时间常数τ可以是大约2至2.5秒的量级。但是，应当理解，本发明的不同实施方案不限于该例证实施例，因为时间常数τ可以至少部分地依赖于给定钝化层的依赖于材料的性质以及分析物溶液的主体pH(例如，如上面关于方程(19)所讨论的)。
[0310] 在图8B中，给出了随时间而变化的ISFET输出信号的许多不同的曲线，其中图例采用标志法Npoly＝x(x＝0，1，2，....7)来指示产生指出的输出信号的掺入事件的数目。与一个或多个掺入事件(Npoly≠0)相对应的输出信号的所有曲线包括2个脉冲，它们各自的峰被一些时间间隔隔开。例如，被时间间隔47隔开的包括脉冲45和49的输出信号的曲线与图8A所示的浓度变化相对应，且用图例标志法Npoly＝7来标记，表明在该示例性实现中的时间间隔47代表7个掺入事件。
[0311] 更具体地，在检测核苷酸掺入的一种示例性方法中，如果在一个或多个掺入事件后产生PPi，在某个点掺入停止，PPi不再产生，且未掺入的核苷酸(dNTP)的浓度增加，如图8A的曲线43所示。如果扩散参数使得在PPi引起的离子脉冲结束后发生dNTP浓度的增加(即，在最初PPi刺激后，分析物/钝化层界面已经达到稳态后)，未掺入的核苷酸的这种浓度增加构成第二个离子刺激，其在ISFET输出信号中产生第二个离子脉冲；另外，使用与7个掺入事件相对应的图8A所示的浓度变化例证实施例，图8B中的曲线Npoly＝7包括与最初PPi产生相对应的第一个离子脉冲45，和掺入事件停止后与增加的dNTP浓度相对应的第二个脉冲49，它们各自的峰被时间间隔47隔开。
[0312] 更一般地，申请人已经认识到并理解，对于图8B中的ISFET输出信号中的任一个(包括被某个时间间隔隔开的多个脉冲)，在第一个离子脉冲(由于PPi产生)和第二个离子脉冲(由于未掺入的核苷酸的升高的浓度)之间的时间间隔至少部分地与掺入事件的数目有关。如下面进一步讨论的，该时间间隔也可能至少部分地与其它参数有关，所述参数包括、但不限于：反应孔的尺寸、孔内的填充密度、核苷酸测序或合成反应的动力学、涉及的物质的扩散系数、核苷酸浓度和DNA的起始量。除了与图8B中图例Npoly＝7有关的输出信号以外，为了进一步解释目的，在图8B中标记了许多其它的脉冲；具体地，脉冲53构成的输出信号中的2个脉冲中的第二个，标记为Npoly＝3(即，在脉冲45和脉冲53之间的时间间隔对应3个掺入事件)，且脉冲55构成的输出信号中的2个脉冲中的第二个，标记为Npoly＝5(即，在脉冲45和脉冲55之间的时间间隔对应5个掺入事件)。
[0313] 在前述用于检测核苷酸掺入的方法的另一个方面，如果在将给定核苷酸dNTP引入孔中后没有掺入核苷酸，那么没有PPi产生，并且对与孔结合的ISFET的第一个且唯一的离子刺激是dNTP浓度的升高(随着它进入孔)。结果，仅产生单个离子脉冲，再假设dNTP的适当扩散参数。该情形通过图8B中标记为Npoly＝0的输出信号来解释，其在输出信号中仅包括单个脉冲51。
[0314] 因此，上述方法提供了核酸合成或测序反应的下述显著表征：
[0315] 1)如果在ISFET输出信号中仅存在单个离子脉冲，那么不存在引入反应孔中的核苷酸的掺入(即，仅dNTP刺激)；
[0316] 2)如果在ISFET输出信号中存在2个连续的离子脉冲，那么存在引入反应孔中的核苷酸的掺入(即，在PPi刺激之后是dNTP刺激)；和
[0317] 3)2个连续离子脉冲之间的时间间隔随掺入事件的数目而变化。
[0318] 在根据上面关于核苷酸掺入检测所讨论的不同概念的方法的不同示例性实现中，应当理解，仅仅测定在ISFET输出信号中是否存在一个或2个脉冲，就会提供关于核苷酸掺入的有用信息。因此，并非根据本发明的所有方法都需要分析多个脉冲(如果存在的话)之间的时间间隔。但是，另外，该时间间隔会提供关于掺入事件数目的额外的有用信息，且实际上，一些示例性实现不仅分析在ISFET输出信号中存在的脉冲的数目，而且分析脉冲之间的定时，在某些情况下考虑产生一个或多个离子脉冲的各个物质所涉及的不同扩散参数。
[0319] 关于上面讨论的核苷酸掺入检测的方法，且再次参考上面的方程(17)，申请人已经认识到并理解，可以改进和/或优化核酸合成或测序反应的不同参数，以增加与ISFET输出信号中的给定离子脉冲有关的信噪比(SNR)(例如，增加离子脉冲的波幅ΔΨ0)。
[0320] 首先，从方程(17)可以理解，更高的最初平衡表面电势Ψ1(例如，在将给定核苷酸dNTP引入反应孔之前，在有洗涤缓冲液存在下的稳态表面电势)通常导致离子脉冲的更高的波幅ΔΨ0。在一个方面，再次参考方程(16)，申请人已经理解，通过选择具有明显不同于的ISFET钝化层的pHpzc的pH的洗涤缓冲液(即，在钝化层表面处产生零电荷密度的主体分析物pH)，来促进更高的Ψ1。因此，在不同的实现中，可以基于钝化层采用的材料的类型，适当地选择洗涤缓冲液。
[0321] 从方程(15)，申请人也已经理解，ISFET的相对高的pH灵敏度(ΔΨ0/ΔpH)也可以促成更高的Ψ1；以此方式，如上面关于方程(15)所讨论的，具有大固有缓冲容量βint的钝化层材料可能是合乎希望的，因为在方程(15)中给出的无因次的灵敏度因子会被大βint提高。但是，在这方面也应当理解，在根据上述具体实施方案的核苷酸掺入检测方法中，不一定需要对pH的高灵敏度，因为该方法主要基于PPi和dNTP浓度变化的检测，而不是基于氢离子浓度本身的测量。该情形适用于本文讨论的不同ISFET阵列优化技术的上述方法，它们基于更有限的pH测量范围和减少的线性要求的考虑(例如，考虑到MOSFET主体效应)。当然，根据本文讨论的本发明其它实施方案的方法实际上可能依赖于氢离子浓度和浓度变化作为反应指示指标。在任意情况下，如上所述，申请人已经理解，ISFET的相对高的pH灵敏度，甚至超出明显有限的pH范围，在某些情况下可能促进离子脉冲的波幅ΔΨ0增加，并因此促进ISFET输出信号的SNR增加。
[0322] 另外，申请人已经从方程(17)理解，使最初双层电容Cdl，1减少或最小化(由于分析物溶液的最初离子强度)(即，源自洗涤缓冲液，在引入dNTP之前)，和/或使后续双层电容Cdl，2增加或最大化(由浓度变化刺激产生)(即，PPi产生或dNTP增加)，也会导致离子脉冲的更高波幅ΔΨ0。因此，在不同的实现中，可以适当地选择低离子强度缓冲液，以促进离子脉冲的波幅ΔΨ0增加，并由此促进ISFET输出信号的SNR增加。
[0323] 关于时间分辨率，如上面提及的，脉冲形状的某个方面以及任意2个脉冲之间的时间间隔随时间和在ISFET的分析物/钝化层界面附近产生不同目标离子物质的速率而变化。在这些方面的重要参数的实例包括、但不限于：使分析物溶液的不同组分(例如，不同试剂)进入反应孔的流速，不同物质各自的和/或总的浓度，在孔中存在的模板材料的量，在孔中可能发生的核酸测序或合成反应的动力学，和影响反应孔中物质的扩散的不同因素(例如，不同物质的扩散系数，反应孔的几何形状/尺寸，填充珠子的存在和尺寸，分析物溶液中的影响密度的添加剂)。下面更详细地讨论了通常与ISFET输出信号的一个或多个离子脉冲的时间分辨率有关的参数。
[0324] 如上所述，ISFET可以用于测量稳态pH值，因为在某些实施方案中，pH变化与掺入新合成的核酸链中的核苷酸的数目成比例。在下面更详细地讨论的其它实施方案中，可以针对对其它分析物的灵敏度，特别地构建FET传感器阵列，所述其它分析物可以提供关于目标化学反应的相关信息。这样的改进或结构的一个实例是使用分析物-特异性的受体来结合目标分析物，如本文更详细讨论的。
[0325] 通过阵列控制器250(也在计算机260的操作下)，可以控制ISFET阵列，从而获取与分析物检测和/或测量有关的数据(例如，阵列的各个ISFET的输出信号)，且收集的数据可以由计算机260处理，以产生与模板核酸的加工(包括测序)有关的有意义信息。
[0326] 关于图8所示的系统1000的ISFET阵列100，在一个实施方案中，实现阵列100，作为使用标准的CMOS工艺(例如，0.35微米工艺、0.18微米工艺)设计和制造的集成电路，其包含监测/测量一种或多种分析物和/或反应所需的所有传感器和电子器件。再次参考图1，要与ISFET阵列100一起使用的一个或多个参比电极76可以放置在流动池200中(例如，安置在流动池的“未使用的”孔中)，或以其它方式暴露于参照物(例如，一种或多种测序试剂172)，以建立基线，与该基线对比阵列100的各个ISFET附近的分析物浓度的变化。参比电极76可以电偶联至阵列100、阵列控制器250或直接电偶联至计算机260，以促进基于从阵列100得到的电压信号的分析物测量；在某些实现中，参比电极可以偶联至电地线或其它预定电势，或可以相对于地测量参比电极电压，以建立ISFET输出信号测量的电参照，如下面进一步讨论的。
[0327] ISFET阵列100不限于任何具体尺寸，因为按照本文公开的概念，可以为不同的化学/生物分析目的，制造和采用包括但不限于少至2-256个像素(例如，在二维实现中的16x 16像素)或多至54兆像素(例如，在二维实现中的7400x 7400像素)或甚至更大的一维或二维阵列。在图8所示的示例系统的一个实施方案中，可以针对对PPi、未掺入的核苷酸、氢离子等的灵敏度，构建阵列的单个ISFET传感器；但是，也应当理解，本公开内容在这方面不受限制，因为可以针对对用于多种用途的其它类型的离子浓度的灵敏度，特别构建ISFET传感器阵列的单个传感器(例如，对诸如钠、银、铁、溴、碘、钙和硝酸盐等其它离子敏感的材料是已知的)。
[0328] 更一般地，可以针对对多种分析物中的任意一种或多种的灵敏度，构建根据本公开内容的不同实施方案的chemFET阵列。在一个实施方案中，可以针对对一种或多种分析物和/或一个或多个结合事件的灵敏度，特别地构建阵列的一个或多个chemFET，且在其它实施方案中，可以针对对不同分析物的灵敏度，构建给定阵列的不同chemFET。例如，在一个实施方案中，阵列的一个或多个传感器(像素)可以包括构建成对第一种分析物敏感的第一类chemFET，且阵列的一个或多个其它传感器可以包括构建成对不同于第一种分析物的第二种分析物敏感的第二类chemFET。在一个示例性实现中，第一种和第二种分析物都可以指示特定反应，例如在通过合成测序的方法中的核苷酸掺入。当然，应当理解，超过2种不同类型的chemFET可以用于任意给定的阵列中，以检测和/或测量不同类型的分析物和/或其它反应。一般而言，应当理解，在本文讨论的传感器阵列的任意实施方案中，给出的传感器阵列可以是“同类的”，且包括基本上类似或相同类型的chemFET，以检测和/或测量相同类型的分析物(例如，pH或其它离子浓度)，或传感器阵列可以是“异类的”，且包括不同类型的chemFET，以检测和/或测量不同的分析物。为了讨论简单，下面又在传感器阵列的不同实施方案中讨论了ISFET的实施例，但是本公开内容在这方面不受限制，且在下面更详细地讨论了分析物灵敏度的几个其它选项(例如，关于图11A)。
[0329] 针对对多种分析物中的任意一种或多种的灵敏度构建的chemFET阵列，可以安置在电子芯片中，且每个芯片可以构造成执行一个或多个不同的生物反应。电子芯片可以连接至上述系统的一部分上，其借助于针读出阵列输出，所述针的编码方式使得所述针向该系统传递关于阵列特征和/或要在特定芯片上进行哪类生物反应的信息。
[0330] 在一个实施方案中，本发明包括为在其上面进行生物反应而构建的电子芯片，其包含一个或多个针，所述针用于向电路递送信息，所述电路鉴别芯片的特征和/或要在芯片上进行的反应的类型。它们可以包括、但不限于：短核苷酸多态性检测、短串联重复检测(short tandem repeat detection)或测序。
[0331] 在另一个实施方案中，本发明包括适合在芯片上执行超过一个生物反应的系统，其包含：适合接收芯片的芯片接收模块；和用于检测来自电子芯片的信息的接收器，其中所述信息确定要在芯片上进行的生物反应。典型地，所述系统另外包含一种或多种试剂来执行选择的生物反应。
[0332] 在另一个实施方案中，本发明包括用于测序聚合物模板的装置，所述装置包含：至少一个集成电路，其构造成传送关于下述的信息：反应室的空间位置、加入空间位置中的单体的类型、完成试剂(包含多个具有延伸聚合物的单体)的反应所需的时间。
[0333] 在基于0.35微米CMOS加工技术(或能实现更小的特征尺寸的CMOS加工技术)的示例性实现中，ISFET阵列100的每个像素可以包括ISFET和伴随的实现/选择组分，且
2
可以在阵列表面上占据大约10微米x10微米(即，100微米 )或更小的面积；换而言之，可以实现具有10微米或更小量级的间距(像素中心-至-像素中心的间距)的阵列。使用
0.35微米CMOS加工技术的10微米或更小量级的阵列间距，相对于以前的制造ISFET阵列的尝试(其产生了至少12微米或更大的量级的像素尺寸)，在尺寸缩小方面构成重大改进。
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可以在阵列表面上占据大约10微米x10微米(即，100微米 )或更小的面积；换而言之，可以实现具有10微米或更小量级的间距(像素中心-至-像素中心的间距)的阵列。使用
0.35微米CMOS加工技术的10微米或更小量级的阵列间距，相对于以前的制造ISFET阵列的尝试(其产生了至少12微米或更大的量级的像素尺寸)，在尺寸缩小方面构成重大改进。
[0334] 更具体地，在下面进一步讨论的基于本文公开的发明概念的某些实施方案中，大约九(9)微米的阵列间距允许将包括超过256,000个像素(例如，512x 512阵列)以及有关的行和列选择和偏压/读出电子器件的ISFET阵列制造在7毫米x 7毫米半导体管芯上，并允许将包括超过400万像素(例如，产生超过4兆-像素的2048x 2048阵列)的类似的传感器阵列制造在21毫米x 21毫米管芯上。在其它实施例中，大约5微米的阵列间距允许将包括大约1.55兆-像素(例如，1348x1152阵列)和有关电子器件的ISFET阵列制造在9毫米x 9毫米管芯上，并允许将包括超过14兆-像素和有关电子器件的ISFET传感器阵列制造在22毫米x 20毫米管芯上。在其它实现中，使用其中特征尺寸可能小于0.35微米的CMOS制造工艺(例如，0.18微米CMOS加工技术)，可以制造间距明显小于5微米的
2
ISFET传感器阵列(例如，2.6微米的阵列间距，或小于8或9微米 的像素面积)，提供明显密集的ISFET阵列。当然，应当理解，大于10微米的像素尺寸(例如，在大约20、50、100微米或更大的量级)，也可以在根据本公开内容的chemFET阵列的不同实施方案中实现。
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ISFET传感器阵列(例如，2.6微米的阵列间距，或小于8或9微米 的像素面积)，提供明显密集的ISFET阵列。当然，应当理解，大于10微米的像素尺寸(例如，在大约20、50、100微米或更大的量级)，也可以在根据本公开内容的chemFET阵列的不同实施方案中实现。
[0335] 本领域技术人员会理解，小型化测序反应的能力会减少大基因组(诸如人基因组)的测序所涉及的时间、成本和劳动。
[0336] 在图8所示系统的其它方面，一个或多个阵列控制器250可以用于操作ISFET阵列100(例如，选择/实现阵列的各个像素，以获得表示分析物测量的输出信号)。在不同的实现中，构成一个或多个阵列控制器的一个或多个组件可以与阵列本身的像素元件一起实现，在相同的集成电路(IC)芯片上作为阵列，但是在IC芯片的不同部分中或在芯片外(off-chip)。与阵列控制一起，ISFET输出信号的模拟-至-数字转换可以通过电路来实现，所述电路在与ISFET阵列相同的集成电路芯片上实现，但是位于传感器阵列区域之外(使模拟-至-数字转换电路位于传感器阵列区域之外，会允许更小的间距并因此允许更大数目的传感器以及减少的噪音)。在下面进一步讨论的不同示例性实现中，模拟-至-数字转换可以是4-位、8-位、12-位、16-位或其它位分辨率，这取决于需要的信号动态范围。
[0337] 如本文使用的，阵列是元件(诸如传感器或孔)的平面排列。阵列可以是一维或二维的。一维阵列是这样的阵列，其具有在第一维的一列(或行)元件和在第二维的多个列(或行)。一维阵列的实例是1x 5阵列。二维阵列是这样的阵列，其具有在第一维和第二维的多个列(或行)。在第一维和第二维的列(或行)的数目可以相同或不同。二维阵列的实例是5x 10阵列。
[0338] 已经提供了一种示例性系统1000的chemFET(例如，ISFET)阵列100在测量一种或多种分析物中的作用的一般概述，下面是根据本公开内容的不同发明实施方案的示例性chemFET阵列的更详细描述，所述阵列可以用于多种用途。另外，为了解释目的，下面讨论了根据本公开内容的chemFET阵列，其中使用ISFET阵列的具体实施例，但是其它类型的chemFET可以用于替代实施方案中。另外，还是为了解释目的，在核酸测序应用的背景下讨论了chemFET阵列，但是，本发明不限于此，而是预见到本文所述的chemFET阵列的多种用途。
[0339] 如上所述，本文公开的不同发明实施方案特别地改进了在上面关于图1-7所讨论的Milgrew等人的ISFET阵列设计以及其它现有ISFET阵列设计，从而显著减小了像素尺寸和阵列间距，并由此增加了给定半导体管芯尺寸的ISFET阵列的像素数目(即，增加像素密度)。在某些实现中，在实现像素密度增加的同时，增加了输出信号的信噪比(SNR)(所述输出信号与一种或多种分析物的相关各种测量相对应)和可以从阵列读出这种输出信号的速度。具体地，申请人已经认识到并理解，通过放松对ISFET线性的要求和聚焦于更有限的信号输出/测量范围(例如，与大约7-9或更小的pH范围(而不是1-14)相对应的信号输出，以及不一定与样品中的pH变化明显相关的输出信号)，可以显著降低单个像素复杂性和尺寸，由此促进非常大规模密集的ISFET阵列的实现。
[0340] 为此目的，图9解释了根据本公开内容的一个发明实施方案的ISFET阵列100的一列102j，其中ISFET像素设计被略微简化，以实现小像素尺寸。列102j包括n个像素，其中的第一个和最后一个在图9中显示为像素1051和105n。如下面关于图13进一步讨论的，基于图9所示列设计的完整二维ISFET阵列100包括m个这样的列102j(j＝1，2，3，....m)，其中像素的连续列通常肩并肩地排列。当然，ISFET可以以行-列网格以外的方式进行排列，诸如以蜂巢模式。
[0341] 在图9所示的实施方案的一个方面，列102j的每个像素1051至105n仅包括3个组件，即ISFET 150(也标记为Q1)和2个MOSFET开关Q2和Q3。MOSFET开关Q2和Q3都对n行选择信号( 至 ，逻辑低活跃的)之一做出响应，从而实现或选择列102j
的给定像素。使用像素1051作为一个实例(其适用于该列中的所有像素)，在通过线1181接收对应的行选择信号后，晶体管开关Q3通过线1121将可控制的电流源106j偶联至ISFET
150的源。在接收对应的行选择信号后，晶体管开关Q2通过线1141将ISFET 150的源偶联至列偏压/读出电路110j。ISFET 150的排出装置通过线1161直接偶联至偏压/读出电路
110j。因而，操作像素1051的3个组分，每个像素只需要4根信号线，即线1121、1141、1161和1181。在m列的阵列中，给定行选择信号同时施用于每个列的一个像素(例如，在各个列的相同位置)。
的给定像素。使用像素1051作为一个实例(其适用于该列中的所有像素)，在通过线1181接收对应的行选择信号后，晶体管开关Q3通过线1121将可控制的电流源106j偶联至ISFET
150的源。在接收对应的行选择信号后，晶体管开关Q2通过线1141将ISFET 150的源偶联至列偏压/读出电路110j。ISFET 150的排出装置通过线1161直接偶联至偏压/读出电路
110j。因而，操作像素1051的3个组分，每个像素只需要4根信号线，即线1121、1141、1161和1181。在m列的阵列中，给定行选择信号同时施用于每个列的一个像素(例如，在各个列的相同位置)。
[0342] 如图9所示，根据一个实施方案的列102j的设计基于与上面关于图3所示的Milgrew等人的列设计所讨论的那些类似的一般原理。具体地，用恒定排出电流IDj和恒定排出-至-源电压VDSj构建每个像素的ISFET(当实现时)，以从根据上面方程(3)实现的像素得到输出信号VSj。为此目的，列102j包括可控制的电流源106j，其偶联至模拟电路正供给电压VDDA，并对该列的所有像素共有的偏压电压VB1做出响应，以将恒定排出电流IDj提供给实现的像素的ISFET。在一个方面，电流源106j作为电流镜像来实现，所述电流镜像包括2个长-通道长度和高输出阻抗MOSFET。该列也包括偏压/读出电路110j，它也被该列的所有像素共有，以将恒定排出-至-源电压提供给实现的像素的ISFET。偏压/读出电路110j基于开尔文电桥结构，且包括2个运算放大器107A(A1)和107B(A2)，它们构建成缓冲放大器，并偶联至模拟电路正供给电压VDDA和模拟供给电压地线VSSA。偏压/读出电路也包括可控制的电流吸收器108j(类似于电流源106j)，其偶联至模拟地线VSSA，并对偏压电压VB2和二极管-连接的MOSFET Q6做出响应。串联地设置/控制偏压电压VB1和VB2，以提供补充源和汇集电流(sink current)。电流吸收器108j吸收电流引起的跨二极管-连接的MOSFET Q6形成的电压，被运算放大器递送通过实现的像素的ISFET的排出装置和源，作为恒定排出装置-源电压VDSj。
[0343] 通过在图9的偏压/读出电路110j中采用二极管-连接的MOSFET Q6，而不是图3所示的Milgrew等人的设计中所示的电阻器RSDj，在CMOS制造工艺中提供了重要的优点；
具体地，可以以通常在±20％量级的错误容许量制造匹配的电阻器，而在CMOS制造工艺中的MOSFET匹配是在±1％或更好的量级。负责提供恒定ISFET排出-至-源电压VDSj的组分在列之间可以匹配的程度，显著影响列之间的测量准确度(例如，偏移距)。因而，采用MOSFET Q6(而不是电阻器)会略微减轻列之间的测量偏移距。此外，鉴于电阻器和ISFET的热漂移特征可能略微不同，MOSFET和ISFET的热漂移特征是基本上类似的，或实际上相同；因此，MOSFET Q6中的任意热漂移实际上会消除来自ISFET Q1的任意热漂移，导致在阵列温度变化的情况下更大的测量稳定性。
具体地，可以以通常在±20％量级的错误容许量制造匹配的电阻器，而在CMOS制造工艺中的MOSFET匹配是在±1％或更好的量级。负责提供恒定ISFET排出-至-源电压VDSj的组分在列之间可以匹配的程度，显著影响列之间的测量准确度(例如，偏移距)。因而，采用MOSFET Q6(而不是电阻器)会略微减轻列之间的测量偏移距。此外，鉴于电阻器和ISFET的热漂移特征可能略微不同，MOSFET和ISFET的热漂移特征是基本上类似的，或实际上相同；因此，MOSFET Q6中的任意热漂移实际上会消除来自ISFET Q1的任意热漂移，导致在阵列温度变化的情况下更大的测量稳定性。
[0344] 在图9中，列偏压/读出电路110j也包括样品/保持和缓冲电路，以提供来自该列的输出信号VCOLj。具体地，在通过每个像素中的晶体管Q2和Q3实现或选择像素1051至105n之一后，放大器107A(A1)的输出(即，缓冲的VSj)通过开关(例如，传输门)的操作被储存在列取样和保持电容器Csh上，所述开关响应于列取样和保持信号COL SH。适用于取样和保持电容器的电容的实例包括、但不限于：从大约500fF至2pF的范围。取样的电压通过列输出缓冲放大器111j(BUF)进行缓冲，并提供为列输出信号VCOLj。也如图9所示，通过响应于控制信号CAL的开关，可以将参照电压VREF施加于缓冲放大器111j，以促进由缓冲放大器111j导致的列之间不均匀性的表征，并从而允许读出后的数据校正。
[0345] 图9A解释了偏压/读出电路110j的放大器107A之一的一种示例性电路简图(同样地实现放大器107B)，且图9B是放大器107A和107B的放大器偏压相对于带宽的图。如图9A所示，放大器107A采用基于9个MOSFET(M1至M9)的多电流镜像排列，且被构建成统一增益缓冲器(unity gain buffer)，其中放大器的输入和输出的一般性(generality)分别被标记为IN+和VOUT。偏压电压VB4(表示对应的偏压电流)控制放大器的跨阻抗，并用作带宽控制(即，随着电流增加，带宽增加)。再次参考图9，由于取样和保持电容器Csh，当取样和保持开关关闭时，放大器107A的输出基本上驱动滤光片。因此，为了实现略微高的数据速率，可以调节偏压电压VB4，以提供更高的偏压电流和增加的放大器带宽。从图9B可以看出，在一些示例性实现中，可以实现至少40MHz和明显更大的放大器带宽。在某些实现中，高达100MHz的放大器带宽可能适合促进高数据获取速率和相对更低的像素样品或“驻留”时间(例如，在10至20微秒的量级)。
[0346] 在图9所示的实施方案的另一个方面，不象图3所示的Milgrew等人的像素设计，像素1051至105n不包括任意传输门或需要n-通道和p-通道FET组件的其它装置；具体地，该实施方案的像素1051至105n仅包括相同类型(即，仅n-通道或仅p-通道)的FET装置。为了解释目的，在图9中解释的像素1051和105n显示仅包含p-通道组件，即，2个p-通道MOSFETQ2和Q3和一个p-通道ISFET 150。通过不采用传输门来将ISFET的源偶联至偏压/读出电路110j，可以牺牲ISFET输出信号(即，ISFET源电压VS)的一些动态范围。但是，申请人已经认识到并理解，通过潜在地放弃一些输出信号动态范围(并由此潜在地限制给定静态和/或动态化学性质(诸如pH或其它离子物质的浓度变化)的测量范围)，可以消除对每个像素中不同类型的FET装置(n-通道和p-通道)的要求，且可以减少像素组分数。如下面关于图10-12进一步讨论的，这会显著促进像素尺寸缩小。因而，在一个方面，在减少的动态范围和更小的像素尺寸之间存在有益折中。
[0347] 在图9所示实施方案的另一个方面，不象Milgrew等人的像素设计，每个像素1051至105n的ISFET 150不具有连接到它的源上的它的主体连接(即，不存在偶联主体连接和ISFET的源的电导体，所以它们在运行中被迫处于相同电势)。相反，阵列的所有ISFET的主体连接都彼此连接，并连接至主体偏压电压VBODY。尽管在图9中没有明确地显示，MOSFET Q2和Q3的主体连接同样没有连接到它们各自的源，而是连接至主体偏压电压VBODY。在基于具有所有p-通道组件的像素的一个示例性实现中，将主体偏压电压VBODY偶联至阵列可利用的最高压电势(例如，VDDA)，如下面关于图17进一步讨论的。
[0348] 通过不将每个ISFET的主体连接连通它的源，一些非零的源-至-主体电压VSB的可能性可能产生如上面关于图1所讨论的“主体效应”，其根据非线性关系影响ISFET的阈值电压VTH(且因而，根据方程(3)、(4)和(5)可以影响分析物活性的检测和/或测量，该分析物活性导致在分析物/钝化层界面处的表面电势变化)。但是，申请人已经认识到并理解，通过聚焦于减少的ISFET输出信号动态范围，可能从非零的源-至-主体电压在ISFET中产生的任意主体效应可以是相对微小的。因而，可能在减少的动态范围上产生的任何测量非线性可以忽略不计，或予以考虑并补偿(例如，通过阵列校准和数据处理技术，如下面关于图17进一步讨论的)。申请人还已经认识到并理解，通过不将每个ISFET源连通它的主体连接，构成像素的所有FET可能共有共同的主体连接，从而进一步促进像素尺寸减小，如下面关于图10-12进一步讨论的。因此，在另一个方面，在减少的线性和更小的像素尺寸之间存在有益折中。
[0349] 图10解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，图9所示的像素1051的芯片布局设计的顶视图。图11A显示了沿着图10所示的像素的线I--I的复合横截面视图，包括在线II--II和III-III之间在图10的右一半上的额外元件，其解释了像素制造的叠层视图，且图12A至12L提供了图11A所示的每个制造层的顶视图(图12A至12L的各个图像依次在顶部重叠，以建立图10所示的像素芯片布局设计)。在一个示例性实现中，使用标准的4-金属、2-poly、0.35微米CMOS工艺，可以实现在图10-12中所示的像素设计，以提供正方形几何形状的像素，其具有大约9微米的图10所示的尺寸“e”和与大约7微米的ISFET敏感区域相对应的尺寸“f”。
[0350] 在图10的顶视图中，ISFET 150(在图10中标记为Q1)通常占据像素图的右边中心部分，且ISFET的栅、源和排出装置的各个位置指示为Q1G、Q1S和Q1D。MOSFET Q2和Q3通常占据像素图的左边中心部分；MOSFET Q2的栅和源指示为Q2G和Q2S，且MOSFET Q3的栅和源指示为Q3G和Q3S。在图10所示的布局的一个方面，MOSFET Q2和Q3共有排出装置，指示为Q2/3D。在另一个方面，从图10的顶视图通常可以看出，形成了ISFET，使得它的通道位于沿着像素的第一个轴(例如，与线I--I平行)，并形成MOSFET Q2和Q3，使得它们的通道位于沿着垂直于第一个轴的第二个轴。图10也显示了操作像素所需的4条线，即与Q3的源偶联的线1121，与Q2的源偶联的线1141，与ISFET的排出装置偶联的线1161，和与Q2和Q3的栅偶联的行选择线1181。参考图9，可以理解，给定列的所有像素共有线112、114和116(例如，垂直地穿过图10中的像素)，且给定行的所有像素共有线118(例如，水平地穿过图10中的像素)；因而，基于图9的像素设计和图10所示的布局，穿过每个像素只需要4条金属线。
[0351] 现在参考图11A的横截面视图，在n-孔154中的高度掺杂的p-型区域156和158(沿着图10的线I--I)构成ISFET的源(S)和排出装置(D)，它们之间是n-孔的区域
160，其中ISFET p-通道形成在ISFET多晶硅栅164和栅氧化物165下面。根据图10和11所示的发明实施方案的一个方面，将像素1051的所有FET组件制造为在p-型半导体基质
152中形成的单个n-型孔154的p-通道FET。这是可能的，因为不象Milgrew等人的设计，
1)不存在对像素中的传输门的要求；和2)ISFET源没有连接到n-孔的主体连接。更具体地，高度掺杂的n-型区域162将主体连接(B)提供给n-孔154，且如图10所示，主体连接B偶联至围绕在像素1051周边的金属导体322。但是，主体连接不直接电偶联至ISFET的源区域156(即，不存在偶联主体连接和源的电导体，所以它们在运行中被迫处于相同电势)，主体连接也不直接电偶联至像素中任意组件的栅、源或排出装置。因而，像素的其它p-通道FET组件(即Q2和Q3)可以制造在相同的n-孔154中。
160，其中ISFET p-通道形成在ISFET多晶硅栅164和栅氧化物165下面。根据图10和11所示的发明实施方案的一个方面，将像素1051的所有FET组件制造为在p-型半导体基质
152中形成的单个n-型孔154的p-通道FET。这是可能的，因为不象Milgrew等人的设计，
1)不存在对像素中的传输门的要求；和2)ISFET源没有连接到n-孔的主体连接。更具体地，高度掺杂的n-型区域162将主体连接(B)提供给n-孔154，且如图10所示，主体连接B偶联至围绕在像素1051周边的金属导体322。但是，主体连接不直接电偶联至ISFET的源区域156(即，不存在偶联主体连接和源的电导体，所以它们在运行中被迫处于相同电势)，主体连接也不直接电偶联至像素中任意组件的栅、源或排出装置。因而，像素的其它p-通道FET组件(即Q2和Q3)可以制造在相同的n-孔154中。
[0352] 在图11A的复合横截面视图中，也可以看到高度掺杂的p-型区域159(沿着图10的线I--I)，其对应MOSFET Q2和Q3的共有的排出装置(D)。为了解释目的，在图11A中也可以看到MOSFET Q3的多晶硅栅166，尽管该栅不是沿着图10中的线I--I，而是在沿着线I-I的横截面的“平面之后”。但是，为了简洁，图10所示的MOSFET Q2和Q3的各个源以及Q2的栅，在图11A中不可见，因为它们沿着相同轴(即，垂直于该图的平面)，作为共有的排出装置(如果在图11A中显示，这些元件会不适当地复杂化图11A的复合横截面视图)。
[0353] 在图11A所示的基质、栅氧化物和多晶硅层的上面，提供了许多额外的层，以建立与不同像素组件的电连接，包括交替金属层和氧化物层，通过它们形成传导通道(conductive vias)。按照4-金属CMOS工艺的实施例，这些层在图11A中被标记为“触点”、“金属1”、“通道1”、“金属2”、“通道2”、“金属3”、“通道3”和“金属4”(注：可以采用更多或更少的金属层)。为了便于特别地理解ISFET电连接，图11A的复合横截面视图显示了在线II--II和III-III之间在图10的顶视图右侧上的像素制造的额外元件。关于ISFET电连接，最顶部金属层304对应着ISFET敏感区域178，在其上面安置着分析物-敏感的钝化层172。最顶部金属层304以及ISFET多晶硅栅164和介入导体306、308、312、316、320、326和338，形成ISFET“浮动栅”结构170，其形成方式类似于在上面关于图1所示的常规ISFET设计所讨论的方式。与ISFET排出装置的电连接，由偶联至线1161上的导体340、328、
318、314和310提供。ISFET源通过导体334和336和导体324(其沿着图10的线I-I)偶
联至MOSFET Q2和Q3的共有排出装置。n-孔154的主体连接162通过导体330和332电
偶联至金属导体322，后者围绕在“金属1”层上的像素周边。
318、314和310提供。ISFET源通过导体334和336和导体324(其沿着图10的线I-I)偶
联至MOSFET Q2和Q3的共有排出装置。n-孔154的主体连接162通过导体330和332电
偶联至金属导体322，后者围绕在“金属1”层上的像素周边。
[0354] 如上所述，图12A至12L提供了图11A所示的每个制造层的顶视图(图12A至12L的各个图像依次在顶部重叠，以建立图10所示的像素芯片布局设计)。在图12中，各个层的标有字母的顶视图和图11A的横截面视图之间的对应如下：A)n-型孔154；B)植入物；C)扩散；D)多晶硅栅164(ISFET)和166(MOSFET Q2和Q3)；E)接触体；F)金属1；G)通道1；H)金属2；I)通道2；J)金属3；K)通道3；L)金属4(接触ISFET栅的顶部电极)。在图
12A至12L中指出的不同索引数字对应着在图11A的复合横截面视图中存在的相同特征。
12A至12L中指出的不同索引数字对应着在图11A的复合横截面视图中存在的相同特征。
[0355] 申请人已经认识到并理解，至少在某些用途中，像素电容可以是某类分析物测量的突出参数。因此，在与像素布局和设计有关的另一个实施方案中，可以重新构建不同的通道和金属层，从而至少部分地减小在像素运行过程中产生寄生电容的电势。例如，在一个这样的实施方案中，将像素设计成使得在构成浮动栅结构170的信号线1121、1141、1161和1181和最顶部金属层304之间存在更大的垂直距离。
[0356] 在上面刚刚描述的实施方案中，再次参考图11A，可以容易地看出，最顶部金属层304形成在金属4层中(也参见图12L)，且信号线1121、1141和1161形成在金属3层中(也参见图12J)。另外，尽管在图11A的视图中不可见，从图12H可以看出，信号线1181形成在金属2层中。因为这些信号中的一个或多个可以在阵列运行过程中偶尔接地，寄生电容可以产生在这些信号行中的任意一个或多个和金属层304之间。通过增加这些信号行和金属层304之间的距离，可以减少这样的寄生电容。
[0357] 为此目的，在另一个实施方案中，重新构建某些通道和金属层，使得信号线1121、1141、1161和1181在金属1和金属2层中实现，且金属3层仅用作浮动栅结构170的金属
2层组件和最顶部金属层304之间的跨接线，由此确保信号行和金属层304之间更大的距离。图10-1解释了图9所示chemFET阵列的4个邻近像素簇的这种芯片布局设计顶视图，其中鉴别和标记了一个具体的像素1051。图11A-1显示了沿着图10-1所示像素1051的线I-I的邻近像素的复合横截面视图，包括在线II--II之间的额外元件，其解释了像素制造的叠层视图，且图12-1A至12-1L提供了图11A-1所示的每个制造层的顶视图(图12-1A至12-1L的各个图像依次在顶部重叠，以建立图10-1所示的像素芯片布局设计)。
2层组件和最顶部金属层304之间的跨接线，由此确保信号行和金属层304之间更大的距离。图10-1解释了图9所示chemFET阵列的4个邻近像素簇的这种芯片布局设计顶视图，其中鉴别和标记了一个具体的像素1051。图11A-1显示了沿着图10-1所示像素1051的线I-I的邻近像素的复合横截面视图，包括在线II--II之间的额外元件，其解释了像素制造的叠层视图，且图12-1A至12-1L提供了图11A-1所示的每个制造层的顶视图(图12-1A至12-1L的各个图像依次在顶部重叠，以建立图10-1所示的像素芯片布局设计)。
[0358] 在图10-1中，可以看出，像素顶视图布局一般地类似于图10所示的布局。例如，在顶视图中，ISFET 150通常占据每个像素的右边中心部分，且MOSFET Q2和Q3通常占据像素图的左边中心部分。为了清楚，在图10-1中省略了在图10中包括的许多组分标记，尽管在像素1051中指出了ISFET多晶硅栅164的朝向。图10-1也显示了操作像素所需的4条线(1121、1141、1161和1181)。图10和图10-1之间的一个显著差异涉及金属导体322(位于金属1层上)，其提供了与主体区域162的电连接；即在图10中，导体322围绕在像素周边，而在图10-1中，导体322不完全围绕在像素周边，而是包括不连续727。这些不连续727允许线1181也制造在金属1层上，并穿过像素以连接至行的邻近像素。
[0359] 现在参考图11A-1的横截面视图，为了讨论的目的，在横截面中显示了3个邻近的像素，中心像素对应着图10-1中的像素1051。如同在图11A的实施方案中，像素1051的所有FET组件都制造成单个n-型孔154中的p-通道FET。另外，如同在图11A中，在图11A-1的复合横截面视图中，也可以看见高度掺杂的p-型区域159(沿着图10-1的线I--I)，其对应着MOSFET Q2和Q3的共有的排出装置(D)。为了解释目的，在图11A-1中也可以看见MOSFET Q3的多晶硅栅166，尽管该栅不位于沿着图10-1中的线I--I，而是在沿着线I-I的横截面的“平面之后”。但是，为了简洁，图10-1所示的MOSFET Q2和Q3的各个源以及Q2的栅，在图11A-1中不可见，因为它们位于沿着相同轴(即，垂直于该图的平面)，作为共有的排出装置。此外，为了促进对ISFET浮动栅电连接的理解，图11A-1的复合横截面视图显示了在图10-1的线II-II之间的像素制造的额外元件。
[0360] 更具体地，如同在图11A的实施方案中，最顶部金属层304对应着ISFET敏感区域178，在其上面安置着分析物-敏感的钝化层172。最顶部金属层304以及ISFET多晶硅栅164和介入导体306、308、312、316、320、326和338，形成ISFET浮动栅结构170。但是，不同于图11A的实施方案，与ISFET排出装置的电连接由偶联至线1161上的导体340、328和318提供，其形成在金属2层中，而不是在金属3层中。另外，在图11A-1中也将线1121和1141显示为形成在金属2层中，而不是在金属3层中。从图12-1A至12-1L的各个图像(其中各个层的标有字母的顶视图和图11A-1的横截面视图之间的对应与关于图12A-12L所述相同)，可以进一步理解这些线以及线1181的结构；具体地，在图12-1F中可以看出，线1181以及金属导体322形成在金属1层中，且可以看出，线1121、1141和1161形成在金属2层中，仅将浮动栅结构170的跨接线308保留在图12-1J所示的金属3层中。
