基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法
阅读：1027发布：2020-07-20
专利汇可以提供基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于 牛 BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法，该方法通过从生鲜牛奶中提取DNA，PCR扩增牛BAF60c基因的特异引物，酶切判定其中T>C突变的基因型，然后评估该牛奶的乳糖、 乳蛋白 和脂蛋白比等指标，从而根据不同基因型来判定不同品质的牛奶。本发明通过检测和判断牛BAF60c基因中功能性突变位点的基因型，从而预测和评估牛奶品质，进行生鲜奶的分级，筛选品质好的生鲜奶，为牛奶品质的检测与评价提供了一种新方法，也为企业生产高品质奶产品提供参考，应用前景广阔，对于牛奶的 营养品 质检测具有重要的意义。，下面是基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法专利的具体信息内容。
1.一种基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法，其特征在于它由以下步骤组成：
(1)采集生鲜牛奶样品，并从中提取牛基因组DNA；
(2)设计并合成牛BAF60c基因的特异性引物：
上游引物：5'-GTT ACC TGC CCT GAA TGT GG-3'；
下游引物：5'-AGG ACA CCT GGA GAG ACC TG-3'；
(3)采用步骤(1)提取的牛基因组DNA为模板，对步骤(2)中的特异性引物进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)中的PCR扩增产物用Alu I限制性内切酶进行酶切，然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行检测，根据电泳结果中的条带，判断T6060C位点的基因型，其中出现65bp、81bp和121bp三条带被判定为TT基因型，出现65bp、81bp、121bp和186bp四条带被判定为TC基因型，出现81bp、121bp和186bp三条带被判定为CC基因型；
(5)根据T6060C位点的基因型来评估牛奶乳糖含量、乳蛋白含量和脂蛋比，如果基因型为TT型，该样品的乳糖含量为5.02％～5.06％、乳蛋白含量为2.98％～3.02％、脂蛋比为
1.37～1.41；如果基因型为TC型，样品的乳糖含量为5.00％～5.06％、乳蛋白含量为2.84％～2.90％、脂蛋比为1.28～1.36；如果基因型为CC型，样品的乳糖含量为5.22％～5.32％、乳蛋白含量为3.22％～3.32％、脂蛋比为1.42～1.50。
2.根据权利要求1所述的基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增长度为526bp。
3.根据权利要求2所述的基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述PCR扩增的条件为：95℃，预变性5min；94℃，变性30s，60℃，退火40s，
72℃，延伸30s，32个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的聚丙烯酰胺凝胶是将12g聚丙烯酰氨溶于100mL去离子水中制成，电泳检测的电压为120V、温度4℃、时间4h，并采用质量分数为0.1％的硝酸银染液对凝胶进行染色。
基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品品质检测技术领域，具体涉及一种基于牛BAF60c基因位点突变评估牛奶品质的方法。
背景技术
[0002] 近几年来，分子生物学技术已成为奶产品质量检测和分子营养研究的有力工具。利用分子生物学的方法进行牛奶品质的鉴定已经成为一种趋势。基因BAF60c以脂肪-BAF复合体(lipoBAF)的形式参与脂质代谢，可能与牛奶品质具有一定的相关性。目前利用基因突变情况来分析牛奶品质也尚无报道。
