本発明は、水分散性の高いヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の製造方法に関する。

人間にとって必須ミネラルである鉄は、通常、食品から経口摂取され、体内に吸収される。 動物性食品に含まれるヘム鉄（鉄−ポルフィリン複合体）は、植物性食品に多く含まれる非ヘム鉄と異なり、鉄−ポルフィリン複合体のまま腸粘膜細胞から吸収される。 また、ヘム鉄は、他の食品により吸収阻害を受けないのに対し、非ヘム鉄は、お茶又はコーヒーに含まれるタンニンの他、食物繊維、カルシウム又はリン酸等によって吸収されにくい状態になり、体内吸収率が低下する。 このような特徴から、ヘム鉄は、体内吸収率の高い鉄剤として、健康補助食品等に広く用いられている。

ヘム鉄は、通常、ヘモグロビン又はミオグロビンのようなヘムタンパク質の形態で動物の体内に存在する。 ヘモグロビンの場合、ヘム鉄の体内吸収率は、非ヘム鉄の5倍とされる。 これに対し、ヘモグロビンのタンパク質部分（グロビン）を除去したヘム鉄のみの形態の場合、その体内吸収率は著しく低下する。 これは、ヘム鉄分子の重合（スタッキング）が起きて水に対する溶解性又は分散性が低下するためと考えられている。

そこで、水に対する溶解性又は分散性及び体内吸収率の向上を目指して、ヘモグロビンをプロテアーゼ等の消化酵素で分解して得られる酵素処理ヘム鉄が開発された。 例えば、特許文献1は、ヘムタンパク質を溶血及び変性させ、次いでタンパク質分解酵素の助けにより分割することによりヘム鉄が強化された画分を形成し、該ヘム鉄強化画分を沈殿法又は限外濾過のような半透膜技術により分離する、ヘムタンパク質、特にヘモグロビンからヘム鉄強化アミノ酸製剤を製造する方法を記載する。

特許文献2は、ヘムタンパク質に由来するペプチドとヘム鉄とを含む複合体を製造するための方法であって、（i）ヘムタンパク質を含有する魚血を変性処理してヘムタンパク質を変性させて、変性ヘムタンパク質水溶液を得る、ヘムタンパク質変性工程；（ii）変性ヘムタンパク質水溶液をプロテアーゼ処理して変性ヘムタンパク質を分解し、ヘムタンパク質に由来するペプチドとヘム鉄とを含む複合体を含有するプロテアーゼ処理液を得る、プロテアーゼ処理工程；（iii）プロテアーゼ処理液を限外濾過し、保持物画分からヘムタンパク質に由来するペプチドとヘム鉄とを含む複合体を得る、限外濾過工程を含む前記方法を記載する。

前記文献に記載の酵素処理ヘム鉄に対し、酵素処理を必要としない鉄剤も開発された。 例えば、特許文献3は、鉄を遊離する、或いはさらに還元する作用をもつ物質の存在下で安定性を有することを特徴とする乳タンパク質と鉄剤とからなる鉄組成物を記載する。 当該文献は、ヘム鉄のような有機鉄剤又は硫酸第一鉄のような無機鉄剤と、脱脂乳のような乳タンパク質とを、実質的に粉末の形態で、或いは脱イオン水にそれぞれ懸濁又は溶解し、撹拌混合することによって前記鉄組成物を調製する方法を記載する。

特許文献1又は2に記載の酵素処理ヘム鉄は、水への溶解度が高く、腸管での吸収率が高いという特徴を示すことが知られている（非特許文献1及び2）。 前記のような酵素処理ヘム鉄は、高価な消化酵素を使用して製造される。 このため、製造コストを低下させることが困難な場合が多い。 これに対し、特許文献3に記載の技術のように、酵素処理を必要とせず、安価な材料から鉄剤を製造する方法も知られている。 しかしながら、経口摂取における体内吸収率の向上を図るためには、水に対する分散性を向上させる必要がある。