[0361] 因此，通过将信号线1121、1141、1161和1181连接至金属1和金属2层，并从而增加这些信号行和金属4层中的浮动栅结构170的最顶层304之间的距离，可以至少部分地减少ISFET的寄生电容。应当理解，该一般概念(例如，在信号行和浮动栅结构的最顶层之间包括一个或多个介入金属层)可以在包含更大数目的金属层的其它制造工艺中实现。例如，通过增加额外金属层(超过4个总金属层)，可以增加像素信号线和最顶部金属层之间的距离，其中在额外金属层中仅形成与最顶部金属层的跨接线。具体地，可以采用6-金属-层制造工艺，其中使用金属1和金属2层制造信号线，浮动栅结构的最顶部金属层形成在金属6层中，且与最顶部金属层的跨接线分别形成在金属3、金属4和金属5层中(在金属层之间具有有关的通道)。在基于6-金属-层制造工艺的另一个示例性实现中，可以采用在图10、11A和12A-12L中所示的一般像素结构(在金属2和金属3层上的信号线)，其中最顶部金属层形成在金属6层中，且跨接线分别形成在金属4和金属5层中。
[0362] 在关于降低的电容的另一个方面，可以减少最顶部金属层304(和因而ISFET敏感区域178)的尺寸“f”，从而减少邻近像素之间的交叉电容。从图11A-1可以看出(且如下面关于涉及在ISFET阵列上面制造孔的其它实施方案进一步讨论的)，可以制造孔725，从而具有锥形形状，使得在孔顶部的尺寸“g”小于像素间距“e”，但是仍然大于孔底部的尺寸“f”。基于这种锥形，也可以将最顶部金属层304设计成具有尺寸“f”，而不是尺寸“g”，从而提供邻近像素的顶部金属层之间的额外空间。在一些例证性的非限制性实现中，对于具有9微米量级的尺寸“e”的像素，尺寸“f”可以是6微米的量级(相对于上面讨论的7微米)，且对于具有5微米量级的尺寸“e”的像素，尺寸“f”可以是3.5微米的量级。
[0363] 因而，分别显示在图10、11A、12A至12L、图10-1、11A-1、12-1A至12-1L中的像素芯片布局设计解释了，根据不同实施方案，相同类型的FET装置可以用于像素的所有组件，且所有组件可以在单个孔中实现。这会急剧减小像素所需的面积，由此促进给定面积中的像素密度增加。
[0364] 在一个示例性实现中，ISFET的栅氧化物165可以制造成，具有大约75埃量级的2
厚度，产生4.5fF/μm 的栅氧化物电容/单位面积Cox。另外，多晶硅栅164可以制造成具有与1.2μm的通道宽度W和0.35-0.6μm的通道长度L相对应的尺寸(即，W/L范围为
2
大约2-3.5)，且可以选择区域160的掺杂(doping)，使得p-通道的载体迁移率是190cm/
2 2
V·s(即，1.9E10μm/V·s)。从上面的方程(2)，这会产生大约170-300μA/V 量级的ISFET跨导参数β。在该示例性实现的其它方面，模拟供给电压VDDA是3.3伏特，且偏压VB1和VB2，从而提供5μA量级的恒定ISFET排出电流IDj(在某些实现中，可以调节VB1和VB2，以提供大约1μA至20μA的排出电流)。另外，调整MOSFET Q6(参见图9中的偏压/读
出电路110j)的大小，以具有通道宽度/长度比(例如，W/L为大约50)，使得在IDj为5μA的情况下，跨Q6的电压是800mV(即，VDSj＝800mV)。从方程(3)，基于这些示例性参数，这会提供范围为大约0.5-2.5伏特的像素输出电压VSj(对于范围为大约0-2伏特的ISFET阈值电压变化)。
厚度，产生4.5fF/μm 的栅氧化物电容/单位面积Cox。另外，多晶硅栅164可以制造成具有与1.2μm的通道宽度W和0.35-0.6μm的通道长度L相对应的尺寸(即，W/L范围为
2
大约2-3.5)，且可以选择区域160的掺杂(doping)，使得p-通道的载体迁移率是190cm/
2 2
V·s(即，1.9E10μm/V·s)。从上面的方程(2)，这会产生大约170-300μA/V 量级的ISFET跨导参数β。在该示例性实现的其它方面，模拟供给电压VDDA是3.3伏特，且偏压VB1和VB2，从而提供5μA量级的恒定ISFET排出电流IDj(在某些实现中，可以调节VB1和VB2，以提供大约1μA至20μA的排出电流)。另外，调整MOSFET Q6(参见图9中的偏压/读
出电路110j)的大小，以具有通道宽度/长度比(例如，W/L为大约50)，使得在IDj为5μA的情况下，跨Q6的电压是800mV(即，VDSj＝800mV)。从方程(3)，基于这些示例性参数，这会提供范围为大约0.5-2.5伏特的像素输出电压VSj(对于范围为大约0-2伏特的ISFET阈值电压变化)。
[0365] 关于图11A所示的分析物-敏感的钝化层172，在示例性的CMOS实现中，钝化层可能对不同离子物质(包括氢)的浓度非常敏感，且可以包括氮化硅(Si3N4)和/或氮氧化硅(Si2N2O)。在常规的CMOS工艺中，钝化层可以通过这些材料的一次或多次连续沉积来形成，且通常用于处理或包被装置，从而保护免于污染，并增加电稳定性。氮化硅和氮氧化硅的材料性质使得包含这些材料的钝化层会提供刮擦保护，并用作水和钠的扩散的重要屏障，所述扩散可以造成装置金属化腐蚀和/或造成装置运行变得不稳定。包括氮化硅和/或氮氧化硅的钝化层也提供ISFET装置的离子-灵敏度，因为钝化层含有这样的表面基团，其可以捐献质子或接收来自它们接触的分析物溶液的质子，由此改变表面电势和装置阈值电压VTH，如上面关于图1和2A所讨论的。
[0366] 对于包含铝作为金属(其具有大约650摄氏度的熔点)的CMOS工艺，氮化硅和/或氮氧化硅钝化层通常通过等离子体增强的化学气相沉积(PECVD)来形成，其中在
250-350摄氏度的辉光放电会电离形成氮化硅或氮氧化硅的组分气体，产生活性物质，它们在晶片表面处反应以形成各种物质的薄层。在一个示例性工艺中，通过首先沉积氮氧化硅薄层(0.2-0.4μm量级)，随后沉积稍微更厚的氮氧化硅(0.5μm量级)和最后沉积氮化硅(0.5μm量级)，可以形成厚度在大约1.0-1.5μm量级的钝化层。因为在PECVD工艺中涉及的低沉积温度，铝金属化没有受到不利影响。
250-350摄氏度的辉光放电会电离形成氮化硅或氮氧化硅的组分气体，产生活性物质，它们在晶片表面处反应以形成各种物质的薄层。在一个示例性工艺中，通过首先沉积氮氧化硅薄层(0.2-0.4μm量级)，随后沉积稍微更厚的氮氧化硅(0.5μm量级)和最后沉积氮化硅(0.5μm量级)，可以形成厚度在大约1.0-1.5μm量级的钝化层。因为在PECVD工艺中涉及的低沉积温度，铝金属化没有受到不利影响。
[0367] 但是，申请人已经认识到并理解，尽管低温PECVD工艺会为常规CMOS装置提供充分钝化，该低温工艺通常导致低密度和稍微多孔的钝化层，这在某些情况下可能不利地影响ISFET阈值电压稳定性。具体地，在ISFET装置运行期间，低密度多孔的钝化层可以随着时间吸附来自溶液的离子，并被它们饱和，这又可能造成不希望的ISFET阈值电压VTH随时间变化的漂移，这造成准确测量挑战。
[0368] 鉴于前述内容，在一个实施方案中，使用钨金属替代铝的CMOS工艺，可以用于制造根据本公开内容的ISFET阵列。钨的高熔解温度(超过3400摄氏度)允许为氮化硅或氮氧化硅钝化层使用更高温低压化学气相沉积(LPCVD)工艺(例如，大约700-800摄氏度)。所述LPCVD工艺通常产生明显更密集的且更少孔的钝化层膜，由此减少导致ISFET阈值电压漂移的来自分析物溶液的离子吸附的潜在不良作用。
[0369] 在其中采用基于铝的CMOS工艺来制造根据本公开内容的ISFET阵列的另一个实施方案中，图11A所示的钝化层172可以包含除了在常规CMOS工艺中通常采用的那些以外的额外沉积和/或材料。例如，钝化层172可以包括如上所讨论的氮化硅和/或氮氧化硅的最初低温等离子体辅助的沉积(PECVD)；为了讨论的目的，这些常规沉积在图11A中解释为钝化层172的第一部分172A。在一个实施方案中，在第一部分172A之后，安置一种或多种额外的钝化材料以形成至少第二部分172B，以增加总钝化层172的密度和减小孔隙度(和吸附)。尽管主要为了图11A的图解目的显示了一个额外的部分172B，应当理解，公开内容在这方面不受限制，因为总钝化层172可以包含2个或更多个组成部分，其中每个部分可以包含相同或不同材料的一个或多个层/沉积，且各个部分可以同样地或不同地构建。
[0370] 适合钝化层172的第二部分172B(或其它额外部分)的材料实例包括、但不限于：氮化硅、氮氧化硅、氧化铝(Al2O3)、氧化钽(Ta3O5)、氧化锡(SnO2)和二氧化硅(SiO2)。在一个方面，第二部分172B(或其它额外部分)可以通过多种相对低温工艺来沉积，包括、但不限于：RF溅射、DC磁控溅射、热或电子束蒸发和离子辅助的沉积。在另一个方面，在沉积第二部分172B之前，可以采用预溅射蚀刻工艺，以去除停留在第一部分172A上的任何天然氧化物(或者，可以采用还原环境，诸如高温氢环境，以去除停留在第一部分172A上的天然氧化物)。在另一个方面，第二部分172B的厚度可以是大约0.04μm-0.06μm(400-600埃)的量级，且第一部分的厚度可以是如上面所讨论的1.0-1.5μm的量级。在一些示例性实现中，第一部分172A可以包括氮氧化硅和氮化硅的多层，其具有1.0-1.5μm的复合厚度，且第二部分172B可以包括氧化铝或氧化钽的单层，其具有大约400-600埃的厚度。另外，应当理解，前述示例性厚度主要为了解释目的而提供，公开内容在这些方面不受限制。
[0371] 根据本发明已经发现，氢离子敏感的钝化层也对其它分析物敏感，其它分析物包括但不限于PPi和未引入的三磷酸核苷酸。作为一个实例，氮化硅钝化层能检测PPi和三磷酸核苷酸的浓度的变化。使用相同chemFET测量这些分析物的浓度变化的能力，极大促进了使用单个阵列测序核酸的能力，由此简化了测序方法。
[0372] 因而，应当理解，本文所述的chemFET阵列可以用于检测和/或测量不同的分析物，且如此可以监测多种反应和/或相互作用。也应当理解，本文与氢离子检测(以pH变化的形式)有关的讨论是为了方便和简洁，且其它分析物(包括其它离子)的静态或动态水平/浓度可以替换这些描述中的氢。具体地，通过如上面关于图2A所讨论的chemFET的暂时或动态响应，可以检测在分析物中存在的任意一种或多种不同离子物质的足够快速的浓度变化。也如上面关于分析物/钝化层界面的位点-解离(或位点-结合)模型所讨论的，应当理解，与分析物/钝化层界面处的平衡反应有关的不同参数(例如，正向和反向平衡反应的速率常数、钝化层表面上每单位面积的质子供体/受体位点的总数、固有缓冲容量、在零电荷点处的pH)是材料依赖性的性质，因而受到钝化层采用的材料的选择的影响。
[0373] 本文所述的chemFET(包括ISFET)能够检测任意分析物，所述分析物本身在接触chemFET表面或以其它方式被chemFET表面感知或检测时能诱导电场的变化。分析物不必为了被传感器检测到而带电荷。例如，根据该实施方案，分析物可以是带正电荷的(即，阳离子)、带负电荷的(即，阴离子)、两性离子的(即，能具有2种等量且相反的电荷，但是总体上是中性的)和极性且仍然中性的。该列表无意作为其它分析物类别的穷尽，并且本领域普通技术人员基于本文提供的公开内容，可以容易地预见到每个类别内的物质。
[0374] 在本发明的最广泛的含义中，钝化层可以被包被或没有被包被，且分析物可以与或不与钝化层直接相互作用。作为一个实例，钝化层可以包含氮化硅，且分析物可以是除了氢离子以外的物质。作为一个具体实例，钝化层可以包含氮化硅，且分析物可以是PPi。在这些实例中，直接检测PPi(即，在没有直接或间接连接到钝化层上的PPi受体存在下)。
[0375] 如果待测分析物是氢(或者氢氧化物)，则优选地使用弱缓冲剂，使得可以检测在钝化层处的离子物质的变化。如果待测分析物是除了氢(或者氢氧化物)以外的物质，但是在反应或检测步骤期间溶液中存在pH变化的某种可能性，则优选地使用强缓冲剂，使得pH变化不会干扰分析物的检测。缓冲剂是抵抗pH不同程度变化的离子型分子(或包含离子型分子的溶液)。某些缓冲剂能中和加入溶液中或在溶液中产生的酸或碱，导致溶液的pH不发生显著变化。应当理解，任意缓冲剂是合适的，只要它具有在希望的范围内的pKa。对于某些实施方案，合适的缓冲剂是这样的，其在6-9、更优选6.5-8.5的大约pH范围内起作用。在其它实施方案中，合适的缓冲剂是这样的，其在7-10、包括8.5-9.5的大约pH范围内起作用。
[0376] 缓冲剂的强度是相对术语，因为它取决于加入目标溶液中或在目标溶液中产生的酸或碱的性质、强度和浓度。弱缓冲剂是这样的缓冲剂，其允许检测(且因此不能控制)约至少±0.005、约至少±0.01、约至少±0.015、约至少±0.02、约至少±0.03、约至少±0.04、约至少±0.05、约至少±0.10、约至少±0.15、约至少±0.20、约至少±0.25、约至少±0.30、约至少±0.35、约至少±0.45、约至少±0.50或更高的pH变化。在有些实施方案中，所述pH变化是约0.005的量级(例如，每个核苷酸掺入)，且优选地是pH的增加。
强缓冲剂是这样的缓冲剂，其控制约至少±0.005、约至少±0.01、约至少±0.015、约至少±0.02、约至少±0.03、约至少±0.04、约至少±0.05、约至少±0.10、约至少±0.15、约至少±0.20、约至少±0.25、约至少±0.30、约至少±0.35、约至少±0.45、约至少±0.50或更高的pH变化。通过改变缓冲剂物质本身的浓度，可以改变缓冲强度。因而，低浓度缓冲剂可以是低强度缓冲剂。实例包括具有小于1mM(例如，50-100μM)缓冲剂物质的那些。
适合本文所述测序反应(其中读出pH变化)的弱缓冲剂的非限制性实例是0.1mM Tris或三(羟甲基)甲基甘氨酸。合适的弱缓冲剂的实例提供在实施例中，且也是本领域已知的。
更高浓度的缓冲剂可以是更强的缓冲剂。实例包括具有1-25mM缓冲剂物质的那些。适合本文所述测序反应(其中直接读出PPi和/或三磷酸核苷酸)的强缓冲剂的非限制性实例是1、5或25mM(或更高)Tris或三(羟甲基)甲基甘氨酸。本领域普通技术人员能确定用于本发明包括的反应和检测方法的最佳缓冲剂。
强缓冲剂是这样的缓冲剂，其控制约至少±0.005、约至少±0.01、约至少±0.015、约至少±0.02、约至少±0.03、约至少±0.04、约至少±0.05、约至少±0.10、约至少±0.15、约至少±0.20、约至少±0.25、约至少±0.30、约至少±0.35、约至少±0.45、约至少±0.50或更高的pH变化。通过改变缓冲剂物质本身的浓度，可以改变缓冲强度。因而，低浓度缓冲剂可以是低强度缓冲剂。实例包括具有小于1mM(例如，50-100μM)缓冲剂物质的那些。
适合本文所述测序反应(其中读出pH变化)的弱缓冲剂的非限制性实例是0.1mM Tris或三(羟甲基)甲基甘氨酸。合适的弱缓冲剂的实例提供在实施例中，且也是本领域已知的。
更高浓度的缓冲剂可以是更强的缓冲剂。实例包括具有1-25mM缓冲剂物质的那些。适合本文所述测序反应(其中直接读出PPi和/或三磷酸核苷酸)的强缓冲剂的非限制性实例是1、5或25mM(或更高)Tris或三(羟甲基)甲基甘氨酸。本领域普通技术人员能确定用于本发明包括的反应和检测方法的最佳缓冲剂。
[0377] 在有些实施方案中，所述钝化层和/或包被在其上面的层和/或分子决定了阵列读出的分析物特异性。
[0378] 使用由氮化硅(Si3N4)、氮氧化硅(Si2N2O)、氧化硅(SiO2)、氧化铝(Al2O3)、五氧化钽(Ta2O5)、氧化锡或二氧化锡(SnO2)等制成的钝化层，可以进行通过本发明测定的氢离子(以pH的形式)和其它分析物的检测。
[0379] 钝化层也可以直接检测其它离子物质，包括但不限于钙、钾、钠、碘化物、镁、氯化物、锂、铅、银、镉、硝酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐等。
[0380] 在有些实施方案中，所述钝化层包被了目标分析物的受体。优选地，所述受体选择性地结合目标分析物或(在某些情况下)分析物所属的试剂类别。如本文使用的，选择性地结合分析物的受体是优先结合该分析物的分子(即，它对该分析物的结合亲和力大于它对任何其它分析物的结合亲和力)。它对目标分析物的结合亲和力可以是它对任何其它分析物的结合亲和力的2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、15-倍、20-倍、25-倍、30-倍、40-倍、50-倍、100-倍或更高。除了它的相对结合亲和力以外，受体还必须具有高得足以有效结合目标分析物的绝对结合亲和力(即，它必须具有足够的灵敏度)。具有在皮摩尔至微摩尔范围内的结合亲和力的受体是合适的。优选地，这种相互作用是可逆的。
[0381] 所述受体可以是任意性质(例如，化学、核酸、肽、脂类、它们的组合等)。在这样的实施方案中，分析物也可以是任意性质，只要存在选择性地(且在某些情况下特异性地)结合它的受体。但是，应当理解，本发明另外预见到，在没有受体存在下分析物的检测。这种的一个实例是，在没有PPi或Pi受体存在下，通过钝化层检测PPi和Pi。
[0382] 在一个方面，本发明预见到作为离子载体的受体。如本文使用的，离子载体是选择性地结合离子物质(阴离子或阳离子)的分子。在本发明的上下文中，离子载体是受体，且它结合的离子是分析物。本发明的离子载体包括本领域公知的源自微生物的载体离子载体(即，结合特定离子的小的脂溶性的分子)。不同的离子载体可从诸如Calbiochem等来源商业得到。
[0383] 通过使用钝化层自身或通过使用包被在钝化层上的受体，可以检测一些离子。例如，使用聚硅氧烷、缬氨霉素或沙利霉素，可以选择性地检测钾；使用莫能星、制霉菌素或SQI-Pr，可以选择性地检测钠；使用离子霉素、卡西霉素(A23187)或CA 1001(ETH 1001)，可以选择性地检测钙。
[0384] 在某些情况下，也可以使用能结合超过一种离子的受体。例如，白僵菌素可以用于检测钙和/或钡离子，尼日利亚菌素可以用于检测钾、氢和/或铅离子，且短杆菌肽可以用于检测氢、钠和/或钾离子。本领域普通技术人员会认识到，这些化合物可以用于这样的用途，其中不需要单个离子特异性，或其中不太可能(或不可能)存在或产生化合物结合的其它离子。类似地，结合特定种类的多种物质的受体也可以用于某些实施方案中，包括其中仅存在该种类的一种物质或其中所述方法不需要区分物质的那些。
[0385] 作为另一个实例，在Simonian Electroanalysis 2004，16：1896-1906中描述了神经毒素受体。
[0386] 在包括但不限于核酸测序用途的其它实施方案中，可以使用选择性地结合PPi的受体。PPi受体的实例包括图11B(1)-(3)中所示的那些化合物(化合物1-10)。在Angew，Chem Int(Ed 2004)43：4777-4780和US 2005/0119497
[0387] A1中描述了化合物1，并称作对萘基-二[(二(2-吡啶基甲基)氨基)甲基]苯酚。在J Am Chem Soc 2003 125：7752-7753和US 2005/0119497 A1中描述了化合物2，并称作对(对硝基苯偶氮基)-二[(二(2-吡啶基甲基-1)氨基)甲基]苯酚(或它的双
核Zn复合物)。在US 2005/0119497A1中提供了化合物1和2的合成线路图。在Lee等人Organic Letters 20079(2)：243-246和Sensors and Actuators B 199529：324-327中描述了化合物3。在Angew，Chem Int(Ed 2002)41(20)：3811-3814中描述了化合物4。在图
11C(1)-(3)中显示了化合物7、8和9的示例性合成。在WO 2007/002204中描述了化合物
2+ 2+
5，并在其中称作二-Zn -二吡啶甲基胺(Zn -DPA)。在图11B(3)中解释了结合PPi的化合物6(McDonough等人Chem.Commun.2006 2971-2973)。在图11E中显示了化合物7与金属氧化物表面的结合。
核Zn复合物)。在US 2005/0119497A1中提供了化合物1和2的合成线路图。在Lee等人Organic Letters 20079(2)：243-246和Sensors and Actuators B 199529：324-327中描述了化合物3。在Angew，Chem Int(Ed 2002)41(20)：3811-3814中描述了化合物4。在图
11C(1)-(3)中显示了化合物7、8和9的示例性合成。在WO 2007/002204中描述了化合物
2+ 2+
5，并在其中称作二-Zn -二吡啶甲基胺(Zn -DPA)。在图11B(3)中解释了结合PPi的化合物6(McDonough等人Chem.Commun.2006 2971-2973)。在图11E中显示了化合物7与金属氧化物表面的结合。
[0388] 受体可以共价地或非共价地结合在钝化层上。受体与钝化层的共价结合可以是直接的或间接的(例如，通过连接物)。图11D(1)和(2)解释了使用硅烷醇化学将受体共价结合到钝化层上。使用例如脂族伯胺(左下图)或异硫氰酸芳基酯(右下图)，可以将受体固定化在钝化层上。在这些和其它实施方案中，钝化层(其自身可以包含氮化硅、氧化铝、氧化硅、五氧化钽等)通过它的反应性表面基团结合到硅烷化(silanation)层上。关于共价结合到FET表面上的硅烷醇化学的其它细节，可以参见至少下述出版物：对于氮化硅，参见Sensors and Actuators B 199529：324-327，Jpn J Appl Phys 1999 38：3912-3917和Langmuir 2005 21：395-402；对于氧化硅，参见Protein Sci 1995 4：2532-2544和Am Biotechnol Lab 2002 20(7)：16-18；对于氧化铝，参见Colloids and Surfaces 1992 63：1-9，Sensors and Actuators B2003 89：40-47和Bioconjugate Chem 1997 8：424-433。
然后将受体缀合到硅烷化层反应基团上。后一种结合可以直接发生，或通过使用图11D(1)和(2)所示的双功能连接物间接发生。
然后将受体缀合到硅烷化层反应基团上。后一种结合可以直接发生，或通过使用图11D(1)和(2)所示的双功能连接物间接发生。
[0389] 双功能连接物是这样的化合物，其具有至少2种反应基团，与它们可以结合两种实体。在某些情况下，反应基团位于连接物的相对末端。在有些实施方案中，所述双功能连接物是通用双功能连接物，诸如在图11D(1)和(2)中所示的那些。通用连接物是可以用于连接多种实体的连接物。应当理解，在图11D(1)和(2)中所示的化学物质是解释性的，且是非限制性的。
[0390] 双功能连接物可以是同型-双功能连接物或异型-双功能连接物，这取决于要缀合的分子的性质。同型-双功能连接物具有2个相同的反应基团。异型-双功能连接物具有2个不同的反应基团。不同类型的可商业得到的连接物可与一种或多种下述基团反应：伯胺、仲胺、巯基、羧基、羰基和碳水化合物。胺-特异性的连接物的实例是：二(磺酸基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、二[2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)乙基]砜、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、二甲基己二亚酰胺化物(adipimate)·2 HCl、庚二亚氨酸二甲酯·2HCl、二甲基辛二亚氨酸酯·2HCl和乙二醇二-[琥珀酰亚胺基-[琥珀酸盐]]。
可与巯基反应的连接物包括二马来酰亚胺基己烷、1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫)-丙酰胺基)]丁烷、1-[对叠氮基水杨酰基酰胺基]-4-[碘代乙酰胺基]丁烷和N-[4-(对叠氮基水杨酰基酰胺基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫]丙酰胺。优先与碳水化合物反应的连接物包括叠氮基苯甲酰基肼。优先与羧基反应的连接物包括4-[对叠氮基水杨酰基酰胺基]丁胺。
可与巯基反应的连接物包括二马来酰亚胺基己烷、1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫)-丙酰胺基)]丁烷、1-[对叠氮基水杨酰基酰胺基]-4-[碘代乙酰胺基]丁烷和N-[4-(对叠氮基水杨酰基酰胺基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫]丙酰胺。优先与碳水化合物反应的连接物包括叠氮基苯甲酰基肼。优先与羧基反应的连接物包括4-[对叠氮基水杨酰基酰胺基]丁胺。
[0391] 与胺和巯基反应的异型双功能连接物包括N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯、琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酸基琥珀酰亚胺基6-[3-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基]己酸盐和磺酸基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯。与羧基和胺基团反应的异型双功能连接物包括1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]-碳二亚胺氢氯化物。与碳水化合物和巯基反应的异型双功能连接物包括4-[N-马来酰亚胺基甲基]-环己烷-1-羧基酰肼·2HCl、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼·2HCl和3-[2-吡啶基二硫]丙酰基酰肼。
[0392] 或者，受体可以非共价地包被在钝化层上。受体在钝化层上的非共价沉积可以包含使用聚合物基质。聚合物可以是天然存在的或非天然存在的，且可以属于任意类型，包括但不限于核酸(例如，DNA、RNA、PNA、LNA等或模仿物、衍生物或其组合)、氨基酸(例如，肽、蛋白(天然的或变性的)等或模仿物、衍生物或其组合、脂类、多糖和功能化的嵌段共聚物。受体可以吸附在聚合物基质上，和/或陷入聚合物基质内。聚合物的性质取决于使用的受体和/或待测分析物的性质。
[0393] 或者，受体可以共价地缀合或交联到聚合物上(例如，它可以“移植”到功能化的聚合物上)。
[0394] 合适的肽聚合物的实例是聚-赖氨酸(例如，聚-L-赖氨酸)。其它聚合物的实例包括：嵌段共聚物，包括聚乙二醇(PEG)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯类、烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝酸纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)、聚(对苯二酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)、聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸、聚酐、聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)(SIBS)嵌段共聚物、乙烯醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、乳酸和羟乙酸的聚合物、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨酯类、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共聚己内酯)和天然聚合物诸如藻酸盐和其它多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、白蛋白和其它亲水蛋白、玉米醇溶蛋白和其它谷醇溶蛋白和疏水蛋白、其共聚物和混合物及其化学衍生物，它们包括化学基团的置换和/或添加，例如，烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其它修饰。
[0395] 与ISFET阈值电压稳定性和/或预测性有关的另一个问题涉及捕获电荷，其可以积累(具体地)在CMOS-制造的装置的金属层上，这是由于在阵列制造过程中或之后的不同加工活动(例如，线后(back-end-of-line)加工，诸如等离子体金属蚀刻、晶片清洁、切割、包装、处理等)。具体地，参考图11A，捕获电荷在某些情况下可能积累在构成ISFET浮动栅结构170的不同导体304、306、308、312、316、320、326、338和164中的一个或多个上。该现象在相关文献中也称作“天线效应”。
[0396] 捕获电荷进行积累的一个机会包括最顶部金属层304的等离子体蚀刻。申请人已经认识到并理解，电荷积累在浮动栅结构的一个或多个导体或FET的其它部分上的其它机会包括晶片切割(在这期间切入晶片中的切割锯的摩擦过程产生静电)和/或不同的加工后晶片处理/包装步骤，诸如管芯-至-包装电缆接合，其中在某些情况下操纵/运输晶片的自动化机器可能是向浮动栅结构的导体静电放电(ESD)的来源。如果不存在与硅基质(或其它半-导体基质)的连接来提供放出这种电荷积累的电途径，电荷可能积累到造成不希望的变化或破坏栅氧化物165的点(例如，电荷注入氧化物中，或对底层基质的低-水平氧化物击穿)。在栅氧化物中或在栅氧化物-半导体界面处的捕获电荷又可以造成不希望的和/或不可预测的ISFET运行和性能的变化，诸如阈值电压的波动。
[0397] 鉴于前述内容，本公开内容的其它发明实施方案涉及通过减少捕获电荷或减轻天线效应来提高ISFET性能的方法和装置。在一个实施方案中，可以在已经制造出传感器阵列之后，减少捕获电荷，在其它实施方案中，可以改进制造工艺本身来减少通过某些常规工艺步骤可能诱发的捕获电荷。在其它实施方案中，可以组合使用“制造期间”和“制造后”技术来减少捕获电荷，并由此提高ISFET性能。
[0398] 关于改变制造工艺自身来减少捕获电荷，在一个实施方案中，可以特别地选择图11A所示的栅氧化物165的厚度，从而促进积累的电荷向基质的放出；具体地，更薄的栅氧化物可以允许足够量的累积电荷穿过栅氧化物到达下面的基质，不需要捕获。在基于该概念的另一个实施方案中，可以将像素设计成包括额外的“牺牲”装置，即，具有比ISFET的栅氧化物165更薄的栅氧化物的另一个晶体管。然后可以将ISFET的浮动栅结构偶联至牺牲装置的栅，使它用作“电荷放出晶体管”。当然，应当理解，包括这样的牺牲装置的某些权衡(trade-off)包括像素尺寸和复杂性的增加。
[0399] 在另一个实施方案中，可以在等离子体蚀刻之前用电介质给图11A所示的ISFET浮动栅结构170的最顶部金属层304加帽，以减少捕获电荷。如上面所讨论的，积累在浮动栅结构上的电荷可能在某些情况下由用于金属蚀刻的等离子体偶联。典型地，将光刻胶施加于要蚀刻的金属上，然后基于底层金属的希望的几何形状进行模式化(pattern)。在一个示例性实现中，可以在施加光刻胶之前，使加帽电介质层(例如，氧化物)沉积在要蚀刻的金属上，以在金属表面上提供避免来自等离子体蚀刻工艺的电荷的额外屏障。在一个方面，加帽电介质层可以保留在后面，并形成钝化层172的一部分。
[0400] 在另一个实施方案中，可以将最顶部金属层304的金属蚀刻工艺改进成包括湿化学法或离子束铣，而不是等离子体蚀刻。例如，使用对底层电介质选择性的水性化学试剂(例如，参见与铝有关的氯氮卓二钾(Transene)的网站，其通过引用并入本文)，可以蚀刻金属层304。另一个替代方案对金属层304采用离子铣，而不是等离子体蚀刻。离子铣常用于蚀刻使用常规离子体或湿化学法不能容易地去除的材料。离子铣工艺不象离子体那样采用振荡电场，所以不会在金属层中发生电荷积累。另一个金属蚀刻替代方法包含优化等离子体条件，从而降低蚀刻速率(即更低的功率密度)。
[0401] 在另一个实施方案中，可以对金属层做出结构变化，以促进在浮动栅界定过程中的完全电分离。在一个方面，设计金属层叠(stack-up)，使得大面积ISFET浮动栅在它最后界定期间不连接任何物体，可能需要以后的金属层用作“跨接线”，以实现与晶体管浮动栅的电连接。该“跨接线”连接线路图阻止电荷从大浮动栅流向晶体管。该方法可以如下实现(M＝金属层)：i)M1接触Poly栅电极；ii)M2接触M1；iii)M3界定浮动栅，并分别用分离的岛状物连接至M2；iv)M4跨接线(具有在分离的岛状物上面的非常小的被蚀刻面积和与浮动栅M3的连接)将M3浮动栅连接至M1/M2/M3堆，该堆在晶体管有效区上面立即连接至Poly栅；和v)仅在浮动栅上面去除M3至M4夹层电介质，从而暴露裸露的M3浮动栅。在上面刚刚描述的方法中，步骤v)不需要执行，因为根据上面讨论的某些实施方案的ISFET结构使M4保留在M4浮动栅上面原位钝化。在一个方面，去除可能以其它方式提高ISFET性能(即灵敏度)。在任意情况下，最终的敏感的钝化层可以是薄的溅射沉积的离子敏感的金属-氧化物层。应当理解，上面讨论的保护层跨接的结构可以在标准的CMOS制造流中实现，以允许前3个金属层中的任一个用作浮动栅(即M1、M2或M3)。
[0402] 关于减少捕获电荷的制造后工艺，在一个实施方案中，“混合气体退火”可以用作制造后工艺来减轻捕获电荷的潜在不良作用。在混合气体退火中，在氢气和氮气混合物中加热CMOS-制造的ISFET装置。混合物中的氢气扩散进栅氧化物165，并中和捕获电荷的某些形式。在一个方面，混合气体退火不一定需要去除所有栅氧化物损害(它们可能源自捕获电荷)；相反，在有些情况下，一些捕获电荷的部分中和足以显著提高ISFET性能。在根据本公开内容的示例性的退火工艺中，可以在氢/氮混合物(包括10％-15％的氢)中在大约400至425摄氏度加热ISFET大约30至60分钟。在一个具体实现中，观察到在氢/氮混合物(包括10％的氢)中在425摄氏度退火30分钟，可以特别有效地提高ISFET性能。对于铝CMOS工艺，退火温度应当保持在450摄氏度或450摄氏度以下，以避免损害铝冶金学。在根据本公开内容的退火工艺的另一个方面，在切割制造的ISFET阵列的晶片之后进行混合气体退火，从而确保有效地改善由切割过程本身和/或其它切割前加工步骤(例如，金属的等离子体蚀刻)诱发的捕获电荷导致的损害。在另一个方面，可以在管芯-至-包装电缆接合之后进行混合气体退火，以同样地改善由捕获电荷导致的损害。在装配过程的该时刻，切割的阵列芯片通常是在热和化学耐受性的陶瓷包装中，且低-耐受性电缆接合操作以及耐热的管芯-至-包装粘合剂可以用于抵抗退火操作。因而，在一个示例性的实施方案中，本发明包括制备FET阵列的方法，每个FET具有浮动栅或偶联至浮动栅，所述浮动栅具有零或基本上零的捕获电荷，所述方法包括：在普通半导体基质上制造多个FET，多个FET中的每一个偶联至浮动栅；在切割步骤之前，将混合气体退火施加于半导体；切割半导体；和在切割步骤之后，将混合气体退火施加于半导体。优选地，半导体基质包含至少100,000个FET。
优选地，多个FET是chemFET。所述方法可以另外包括：将钝化层沉积在半导体上，将聚合的、玻璃、可离子反应地蚀刻的或光可界定的(photodefineable)材料层沉积在钝化层上，并蚀刻聚合的、玻璃、可离子反应地蚀刻的或光可界定的材料，以在玻璃层中形成反应室阵列。
优选地，多个FET是chemFET。所述方法可以另外包括：将钝化层沉积在半导体上，将聚合的、玻璃、可离子反应地蚀刻的或光可界定的(photodefineable)材料层沉积在钝化层上，并蚀刻聚合的、玻璃、可离子反应地蚀刻的或光可界定的材料，以在玻璃层中形成反应室阵列。
[0403] 在根据本公开内容实施方案的减轻捕获电荷的潜在不良作用的其它方法中，在多个晶片制造后处理/包装步骤中的任一个期间中，可以采用多种“静电放电(ESD)-敏感的方法”。例如，在一个示例性的方法中，可以使用防静电切割带来将晶片基质保持就位(例如，在切割过程中)。另外，尽管常规地与切割锯的冷却一起采用高电阻率(例如，10MΩ)的去离子水，根据本公开内容的一个实施方案，更低电阻率/更高电导率的水可以用于该目的，以通过水促进电荷传导；例如，可以用二氧化碳将去离子水处理至更低的电阻率，并提高从切割过程中产生的电荷的传导。此外，在不同的晶片切割/处理/包装步骤中，可以使用传导性的且地线的管芯-弹射工具，也提供在这些步骤中的任一步中产生的电荷的有效传导途径，并从而减少电荷积累在阵列的各个ISFET的浮动栅结构的一个或多个导体上的机会。
[0404] 在包含制造后工艺来减少捕获电荷的另一个实施方案中，可以用紫外线辐射辐照ISFET的栅氧化物区域。再次参考图11A，在基于该实施方案的一个示例性实现中，在阵列的每个像素的顶部金属层304的ISFET阵列制造过程中，在ISFET浮动栅结构附近，包括任选的孔或窗302。该窗意在允许紫外线辐射(当产生时)进入ISFET栅区域；具体地，构建如图11和12A-L所示的像素1051的不同层，使得进入窗302的紫外线辐射可以以基本上无阻挡的方式照射到在多晶硅栅164附近的区域和栅氧化物165上。
[0405] 为了促进紫外线照射过程来减少捕获电荷，申请人已经认识到并理解，通常需要在图11A所示的钝化层172中采用除了氮化硅和氮氧化硅以外的材料，因为氮化硅和氮氧化硅会显著吸收紫外线辐射。鉴于前述内容，这些材料需要替换为略微透过紫外线辐射的其它材料，它们的实例包括、但不限于：磷酸硅酸盐玻璃(PSG)和掺杂硼的磷酸硅酸盐玻璃(BPSG)。但是，PSG和BPSG不能透过氢和氢氧离子；因此，为了用于为pH灵敏度设计的ISFET的钝化层中，PSG和BPSG可以与离子不能透过的而显著透过紫外线辐射的材料诸如氧化铝(Al2O3)一起使用，以形成钝化层。例如，再次参考图11A，PSG或BPSG可以用作钝化层172的第一部分172A中的氮化硅或氮氧化硅的替代物，且氧化铝薄层(例如，400-600埃)可以用于钝化层172的第二部分172B(例如，使用CMOS后腾空(lift-off)刻制(lithography)工艺可以沉积氧化铝)。
[0406] 在包含紫外线照射的实施方案的另一个方面，在紫外线照射过程中，必须适当偏压传感器阵列的每个ISFET，以促进捕获电荷的减少。具体地，来自紫外线照射的高能光子(碰撞到在其中形成ISFET传导通道的主体硅区域160)建立电子-空穴对，其促进随着电流流过ISFET传导通道时栅氧化物中的捕获电荷的中和。为此目的，下面关于图17进一步讨论的阵列控制器产生适当的信号，用于在紫外线照射过程中偏压阵列的ISFET。具体地，再次参考图9，产生每一个信号 至 从而同时实现/选择(即，开启)传感器阵列的所有行，并由此将阵列的所有ISFET偶联至每列中的各个可控制的电流源106j。在同时选择每列的所有像素后，该列的所有像素共有来自给定列的电流源106j的电流。通过去除偏压电压VB4，使列放大器107A和107B不启动，并在同时，连接到给定列的每个ISFET的排出装置上的放大器107B的输出通过响应于控制信号“UV”的开关接地。另外，阵列的所有ISFET的共同主体电压VBODY偶联至电地线(即，VBODY＝0伏特)(如上面所讨论的，在阵列的正常运行期间，主体偏压电压VBODY偶联至阵列可利用的最高压电势，例如，VDDA)。在一个示例性的操作中，将所有可控制的电流源106j的偏压电压VB1设置成，使得每个像素的ISFET传导大约1μA的电流。利用如此偏压的ISFET阵列，然后用足够剂量的紫外线辐射辐照阵列(例如，来自EPROM擦除器，其在离阵列大约1英寸的距离产生大约20毫瓦/
2
cm 的辐射，持续大约1小时)。辐照后，可以使阵列休息和稳定化几小时，然后用于测量化学性质诸如离子浓度。
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cm 的辐射，持续大约1小时)。辐照后，可以使阵列休息和稳定化几小时，然后用于测量化学性质诸如离子浓度。
[0407] 利用至少一种上述的减少捕获电荷的技术，我们已经能够制造具有零或基本上零捕获电荷的FET浮动栅。因而，在有些实施方案中，本发明的一个方面包括这样的浮动栅，2 2
其具有约4μm 至约50μm 表面积，具有基线阈值电压，且优选地具有零或基本上零捕获电荷。优选地，所述FET是chemFET。捕获电荷应当保持在不会造成阵列中的FET与FET之间的可察觉变化的水平，因为这会限制该装置的动态范围、测量一致性和以其它方式不利地影响性能。