[0003] 另外，在牛奶的品质鉴定中，往往将蛋白质、脂肪、乳糖作为三项重要检测指标。此外，总固体、奶产量和脂蛋比也是衡量优质牛奶的重要指标。这些指标往往被作为原料奶收购的标准，其检测方法包括感官评价、理化检测方法、生化检测方法及其他基于营养代谢组学的一些检测方法。
[0004] 感官检测是牛奶品质评价最直接的方法，可以很大程度上反映牛奶被接受性的实际品质。但是分析结果主要依据品评人员的主观感觉和经验，测量结果通常会有较大波动，重复性和客观性也较难把握。与其它分析方法的检测结果也缺乏可比性，限制了该法在牛奶品质研究和评价中的应用。理化检测方法是牛奶品质检测普遍采用的方法，对于牛奶品质指标的检测有针对单一营养指标的检测，也有针对多个营养指标的检测以及体细胞检测。检测蛋白质的方法有凯氏定氮法、考马斯亮蓝法和紫外分光光度法等，检测奶脂的方法有哥特里-罗紫法、盖勃氏法、巴勃科克氏法、核磁共振定量氢谱技术等，检测奶糖的方法有直接滴定法、蒽酮比色法、莱因-埃农法等。而中红外光谱分析法、近红外光谱分析法、超声波检测技术、多波长检测法、低场核磁共振技术等是针对多个牛奶品质指标检测的方法。无论是针对一种品质指标的检测还是多指标的检测，有一定的优势，当然也存在缺陷。
[0005] 凯氏定氮法检测牛奶中的蛋白质时，其准确度高，但操作复杂、耗时且无法实现在线和现场检测。张继红等基于经典凯氏定氮法，采用模块式消化法测定奶蛋白的含量，提高了检测速度。也有对牛奶经微波消解技术处理后，利用凯氏定氮法分析奶蛋白含量，提高了分析效率，减少了试剂用量大造成的环境污染。紫外分光光度法则适用于一定的浓度范围内牛奶蛋白含量的检测。哥特里-罗紫法是测奶脂含量最常用的方法，准确度高，结果重现性好，应用广泛，但耗时长，污染大。利用干柱法检测牛奶中脂肪含量，避免了哥特里-罗紫法中脂肪抽取的问题，但仍存在试剂用量较大的问题。罗晓红等研究了基于伊尼霍夫碱法的快速检测牛奶脂肪的方法，与传统的罗兹-哥特里法相比具有省时、适用范围广的优点。直接滴定法检测牛奶中的奶糖是基于奶糖还原性基础上的测定方法。蒽酮比色法与直接滴定法相比，蒽酮比色法具有准确度和灵敏度高、操作简便、所需试剂少的优点。利用中红外光谱分析法对牛奶中脂肪、蛋白质和奶糖的含量进行快速检测，其预测精度达1％，但价格昂贵，仪器操作和维护复杂，对环境要求高，一般只适合于实验室分析，此外，该法穿透能力非常有限(常规使用的光程为20～50μm)，限制了进一步分析物质分子结构方面的信息。近红外光谱分析法在检测牛奶品质方面是一个很有前景的选择。王丽杰等利用近红外漫反射光谱技术结合偏最小二乘方法建立了光谱信息与牛奶中脂肪、蛋白质和奶糖含量之间的校正模型，模型的预测效果可以满足检测需要。此后，近红外分析技术还实现了牛奶中一些理化指标以及体细胞数的检测，除了常规指标含量的检测外，该法还能实现对一些微量物质的检测，该法具有操作简便、分析速度快、成本低的优点，可以一次得到多个指标参数，实现无损检测，但应用此法需要建立大量的模型数据库来辅助进行奶品分析，一般只能检测mg/L浓度水平的物质，增加了该法的检测难度。超声波分析法对牛奶的脂肪、非脂奶固体、密度、蛋白质和奶糖的检测精度可以满足目前奶品行业检测要求，该法的适用范围较广，但检测速度慢、成本高，能反映速度的物理参数少，预测能力有限。多波长检测法获取牛奶中蛋白质和脂肪含量不仅克服了常规化学分析法污染牛奶样品的缺点，还避免了近红外光谱法依赖体积庞大、价格昂贵的光谱仪器，并弥补了超声波分析技术易受温度影响的不足，具有快速、方便、可靠、成本低等优点。低场核磁共振可以应用于牛奶中脂肪、水分和蛋白质的检测中，是一种用于奶品质研究的新方法，具有无损、快速检测等优点。
[0006] 但是如果只需要对大规模的牛奶样品的品质进行初步筛选，对牛奶品质指标的含量要求不高时，采用上述的方法工作量就显得非常大。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术进行牛奶品质鉴定的缺陷和不足，提供一种检测效率高、实用性强、基于牛奶样品中牛功能基因BAF60c的突变位点基因型来鉴定牛奶品质的方法。
[0008] 解决上述技术问题所采用的技术方案由以下步骤组成：
[0009] 1、采集生鲜牛奶样品，并从中提取牛基因组DNA。
[0010] 2、设计并合成牛BAF60c基因的特异性引物：
[0011] 上游引物：5'-GTT ACC TGC CCT GAA TGT GG-3'；
[0012] 下游引物：5'-AGG ACA CCT GGA GAG ACC TG-3'。