それ故、本発明は、安価な材料を用いて、水に対する分散性の高い鉄剤を製造する手段を提供することを目的とする。

本発明者は、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、ヘム鉄と乳タンパク質とを特定の条件下で接触させることにより、水に対する分散性の高いヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体が得られることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（1） ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と、乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させて、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を形成させる、複合体ナノ粒子形成工程；
を含む、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の製造方法。

（2） 前記複合体ナノ粒子形成工程において、乳タンパク質を含有する水分散液が、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液中のヘム鉄1重量部に対して1〜50重量部の乳タンパク質を含有する、前記（1）に記載の方法。

（3） 前記（1）又は（2）に記載の方法によって製造される、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子。

（4）100〜200 nmの範囲の平均粒径を有する、前記（3）に記載のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子。

本発明により、安価な材料を用いて、水に対する分散性の高い鉄剤を製造する手段を提供することが可能となる。

図1は、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の製造方法の一実施形態を示す工程図である。

図2は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の水分散性における乳タンパク質量依存性を示す図である。 横軸：脱脂粉乳量（mg）；縦軸：φ0.45μmのメンブランフィルター透過液中のヘム鉄濃度（×10

^-6 mol/L）。

図3は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の水分散性における水分散液のpH依存性を示す図である。 横軸：水分散液のpH；縦軸：φ0.45μmのメンブランフィルター透過液中のヘム鉄濃度（×10

^-6 mol/L）。

図4は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の水分散性における初期pH依存性を示す図である。 横軸：ヘム鉄を含有する水溶液の初期pH（pH

_ini ）；縦軸：φ0.45μmのメンブランフィルター透過液中のヘム鉄濃度（×10

^-6 mol/L）。

図5は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体をサイズ分画して得られた画分1〜5の紫外可視スペクトルを示す図である。 横軸：波長（nm）；縦軸：吸光度。

図6は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体をサイズ分画して得られた画分6〜8の紫外可視スペクトルを示す図である。 横軸：波長（nm）；縦軸：吸光度。

図7は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体をサイズ分画して得られた画分2〜5に含まれるヘム鉄・乳タンパク質複合体の粒径分布を示す図である。 横軸：粒径（nm）；縦軸：頻度（％）。

図8は、ヘム鉄・乳タンパク質複合体及びその原料の示差走査熱量分析（DSC）サーモグラムを示す図である。 横軸：温度（℃）；縦軸：熱量（μW）。

＜1. ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の製造方法＞
本発明は、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の製造方法に関する。
図1は、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の製造方法の一実施形態を示す工程図である。 以下、図1に基づき、本発明の方法の好ましい実施形態について詳細に説明する。

［1-1. 複合体ナノ粒子形成工程］
本発明の方法は、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と、乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させて、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を形成させる、複合体ナノ粒子形成工程（工程S1）を含むことが必要である。

本明細書において、「ヘム鉄」は、プロトポルフィリンIX鉄錯体のような、ポルフィリンの鉄錯体を意味する。 ヘム鉄は、通常、哺乳動物及び魚を含む動物の体、特に該動物の血液中において、ヘムタンパク質との複合体の形態で存在する。

本明細書において、「ヘムタンパク質」は、ヘム鉄を構成成分として含むタンパク質を意味する。 ヘムタンパク質としては、ヘモグロビン又はミオグロビンを挙げることができる。

本工程において使用されるヘム鉄は、当該技術分野で通常使用される様々な方法で準備することができる。 例えば、哺乳動物又は魚のような動物の体から、ヘムタンパク質を分離する。 ヘムタンパク質を分離する材料としては、哺乳動物又は魚の血液が好ましい。 次いで、酸性条件下の極性有機溶媒を用いて、分離されたヘムタンパク質から、ヘム鉄を抽出することができる。 前記抽出に使用される酸は、塩酸、酢酸、硝酸、硫酸又はクエン酸が好ましい。 前記抽出に使用される極性有機溶媒は、アセトン、エタノール又はプロパノールが好ましい。 塩酸酸性条件下のアセトンを用いて哺乳動物又は魚の血液由来のヘムタンパク質からヘム鉄を抽出する場合、前記複合体の製造コストを低減することができる。