其具有约4μm 至约50μm 表面积，具有基线阈值电压，且优选地具有零或基本上零捕获电荷。优选地，所述FET是chemFET。捕获电荷应当保持在不会造成阵列中的FET与FET之间的可察觉变化的水平，因为这会限制该装置的动态范围、测量一致性和以其它方式不利地影响性能。
[0408] 图13解释了根据本公开内容的一个实施方案的ISFET传感器阵列100的一种示例性CMOS IC芯片实现的方框图，所述ISFET传感器阵列100基于上面关于图9-12所讨论的列和像素设计。在该实施方案的一个方面，阵列100包括512列1021至102512，它们具有对应的列偏压/读出电路1101至110512(每列一个，如图9所示)，其中每个列包括512个几何学上正方形的像素1051至105512，它们各自具有大约9微米x 9微米的尺寸(即，该阵列是512列x 512行)。在另一个方面，整个阵列(包括像素以及有关的行和列选择电路和列偏压/读出电路)可以制造在半导体管芯上，作为具有大约7毫米x7毫米尺寸的用途特异性的集成电路(ASIC)。尽管在图13的实施方案中显示了512x 512像素的阵列，应当理解，根据其它实施方案，可以用不同数目的行和列和不同的像素尺寸来实现阵列，如下面关于图19-23进一步讨论的。
[0409] 另外，如上面所讨论的，应当理解，根据常规CMOS制造技术以及改进的CMOS制造技术(例如，为了促进本文讨论的chemFET阵列的不同功能方面的实现，诸如钝化材料的额外沉积、减少捕获电荷的工艺步骤等)和除了在CMOS制造中常规采用的那些以外的其它半导体制造技术，可以制造根据本发明不同实施方案的阵列。另外，不同的刻制技术可以用作阵列制造工艺的一部分。例如，在一个示例性实现中，可以采用刻制技术，其中通过使步骤(step)边缘与在晶片基质上的重复刻制暴露重叠大约0.2微米，将适当设计的块“缝”在一起。在单个暴露中，最大管芯尺寸通常是大约21毫米x 21毫米。通过选择性地暴露不同的块(侧面、顶面和底面、中心等)，可以将非常大的芯片界定在晶片上(极限达到每个晶片一个芯片的最大值，通常称作“晶片比例集成”)。
[0410] 在图13所示的阵列100的一个方面，前2列和最后2列1021、1022、102511和102512以及列1023至102510中每一列的前2个像素1051和1052和最后2个像素105511和105512(例如，围绕在阵列周边的2行和2列像素)可以构建成“参照”或“假”像素103。参考图11A，对于阵列的假像素，每个假像素的ISFET的最顶部金属层304(最终偶联至ISFET多晶硅栅164)被连接到其它假像素的相同金属层上，且可作为芯片的末端来接近，其又可以偶联至参照电压VREF。如上面关于图9所讨论的，参照电压VREF也可以施加于阵列的各个列的偏压/读出电路。在下面进一步讨论的某些示例性实现中，可以从阵列获取初步实验/评价数据，这基于施加参照电压VREF、和选择和读出假像素和/或读出列，基于将VREF直接施加于各个列缓冲器(例如，通过CAL信号)，以促进偏移距测定(例如，像素-至-像素和列-至-列差异)和阵列校准。
[0411] 在类似于图13所示阵列的阵列的另一个实现中，不是将512列的前2列和最后2列以及每列512个像素的前2个像素和最后2个像素保留为参照像素，可以制造这样的阵列，其包括额外的2行/列参照像素，它们围绕在有效像素的512x 512区域的周边，使得阵列的总尺寸在实际像素方面是516x 516像素。由于本公开内容预见到不同尺寸和结构的阵列，应当理解，前述概念可以适用于本文讨论的其它阵列实施方案中的任一个。为了在下面即将关于图13所示的示例性阵列100进行讨论的目的，考虑512x 512像素阵列的总像素数。
[0412] 在图13中，阵列运行所需的不同的电源供给和偏压电压(如上面关于图9所讨论的)通过电连接(例如，针、金属垫)提供至阵列，并为了简洁而在块195中标记为“供应和偏压连接”。图13的阵列100也包括行选择移位寄存器192、2组列选择移位寄存器1941，2和2个输出驱动器1981和1982，以提供2个平行的阵列输出信号Vout1和Vout2，它们代表传感器测量(即，由阵列的各个ISFET产生的单个输出信号的集合)。在图13中显示的不同电源供给和偏压电压、行和列移位寄存器的控制信号和列偏压/读出电路的控制信号，由如下面关于图17进一步讨论的阵列控制器提供，其也读出来自阵列100的阵列输出信号Vout1和Vout2(和其它任选的状态/诊断信号)。在图13所示的阵列实施方案的另一个方面，构建阵列，使得通过多个平行的阵列输出信号(例如，Vout1和Vout2)可以同时读出阵列的多个区域(例如，多个列)，会促进数据获取速率增加，如下面关于图17和18进一步讨论的。尽管图13解释了这样的阵列，其具有2列选择寄存器和平行的阵列输出信号Vout1和Vout2，以一次从2列同时获取数据，应当理解，在其它实施方案中，根据本公开内容的阵列可以构造成仅具有一个测量信号输出，或超过2个测量信号输出；具体地，如下面关于图19-23进一步讨论的，根据其它发明实施方案的更密集的阵列可以构造成具有另外4个或更多个平行的测量信号输出，并同时使得阵列的不同区域可以通过4个或更多个输出提供数据。
[0413] 图14解释了行选择移位寄存器192，图15解释了列选择移位寄存器1942之一，图16解释了根据一个示例性实现，图13所示的阵列100的输出驱动器1982之一。如图14和15所示，行和列选择移位寄存器作为一系列D-型触发器(flip-flop)来实现，所述触发器偶联至数字电路正供给电压VDDD和数字供应地线VSSD。在行和列移位寄存器中，将数据信号施加于每个系列中的第一个触发器的D-输入，且同时将时钟信号施加于系列中的所有触发器的时钟输入。对于每个触发器，“Q”输出再现时钟信号跃迁(例如，下降缘)后的D-输入状态。参考图14，行选择移位寄存器192包括512D-型触发器，其中第一个触发器193接收垂直数据信号DV，且所有触发器接收垂直时钟信号CV。第一个触发器193的“Q”输出提供了第一行选择信号RowSel1，且偶联至系列中的下一个触发器的D-输入。连续触发器的Q输出偶联至系列中的下一个触发器的D-输入，并提供行选择信号RowSel2至RowSel512，其具有垂直时钟信号CV的连续下降缘跃迁，如下面关于图18进一步讨论的。最后的行选择信号RowSel512也可以用作阵列100的任选输出，作为信号LSTV(最后阶段垂直，Last STage Vertical)，其提供阵列的最后一行已经被选择的指示(例如，对于诊断目的)。尽管没有在图14中明确显示，将行选择信号RowSel1至RowSel512中的每一个施加于对应的逆变器，它们的输出被用于实现每列中的给定像素(如图9中信号 至 所
示)。
示)。
[0414] 关于列选择移位寄存器1941和1942，它们以类似于行选择移位寄存器的方式来实现，其中每列选择移位寄存器包含256个串联的触发器，并负责实现读出阵列的奇数列或阵列的偶数列。例如，图15解释了列选择移位寄存器1942，其构建成实现阵列所有偶数列的连续读出，这通过列选择信号ColSel2、ColSel4、....ColSel512来实现，而另一个列选择移位寄存器1941构建成实现阵列所有奇数列的连续读出(通过列选择信号ColSel1、ColSel3、....Col Sel511)。两个列选择移位寄存器同时由水平数据信号DH和水平时钟信号CH控制，以提供各个列选择信号，如下面关于图18进一步讨论的。如图15所示，最后一个列选择信号ColSel512也可以用作阵列100的任选输出，作为信号LSTH(最后阶段水平，Last STage Horizontal)，其提供阵列的最后一列已经被选择的指示(例如，对于诊断目的)。
[0415] 现在再次参考图7，申请人已经认识到并理解，基于移位寄存器实现阵列行和列选择，如上面关于图13-15所讨论的，是对在不同现有技术ISFET阵列设计(包括图7所示的Milgrew等人的设计)中采用的行和列解码器方案的重大改进。具体地，关于图7所示的行解码器92和列解码器94，在集成电路阵列设计中实现这些组件的复杂性，会随着阵列尺寸的增加而急剧增加，因为两种解码器需要额外的输入。例如，如上面关于图13所讨论的具9
有512行和列的阵列，每个行和列解码器需要9个输入(2 ＝512)，如果这样的线路图用于行和列选择；类似地，如下面关于其它实施方案所讨论的具有7400行和7400列的阵列，每
13
个行和列解码器需要13个输入(2 ＝8192)。相反，图14和15所示的行和列选择移位寄存器不需要额外的输入信号(随着阵列尺寸增加)，但是需要额外的D-型触发器(其常规地在CMOS工艺中实现)。因而，在图14和15中所示的移位寄存器实现会为阵列行和列选择提供更容易放大的解决方案。
有512行和列的阵列，每个行和列解码器需要9个输入(2 ＝512)，如果这样的线路图用于行和列选择；类似地，如下面关于其它实施方案所讨论的具有7400行和7400列的阵列，每
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个行和列解码器需要13个输入(2 ＝8192)。相反，图14和15所示的行和列选择移位寄存器不需要额外的输入信号(随着阵列尺寸增加)，但是需要额外的D-型触发器(其常规地在CMOS工艺中实现)。因而，在图14和15中所示的移位寄存器实现会为阵列行和列选择提供更容易放大的解决方案。
[0416] 在图13的实施方案中，“奇数”列选择移位寄存器1941将奇数列选择信号提供给“奇数”输出驱动器1981，且偶数列选择移位寄存器1942将偶数列选择信号提供给“偶数”输出驱动器1982。同样地构建两个输出驱动器，且偶数输出驱动器1982的一个实例如图16所示。具体地，图16表明，将各个偶数列输出信号VCOL2、VCOL4、...VCOL512(关于一般列信号输出VCOLj，参见图9)施加于对应的开关1912、1914、...191512，它们响应于由列选择寄存器1942提供的偶数列选择信号ColSel2、ColSel4、....ColSel512，以通过总线175将偶数列输出信号连续偶联至缓冲放大器199(BUF)的输入。在图16中，缓冲放大器199接收来自输出缓冲器正供给电压VDDO和输出缓冲器供应地线VSSO的功率，且响应于输出缓冲器偏压电压VBO0，以设定缓冲器输出的对应偏压电流。鉴于缓冲放大器199的高阻抗输入，将响应于偏压电压VB3的电流吸收器197偶联至总线175，以提供适当的驱动电流(例如，大约100μA的量级)，用于选择的列的列输出缓冲器的输出(参见图9的缓冲放大器111j)。缓冲放大器199提供输出信号Vout2，其基于阵列的选择的偶数列；同时，参考图13，“奇数”输出驱动器1981的对应缓冲放大器提供输出信号Vout1，其基于阵列的选择的奇数列。
[0417] 在一个示例性实现中，偶数和奇数输出驱动器1981和1982的开关(例如，图16所示的开关1912、1914、....191512)可以作为CMOS-对传输门(包括n-通道MOSFET和p-通道MOSFET；参见图4)来实现，且可以采用逆变器，使得每个列选择信号及其补码可以施加于给定传输门开关191，以实现开关。每个开关191在实现或“打开”时具有串联电阻(series resistance)，以将对应的列输出信号偶联至总线175；同样地，当开关关闭时，每个开关添加电容到总线175上。更大的开关减少串联电阻，并允许总线175的更高的驱动电流，这通常允许总线175更快速地稳定(settle)；另一方面，当开关关闭时，更大的开关会增加总线175的电容，这又增加总线175的稳定时间。因此，在与开关大小有关的开关串联电阻和电容之间存在权衡。
[0418] 在实现连续开关后，总线175的快速稳定的能力，又促进从阵列快速获取数据。为此目的，在某些实施方案中，特别地构建输出驱动器1981和1982的开关191，以显著减少总线175的稳定时间。给定开关的n-通道和p-通道MOSFET添加总线175的电容；但是，n-通道MOSFET通常具有比它们的p-通道对应物更好的频率响应和电流驱动能力。鉴于前述内容，申请人已经认识到并理解，通过实现“不对称”开关，可以采用n-通道MOSFET的一些优良特征来改进总线175的稳定时间，其中给定开关的n-通道MOSFET和p-通道MOSFET的各个尺寸是不同的。
[0419] 例如，在一个实施方案中，参考图16，可以构建电流吸收器197，使得当所有开关1912、1914、....191512是打开或关闭(不传导)时，总线175通常是“断开的”。鉴于基于ISFET测量的列输出信号的稍微有限的预期信号动态范围，当给定开关被实现或打开(传导)时，在许多情况下，大多数传导通过构成开关的CMOS-对的n-通道MOSFET来实现。因此，在该实施方案的一个方面，每个开关191的n-通道MOSFET和p-通道MOSFET的大小是不同的；即在一个示例性实现中，n-通道MOSFET的大小显著大于p-通道MOSFET。更具体地，考虑同样大小的n-通道和p-通道MOSFET作为参照点，在一个实现中，n-通道MOSFET可以增大至约2-2.5倍大，且p-通道MOSFET的尺寸可以减小至约8-10倍小，使得n-通道MOSFET是p-通道MOSFET的约20倍。由于p-通道MOSFET的尺寸的显著减小和n-通道
MOSFET的尺寸的相对适当增大，开关在关闭状态时的总电容显著减小，总线175的电容相应地显著减小；同时，由于更大的n-通道MOSFET，开关的电流驱动能力、频率响应和跨导都显著增加，这又导致总线175的稳定时间的显著减少。
MOSFET的尺寸的相对适当增大，开关在关闭状态时的总电容显著减小，总线175的电容相应地显著减小；同时，由于更大的n-通道MOSFET，开关的电流驱动能力、频率响应和跨导都显著增加，这又导致总线175的稳定时间的显著减少。
[0420] 尽管上面的实例描述了输出驱动器1981和1982的不对称开关191，其中n-通道MOSFET大于p-通道MOSFET，应当理解，在另一个实施方案中，可以实现颠倒，即其中p-通道MOSFET大于n-通道MOSFET的不对称开关。在该实施方案的一个方面，再次参考图16，电流吸收器197可以备选地用作电流源，以适当驱动选择的列的列输出缓冲器的输出(参见图9的缓冲放大器111j)，且构建成，当所有开关1912、1914、....191512打开或关闭(不传导)时，总线175通常是“合上的”。在该情况下，大多数开关传导可以通过构成开关的CMOS-对的p-通道MOSFET来实现。在该实施方案中可以实现减小的开关电容(和因而减小的总线电容)的益处，尽管总线175的稳定时间减小的总有益效果可能稍微小于前面上文所述的效果，这是由于p-通道MOSFET与n-通道MOSFET相比更低的频率响应。尽管如此，基于更大的p-通道MOSFET的不对称开关仍然可以促进总线稳定时间的显著减少，且也可以提供这样的电路实现，其中列输出缓冲放大器(图9的111j)可以是主体连接的(body-tied)源输出器，具有略微增加的增益。
[0421] 在图16所示的涉及促进总线175的快速稳定的另一个实施方案中，可以理解，偶联至总线175上的更少的开关191导致更小的总线电容。记住这一点，并再次参考图13，在另一个实施方案中，可以在ISFET阵列100中采用超过2个输出驱动器1981和1982，使得每个输出驱动器处理阵列的更小数目的列。例如，不是用一个驱动器处理所有偶数列并用另一个驱动器处理所有奇数列，而是阵列可以包括4个列选择寄存器1941，2，3，4和4个对应的输出驱动器1981，2，3，4，使得每个输出驱动器处理阵列总列的1/4，而不是列的1/2。在这样的实现中，与上面关于图16所讨论的实施方案相比，每个输出驱动器因此具有半数开关191，且每个输出驱动器的总线175具有对应的更低的电容，由此提高总线稳定时间。尽管为了在该实施例中解释的目的讨论了4个输出驱动器，应当理解，本公开内容在这方面不受限制，且实际上可以采用大于2个的任意数目的输出驱动器，以改进上述方案中的总线稳定时间。下面更详细地讨论了其它阵列实施方案，其中采用超过2个输出驱动器来促进从阵列快速获取数据(例如，关于图19-23)。
[0422] 为了解释目的，在上面刚刚讨论的任意实施方案中，总线175可以具有在大约5pF至20pF范围内的电容(例如对称开关、不对称开关、更大数目的输出驱动器等)。当然，应当理解，总线175的电容不限于这些示例值，且其它电容值在根据本公开内容的阵列的不同实现中是可能的。
[0423] 在上面关于图13-16所讨论的阵列设计的一个方面，在阵列上提供单独的模拟供给电压连接(对于VDDA、VSSA)、数字供给电压连接(对于VDDD、VSSD)和输出缓冲供给电压连接(对于VDDO、VSSO)，以促进噪音分离和减小不同阵列组件之间的信号串扰，由此增加输出信号Vout1和Vout2的信噪比(SNR)。在一个示例性实现中，正供给电压VDDA、VDDD和VDDO各自可以是大约3.3伏特。在另一个方面，这些电压各自可以由一个或多个可编程的电压源提供“关闭芯片”，如下面关于图17进一步讨论的。
[0424] 图17解释了根据本公开内容的一个发明实施方案，与阵列控制器250偶联的图13的传感器阵列100的方框图。在不同示例性实现中，阵列控制器250可以制造成“单独站立”控制器，或计算机260的一个或多个计算机兼容的“卡”形成部分，如上面关于图8所讨论的。在一个方面，阵列控制器250的功能可以由计算机260通过界面块252(例如，串行接口、通过USB口或PCI总线、以太网连接等)来控制，如图17所示。在一个实施方案中，将阵列控制器250的全部或部分制造成一个或多个印制电路板，且将阵列100构建成插入印制电路板之一中，类似于常规IC芯片(例如，将阵列100构建为ASIC，其插入印制电路板的芯片插座，诸如零插入力的或“ZIF”插座)。在这种实施方案的一个方面，构建为ASIC的阵列100可以包括一个或多个针/末端连接，其专门提供识别码(在图17中指示为“ID”)，其可以被阵列控制器250访问/读取，和/或传递至计算机260。这样的识别码可以代表阵列100的不同属性(例如，尺寸，像素的数目，输出信号的数目，不同运行参数诸如供应和/或偏压电压等)，且可以被处理，以确定由阵列控制器250提供的对应运行模式、参数和/或信号，以确保许多不同类型的阵列100中的任一个的适当运行。在一个示例性实现中，可以给构建成ASIC的阵列100提供3个针(专用于识别码)，且在制备过程中，可以编码ASIC，以提供在这3个针的每一个处的3种可能的电压状态之一(即，三态的针编码线路图)，其由阵列控制器250读取，由此提供27个独特的阵列识别码。在该实施方案的另一个方面，可以实现阵列控制器250的全部或部分，作为场可编程的门阵列(FPGA)，其构建成执行不同的阵列控制器功能，如下面更详细地描述的。
[0425] 通常，阵列控制器250会为阵列100提供不同的供给电压和偏压电压、以及与行和列选择有关的不同信号、像素输出的取样和数据获取。具体地，阵列控制器250读出一个或多个模拟输出信号(例如，Vout1和Vout2)，包括来自阵列100的多路的各个像素电压信号，然后数字化这些各个像素信号，以将测量数据提供给计算机260，后者又可以储存和/或处理数据。在某些实现中，阵列控制器250也可以构造成执行或促进不同的阵列校准和诊断功能以及任选的阵列紫外线照射处理，如上面关于图11A所讨论的。
[0426] 如图17所示，阵列控制器250通常会给阵列100提供模拟供给电压和地线(VDDA、VSSA)、数字供给电压和地线(VDDD、VSSD)和缓冲器输出供给电压和地线(VDDO、VSSO)。在一个示例性实现中，供给电压VDDA、VDDD和VDDO中的每一个是大约3.3伏特。在另一个实现中，供给电压VDDA、VDDD和VDDO可以低至大约1.8伏特。如上面所讨论的，在一个方面，这些电源供给电压中的每一个通过单独的传导途径提供给阵列100，以促进噪音分离。在另一个方面，这些供给电压可以源自各个电源供给/调节器，或这些供给电压中的一个或多个可以源自阵列控制器250的电源供给258的共同源。电源供给258也可以提供阵列运行所需的不同偏压电压(例如，VB1、VB2、VB3、VB4、VBO0、VBODY)和用于阵列诊断和校准的参照电压VREF。
[0427] 在另一个方面，电源供给258包括一个或多个可以由计算机260控制的数字-至-模拟转换器(DAC)，以允许偏压电压、参照电压和供给电压中的任一个或全部在软件控制下变化(即，可编程的偏压设置)。例如，响应于计算机控制(例如，通过软件执行)的电源供给258可以促进供给电压中的一个或多个的调节(例如，在3.3伏特和1.8伏特之间切换，取决于由识别码表示的芯片类型)和/或偏压电压VB1和VB2(对于像素排出电流)、VB3(对于列总线驱动)、VB4(对于列放大器带宽)和VBO0(对于列输出缓冲器电流驱动)中的一个或多个的调节。在某些方面，可以调节一个或多个偏压电压，以优化来自实现的像素的信号的稳定时间。另外，在任选的制造后紫外线照射处理期间，可以使阵列的所有ISFET的共同主体电压VBODY接地，以减少捕获电荷，然后在阵列的诊断分析、校准和正常运行(用于测量/数据获取)期间偶联至更高的电压(例如，VDDA)。同样地，可以改变参照电压VREF，以促进多种诊断和校准功能。
[0428] 也如图17所示，通常与要通过阵列100测量的分析物溶液一起使用的参比电极76(如上面关于图1所讨论的)，可以偶联至电源供给258，以提供像素输出电压的参考电势。例如，在一个实现中，可以将参比电极76偶联至供应地线(例如，模拟地线VSSA)，以提供基于上面方程(3)的像素输出电压的参照。在其它示例性实现中，可以如下设定参比电极电压：通过将具有已知pH水平的目标溶液/样品放置在传感器阵列100附近，并调节参比电极电压，直到阵列输出信号Vout1和Vout2提供在希望的参照水平的像素电压，以后像素电压偏离该水平的变化会反映相对于已知参照pH水平的局部pH变化。一般而言，应当理解，与参比电极76有关的电压不一定需要与上面讨论的参照电压VREF(其可以用于多种阵列诊断和校准功能)相同，尽管在某些实现中，由电源供给258提供的参照电压VREF可以用于设定参比电极76的电压。
[0429] 关于来自阵列100的数据获取，在一个实施方案中，图17的阵列控制器250可以包括一个或多个前置放大器253，以进一步缓冲一个或多个来自传感器阵列的输出信号(例如，Vout1和Vout2)，并提供可选择的增益。在一个方面，阵列控制器250可以针对每个输出信号包括一个前置放大器(例如，针对2个模拟输出信号的2个前置放大器)。在其它方面，前置放大器可以构造成接收0.0-1.8伏特或0.0-3.3伏特的输入电压，可以具有可编程的/计算机可选择的增益(例如，1、2、5、10和20)和低噪音输出(例如，＜10nV/sqrtHz)，且可以提供低通滤波(例如，5MHz和25MHz的带宽)。关于噪音减少和增加信噪比，在其中将阵列100构建成插入印制电路板(其含有阵列控制器250的全部或部分)的芯片插座中的ASIC的实现中，滤波电容器可以安置在芯片插座附近(例如，ZIF插座的下侧)，以促进噪音减少。在另一个方面，前置放大器可以具有输入和/或输出电压信号的可编程的/计算机可选择的偏移距，以设定至希望的范围的标称水平。
[0430] 图17的阵列控制器250也包含一个或多个模拟-至-数字转换器254(ADC)，以将传感器阵列输出信号Vout1和Vout2转换成数字输出(例如，10-位或12-位)，从而将数据提供给计算机260。在一个方面，可以为传感器阵列的每个模拟输出采用一个ADC，且每个ADC可以偶联至对应的前置放大器的输出(如果在给定实现中采用前置放大器)。在另一个方面，ADC可以具有计算机可选择的输入范围(例如，50mV、200mV、500mV、1V)，以促进与不同范围的阵列输出信号和/或前置放大器参数的相容性。在其它方面，ADC的带宽可以大于60MHz，且数据获取/转换速率大于25MHz(例如，高达100MHz或更大)。
[0431] 在图17的实施方案中，ADC采集时机和阵列行和列选择可以由定时发生器256控制。具体地，定时发生器会提供数字垂直数据和时钟信号(DV、CV)(以控制行选择)、数字水平数据和时钟信号(DH、CH)(以控制列选择)和列取样和保持信号COL SH(以取样实现的行的各个像素电压)，如上面关于图9所讨论的。定时发生器256也为ADC 254提供取样时钟信号CS，从而适当地取样和数字化给定阵列模拟输出信号(例如，Vout1和Vout2)的数据流中的连续像素值，如下面关于图18进一步讨论的。在某些实现中，定时发生器256可以通过微处理器执行代码来实现，并构建为多-通道数字模式发生器，以提供适当定时的控制信号。在一个示例性实现中，定时发生器256可以作为场可编程的门阵列(FPGA)来实现。
[0432] 图18解释了不同阵列控制信号的一种示例性的定时简图，所述信号由定时发生器256提供，以获取来自传感器阵列100的像素数据。为了下面讨论的目的，将“帧”定义为包括阵列中每个像素的值(例如，像素输出信号或电压VS)的数据集，并将“帧率”定义为可以从阵列获取连续帧的速率。因而，帧率基本上对应着阵列中每个像素的“像素取样速率”，因为以该帧率得到任意给定像素的数据。
[0433] 在图18的实例中，选择20帧/秒的示例性帧率来解释阵列的运行(即，行和列选择和信号获取)；但是，应当理解，根据本公开内容的阵列和阵列控制器在这方面不受限制，因为不同的帧率(包括更低的帧率(例如，1-10帧/秒)或更高的帧率(例如，25、30、40、50、60、70-100帧/秒等))是可能的，并且阵列具有相同或更高数目的像素。在某些示例性应用中，可以获取这样的数据集，其包括在几秒内的许多帧，以进行给定一种或多种分析物的实验。几个这样的实验可以连续进行，在某些情况下，其间暂停，以允许数据转移/处理和/或传感器阵列ASIC的清洗和以后实验的试剂准备。
[0434] 例如，关于检测核苷酸掺入的方法(上面关于图8、8A和8B进行了讨论，其中在ISFET上面的反应孔内的核酸合成或测序反应期间，在阵列的给定ISFET像素的输出信号中产生一个或多个离子脉冲)，可以选择适当的帧率，以充分对ISFET的输出信号采样，从而有效地检测一个或多个脉冲的存在和脉冲之间的时间间隔。在一些示例性实现中，可以产生一个或多个离子脉冲，所述脉冲具有大约1秒至大约2.5秒量级的半数最大值全宽度(FWHM)，和大约1至20秒量级的连续脉冲峰之间的时间间隔(如果产生多个脉冲)，这取决于核苷酸掺入事件的数目。给出这些示例值后，20Hz的帧率(或像素取样速率)足以可靠地分辨给定像素的输出信号中的一个或多个脉冲。另外，在该实例中给出的脉冲特征和帧率主要为了解释目的而提供，且在其它实现中可能涉及不同的脉冲特征和帧率。
[0435] 在一个实现中，阵列控制器250控制阵列100来连续实现行，每次一个。例如，现在再次参考图9，通过行选择信号 实现第一行像素。使实现的像素稳定一段时间，然后，简单地建立(assert)COL SH信号，以关闭每列中的样品/保持开关，并通过该列的第一个像素将电压值输出存储在该列的样品/保持电容器Csh上。该电压然后可用作列输出电压VCOLj，其施加于2个(奇数和偶数列)阵列输出驱动器1981和1982之一(例如，参见图16)。然后撤销(deassert)COL SH信号，由此打开每列中的样品/保持开关，并从列放大器107A和107B解偶联列输出缓冲器111j。此后不久，通过行选择信号 实现第
二行像素。在使第二行像素稳定的时间段期间，产生列选择信号，每次2个(一个奇数和一个偶数；奇数列选择信号连续施加于奇数输出驱动器，偶数列选择信号连续施加于偶数输出驱动器)，以读出与第一行有关的列输出电压。因而，在实现并稳定阵列中的给定行的同时，读出前一行，每次2列。通过交错行选择和取样/读出(例如，通过不同的垂直和水平时钟信号和列取样/保持)，和通过一次读出给定行的多列，可以以明显流线化的方式从阵列获取数据帧。
二行像素。在使第二行像素稳定的时间段期间，产生列选择信号，每次2个(一个奇数和一个偶数；奇数列选择信号连续施加于奇数输出驱动器，偶数列选择信号连续施加于偶数输出驱动器)，以读出与第一行有关的列输出电压。因而，在实现并稳定阵列中的给定行的同时，读出前一行，每次2列。通过交错行选择和取样/读出(例如，通过不同的垂直和水平时钟信号和列取样/保持)，和通过一次读出给定行的多列，可以以明显流线化的方式从阵列获取数据帧。
[0436] 图18解释了20帧/秒的示例性帧率的前述过程的定时细节。鉴于该帧率和阵列中的512行，每行必须在大约98微秒内读出，如图18中的垂直描绘所指示的。因此，垂直时钟信号CV具有98微秒的时间段(即，超过10kHz的时钟频率)，在CV信号的后缘(负跃迁)上实现新行。图18的左侧反映了新帧周期的开始，在该时间点，在CV信号的第一个后缘之前建立垂直数据信号DV，并在CV信号的下一个后缘之前撤销(对于来自连续帧的数据获取，仅在实现行512后再次重新建立垂直数据信号)。另外，在紧邻CV信号的每个后缘(即，实现的新行)之前，建立COL SH信号2微秒，在CV信号的后缘之前剩下大约50纳秒。
[0437] 在图18中，COL SH信号的第一次出现实际上是取样阵列的行512的像素值。因而，在CV信号的第一个后缘上，实现第一行，并允许稳定(大约96微秒)直到COL SH信号第二次出现。在第一行的该稳定时间期间，通过列选择信号读出行512的像素值。因为同时产生2个列选择信号来读出512列，水平时钟信号CH必须在该时期产生256个周期，CH信号的每个后缘产生一个奇数和一个偶数列选择信号。如图18所示，给定行的CH信号的第一个后缘在选择行后2微秒定时发生(在COL SH信号失活后)，以允许存储在取样/保留电容器Csh上并由列输出缓冲器提供的电压值稳定。但是，应当理解，在其它实现中(例如，如下面关于图18A所讨论的)，在CH信号的第一个后缘和COL SH信号的后缘(即，失活)之间的时间段可以显著小于2微秒，且在某些情况下，小至刚好超过50纳秒。也对于每行，在CH信号的第一个后缘之前建立水平数据信号DH，并在CH信号的下一个后缘之前撤销。在COL SH信号出现之前，选择最后2列(例如，511和512)，如上面所讨论的，所述出现发生在实现下一行之前大约2微秒。因而，在大约94微秒的时间段内，读出512列，每次2个(即，每行98微秒，减去在每行开始和结尾处的2微秒)。这导致每个阵列输出信号Vout1和Vout2的大约2.7MHz的数据速率。
[0438] 图18A解释了来自阵列100的数据获取过程的另一个定时简图，其从图18的定时简图简单修改而来。如上面关于图13所讨论的，在某些实现中，与图13所示类似的阵列可以构造成包括512x 512“有效”像素的区域，其被参照像素周边围绕(即，阵列的最前和最后2个行和列)，产生具有516x 516像素的总像素数的阵列。因此，鉴于示例性的20帧/秒的帧率和阵列中的516行，每个行必须在大约97微秒内读出，如图18A中的垂直描绘所指示的。因此，垂直时钟信号CV具有97微秒的稍微更小的时间段。因为2列选择信号同时产生以读出516列，水平时钟信号CH必须在该时期内产生258个周期，不同于关于图18所述的256个周期。因此，在图18A所示的一个方面，在离COL SH信号的后缘(即，失活)50纳秒后立即定时发生给定行的CH信号的第一个后缘，从而将额外的水平时钟周期“压缩”成垂直时钟信号CV的稍微更小的时间段。如图18所示，在CH信号的第一个后缘之前建立水平数据信号DH，且这也发生在图18A的定时简图中的稍早时间(相对于图18)。在COL SH信号出现之前选择最后2列(即，列515和516，在图18A中标记为“Ref3，4)，如上面所讨论的，所述出现发生在实现下一行之前大约2微秒。因而，在大约95微秒的时间段内，读出516列，每次2个(即，每行97微秒，减去在每行结尾处的2微秒和在每行开始处的可忽略的时间)。这导致由图18的定时简图提供的每个阵列输出信号Vout1和Vout2基本上相同的数据速率，即大约2.7MHz。
[0439] 如上面关于图17所讨论的，定时发生器256也产生对ADC 254的取样时钟信号CS，从而适当地取样和数字化给定阵列输出信号的数据流中的连续像素值。在一个方面，取样时钟信号CS会提供数据流中的取样给定像素值至少一次。尽管取样时钟信号CS没有在图18和18A的定时简图中显示，可以理解，在示例性实现中，信号CS可以基本上跟踪水平时钟信号CH的定时；具体地，取样时钟信号CS可以与水平时钟信号CH协调，从而在CH即将实现数据流中的下一个像素值之前，造成ADC取样像素值，由此在取样给定像素值之前允许尽可能多的信号稳定时间。例如，ADC可以构造成，在CS的正跃迁之后，取样输入像素值，且CS的各个正跃迁可以由定时发生器256定时在紧邻CH的各个负跃迁之前发生，或在某些情况下，基本上与其同时发生，从而在即将实现数据流中的下一个像素之前取样给定像素。在另一个示例性实现中，通过取样时钟信号CS，定时发生器256可以控制ADC 254，以明显更高的速率取样输出信号Vout1和Vout2，从而为每个像素测量提供多个数字化的样品，它们然后可以进行平均(例如，ADC数据获取速率可以是大约100MHz，以取样2.7MHz阵列输出信号，从而提供多达约35-40个样品/像素测量)。
[0440] 在一个实施方案中，在ADC 254取样并数字化像素值以后，可以将计算机260编程，以处理从阵列100和阵列控制器250得到的像素数据，从而促进高数据获取速率，其在某些情况下可能超过给定阵列输出信号表示的像素电压的足够稳定时间。在图18B中解释了根据本发明的一个实施方案的一种示例性方法的流程图，其可以由计算机260实现，用于加工和校正以高获取速率获得的阵列数据。在该实施方案的不同方面，将计算机260编程为，首先表征给定阵列输出信号的像素电压的足够的稳定时间以及在略微高运行频率的阵列响应，其中使用阵列的参照或“干”输入(例如，没有分析物存在)。该表征形成衍生校正因子的基础，所述校正因子随后应用于在高运行频率且在有待测分析物存在下从阵列得到的数据。
[0441] 关于像素稳定时间，再次参考图16，如上面所讨论的，给定阵列输出信号(例如，图16中的Vout2)包括一系列像素电压值，它们源自列选择开关191的连续运行，以通过总线175将各个列电压VCOLj施加于缓冲放大器199(各个列电压VCOLj又代表ISFET源电压VSj的缓冲形式)。在某些实现中，发现了2个连续像素读数之间的阵列输出信号的电压变化ΔVPIX被表征为下式给出的指数过程
[0442] ΔVPIX(t)＝A(1-e-t/k)， (PP)
[0443] 其中A是2个像素电压值之间的差(VCOLj-VCOLj-1)，且k是与总线175的电容有关的时间常数。图18C和18D解释了给定阵列输出信号Vout中的示例性像素电压(例如，Vout1和Vout2之一)，它显示了随时间而变化的输出信号中的像素-至-像素跃迁，其相对于示例性取样时钟信号CS绘制。在图18C中，取样时钟信号CS具有时段524，且由CS控制的ADC在CS的正跃迁后取样像素电压(如上面所讨论的，在一个实现中，CS和CH具有基本上相同的时段)。图18C指示2个样品525A和525B，在它们之间可以容易地观察到与ΔVPIX(t)相对应的指数电压跃迁522(在电压差A之间)。
[0444] 为了讨论的目的，将像素“稳定时间”tsettle定义为这样的时间t，在此时，ΔVPIX(t)达到这样的值，该值与它的最终值相差等于阵列输出信号的峰值噪音水平的量。如果将阵列输出信号的峰值噪音水平表示为np，则在稳定时间tsettle时的电压由ΔVPIX(tsettle)＝A[1-(np/A)]给出。代入方程(PP)，并计算tsettle，得到
[0445]
[0446] 图18D概念性地解释了具有差异A的2个像素电压之间的单个电压跃迁522的像素稳定时间tsettle(索引数字526)，其中使用具有足够长时间的取样时钟信号CS，从而允许完全稳定。为了提供一些用于解释目的的示例参数，在实现中，表示像素电压跃迁的最大范围的A最大值(例如，在最小值和最大值处的连续像素)是大约250mV的量级。另外，阵列输出信号的峰值噪音水平np取作大约100μV，且时间常数k取作5纳秒。这些值提供了大约40纳秒的示例性稳定时间tsettle。如果阵列输出信号的最大数据速率取作稳定时间tsettle的倒数，40纳秒的稳定时间对应25MHz的最大数据速率。在其它实现中，A可以是20mV的量级，且时间常数k可以是15纳秒的量级，产生大约80纳秒的稳定时间tsettle和12.5MHz的最大数据速率。上面指出的k值通常对应在大约5pF至20pF范围内的总线175的电容。应当理解，前述值主要为了解释目的而提供，本发明的不同实施方案不限于这些示例值；具体地，根据本发明不同实施方案的阵列可以具有不同的像素稳定时间tsettle(例如，在某些情况下，小于40纳秒)。
[0447] 如上所述，在一个实施方案中，可以以超过像素稳定时间所确定的那些的数据速率，从阵列获取像素数据。图18B解释了根据本公开内容的一个发明实施方案的这种方法的流程图。在图18B的方法中，最初为信号CV、CH和CS选择足够缓慢的时钟频率，使得每个阵列输出信号得到的数据速率等于或低于像素稳定时间tsettle的倒数，以允许给定输出信号中的像素至像素的完全稳定的像素电压值。利用这些时钟频率，如图18B的块502所示，然后在没有分析物存在下(或在有参照分析物存在下)获取整个阵列的稳定的像素电压值，以提供阵列的第一个“干的”或参照数据图像。在图18B的块504中，对于构成第一个数据图像的每个像素电压，收集并存储像素的终电压和对应的输出信号数据流中的紧邻在前像素的终电压之间的跃迁值(即，电压差A)。阵列的所有像素的这些跃迁值的集合，会提供第一个跃迁值数据集。
[0448] 随后，在图18B的块506中，增加信号CV、CH和CS的时钟频率，使得每个阵列输出信号得到的数据速率超过像素电压值完全稳定的速率(即，数据速率高于稳定时间tsettle的倒数)。为了讨论的目的，从信号CV、CH和CS的这种时钟频率增加的选择产生的每个阵列输出信号的数据速率，被称作“超速数据速率”。使用与超速数据速率相对应的时钟频率，在没有分析物存在下(或在有相同参照分析物存在下)再得到整个阵列的像素电压值，以提供阵列的第二个“干的”或参照数据图像。在图18B的块508中，计算并存储基于在超速数据速率得到的第二个数据图像的第二个跃迁值数据集，如上面关于第一个数据图像所述的。
[0449] 在图18B的块510中，基于存储在第一个和第二个跃迁值数据集中的值，计算阵列的每个像素的校正因子。例如，可以将每个像素的校正因子计算为它的来自第一个跃迁值数据集的跃迁值与它的来自第二个跃迁值数据集的对应跃迁值之比(例如，可以将来自第一个数据集的跃迁值除以来自第二个数据集的跃迁值，或反之亦然)，以提供校正因子数据集，然后将其存储。如在图18B的块512和514中指出的，该校正因子数据集然后可以用于处理在有实际待测分析物存在下从阵列得到的像素数据，所述阵列以与超速数据速率相对应的时钟频率运行；具体地，在有分析物存在下以超速数据速率从阵列得到的数据可以乘以或除以(在适宜时)校正因子数据集(例如，每个像素乘以或除以相应的校正因子)，以得到校正过的数据，其代表待测的希望的分析物性质(例如，离子浓度)。应当理解，在计算和存储校正因子数据集以后，它可以重复地用于校正在超速数据速率从阵列获得的多个数据帧。
[0450] 除了控制传感器阵列和ADC以外，定时发生器256可以构造成促进不同的阵列校准和诊断功能以及任选的紫外线照射处理。为此目的，定时发生器可以利用信号LSTV(其指示阵列最后一行的选择)和信号LSTH(其指示阵列最后一列的选择)。定时发生器256也可以负责产生CAL信号，其将参照电压VREF施加于列缓冲放大器，并产生UV信号，其在紫外线照射过程中将阵列的所有ISFET的排出装置接地(参见图9)。在不同的校准和诊断功能或紫外线照射期间，定时发生器也可以提供对电源供给258的某种控制功能，以适当控制供给或偏压电压；例如，在紫外线照射期间，定时发生器可以控制电源供给，以将主体电压VBODY偶联至地线，同时活化UV信号，以将ISFET排出装置接地。关于阵列校准和诊断以及紫外线照射，在某些实现中，定时发生器可以接收来自计算机260的专门化的程序，以提供适当的控制信号。在一个方面，计算机260可以使用从阵列的参照和/或假像素得到的不同数据，以及基于CAL信号和参照电压VREF的应用的列信息，以确定与给定阵列有关的不同校准参数，和/或产生用于校准和诊断功能的专门化的程序。