[0013] 3、采用步骤1提取的牛基因组DNA为模板，对步骤2中的特异性引物进行PCR扩增。
[0014] 4、将步骤3中的PCR扩增产物用Alu I限制性内切酶进行酶切，然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行检测，根据电泳结果中的条带，判断T6060C位点的基因型，其中出现65bp、81bp和121bp三条带被判定为TT基因型，出现65bp、81bp、121bp和186bp四条带被判定为TC基因型，出现81bp、121bp和186bp三条带被判定为CC基因型。
[0015] 5、根据T6060C位点的基因型来评估牛奶乳糖含量、乳蛋白含量、脂蛋比，如果基因型为TT型，该样品的乳糖含量为5.02％～5.06％、乳蛋白含量为2.98％～3.02％、脂蛋比为1.37～1.41；如果基因型为TC型，样品的乳糖含量为5.00％～5.06％、乳蛋白含量为2.84％～2.90％、脂蛋比为1.28～1.36；如果基因型为CC型，样品的乳糖含量为5.22％～5.32％、乳蛋白含量为3.22％～3.32％、脂蛋比为1.42～1.50。
[0016] 上述步骤2中，所述PCR扩增的扩增长度为526bp，PCR扩增的条件为：95℃，预变性5min；94℃，变性30s，60℃，退火40s，72℃，延伸30s，32个循环；72℃延伸10min。
[0018] 本发明通过507个牛奶样品的乳蛋白、乳糖和脂蛋比数据，再利用体细胞分离结合SDS苯酚法相结合的方法提取每个牛奶样品的DNA，直接测序得到基因突变位点，通过PCR扩增以及内切酶酶切判定基因型，最终建立起基因型与奶品质指标的关联性，从而对牛奶品质指标进行评估。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019] 1、本发明首次发现了牛BAF60c基因与牛奶品质的紧密关系，尤其是T6060C位点突变带来的乳糖、乳蛋白、脂蛋比等品质指标的显著变化。
[0020] 2、本发明可以实现对大规模的牛奶样品的品质进行初步筛选，有利于进行生鲜奶的分级，筛选品质好的生鲜奶，为从分子水平评估牛奶的营养品质开辟新的途径。
[0022] 图1是牛BAF60c基因T6060C突变位点的测序图。
[0023] 图2是牛BAF60c基因T6060C突变位点的酶切结果。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
[0025] 实施例1
[0026] 1、牛奶样品采集于陕西省西安市的现代农业综合开发总公司的华阴奶牛养殖基地中的507头奶牛，每个样品的采取量是20mL，分别装入到两支10mL的离心管中，其中一支采用乳成分分析仪等仪器对牛奶品质指标(乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物含量、脂蛋白)进行直接检测，另一支按照下述方法提取牛基因组DNA：
[0027] 将牛奶样品于超高速低温离心机中在7500rpm、4℃下离心30min，用小勺刮去离心管上层的奶脂，用吸管将中间层的奶蛋白去掉，留下最底部的一层沉淀。向离心管底部加入600μL pH＝7.4的PBS缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5mL离心管中，12000rpm、4℃离心10min，弃去上层液体，保留底部沉淀。再向底部沉淀加乳化剂(由质量分数为90％的Triton-X100水溶液、体积分数为95％的乙醇水溶液、0.9g/L的NaCl水溶液按体积比为20:
125:855配制而成)60μL、pH＝7.4的PBS缓冲液540μL，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，在40℃恒温水浴处理10min脱去体细胞周围的奶脂，12000rpm、4℃离心10min，弃上清液，加pH＝
7.4的PBS缓冲液500μL悬浮沉淀，于12000rpm、4℃离心10min使体细胞沉淀富集，弃上清液。
向体细胞沉淀中加入350μL DNA提取缓冲液(NaCl 1mol/L、Tris-Cl 0.5mol/L、EDTA-Na
