支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法
阅读：670发布：2020-05-12
专利汇可以提供支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，具体而言，提供了一种支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法。冻干保护液包括1-3w/v％右旋糖酐、2-4w/v％山梨醇、4-6w/v％ 水 解 乳蛋白 、0.5-2w/v％转 铁 蛋白、0.5-3w/v％明胶、1-5w/v％海藻糖、1-3w/v％ 脱脂 奶、0.5-1.5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.05-0.15w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。该冻干保护液针对支原体菌株的冻干保藏设计，各组分之间协同作用，显著降低冻干过程和保藏期间的支原体死亡，有效保护支原体，延长支原体冻干保存时间。，下面是支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种支原体的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括：1-3w/v％右旋糖酐、
2-4w/v％山梨醇、4-6w/v％水解乳蛋白、0.5-2w/v％转铁蛋白、0.5-3w/v％明胶、1-5w/v％海藻糖、1-3w/v％脱脂奶、0.5-1.5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.05-0.15w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括：1.2-2.8w/v％右旋糖酐、2.2-3.8w/v％山梨醇、4.2-5.8w/v％水解乳蛋白、0.7-1.8w/v％转铁蛋白、
0.7-2.8w/v％明胶、1.5-4.5w/v％海藻糖、1.2-2.8w/v％脱脂奶、0.7-1.3w/v％Na2HPO4.12H2O和0.07-0.13w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
3.根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括：1.5-2.5w/v％右旋糖酐、2.5-3.5w/v％山梨醇、4.5-5.5w/v％水解乳蛋白、0.8-1.5w/v％转铁蛋白、1-
2.5w/v％明胶、2-4w/v％海藻糖、1.5-2.5w/v％脱脂奶、0.8-1.2w/v％Na2HPO4.12H2O和
0.08-0.12w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
4.根据权利要求3所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1w/v％转铁蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、
2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
5.根据权利要求1-4任一项所述的冻干保护剂，其特征在于，所述支原体包括牛支原体、猪肺炎支原体、山羊传染性胸膜肺炎支原体或绵羊肺炎支原体。
6.权利要求1-5任一项所述的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，将配方量的右旋糖酐、山梨醇、水解乳蛋白、转铁蛋白、明胶、海藻糖、脱脂奶、Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O，用水混匀，得到所述冻干保护剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，用水混匀后除菌，得到所述冻干保护剂；
优选地，除菌采用0.22微米滤膜过滤除菌。
8.一种冻干支原体的制备方法，其特征在于，将支原体和权利要求1-5任一项所述的冻干保护剂混匀冻干。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，支原体和冻干保护剂的体积比为(0.1-1.5):1。
10.采用权利要求8或9所述制备方法得到的冻干支原体。
支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1-0.3微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病，但也有少数的致病支原体，例如猪肺炎支原体、生殖器支原体、牛支原体等等。牛支原体是一种可导致牛发生肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流产与不孕等多种疾病的重要致病性病原体，在环境等其他应激因素的作用下还可引起多种疾病的继发感染。
[0003] 在实际的支原体研究过程中一般都会涉及支原体菌株的冻干保藏，但是由于支原体的基本特性，决定了在支原体菌株冻干具有一定的难度，冻干时往往会引起支原体的大量死亡。目前报道的支原体冻干保护剂多以单一或组合成分的血清、海藻糖和脱脂乳等为主，但是冻干效果并不尽如人意，支原体冻干的活菌率和保存期都有待进一步地提高。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种支原体的冻干保护剂及其制备方法，以缓解现有技术中支原体的冻干保护剂效果不理想，冻干支原体活菌率低，保存期短的问题。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种冻干支原体的制备方法及得到的冻干支原体，以缓解现有技术中缺少活菌率高且效期短的冻干支原体。