[0451] 关于阵列控制器250的计算机界面252，在一个示例性实现中，将界面构建成促进大约200MB/秒的向计算机260的数据速率，且可以包括高达400MB或更大的局部存储。将计算机260构建成以200MB/秒的速率接收数据，并处理数据，从而重建像素的图像(例如，其可以以伪彩色显示在显示器上)。例如，计算机可以构造成执行用C++或Visual Basic常规书写的一般目的程序，以操作数据和显示(根据需要)。
[0452] 当用于测序时，本文所述的系统通常包含chemFET阵列支持反应室，所述chemFET偶联至能执行逻辑的界面，所述逻辑将来自chemFET的信号转化成测序信息。
[0453] 在有些实施方案中，本发明包括用于聚合物测序的逻辑(优选地，计算机可执行的逻辑)，其包含用于测定离子脉冲的逻辑，所述离子脉冲与PPi或dNTP或二者的离子相互作用有关。典型地，所述逻辑将离子脉冲特征转化成聚合物测序信息。
[0454] 在有些实施方案中，本发明包括这样的逻辑(优选地，计算机可执行的逻辑)，其包含用于测定核酸模板序列的逻辑，这基于离子脉冲之间的时间或单个离子脉冲的特征。所述逻辑可以任选地另外包含用于测定chemFET阵列上的离子脉冲的空间位置的逻辑。
[0455] 在有些实施方案中，本发明包括这样的逻辑(优选地，计算机可执行的逻辑)，其包含用于测定核酸模板序列的逻辑，这基于在测序反应中使用特定dNTP的持续时间。典型地，所述逻辑接收来自一个或多个chemFET的信号。优选地，所述序列基本上实时地显示。
[0456] 在有些实施方案中，本发明包括这样的逻辑(优选地，计算机可执行的逻辑)，其用于处理来自chemFET阵列的离子脉冲，以测定目标聚合物的序列。所述逻辑可以任选地另外包含用于文件管理、文件存储和显示的逻辑。所述逻辑还可以任选地另外包含用于将离子脉冲转化成核苷酸序列的逻辑。优选地，所述序列基本上实时地显示。
[0457] 可以将来自系统的测序信息递送至手持式计算装置，诸如个人数字助理。因而，在一个实施方案中，本发明包括这样的逻辑，其将生物体的整个基因组显示在手持式计算装置上。本发明也包括这样的逻辑，其适合将来自chemFET阵列的数据发送至手持式计算装置。任意这样的逻辑可以由计算机实现。
[0458] 已经讨论了根据本公开内容的示例性ISFET阵列和阵列控制器的几个方面，图19-23的方框图解释了根据其它发明实施方案，具有更大数目像素的ISFET传感器阵列的替代性CMOS IC芯片实现。在一个方面，下面关于图19-23进一步讨论的每个ISFET阵列可以由类似于图17所示的阵列控制器来控制，在某些情况下，经过微小改进，以积累更高数目的像素(例如，额外的前置放大器253和模拟-至-数字转换器254)。
[0459] 图19的方框图解释了根据一个发明实施方案，基于上面关于图9-12讨论的列和像素设计和0.35微米CMOS制造工艺的ISFET传感器阵列100A。阵列100A包括2048列1021至1022048，其中每个列包括2048个几何学上正方形的像素1051至1052048，每个像素具有大约9微米x 9微米的尺寸。因而，所述阵列包括超过400万像素(＞4兆-像素)，且在一个示例性实现中，整个阵列(ISFET像素和有关的电路)可以制造成集成电路芯片，其具有大约20.5毫米x 20.5毫米的尺寸。
[0460] 在图19所示的实施方案的一个方面，阵列100A可至少部分地构建成多个像素组，它们可以分别控制。例如，每列像素可以分成上一半和下一半，在列的各个上一半中的像素的集合形成行的第一组4001(例如，上组，行1-1024)，且在列的各个下一半中的像素的集合形成行的第二组4002(例如，下组，行1025-2048)。行的第一组和第二组(例如，上组和下组)各自又与对应的行选择寄存器、列偏压/读出电路、列选择寄存器和输出驱动器相关。以此方式，来自行的第一组和第二组4001和4002中的每一个的像素选择和数据获取基本上类似于来自图13所示的整个阵列100的像素选择和数据获取；换而言之，在一个方面，图
19的阵列100A基本上包含不同像素组的2个同时控制的“子阵列”，以提供来自更高数目像素的明显流线化的数据获取。
19的阵列100A基本上包含不同像素组的2个同时控制的“子阵列”，以提供来自更高数目像素的明显流线化的数据获取。
[0461] 具体地，图19表明，行的第一组4001的行选择可以由第一个行选择寄存器1921控制，且行的第二组4002的行选择可以由第二个行选择寄存器1922控制。在一个方面，行选择寄存器1921和1922中的每一个可以构建成如上面关于图14所讨论的，以接收垂直时钟(CV)和垂直数据(DV)信号，并响应性地产生行选择信号；例如第一个行选择寄存器1921可以产生信号 至 且第二个行选择寄存器1922可以产生信号 至在另一个方面，两个行选择寄存器1921和1922可以同时接收共同的垂直时钟和
数据信号，使得在任意给定的时间实现阵列的2个行，一个来自上组，另一个来自下组。
数据信号，使得在任意给定的时间实现阵列的2个行，一个来自上组，另一个来自下组。
[0462] 对于行的第一组和第二组的每一个，图19的阵列100A另外包含列偏压/读出电路1101T-1102048T(对于第一行组4001)和1101B-1102048B(对于第二行组4002)，使得每个列包括图9所示的偏压/读出电路110j的2个情况。阵列100A也包含第二行组4002的2个列选择寄存器1921，2(奇数和偶数)和2个输出驱动器1981，2(奇数和偶数)，和第一行组4001的2个列选择寄存器1923，4(奇数和偶数)和2个输出驱动器1983，4(奇数和偶数)(即，共
4个列选择寄存器和4个输出驱动器)。列选择寄存器接收水平时钟信号(对于第一行组和第二行组，分别是CHT和CHB)和水平数据信号(对于第一行组和第二行组，分别是DHT和DHB)，以控制奇数和偶数列选择。在一个实现中，CHT和CHB信号可以提供为普通信号，且DHT和DHB可以提供为普通信号，以一次同时读出阵列的4个列(即，来自每个行组的一个奇数列和一个偶数列)；具体地，如上面关于图13-18所讨论的，对于每个实现的行，2个列可以同时读出，并将对应的像素电压提供为2个输出信号。因而，通过在任意给定时间的
2个行的实现和在任意给定时间的每行2个列的读出，阵列100A可以提供4个同时的输出信号Vout1、Vout2、Vout3和Vout4。
4个列选择寄存器和4个输出驱动器)。列选择寄存器接收水平时钟信号(对于第一行组和第二行组，分别是CHT和CHB)和水平数据信号(对于第一行组和第二行组，分别是DHT和DHB)，以控制奇数和偶数列选择。在一个实现中，CHT和CHB信号可以提供为普通信号，且DHT和DHB可以提供为普通信号，以一次同时读出阵列的4个列(即，来自每个行组的一个奇数列和一个偶数列)；具体地，如上面关于图13-18所讨论的，对于每个实现的行，2个列可以同时读出，并将对应的像素电压提供为2个输出信号。因而，通过在任意给定时间的
2个行的实现和在任意给定时间的每行2个列的读出，阵列100A可以提供4个同时的输出信号Vout1、Vout2、Vout3和Vout4。
[0463] 在图19的阵列100A的一个示例性实现中，其中以20帧/秒的帧率获取完整的数据帧(所有像素来自第一和第二行组4001和4002)，连续使1024对的行实现各自大约49微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约45微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出1024个像素(在每个行的开始和结束处允许2微秒，如上面关于图18所讨论的)。因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1、Vout2、Vout3和Vout4中的每一个具有大约23MHz的数据速率。另外，应当理解，在其它实现中，可以以除了20帧/秒以外的帧率(例如，50-100帧/秒)，从图19的阵列100A获得数据。
[0464] 象图13的阵列100一样，在其它方面，图19的阵列100A可以包括围绕在阵列周边的假或参照像素103的多个行和列，以促进初步实验/评价数据、偏移距测定和/或阵列校准。另外，以类似于上面关于图13所讨论的方式，将阵列运行所需要的不同的电源供给和偏压电压(如上面关于图9所讨论的)提供给块195中的阵列100A。
[0465] 图20的方框图解释了根据另一个发明实施方案，基于0.35微米CMOS制造工艺且具有基本上类似于上面在图19讨论的阵列100A的结构的ISFET传感器阵列100B。尽管阵列100B也通常基于上面关于图9-12所讨论的列和像素设计，阵列100B中的像素尺寸/间距小于图10所示的像素。具体地，再次参考图10和11，图10所示的尺寸“e”比图20的实施方案大幅减小(从大约9微米减小至大约5微米)，且不影响安置在像素中心区域的有效像素组件的完整性；类似地，图10所示的尺寸“f”从大约7微米减小至大约4微米。换而言之，围绕在有效组件周围的一些周边像素区域在关于图10给出的尺寸方面大幅减小，且不干扰图10和11所示的像素有效组件的顶视图和横截面布局和设计。这样的像素105A的顶视图如图20A所示，其中尺寸“e”是5.1微米，且尺寸“f”是4.1微米。在该像素设计的一个方面，为了促进尺寸缩小，在像素105A中包括比图10所示的像素更少的主体连接B(例如，在每个像素角落各一个)，其包括围绕在整个像素周边的几个主体连接B。
[0466] 如在图20中所指出的，阵列100B包括1348个列1021至1021348，其中每个列包括1152个几何学上正方形的像素105A1至105A1152，每个像素具有大约5微米x 5微米的尺寸。
因而，所述阵列包括超过150万个像素(＞1.5兆-像素)，且在一个示例性实现中，整个阵列(ISFET像素和有关的电路)可以制造成集成电路芯片，其具有大约9毫米x 9毫米的尺寸。象图19的阵列100A一样，在一个方面，将图20的阵列100B分成行的2个组4001和
4002，如上面关于图19所讨论的。在一个示例性实现中，可以以50帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现576对的行各自大约35微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约31微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出674个像素(在每个行的开始和结束处允许2微秒，如上面关于图18所讨论的)。因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1、Vout2、Vout3和Vout4中的每一个具有大约22MHz的数据速率。另外，应当理解，在其它实现中，可以以除了50帧/秒以外的帧率，从图20的阵列100B获得数据。
因而，所述阵列包括超过150万个像素(＞1.5兆-像素)，且在一个示例性实现中，整个阵列(ISFET像素和有关的电路)可以制造成集成电路芯片，其具有大约9毫米x 9毫米的尺寸。象图19的阵列100A一样，在一个方面，将图20的阵列100B分成行的2个组4001和
4002，如上面关于图19所讨论的。在一个示例性实现中，可以以50帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现576对的行各自大约35微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约31微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出674个像素(在每个行的开始和结束处允许2微秒，如上面关于图18所讨论的)。因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1、Vout2、Vout3和Vout4中的每一个具有大约22MHz的数据速率。另外，应当理解，在其它实现中，可以以除了50帧/秒以外的帧率，从图20的阵列100B获得数据。
[0467] 图21的方框图解释了根据另一个实施方案，基于0.35微米CMOS制造工艺且具有上面关于图20和20A讨论的更小的像素尺寸(5.1平方微米像素)的ISFET传感器阵列100C。如在图21中所指出的，阵列100C包括4000个列1021至1024000，其中每个列包括3600个几何学上正方形的像素105A1至105A3600，每个像素具有大约5微米x 5微米的尺寸。因而，所述阵列包括超过1400万个像素(＞14兆-像素)，且在一个示例性实现中，整个阵列(ISFET像素和有关的电路)可以制造成集成电路芯片，其具有大约22毫米x 22毫米的尺寸。象图19和20的阵列100A和100B一样，在一个方面，将图21的阵列100C分成行的2个组4001和4002。但是，不同于阵列100A和100B，对于每个行组，阵列100C包括16个列选择寄存器和16个输出驱动器，以在实现的行中一次同时读出16个像素，所以可以从阵列
100C提供32个输出信号Vout1-Vout32。在一个示例性实现中，可以以50帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现1800对的行各自大约11微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约7微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出250个像素(4000/16)(在每个行的开始和结束处允许2微秒)。
因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1-Vout32中的每一个具有大约35MHz的数据速率。
与前面的实施方案一样，应当理解，在其它实现中，可以以除了50帧/秒以外的帧率，从阵列100C获得数据。
100C提供32个输出信号Vout1-Vout32。在一个示例性实现中，可以以50帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现1800对的行各自大约11微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约7微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出250个像素(4000/16)(在每个行的开始和结束处允许2微秒)。
因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1-Vout32中的每一个具有大约35MHz的数据速率。
与前面的实施方案一样，应当理解，在其它实现中，可以以除了50帧/秒以外的帧率，从阵列100C获得数据。
[0468] 尽管上面关于图13-21讨论的示例性阵列基于0.35微米常规CMOS制造工艺，应当理解，根据本公开内容的阵列在这方面不受限制，因为可以采用具有小于0.35微米的特征尺寸的CMOS制造工艺(例如，0.18微米CMOS加工技术)来制造这种阵列。因此，可以制造像素尺寸/间距明显小于5微米的ISFET传感器阵列，提供明显更密集的ISFET阵列。例如，图22和23的各个方框图解释了根据基于0.18微米CMOS制造工艺的其它实施方案的ISFET传感器阵列100D和100E，其中实现了2.6微米的像素尺寸。像素设计本身基本上基于图20A所示的像素105A，虽然由于0.18微米CMOS工艺在更小的规模上。
[0469] 图22的阵列100D包括2800个列1021至1022800，其中每个列包括2400个几何学上正方形的像素，每个像素具有大约2.6微米x 2.6微米的尺寸。因而，所述阵列包括超过650万个像素(＞6.5兆-像素)，且在一个示例性实现中，整个阵列(ISFET像素和有关的电路)可以制造成集成电路芯片，其具有大约9毫米x 9毫米的尺寸。象图19-21的阵列
100A、100B和100C一样，在一个方面，将图22的阵列100D分成行的2个组4001和4002。
但是，不同于阵列100A、100B和100C，对于每个行组，阵列100D包括8个列选择寄存器和
8个输出驱动器，以在实现的行中一次同时读出8个像素，所以可以从阵列100D提供16个输出信号Vout1-Vout16。在一个示例性实现中，可以以50帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现1200对的行各自大约
16-17微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约14微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出350个像素(2800/8)(在每个行的开始和结束处允许1-2微秒)。因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1-Vout16中的每一个具有大约25MHz的数据速率。与前面的实施方案一样，应当理解，在其它实现中，可以以除了50帧/秒以外的帧率，从阵列100D获得数据。
100A、100B和100C一样，在一个方面，将图22的阵列100D分成行的2个组4001和4002。
但是，不同于阵列100A、100B和100C，对于每个行组，阵列100D包括8个列选择寄存器和
8个输出驱动器，以在实现的行中一次同时读出8个像素，所以可以从阵列100D提供16个输出信号Vout1-Vout16。在一个示例性实现中，可以以50帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现1200对的行各自大约
16-17微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约14微秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出350个像素(2800/8)(在每个行的开始和结束处允许1-2微秒)。因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1-Vout16中的每一个具有大约25MHz的数据速率。与前面的实施方案一样，应当理解，在其它实现中，可以以除了50帧/秒以外的帧率，从阵列100D获得数据。
[0470] 图23的阵列100E包括7400个列1021至1027400，其中每个列包括7400个几何学上正方形的像素，每个像素具有大约2.6微米x 2.6微米的尺寸。因而，所述阵列包括超过5400万个像素(＞54兆-像素)，且在一个示例性实现中，整个阵列(ISFET像素和有关的电路)可以制造成集成电路芯片，其具有大约21毫米x 21毫米的尺寸。象图19-22的阵列100A-100D一样，在一个方面，将图23的阵列100E分成行的2个组4001和4002。但是，不同于阵列100A-100D，对于每个行组，阵列100E包括32个列选择寄存器和32个输出驱动器，以在实现的行中一次同时读出32个像素，所以可以从阵列100E提供64个输出信号Vout1-Vout64。在一个示例性实现中，可以以100帧/秒的帧率获取整个数据帧(来自第一和第二行组4001和4002的所有像素)，由此需要连续实现3700对的行各自大约3微秒的时间段。对于每个实现的行，在大约700纳秒时间内通过每个列选择寄存器/输出驱动器读出230个像素(7400/32)。因而，在该实施例中，阵列输出信号Vout1-Vout64中的每一个具有大约328MHz的数据速率。与前面的实施方案一样，应当理解，在其它实现中，可以以除了100帧/秒以外的帧率，从阵列100D获得数据。
[0471] 因而，在基于本文公开的发明概念的ISFET阵列的不同实施例中，大约九(9)微米的阵列间距(例如，小于10微米x 10微米的传感器表面积)允许在7毫米x 7毫米半导体管芯上制造这样的ISFET阵列，其包括超过256,000个像素(即，512x 512阵列)以及有关的行和列选择和偏压/读出电子器件，并在21毫米x 21毫米管芯上制造类似的传感器阵列，其包括超过400万个像素(即，2048x 2048阵列，超过4兆-像素)。在其它实施例中，大约5微米的阵列间距允许在9毫米x 9毫米管芯上制造这样的ISFET阵列，其包括大约1.55兆-像素(即，1348x 1152阵列)和有关的电子器件，并在22毫米x 20毫米管芯上制造这样的ISFET传感器阵列，其包括超过14兆-像素和有关的电子器件。在其它实现中，使用CMOS制造工艺，其中小于0.35微米的特征尺寸是可能的(例如，0.18微米CMOS加工技术)，可以制造具有明显小于5微米的像素尺寸/间距的ISFET传感器阵列(例如，
2.6微米的阵列间距，或小于8或9微米2的像素/传感器)，提供明显更密集的ISFET阵列。
2.6微米的阵列间距，或小于8或9微米2的像素/传感器)，提供明显更密集的ISFET阵列。
[0472] 在上面讨论的ISFET阵列的实施方案中，阵列像素采用如上面关于图9所讨论的p-通道ISFET。但是，应当理解，根据本公开内容的ISFET阵列在这方面不受限制，且在其它实施方案中，ISFET阵列的像素设计可以基于n-通道ISFET。具体地，上面关于图13和19-23所讨论的任意阵列可以用基于n-通道ISFET的像素来实现。
[0473] 例如，图24解释了根据本公开内容的另一个发明实施方案，用n-通道ISFET和附随的n-通道MOSFET实现的图9的像素设计。更具体地，图24解释了阵列列的一个示例性的像素1051(即，该列的第一个像素)以及列偏压/读出电路110j，其中ISFET 150(Q1)是n-通道ISFET。象图9的像素设计一样，图24的像素设计仅包括3个组件，即ISFET 150和2个n-通道MOSFET开关Q2和Q3，其响应于n行选择信号之一(RowSel1至RowSeln，逻辑高活化)。在图24的像素中不需要传输门，且像素的所有装置属于“相同类型”，即，n-通道装置。也象图9的像素设计一样，操作图24所示的像素1051的3个组件，只需要4根信号线/像素，即线1121、1141、1161和1181。在其它方面，图9和图24的像素设计是类似的，因为它们都构建成具有恒定排出电流IDj和恒定排出-至-源电压VDSj，以从实现的像素获得输出信号VSj。
[0474] 图24的n-通道ISFET像素设计和图9的p-通道ISFET设计的主要差异之一是，流过像素的电流的相反方向。为此目的，在图24中，元件106j是偶联至模拟电路供给电压地线VSSA的可控制的电流吸收器，且偏压/读出电路110j的元件108j是偶联至模拟正供给电压VDDA的可控制的电流源。另外，ISFET 150的主体连接没有连接到它的源，而是连接到阵列的其它ISFET的主体连接，后者又偶联至模拟地线VSSA，如图24所示。
[0475] 除了图9和24所示的像素设计以外(基于恒定ISFET排出电流和恒定ISFET排出装置-源电压)，根据本公开内容的其它发明实施方案，预见到ISFET阵列的替代性像素设计，其基于p-通道ISFET和n-通道ISFET，如图25-27所示。如下面所讨论的，一些替代性像素设计可能需要来自阵列控制器250的额外的和/或修饰的信号，以促进数据获取。
具体地，除了阵列的每个列的取样和保持电容器以外，图25-27所示的像素设计的共同特征包括在每个像素本身内的取样和保持电容器。尽管图25-27的替代性像素设计通常包括比图9和24的像素设计更大数目的组件，像素取样和保持电容器的特征会实现“快照”类型的阵列，其中阵列的所有像素可以同时实现，其取样整个帧，并获取信号，所述信号表示在阵列的各个ISFET附近的一种或多种分析物的测量。在某些用途中，这可以提供更高的数据获取速率和/或提高的信号灵敏度(例如，更高的信噪比)。
具体地，除了阵列的每个列的取样和保持电容器以外，图25-27所示的像素设计的共同特征包括在每个像素本身内的取样和保持电容器。尽管图25-27的替代性像素设计通常包括比图9和24的像素设计更大数目的组件，像素取样和保持电容器的特征会实现“快照”类型的阵列，其中阵列的所有像素可以同时实现，其取样整个帧，并获取信号，所述信号表示在阵列的各个ISFET附近的一种或多种分析物的测量。在某些用途中，这可以提供更高的数据获取速率和/或提高的信号灵敏度(例如，更高的信噪比)。
[0476] 图25解释了单个像素105C和有关的列电路110j的一个这样的替代性设计。像素105C采用n-通道ISFET，其通常基于这样的假定：提供基于反馈放大器(Q4、Q5和Q6)的跨ISFET Q1的恒定电压。具体地，晶体管Q4构成反馈放大器负荷，且放大器电流由偏压电压VB1(由阵列控制器提供)设定。晶体管Q5是普通门放大器，且晶体管Q6是普通源放大器。另外，反馈放大器的目的是，通过调节由晶体管Q3供给的电流，保持跨ISFET Q1的电压恒定。晶体管Q2限制ISFET Q1可以吸收的最大电流(例如，从而防止过热非常大的像素阵列引起的损害)。该最大电流由偏压电压VB2(也由阵列控制器提供)设定。在图25所示的像素设计的一个方面，通过把偏压电压VB2设定为0伏特和把偏压电压VB1设定为3.3伏特，可以关闭像素105C的电源。以此方式，可以调节供给这种像素的大阵列的功率(打开短时间段，然后由阵列控制器关闭)，以得到离子浓度测量，同时减少阵列的总功率消耗。调节像素的功率也会减少阵列的热消散和分析物溶液的潜在加热，由此也减少来自样品加热的任何潜在有害作用。
[0477] 在图25中，反馈放大器的输出(晶体管Q3的栅)由MOS开关Q7取样，并存储在像素自身内的像素取样和保持电容器Csh上。开关Q7由像素取样和保持信号pSH(由阵列控制器提供给阵列芯片)控制，其同时施加于阵列的所有像素，从而将所有像素的读数同时存储在它们各自的取样和保持电容器上。以此方式，基于图25的像素设计的阵列可以视作“快照”阵列，因为在任意给定的时间取样数据的全帧，而不是取样阵列的连续行。将每个像素值存储在对应的像素取样和保持电容器Csh上以后，每个像素105C(ISFET和反馈放大器)自由地获取另一个pH读数，或它可以被关闭，以节省电源。
[0478] 在图25中，存储在所有像素取样和保持电容器Csh上的像素值通过源输出器Q8施加于列电路110j，每次一行，所述源输出器Q8通过响应于行选择信号(例如，RowSel1)的晶体管Q9来实现。具体地，在选择并稳定行以后，存储在像素取样和保持电容器中的值然后又存储在列取样和保持电容器Csh2上，如通过列取样和保持信号COL SH所实现的，并提供为列输出信号VCOLj。
[0479] 图26解释了根据本公开内容的一个实施方案，单个像素105D和有关的列电路110j的另一个替代性设计。在该实施方案中，将ISFET显示为p-通道装置。在数据获取周期开始时，由信号pSH(像素取样/保持)和pRST(像素复位)控制的CMOS开关被关闭
(这些信号由阵列控制器供给)。这把ISFET(Q1)的源拉向电压VRST。随后，由信号pRST控制的开关被打开，且ISFET Q1的源把像素取样和保持电容器Csh拉向低于由pH设定的水平的阈值。然后打开由信号pSH控制的开关，并通过响应于行选择信号RowSel1的开关的运行，将像素输出值偶联至列电路110j，以提供列输出信号VCOLj。象在图25中所示的实施方案中的像素设计一样，基于像素105D的阵列是“快照”型阵列，因为阵列的所有像素可以同时运行。在一个方面，该设计允许在所有像素上长的同时积分时间，然后高速读出整个数据帧。
(这些信号由阵列控制器供给)。这把ISFET(Q1)的源拉向电压VRST。随后，由信号pRST控制的开关被打开，且ISFET Q1的源把像素取样和保持电容器Csh拉向低于由pH设定的水平的阈值。然后打开由信号pSH控制的开关，并通过响应于行选择信号RowSel1的开关的运行，将像素输出值偶联至列电路110j，以提供列输出信号VCOLj。象在图25中所示的实施方案中的像素设计一样，基于像素105D的阵列是“快照”型阵列，因为阵列的所有像素可以同时运行。在一个方面，该设计允许在所有像素上长的同时积分时间，然后高速读出整个数据帧。
[0480] 图27解释了根据本公开内容的一个实施方案，单个像素105E和有关的列电路110j的另一个替代性设计。在该实施方案中，再次将ISFET显示为p-通道装置。在数据获取周期开始时，暂时关闭由控制信号p1和pRST操作的开关。这会清除存储在取样电容器Csh上的值，并允许电荷存储在ISFET(Q1)上。随后，关闭由信号pSH控制的开关，允许存储在ISFET Q1上的电荷被存储在像素取样和保持电容器Csh上。然后打开由信号pSH控制的开关，并通过响应于行选择信号RowSel1的开关的运行，将像素输出值偶联至列电路110j，以提供列输出信号VCOLj。通过ISFET电容与Csh帽之比，可以提供像素105E中的增益，即，增益＝CQ1/Csh，或通过实现像素多个倍数(即，采取分析物测量的多个样品)并将ISFET输出积累在像素取样和保持电容器Csh上，而不复位电容器(即，增益是积累数目的函数)。
象图25和26的实施方案一样，基于像素105D的阵列是“快照”型阵列，因为阵列的所有像素可以同时运行。
象图25和26的实施方案一样，基于像素105D的阵列是“快照”型阵列，因为阵列的所有像素可以同时运行。
[0481] 离开传感器的讨论，我们现在将解决ISFET阵列与微孔阵列和伴随流体的组合。由于微孔阵列结构的大多数附图仅以横截面显示，或将阵列仅显示为简图中的块，提供图
28A和28B来辅助读者开始想象得到的三维结构的装置。图28A显示了排列在阵列中的一组圆柱形孔2810，而图28B显示了排列在阵列中的一组矩形柱形孔2830。可以看出，孔彼此被形成孔壁的材料2840隔开(分离)。尽管可能制造其它横截面的孔，在某些实施方案中，这样做可能不是有利的。这种微孔阵列安置在上面讨论的ISFET阵列上，每个孔具有一个或多个ISFET。在以后的附图中，当提及微孔阵列时，可以想象这些阵列中的一个。
28A和28B来辅助读者开始想象得到的三维结构的装置。图28A显示了排列在阵列中的一组圆柱形孔2810，而图28B显示了排列在阵列中的一组矩形柱形孔2830。可以看出，孔彼此被形成孔壁的材料2840隔开(分离)。尽管可能制造其它横截面的孔，在某些实施方案中，这样做可能不是有利的。这种微孔阵列安置在上面讨论的ISFET阵列上，每个孔具有一个或多个ISFET。在以后的附图中，当提及微孔阵列时，可以想象这些阵列中的一个。
[0482] 对于多种用途，为了使用上面解释的高密度电子阵列完成感知化学反应或化学试剂的系统，需要向阵列元件(称作“像素”)递送含有待感知的化学或生化组分的技术和装置。在该部分中，将解释示例性的技术和方法，它们用于这些目的，具有希望的特征。
[0483] 由于可能希望系统高速运行，优选地，流体递送系统(在可能的范围内)不会限制总系统的运行速度。
[0484] 因此，不仅需要高速、高-密度的ISFET阵列或对离子浓度或其它化学性质、或化学性质的变化敏感的其它元件，而且需要有关的机理和技术，用于向阵列元件供应在足够小的反应体积中的待评价的样品，从而实质上推进要感知的变量的检测的速度和质量。
[0485] 受试化学样品向阵列元件的递送涉及2个组件和有时3个组件或子系统和有关的方法：(1)试剂的大流体系统和洗液供应和适当的阀门和辅助装置，(2)流动池和(3)在许多用途中，微孔阵列。将讨论这些子系统中的每一个，然而是逆序。
[0486] 如别处所讨论的，对于许多应用，诸如在DNA测序中，希望在半导体传感器阵列上面提供对应的微孔阵列，每个微孔足够小，优选地仅容纳一个DNA-负载的珠子，与之相关联的阵列中的下面的像素将提供对应的输出信号。
[0487] 这样的微孔阵列的使用包含3个制造和准备阶段，各自分别予以讨论：(1)建立微孔阵列以产生芯片，所述芯片具有包含微孔阵列层的涂层；(2)将被涂覆的芯片固定在流体界面上；且在DNA测序的情况下，(3)将DNA-负载的珠子装载进孔中。当然，应当理解，在其它用途中，珠子可能是不必要的，或可以采用具有不同特征的珠子。
[0488] 本文所述的系统可以包括微流体反应室的阵列，所述反应室集成了包含chemFET阵列的半导体。在有些实施方案中，本发明包括这种阵列。所述反应室例如可以形成在玻璃、电介质、光可界定的或可蚀刻的材料中。玻璃材料可以是二氧化硅。
[0489] 优选地，所述阵列包含至少100,000个室。优选地，每个反应室具有长宽比为约1∶1或更小的水平宽度和垂直深度。优选地，反应室之间的间距不超过约10微米。
[0490] 上述阵列也可以提供在用于测序的试剂盒中。因而，在有些实施方案中，本发明包括这样的试剂盒，其包含集成了chemFET阵列的微流体反应室阵列和一种或多种扩增试剂。
[0491] 在有些实施方案中，本发明包括这样的测序装置，其包含叠加在chemFET上面的电介质层，所述电介质层具有在chemFET上面的偏心凹陷。优选地，所述电介质层由二氧化硅制成。
[0492] 微孔制造可以通过多种方式来实现。制造的实际细节可能需要一些实验，并随着可利用的加工能力而变化。
[0493] 一般而言，高密度微孔阵列的制造包含，使用蚀刻工艺，在诸如光刻胶(有机的或无机的)、电介质等材料层上光刻地制造孔阵列结构。制造可以用材料在传感器阵列上完成，或可以单独完成，然后转移到传感器阵列芯片上，将二者组合。但是，不排除光刻以外的技术，只要它们会提供可接受的结果。
[0494] 现在讨论形成微孔阵列的方法的一个实例，开始参考图29。该图图形地描述了芯片布局的一角(即，左下角)的顶视图，其显示了在CMOS管芯2914上的单个ISFET传感器2912的阵列2910。信号线2916和2918用于对阵列进行寻址并读出它的输出。块2920表示如上讨论的一些阵列电子器件，且层2922表示变成微流体结构(流动池，下面更充分地解释)的一部分的壁部分；流动池是这样的结构，其在微孔阵列上面或如果没有微孔结构则直接在传感器表面上面提供流体流动。在半导体加工期间，可以在管芯的表面上形成在图29的左下处的诸如模式2922等模式，以形成ISFET和有关的电路，当电介质已经覆盖管芯的表面时，用作定位传感器像素上面的孔的对准标记(alignment mark)。
[0495] 在形成显示的半导体结构以后，将微孔结构施加于管芯。也就是说，可以在管芯上形成微孔结构，或可以单独形成，然后固定到管芯上，任一个方案都是可接受的。为了在管芯上形成微孔结构，可以使用不同的方法。例如，整个管芯可以旋转涂覆例如负性光刻胶，诸如Microchem的SU-8 2015或正性阻蚀胶(resist)/聚酰亚胺诸如HD Microsystems HD8820，以达到希望的微孔高度。通过在一个或多个层中以预定速率(这可以通过参考文献和生产商手册来找到，或根据经验)旋涂适当的阻蚀胶，可以达到在光刻胶层中的希望的孔高度(例如，在每孔一个像素的实例中，约4-12μm，尽管通常不限于此)。(通常可以根据传感器像素的侧面尺寸来选择孔高度，优选标称的1∶1-1.5∶1长宽比、高度∶宽度或直径。基于信噪比考虑，在尺寸和达到希望的性能水平所需的数据取样速率之间存在关系。因而，在选择给定用途的最佳参数时，存在许多因素)。或者，可以施加多层不同的光刻胶，或可以沉积另一种形式的电介质材料。不同类型的化学气相沉积也可以用于构筑适合在其中形成微孔的材料层。
[0496] 一旦光刻胶层(单数形式“层”也用于包括聚集体中的多层)就位，通过将掩蔽物(例如，铬)放置在阻蚀胶涂覆的管芯上，并将所述阻蚀胶暴露于交联(通常是紫外线)辐射，可以产生单个孔(通常描绘成每孔具有一个或4个ISFET传感器)。暴露于辐射(即，当掩蔽物不阻断辐射时)的所有阻蚀胶变得交联，且作为结果，将形成结合在芯片(管芯)的表面上的永久塑料层。通过在诸如丙二醇甲基乙基醋酸酯(PGMEA)等合适溶剂(即，显影剂)或其它适当溶剂中洗涤芯片，去除未反应的阻蚀胶(即，在未暴露的区域中的阻蚀胶，由于掩蔽物阻断光到达阻蚀胶并阻止交联)。得到的结构界定了微孔阵列的壁。
[0497] 图30显示了与图29所示的管芯部分相对应，每孔一个传感器实施方案的铬掩蔽物3010的一部分的布局实施例。灰色区域3012、3014是阻断紫外线辐射的区域。在灰色区域3012内在图30的左下象限上的白色部分3016中的对准标记，用于对准孔布局和芯片表面上的ISFET传感器。在掩蔽物的右上象限中的圆3014的阵列阻断辐射到达孔区域，以留下未反应的阻蚀胶，它们可以在形成孔时溶解。
[0498] 图31显示了每孔4个传感器实施方案的掩蔽物3020的对应布局。注意，仍使用对准模式3016，且在阵列2910中的单个孔-掩蔽圆3014A的直径现在是图30中的孔3014的2倍，以便每个孔容纳4个传感器，而不是每个孔一个传感器。
[0499] 在将管芯/阻蚀胶暴露于紫外线辐射以后，可以将第二层阻蚀胶涂覆在芯片表面上。通常，该层阻蚀胶可以相对较厚，诸如约400-450μm厚。第二种掩蔽物3210(图32)(其也可以是铬)用于掩蔽在阵列周围的区域3220，以构筑阻蚀胶的环或壁(或盆地，使用该术语的地质学含义)3310，其围绕在基质3312上的传感器的有效阵列周围，如图33所示。在描述的具体实施例中，在阵列的每一侧，在x方向，环比传感器阵列宽150μm，且在每一侧，在y方向，环比传感器阵列宽9μm。在掩蔽物3210上的对准标记(大多数未显示)与在第一层和CMOS芯片本身上的对准标记配对。
[0500] 其它光刻方案可以用于形成微孔阵列，当然，上面仅是一个实例。
[0501] 例如，可以采用不同方案的接触刻制和不同的蚀刻剂和显影剂。有机和无机材料都可以用作在其中形成微孔的层。所述层可以在芯片上蚀刻，所述芯片具有在传感器阵列中的像素结构上面的电介质层，诸如钝化层，或所述层可以分别形成，然后施加于传感器阵列上面。具体选择或方法将取决于诸如阵列尺寸、孔尺寸、可利用的制造设备、可接受的成本等因素。
[0502] 可以在某些实施方案中用于形成微孔层的不同有机材料中，是上述的SU-8型负作用光刻胶、常规的正作用光刻胶和正作用光可界定的聚酰亚胺。各自具有熟悉光刻领域的技术人员熟知的优点和缺点。
[0503] 自然，在生产环境中，改进是适当的。
[0504] 接触刻制具有它的限制，且它可能不是制备最高密度孔的备选制备方法，也就是说，它可能在侧面方向产生比希望的更高的最小间距限度。其它技术，诸如深层紫外线分步重复(deep-UV step-and-repeat)方法，能提供更高分辨率刻制，且可以用于产生小间距和可能更小的孔直径。当然，对于不同的希望的规范(例如，每个芯片的传感器和孔的数目)，不同技术可能证实是最佳的。且实际因素，诸如生产商可利用的制造工艺，可能刺激特定制造方法的使用。尽管讨论了新颖的方法，本发明的不同方面不限于这些新颖方法的使用。
[0505] 优选地，在最终的金属化过程之后，使含有ISFET阵列的CMOS晶片平面化。在氮化硅钝化之前的化学机械电介质平面化是合适的。这将允许在非常平的表面上进行以后的刻制步骤，所述表面不含有后段CMOS形貌。
[0506] 通过利用深层紫外线分步重复刻制系统，可能解决具有优良分辨率、重合度(registration)和重复性的小特征。但是，这些系统的高分辨率和大数值孔径(NA)排除它们具有大的焦点深度。这样，当使用这样的制造系统时，可能必须使用更薄的光可界定的旋涂(spin-on)层(即，1-2μm量级的阻蚀胶，而不是在接触刻制中使用的更厚的层)进行图案转移，然后在底层蚀刻微孔特征。高分辨率刻制然后可以用于制作微孔特征，且可以使用常规的SiO2蚀刻化学法——焊盘(bondpad)区域和然后微孔区域各自一个——具有选择性蚀刻停止；然后可以分别在铝焊盘和氮化硅钝化(等)上进行蚀刻停止。或者，可以采用其它合适的替代图案转移和蚀刻工艺，以提供无机材料的微孔。
[0507] 另一个方案是在有机材料中形成微孔结构。例如，可以采用双阻蚀胶(dual-resist)“软膜”工艺，由此在更厚的有机材料(例如，固化的聚酰亚胺或相反作用阻蚀胶)上面使用薄的高分辨率深层紫外线阻蚀胶。顶部阻蚀胶层被模式化。使用氧等离子体活性离子蚀刻工艺，可以转移图案。该过程次序有时称作“便携适型掩蔽”(PCM)技术。
参见B.J.Lin等人，“Practicing the Novolac deep-UV portable conformable masking technique”，Journal of Vacuum Science and Technology 19，No.4，1313-1319(1981)；和A.Cooper等人，“Optimization of a photosensitive spin-on dielectric process for copper inductor coil and interconnect protection in RF SoC devices.”