0.5mol/L、pH调至7.5～8.0)、50μL SDS裂解液(将20g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中，于68℃加热溶解后，用浓HCl调至pH＝7.2，用双蒸水定容至100mL)、10μL蛋白酶K，在56℃下水浴消化过夜。向消化产物中加等体积的Tris饱和酚，离心得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1的混合物，来回颠倒，使沉淀溶解，12000rpm离心得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入冰无水乙醇(-20℃)沉淀，轻轻振摇，-20℃静置，12000rpm离心10min，弃去上层乙醇，底部沉淀用冰乙醇(-20℃)洗涤，12000rpm、4℃离心10min，小心去除上层乙醇，快速挥发乙醇，加入25μL TE(将2mL pH＝8.0的1mol/L Tris-HCl缓冲液和0.4mL 0.5mol/L EDTA水溶液混合均匀后，加蒸馏水定容至200mL，调pH至8.0配制而成)溶解DNA，-4℃保存备用。
125:855配制而成)60μL、pH＝7.4的PBS缓冲液540μL，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，在40℃恒温水浴处理10min脱去体细胞周围的奶脂，12000rpm、4℃离心10min，弃上清液，加pH＝
7.4的PBS缓冲液500μL悬浮沉淀，于12000rpm、4℃离心10min使体细胞沉淀富集，弃上清液。
向体细胞沉淀中加入350μL DNA提取缓冲液(NaCl 1mol/L、Tris-Cl 0.5mol/L、EDTA-Na
0.5mol/L、pH调至7.5～8.0)、50μL SDS裂解液(将20g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中，于68℃加热溶解后，用浓HCl调至pH＝7.2，用双蒸水定容至100mL)、10μL蛋白酶K，在56℃下水浴消化过夜。向消化产物中加等体积的Tris饱和酚，离心得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1的混合物，来回颠倒，使沉淀溶解，12000rpm离心得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入冰无水乙醇(-20℃)沉淀，轻轻振摇，-20℃静置，12000rpm离心10min，弃去上层乙醇，底部沉淀用冰乙醇(-20℃)洗涤，12000rpm、4℃离心10min，小心去除上层乙醇，快速挥发乙醇，加入25μL TE(将2mL pH＝8.0的1mol/L Tris-HCl缓冲液和0.4mL 0.5mol/L EDTA水溶液混合均匀后，加蒸馏水定容至200mL，调pH至8.0配制而成)溶解DNA，-4℃保存备用。
[0028] 2、根据牛BAF60c基因序列设计特异性引物，上游引物为5’-GTT ACC TGC CCT GAA TGT GG-3’，下游引物为5’-AGG ACA CCT GGA GAG ACC TG-3’，并由上海生工生物工程公司合成。
[0029] 3、采用步骤1提取的牛基因组DNA为模板，对步骤2中的特异性引物进行PCR扩增，2+
PCR扩增反应体系为：牛奶中DNA含量1μL、2×Taq Master Buffer(5mmol/L Mg )3.3μL、dNTP(2.5mmol/L)1μL、上游引物(10pmol/μL)0.3μL、下游引物(10pmol/μL)0.3μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.1μL，双蒸水补至10μL；PCR扩增条件：95℃，预变性5min；94℃，变性30s，60℃，退火40s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；待反应结束后，将扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收、纯化，并对扩增序列进行测序，用DNAStar软件的Seqman工具对测序结果进行分析。取PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小，并经测序结果，发现该PCR扩增产物长度为526bp，在牛BAF60c基因的第6060bp位置上(处于第4内含子)有一个T>C突变。