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] 一种支原体的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括：1-3w/v％右旋糖酐、2-4w/v％山梨醇、4-6w/v％水解乳蛋白、0.5-2w/v％转铁蛋白、0.5-3w/v％明胶、1-5w/v％海藻糖、1-3w/v％脱脂奶、0.5-1.5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.05-0.15w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0009] 进一步地，所述冻干保护剂包括：1.2-2.8w/v％右旋糖酐、2.2-3.8w/v％山梨醇、4.2-5.8w/v％水解乳蛋白、0.7-1.8w/v％转铁蛋白、0.7-2.8w/v％明胶、1.5-4.5w/v％海藻糖、1.2-2.8w/v％脱脂奶、0.7-1.3w/v％Na2HPO4.12H2O和0.07-0.13w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0010] 进一步地，所述冻干保护剂包括：1.5-2.5w/v％右旋糖酐、2.5-3.5w/v％山梨醇、4.5-5.5w/v％水解乳蛋白、0.8-1.5w/v％转铁蛋白、1-2.5w/v％明胶、2-4w/v％海藻糖、
1.5-2.5w/v％脱脂奶、0.8-1.2w/v％Na2HPO4.12H2O和0.08-0.12w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
1.5-2.5w/v％脱脂奶、0.8-1.2w/v％Na2HPO4.12H2O和0.08-0.12w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0011] 进一步地，所述冻干保护剂包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1w/v％转铁蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0012] 进一步地，所述支原体包括牛支原体、猪肺炎支原体、山羊传染性胸膜肺炎支原体或绵羊肺炎支原体。
[0013] 冻干保护剂的制备方法，将配方量的右旋糖酐、山梨醇、水解乳蛋白、转铁蛋白、明胶、海藻糖、脱脂奶、Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O，用水混匀，得到所述冻干保护剂。
[0014] 进一步地，用水混匀后除菌，得到所述冻干保护剂；
[0015] 优选地，除菌采用0.22微米滤膜过滤除菌。
[0016] 一种冻干支原体的制备方法，将支原体和冻干保护剂混匀冻干。
[0017] 进一步地，支原体和冻干保护剂的体积比为(0.1-1.5):1。
[0018] 采用上述冻干支原体的制备方法得到的冻干支原体。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0020] 本发明提供的支原体的冻干保护液包括右旋糖酐、山梨醇、水解乳蛋白、转铁蛋白、明胶、海藻糖、脱脂奶、Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O。其中，Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O起到缓冲稳定体系的作用，右旋糖酐起到防止糖类在冻干过程中的结晶的作用，水解乳蛋白、脱脂奶、转铁蛋白起到防止保存过程中的氧化反应的作用，明胶起到防止有效物质随水蒸气一起升华飞散并使成形的作用，山梨醇、海藻糖起到低温保护和脱水保护作用的作用。该冻干保护液针对支原体菌株的冻干保藏设计，避免了现有的冻干保护液冻干效果不尽如人意，活菌率过低，保存期短的技术问题，各组分之间协同作用，显著降低冻干过程和保藏期间的支原体死亡，有效保护支原体，延长支原体冻干保存时间。
具体实施方式
[0021] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0022] 除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0023] 一种支原体的冻干保护剂，包括：1-3w/v％右旋糖酐、2-4w/v％山梨醇、4-6w/v％水解乳蛋白、0.5-2w/v％转铁蛋白、0.5-3w/v％明胶、1-5w/v％海藻糖、1-3w/v％脱脂奶、0.5-1.5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.05-0.15w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0024] Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O起到缓冲稳定体系的作用，右旋糖酐起到防止糖类在冻干过程中的结晶的作用，水解乳蛋白、脱脂奶、转铁蛋白起到防止保存过程中的氧化反应的作用，明胶起到防止有效物质随水蒸气一起升华飞散并使成形的作用，山梨醇、海藻糖起到低温保护和脱水保护作用的作用。该冻干保护液针对支原体菌株的冻干保藏设计，避免了现有的冻干保护液冻干效果不尽如人意，活菌率过低，保存期短的技术问题，各组分之间协同作用，显著降低冻干过程和保藏期间的支原体死亡，有效保护支原体，延长支原体冻干保存时间。