本工程において使用されるヘム鉄は、前記のような方法によって自ら準備してもよく、予め精製されたものを購入等して用いてもよい。 いずれの場合であっても、本発明の範囲に包含される。

本工程において使用される乳タンパク質は、脱脂粉乳、生乳、ホエー、脱塩ホエー若しくはカゼイン、又はそれらの混合物であることが好ましく、脱脂粉乳であることがより好ましい。 前記のような乳タンパク質は、食品用途に広く用いられている。 このため、乳タンパク質を使用することにより、医薬品又は健康補助食品の原料として安全性の高い鉄剤を得ることができる。 また、脱脂粉乳を用いる場合、前記複合体の製造コストを低減することができる。

本発明者は、アルカリ性に調整されたヘム鉄水溶液と、乳タンパク質を含有する水分散液とを混合することにより、鉄含有材料と乳タンパク質とを実質的に粉末の形態で混合することによって得られる従来技術の鉄剤を上回る、高い水分散性を有するヘム鉄・乳タンパク質複合体が得られることを見出した。 それ故、本工程において使用されるヘム鉄を含有する水溶液は、アルカリ性水溶液であることが必要である。 ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液のpHは、8以上であることが好ましく、8〜12の範囲であることがより好ましく、9〜12の範囲であることが特に好ましい。 前記pH範囲を実質的に維持するため、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液は、1種以上のアルカリ及び／又は緩衝剤を含有してもよい。 前記アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水又は炭酸ナトリウムが好ましい。 前記緩衝剤としては、リン酸ナトリウム緩衝剤、酢酸ナトリウム緩衝剤又はクエン酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。 ヘム鉄を含有する水溶液が前記pH範囲のアルカリ性水溶液である場合、結果として得られるヘム鉄・乳タンパク質複合体は、従来技術のヘム鉄由来の鉄剤と比較して、広いpH範囲で高い水分散性を発現することができる。 また、前記ヘム鉄・乳タンパク質複合体は、100〜200 nmの平均粒径を有するナノ粒子となる。

本工程において使用される乳タンパク質を含有する水分散液は、酸性又は中性であることが好ましい。 例えば、乳タンパク質を含有する水分散液のpHは、7以下であることが好ましく、1〜7の範囲であることがより好ましい。 前記pH範囲を実質的に維持するため、乳タンパク質を含有する水分散液は、1種以上の酸及び／又は緩衝剤を含有してもよい。 前記酸としては、塩酸、酢酸、硝酸、硫酸又はクエン酸が好ましい。 前記緩衝剤としては、リン酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤又は酢酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。 前記のように、ヘム鉄を含有する水溶液は、アルカリ性水溶液である。 このため、乳タンパク質を含有する水分散液が前記pH範囲の酸性又は中性水分散液である場合、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させることにより、追加の中和処理をすることなく略中性の水分散液を得ることができる。

本工程において使用される乳タンパク質を含有する水分散液は、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液中のヘム鉄1重量部に対して1〜50重量部の乳タンパク質を含有することが好ましく、10〜40重量部の乳タンパク質を含有することがより好ましい。 乳タンパク質を含有する水分散液が、ヘム鉄1重量部に対して1重量部以上の乳タンパク質を含有する場合、高い水分散性を有するヘム鉄・乳タンパク質複合体のナノ粒子を得ることができる。 また、乳タンパク質を含有する水分散液が、ヘム鉄1重量部に対して50重量部以下の乳タンパク質を含有する場合、製造コストを低減することができる。