参见B.J.Lin等人，“Practicing the Novolac deep-UV portable conformable masking technique”，Journal of Vacuum Science and Technology 19，No.4，1313-1319(1981)；和A.Cooper等人，“Optimization of a photosensitive spin-on dielectric process for copper inductor coil and interconnect protection in RF SoC devices.”
[0508] 或者，可以采用“钻探-聚焦”技术，由此在不同的焦点深度处进行几个连续的分步重复暴露，以补偿高分辨率行进机器(stepper)的有限焦点深度(DOF)(当制造厚阻蚀胶层时)。该技术依赖于行进机器NA和DOF以及阻蚀胶材料的反差性质。
[0509] 另一个PCM技术可以适合这些目的，诸如在Edwards等人的美国专利申请公开号2006/0073422中公开的技术。这是三层PCM方法，且显示在图33A中。如图显示的，基本上需要6个主要步骤来制备微孔阵列，且结果非常类似于接触刻制产生的结果。
[0510] 在第一步3320中，将高反差负作用光刻胶(诸如型Shipley InterVia光电介质材料8021(IV8021))的层3322旋涂在晶片表面上，我们将其假定为提供图33的基质3312(在其中制造传感器阵列)的晶片，并进行软烘烤运行。接着，在步骤3324中，施加封闭抗反射涂层(BARC)层3326，并软烘烤。在该结构上面，旋涂薄阻蚀胶层3328，并软烘烤，在步骤3330中，薄阻蚀胶层适合精细特征确定。然后在步骤3332中模式化阻蚀胶层3328，暴露，并显影，并去除在暴露的区域3329中的BARC(不再受到阻蚀胶3328的保护)。这会向未固化的IV8021层向下打开区域3329。BARC层现在可以象共形接触掩蔽物一样起作用。在步骤3334中，具有液泛暴露工具的毯暴露交联暴露的IV8021，后者现在显示为不同于在3322处的未固化的IV8021。在步骤3338中，执行一种或多种显影剂，去除区域3336中除了交联的IV8021以外的所有物质。区域3336现在构成微孔的壁。
[0511] 尽管如上面所示，孔在ISFET的顶部钝化层上降至最低点(即终止)，据信，如果将活性珠子保持从ISFET钝化层轻微鼓起，可以改善ISFET传感器性能(即诸如信噪比)。这样做的一种方式是，在像素微孔的边界内放置间隔“隆起物”。这样做的效果的一个实例是，不会蚀刻掉用于形成微孔结构的层部分(即2个形成微孔的刻制步骤——一个步骤蚀刻掉一部分，另一个步骤模式化隆起物，并完成蚀刻至最低点)，其中通过沉积和刻制界定，并蚀刻单独层，以形成“隆起物”，其中使用永久的光可界定的材料制作隆起物(在完成微孔后)，或在形成微孔之前形成隆起物。隆起物特征如图33B中的3350所示。替代的(或额外的)非集成方案是，给孔装载一层或2层非常小的填充珠子，然后装载DNA-负载的珠子。
[0512] 使用6um(微米)厚的四甲氧基硅烷(TEOS)层作为用于微孔形成的SiO2-样层，图33B-1显示了本文教导的阵列结构的部分3300A的横截面的扫描电子显微镜(SEM)图像。
微孔3302A形成在TEOS层3304A中。该孔向6um厚层中延伸约4um。典型地，蚀刻的孔以蚀刻-停止材料为底部，所述蚀刻-停止材料可以是例如氧化物、有机材料或在半导体加工中已知用于蚀刻-停止用途的其它合适材料。薄蚀刻停止材料层可以形成在更厚的聚酰亚胺或其它合适的电介质层上面，所以在孔底和芯片的金属4(M4)层之间存在约2um的蚀刻停止+聚酰亚胺，其中为阵列中的每个下面的ISFET形成延长的栅电极3308A。由于在侧面被标记，显示了形成更低水平互连和结构的CMOS金属化层M3、M2和M1，其ISFET通道形成在用箭头3310A指示的区域。
微孔3302A形成在TEOS层3304A中。该孔向6um厚层中延伸约4um。典型地，蚀刻的孔以蚀刻-停止材料为底部，所述蚀刻-停止材料可以是例如氧化物、有机材料或在半导体加工中已知用于蚀刻-停止用途的其它合适材料。薄蚀刻停止材料层可以形成在更厚的聚酰亚胺或其它合适的电介质层上面，所以在孔底和芯片的金属4(M4)层之间存在约2um的蚀刻停止+聚酰亚胺，其中为阵列中的每个下面的ISFET形成延长的栅电极3308A。由于在侧面被标记，显示了形成更低水平互连和结构的CMOS金属化层M3、M2和M1，其ISFET通道形成在用箭头3310A指示的区域。
[0513] 在垂直的横截面视图中(即，从上向下看)，可以形成圆形或正方形的孔。圆孔可以改善珠子捕获，且可以避免对在孔底部或顶部的填充珠子的需要。
[0514] 也可以有利地使用在微孔侧面的锥形斜面。参考图33B-2，如果珠子3320A的直径大于孔底直径，但是足够小以放进孔口，珠子将会由于几何约束而脱离孔底。例如，图33B-2解释了这样的微孔的实例，其从上面看是正方形横截面，侧面4um，且装载3.8um直径珠子3320A。经过实验和一些计算，可以确定合适的珠子尺寸和孔尺寸组合。图33B-3显示了装载2.8um直径珠子3322A的一个4um孔的一部分，所述珠子明显相对较小，且完全落入孔底部；4.0um直径珠子3324A被孔的侧壁锥形体阻止到达底部；且3.6um直径的中间尺寸的珠子3326A被填充珠子3328A隔离孔底。显然，必须小心地使珠子尺寸匹配微孔蚀刻锥形体。
[0515] 因而，通过任意高长宽比光可界定的或可蚀刻的薄膜工艺，可以制造微孔，其可以提供必要的厚度(例如，约4-10um)。被认为合适的材料是光敏感的聚合物、沉积的二氧化硅、非光敏感的聚合物，它们可以使用例如等离子体蚀刻工艺等来蚀刻。在二氧化硅家族中，TEOS和硅烷氧化亚氮(SILOX)是合适的。最终结构是类似的，但是不同材料存在不同的表面组成，其可能造成目标生物学或化学不同反应。
[0516] 当形成微孔层时，可能必须提供蚀刻停止层，使得蚀刻工艺不会进行到超过希望的深度。例如，可以存在要保留的底层，诸如低-K电介质。蚀刻停止材料应当根据用途来选择。SiC和SiN材料可能是合适的，但是这不意味着表示不可以采用其它材料。这些蚀刻-停止材料也可以用于增强驱动ISFET传感器灵敏度的表面化学，通过选择蚀刻-停止材料来具有适当的零电荷点(PZC)。除了二氧化硅和氮化硅以外，不同的金属氧化物可能是合适的。
[0517] 不同金属氧化物的PZC可以在不同的教科书中找到，诸如J.Fierro的“Metal Oxides-Chemistry and Applications”。我们已经获知，Ta2O5可以比Al2O3优选地用于蚀刻停止，因为Al2O3的PZC刚好在使用的pH(即，约8.8)，且因此，刚好在零电荷点。另外，Ta2O5具有更高的pH灵敏度(即，mV/pH)，即传感器性能的另一种重要因素。优化这些参数，可能需要钝化表面材料的明智选择。
[0518] 使用薄金属氧化物材料用于该目的(即，作为蚀刻停止层)是困难的，因为它们实际上如此薄地沉积(通常200-500A)。微孔制造后金属氧化物沉积技术可能允许在高长宽比微孔底部安置适当的PZC金属氧化物膜。
[0519] (a)反应性地溅射的氧化钽、(b)非反应性的化学计算的氧化钽、(c)氧化钨或(d)氧化钒的电子束沉积，可以证实具有优良的“向下入孔(down-in-well)”覆盖，这是由于沉积过程的优良方向性。
[0520] 阵列通常包含至少100个微流体孔，每个孔与一个或多个chemFET偶联传感器。优选地，所述孔形成在玻璃(例如，SiO2)、聚合材料、光可界定的材料或反应性离子可蚀刻的薄膜材料中的至少一种中。优选地，所述孔具有小于约1∶1的宽高比。优选地，所述传感器是场效应晶体管，且更优选chemFET。chemFET可以任选地偶联至PPi受体。优选地，每2
个chemFET占据10 微米或更小的阵列面积。
个chemFET占据10 微米或更小的阵列面积。
[0521] 在有些实施方案中，本发明包括这样的测序装置，其包含半导体晶片装置，后者偶联至电介质层诸如玻璃(例如，SiO2)、聚合的、光可界定的或活性离子可蚀刻的材料，在其中形成反应室。典型地，玻璃、电介质、聚合的、光可界定的或活性离子可蚀刻的材料与半导体晶片层集成在一起。在某些情况下，玻璃、聚合的、光可界定的或活性离子可蚀刻的层是非结晶的。在某些情况下，玻璃可以是SiO2。所述装置可以任选地另外包含合适材料的流体递送模块，该合适材料诸如聚合材料，优选注塑材料。更优选地，聚合层是聚碳酸酯。
[0522] 在有些实施方案中，本发明包括制备测序装置的方法，包括：使用光刻，在位于晶体管阵列上面的玻璃、电介质、光可界定的或反应性离子可蚀刻的材料中产生孔。
[0523] 使用在与微孔阵列相组合的芯片上的传感器阵列的组件来测序样品中的DNA的过程，被称作“实验”。进行实验需要给孔装载DNA-结合的珠子，并从孔流过几种不同的流体溶液(即，试剂和洗液)。需要与流体界面偶联的流体递送系统(例如，阀门、导管、压力源等)，其以受控的均匀流动使不同溶液流过孔，具有可接受的小死体积和连续溶液之间的小交叉污染。理论上，与芯片(有时称作“流动池”)的流体界面会造成流体同时到达所有微孔。为了使降列速度最大化，必须使阵列输出在尽可能接近地同时得到。该理论显然是不可能的，但是希望使引入不同孔中的流体的到达时间的差别或不对称最小化，从而使来自阵列的所有信号的总获取速度最大化。
[0524] 许多结构的流动池设计是可能的；因而，本文提供的系统和方法不依赖于特定流动池结构的使用。尽管希望合适的流动池基本上符合下述目标集合：
[0525] ○具有适合与流体递送系统互连的连接，例如，通过适当尺寸的管道；
[0526] ○在孔上面具有适当的顶部空间；
[0527] ○使流体遇到的死体积最小化；
[0528] ○使小空间最小化(以使交叉污染最小化)，该小空间接触流体但是不会被流过流动池的洗液快速地清扫干净；
[0529] ○构造成达到在阵列上面一致的流体运输时间；
[0530] ○在孔上面的流动中产生或扩散微小气泡；
[0531] ○适合放置可取出的参比电极到流动室内或离流动室尽可能近；
[0532] ○便利珠子的容易装载；
[0533] ○能够以可接受的成本制备；和
[0534] ○可容易地装配和连接到芯片包。
[0535] ○尽可能地满足这些标准，会积极地促进系统性能。例如，使气泡最小化是重要的，所以来自阵列的信号真实地指示孔中的反应，而不是假性噪声。
[0536] 将讨论几个实例设计中的每一个，它们以不同方式和程度满足这些标准。在每个实例中，通常可以选择以两种方式之一实现设计：通过把流动池连接至框架，并将框架粘合(或以其它方式连接)到芯片上，或通过将框架集成在流动池结构中，并将该统一组件连接到芯片上。此外，通过将参比电极集成进排列中的方式，可以将设计分类。根据设计，可以将参比电极集成进流动池中(例如，形成流动室的顶板的一部分)或在流动通道中(通常在传感器阵列之后，在流动通道的出口或下游侧)。
[0537] 在图34-37中，显示了整合这样的流体界面的合适的实验装置3410的第一个实例，下面更详细地讨论了其制备和构造。
[0538] 所述装置包含半导体芯片3412(通常指示，尽管被隐藏)(在其上面或在其中形成孔和传感器的阵列)和流体组件3414(其在芯片上面，并将样品递送给芯片用于读取)。流体组件包括部件3416(用于引入含有样品的流体)、部件3418(用于允许流体被导出)和流动室部件3420(用于允许流体从入口流到出口，并沿着通道与孔中的材料相互作用)。这3个部件被包含玻璃载玻片3422的界面(例如，Erie Microarray目录号C22-5128-M20，来自Erie Scientific Company，Portsmouth，NH，其被切成3部分，每部分的尺寸是约25mm x25mm)统一。
[0539] 在玻璃载玻片的上表面固定着2个配件3424和3426，诸如纳米口配件(nanoport fittings Part)#N-333，其来自Upchurch Scientific of Oak Harbor，WA。一个口(例如，3424)用作递送来自抽泵/阀门系统(在下面描述，但是在这里不显示)的液体的入口。第二个口(例如，3426)是将液体导向废物的出口。每个口连接导管3428、3432，诸如适当内径的柔性管道。将纳米口安置成，管道可以穿透对应的孔进入玻璃载玻片。管口应当与载玻片下表面齐平。
[0540] 在玻璃载玻片底面，流动室3420可以包含不同的结构，用于促进穿过微孔阵列的基本上层流。例如，使用正性光刻胶(诸如SU-8光刻胶，其来自MicroChem Corp.of Newton，MA)，通过接触刻制，可以制作一系列微流体通道，它们从入口管向流动室边缘散开。在下面将讨论其它结构。
[0541] 芯片3412又固定在载体3430上，用于包装和连接插针(connector pins)3432。
[0542] 为了容易描述，从图38开始讨论制造，我们现在考虑将玻璃载玻片3422相对于它在图34-37中的朝向上下颠倒。
[0543] 将光刻胶层3810施加于载玻片的“上面”(当载玻片和它的附加层被反转并固定于在其上面具有微孔阵列的ISFET阵列的传感器组件上时，其将变成“下面”侧)。在该实施例中，层3810可以是约150μm厚，且它将形成从纳米口的管道末端到传感器阵列芯片边缘的主要流体负载层。使用掩蔽物，诸如图39的掩蔽物3910，模式化层3810(“模式化”是指，使用辐射源穿过掩蔽物暴露阻蚀胶，然后去除未塑料化的阻蚀胶)。掩蔽物3910具有辐射可透过的区域(显示为白色)和辐射阻断区域3920(显示为阴影)。辐射阻断区域是在3922-3928处。区域3926将形成围绕传感器组件的通道；它形成在掩蔽物3920的外边界内侧约0.5mm处，以避免典型的边缘珠子。区域3922和3924将阻断辐射，从而去除阻蚀胶的对应部分，以形成显示的空隙形状。每个区域3922、3924具有圆形末端，其尺寸可以容纳对应的导管3428、3432(穿过对应的纳米口3424、3426)之一的末端。从圆形末端，区域3922、3924在传感器阵列的方向散开，以允许液体扩散，所以在阵列上的流动基本上是层式的。区域3928仅仅是对准模式，且可以是任意合适的对准模式，或替换为合适的替代对准机理。在图38上的虚线已经用于解释在掩蔽区域3922和3924下面的空隙3822和3824
的形成。
的形成。
[0544] 第二层光刻胶相当独立地形成，不是在阻蚀胶3810或载玻片3422上。优选地，它在平的柔性表面(未显示)上形成，以建立去皮的(peel-off)模式化的塑料层。如图40所示，该第二层光刻胶可以使用掩蔽物(诸如掩蔽物4010)来形成，其在模式化以后会在柔性基质上留下在区域4012下面的边界，在区域4014、4016下面的2个裂缝(它们的用途将在下面讨论)和由模式化的区域4018和4022生成的对准标记。然后使用一种对准标记或对准标记集合(由模式4018生成，用于这些层的对准)，将第二层光刻胶施加于第一层光刻胶上。然后，将第二层从它的柔性基质剥离，并去除后者。
[0545] 由模式4022生成的其它对准标记或标记集合，被用于对准要讨论的后续层。
[0546] 第二层优选地是约150μm深，且它将覆盖流体运输通道，例外是，在裂缝形成区域4014和4016下面，在传感器阵列芯片的每个边缘处约150μm长的裂缝。
[0547] 在将第二层光刻胶安置在第一层上以后，使用掩蔽物诸如掩蔽物4110，在第二层上面形成模式化的第三层光刻胶，如图41所示。第三层会在区域4112下面提供挡板部件，它与在传感器芯片阵列上的环3310一样宽(参见图33)，但是窄约300μm，以允许与第一层的流体运输通道重叠。第三层可以是约150μm厚，并穿透芯片环3310(朝向由此形成的盆地的底面)150μm。该结构会在传感器阵列芯片的孔上面留下约300μm的顶部空间。流体沿着传感器阵列的整个宽度流过孔，穿过在4014、4016下面的150μm裂缝。
[0548] 图36显示了微流体和传感器组件的上述实例实施方案的透视的部分剖视图，也描绘在图34和35中，为了使流体流流动通道更可见而放大。(在图37中显示了流动通道的一半的其它放大示意图)。在这里，可以看到，流体通过入口管3428进入入口3424。在管3428的底部，流体流过由掩蔽区域3922形成的流动扩展室3610，流体流过环3310，然后向下进入盆地的底部3320，并穿过具有微孔阵列的管芯3412。穿过阵列后，流体然后在环3310的远壁处做垂直旋转，并流过环的顶部，流向和穿过由掩蔽区域3924形成的汇流室3612，经由出口管3432从出口3426退出。在图37的放大示意图中，也可以看到该流程的一部分，即从阵列的中央至出口，其中箭头指示流体流向。
[0549] 通过将粘合剂施加于这2个组件的匹配表面的部件上，并对准地把它们压到一起，可以将流体组件固定在传感器阵列芯片组件上。
[0550] 尽管图34-36中没有解释，可以将参比电极理解为金属化3710，如图37所示，在流动室的顶板处。
[0551] 在图42中显示了引入参比电极的另一种方式。在这里，在流动室的顶板中提供了孔4210，且将护孔环(grommet)4212(例如，有机硅)插入该孔中，提供中央通道或腔，穿过其中可以插入参比电极4220。挡板或其它微特征(在图42中未显示，但是在下面关于图42A予以讨论)可以模式化到流动通道中，以促进在微孔阵列上面的层流。
[0552] 为了许多原因，希望达到均匀流前线和消除有问题的流动通道区域。一个原因是，对于许多用途、尤其基因测序而言，希望在系统的流动池内流体界面的非常快速的通行。换而言之，进入流体必须在短时间段内彻底替换以前的流体。在流动池内不均匀的流体速率和扩散、以及有问题的流动通道，可以与该需要相竞争。穿过矩形横截面导管的简单流，可以从流动体积中心附近的区域至邻近侧壁的区域表现出显著不一致的流体速率，一个侧壁是微孔层的顶部表面和孔中的流体。这种不一致导致在2种移动中的流体之间的空间上和时间上的大浓度梯度。此外，在停滞区域(如流动池内部的锐角)可能聚集或产生气泡。(表面能(亲水相对于疏水)可以显著影响气泡保留。如果模塑的表面太疏水，应当考虑在加工过程中避免表面污染，并使用表面处理来建立更亲水的表面)。当然，流动室的物理安排可能是最影响流动前线可达到的均匀程度的因素。
[0553] 一个方案是，构建流动室的流动横截面，以实现跨阵列宽度而变化的流速，使得通行时间在阵列中是均匀的。例如，扩散段(即，流动扩展室)部分3416、3610的横截面可以制成图42A的4204A处所示，而不简单地是4204A处的矩形。也就是说，它可以具有弯曲的(例如，凹的)壁。扩散段的不平的壁4206A可以是顶面或底面。另一个方案是，构建进入阵列的有效通道长度，使得在阵列上面从入口到出口的总通道长度基本上相同。这可以如下实现，例如，通过在流动通道中放置流动扰乱结构(诸如圆筒或其它结构)，其方向垂直于流动方向。如果流动室具有微孔阵列顶部作为底面，且具有相对壁作为顶板，这些流动扰乱结构可以提供在微孔层顶部上或在顶壁上(或内)。所述结构必须充分地深入流体，以具有希望的效果，但是即使小的流动紊乱也可能具有显著影响。回到图42B-42F，图形地显示了这些结构的一些实例。在图42B中，在微孔层4210B的表面上，形成了许多圆柱形流动扰乱物4214B，它们向流动室顶壁4212B垂直伸出，并用于扰乱在箭头A方向移动的流体的层流。图42C描述了类似的排列，例外是，流动扰乱物4216C具有圆形顶部，且看起来更像隆起物，可能是半球或具有球形顶的圆筒。相反，在图42D中，流动扰乱物4218D从流动室的顶壁4212B伸出或垂下。仅显示了一列流动扰乱物，但是应当理解，通常需要多个更多或更少的平行的列。例如，图42E显示了这种流动扰乱物的几个列4202E(从顶壁4212B向外伸出(尽管相对于图42B-42D朝向颠倒)。可以选择扰乱物之间的间距和它们的高度，以影响流动曲线变成抛物线的距离，使得通行时间平衡。
[0554] 在图42F和42F1中显示的另一种结构，包含使用固体梁样突出物或挡板4220F作为扰乱物。该概念可以用于形成流动室的顶部件。与没有扰乱物结构的简单矩形横截面相比，这样的排列会促进更均匀的流体流动，并显著减少流体置换时间。此外，替代沿着一个边缘发生的流体进入阵列，流体可以在一个角4242F处通过小口引入，且可以从相对角4244F处通过口退出，与该角区域进行流体交换。这些平行挡板4220F将输入和出口角之间的流动体积分割成多个通道。最低的流体耐受通道是沿着芯片的边缘，垂直于挡板。随着进入流体充入该通道，流体然后在挡板之间指向芯片的相对侧。每个挡板对之间的通道深度优选地在芯片上分级，使得流动被迫穿过最远的通道向出口移动，由此使挡板之间的流动前线平齐。挡板在芯片(即，微孔层)表面附近向下伸出，但是因为它们非常薄，流体可以在它们下面快速扩散，并暴露阵列组件的有关区域。
[0555] 图42F2-42F8解释了单片注射模塑的(优选聚碳酸酯)流动池部件42F200的一个实例，其可以用于提供挡板4220F、流动室顶板、流体入口和出口和甚至参比电极。图42F7显示了在部件42F200的底面上的挡板的放大视图，且将挡板显示为图42F6中部件42F200的底面的一部分。由于通过注射模塑难以形成小尺寸的矩形结构，这些挡板的具体实例(显示为4220F’)是三角形横截面。
[0556] 在图42F2中，存在固定于传感器阵列包42F300上的部件42F200的顶部等轴视图，在它们和接触针42F204(依靠传感器阵列芯片包)之间形成密封42F202。图42F3和42F4分别显示了穿过图42F5的截面线H-H和I-I的截面，使人看见传感器阵列芯片
42F250、挡板4220F’和经由入口42F260和出口42F270的流体流动通道的关系。
42F250、挡板4220F’和经由入口42F260和出口42F270的流体流动通道的关系。
[0557] 通过将金属化应用于部件42F200的底面42F280，可以形成参比电极。
[0558] 不同的其它位置和方案也可以用于将流体流引入流动室。除了在其中可以将流体引导穿过芯片组件42F1的边缘宽度的实施方案(如图57-58所示)以外，例如，或可以在芯片组件的一个角处引入流体，如图42F1所示。也可以例如如图42G和42H所示引入流体，其中流体穿过要在附近排出的入口导管4252G，并流向芯片中心，如在4254G处，且从引入点向外放射状流动。
[0559] 图42I和42J以及图42G和42H描绘了这样的结构的一个实例的横截面和它运行。不同于以前的实施例，该实施方案含有额外的元件，隔膜阀4260I。最初，如图42H所示，阀门4260I打开，提供通过导管4262I向废物池(未显示)的通道。打开的阀门会提供向废物池或出口的低阻抗流。然后将气压施加于隔膜阀，如图42J所示，关闭低阻抗通道，并造成流体流继续向下穿过部件4266J(其形成流动室顶板)的中央腔4264J，并穿过芯片(传感器)组件。如上所述，流体被在传感器边缘处的通道汇集，并通过导管4268J退出至废物输出。
[0560] 在图42K-42M中描绘了该理论的变化，其显示，流体不是在芯片组件中心处引入，相反，而是在一个角4272K处引入。如线4274K象征性地指示的，它流过芯片3412，并在对角相对角4276K处退出。该概念的优点是，它几乎消除了任何驻点。它也具有下述优点，即传感器阵列可以垂直放置，使得流体在底部处引入，并在顶部处退出，以辅助清除气泡。顺便提及，这类实施方案可以视作在阵列中心引入流体的实施方案的四分之一。在图42L中显示了一个实现的实例，其中阀门4278L关闭，且转流向废物出口或蓄池。相对于图42I和42J的实施方案的主要差异是，流体流是在阵列的角(而不是在它的中心)引入。
[0561] 在所有情况下，应当注意，在试剂周期之间，确保整个流动室以及微孔的彻底洗涤。流动紊乱可能加重充分清洁流动室的挑战。
[0562] 流动紊乱也可能诱发或增加流体中的气泡。气泡可能阻止流体到达微孔，或延迟它引入微孔，把错误引入微孔读出，或使来自该微孔的输出在处理来自阵列的输出中无用。因而，应当小心地选择结构和流动扰乱物元件的尺寸，以控制这些潜在的不利因素。例如，可能在扰乱物元件的高度和希望的速度分布图变化之间做出折衷。
[0563] 图43-44显示了另一个替代性流动池设计4310。该设计依赖于单个塑料片或部件4320的模塑，其将被连接到芯片上，以完成流动池。通过在4330和4340处接进塑料片的适当孔中的螺纹连接，制作与流体系统的连接。或者，如果部件4320由诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)等材料制成，通过将管道简单地插入部件4320的适当尺寸的孔中来制作连接。在图
43-44中显示了该设计的垂直横截面。该设计可以使用悬垂塑料环4350(其可以是显示的固体壁，或许多悬垂的分别隔开的腿，所述腿形成向下延伸的栅栏-样壁)来封闭芯片包，并对准塑料片和芯片包或其它合适的结构，由此对准芯片框架和形成流动池的部件4320。
通过孔4330、4340之一，将液体引入流动池，此后向下流向流动室。
43-44中显示了该设计的垂直横截面。该设计可以使用悬垂塑料环4350(其可以是显示的固体壁，或许多悬垂的分别隔开的腿，所述腿形成向下延伸的栅栏-样壁)来封闭芯片包，并对准塑料片和芯片包或其它合适的结构，由此对准芯片框架和形成流动池的部件4320。
通过孔4330、4340之一，将液体引入流动池，此后向下流向流动室。
[0564] 在图解的实施方案中，通过部件4320的腔4325，将参比电极引入流动室顶部。有机硅套管4360和环氧停止环4370可以便利可取出的参比电极的放置(参见图44的放大图)。有机硅套管会提供紧密密封，且环氧停止环会防止电极插入流动池中太深。当然，其它机制可以用于相同目的，且可能没有必要采用结构来停止电极。如果诸如PDMS等材料用于部件4320，当插入电极时，该材料本身可以形成不透水密封，不需要有机硅套管。
[0565] 图45和46显示了类似的排列，例外是，部件4510缺少用于容纳参比电极的腔。相反，参比电极4515形成在或固定在中央部分4520的底部，并形成流动室顶板的至少一部分。例如，可以在将部件4510固定在芯片包上之前，将金属化层施加于中央部分4520的底部。
[0566] 图47-48显示了另一个实例，它是图43-44所示的实施方案的变体，但是其中框架被制备为流动池的一部分，而不是将流动孔结构连接到事先连接在芯片表面上的框架上。在这类设计中，组件在一定程度上更精致，因为芯片的导线连接(wirebond)没有被包裹芯片的环氧所保护。该设计的成功依赖于准确放置，并确保集成的“框架”与芯片表面的粘合。
在图49-50中显示了图45-46的实施方案的一个相似实施方案，其中参比电极4910是在流动室的顶板上，且框架被制备为流动池的一部分。
在图49-50中显示了图45-46的实施方案的一个相似实施方案，其中参比电极4910是在流动室的顶板上，且框架被制备为流动池的一部分。
[0567] 如图51-52所示的流体组件的另一个替代方案具有流体部件5110，其从芯片包5130的顶部在间隙器5120上隆起约5.5mm。这允许操作人员可视地检查塑料片5140和芯片表面之间粘合的质量，并在必要时从外面加强该粘合。
[0568] 一些前述替代性实施方案也可以在杂合的塑料/PDMS结构中实现。例如，如图53-54所示，塑料部件5310可以构成框架和流动室，其停靠在PDMS“基底”部分5320上。
塑料部件5310也可以为阵列提供区域5330，用于扩展来自入口的流体流；且PDMS部分还可以包括交流裂缝5410、5412，穿过它们，液体从PDMS部分流向下面的流动室，并从后者流出。
塑料部件5310也可以为阵列提供区域5330，用于扩展来自入口的流体流；且PDMS部分还可以包括交流裂缝5410、5412，穿过它们，液体从PDMS部分流向下面的流动室，并从后者流出。
[0569] 如上面所讨论的，流体结构也可以由玻璃制成，诸如光可界定的(PD)玻璃。在选择性地暴露于紫外光之后，这样的玻璃可以具有增强的在氢氟酸中的蚀刻速率，且由此可以在顶侧和背侧微机械加工部件，它们当粘合在一起时，可以形成三维低长宽比流体池。
[0570] 一个实例如图55所示。第一个玻璃层或片5510已经被模式化和蚀刻，以产生纳米口流体孔5522和5524(在顶侧)和流体扩展通道5526和5528(在背侧)。第二个玻璃层或片5530已经被模式化和蚀刻，以提供向下流体输入/输出通道5532和5534，高度为约
300μm(该层的厚度)。使层5530的下表面薄至通道5532和5534的外侧，以允许层5530停靠在芯片框架上，且允许突出区域5542处于适当高度，以形成流动通道的顶部。需要2个玻璃层或晶片和4个刻制步骤。2个晶片应当对准并粘合(例如，使用适当的胶，未显示)，使得向下流体输入/输出口与流体扩展通道适当对准。可以将对准靶标蚀刻进玻璃，以便利对准过程。
300μm(该层的厚度)。使层5530的下表面薄至通道5532和5534的外侧，以允许层5530停靠在芯片框架上，且允许突出区域5542处于适当高度，以形成流动通道的顶部。需要2个玻璃层或晶片和4个刻制步骤。2个晶片应当对准并粘合(例如，使用适当的胶，未显示)，使得向下流体输入/输出口与流体扩展通道适当对准。可以将对准靶标蚀刻进玻璃，以便利对准过程。
[0571] 可以将纳米口安置在纳米口流体孔上面，以便利输入和输出管道的连接。
[0573] 通过使用玻璃材料制作2-层流体池，参比电极也可以是传导层或沉积在第二个玻璃层的下表面上的模式(未显示)。或者，如图56所示，可以蚀刻突出区域，以形成可渗透的玻璃膜5610，在其顶部涂覆银(或其它材料)薄膜5620，以形成集成的参比电极。可以将孔5630蚀刻进上层以接近电极，且如果该孔足够大，它也可以用作氯化银溶液的蓄池。可以以任意合适的方式，制作与薄膜银电极的电连接，诸如通过使用可用夹子夹住的(clip-on)图钉连接器或备选地导线连接至陶瓷ISFET包。
[0574] 另一个替代方案是，使用在流动室顶板(即，在形成流体池顶板的部件的下侧)上的金属化的表面，将参比电极集成进测序芯片/流动池。可以以多种方式中的任一种，制作与金属化的表面的电连接，所述方式包括、但不限于：通过将传导性环氧施加于陶瓷包装密封环，后者又可以通过陶瓷基质中的通道电连接至在芯片包底部的备用针。这样做会允许流体池中的参考电势的系统-水平控制，这通过固定在芯片的控制电子器件上的芯片插座的输入来实现。
[0575] 相反，外面插入的电极需要连通入口的额外流体管道，其在周期之间需要额外的流体流。
[0576] 陶瓷针网格阵列(PGA)包装可以用于ISFET阵列，允许前脸上的不同表面之间的专门的电连接，在背面是针。
[0577] 可以把流动池视作ISFET芯片和它的PGA的“盖子”。如别处所述的流动池可以由许多不同的材料制成。注射模塑的聚碳酸酯表现得非常合适。使用粘合层(例如，铬)，可以将传导性的金属(例如，金)沉积在流动池顶板(流动室顶板)的下侧。优选地，将适当的低温薄膜沉积技术用于金属参比电极的沉积，这是由于在流体池底侧处(即，ISFET阵列的框架周围)的材料(例如，聚碳酸酯)和大分步覆盖形貌。一种可能的方案是，使用在行星系统中的电子束蒸发。
[0578] 有效电极区域被限制在ISFET阵列的框架周围内侧的中央流动室，因为在测序过程中仅金属化的表面接触离子型流体。
[0580] 得到的与ISFET装置的流体系统连接因而掺合缩短的输入和输出流体线，这是希望的。
[0581] 流体组件的另一个实例实施方案如图57-58所示。该设计限于塑料片5710(其掺合框架，且直接连接至芯片表面)和第二个片5720(其用于连接来自流体系统的管道)，并同样地限于上面讨论的PDMS片，将来自小腔管的液体分配宽平裂缝。将2个片胶合到一起，且多个(例如，3个)对准标志物(未显示)可以用于在胶合过程中精确地对准2个片。可以在底板中提供孔，且将孔用于给腔填充环氧(例如)以保护与芯片的导线连接，和填充在框架/芯片接触中的任意潜在缝隙。在解释的实施例中，参比电极是在流动池外面(在排出流的下游，穿过出口-参见下文)，尽管当然可以使用参比电极的其它结构。
[0582] 在图59-60中显示了流动池结构的其它实例。图59A包含流动池流体界面的注射模塑的底层或平板5910的8个视图(A-H)，而图59B包含匹配的注射模塑的顶板或层5950的7个视图(A-G)。平板5910的底具有下垂的边框5912(其构造和排列成封闭传感器芯片)和向上延伸的边框5914(沿着它的外缘与顶部平板5610配合)。在它们之间形成2个流体室(入口室和出口室)。顶板5950的分步的下垂部分5960将输入室与输出室隔开。入口管5970和出口管5980与顶板5950的其它部分模塑成一体。从入口管5970(其在由平板5910的顶部中的凹陷5920形成的入口室的小末端处排空)到入口室的出口边缘散开，以指导穿过整个阵列的流体。
[0583] 是否将玻璃或塑料或其它材料用于形成流动池，可能希望(特别对于更大的阵列)在入口导管和阵列前缘之间包括流动池入口室，不仅是逐渐扩大的(散开的)空间，而且是促进经过阵列的流动适当地成为层流的某种结构。使用注射模塑的流动池的底层5990作为一个实例，用于该目的的结构(如图59C所示)的一个实例类型是，从流动池的入口位置到微孔阵列或传感器阵列的前缘的通道的树状结构5992，其应当理解为在该结构的出口侧下面，在5994处。
[0584] 上述测序系统通常利用层流流动系统来测序生物聚合物。流体流动系统优选地部分地包括由传感器芯片和单片注射模塑的部件形成的流动室，所述部件包含入口和出口，且可固定在芯片上，以构成流动室。优选地形成在室内的这种部件的表面，以促进如本文所述的希望的方便的流体流动。
[0585] 在有些实施方案中，本发明包括用于检测离子脉冲的装置，其包含层流流动系统。优选地，所述装置用于测序多个核酸模板，其中所述核酸模板任选地沉积在阵列上。
[0586] 所述装置通常包括这样的流体组件，其包含含有一个或多个孔的部件，所述孔用于非机械地引导流体流过至少100K、500K或1M个微流体反应室的阵列，使得流体同时或基本上同时到达所有微流体反应室。典型地，流体流平行于传感器表面。典型地，组件具有小于1000、500、200、100、50、20或10的雷诺数。优选地，所述部件另外包含第一个孔(用于将流体导向传感器阵列)和第二个孔(用于将流体导离传感器阵列)。
[0587] 在有些实施方案中，本发明包括将流体导向传感器阵列的方法，包括：提供流体组件，其包含孔，所述孔将流体源流体地偶联至传感器阵列，并非机械地将流体导向传感器阵列。“非机械地”是指，流体在来自气体压力源(相对于机械泵)的压力下移动。
[0588] 在有些实施方案中，本发明包括孔阵列，每个孔偶联至具有入口和出口的盖子，和流体递送系统(用于非机械地从所述入口和出口递送和去除流体)。
[0589] 在有些实施方案中，本发明包括使用上述装置测序生物聚合物的方法，包括：将包含单体的流体导向反应室阵列，其中所述流体具有最大2000、1000、200、100、50或20的流体流动雷诺数。所述方法可以任选地另外包含，检测来自每个所述反应室的离子脉冲。通常通过向传感器表面的离子扩散，检测离子脉冲。存在提供流体组件的不同其它方式，所述流体组件用于递送经过微孔和传感器阵列组件的适当的流体流，前述实例因而无意是穷尽性的。
[0590] 可以将商业化的流动-型流体电极(诸如氯化银质子-可渗透的电极)依次插入流体线中，且通常设计成沿着流体线提供稳定的电势(为了不同的电化学目的)。但是，在上面讨论的系统中，这样的电势必须维持在接触微孔ISFET芯片的流体体积。利用常规的氯化银电极，已经发现，由于芯片表面和电极之间的电学上的长流体通道(通过流动池中的小通道)，难以实现稳定的电势。这导致芯片的电子器件中的噪音的接受。另外，在电极的流动腔内的大体积易于捕获和积累气泡，它们使与流体的电连接退化。参考图60，已经发现该问题的解决方案是，使用不锈钢毛细管电极6010，其直接连接至芯片的流动池出口6020，并通过屏蔽电缆6030连接至电压源(未显示)。金属毛细管6010具有小内径(例如，0.01”的量级)，其不会在任意可察觉的程度上捕获气体，并象其它微流体导管一样有效地运输流体和气体。另外，因为毛细管可以直接插入流动池口6020，它接近芯片表面，减少通过流体的可能电损失。毛细管的大内表面积(通常约2”长)也可以促成它的高性能。不锈钢结构是高度化学耐受性的，且不会发生电化学效应，因为在该系统中非常低的电流使用(＜1μA)。流体配件6040连接在毛细管的末端(其不是在流动池口中)，用于将管道连接至流体递送和去除子系统。
[0591] 根据用途，使用传感器阵列的完整系统包括合适的流体源、阀门和控制器(用于操作在微阵列或传感器阵列上面的低试剂和洗液的阀门)。这些元件可从现成的(off-the-shelf)组件容易地装配，且可以容易地将控制器程式化成执行希望的实验。
[0592] 应当理解，在chemFET处的读出可以是电流或电压(及其变化)，且对任一种读出的任何具体提及只是为了简单，无意排除其它读出。因此，在下文中对在chemFET处电流或电压检测的任何提及，应当理解为预见到且也同样适用于其它读出。在重要的实施方案中，读出反映了分析物浓度的快速、暂时的变化。可以在不同时间检测超过一种分析物的浓度。将这些测量与聚焦于稳态浓度测量的现有方法相对比。
[0593] 如已经讨论的，本发明的装置和系统可以用于检测和/或监测不同实体之间的相互作用。这些相互作用包括生物和化学反应，且可以包含酶反应和/或无酶相互作用，诸如但不限于结合事件。作为一个实例，本发明预见到监测这样的酶反应，其中基质和/或试剂被消耗，且/或产生反应中间体、副产物和/或产物。根据本发明可以监测的反应的一个实例是核酸合成方法，诸如会提供关于核酸序列的信息的方法。将在本文中更详细地讨论该反应。