[0025] 可以理解的是，本发明中“w/v％”的含义是组分的体积质量比，例如右旋糖酐的含量为1-3w/v％是指冻干保护液1L体积中含有1-3g的右旋糖酐。右旋糖酐典型但非限制性的为1w/v％、1.2w/v％、1.4w/v％、1.6w/v％、1.8w/v％、2w/v％、2.2w/v％、2.4w/v％、2.6w/v％、2.8w/v％或3w/v％；山梨醇典型但非限制性的为2w/v％、2.2w/v％、2.4w/v％、2.6w/v％、2.8w/v％、3w/v％、3.2w/v％、3.4w/v％、3.6w/v％、3.8w/v％或4w/v％；水解乳蛋白典型但非限制性的为4w/v％、4.2w/v％、4.5w/v％、4.8w/v％、5w/v％、5.3w/v％、5.5w/v％、5.7w/v％或6w/v％；转铁蛋白典型但非限制性的为0.5w/v％、0.7w/v％、0.9w/v％、1.1w/v％、1.3w/v％、1.5w/v％、1.7w/v％、1.9w/v％或2w/v％；明胶典型但非限制性的为0.5w/v％、0.8w/v％、1.2w/v％、1.5w/v％、1.8w/v％、2.1w/v％、2.4w/v％、2.7w/v％或3w/v％；海藻糖典型但非限制性的为1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、3.5w/v％、4w/v％、
4.5w/v％或5w/v％；脱脂奶典型但非限制性的为1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％或3w/v％；Na2HPO4.12H2O典型但非限制性的为0.5w/v％、0.7w/v％、0.9w/v％、1.1w/v％、1.3w/v％或1.5w/v％；NaH2PO4.2H2O典型但非限制性的为0.05w/v％、0.07w/v％、0.09w/v％、
0.11w/v％、0.13w/v％或0.15w/v％。
4.5w/v％或5w/v％；脱脂奶典型但非限制性的为1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％或3w/v％；Na2HPO4.12H2O典型但非限制性的为0.5w/v％、0.7w/v％、0.9w/v％、1.1w/v％、1.3w/v％或1.5w/v％；NaH2PO4.2H2O典型但非限制性的为0.05w/v％、0.07w/v％、0.09w/v％、
0.11w/v％、0.13w/v％或0.15w/v％。
[0026] 在优选地实施方式中，冻干保护剂包括：1.2-2.8w/v％右旋糖酐、2.2-3.8w/v％山梨醇、4.2-5.8w/v％水解乳蛋白、0.7-1.8w/v％转铁蛋白、0.7-2.8w/v％明胶、1.5-4.5w/v％海藻糖、1.2-2.8w/v％脱脂奶、0.7-1.3w/v％Na2HPO4.12H2O和0.07-0.13w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0027] 进一步优选地，冻干保护剂包括：1.5-2.5w/v％右旋糖酐、2.5-3.5w/v％山梨醇、4.5-5.5w/v％水解乳蛋白、0.8-1.5w/v％转铁蛋白、1-2.5w/v％明胶、2-4w/v％海藻糖、
1.5-2.5w/v％脱脂奶、0.8-1.2w/v％Na2HPO4.12H2O和0.08-0.12w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
1.5-2.5w/v％脱脂奶、0.8-1.2w/v％Na2HPO4.12H2O和0.08-0.12w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0028] 更进一步优选地，冻干保护剂包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1w/v％转铁蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0029] 通过对本发明冻干保护剂中各组分的含量进行逐步优化，本发明试验发现支原体的冻干活菌率和保存时间都得到显著的改善。
[0030] 在优选地实施方式中，冻干保护剂可以用于冻干的支原体包括牛支原体、猪肺炎支原体、山羊传染性胸膜肺炎支原体或绵羊肺炎支原体，优选为牛支原体。本发明提供的冻干保护剂是针对支原体这一特殊菌群设计与研发，针对支原体没有细胞壁、高度多形性等自身特性提出的可以显著改善支原体冻干效果的冻干保护剂，可以满足各种支原体的研究生产中冻干的需求。
[0031] 一种冻干保护剂的制备方法，将配方量的右旋糖酐、山梨醇、水解乳蛋白、转铁蛋白、明胶、海藻糖、脱脂奶、Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4.2H2O，用水混匀，得到冻干保护剂。本发明提供的冻干保护剂的制备并没有特殊的要求，将各组分按照原料配比混匀在水中即可，成本低同时操作简便。
[0032] 在优选地实施方式中，用水混匀后除菌，得到冻干保护剂，优选地，除菌采用0.22微米滤膜过滤除菌。过滤除菌可以有效除菌，避免污染支原体菌种，同时避免对组分中水解乳蛋白等的破坏，影响冻干保护剂的效果。
[0033] 一种冻干支原体的制备方法，将支原体和冻干保护剂混匀冻干。
[0034] 在优选地实施方式中，支原体和冻干保护剂的体积比为(0.1-1.5):1。可以理解的是，支原体指的是培养后得到1.0-40.0×108CFU/ml的菌液，支原体菌液和冻干保护剂的体积比为(0.1-1.5):1，体积比例如但不限为0.1:1、0.5:1、1:1或1.5:1。
[0035] 本发明最后提供采用上述冻干支原体的制备方法得到的冻干支原体。
[0036] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0037] 实施例1
[0038] 一种支原体的冻干保护剂，包括：1w/v％右旋糖酐、4w/v％山梨醇、4w/v％水解乳蛋白、2w/v％转铁蛋白、0.5w/v％明胶、5w/v％海藻糖、1w/v％脱脂奶、1.5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.05w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0039] 实施例2
[0040] 一种支原体的冻干保护剂，包括：3w/v％右旋糖酐、2w/v％山梨醇、6w/v％水解乳蛋白、0.5w/v％转铁蛋白、3w/v％明胶、1w/v％海藻糖、3w/v％脱脂奶、0.5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.15w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0041] 实施例3