本工程において、「ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と、乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させる」とは、例えば、前記ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と前記乳タンパク質を含有する水分散液とを混合することを意味する。 この場合、前記二成分を混合する順序は特に限定されない。 前記ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と前記乳タンパク質を含有する水分散液とを混合する場合、振盪又は撹拌のような手段により、実質的に均質な混合物を形成させることが好ましい。

本工程において、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させる温度は、0〜50℃の範囲であることが好ましい。 前記二成分を接触させる時間は、極めて短時間でよく、例えば、0時間超且つ24時間以下の範囲であることが好ましい。 前記範囲の温度で前記二成分を接触させることにより、乳タンパク質を凍結又は熱変性させることなくヘム鉄と複合体を形成させることができる。

本工程において形成されたヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子は、例えば凍結乾燥のような当該技術分野で通常使用される手段により、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させた反応系から分離することができる。 或いは、以下において説明する複合体ナノ粒子精製工程を実施することにより、前記複合体のナノ粒子を精製してもよい。

前記の条件で本工程を実施することにより、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を形成させることができる。

［1-2. 複合体ナノ粒子精製工程］
本発明の方法は、場合により、複合体ナノ粒子形成工程で得られたヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を精製する、複合体ナノ粒子精製工程（工程S2）を含んでもよい。

複合体ナノ粒子形成工程において、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させた反応系には、所望の生成物であるヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子に加えて、原料であるヘム鉄及び乳タンパク質、さらには酸、アルカリ、緩衝剤、及び／又はこれらの塩が含まれる場合がある。 それ故、本工程を実施することにより、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を精製して、前記の成分を含む反応系から複合体のナノ粒子を分離することができる。

本工程において、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を精製する手段としては、濾過、透析及び限外濾過のような膜分離手段、ゲル濾過のようなクロマトグラフィー手段、又は減圧乾燥及び凍結乾燥のような状態変化に基づく分離手段等の当該技術分野で通常使用される分離精製手段を挙げることができる。 前記の分離精製手段は、複合体ナノ粒子形成工程で得られた反応系にそのまま適用してもよい。 或いは、複合体ナノ粒子形成工程で得られた反応系に酸及び／又はアルカリが含まれる場合、前記の分離精製手段を実施する前又は後に、中和処理を実施してもよい。 中和処理に使用される酸及び／又はアルカリとしては、前記で説明した1種以上の酸及び／又はアルカリが好ましい。

前記の条件で本工程を実施することにより、より高純度のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を得ることができる。

＜2. ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子＞
本発明の方法により、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子を得ることができる。 それ故、本発明はまた、ヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子に関する。

本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子は、広いpH範囲で高い水分散性を有する。 前記複合体のナノ粒子は、通常は、強酸性、弱酸性〜中性及び中性〜強アルカリ性の水溶液、典型的には、pH1〜3及び6〜14の範囲の水溶液において、高い水分散性を発現することができる。

なお、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の水分散性は、例えば、以下の方法で算出される、前記複合体のナノ粒子の水分散液に含まれるヘム鉄の濃度に基づき、評価することができる。 前記複合体のナノ粒子を水に分散させる。 得られた水分散液を、メンブランフィルターで濾過する。 紫外可視吸光光度計を用いて、透過液に含まれるヘム鉄の、Soret帯における吸光度（例えば389.5〜394 nm）を測定する。 得られた吸光度及びヘム鉄の標準溶液の吸光度に基づき、前記複合体のナノ粒子の水分散液に含まれるヘム鉄の濃度を算出する。 算出されたヘム鉄の濃度を指標として、前記複合体のナノ粒子の水分散性を評価する。

本発明者は、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体が、従来技術の鉄剤では得られないナノオーダーの平均粒径を有する粒子、すなわちナノ粒子の形態であることを見出した。 本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子は、通常は100〜200 nmの範囲、典型的には100〜130 nmの平均粒径を有する。 また、前記複合体のナノ粒子は、実質的に均一な粒度分布を有する。 前記範囲の平均粒径及び実質的に均一な粒度分布を有することにより、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子は、高い水分散性を発現することができる。