PCR扩增反应体系为：牛奶中DNA含量1μL、2×Taq Master Buffer(5mmol/L Mg )3.3μL、dNTP(2.5mmol/L)1μL、上游引物(10pmol/μL)0.3μL、下游引物(10pmol/μL)0.3μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.1μL，双蒸水补至10μL；PCR扩增条件：95℃，预变性5min；94℃，变性30s，60℃，退火40s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；待反应结束后，将扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收、纯化，并对扩增序列进行测序，用DNAStar软件的Seqman工具对测序结果进行分析。取PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小，并经测序结果，发现该PCR扩增产物长度为526bp，在牛BAF60c基因的第6060bp位置上(处于第4内含子)有一个T>C突变。
[0030] 4、将步骤3中的PCR扩增产物用Alu I限制性内切酶进行酶切，酶切反应体积为10μL，其中10×Buffer 1μL、PCR扩增产物5μL、Alu I限制性内切酶0.5μL，双蒸水补至10μL，于37℃下温育10h。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行检测，即将12g聚丙烯酰氨(其中丙烯酰胺结构单元与双丙烯酰胺结构单元的质量比为29︰1)溶于100mL去离子水中制成凝胶，进行酶切产物检测，电泳电压为120V、温度4℃、时间4h，并采用质量分数为0.1％的硝酸银染液对凝胶进行染色。根据电泳结果中的条带，判断507个牛奶样品T6060C位点的基因型，其中出现65bp、81bp和121bp三条带被判定为TT基因型，出现65bp、81bp、121bp和186bp四条带被判定为TC基因型，出现81bp、121bp和186bp三条带被判定为CC基因型。基因BAF60c数据分析结果显示，T和C的等位基因频率分别为0.73和0.27，TT(295个)基因型所占的比例为58.19％，TC(153个)基因型为30.18％，CC(59个)基因型为11.63％，基因的杂合度为
0.39，多态信息含量为0.32，属于中度多态。
0.39，多态信息含量为0.32，属于中度多态。
[0031] 5、利用SPSS 19.0进行牛奶品质指标数据与基因型信息的关联性分析。牛BAF60c基因突变位点基因型与牛奶品质指标含量关联分析结果发现，T6060C突变位点基因型与乳糖、乳蛋白含量、脂蛋比等指标存在显著性相关关系(p<0.05)，与乳脂、总固形物含量等均未达到显著相关性水平(p>0.05)。因此，根据测试牛奶样品提取DNA后的BAF60c基因突变位点的基因型，即可评估牛奶及奶制品的乳糖含量、乳蛋白含量和脂蛋比等乳品质指标：TT基因型，样品的乳糖含量为5.02％～5.06％、乳蛋白含量为2.98％～3.02％、脂蛋比为1.37～1.41；TC基因型，样品的乳糖含量为5.00％～5.06％、乳蛋白含量为2.84％～2.90％、脂蛋比为1.28～1.36；CC基因型，样品的乳糖含量为5.22％～5.32％、乳蛋白含量为3.22％～
3.32％、脂蛋比为1.42～1.50。
3.32％、脂蛋比为1.42～1.50。
[0032] 由上述结果可见，无论是乳糖含量和乳蛋白含量，还是脂蛋比，C等位基因都会产生一个正向影响，针对乳糖含量而言，CC基因型牛奶中的平均值为5.27％，显著高于TT基因型(5.04％)和TC基因型(5.03％)的牛奶样品；针对乳蛋白而言，CC基因型牛奶中的平均值为3.27％，显著高于TC基因型(2.87％)的牛奶样品；针对脂蛋比而言，TC基因型(1.46％)的牛奶样品显著高于TC基因型(1.32％)。因此，CC基因型的牛奶中营养价值相对于其他两种基因型高，生产商可选择CC基因型的牛奶来生产高品质奶产品。
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