[0594] 在测序反应的上下文中，本文提供的装置和系统能基于chemFET电流和/或电压的变化检测核苷酸掺入，因为这些参数相互关联。电流变化可以是一个或多个下述事件的结果(单一的，或其中的一些组合)：PPi的产生、Pi的产生(例如，在有焦磷酸酶存在下)、氢的产生(和伴随的pH变化，例如在有低强度缓冲剂存在下)、在chemFET表面处的未掺入的dNTP的浓度降低、在chemFET表面处未掺入的dNTP的延迟到达等。本文所述的方法能够检测在chemFET表面处的分析物浓度变化，且这些变化可能源自一个或多个前述事件。本发明预见到chemFET(诸如ISFET)在本文所述测序方法中的应用，即使读出独立于pH(或对pH不敏感)。换而言之，本发明预见到ISFET用于检测分析物(诸如PPi和未掺入的核苷酸)的用途。本文提供的关于测序的方法，可以与文献中的那些相对比，所述文献包括Pourmand等人PNAS 2006 103(17)：6466-6470。如本文所讨论的，本发明预见到测定核酸的核苷酸序列(即，“序列”)的方法。这样的方法包含，基于模板核酸的序列，合成新的核酸(由预先存在的核酸引发，如普通技术人员将会理解的)。也就是说，新合成的核酸的序列与模板核酸的序列互补，因此新合成的核酸的序列知识产生关于模板核酸的序列的信息。如下衍生出新合成的核酸的序列知识：通过测定已知的核苷酸是否已经掺入新合成的核酸中，且如果成立，则测定已经掺入多少这种已知的核苷酸。可以以多种方式监测核苷+酸掺入，包括诸如PPi、Pi和/或H 等产物的生成。
[0595] 图61解释了由核苷酸向新合成的核酸链中掺入引起的PPi的生产/产生。甚至可以在没有PPi受体的情况下(诸如在图11B1-3中提供的那些)和在没有可检测的pH变化存在下(例如，可能发生在有本文定义的强缓冲剂存在下)，直接地检测作为核酸链中核苷酸掺入的反应副产物而产生的PPi。在某些情况下，PPi的简单存在足以造成chemFET表面的电变化，从而导致电流变化。电流变化可以源自单独的PPi产生，或与其它事件(诸如上述的那些)组合的PPi产生。
[0596] 图8A显示了核苷酸掺入反应的基质和产物的计算浓度。这些计算是基于这样的模型，其中从多个相同的模板核酸同步地合成多个核酸，所述模板核酸结合在位于孔中的珠子上，如本文所述。该模型假设，所述孔含有与引物核酸杂交的模板核酸、聚合酶和核苷酸掺入所需的辅因子，以及核苷酸。通过向孔中引入(通过流动)已知的相同的三磷酸核苷酸群体，启动掺入反应。所述模型指示，通过chemFET表面检测到的第一种分析物是新产生的PPi，且在此后的某个时间点，产生未引入的三磷酸核苷酸。这些分析物群体中的每一个将会产生在chemFET处的电流读出。图8B显示了电压脉冲和/或峰(在本文中互换地称呼)，其对应PPi和未掺入的核苷酸的浓度的变化。第一个可观察的脉冲的时间在本文中称作t0，第二个可观察的脉冲的时间在本文中称作t1。不同的叠加痕迹反映在给定反应中没有、一个或多个相同核苷酸的掺入。从图8B可以看出，t1和t0之间的时间差(即，t1-t0)随着核苷酸掺入增加而增加。结果，PPi脉冲和未引入的三磷酸核苷酸脉冲之间的时间差可以用作在任意给定步骤中已经掺入多少三磷酸核苷酸的度量。这通常用于测定掺入了多少已知的单一类型的dNTP。但是，根据本发明的其它方面，也可以用于测定掺入的dNTP的数目，无论dNTP的种类。
[0597] 因而，本发明的某些实施方案预见到，在引入与模板核酸上的下一个待测序位置互补的核苷酸以后，这样的核苷酸将被有效地消耗，产生PPi，其然后在chemFET处检出。只有在合成反应已经结束(即，适当数目的核苷酸已经掺入所有新合成的核酸)之后，未掺入的核苷酸群体才能扩散至chemFET表面并被其检出。未掺入的核苷酸的检测的延迟，是已经掺入多少这种核苷酸的指示指标。这些延迟被模型化在图8B中。如果引入孔中的核苷酸不与模板核酸上的下一个待测序位置互补，则不会发生掺入。因此，在chemFET表面处检出的第一种分析物将是未掺入的核苷酸群体，因为不会产生PPi。因而，chemFET对单个离子脉冲(其被翻译成单个电压脉冲)的检测指示没有发生核苷酸掺入，2个时间上分离的离子脉冲(其被翻译成2个电压脉冲)的检测指示已经发生核苷酸掺入，且2个脉冲之间的时间差指示已经掺入的核苷酸的数目。
[0598] dNTP向核酸链中的掺入会释放PPi，其然后可以水解成2个正磷酸盐(Pi)和1个氢离子。因此，可以检测氢离子的产生，作为核苷酸掺入的指示指标。或者，可以直接地或间接地检测Pi。可以在chemFET处检测任意的和所有的这些事件(和更多，如本文所述)，从而造成与核苷酸掺入相关的电流变化。
[0599] 当不能在时间上分辨2个脉冲(即，2个峰可能合并成一个，其中t0和t1峰不可区分)时，发生该双脉冲检测的限度。对于Npoly＝0相对于Npoly＝1的情况，如下给出该限度：考虑第一个峰Npoly＝0(其具有宽度＝W0)和标准差σW0和第二个峰Npoly＝1(其具有宽度＝W1)和标准差σW1。对于Pe为1％[其中Pe＝erfc(SNR/2*(sqr(2)))]，信噪比(SNR)＝5.15。因此，检测限是由下式给出的峰宽度的差ΔW：ΔW＝(W1-W0)＞5.15*σW0。对于其它SNR，可以进行类似计算。
[0600] 在某些实施方案中，chemFET(或ISFET)读出独立于Pi和/或H+的浓度的变化+(或对其不敏感)。在这些实施方案中，PPi向Pi水解(伴随H 的释放)的速率降低，有时是显著的。PPi向Pi的转化，可以被酶(诸如焦磷酸酶)和/或某些离子催化。在没有酶和特定离子二者存在下(和在有些情况下，在没有任一种存在下)，转化速率充分减慢至可忽略。(参见例如J.Chem，Soc.Farady Trans.2007，93：4295，其报道了在没有酶或离子存-1 -1
在下转化速率常数是在约3 年 的量级，与之相比，Biochemistry，2002，41：12025报道了
2+ 3 -1
在有酶和Mg 存在下的速率是在约10s 的量级)。pH不敏感的环境可以是这样的环境，其被充分缓冲，以掩蔽氢释放引起的pH的任何变化。如果反应引起少量(如果有的话)氢离子释放，反应可以是pH不敏感的或独立的。
在下转化速率常数是在约3 年 的量级，与之相比，Biochemistry，2002，41：12025报道了
2+ 3 -1
在有酶和Mg 存在下的速率是在约10s 的量级)。pH不敏感的环境可以是这样的环境，其被充分缓冲，以掩蔽氢释放引起的pH的任何变化。如果反应引起少量(如果有的话)氢离子释放，反应可以是pH不敏感的或独立的。
[0601] 待测序的核酸在本文中称作靶核酸。靶核酸包括、但不限于，DNA(诸如但不限于基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等)和RNA(诸如但不限于mRNA、miRNA等)。核酸可以来自任意来源，包括天然存在的来源或合成来源。核酸可以是PCR产物、粘粒、质粒、天然存在的或合成的文库等。本发明在这方面无意受到限制。本文提供的方法可以用于测序任意长度的核酸。为了清楚，实施例提供了已知序列的4个模板的测序的原理演示证据。该人工模型意在证实，本文所述的装置和系统的实施方案能读出与模板的已知序列相关联的核苷酸掺入。这无意表示所述方法或系统在该领域的典型用途。下面是这些方法的简单描述。
[0602] 使用本领域已知的任意方式，制备靶核酸。作为一个实例，根据本领域已知的技术(参见例如Sambrook等人“Maniatis”)，可以从样品收获基因组DNA。在收获后，可以将DNA片段化，以产生更小长度的核酸。得到的片段可以是长度为数百、数千或数万个核苷酸的量级。在有些实施方案中，所述片段的大小是200-1000个碱基对，或大小是300-800个碱基对，或长度为约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个碱基对，尽管它们不限于此。可以通过任意方式将核酸片段化，包括但不限于机械的、酶的或化学的方式。实例包括剪切、超声处理、雾化、内切核酸酶(例如，DNA酶I)消化、扩增诸如PCR扩增或本领域已知的生成核酸片段(优选具有希望的长度)的任意其它技术。如本文使用的，片段化也包括使用扩增来产生靶核酸的更小尺寸的片段的群体。也就是说，可以将靶核酸解链，然后退火成2个(和优选地更多个)扩增引物，然后使用例如热稳定的聚合酶(诸如Taq)扩增。一个实例是巨大地平行的基于PCR的扩增。片段化之后可以进行尺寸选择技术，以富集或分离特定长度或尺寸的片段。这种技术也是本领域已知的，包括、但不限于凝胶电泳或SPRI。
[0603] 或者，可以使用已经足够小尺寸(或长度)的靶核酸。这样的靶核酸包括源自外显子富集过程的那些。因而，不是片段化(随机地或非随机地)更长的靶核酸，所述靶物可以是天然存在的或可以以更短的、可使用的长度分离的核酸，诸如mRNA、cDNA、外显子、PCR产物(如上所述)等。参见Albert等人Nature Methods 20074(11)：903-905(外显子和基因座-特异性区域的微阵列杂交)，Porreca等人Nature Methods 20074(11)：931-936和Okou等人Nature Methods 2007 4(11)：907-909的在测序之前分离和/或富集诸如外显子等序列的方法。
[0604] 在有些实施方案中，将尺寸选择的靶核酸连接至接头序列的5’和3’末端。这些接头序列包含与扩增引物序列(将用于扩增靶核酸)互补的序列。一种接头序列也可以包含与测序引物互补的序列。相对的接头序列可以包含这样的部分，其促进核酸与固体支持物(诸如但不限于珠子)的结合。这样的部分的一个实例是生物素分子(或双生物素部分，如Diehl等人Nature Methods，2006，3(7)：551-559所述)，且这样的标记的核酸因此可以结合到具有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素基团的固体支持物上。可以使用的另一个部分是NHS-酯和胺亲和对。应当理解，本发明在这方面不受限制，且普通技术人员能用其它结合对替换这些亲和对。得到的核酸在本文中称作模板核酸。模板核酸至少包含靶核酸，且通常在5’和3’末端处包含除了靶物以外的核苷酸序列。
[0605] 在有些实施方案中，模板核酸能自我-退火，从而产生用于掺入三磷酸核苷酸的3’末端。在这样的实例中，不需要单独的测序引物，因为模板起模板和引物的作用。关于在焦磷酸测序反应中使用自我-退火模板的讨论，参见Eriksson等人Electrophoresis 2004
25：20-27。
25：20-27。
[0606] 在其它实施方案中，使用切口的双链的(或部分双链的)模板，所述切口优选在接头序列内(在珠子结合的模板的游离端)。双链模板中的开口允许聚合酶(诸如DNA聚合酶)在切口部位处进入，并开始核苷酸掺入。这些开口可以以受控方式引入模板，具体地因为受到DNA切口酶(即，该实例中的切口酶)作用的序列是已知的(即，5’GAGTC3’)。关于这些共有的切口靶序列的讨论，参见Zyrina等人。
[0607] 在有些情况下，使用间隔物来将模板核酸(且具体地，其中包含的靶核酸序列)与固体支持物(诸如珠子)隔离。例如，这会促进最接近珠子的靶物末端的测序。合适的连接物的实例是本领域已知的(参见Diehl等人Nature Methods，2006，3(7)：551-559)，包括、但不限于，碳-碳连接物，诸如但不限于iSp18。
[0608] 模板核酸结合的固体支持物在本文中称作“捕获固体支持物”。如果固体支持物是珠子，则这些珠子在本文中称作“捕获珠子”。珠子可以由任意材料制成，包括但不限于纤维素、纤维素衍生物、明胶、丙烯酸树脂类、玻璃、硅胶、聚乙烯吡咯烷(PVP)、乙烯酰胺和丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯、与二乙烯苯交联的聚苯乙烯等(参见，Merrifield Biochemistry TM1964，3，1385-1390)、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶类、葡聚糖、交联的葡聚糖(例如，Sephadex )，TM
橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、天然海绵、金属和琼脂糖胶(Sepharose )。在一个实施方案中，所述珠子是抗生蛋白链菌素-包被的珠子。珠子直径取决于使用的chemFET和微孔阵列的密度，更大阵列(和因而更小尺寸的孔)需要更小的珠子。通常，珠子尺寸可以是约
1-10μM，更优选2-6μM。在有些实施方案中，珠子是约5.91μM，而在其它实施方案中，珠子是约2.8μM。在其它实施方案中，珠子的直径是约1.5μm或约1μm。应当理解，珠子的形状可以是或不是完全球形。也应当理解，可以使用其它珠子，且可以使用将核酸结合到珠子上的其它机理。在有些情况下，捕获珠子(即，在上面发生测序反应的珠子)与模板制备珠子(包括扩增珠子)相同。
橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、天然海绵、金属和琼脂糖胶(Sepharose )。在一个实施方案中，所述珠子是抗生蛋白链菌素-包被的珠子。珠子直径取决于使用的chemFET和微孔阵列的密度，更大阵列(和因而更小尺寸的孔)需要更小的珠子。通常，珠子尺寸可以是约
1-10μM，更优选2-6μM。在有些实施方案中，珠子是约5.91μM，而在其它实施方案中，珠子是约2.8μM。在其它实施方案中，珠子的直径是约1.5μm或约1μm。应当理解，珠子的形状可以是或不是完全球形。也应当理解，可以使用其它珠子，且可以使用将核酸结合到珠子上的其它机理。在有些情况下，捕获珠子(即，在上面发生测序反应的珠子)与模板制备珠子(包括扩增珠子)相同。
[0609] 本发明的重要方面预见到同时测序多个不同的模板核酸。这可以使用本文所述的传感器阵列来实现。在一个实施方案中，所述传感器阵列上面叠加(和/或集成)微孔阵列(或反应室或孔，作为在本文中互换使用的那些术语)，条件是，每个微孔存在至少一个传感器。在多个微孔中存在模板核酸的相同拷贝群体。不要求任意2个微孔携带相同的模板核酸，尽管在某些情况下，这样的模板可以共有重叠序列。因而，每个微孔包含模板核酸的多个相同拷贝，且微孔之间的模板可以是不同的。
[0610] 阵列之间的微孔可以存在尺寸差异。可以用横截面的方式描述微孔尺寸。横截面可以称作与孔深度(或高度)平行的“切面”，或它可以是与孔深度(或高度)垂直的切面。
[0611] 可以用宽度(或直径)与高度之比的方式描述这些微孔的尺寸。在有些实施方案中，该比例是1∶1至1∶1.5。珠子与孔尺寸(例如，珠子直径与孔宽度、直径或高度)之比优选在0.6-0.8的范围内。
[0612] 微孔的横截面可以是正方形，但是它们不限于此。微孔底部的尺寸(即，在垂直于孔深度的横截面)可以是1.5μm x 1.5μm，或它可以是1.5μm x 2μm。在实施例中显示了不同的直径，包括、但不限于，在或约100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、10μm、9μm、
8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小的直径。在某些具体的实施方案中，直径可以是在或约44μm、32μm、8μm、4μm或1.5μm。在实施例中显示了不同的高度，包括、但不限于，在或约100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、
50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、
5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小的高度。在某些具体的实施方案中，所述高度可以是在或约55μm、48μm、32μm、12μm、8μm、6μm、4μm、2.25μm、1.5μm或更小。本发明的不同实施方案预见到这些直径中的任一个与这些高度中任一个的组合。在其它实施方案中，反应孔尺寸可以是(直径μm x高度μm)44x 55、32x 32、32x 48、8x 8、8x 12、4x 4、4x 6、
1.5x 1.5或1.5x 2.25。
8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小的直径。在某些具体的实施方案中，直径可以是在或约44μm、32μm、8μm、4μm或1.5μm。在实施例中显示了不同的高度，包括、但不限于，在或约100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、
50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、
5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小的高度。在某些具体的实施方案中，所述高度可以是在或约55μm、48μm、32μm、12μm、8μm、6μm、4μm、2.25μm、1.5μm或更小。本发明的不同实施方案预见到这些直径中的任一个与这些高度中任一个的组合。在其它实施方案中，反应孔尺寸可以是(直径μm x高度μm)44x 55、32x 32、32x 48、8x 8、8x 12、4x 4、4x 6、
1.5x 1.5或1.5x 2.25。
[0613] 反应孔体积可以随孔尺寸而变化(在阵列之间，且优选不是在单个阵列内)。该体积可以是在或约100皮升(pL)、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更小的pL。在重要的实施方案中，孔体积小于1pL，包括等于或小于0.5pL、等于或小于0.1pL、等于或小于0.05pL、等于或小于0.01pL、等于或小于0.005pL或者等于或小于0.001pL。体积可以是0.001-0.9pL、0.001-0.5pL、0.001-0.1pL、0.001-0.05pL或0.005-0.05pL。在具体实施方案中，孔体积是
75pL、34pL、23pL、0.54pL、0.36pL、0.07pL、0.045pL、0.0024pL或0.004pL。可以将每个微孔中的多个模板引入微孔中(例如，通过核酸负载的珠子)，或它可以在微孔自身中产生。
多个在本文中被定义为至少2个，且在微孔中或在核酸负载的珠子上的模板核酸的上下文中，包括数十、数百、数千、数万、数十万、数百万或更多个模板核酸拷贝。拷贝数的限度取决于许多变量，包括模板核酸的结合位点(例如，在珠子上或在微孔壁上)的数目、珠子的尺寸、模板核酸的长度、用于产生多个的扩增反应的程度等。通常优选地，每个孔具有尽可能多的给定模板拷贝，以增加信噪比。扩增和核酸与诸如珠子等固体支持物的缀合，可以以多种方式来实现，包括但不限于Margulies等人Nature 2005 437(15)：376-380和伴随的补充材料所述的乳液PCR(即，油包水乳液扩增)。在有些实施方案中，所述扩增是代表性的扩增。代表性的扩增是不改变任何核酸物质的相对表示的扩增。所述孔通常还包括测序引物、聚合酶和合成反应必需的其它基质或催化剂。
75pL、34pL、23pL、0.54pL、0.36pL、0.07pL、0.045pL、0.0024pL或0.004pL。可以将每个微孔中的多个模板引入微孔中(例如，通过核酸负载的珠子)，或它可以在微孔自身中产生。
多个在本文中被定义为至少2个，且在微孔中或在核酸负载的珠子上的模板核酸的上下文中，包括数十、数百、数千、数万、数十万、数百万或更多个模板核酸拷贝。拷贝数的限度取决于许多变量，包括模板核酸的结合位点(例如，在珠子上或在微孔壁上)的数目、珠子的尺寸、模板核酸的长度、用于产生多个的扩增反应的程度等。通常优选地，每个孔具有尽可能多的给定模板拷贝，以增加信噪比。扩增和核酸与诸如珠子等固体支持物的缀合，可以以多种方式来实现，包括但不限于Margulies等人Nature 2005 437(15)：376-380和伴随的补充材料所述的乳液PCR(即，油包水乳液扩增)。在有些实施方案中，所述扩增是代表性的扩增。代表性的扩增是不改变任何核酸物质的相对表示的扩增。所述孔通常还包括测序引物、聚合酶和合成反应必需的其它基质或催化剂。
[0614] 待测序模板核酸对任意捕获(即，测序)珠子的饱和度可以不是100％。在有些实施方案中，存在10％-100％的饱和水平。如本文使用的，模板对捕获珠子的饱和度表示珠子上与模板缀合的位点的比例。在有些情况下，这可以是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或它可以是100％。
[0615] 应该理解，测序引物和聚合酶的量可以是饱和水平、超过饱和水平，或在某些情况下低于饱和水平。如本文使用的，测序引物或聚合酶的饱和水平是每个模板核酸分别与测序引物杂交或被聚合酶结合时的水平。因而，饱和量是与单个珠子上的模板数目相等的聚合酶或引物的数目。在有些实施方案中，所述水平大于该水平，包括超过模板核酸水平至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。在其它实施方案中，聚合酶和/或引物的数目可以是单个孔中单个珠子上的模板数目的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多达100％。
[0616] 因而，例如，在孔中之前和/或同时，将模板核酸与测序引物(其结合位于模板核酸的3’末端上的它的互补序列(即，在扩增引物序列中，或在连接到靶核酸的3’末端上的另一个接头序列中))和与聚合酶一起温育一段时间，温育条件促进引物与它的互补序列的杂交，且促进聚合酶与模板核酸的结合。引物可以是基本上任意序列，只要它的长度足够独特。杂交条件是使引物只与在模板的3’末端上的它的真实补体杂交的条件。合适的条件公开在Margulies等人Nature 2005 437(15)：376-380和伴随的补充材料中。
[0617] 如本文所述的，可以将模板核酸工程化，使得不同的模板具有相同的5’末端和相同的3’末端。但是，在有些实施方案中，本发明预见到多个模板群体的使用，其中给定多个的每个元件共有相同的3’末端，但是不同的模板群体彼此差别在于它们的3’末端序列。作为一个实例，本发明预见到在某些情况下测序来自超过一个对象或来源的核酸。来自第一个来源的核酸可以具有第一种3’序列，来自第二个来源的核酸可以具有第二种3’序列，以此类推，条件是，第一种和第二种3’序列是不同的。在这方面，3’末端(其通常是独特序列)可以用作条码或标识符，以标记(或鉴别)给定孔中特定核酸的来源。关于用条码标记核酸然后测序的讨论，可以参考Meyer等人Nucleic Acids Research 2007 35(15)：
e97。在某些情况下，在将珠子装载(或引入)孔中之前，或在这样装载之后，可以使测序引物(如果使用的话)与模板杂交(或退火，作为在本文中互换使用的术语)。
e97。在某些情况下，在将珠子装载(或引入)孔中之前，或在这样装载之后，可以使测序引物(如果使用的话)与模板杂交(或退火，作为在本文中互换使用的术语)。
[0618] 但是，在每个单个模板上的5’和3’末端优选地具有不同的序列。具体地，模板共有相同的引物结合序列。这会便利在微孔之间使用相同的引物，也确保在微孔之间发生类似的(或相同的)引物杂交程度。与互补引物(诸如测序引物)退火后，模板是在本文中称作模板/引物杂合体的复合物中。在该杂合体中，模板的一个区域是双链的(即，其中它与它的互补引物结合)，且一个区域是单链的。该单链区域用作核苷酸掺入引物末端的模板，且因而根据本发明最终测序该单链区域。
[0619] 合适的聚合酶包括、但不限于，DNA聚合酶、RNA聚合酶或其亚基，只要它能基于模板并从杂交的引物开始合成新核酸链。合适的聚合酶亚基的一个实例是缺乏3’至5’外切核酸酶活性的大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段的exo-形式。其它聚合酶包括T4exo-、Therminator和Bst聚合酶。聚合酶可以游离在溶液中(且可以存在于洗液和dNTP溶液中)，或可以结合在例如珠子(或对应的固体支持物)上或chemFET壁上，但是优选地不结合在ISFET表面自身上。在另一个方面，本发明提供了测序核酸的方法，包括，将多个模板核酸安置在多个反应室中，并使每个反应室接触chemFET。测序包括，通过将一个或多个已知的三磷酸核苷酸依次引入测序引物的3’末端，合成新核酸链，并检测一个或多个已知的三磷酸核苷酸掺入。掺入通过DNA聚合酶来进行。在有些实施方案中，聚合酶具有对模板的高亲和力，且具有100碱基对、250碱基对、500碱基对、750碱基对或甚至1000碱基对的持续合成能力。在有些实施方案中，聚合酶在高pH条件中具有高活性和高催化率。在有些实施方案中，反应混合物的pH是约7-10，且优选约9。在有些实施方案中，所述酶在低dNTP浓度时具有高活性和高催化率。在某些实施方案中，dNTP浓度是50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM，且优选20μM或更小。在某些实施方案中，当反应混合物具有低离子强度时，所述酶具有高活性和高催化率。在某些实施方案中，MgCl2或MnCl2的浓度是100μM或更小。在某些实施方案中，Tris的浓度是0.5mM或更小。
[0620] 本发明的不同方面涉及在有低离子强度溶液或环境存在下向现有核酸(例如测序引物)中的核苷酸掺入。如本文使用的，低离子强度溶液是离子浓度等于或小于3mM总离子浓度的溶液。低离子强度溶液的一个实例是具有小于100μM MgCl2的0.5mM Tris-HCl溶液。MgCl2浓度可以等于或小于90μM、等于或小于80μM、等于或小于70μM、等于或小于60μM、等于或小于50μM、等于或小于40μM、等于或小于30μM、等于或小于20μM、等于或小于10μM或者更小。因此，在某些实施方案中，聚合酶必须能在低离子强度起作用。如实施例所述，聚合酶优选地能识别和结合引物/模板杂合体，对杂合体具有足够的亲和力，导致例如在低离子强度条件下增加的聚合酶持续合成能力，并延伸引物。实施例2证实了T4exo-、Therminator、Bst和Klenow exo-聚合酶的这些不同的性质。该实施例进一步证实，在接触chemFET的硅孔的背景下，这些聚合酶能将核苷酸掺入并由此延伸引物。
[0621] 在有些实施方案中，聚合酶还必须能够掺入低浓度dNTP中的核苷酸。在有些实施方案中，dNTP的低浓度是低于20μM总dNTP的浓度。本领域普通技术人员会理解，在预见到连续(而不是同时)将dNTP引入反应孔中的那些实施方案中，该浓度与加入反应孔中的每种dNTP的浓度有关。在其它实施方案中，dNTP浓度(在反应过程中在任意时间在反应孔中存在的每种dNTP，或在某些情况下的总dNTP)是等于或小于19μM、等于或小于18μM、等于或小于17μM、等于或小于16μM、等于或小于15μM、等于或小于14μM、等于或小于13μM、等于或小于12μM、等于或小于11μM、等于或小于10μM、等于或小于9μM、等于或小于8μM、等于或小于7μM、等于或小于6μM、等于或小于5μM、等于或小于4μM、等于或小于3μM、等于或小于2μM、等于或小于1μM或者更小。在有些实施方案中，dNTP浓度是在0-20μM之间、在1-19μM之间或在5-15μM之间。
[0622] 本发明的某些实施方案要求，聚合酶具有足够的持续合成能力。如本文使用的，持续合成能力是聚合酶保持结合单个引物/模板杂合体的能力。如本文使用的，它通过在聚合酶从引物/模板杂合体分离之前聚合酶掺入核酸(诸如测序引物)中的核苷酸的数目来测量。在有些实施方案中，聚合酶具有至少100个核苷酸的持续合成能力，尽管在其它实施方案中，它具有至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸或至少500个核苷酸的持续合成能力。本领域普通技术人员会理解，聚合酶的持续合成能力越高，在分离之前可以掺入的核苷酸越多，因此可以测序的核酸越长。换而言之，具有低持续合成能力的聚合酶，例如在5个掺入后从杂合体分离的聚合酶，将仅提供长度为5个核苷酸的序列(根据本发明的某些方面)。
[0623] 本发明的其它方面和实施方案预见到在高pH(即，大于7的pH)执行核苷酸掺入。因而，某些反应在等于或大于7.5、等于或大于8、等于或大于8.5、等于或大于9、等于或大于9.5、等于或大于10或者等于或大于11的pH进行。聚合酶可以是在7-11、7.5-10.5、
8-10、8.5-9.5或在约9的pH将核苷酸掺入核酸(诸如测序引物)的聚合酶。
8-10、8.5-9.5或在约9的pH将核苷酸掺入核酸(诸如测序引物)的聚合酶。
[0624] 基于本文的教导应当理解，本发明的某些方面和实施方案将采用这样的聚合酶，其在低离子强度溶液和/或低dNTP浓度和/或高pH中表现出高活性。合适的掺入速率将随实施方案而异。在有些实施方案中，以比反应室内的试剂扩散更快的速率，进行核苷酸掺入。例如，在一个实施方案中，以超过反应孔中dNTP的扩散速率、优选dNTP向底部或反应孔(即，传感器)的扩散速率的速率，进行核苷酸掺入。在这些实例中，新引入的dNTP不会向传感器扩散，直到掺入反应结束。在此时，剩余的dNTP(即，未掺入的dNTP)扩散经过杂合体(或珠子，视情况而定)，并扩散向传感器底部。在这些实例中，在掺入反应结束之前，在珠子和孔底方向的dNTP扩散甚至在到达孔底之前被用完。
[0625] 聚合酶掺入核苷酸的速率将随具体用途而异，尽管通常更快的掺入速率是优选的。在某些情况下，单个聚合酶向单个核酸(诸如测序引物)中的掺入的速率快于孔中未引入的三磷酸核苷酸的扩散速率，尤其是它们向孔底的扩散。“测序”速率将依赖于芯片上阵列的数目、孔的尺寸、进行反应的温度和条件等。如本文别处所讨论的，通过有效地阻碍未引入的三磷酸核苷酸的移动，也可以操纵扩散速率。这可以如下实现，例如通过增加反应室中的粘度。这可以通过向反应室中加入增粘剂来实现，所述增粘剂例如但不限于聚乙二醇(PEG)或PEA。通过在反应孔中使用填充珠子，也可以延迟扩散。在本发明的某些实施方案中，4个核苷酸周期的时间可以是50-100秒、60-90秒或约70秒。在其它实施方案中，该周期时间可以等于或小于70秒，包括等于或小于60秒、等于或小于50秒、等于或小于40秒或者等于或小于30秒。约400个碱基的读出长度可以是30分钟、60分钟、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或在某种情况下5或更多小时的量级。这些时间对于兆碱基、更优选千兆碱基的序列的测序而言是足够的，通过使用更密集的阵列(即，具有更大数目的反应孔和FET的阵列)和/或同时使用多个阵列，可以得到更大的序列量。
[0626] 表2提供了基于本文预见到的不同阵列、芯片和系统结构的测序的估计速率。应当理解，本发明预见到甚至比表2所示那些更密集的阵列。这些更密集的阵列可以表征为间距为1.4μm且孔尺寸为1μm的90nmCMOS(其可以使用0.7μm珠子)、或为间距为1μm且孔尺寸为0.5μm的65nm CMOS(其可以使用0.3μm珠子)或间距为0.7μm且孔尺寸为0.3μm的45μm CMOS(其可以使用0.2μm珠子)。
[0627] 表2.反应参数和读出速率
[0628]
[0629] *Gbp是千兆碱基
[0630] **HG是人基因组
[0631] 在孔中之前和/或同时，也可以使模板核酸接触其它试剂和/或辅因子，包括但不限于缓冲剂、去污剂、还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT，Cleland氏试剂)、单链结合蛋白等。在一个实施方案中，聚合酶包含一种或多种单链结合蛋白(例如，聚合酶可以是工程化成包含一种或多种单链结合蛋白的聚合酶)。在一个实施方案中，在将它引入流动室和其孔之前，使模板核酸接触引物和聚合酶。
[0632] 在一个实施方案中，将核酸负载的珠子引入流动室，并最终引入位于chemFET阵列上面的孔中。该方法要求，流动室中的每个孔仅含有一个核酸负载的珠子，因为每个孔存在2个珠子会产生源自2个不同模板核酸的不可用的测序信息。实施例会提供在磁珠背景下的一种示例性珠子装载方法的简单描述。应当理解，类似的方案可以用于装载其它珠子类型。已经证实所述方法会减少在流动室的孔中捕获空气的可能性和发生率，在流动室的所有孔中均匀分布核酸负载的珠子，并避免多余的珠子在流动室中的存在和/或积累。在有些实施方案中，可以分析微孔阵列，以测定珠子向微孔中装载的程度，且在某些情况下，鉴别具有珠子的那些微孔和缺少珠子的那些微孔。知道哪些微孔缺少珠子的能力，会提供测序反应的另一种内部对照。通过标准的显微镜检查或通过传感器自身，可以测定珠子在孔中的存在或缺失。图61A和B是从微孔阵列的光学显微镜检查(A)和从在微孔阵列下面的传感器阵列(B)捕获的图像。两个图像中的白色斑点各自代表在孔中的珠子。这样的微孔观察通常每次运行仅进行一次，具体地因为一旦安置在微孔中，珠子就不可能移动到另一个孔中。
[0633] 被占据的孔在孔阵列中的百分比，可以随执行的方法而变化。如果方法的目的在于在尽可能最短的时间内获取最大序列数据，则希望更高的占据。如果速度和通量不是关键的，则可以容忍更低的占据。因此，根据该实施方案，合适的占据百分比可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的孔。如本文使用的，占据表示一个核酸负载的珠子在孔中存在，且占据百分比表示被单个珠子占据的总孔在阵列中的比例。被超过一个珠子占据的孔不能用于本发明预见到的分析中。
[0634] 最后，将模板核酸的同类群体放入多个孔中的每一个中，每个孔位于至少一个传感器上面且因而与之对应。如上面所讨论的，优选地孔含有至少10、至少100、至少1000、至4 5 6
少10、至少10、至少10 或更多个相同模板核酸拷贝。相同模板核酸是指，模板的序列是相同的。最优选地，孔中的所有模板核酸都一致地与引物杂交。模板核酸与引物的一致杂交是指，在与孔中每个其它模板/引物杂合体一样的位置，引物与模板杂交(即，序列沿着与引物互补的模板)。引物在每个模板上的一致定位，允许在孔内所有新核酸链的协调合成，由此导致更大的信噪比。
少10、至少10、至少10 或更多个相同模板核酸拷贝。相同模板核酸是指，模板的序列是相同的。最优选地，孔中的所有模板核酸都一致地与引物杂交。模板核酸与引物的一致杂交是指，在与孔中每个其它模板/引物杂合体一样的位置，引物与模板杂交(即，序列沿着与引物互补的模板)。引物在每个模板上的一致定位，允许在孔内所有新核酸链的协调合成，由此导致更大的信噪比。
[0635] 在有些实施方案中，然后以流体或通过任意其它合适的方法，以先后次序将核苷酸加入流动室，并从而加入孔中。核苷酸可以以任意次序加入，只要它是已知的，且为了简单，在运行中保持恒定。
[0636] 如本文提及的，在有些实施方案中，所述方法依赖于PPi和未掺入的核苷酸的检测。在其它实施方案中，不检测未掺入的核苷酸。这可以如下实现，例如通过将ATP加入洗涤缓冲液，使得流入孔中的dNTP从孔置换ATP。ATP匹配进入孔中的dNTP的离子强度，且也具有与那些dNTP类似的扩散特性。以此方式，在测序反应过程中dNTP的流入和流出不会干扰在chemFET处的测量。使用的ATP的浓度是使用的dNTP的浓度的量级。
[0637] 在有些实施方案中，具体地其中使用低离子强度环境，用二价阳离子，诸如但不限2+ 2+
于Mg (例如以MgCl2的形式)或Mn (例如以MnCl2的形式)，预温育dNTP和/或聚合酶。
2+ 2+
也可以使用其它二价阳离子，包括但不限于Ca 、Co 。该预温育(和因而“预装载”dNTP和/或聚合酶)可以确保，将聚合酶暴露于足够量的二价阳离子，以发挥适当且必要的功能，即使它存在于低离子强度环境中。根据该实施方案，预温育可以发生1-60分钟、5-45分钟或10-30分钟，尽管本发明不限于这些时间范围。
于Mg (例如以MgCl2的形式)或Mn (例如以MnCl2的形式)，预温育dNTP和/或聚合酶。
2+ 2+
也可以使用其它二价阳离子，包括但不限于Ca 、Co 。该预温育(和因而“预装载”dNTP和/或聚合酶)可以确保，将聚合酶暴露于足够量的二价阳离子，以发挥适当且必要的功能，即使它存在于低离子强度环境中。根据该实施方案，预温育可以发生1-60分钟、5-45分钟或10-30分钟，尽管本发明不限于这些时间范围。
[0638] 测序周期因此可以如下进行：用洗涤缓冲液(任选地含有ATP)洗涤流动室(和孔)，将第一种dNTP物质(例如，dATP)引入流动室(和孔)，释放和检测PPi和然后未掺入的核苷酸(如果发生掺入)或仅检测未掺入的核苷酸(如果未发生掺入)(通过任一种本文所述的机理)，用洗涤缓冲液洗涤流动室(和孔)，用含有腺苷三磷酸双磷酸酶的洗涤缓冲液洗涤流动室(和孔)(以在后面的dNTP流过之前去除尽可能多的未掺入的核苷酸)，用洗涤缓冲液洗涤流动室(和孔)，并引入第二种dNTP物质。该过程继续至所有4种dNTP(即，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)已经流过室，并允许掺入新合成的链。该4-核苷酸周期可以重复任意次数，包括但不限于10、25、50、100、200或更多次。周期的数目由测序的模板的长度、补充反应试剂(尤其是dNTP储液和洗涤缓冲液)的需要决定。