なお、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の粒度分布及び平均粒径は、例えば、ナノ粒子解析装置を用いて決定することができる。

本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子は、通常は200,000以上の範囲の平均分子量を有する。 また、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子において、ヘム鉄は、通常、非晶質の形態で乳タンパク質と複合体を形成している。

なお、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の平均分子量は、例えば、限外濾過膜を用いる分画又はゲル濾過クロマトグラフィー等により、決定することができる。 また、前記複合体に含まれるヘム鉄の結晶形態は、例えば、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子の示差走査熱量分析（DSC）サーモグラムにおいて、ヘム鉄の融点に相当する吸熱ピーク（343℃付近）を観測することにより、決定することができる。

以上説明したように、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子は、広いpH範囲で高い水分散性を発現することができる。 それ故、本発明のヘム鉄及び乳タンパク質を含む複合体のナノ粒子により、経口摂取に適した様々な医薬品又は健康補助食品を製造することが可能となる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。 但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実験1 ヘム鉄・乳タンパク質複合体の水分散性における乳タンパク質量依存性＞
［ヘム鉄・乳タンパク質複合体の調製］
乳タンパク質として、脱脂粉乳を用いて、以下の手順で実施例1のヘム鉄・乳タンパク質複合体の試料を調製した。 ヘム鉄（東京化成製）5.0 mgを秤量し、10 mM NaOH水溶液5 cm ³に溶解させた（ヘム鉄濃度：1.0 g/L）。 市販の脱脂粉乳0、10、20、50、100又は200 mg（ヘム鉄1重量部に対して0、2、4、10、20又は40重量部）を秤量し、それぞれを10 mM塩酸5 cm ³に分散させた。 得られたヘム鉄溶液及び脱脂粉乳分散液を混合した。 前記混合溶液（6種、各10 cm ³ ）を、恒温槽中、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を凍結乾燥して、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の乾燥固体を得た。

特許文献3に記載の方法に基づき、以下の手順で比較例1の試料を調製した。 5.0 mgのヘム鉄と、脱脂粉乳0、10、20、50、100又は200 mgとを、粉末のまま混合した。 得られた混合物を、比較例1のヘム鉄・乳タンパク質粉末混合物とした。

［水分散性の評価］
前記の操作で得られた実施例1のヘム鉄・乳タンパク質複合体及び比較例1のヘム鉄・乳タンパク質粉末混合物に、pH7.0に調整した100 mMのリン酸ナトリウムバッファー15 cm ³を加えた。 得られた混合物を、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を、φ0.45μmのメンブランフィルター（アドバンテック製）で濾過した。 透過液の平衡pHを測定した後、紫外可視吸光光度計（U-best v560；日本分光製）を用いて、Soret帯におけるヘム鉄の吸光度（389.5〜394 nm）を測定した。 得られた吸光度及びヘム鉄の標準溶液の吸光度に基づき、各試料のヘム鉄の濃度を算出した。 結果を図2に示す。

図2に示すように、実施例1のヘム鉄・乳タンパク質複合体においては、複合体形成時に混合する脱脂粉乳の量が増すにつれて、φ0.45μmのメンブランフィルターを透過したヘム鉄の濃度が増加した。 透過液中のヘム鉄の濃度は、50〜200 mg（ヘム鉄1重量部に対して10〜40重量部）の脱脂粉乳を用いた試料で略一定となった。 この結果から、ヘム鉄と乳タンパク質との複合体を形成することによって、ヘム鉄の水分散性が向上したことが示唆される。 これに対し、比較例1のヘム鉄・乳タンパク質粉末混合物においては、混合する脱脂粉乳の量を増しても、φ0.45μmのメンブランフィルターを透過したヘム鉄の濃度が増加しなかった。 以上の結果から、ヘム鉄と脱脂粉乳とを、溶液又は分散液の形態で混合することが、水分散性の高いヘム鉄・乳タンパク質複合体を得るために重要であることが示唆される。