[0042] 一种支原体的冻干保护剂，包括：1.5w/v％右旋糖酐、3.5w/v％山梨醇、4.5w/v％水解乳蛋白、1.5w/v％转铁蛋白、1w/v％明胶、4w/v％海藻糖、1.5w/v％脱脂奶、1.2w/v％Na2HPO4.12H2O和0.08w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0043] 实施例4
[0044] 一种支原体的冻干保护剂，包括：2.5w/v％右旋糖酐、2.5w/v％山梨醇、5.5w/v％水解乳蛋白、0.8w/v％转铁蛋白、2.5w/v％明胶、2w/v％海藻糖、2.5w/v％脱脂奶、0.8w/v％Na2HPO4.12H2O和0.12w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0045] 实施例5
[0046] 一种支原体的冻干保护剂，包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1w/v％转铁蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0047] 对比例1
[0048] 一种支原体的冻干保护剂，包括：0.1w/v％右旋糖酐、10w/v％山梨醇、1w/v％水解乳蛋白、6w/v％转铁蛋白、0.05w/v％明胶、10w/v％海藻糖、0.5w/v％脱脂奶、5w/v％Na2HPO4.12H2O和0.01w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0049] 对比例2
[0050] 一种支原体的冻干保护剂，包括：5w/v％右旋糖酐、0.5w/v％山梨醇、10w/v％水解乳蛋白、0.1w/v％转铁蛋白、6w/v％明胶、0.1w/v％海藻糖、6w/v％脱脂奶、0.1w/v％Na2HPO4.12H2O和3w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0051] 对比例3
[0052] 一种支原体的冻干保护剂，包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0053] 对比例4
[0054] 一种支原体的冻干保护剂，包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、1w/v％转铁蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0055] 对比例5
[0056] 一种支原体的冻干保护剂，包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1w/v％转铁蛋白、1.5w/v％明胶、3w/v％海藻糖、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0057] 对比例6
[0058] 一种支原体的冻干保护剂，包括：2w/v％右旋糖酐、3w/v％山梨醇、5w/v％水解乳蛋白、1w/v％转铁蛋白、3w/v％海藻糖、2w/v％脱脂奶、1w/v％Na2HPO4.12H2O和0.1w/v％NaH2PO4.2H2O，余量为水。
[0059] 对比例7
[0060] 一种支原体的冻干保护剂，包括：7.5w/v％脱脂奶和2.5w/v％海藻糖，余量为水。
[0061] 对比例8
[0062] 一种支原体的冻干保护剂，包括：7.5w/v％脱脂奶、2.5w/v％海藻糖和40w/v％血清，余量为水。
[0063] 试验例
[0065] 2、冻干保护剂制备：按照实施例1-5和对比例1-8中的冻干保护剂的配方分别制备冻干保护剂(100毫升含量)。
[0066] 3、冻干
[0067] 3.1混合：分别将实施例1-5和对比例1-8中的冻干保护剂，与牛支原体菌液1:1(体积比)混合，并活菌计数。将混合液分别分装至7毫升无菌瓶中，2ml/瓶，盖上T形塞。
[0068] 3.2冻干：按照冻干机的冻干程序对上述样品进行冻干处理。
[0069] 按照以上程序，连续制备三批上述冻干样品。
[0070] 4、冻干效果检验
[0071] 4.1性状和溶解性观察：每种冻干保护剂随机选择10瓶冻干样品，观察冻干物性状和溶解性。性状为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。判为合格。
[0072] 4.2真空度检测：每种冻干保护剂随机选择10瓶冻干样品，检测真空度。瓶内出现白色、粉色或紫色辉光判为合格。
[0073] 4.3剩余水分：每种冻干保护剂机选择10瓶冻干样品，检测剩余水分。剩余水分不超过4.0％判为合格。
[0074] 4.4活菌率测定：每种冻干保护剂随机选择3瓶冻干样品，分别于冻干结束当日活菌计数，计算活菌率。
[0075] 4.5保存期试验：每种冻干保护剂随机选择3瓶冻干样品，分别于冻干结束当日、-20℃保存(12、24、和36个月)进行活菌计数。
[0076] 对实施例1-5和对比例1-8中冻干保护剂分别制备的3批冻干牛支原体的性状、溶解度、真空度和剩余水分检测合格的样品，进入活菌率和保存期的试验检测。
[0077] 效果例1活菌率
[0078] 对每个样品的冻干前后进行活菌计数，计算活菌率，3批样品平均结果如下表所示：
[0079]
[0080]
[0081] 备注：“Y”代表“性状为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解”。“N”代表“性状为紧凑型团块、不易与瓶壁脱离或加稀释液后溶解缓慢”。
[0082] 效果例2保存期
[0083] 对每个样品的冻干结束当日、-20℃保存(12、24、和36个月)进行活菌计数，计算活菌率，结果如下表所示：
[0084]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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