[0639] 作为测序反应的一部分，如果它的互补核苷酸存在于模板核酸的相同位置处，可以将dNTP连接至(或“掺入”，如本文使用的)新合成的链的3’(或测序引物的3’末端，在首先掺入dNTP的情况下)。引入的dNTP的掺入(和伴随的PPi释放)因此指示模板核酸中对应的核苷酸的种类。如果还没有掺入dNTP，则在chemFET表面处仅检测到与未掺入的核苷酸相对应的单个离子脉冲。因此可以得出结论，在该位置处的模板中不存在互补的核苷酸。如果引入的dNTP已经掺入新合成的链，则chemFET将会检测与PPi相对应的第一个离子脉冲和与未掺入的核苷酸相对应的第二个脉冲。另外可能定量掺入的dNTP的数目，例如通过测量第一个(PPi)离子脉冲时间(即，t0)和第二个(未掺入的核苷酸)离子脉冲时间(即，t1)之间的时间差。时间差越大，掺入的核苷酸的数目越大。结果是，在模板的均聚物延伸(例如，聚腺苷酸、聚胸苷酸、聚胞苷酸或聚鸟苷酸)的测序中，没有丢失序列信息。
[0640] 腺苷三磷酸双磷酸酶是这样的酶，其降解残余的未掺入的核苷酸，在该过程中将它们转化成单磷酸盐，并释放无机磷酸盐。它可用于降解未掺入的和/或多余的dNTP。在测量结束之后和在引入后续的dNTP之前从所有孔洗掉多余的和/或未掺入的dNTP，是重要的。因此，在引入不同的dNTP之间加入腺苷三磷酸双磷酸酶，可以用于去除未掺入的dNTP，它们否则会干扰测序数据。
[0641] 其它测序反应试剂(诸如上述的那些)可以引入反应中，尽管在某些情况下，这可能不是必要的。例如，在必要时，可以加入其它聚合酶、DTT、SBB等。
[0642] 本发明因此预见到同时执行多个不同的测序反应。同时在每个被占据的孔中发生多个相同的测序反应。每个孔内的这种同时且相同的dNTP掺入，会增加信噪比。通过在多个孔中同时进行测序反应，对多个不同的核酸同时测序。
[0643] 该方法的目的是，对于任意给定的dNTP，使在所有微孔之间的完全掺入最大化，减少或降低信号检测结束以后在孔中剩余的未掺入的dNTP的数目，和实现尽可能高的信噪比。
[0644] 测序反应可以运行在一定温度范围内。典型地，反应运行在30-60℃、35-55℃或40-45℃的范围内。优选地，在防止在核酸中形成二级结构的温度运行反应。但是，这必须与在更高的温度时引物(和新合成的链)向模板核酸的结合和腺苷三磷酸双磷酸酶半衰期减少相平衡。一种合适的温度是约41℃。通常将溶液(包括洗涤缓冲液和dNTP溶液)温热至这些温度，从而不改变孔中的温度。但是，优选地将含有腺苷三磷酸双磷酸酶的洗涤缓冲液维持在更低的温度，以便延长该酶的半衰期。典型地，该溶液维持在约4-15℃、更优选
4-10℃。应当理解，在低离子浓度测序可以降低测序引物的Tm，可能低于聚合酶的最适Tm。
本发明因此预见到，测序引物可以包含核苷酸修饰，诸如修饰的碱基、连接的核酸(LNA)单体、肽核酸(PNA)单体，或者小沟结合剂可以用于升高引物Tm到合适范围内。核苷酸掺入反应可以非常快地发生。结果，在某些情况下，可能希望减慢反应或减慢孔中分析物的扩散，从而确保反应过程中的最大数据捕获。可以以许多方式减慢试剂和/或副产物的扩散，该方式包括但不限于将填充珠子加入孔中，和/或在孔中使用聚合物诸如聚乙二醇(例如，结合到捕获珠子和/或填充珠子上的PEG)。填充珠子也倾向于增加在chemFET表面处的试剂和/或副产物的浓度，由此增加信号的可能性。填充珠子的存在通常允许更大的取样时间(例如，2-或4-倍)。
4-10℃。应当理解，在低离子浓度测序可以降低测序引物的Tm，可能低于聚合酶的最适Tm。
本发明因此预见到，测序引物可以包含核苷酸修饰，诸如修饰的碱基、连接的核酸(LNA)单体、肽核酸(PNA)单体，或者小沟结合剂可以用于升高引物Tm到合适范围内。核苷酸掺入反应可以非常快地发生。结果，在某些情况下，可能希望减慢反应或减慢孔中分析物的扩散，从而确保反应过程中的最大数据捕获。可以以许多方式减慢试剂和/或副产物的扩散，该方式包括但不限于将填充珠子加入孔中，和/或在孔中使用聚合物诸如聚乙二醇(例如，结合到捕获珠子和/或填充珠子上的PEG)。填充珠子也倾向于增加在chemFET表面处的试剂和/或副产物的浓度，由此增加信号的可能性。填充珠子的存在通常允许更大的取样时间(例如，2-或4-倍)。
[0645] 数据捕获速率可以在10-100帧/秒变化，且可以是例如其中任意值，使用哪个速率的选择至少部分地取决于孔尺寸和填充珠子或其它扩散限制技术的存在。更小的孔尺寸通常要求更快的数据捕获速率。
[0646] 在本发明的基于流动的且其中孔的上表面是开放的并与经过全部芯片的流体相+交流的某些方面，重要的是，在它扩散出孔之前，检测释放的PPi或其它副产物(例如，H)。
反应副产物扩散出孔，会导致假阴性(因为在该孔中未检出副产物)和在邻近或下游孔中的潜在假阳性(其中可以检出副产物)，因而应当避免。填充珠子和/或诸如PEG等聚合物也可以辅助减少孔之间扩散和/或串扰的程度。
反应副产物扩散出孔，会导致假阴性(因为在该孔中未检出副产物)和在邻近或下游孔中的潜在假阳性(其中可以检出副产物)，因而应当避免。填充珠子和/或诸如PEG等聚合物也可以辅助减少孔之间扩散和/或串扰的程度。
[0647] 因而，在某些实施方案中，除了核酸-负载的珠子以外，使用填充珠子。填充珠子可以是磁性的(包括超顺磁的)，但是它们不限于此。在某些实施方案中，填充珠子和捕获珠子由相同材料制成(例如，二者都是磁性的，二者都是聚苯乙烯等)，而在其它实施方案中，它们由不同材料制成(例如，填充珠子是聚苯乙烯，且捕获珠子是磁性的)。填充珠子通常小于捕获珠子。尺寸差异可以变化，且可以是5-倍、10-倍、15-倍、20-倍或更多。作为一个实例，0.35μm直径填充珠子可以与5.91μm捕获珠子一起使用。这样的填充珠子可从诸如Bang Labs等来源商业得到。填充珠子相对于捕获珠子的放置可以变化。例如，填充珠子可以围绕捕获珠子，由此防止捕获珠子接触chemFET表面。作为另一个实例，可以在捕获珠子之后，将填充珠子装载进孔中，在该情况下，捕获珠子接触chemFET表面。在捕获珠子和chemFET表面之间存在的填充珠子会减慢诸如PPi等测序副产物的扩散，由此促进数据捕获。
[0648] 本发明另外预见到，将填充珠子或修饰应用于chemFET表面(如本文所述)，以预防chemFET表面接触和从而干扰结合到捕获珠子上的模板核酸。深度或高度为0.1-0.5μm的填充珠子层会排除该相互作用。
[0649] 在测序反应之前可以分析阵列，以确定珠子的位置。已经发现，在没有流动存在下，背景信号(即，噪音)小于或等于约0.25mV，但是在有DNA-负载的捕获珠子存在下，该信号增加至约1.0mV＝/-0.5mV。该增加足以允许用珠子测定孔。
[0651] 一种优选的试剂盒包含一个或多个装有洗涤缓冲液的容器、一个或多个各自装有下述试剂之一的容器：dATP缓冲液、dCTP缓冲液、dGTP缓冲液或dTTP缓冲液、dATP、dCTP、dGTP和dTTP储液、腺苷三磷酸双磷酸酶、SSB、聚合酶、填充珠子和任选的焦磷酸酶。重要的是，试剂盒可以只包含天然存在的dNTP。试剂盒还可以包含一种或多种含有实施例所述组分的洗涤缓冲液，但是不限于此。试剂盒还可以包含使用说明书，其包括例证本发明方法的简图。
[0652] 应当理解，使用chemFET阵列，也可以检测受体和配体之间、或结合对的2个成员之间或分子复合物的组分之间的相互作用。这种相互作用的实例包括核酸彼此的杂交、蛋白-核酸结合、蛋白-蛋白结合、酶-底物结合、酶-抑制剂结合、抗原-抗体结合等。根据本发明，可以检测造成在FET界面处的半导体电荷密度变化并因而改变从源流向本文所述传感器的排出装置的电流的任意结合或杂交事件。
[0653] 在这些实施方案中，钝化层(或可能地，包被在钝化层上的中间层)被核酸(例如，DNA、RNA、miRNA、cDNA等)、抗原(其可以是任意性质)、蛋白(例如，酶、辅因子、抗体、抗体片段等)等官能化。这些实体与钝化层的缀合可以是直接的或间接的(例如，使用双功能连接物，其结合钝化层反应基团和要结合的实体)。
[0654] 作为一个实例，可以在合成期间将反应基团(诸如胺或硫醇基团)添加到核酸的任意核苷酸处，以提供双功能连接物的结合点。作为另一个实例，通过掺入缀合活性试剂可以合成核酸，该缀合活性试剂诸如Uni-Link AminoModifier、3′-DMT-C6-Amine-ON CPG、AminoModifier II、N-TFA-C6-AminoModifier、C6-ThiolModifier、C6-二硫化物亚磷酰胺和C6-二硫化物CPG(Clontech，Palo Alto，CA)。下面讨论了用于结合核酸的其它方法。
[0655] 在本发明的一个方面，与核酸阵列组合地提供chemFET阵列。可以将短核酸(例如，寡核苷酸)或更长核酸(例如，全长cDNA)形式的核酸提供在本文所述阵列的chemFET表面上。核酸阵列通常包含在平面表面上的多个物理上确定的区域(例如，“斑点”)，它们每个已经缀合一个和多个、优选多个核酸。核酸通常是单链的。缀合到给定斑点上的核酸通常是相同的。在寡核苷酸阵列的背景下，这些核酸可以是长度小于100个核苷酸的量级(包括长度为约10、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸)。如果阵列用于检测某些基因(包括这些基因中的突变或这些基因中的表达水平)，则阵列可以包括许多斑点，它们每个含有跨该基因的确定的且潜在不同的序列的寡核苷酸。然后将这些斑点在平面表面上定位，以便排除在阵列的杂交和读出装置中的位置有关的效应。
[0656] 使阵列接触待测样品。样品可以是基因组DNA样品，来自细胞、组织或块(例如，肿瘤)的cDNA样品，生长在阵列上的细胞群体(可能是在与下面的传感器阵列相对应的二维阵列中)等。这样的阵列因此可用于测定特定基因或它的表达的存在和/或水平，检测特定基因内的突变(诸如但不限于缺失、添加、置换，包括单核苷酸多态性)等。
[0657] 样品核酸和固定化的核酸的结合或杂交，通常在严格杂交条件(作为本领域理解的术语，参见例如Sambrook等人“Maniatis”)下进行。相关条件的实例包括(以递增严格性次序)：温育温度为25℃、37℃、50℃和68℃；缓冲液浓度为10X SSC、6X SSC、4X SSC、1X SSC、0.1X SSC(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)，和使用其它缓冲系统的它们的等效物；甲酰胺浓度为0％、25％、50％和75％；温育时间从5分钟至24小时；1、2或更多个洗涤步骤；洗涤温育时间为1、2或15分钟；且洗液为6X SSC、1X SSC、0.1X SSC或去离子水。作为实例，杂交可以在50％甲酰胺和4X SSC中进行，随后用50℃的2X SSC/甲酰胺和用1X SSC洗涤。
[0658] 核酸阵列包括这样的阵列，其中已经形成的核酸诸如cDNA被沉积(或“印迹”)在阵列的一个具体位置上。通过压电沉积、核酸与聚合物层(诸如但不限于聚-L-赖氨酸或聚吡咯)的紫外交联、直接缀合硅涂覆的SiO2(如公开的美国专利申请2003/0186262所述)、直接缀合硅烷化的chemFET表面(例如，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理过的表面，例如如Uslu等人Biosensors and Bioelectronics 2004，19：1723-1731所述)，可以将核酸印迹在表面上。
[0659] 核酸阵列也包括这样的阵列，其中直接在阵列上合成核酸(诸如已知序列的寡核苷酸)。使用本领域公知的技术，可以在阵列上合成核酸，所述技术诸如但不限于用细尖针印制在玻璃载玻片上、使用预制备的掩蔽物的光刻、使用动态的微镜装置(诸如DLP镜子)的光刻、喷墨印刷或电化学在微电极阵列上。也可以参考Nuwaysir等人2002“Gene expression analysis using oligonucleotide arrays produced by maskless photolithography.”Genome Res 12：1749-1755。该后一类阵列的商业来源包括Agilent、Affymetrix和NimbleGen。
[0660] 因而，可以给chemFET钝化层包被核酸要与其结合和/或合成来源的反应性分子(和因此反应基团)的中间层。
[0661] 本发明预见到，将这样的核酸阵列与chemFET阵列和尤其是本文所述的“大规模”chemFET阵列相组合。chemFET/核酸阵列可以用于多种用途，其中的一些不需要孔(或微孔或反应室，它们在本文中互换使用)。因为分析物可能仍然在流体中，包括在“封闭的”系统中(即，其中试剂和洗涤溶液等的流动被自动化)，将存在位于阵列上面且与之接触的一个或多个流动室。多个流动室的使用允许同时分析多个样品(或核酸文库)。可能存在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个流动室。该结构同样适用于其它生物阵列，包括本文讨论的那些，诸如蛋白阵列、抗体阵列、酶阵列、化学阵列等。
[0662] 因为通过下面的FET电子地检测结合配偶体之间或复合物组分之间的结合事件，可以进行这种测定，不需要操纵(例如，非固有地标记)待测样品。这是有利的，因为这种操纵经常导致样品损失，且通常需要增加的时间和处理。另外，本方法允许实时研究结合相互作用。
[0663] 也预见到了与本发明的chemFET阵列组合使用的蛋白阵列。蛋白阵列包含蛋白或肽或其它氨基酸，其含有以有组织的且预定的方式结合到平面表面上的生物部分。这样的蛋白包括、但不限于，酶、抗体和抗体片段或抗体模仿物(例如，单链抗体)。
[0664] 在一个实施方案中，蛋白阵列可以包含多个不同的蛋白(或其它含有氨基酸的生物部分)。每个蛋白，且优选多个蛋白，存在于阵列的预定区域或“单元”中。将区域(或单元)与传感器阵列中的传感器对准，使得对于每个区域(或单元)有一个传感器。单个区域(或单元)中的多个蛋白可以随蛋白尺寸和区域(或单元)的尺寸而变化，其可以是、但3 4
不限于至少10、50、100、500、10、10 或更大。阵列自身可以具有任意数目的单元，包括但不
2 3 4 5 6 7
限于至少10、10、10、10、10、10、10 或更多。在一个用途中，将阵列暴露于已知含有或疑似含有结合蛋白的分析物的样品。如果蛋白是酶，分析物可以是底物或抑制剂。分析物可以是结合蛋白(包括另一种蛋白)、核酸、化学物质(无论合成的还是天然存在的)等的任意分子。
不限于至少10、50、100、500、10、10 或更大。阵列自身可以具有任意数目的单元，包括但不
2 3 4 5 6 7
限于至少10、10、10、10、10、10、10 或更多。在一个用途中，将阵列暴露于已知含有或疑似含有结合蛋白的分析物的样品。如果蛋白是酶，分析物可以是底物或抑制剂。分析物可以是结合蛋白(包括另一种蛋白)、核酸、化学物质(无论合成的还是天然存在的)等的任意分子。
[0665] 应当理解，象本文预见到的核酸阵列一样，来自蛋白阵列的读出将是穿过chemFET的电流变化，且因而在这些阵列方法中不需要额外的标记和/或标记物检测的步骤。
[0666] 在另一个实施方案中，蛋白阵列可以包含多个相同的蛋白(或其它含有氨基酸的生物部分)。相同的蛋白可以均匀地分布在平面表面上，或它们可以在表面上组织成离散区域(或单元)。在这些后面的实施方案中，将区域(或单元)与传感器阵列中的传感器对准，使得对于每个区域(或单元)有一个传感器。
[0667] 蛋白可以在芯片外合成，然后纯化，并结合到阵列上。或者，它们可以在芯片上合成，类似于上面讨论的核酸。使用无细胞的DNA表达或化学合成的蛋白合成，易于在芯片上合成。使用无细胞的DNA表达，在合成后将蛋白结合到固体支持物上。或者，使用固相肽合成，可以在固体支持物上化学地合成蛋白。通过刻制方法或通过SPOT-合成，进行选择性的去保护。至少可以参考MacBeath和Schreiber，Science，2000，289：1760-1763，或Jones等人Nature，2006，439：168-174。也可以参考Fodor等人的美国专利6919211。
[0668] 也预见到与chemFET阵列相组合的化学化合物微阵列。化学化合物微阵列可以如下制备：通过用不同的连接技术将化合物(例如，有机化合物)共价固定化在固体表面上(在文献中可以称作“小分子微阵列”)，通过将化合物(例如，有机化合物)印迹和干燥在固体表面上且不经固定化(在文献中可以称作“微阵列化的化合物筛选(μARCS)”)，或通过印迹在均匀溶液中的有机化合物且不经固定化和干燥效应(被Reaction Biology TMCorporation商业化为DiscoveryDot 技术)。
[0669] 本发明另外预见到与chemFET阵列相组合的组织微阵列。在Battifora Lab Invest 1986，55：244-248；Battifora和Mehta Lab Invest 1990，63：722-724；和Kononen等人Nat Med 1998，4：844-847中，更详细地讨论了组织微阵列。
[0670] chemFET阵列和生物或化学阵列的结构在每种情况下是类似的，且一种组合阵列的讨论适用于本文所述的或本领域已知的其它组合阵列。
[0671] 在另一个方面，本发明预见到细胞培养物(例如，二维细胞培养物)(参见例如Baumann等人Sensors and Actuators B 55 1999 77：89)和放置成与chemFET阵列相接触的组织切片的分析。作为一个实例，可以将脑切片放置成与本发明的chemFET阵列相接触，且可以在有或没有刺激(诸如但不限于神经毒素等)存在下检测切片的变化。由此可以分析神经过程和/或刺激的转导。在这些实施方案中，通过经由钝化层自身或经由包被在钝化层上的这些离子的受体检测钙和/或钾流，可以运行chemFET。
[0672] 在另一个方面，本发明预见到如本文所述或以其它方式官能化的chemFET阵列用于体内用途的应用。可以将这样的阵列导入对象中(例如，在遭受离子流的脑或其它区域中)，然后基于所述对象的状态分析变化。
[0673] 本领域已经描述了将核酸、蛋白、分子等结合到固体支持物上的方法，尤其在阵列的背景下。参见例如Lipshutz等人Nat.Genet.(增刊)1999 21：20-24；Li等人Proc.Natl.Acad.Sci.，2001，98：31-36；Lockhart等 人Nat.Biotechnol.1996 14：1675-1680；Wodicka等人Nat.Biotechnol.1997 15：1359-1367；Chen等人Journal of Biomedical Optics 19972：364；Duggan等人Nat Genet 1991 21(1 Suppl)：10-4；Marton等人Nat Med.19984(11)：1293-301；Kononen等人Nat Med 1998 4(7)：844-847；MacBeath等人，Science 2000 289(5485)：1760-1763；Haab等人Genome Biology 2001 2(2)；Pollack等人Nat Genet 1999 23(1)：41-6；Wang DG等人Science 1998 280(5366)：1077-82；
Fodor等人Science 1991 251：767-773；Fodor等人Nature 1993 364：555-556；Pease等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 1994 91：5022-5026；Fodor Science 1997 277：393-395；
Southern等人Genomics 1992 13：1008-1017；Schena等人Science 1995 270(5235)：
467-70；Shalon 等 人 Genome Res 1996 6(7)：639-45；Jongsma Proteomics 2006，6：
2650-2655；Sakata，Biosensors and Bioelectronics 2007，22：1311-1316。
Fodor等人Science 1991 251：767-773；Fodor等人Nature 1993 364：555-556；Pease等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 1994 91：5022-5026；Fodor Science 1997 277：393-395；
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2650-2655；Sakata，Biosensors and Bioelectronics 2007，22：1311-1316。
[0674] 本文所述的系统可以用于测序未标记的生物聚合物，不需要光学检测。
[0675] 在有些实施方案中，本发明包括这样的测序装置，其适合测序未标记的生物聚合物，不需要光学检测，且包含至少100个反应室的阵列。
[0676] 典型地，每个反应室电容地与chemFET偶联。
[0677] 优选地，每个反应室具有不大于约0.39pL的体积和约49μm2的表面孔，更优选2
地具有不大于约16μm 的孔和不大于约0.064pL的体积。优选地，阵列具有至少1,000、
10,000、100,000或1,000,000个反应室。
地具有不大于约16μm 的孔和不大于约0.064pL的体积。优选地，阵列具有至少1,000、
10,000、100,000或1,000,000个反应室。
[0678] 典型地，反应室包含微流体孔。
[0679] 优选地，所述装置适合测序至少106个碱基对/小时、更优选至少107个碱基对/8
小时、最优选至少10 个碱基对/小时。
小时、最优选至少10 个碱基对/小时。
[0680] 在另一个实施方案中，本发明包括使用上述装置测序生物聚合物的方法，包括，测量单个单体掺入延长的聚合物中的时间。
[0681] 典型地，生物聚合物是核酸模板，且单体是核苷酸。优选地，核酸模板具有200-700个碱基对。优选地，在测定序列之前，扩增核酸模板。
[0682] 典型地，在扩散受限条件下进行测量。所述测量可以包括，检测电变化、检测离子脉冲或检测无机焦磷酸(“PPi”)的释放。优选地，掺入可以发生在不大于400μM的离子2+ 2+
强度，其中Mg 或Mn 或其它二价阳离子的浓度不大于100μM。使用上述方法，优选每小
6 7 8
时测序至少10 个碱基对、更优选每小时测序至少10 个碱基对、最优选每小时测序至少10个碱基对。优选地，通过上述的chemFET阵列，实现检测。
强度，其中Mg 或Mn 或其它二价阳离子的浓度不大于100μM。使用上述方法，优选每小
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时测序至少10 个碱基对、更优选每小时测序至少10 个碱基对、最优选每小时测序至少10个碱基对。优选地，通过上述的chemFET阵列，实现检测。
[0683] 在有些实施方案中，本发明包括测定核酸序列的方法，包括：同时进行至少100个测序反应；并测定序列，不使用标记，且不使用光学检测。
[0684] 通过本领域普通技术人员已知的多种方法，可以从多种来源衍生出在本发明的该方法和其它方法中使用的核酸模板。模板可以源自、但不限于：不同复杂性的整个基因组、cDNA、mRNA或siRNA样品，或可以代表整个群体，如在不同的环境和代谢组(metabiome)测序计划中。模板核酸也可以产生自核酸群体的特定子集，包括但不限于PCR产物、特定外显子或目标区域、或16S或其它诊断或鉴别基因组区域。
[0685] 典型地，测序要求的原料是小于3μg的核酸。优选地，在测序之前，扩增模板核酸。任选地，在测序之前，使模板核酸结合到一个或多个珠子上。
[0686] 典型地，测定步骤包括，测量一个或多个第一单体掺入延伸序列中所需的时间量。典型地，在扩散受限条件下测量单体的掺入。测量可以包含，检测电变化、检测离子脉冲或检测无机焦磷酸(“PPi”)的释放。
[0687] 优选地，使用上述方法，优选每小时测序至少106个碱基对、更优选每小时测序至7 8
少10 个碱基对、最优选每小时测序至少10 个碱基对。因而，所述方法可以用于在约24小时内、更优选在约20小时内、更优选在约15小时内、更优选在约10小时内、更优选在约5小时内、最优选在约1小时内测序整个人基因组。这些速率可以如下实现：使用多个本文所示的ISFET阵列，并平行地处理它们的输出。
少10 个碱基对、最优选每小时测序至少10 个碱基对。因而，所述方法可以用于在约24小时内、更优选在约20小时内、更优选在约15小时内、更优选在约10小时内、更优选在约5小时内、最优选在约1小时内测序整个人基因组。这些速率可以如下实现：使用多个本文所示的ISFET阵列，并平行地处理它们的输出。
[0688] 下面的实施例为了例证目的而包括，无意限制本发明的范围。
[0689] 实施例
[0690] 实施例1.珠子制备
[0691] 单链寡核苷酸向抗生蛋白链菌素-包被的磁性珠子的结合。从IDT(Integrated DNA Technologies，Coralville，IN)订购具有5’双生物素标签的单链DNA寡核苷酸模板(HPLC纯化)和20-碱基通用引物。模板的长度是60个碱基，并设计成在3’末端包括与20-碱基引物互补的20个碱基(表3，斜体字)。将冻干的和生物素化的模板和引物重新悬浮于TE缓冲液(10mMTris-HCl、1mM EDTA、pH8)中，分别作为40μM储备溶液和400μM储备溶液，并在-20℃储藏备用。
[0692] 对于每个模板，通过用120μl珠子洗涤缓冲液洗涤3次，然后分别与在5’末端具有生物素的模板1、2、3和4(T1、T2、T3、T4：表3)一起温育，制备60μl磁性5.91μm(Bangs Laboratories，Inc.Fishers，IN)抗生蛋白链菌素-包被的珠子，其储存在4℃的含水缓冲4
悬液中(8.57x 10 珠子/μL)。
悬液中(8.57x 10 珠子/μL)。
[0693] 由于抗生蛋白链菌素对生物素的强共价结合亲和力(Kd～10-15)，这些磁性珠子被用于将模板固定化在固体支持物上，如下所述。报道的这些珠子对游离生物素的结合容量是0.650pmol/μL珠子储备溶液。对于小的(＜100碱基)生物素化的ssDNA模板，保5
守地计算，每个珠子可以结合9.1x10 模板。使用简单的磁体，如使用Dynal磁性颗粒浓缩器或MPC-s(Invitrogen，Carlsbad，CA)，可以容易地浓缩珠子。在所述实验中使用MPC-s。
守地计算，每个珠子可以结合9.1x10 模板。使用简单的磁体，如使用Dynal磁性颗粒浓缩器或MPC-s(Invitrogen，Carlsbad，CA)，可以容易地浓缩珠子。在所述实验中使用MPC-s。
[0694] 在每次洗涤之间，用MPC-s浓缩珠子1分钟，然后加入缓冲液，并重新悬浮珠子。在第三次洗涤后，将珠子重新悬浮于120μL珠子洗涤缓冲液+1μl每种模板(40μM)。在旋转下(Labquake Tube旋转器，Barnstead，Dubuque，IA)，将珠子温育30分钟。在温育后，再在120μL退火缓冲液(20mM Tris-HCl、5mM醋酸镁、pH7.5)中洗涤珠子3次，并重新悬浮于60μL相同缓冲液中。
[0695] 表3.模板1、2、3和4的序列
[0696]
[0697] T1：5’/52Bio/GCA AGT GCC CTT AGG CTT CAG TTC AAA AGT CCT AAC TGG GCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3’(SEQ ID NO：1)
[0698] T2：5’/52Bio/CCA TGT CCC CTT AAG CCC CCC CCA TTC CCC CCT GAA CCC CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3’(SEQ ID NO：2)
[0699] T3：5’/52Bio/AAG CTC AAA AAC GGT AAA AAA AAG CCA AAA AAC TGG AAA ACA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3’(SEQ ID NO：3)
[0700] T4：5’/52Bio/TTC GAG TTT TTG CCA TTT TTT TTC GGT TTT TTG ACC TTT TCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3’(SEQ ID NO：4)
[0701] 测序引物的退火。然后使固定化的模板(其在5’末端结合到5.91μm磁性珠子上)与20-碱基引物退火，所述引物与模板的3’末端互补(表3)。然后向固定化的模板加入400μM引物储备溶液的1.0μL等分试样，其代表20-倍过量的引物，然后将珠子+模板与引物一起在95℃温育15分钟，然后使温度缓慢降低至室温。然后使用MPC-s，在120μL上述的25mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(25mM三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.4mg/mlPVP、0.1％吐温20、8.8mM醋酸镁；pH7.8)中洗涤珠子3次。将珠子重新悬浮于25mM三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液中。
[0702] 与DNA聚合酶一起温育杂交的模板/引物。基本上如Margulies等人Nature 2005437(15)：376-380和伴随的补充材料所述，与聚合酶一起温育模板和引物杂合体。
[0703] 制备的实验样品向ISFET传感器阵列上装载。ISFET阵列的尺寸和密度和放置在其上面的微流体可以随用途而异。一个非限制性实例是512x512阵列。这种阵列的每个网格(其中共有262144个)具有单个ISFET。每个网格也具有放置在它上面的孔(或它们在本文中互换地称作“微孔”)。孔(或微孔)可以具有任意形状，包括圆柱形、圆锥形、正方形、矩形等。在一个示例性的构造中，孔是具有7x 7x 10μm尺寸的正方形孔。孔之间的中心-中心距离在本文中称作“间距”。间距可以是任意距离，尽管优选地具有更短的间距，以便容纳尽可能大的阵列。间距可以小于50μm、小于40μm、小于30μm、小于20μm或小于10μm。在一个实施方案中，间距是约9μm。在阵列上面的整个室(孔位于其中)具有等于或小于约30μL、等于或小于约20μL、等于或小于约15μL或者等于或小于10μL的体积。这些体积因此也对应在所述室内的溶液的体积。
[0704] 在“开放”系统中装载珠子。将含有模板1-4的珠子装载上芯片(10μL每种模板)。简而言之，使用埃彭道夫吸管，将每个模板的等分试样加到芯片上。然后使用磁体将珠子拉入孔中。
[0705] 在“封闭”系统中装载珠子。使用流体装载捕获珠子和填充珠子。使用珠子装载装置(其包括大蓄池(体积约1mL)、小蓄池(体积约10μL)和用于处理小体积珠子溶液的微流体通道)，如图62-70所示，实现珠子溶液体积的微升精确度，以及通过流体连接放置珠子溶液。该方法也影响精确吸管所允许的流体施加的微升精确度。
[0706] 将包含ISFET阵列和流动池的芯片安置在装载固定装置的ZIF(零插入力)插座上，然后将不锈钢毛细管连接至流动池的一个口，并将柔性尼龙管道连接至另一个口。两种材料都是微流体-型流体通道(例如，＜0.01”内径的量级)。将由大和小蓄池组成的珠子装载装置连接至毛细管末端。给普通的塑料注射器充满缓冲溶液，然后连接到尼龙管道的游离端。将从芯片底部伸出的电引线插入在固定装置单元顶部上的插座(未显示)。
[0707] 将包含ISFET阵列和流动池的芯片安置在装载固定装置的插座诸如ZIF(零插入力)插座上，然后可以将不锈钢毛细管连接至流动池的一个口，并将柔性尼龙管道连接至另一个口。两种材料都是微流体-型流体通道(例如，＜0.01”内径的量级)。将由大和小蓄池组成的珠子装载装置连接至毛细管末端。给普通的塑料注射器充满缓冲溶液，然后连接到尼龙管道的游离端。将从芯片底部伸出的电引线插入在固定装置单元顶部上的插座(未显示)。
[0708] 应当理解，存在将珠子拉入流动室的孔中的其它方式，包括离心或重力。本发明在这方面不受限制。
[0709] 使用在开放系统中的ISFET传感器阵列的DNA测序。可以如下进行在“开放”系统(即，将ISFET芯片放置在ISFET装置的平台上，然后以下述次序手工地加入每个核苷酸(5μL，各自6.5μM)：dATP、dCTP、dGTP和dTT(100mM储备溶液，Pierce，Milwaukee，WI)中的示例性测序反应：通过将给定的核苷酸吸入已经在芯片表面上的液体，并以2.5mHz的速率从芯片收集数据。这可以导致大约18帧/秒的数据收集超过7.5秒。然后可以使用LabView分析数据。
[0710] 在给出模板序列的情况下，预见到，加入dATP会导致模板4的4碱基延伸。加入dCTP会导致模板1的4碱基延伸。加入dGTP会造成如表4指出的模板1、2和4延伸，且加入dTTP会导致跑掉(run-off)(指出的所有模板的延伸)。
[0711] 优选地，当以非自动化方式执行该方法时(即，在没有自动化的流动和试剂引入的情况下)，每个孔含有腺苷三磷酸双磷酸酶，以便降解未掺入的dNTP，或者在加入和掺入每个dNTP(例如，dATP)之后，且在加入另一个dNTP(例如，dTTP)之前，将腺苷三磷酸双磷酸酶加入每个孔中。应当理解，在该实施方案中或在本文讨论的任意其它实施方案中，可以腺苷三磷酸双磷酸酶替换为能降解dNTP的其它化合物(或酶)。
[0712] 表4.实验建立和核苷酸加入次序
[0713]dATP dCTP dGTP dTTP
T1 0 (3:C；1:A)4 1 跑掉(25)
T2 0 0 4 跑掉(26)
T3 0 0 0 跑掉(30)
T4 4 0 2 跑掉(24)
T1 0 (3:C；1:A)4 1 跑掉(25)
T2 0 0 4 跑掉(26)
T3 0 0 0 跑掉(30)
T4 4 0 2 跑掉(24)
[0714] 使用在传感器芯片上的微流体的DNA测序。流动方案中的测序是核苷酸试剂向DNA中掺入的开放应用的延伸。不是将试剂加入ISFET芯片上的总体溶液中，而是使试剂以顺序方式流过芯片表面，每次延长单个DNA碱基。依次流过dNTP，从dTTP开始，然后是dATP、dCTP和dGTP。由于在芯片上的流体移动的层流性质，核苷酸向微孔中的扩散和最终扩散在核酸负载的珠子周围，是主要递送机理。流动方案也确保，在应用之间，绝大部分核苷酸溶液被洗掉。这包含，在每个核苷酸流动之后，用缓冲溶液和腺苷三磷酸双磷酸酶溶液冲洗芯片。核苷酸和洗涤溶液储存在系统的化学试剂瓶中，并使用流体管道和自动化阀门的系统，流过芯片。ISFET芯片被活化，用于感知在核苷酸流动过程中DNA延伸的化学产物。
[0715] 实施例2.低离子强度对聚合酶活性的效应
[0716] 进行实验来测试不同聚合酶与本文讨论的测序方面和实施方案有关的某些功能性，具体地包括低离子强度核苷酸掺入反应。这些功能性包括聚合酶在低离子强度中延伸测序引物的能力、聚合酶在低离子强度中对引物/模板核酸杂合体的亲和力、引物延伸速率和在位于chemFET传感器上面的孔的背景下聚合酶延伸引物的能力。下面将讨论这些功能性中的每一个。
[0717] 在低离子强度中的聚合酶活性。通过测定引物沿着模板延伸的程度，可以测量聚合酶活性。设计了荧光报告物试验来测量聚合酶活性(图72A)。简而言之，通过抗生蛋白链菌素-生物素相互作用，将荧光标记的DNA寡核苷酸(在该实施例的上下文中称作模板)结合至超顺磁珠子上。用生物素标记模板的5’末端，用例如6-FAM标记模板的3’末端。用抗生蛋白链菌素标记珠子。使与模板的3’末端互补的DNA寡核苷酸引物与模板退火，并在含有缓冲剂、盐和dNTP的延伸溶液中与聚合酶一起温育珠子足够的时间，以基于模板序列延伸引物。温育后，通过连续洗涤珠子去除聚合酶和其它反应组分。如果通过预定的限制酶识别位点延伸引物，当与适当内切核酸酶(例如，HindIII)一起温育时，将释放荧光标记的双链DNA。然后对来自限制酶切消化的上清液进行荧光定量。释放的荧光的量级与限制内切核酸酶活性释放的DNA的量成比例，后者与在珠子上存在的双链DNA的量成比例，所述双链DNA的量又与聚合酶活性成比例。
[0718] 具体地，通过在没有dNTP存在下使聚合酶结合珠子-固定化的引物/模板杂合体，产生图72B和72C所示的数据。洗掉未结合的聚合酶和结合溶液组分后，将添加了dNTP的指示的延伸混合物(例如，标准的或低离子强度)加给珠子，并在40℃温育10分钟。随后如上所述完成活性测定，以测量指示的聚合酶的活性，并绘制背景去除的荧光。在图72C中，“Therminator(+)”指示在延伸溶液中加入dNTP，“Therminator(-)”指示在延伸溶液中没有dNTP，即分别是阳性和阴性对照。
[0719] 使用该试验，已经在标准的和低离子强度反应条件中测量了聚合酶活性。与标准条件相比，许多聚合酶在低离子强度条件中是相对有效的(图72B和72C)。