＜実験2 ヘム鉄・乳タンパク質複合体の水分散性における水分散液のpH依存性＞
［ヘム鉄・乳タンパク質複合体の調製］
乳タンパク質として、脱脂粉乳を用いて、以下の手順で実施例2のヘム鉄・乳タンパク質複合体の試料を調製した。 ヘム鉄（東京化成製）5.0 mgを秤量し、10 mM NaOH水溶液5 cm ³に溶解させた（ヘム鉄濃度：1.0 g/L）。 市販の脱脂粉乳100 mgを秤量し、10 mM塩酸5 cm ³に分散させた。 得られたヘム鉄溶液及び脱脂粉乳分散液を混合した。 前記混合溶液（10 cm ³ ）を、恒温槽中、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を凍結乾燥して、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の乾燥固体を得た。 前記と同様の手順で、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の試料を複数調製した。

実施例2の手順において、脱脂粉乳を使用しない他は前記と同様の手順で、比較例2のヘム鉄の試料を調製した。

［水分散性の評価］
前記の操作で得られた実施例2のヘム鉄・乳タンパク質複合体及び比較例2のヘム鉄に、pH2〜12に調整した100 mMのリン酸ナトリウムバッファー15 cm ³を加えた。 得られた混合物を、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を、φ0.45μmのメンブランフィルター（アドバンテック製）で濾過した。 透過液の平衡pHを測定した後、紫外可視吸光光度計（U-best v560；日本分光製）を用いて、Soret帯におけるヘム鉄の吸光度（389.5〜394 nm）を測定した。 得られた吸光度及びヘム鉄の標準溶液の吸光度に基づき、各試料のヘム鉄の濃度を算出した。 結果を図3に示す。

図3に示すように、比較例2のヘム鉄は、酸性から中性の水溶液には溶解又は分散せず、pH8〜11の強アルカリ性の水溶液にのみ溶解した。 これに対し、実施例2のヘム鉄・乳タンパク質複合体は、比較例2のヘム鉄と比較して広いpH範囲の水溶液に分散した。 例えば、実施例2のヘム鉄・乳タンパク質複合体は、比較例2のヘム鉄が溶解又は分散しない、pH2の強酸性、pH6〜7の弱酸性〜中性及びpH7〜8の中性〜弱アルカリ性の水溶液に分散し、さらにpH8〜11の強アルカリ性の水溶液にも分散した。 pH4〜5の弱酸性領域では、実施例2のヘム鉄・乳タンパク質複合体及び比較例2のヘム鉄のいずれも溶解又は分散しなかった。 以上の結果から、ヘム鉄と乳タンパク質との複合体を形成させることにより、広いpH範囲でヘム鉄を溶解又は分散できることが示唆される。

＜実験3 ヘム鉄・乳タンパク質複合体の水分散性における初期pH依存性＞
［ヘム鉄・乳タンパク質複合体の調製］
乳タンパク質として、脱脂粉乳を用いて、以下の手順で実施例3のヘム鉄・乳タンパク質複合体の試料を調製した。 ヘム鉄（東京化成製）5.0 mgを秤量し、pH2〜12の初期pH（pH _ini ）の10 mM リン酸ナトリウムバッファー水溶液5 cm ³に溶解又は分散させた（ヘム鉄濃度：1.0 g/L）。 市販の脱脂粉乳100 mgを秤量し、pH 7の10mMリン酸ナトリウムバッファー5 cm ³に分散させた。 得られたヘム鉄溶液及び脱脂粉乳分散液を混合した。 前記混合溶液（10 cm ³ ）を、恒温槽中、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を凍結乾燥して、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の乾燥固体を得た。

［水分散性の評価］
前記の操作で得られた実施例3のヘム鉄・乳タンパク質複合体に、pH7.0に調整した100 mMのリン酸ナトリウムバッファー15 cm ³を加えた。 得られた混合物を、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を、φ0.45μmのメンブランフィルター（アドバンテック製）で濾過した。 透過液の平衡pH（pH _eq ）を測定した後、紫外可視吸光光度計（U-best v560；日本分光製）を用いて、Soret帯におけるヘム鉄の吸光度（389.5〜394 nm）を測定した。 得られた吸光度及びヘム鉄の標準溶液の吸光度に基づき、各試料のヘム鉄の濃度を算出した。 結果を図4に示す。

前記の手順で得られた透過液の平衡pH（pH _eq ）は、いずれも6.86±0.05の範囲内だった。 図4に示すように、実施例3のヘム鉄・乳タンパク質複合体において、pH2〜7の初期pH（pH _ini ）の酸性〜中性の水溶液に溶解又は分散させたヘム鉄から調製された試料は、その後pH7の水溶液と混合しても、非常に溶解性又は分散性が低かった。 これに対し、pH8〜9の初期pH（pH _ini ）の弱アルカリ性の水溶液に溶解させたヘム鉄から調製された試料は、その後pH7の水溶液と混合することにより、該水溶液に分散した。 また、pH9〜12の初期pH（pH _ini ）の弱アルカリ性〜強アルカリ性の水溶液に溶解させたヘム鉄から調製された試料は、非常に分散性が高かった。 実験2に示すように、ヘム鉄はpH8〜11のアルカリ性の水溶液にのみ溶解する（図3：比較例2）。 それ故、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の形成時において、ヘム鉄が溶解し得るアルカリ性の水溶液にヘム鉄を溶解させることが、水に対する分散性の高いヘム鉄・乳タンパク質複合体を得るために重要であることが示唆される。

＜実験4 ヘム鉄・乳タンパク質複合体のサイズ分画及び分析＞
［ヘム鉄・乳タンパク質複合体の調製］
乳タンパク質として、脱脂粉乳を用いて、以下の手順で実施例4のヘム鉄・乳タンパク質複合体の試料を調製した。 ヘム鉄（東京化成製）50 mgを秤量し、10 mM NaOH水溶液50 cm ³に溶解させた（ヘム鉄濃度：1.0 g/L）。 市販の脱脂粉乳500 mgを秤量し、10 mM塩酸50 cm ³に分散させた。 得られたヘム鉄溶液及び脱脂粉乳分散液を混合した。 前記混合溶液（100 cm ³ ）を、恒温槽中、30℃、120 rpmの条件で20時間振盪した。 振盪後、得られた混合溶液を凍結乾燥して、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の乾燥固体を得た。

［ヘム鉄・乳タンパク質複合体のサイズ分画］
前記の操作で得られたヘム鉄・乳タンパク質複合体を50 mg秤量して、50 cm ³の蒸留水に分散させた（ヘム鉄・乳タンパク質複合体濃度：1.0 g/L）。 得られた水分散液から一部を分取して、画分1とした。 残余の水分散液を、5000 rpmで5分間遠心分離した。 得られた上清から一部を分取して、画分2とした。 残余の上清を、セルロースアセテート製のφ0.8μmメンブランフィルター（アドバンテック社製）で濾過した。 得られた透過液から一部を分取して、画分3とした。 残余の透過液を、セルロースアセテート製のφ0.45μmメンブランフィルター（アドバンテック社製）で濾過した。 得られた透過液から一部を分取して、画分4とした。 残余の透過液を、セルロースアセテート製のφ0.2μmメンブランフィルター（アドバンテック社製）で濾過した。 得られた透過液から一部を分取して、画分5とした。 残余の透過液を、ウルトラフィルターユニットUSY-20、USY-5又はUSY-1（それぞれ分画分子量200,000、50,000又は10,000；アドバンテック製）で限外濾過した。 得られた透過液から一部を分取して、それぞれ画分6、7又は8とした。