[0720] 在低离子强度中的聚合酶亲和力。使用我们的标准试验，可以间接地测量聚合酶对模板/引物杂合体的亲和力(图72A)。在不含dNTP的标准延伸溶液中，使3种不同的DNA聚合酶(T4exo-，Therminator，Klenow exo-)在室温结合引物-活化的、珠子-固定化的模板(图72A，步骤1)15分钟。然后洗涤珠子，以去除未结合的聚合酶和其它组分，然后重新悬浮于低离子强度溶液(例如，0.5mM Tris、100μM MgCl2、pH9.0、25℃)中，并在40℃温育。在图73指示的时间后，洗涤珠子，并重新悬浮于添加了20μM每种dNTP的低离子强度溶液(例如，0.5mM Tris、100μM MgCl2、pH9.0、25℃(对于Therminator和Klenow exo-)或0.5mM Tris、80μM MgCl2、pH9.0、25℃(对于T4exo-))中。如果聚合酶具有对模板/引物杂合体的低亲和力，预见到它会脱落并被洗掉，且结果，将不存在引物延伸。但是，如果聚合酶具有对模板/引物杂合体的高亲和力，它将保持结合，并在与dNTP一起温育时延伸模板。使用我们的标准试验，测量延伸的引物的量(图72A)，并绘制在图73中。引物延伸在所有时间点是相等的，表明当在40℃温育时所有3种聚合酶都紧密结合引物-活化的模板40分钟。作为阳性对照(指示为“(+)dNTP”)，测量了没有聚合酶与引物-活化的模板预结合的引物延伸，且作为阴性对照(指示为“(-)dNTP”)，测量了没有将dNTP加入延伸溶液中时的荧光。在低离子强度溶液中温育40分钟后，T4exo-聚合酶(3’至5’外切核酸酶缺陷型)、Therminator和Klenow exo-延伸引物，表明所有3种聚合酶在低离子强度中具有对模板/引物杂合体的高亲和力(图73)。
[0721] 聚合酶的速率。使用标准试验，通过测量每单位时间延伸的模板的部分，可以测量聚合酶沿着模板延伸引物的速率。T4exo-聚合酶(3’至5’外切核酸酶缺陷型)在标准反应条件(STD；10mM Tris-HCl、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、20μM每种dNTP、pH7.9、25℃)和低离子强度条件(LS；0.5mM Tris、80μM MgCl2、20μM每种dNTP、pH9.0、25℃)中都延伸引物，但是速率不同。T4的以前研究证实，T4在标准反应溶液中(即，在标准离子强度)可以以每秒4个核苷酸的最大稳态速率沿着模板延伸引物。在该速率，预期在标准反应溶液中的延伸在8.75秒内结束，实际上在实验中在约10秒时结束延伸(图
74A，T4-STD)。在低离子强度反应溶液中，T4在20秒内结束延伸，表明2倍降低。此外，当反应溶液是0.5mM Tris、20μM MgCl2和5μM每种dNTP时，T4的速率相对于80μM MgCl2和20μM每种dNTP(即，图74A的低离子强度溶液，参见图74B)降低约2倍，并相对于10mM MgCl2和20μM每种dNTP(即，图74A的标准溶液，数据未显示)降低4倍。已经报道，T4以二相性动力学聚合，包括最初的聚合(或掺入)爆发和随后较慢的聚合速率。该最初聚合爆发可以补偿在低离子强度时观察到的轻微降低的速率(Capson等人Biochemistry 1992
31：10984-10994.)。
74A，T4-STD)。在低离子强度反应溶液中，T4在20秒内结束延伸，表明2倍降低。此外，当反应溶液是0.5mM Tris、20μM MgCl2和5μM每种dNTP时，T4的速率相对于80μM MgCl2和20μM每种dNTP(即，图74A的低离子强度溶液，参见图74B)降低约2倍，并相对于10mM MgCl2和20μM每种dNTP(即，图74A的标准溶液，数据未显示)降低4倍。已经报道，T4以二相性动力学聚合，包括最初的聚合(或掺入)爆发和随后较慢的聚合速率。该最初聚合爆发可以补偿在低离子强度时观察到的轻微降低的速率(Capson等人Biochemistry 1992
31：10984-10994.)。
[0722] Therminator和Bst聚合酶在标准反应条件(STD；20mM Tris-HCl、10mM(NH2)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、pH8.8、25℃)和低离子强度条件(LS；0.5mM Tris、100μM MgCl2、20μM每种dNTP、pH9.0、25℃)中都可以延伸引物。在低离子强度条件中的稳态速率比这些聚合酶在标准离子强度条件中的延伸更慢，且比在低离子强度延伸溶液中的T4引物延伸的稳态速率更慢。
[0723] 在传感器孔中的引物延伸。使用与标准活性试验(图72A)类似的试验，在chemFET传感器的硅孔中测试了引物延伸，以测定传感器孔壁材料是否会抑制聚合酶。该试验与上述试验的差别仅在于，未用6-FAM标记模板。将含有聚合酶-结合的引物-活化的模板的珠子吸到硅染料上(如图75A所示)，在40℃温育1分钟，随后加入在低盐缓冲液中的dNTP。温育后，从芯片回收珠子，并进行标准限制酶切消化。使用BioAnalyzer，通过DNA片段分离来测量引物延伸。dNTP的加入产生片段，而没有dNTP的反应不会，表明传感器孔壁材料不会抑制引物的聚合酶延伸(图75B)。
[0724] 实施例3.增加速度和通量
[0725] 在ISFET/chemFET芯片上使用的阵列结构的一个优点是，所有微孔平行地接收和处理化学物质，且平行地分析FET的输出。尽管单个芯片限于N个孔，且数字N将随时间增加(因为半导体处理使装置收缩得甚至更小)，无论在单个芯片上存在多少FET和孔(也称作反应室)，可以用在平行地运行的相同机器中的2个或更多个芯片容易地建立系统；或多个机器可以平行地运行，且随着它们的FET提供输出，可以平行地处理那些输出，以减少测序基因组或进行另一种分析所需的时间。平行的计算是众所周知的，计算机科学工作者已知多种构建几个芯片的输出的处理的方式，以加速希望的输出的计算。因此，使用多个芯片，每个芯片具有256k或更多个微孔，可以在1小时或仅几小时的时段内容易地从样品提取人基因组。随着芯片速度增加和装置尺寸缩小，用单个芯片可能实现这些时间。
[0726] 上面已经解释了离子脉冲检测方案的理论和目的，提供条件的基础实施例可能对某些人而言是有帮助的，所述条件基于模拟(在某些情况下)似乎可用于实现DNA测序反应的检测。
[0727] 溶液中的离子。离子强度是在测定离子脉冲响应时所涉及的一个因素。限制反应缓冲液中的离子是有帮助的。假定0.5mM Tris和使用Cl-来平衡变化，可以测定下述的：
[0728] 物质 浓度(mM)
[0729] Tris 0.452
[0730] Tris-H+ 0.048
[0731] Cl- 0.048
[0732] 考虑0.5mM Tris的情况，因为通过放大上述浓度，可以给出Tris的其它浓度(例如5-20mM)。假定pH恒定在8.8。溶液中的其它物质包括反应物和产物。
[0733]
[0734]
[0735] 这是放大到0.5mM Tris-HCl的反应缓冲液的情形。假定，通过预浸泡，使所有Mg++2
都络合到酶上。从反应溶液和测序反应的扩散方程，计算离子强度I＝1/2∑sqsCs，且传感器动力学由上述关系给出。
都络合到酶上。从反应溶液和测序反应的扩散方程，计算离子强度I＝1/2∑sqsCs，且传感器动力学由上述关系给出。
[0736] 由于浓度变化较小，可能进行浓度变化中的离子强度的扩展：
[0737] I＝{119.227+6.67[PPi]+2.78[Pi]+0.79[释放的H+]-9.52(6.5μM-[dNTP])}x -610 (5)
[0738] pH是8.80。
[0739] 对于在0.5mM Tris的BST反应缓冲液，其含有离子和硫酸：
[0740] I＝{1452.46+6.5[PPi]+2.87[Pi]+0.98[释 放 的 H+]-9.98(6.5μM-[dNTP])}-6x10 (5’)
[0741] 对于5mM Tris缓冲液，离子强度由下式给出
[0742] I＝{555.803+7.43[PPi]+2.92[Pi]+0.98[释放的H+]-9.90(6.5μM-[dNTP])}-6x10 (5”)
[0743] pH是9.03。
[0744] 对于0.5mM Tris+1mM MgCl2，离子强度由下式给出
[0745] I＝{3119.86+6.94[PPi]+2.78[Pi]+0.91[释放的H+]-9.49(6.5μM-[dNTP])}-6x10 (5”’)
[0746] pH是8.81。
[0747] 对于5mM Tris+1mM MgCl2，离子强度由下式给出
[0748] I＝{3556.67+7.71[PPi]+2.93[Pi]+0.98[释放的H+]-9.89(6.5μM-[dNTP])}-6x10 (5””)
[0749] pH是9.04。
[0750] 对于0.5mM Tris，离子强度由下式给出
[0751] I＝{250.699+6.44[PPi]+2.83[Pi]+0.96[释 放 的 H+]-9.67(20μM-[dNTP])}-6x10 (5””’)
[0752] pH是8.53(存在dNTP)和8.97(没有dNTP)。
[0753] 对于0.5mM Tris+50μM MgCl2，离子强度由下式给出
[0754] I＝{400.759+6.46[PPi]+2.84[Pi]+0.96[释 放 的 H+]-9.66(20μM-[dNTP])}-6x10 (5”””)
[0755] pH是8.53(存在dNTP)和8.97(没有dNTP)。
[0756] 最后，考虑pH＝9且离子强度＝300mM的不含有dNTP的标准缓冲液。方程将是[0757] I＝{493.20+6.46[PPi]+2.84[Pi]+0.96[释放的H+]-9.66(20μM-[dNTP])}x10-6 (5”””’)
[0758] 应当指出，信号与I-1/2成比例，所以希望保持反应缓冲溶液的离子强度尽可能低。-1/2 -1/2 -1/2
注意，(I0+dI) ＝I0 -1/2(dI/I0)I0 。因而，信号的相对变化-1/2(dI/I0)。通过对比方程5-5”””’，可以看出，dI大致独立于缓冲液离子强度。因而，如果最初离子强度I0越低，相对信号变化越大。
注意，(I0+dI) ＝I0 -1/2(dI/I0)I0 。因而，信号的相对变化-1/2(dI/I0)。通过对比方程5-5”””’，可以看出，dI大致独立于缓冲液离子强度。因而，如果最初离子强度I0越低，相对信号变化越大。
[0759] 反应/扩散计算
[0760] 发生的反应是
[0761] d[DNA]/dt＝-kbst[dNTP][DNA]
[0762] d[PPi]/dt＝kbst[dNTP][DNA]
[0763] d[dNTP]/dt＝kbst[dNTP][DNA]
[0764] 如果存在反应PPi+H2O→2Pi的酶，则假定该反应瞬时发生。除了DNA以外，所有+这些物质以单个扩散系数扩散。但是，通过加入更多DNA碱基释放的H 确实扩散。
[0765] 可以使用有限元法来计算这些物质的反应和扩散。该方法优选地在柱面坐标中编++码。每个单元中的反应遵循上面的线路图，下面注解了Mg 对反应速率的影响。另外，也跟++ ++
踪Mg 的扩散。但是，在电流计算中记住，假定Mg 是恒定的。
踪Mg 的扩散。但是，在电流计算中记住，假定Mg 是恒定的。
[0766] 针对扩散进直径D且深度H的圆筒中的分析溶液，检查数值码：
[0767] C(r，z，t)＝c0-c0(2/π)∑n＝0∞[e-D(n+1/2)^2 π^2 t/H^2/(n+1/2)]sin[(n+1/2)πz/H]
[0768] 如果使用在r方向的(D/2)/100点和在z方向的H/100点的网格，结果符合0.1％准确度。
[0769] 为了确定参数kbst，使用来自Rothberg等人Nature论文的结果。该论文提出了相关扩散的简化的质量传递计算，由此得到的相关反应是
[0770] d[DNA]/dt＝-kbst[dNTP][DNA]
[0771] d[PPi]/dt＝kbst[dNTP][DNA]-kc([PPi])
[0772] d[dNTP]/dt＝kbst[dNTP][DNA]+kc([dNTP]0-[dNTP])
[0773] 合并最后2个反应，得到
[0774] d([PPi]+[dNTP])/dt＝-kbst[dNTP][DNA]-kc([dNTP]0-[PPi]-[dNTP])
[0775] 可以在数字上解出这些方程，以确定kbst和kc的值，得到kbst＝2.38(μMs)-1和kc-1＝0.2s (在30℃)。
[0776] PPi→Pi酶
[0777] 反应PPi+H2O→2Pi以有限速率发生。在有酶和Mg++存在下的速率常数是约3 -1
10s (Biochemistry 41(2002)12025)。所以，该反应经1ms结束。因而，可以说该转化是瞬-1 -1
时的。但是，在没有任何酶或离子催化剂存在下，速率常数是约3 年 (J.Chem.Soc.Farady Trans，93(1007)4295)。在该情况下，反应根本不进行。但是，许多离子会将该反应催化到一定程度。因而，如果希望该反应不进行，必须小心地选择溶液，使得不存在催化反应的离子。
10s (Biochemistry 41(2002)12025)。所以，该反应经1ms结束。因而，可以说该转化是瞬-1 -1
时的。但是，在没有任何酶或离子催化剂存在下，速率常数是约3 年 (J.Chem.Soc.Farady Trans，93(1007)4295)。在该情况下，反应根本不进行。但是，许多离子会将该反应催化到一定程度。因而，如果希望该反应不进行，必须小心地选择溶液，使得不存在催化反应的离子。
[0778] 扩散系数
[0779] 来自测序反应的pH变化引起的信号依赖于涉及的物质的扩散系数。参考文献(Biophys.J 78(2000)1657)给出了Pi、PPi和dNTP的值：
[0780] 物质 106D(cm2/s)，在37℃
[0781] Pi 9.5
[0782] PPi 7.48
[0783] ATP 5.3
[0784] 参考文献(BBA 1291(1996)115)给出了在一定温度范围内的ATP的值。在37℃，-6 2该值是4.5x10 cm/s，它用于本文中。通过用因子DATP(T)/DATP(37℃)放大上述值，计算在温度T的Pi和PPi的值。在25℃的离子扩散系数是(J.Chem.Phys.119(2003)11342.)
[0785] 物质 105D(cm2/s)，在25℃
[0786] Mg++ 1.25(J.Amer.Chem.Soc.77(1955)265)
[0787] Na+ 1.33(J.Chem.Phys.119(2003)11342.)
[0788] 假定H+的扩散系数等于Na+的扩散系数，因为通过电荷中性，H+必须与阴离子成对+ +扩散，或H 必须与另一种阳离子交换，其中N 最快速地扩散。
[0789] 一个优选的实现包括，使用小球(例如0.1μm)来降低所有物质的扩散系数。这使pH曲线转换至更大的时间，其大致以扩散系数减小的比例。教科书关于扩散系数的减小的公式是
[0790]
[0791] 其中 是球体占据的体积分数。小球的半径不会直接进入该表达。对于没有球体时， 对于随机填充的球体， 且对于密集填充的球体，
[0792] 另一个方案是使用其它方法来减小H+、Pi、PPi和dNTP的扩散系数。例如，可以增加溶液的粘度。
[0793] 测序反应
[0794] 现在考虑Mg++扩散效应。尚未准确获知酶反应速率如何依赖于[Mg++]。但是，酶++ ++活性需要二价金属离子。假定速率与Mg 成线性比例，且在1mM Mg 时达到最大速率。因而，假定反应速率常数等于
[0795] kbst min(1，[Mg++]/1mM) (7)
[0796] 可以使用1.25x 10-5cm2/2的Mg++扩散系数。对于模型2，在t＝0时，Mg++仅是z++＝0，在浓度[Mg ]0＝1mM。对于t＞0，它扩散，并通过方程(8)影响反应速率。对于模型++ ++
1，孔中的Mg 的浓度在所有时间都是1mM。或者，我们可以假定，用Mg 浸泡酶，使溶液中++
游离Mg 的浓度是零。
1，孔中的Mg 的浓度在所有时间都是1mM。或者，我们可以假定，用Mg 浸泡酶，使溶液中++
游离Mg 的浓度是零。
[0797] 在7-9的pH范围，反应大致如下释放H+
[0798]
[0799] 这是因为，具有低于溶液pH的pKa值的所有H+都实现良好逼近。如果溶液是pH7-9，所有这些物质都降低pH。所以，下述反应的净作用不会改变pH：
[0800] dNTP+DNAn→PPi+DNAn+1 (8)
[0801] 下述反应的净作用会通过释放一个净H+改变pH：
[0802] PPi+H2O→2Pi (9)
[0803] 由珠子表面上的DNA释放的H+会扩散到DNA外面，且由于pH远高于DNA的pKa，+ +这些H 离子会在平衡时间t＜0内扩散出孔(所有这些H 都扩散出)。也就是说，如果在+
加入dNTP之前使珠子上的DNA平衡，溶液应当只是常见的缓冲溶液(少许额外的Na 在珠+
子附近，以平衡DNA上的负电荷，在德拜长度内)。当加入DNA的额外碱基时，H 的脉冲会+
实现---扩散系数稍微类似于Na。
加入dNTP之前使珠子上的DNA平衡，溶液应当只是常见的缓冲溶液(少许额外的Na 在珠+
子附近，以平衡DNA上的负电荷，在德拜长度内)。当加入DNA的额外碱基时，H 的脉冲会+
实现---扩散系数稍微类似于Na。
[0804] 孔尺寸
[0805] 对小孔进行仿真运行：
[0806] D(μm) H(μm) 2R珠子(μm) V孔(pl) [DNA]孔(μM)
[0807] 1.5 2.25 1.05 0.005063 4.62
[0808] 4 6 2.8 0.096 1.73
[0809] 6 8 5.91 0.29 2.55
[0810] 对于D＝1.5μm，h＝0.2μm(1层珠子)。对于D＝4μm，h＝1.1μm。否则，h＝1.5μm。另外，对于具有半径3.6μm的更大珠子的4μm x 6μm孔，进行一次运行。
[0811] 装置流动中的dNTP前线厚度
[0812] 在计算中假定在t＝0在孔上面的dNTP从0瞬时变化至6.5μM。如果dNTP足够快速地流过孔，该条件是大致真实的。定义
[0813] V＝在孔上面的流体的流动速率
[0814] L＝装置的长度
[0815] D＝dNTP的扩散系数＝3.91x10-6cm2/s
[0816] d＝孔的尺寸
[0817] t＝经过装置的流动时间
[0818] t0＝“瞬时变化”的截止时间
[0819] Wd＝由于装置末端处的扩散导致的前线宽度＝(2D t)1/2
[0820] Wm＝由于混合导致的前线宽度≈冲洗体积区域的长度
[0821] U＝冲洗体积＝15μl(目前52μl)
[0822] u＝流速＝50μl/s
[0823] 2个模型(指定为313和314)的流动池几何形状如下：
[0824] 流动池 轴(mm) 宽度(mm) 高度(mm) 体积(μl) 单元体积/s
[0825] 314 7.249 7.249 0.336 17.657 2.775
[0826] 313 4.999 4.999 0.293 7.321 6.693
[0827] 取L＝5mm，d＝4μm，并假定t＝1/6.69s。Q＝50μl/s。则Wd＝10.8μm。另外，V＝L/t＝3.3cm/s。对于t0的值取决于孔尺寸。它应当远远短于Npoly＝0时dNTP向孔底扩散的时间(即远远短于发生该离子脉冲响应的时间)，即该值的10％。对于4x6μm孔，dNTP向孔底扩散的时间(假
2 2
定没有扩散阻碍)是H/(2D)，所以t0＝10％x H/(2D)＝0.015s。模拟揭示，负载DNA的球体会减慢扩散，所以可能t0＝10％*0.2s＝0.02s。定义W＝max(Wd，Wm)。前线的前缘穿过装置的时间是d/V。整个前线(前缘+后缘)穿过孔的时间是(W+d)/V。dNTP浓度的“瞬时”升高的条件是(W+d)/V＜＜t0。(W+d)/V≈U/u。因为U/u＝0.3s，且t0＝0.02s，上面的假定不满足该条件。必须使U更小，或必须使u更大，或二者兼有，因子为10。由冲洗区域的长度给出Wm的条件可能有些过于严格：混合区域的宽度可以基本上小于整个冲洗区域的长度。这是保守条件。但是，Wd/V＜＜t0，所以可以忽略前线的扩散性传播。
2 2
定没有扩散阻碍)是H/(2D)，所以t0＝10％x H/(2D)＝0.015s。模拟揭示，负载DNA的球体会减慢扩散，所以可能t0＝10％*0.2s＝0.02s。定义W＝max(Wd，Wm)。前线的前缘穿过装置的时间是d/V。整个前线(前缘+后缘)穿过孔的时间是(W+d)/V。dNTP浓度的“瞬时”升高的条件是(W+d)/V＜＜t0。(W+d)/V≈U/u。因为U/u＝0.3s，且t0＝0.02s，上面的假定不满足该条件。必须使U更小，或必须使u更大，或二者兼有，因子为10。由冲洗区域的长度给出Wm的条件可能有些过于严格：混合区域的宽度可以基本上小于整个冲洗区域的长度。这是保守条件。但是，Wd/V＜＜t0，所以可以忽略前线的扩散性传播。
[0828] 现在，不同的计算。希望在小于t0的时间内，使在通道壁处的dNTP浓度从0升高至6.5μM。假定在t＝0时的浓度C(x，y，z)是c0＝6.5μM(t＝0)。取0＜x＜L，-B＜y＜B，0＜z＜W。对于0＜x＜L的任意值，希望知道在y＝B时的浓度。严格地讲，
在壁处的浓度停留在0，因为那里的速度是零，除非考虑扩散。所以，必须考虑在x方向的对流和在z方向的扩散。计算对流[6]
在壁处的浓度停留在0，因为那里的速度是零，除非考虑扩散。所以，必须考虑在x方向的对流和在z方向的扩散。计算对流[6]
[0829] v＝[(p0-pL)B2/(2μL)][1-(y/B)2] (10)
[0830] 流速是Q＝(2/3)(p0-pL)B3W/(μL)。计算出在装置末端处的平均流动时间是0.95c0。首先，注意，不考虑扩散，浓度由下式给出
[0831] c(x，y，z)＝0，t＜t*
[0832] c0，t＞t*
[0833] t*＝x/v(y) (11)
[0834] 流动变成在t’＝L/v时最大浓度的95％(0.95B)。清除一个体积的时间是t”＝体积/Q，其中体积＝2B W L。可以发现，t’＝2/3/0.0975，t”＝6.87t”。因此，使平均浓度达到最终值的95％，需要7个装置体积(不是3个)。关心的是在装置壁处的浓度值。浓度服从方程
[0835]
[0836] c(x，y，0)＝0
[0837] c(0，y，t)＝c0
[0838]
[0839] 忽略由对流支配的在y方向的扩散。现在，浓度通过在时间δt内的扩散达到壁，但是从在更小的x-δx和y＝y-δy处存在的浓度曲线扩散，因为对流发生在该时间δt2
内。注意，(δy) ＝2D t。从上面可以知道，通过时间t”＝1/6.69s内的扩散，浓度可以扩散δy＝10μm的量级。希望它在时间t0＝0.02s内扩散，这暗示着3.95μm的扩散距* *
离。所以，作为保守计算，可以从方程(11)t ＝L/v(B-3.95μm)计算出。通过时间t+t0，在壁处的浓度将是大约c0(通过扩散和对流的组合)。因而
内。注意，(δy) ＝2D t。从上面可以知道，通过时间t”＝1/6.69s内的扩散，浓度可以扩散δy＝10μm的量级。希望它在时间t0＝0.02s内扩散，这暗示着3.95μm的扩散距* *
离。所以，作为保守计算，可以从方程(11)t ＝L/v(B-3.95μm)计算出。通过时间t+t0，在壁处的浓度将是大约c0(通过扩散和对流的组合)。因而
[0840] v＝(3/4)(1/B W)Q[1-(y/B)^2]
[0841] 使用它，t*＝L/v(B-3.95μm)＝1.84s。在以后的值t0，在壁处的浓度将大致升高至最大。不幸的是，该计算忽略了在1.84s期间，来自更小y值的速度分布图的物质也具有向壁扩散的机会。也忽略了，随着y变大，从更小的x值处开始的扩散以更低的速率向右进行。
[0842] 因而，可以研究在边界层上面的扩散何时快于对流。通过扩散δ/t＝2D/δ。通过对流δ/t＝v(B-δ)。对于δ＝0.001mm＝1.0μm，这二者相等。所以，当前线已经到2
达该值δ＝L/v(B-δ)＝6.78s，物质向壁的前进完全由扩散支配。且在时间δ/(2D)＝
0.01s期间，浓度将大致升高至c0。所以，对于δ＜1.0μm，对流比在x方向的扩散更重要。
达该值δ＝L/v(B-δ)＝6.78s，物质向壁的前进完全由扩散支配。且在时间δ/(2D)＝
0.01s期间，浓度将大致升高至c0。所以，对于δ＜1.0μm，对流比在x方向的扩散更重要。
[0843] 检查上述近似计算，需要方程(12)的数字解答。可以使用有限元法来数字地解答方程(12)。我们发现，对于上面的装置，在壁处的浓度在约0.15s(在x＝0.5mm处)和约0.5s(在x＝5.0mm处)内升高。这太缓慢。雷诺数是Re＝1g/cm3*0.5cm/
(1/6.69s)*0.0293cm/0.01cp＝9.8。如果将高度设定为0.1mm，会发现在壁处的浓度在约
0.04s(在x＝0.5mm处)和约0.15s(在x＝5.0mm处)内升高。这可能太缓慢。Re＝
9.8。如果备选地设定Q＝240μl/s，在壁处的浓度在约0.05s(在x＝0.5mm处)和约
0.2s(在x＝5.0mm处)内升高。这可能太缓慢。Re＝47。如果设定高度＝0.1mm且Q＝
240μl/s，在壁处的浓度在约0.013s(在x＝0.5mm处)和约0.07s(在x＝5.0mm处)内
升高。这可能足够快。Re＝47。在所有情况下的流动应当是层流。
(1/6.69s)*0.0293cm/0.01cp＝9.8。如果将高度设定为0.1mm，会发现在壁处的浓度在约
0.04s(在x＝0.5mm处)和约0.15s(在x＝5.0mm处)内升高。这可能太缓慢。Re＝
9.8。如果备选地设定Q＝240μl/s，在壁处的浓度在约0.05s(在x＝0.5mm处)和约
0.2s(在x＝5.0mm处)内升高。这可能太缓慢。Re＝47。如果设定高度＝0.1mm且Q＝
240μl/s，在壁处的浓度在约0.013s(在x＝0.5mm处)和约0.07s(在x＝5.0mm处)内
升高。这可能足够快。Re＝47。在所有情况下的流动应当是层流。
[0844] 上面可能有些过于严格，因为最大的信号来自dNTP的突破，且该突破非常尖锐。可能不需要在孔顶部处的dNTP升高在0.02s内结束。可能该升高只是必须明显地完全早于在孔底部发生dNTP突破。并且这是在秒的量级。所以，需要用在孔顶部处升高的dNTP浓度来解答反应/扩散方程。在0至t之间使它从0线性升高至6.5μM，其中t是在前面段落中为在装置末端处的上升时间指定的值。
[0845] 从这些数值模拟可以发现，在孔表面处的dNTP的有限上升时间仅轻微降低离子脉冲装置的性能。对于6μm x 8μm装置，0.2s的有限上升时间仅轻微影响观察到的传感器响应曲线。通过使第一个峰转换至更长的时间以及降低Npoly的所有值的峰高度，0.5s的有限上升时间影响观察到的传感器响应曲线。具有更慢响应时间的表面受到该有限dNTP上升时间的影响更少。对于4μm x 6μm，效应是类似的，如果更剧烈一些，因为该装置的特征扩散时间更小，因此有限上升时间是对在孔表面处瞬时dNTP升高的理想化情况的更大相对干扰。
[0846] 结果的参数灵敏度
[0847] 为了测定离子脉冲响应对实验变量的灵敏度，采用4μm x 6μm系统作为参照。因为该检测方法依赖于扩散，孔几何形状对绘制的任意Npoly曲线的分辨率有显著影响。
[0848] dNTP浓度减半至3.25μM，并倍增至13μM。以因子3增加在珠子表面上的DNA。用更大的3.6μm珠子进行运行。以因子3增加在珠子表面上的DNA和dNTP。使酶的反应++
速率k减半和倍增。对于所有上述，产生不含游离Mg 的5μM Tris的传感器响应曲线。
速率k减半和倍增。对于所有上述，产生不含游离Mg 的5μM Tris的传感器响应曲线。
[0849] 使酶反应速率常数倍增，会使峰非常轻微地更高。
[0850] 一种可能性是，在珠子上的DNA浓度太高，以至于有效地使反应受到扩散限制，所以酶速率常数不是影响浓度曲线的主要因子。类似地，使酶反应速率降低1/2，对传感器曲线几乎没有影响。仅非常轻微地及时扩散它们。
[0851] 大珠子工作地非常好。因为在珠子上存在更大量的DNA，消耗它需要更久。另外，珠子的体积占据更多的空间，所以向孔底的扩散需要更久一些。峰展开更长的时间。
[0852] 在珠子上的DNA的更大浓度及时展开峰。这是因为更大的DNA浓度意味着珠子上更大量的DNA。该更大量的DNA需要更长的时间进行反应。因而，dNTP的最终突破需要更久。
[0853] 将溶液dNTP浓度降低至3.25μM会及时展开峰，但是也降低峰高度。以区分不同Npoly曲线的方式，两种效应可能大致取消。相反，将dNTP浓度增加至13μM会转移峰到更小的时间。尽管峰更高，它们也基本上在时间上更紧密。曲线处于如此更短的时间，所以它们进入传感器的响应时间。13μM曲线似乎比6.5μM情况更难区分。
[0854] 使珠子上的DNA的浓度增加3倍，并使溶液中的dNTP浓度增加至13μM，会使峰高约3倍，但是不会及时展开它们。时间尺度相对不变，因为尽管珠子上的DNA的量更大，由于更高的dNTP浓度，反应速率也更大。因为相同时间内释放更大量，峰更高。
[0855] 填充珠子-Φ(phi)
[0856] 通过对比类似孔尺寸之间以及4x6微米(宽度x高度)和6x8微米孔之间的离子脉冲响应，观察到对填充珠子的需求(以减慢所有物质的扩散)。Npoly曲线随着孔深度增加和随着填充珠子(Φ＝0.6)而消退(resolve)。
[0857] 观察Φ的效应的公式是有效扩散系数
[0858] Deff＝D0*2(1-Φ)/(2+Φ)
[0859] 对于Φ＝0.6，D0/Deff＝3.25，例如3.25x减速(由于珠子)
[0860] 对于Φ＝0.9，D0/Deff＝14.5，例如14.5x减速(由于此)
[0861] 需要的其它公式是在孔中的特征时间
[0862] H2＝2Deff t
[0863] 所以，对于在Φ＝0.6的6um孔，
[0864] t＝62/(2/3.25*D0)＝58.5/D0
[0865] 在Φ＝0.9的2.25孔，产生
[0866] t＝2.252/(2/14.5*D0)＝36.7/D0
[0867] 所以，在Φ＝0.9的2.25um孔具有在所有时间的约36.7/58.5＝0.63，小于在Φ＝0.6的6um孔。更小的孔将仍然更快一些。如果具有Φ＝0.936，更小的孔将象更大的孔一样准确地运行(假定孔直径和DNA珠子以与孔高度相同的方式放大)。
[0868] 信噪比
[0869] 信噪比与Npoly和Npoly+1信号之间的mV差异成比例，且也与mV曲线存在不同的时间长度的平方根成比例。将σ定义为传感器噪音，且将f定义为帧数/秒。将在0＜t＜tmax期间信号1和信号2之间的绝对值的平均差异定义为Δ，即
[0870] Δ＝∫0tmax|v1-v2|/tmax。
[0871] 取绝对值，因为曲线之间的差异可以具有两个符号。因而，条件是
[0872] Δ＞σ[2/(f tmax)]1/2
[0873] 考虑作为一个实例，对于D＝4μm，H＝6μm孔， dNTP＝20μM，10x DNA情况。取f＝20Hz，且tmax＝2s。Δ的值是0.6861。因而
[0874] 0.6861＞0.22σ
[0875] 所以，使用σ＝0.25mV的值，该装置将工作(1-P＝10-35)。考虑作为另一个实例，D＝4μm，H＝6μm孔， dNTP＝6.5μM，10x DNA情况。取f＝20Hz，且tmax＝4s。Δ的值是0.1862。因而
[0876] 0.1862＞0.1581σ
[0877] 所以，使用σ＝0.25mV的值，该装置可能工作(1-P＝2.4x 10-6)。
[0878] 注意，存在tmax的最佳值：值太小，不会具有足够的信号；值太大，主要看到噪音。tmax的值在这里只是大致的。
[0879] 等同方案
[0880] 尽管本文已经描述和例证了几个发明实施方案，本领域普通技术人员易于想到实现所述功能和/或获得所述结果和/或本文所述的一个或多个优点的多种其它方式和/或结构，且每个这样的改变和/或变体均视作在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员易于理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和结构均是示例性的，实际的参数、尺寸、材料和/或结构将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅用常规实验，本领域技术人员即会识别或能确定本文所述的具体发明实施方案的许多等价方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为实例而给出，在附随的权利要求及其等价方案范围内，本发明的实施方案可以以除具体描述和要求保护的方式之外的方式实施。本公开内容的发明实施方案涉及本文所述的各个特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，两种或更多种这类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合，均包括在本公开内容的发明范围内，如果这类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾的话。
[0881] 本文中定义和使用的所有定义均应理解为优先于所定义术语的字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或通常含义。
[0882] 在本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请都通过引用并入(关于各自引用的主题)，在某些情况下，可以包括文件的全部。
[0883] 除非明确指出相反，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为是指“至少一个/种”。
[0884] 本说明书和权利要求书中用到的短语“和/或”应理解为是指如此联合的要素(即在有些情况下联合存在且在其它情况下分离存在的要素)中的“任一个或二者”。与“和/或”一起列出的多个要素应当以相同的方式解释，即如此联合的要素中的“一个或多个”。除“和/或”条项明确指出的要素外，其它要素可任选存在，无论与那些明确指出的要素相关或不相关。因此，作为非限制性的实例，关于“A和/或B”，当与开放性语言如“包含”结合使用时，在一个实施方案中可仅指A(任选包括除B之外的要素)；在另一实施方案中可仅指B(任选包括除A之外的要素)；在再一实施方案中可指A和B(任选包括其它要素)；等等。
[0885] 本说明书和权利要求书中用到的“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”或“和/或”应理解为包括在内，即包括数字或要素列表中的至少一个，但也包括不止一个，并任选包括其它未列出的项目。仅当明确指出相反时，如“仅一个”或“正好一个”或在权利要求书中用到“由......组成”时，才指正好包括数字或要素列表中的一个要素。一般来说，本文中用到的术语“或”仅在当前面有排他性术语如“任一”、“......中的一个”、“......中的仅一个”或“......中的正好一个”时才应理解为指排他性替代方案(即“一个或另一个而非二者”)。当在权利要求书中用“基本由......组成”时，其应具有专利法领域内所用的通常意义。
[0886] 关于一个或更多个要素的列表，本说明书和权利要求书中用到的短语“至少一个”应理解为是指，选自所述要素列表中的任意一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包含所述要素列表内明确列举的每个要素中的至少一个，也不排除所述要素列表中要素的任意组合。此定义也允许短语“至少一个”所指的要素列表内明确指出的要素之外的要素的任选存在，无论与那些明确指出的要素相关或不相关。因此，作为非限制性的实例，“A和B中的至少一个”(或等价地，“A或B中的至少一个”，或等价地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个、任选包含不止一个A而无B存在(并任选包含除B之外的要素)；在另一个实施方案中可指至少一个、任选包含不止一个B而无A存在(并任选包含除A之外的要素)；在再一实施方案中可指至少一个、任选包含不止一个A和至少一个、任选包含不止一个B(并任选包含其它要素)；等等。
[0887] 也应理解，除非明确指出相反，在本文中要求保护的包含不止一个步骤或操作的任何方法中，所述方法的所述步骤或操作的顺序不必局限于所给出的方法的步骤或操作的顺序。
[0888] 在权利要求书中以及上面的说明书中，所有过渡性短语如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“含”等均应理解为开放性的，即是指包括但不限于。仅过渡性短语“由......组成”和“基本由......组成”分别为封闭式或半封闭式的过渡性短语，如美国专利局专利审查手册第2111.03部分所规定的。
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