［ヘム鉄・乳タンパク質複合体の紫外可視スペクトル測定］
前記の手順で得られた各画分について、紫外可視吸光光度計（U-best v560；日本分光製）を用いて、紫外可視スペクトルを測定した。 なお、画分1〜5は、蒸留水で10倍希釈して紫外可視スペクトルを測定した。 画分6〜8は、ヘム鉄の濃度が低かったため、原液のまま紫外可視スペクトルを測定した。 画分1〜5の紫外可視スペクトルを図5に、画分6〜8の紫外可視スペクトルを図6に、それぞれ示す。

図5に示すように、分画操作にしたがって、各画分に含まれるヘム鉄由来の吸収ピーク（389.5〜394 nm）の吸光度がやや低下した。 この結果から、各分画操作によってヘム鉄の一部分が除去されたことが示唆される。 しかしながら、ヘム鉄の吸光度に基づき算出すると、分画開始前のヘム鉄の総重量に対して78.4％のヘム鉄が、依然として0.2μmメンブランフィルターの透過液（画分5）に含まれていた。 それ故、画分5を得るまでの分画操作によって除去されるヘム鉄は少量と推測される。

これに対し、図6に示すように、画分6〜8に含まれるヘム鉄由来の吸収ピーク（389.5〜394 nm）の吸光度は非常に低かった。 この結果から、ヘム鉄・乳タンパク質複合体は、前記の分画分子量を有する限外濾過膜を殆ど透過できなかったことが示唆される。

［ヘム鉄・乳タンパク質複合体の粒径解析］
前記の手順で得られた画分2〜5について、ナノ粒子解析装置（nano Partica SZ-100；堀場製作所製）を用いて、各画分に含まれるヘム鉄・乳タンパク質複合体の粒径を測定した。 画分2〜5に含まれるヘム鉄・乳タンパク質複合体の粒径分布を図7に示す。

図7に示すように、分画操作にかかわらず、各画分に含まれるヘム鉄・乳タンパク質複合体の粒径分布は略同様であった。 粒径分布から、各画分に含まれるヘム鉄・乳タンパク質複合体は、100〜130 nmの範囲の平均粒径を有するナノ粒子の形態であることが確認された。

［サイズ分画されたヘム鉄・乳タンパク質複合体の分析］
前記の手順で行ったヘム鉄・乳タンパク質複合体の紫外可視スペクトル測定及び粒径解析に基づき、各画分に含まれるヘム鉄・乳タンパク質複合体の平均粒径及びヘム鉄濃度を算出した。 結果を表1に示す。

表1に示すように、水溶液中におけるヘム鉄・乳タンパク質複合体の平均粒径は、100〜130 nmの範囲であった。 このように平均粒径が小さいため、実質的に殆どのヘム鉄・乳タンパク質複合体のナノ粒子が、0.2μmメンブランフィルターを通過したと推測される。 また、前記の分画分子量を有する限外濾過膜を殆ど透過できなかったことから、ヘム鉄・乳タンパク質複合体の平均分子量は、200,000以上と推測される。

＜実験5 ヘム鉄・乳タンパク質複合体の熱量分析＞
実験4で調製した実施例4のヘム鉄・乳タンパク質複合体、並びに原料であるヘム鉄及び脱脂粉乳の示差走査熱量分析（DSC）を、TG/DTA同時測定装置（DTG-60/60H；島津製作所社製）を用いて行った。 各試料のDSCサーモグラムを図8に示す。

図8に示すように、ヘム鉄のDSCサーモグラムには、343℃付近に吸熱ピークが観測された。 この吸熱ピークは、ヘム鉄の融点に由来するピークと推測される。 これに対し、実施例4のヘム鉄・乳タンパク質複合体のDSCサーモグラムには、前記の吸熱ピークが観測されなかった。 この結果から、ヘム鉄・乳タンパク質複合体には、ヘム鉄単独の結晶は含まれておらず、ヘム鉄は、非晶質の形態で脱脂粉乳と複合体を形成していることが示唆される。