小反刍兽疫病毒的制备方法、疫苗及制备方法和应用
阅读：359发布：2020-05-13
专利汇可以提供小反刍兽疫病毒的制备方法、疫苗及制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法、 疫苗 及制备方法和应用，涉及 生物 技术领域，本发明提供的小反刍兽疫病毒的制备方法，包括将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，然后分离并 收获 培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒。本发明采用Vero全悬浮细胞对小反刍兽疫病毒进行培养，充分利用了Vero全悬浮细胞对小反刍兽疫病毒的敏感性，对目标产物没有不良作用。并且，该方法操作简单，工艺先进，能够有效地提高小反刍兽疫病毒培养滴度。此外，通过对小反刍兽疫病毒的接种量及Vero全悬浮细胞的细胞 密度 进行特定的限定，能够有效地提高小反刍兽疫病毒在细胞上的培养效价。，下面是小反刍兽疫病毒的制备方法、疫苗及制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种小反刍兽疫病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，然后分离并收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
其中，所述小反刍兽疫病毒的接种量MOI为10-2～10-6；
所述Vero全悬浮细胞的细胞密度为2.0×106～4.0×106cells/mL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒的接种量MOI为
10-4；
6
优选地，所述Vero全悬浮细胞的细胞密度为3.0×10cells/mL；
优选地，所述培养的pH值为7.0～7.6；更优选为7.5～7.6；
优选地，所述培养的DO值为40～100；更优选为58～62；
优选地，所述培养的温度为34℃～38℃；更优选为34℃～35℃；
优选地，所述培养的转速为30r/min～100r/min；更优选为52～58r/min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，至细胞活率下降至60％～80％时，收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
优选培养至细胞活率下降至74％～76％时，收获培养液上清。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，至细胞密度达到5.0×106～7.0×106cells/mL时，收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
优选培养至细胞密度达到5.8×106～6.2×106cells/mL时，收获培养液上清；
优选地，培养时间为48～96小时，优选为60～72小时，更优选为65～70小时。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述分离包括离心分离；
优选地，所述离心的条件满足如下条件中的至少一个：
温度为3～5℃，转速为3000-8000r/min，时间为25-35分钟。
6.权利要求1-5任一项所述的小反刍兽疫病毒的制备方法在制备小反刍兽疫疫苗中的应用。
7.一种小反刍兽疫疫苗，其特征在于，所述小反刍兽疫疫苗包括权利要求1-5任一项所述的小反刍兽疫病毒的制备方法中制备得到的小反刍兽疫病毒。
8.根据权利要求7所述的小反刍兽疫疫苗，其特征在于，将所述小反刍兽疫疫苗稀释后喷鼻免疫；
优选地，使用稀释液进行稀释，所述稀释液优选为PBS，优选稀释至103.0TCID50/头份-
105.0TCID50/头份，更优选稀释至104.0TCID50/头份；
优选地，所述稀释液包括1％w/w～10％w/w的鞭毛素蛋白，更优为5％w/w；
优选地，所述稀释液包含5％w/w～20％w/w的甘露聚肽糖，更优为10％w/w。
9.如权利要求7或8所述的小反刍兽疫疫苗的制备方法，其特征在于，向权利要求1中得到的培养液上清中加入冻干保护剂，得到所述小反刍兽疫疫苗。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂的加入量为培养液上清体积的10％～30％，优选为20％；
优选地，所述冻干保护剂包括A酶水解酪素、谷氨酸、磷酸二氢钾、蔗糖、水解乳蛋白或明胶中的一种或多种；
优选地，所述冻干保护剂包含1％w/w～5％w/w的A酶水解酪素，更优为3％w/w；
优选地，所述冻干保护剂包含0.1％w/w～0.5％w/w的谷氨酸和磷酸二氢钾，更优为
0.3％w/w；优选地，所述谷氨酸和磷酸二氢钾的质量比为1:1；
优选地，所述冻干保护剂包含15％w/w～25％w/w的蔗糖，更优为20％w/w；
优选地，所述冻干保护剂包含10％w/w～30％w/w的水解乳蛋白，更优为20％w/w；
优选地，所述冻干保护剂包含1％w/w～10％w/w的明胶，更优为5％w/w；
优选地，所述疫苗的病毒含量为106.0～107.0TCID50/头份，优选为107.0TCID50/头份。
小反刍兽疫病毒的制备方法、疫苗及制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 小反刍兽疫(PPR)，是由小反刍兽疫病毒引起小反刍动物的一种急性病毒性传染病。OIE将该病规定为必须上报疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。该病的临床表现与牛瘟类似，故也称为伪牛瘟。其特征是发病急剧、高热稽留、眼鼻分泌物增加、口腔糜烂、腹泻和肺炎。本病毒主要感染绵羊和山羊，也有水牛、骆驼等大型反刍动物感染的临床报道。目前，在疫区比较集中的国家，该病仍频繁爆发，且不断有新疫情，造成巨大的经济损失。
[0003] 疫苗免疫是预防本病的主要手段。我国已有弱毒疫苗，但此疫苗用转瓶贴壁工艺生产，工艺繁琐、病毒含量低、生产成本高等缺点。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0005] 本发明的第一个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的制备方法。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供小反刍兽疫病毒在制备小反刍兽疫疫苗中的应用。
[0007] 本发明的第三个目的在于提供一种小反刍兽疫疫苗，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
[0008] 本发明的第四个目的在于提供上述小反刍兽疫疫苗的制备方法。
[0009] 本发明提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，所述制备方法包括：
[0010] 将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，然后分离并收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
[0011] 其中，所述小反刍兽疫病毒的接种量MOI为10-2～10-6；
[0012] 所述Vero全悬浮细胞的细胞密度为2.0×106～4.0×106cells/mL。
[0013] 进一步地，所述小反刍兽疫病毒的接种量MOI为10-4；
[0014] 优选地，所述Vero全悬浮细胞的细胞密度为3.0×106cells/mL；
[0015] 优选地，所述培养的pH值为7.0～7.6；更优选为7.5～7.6；
[0016] 优选地，所述培养的DO值为40～100；更优选为58～62；
[0017] 优选地，所述培养的温度为34℃～38℃；更优选为34℃～35℃；
[0018] 优选地，所述培养的转速为30r/min～100r/min；更优选为52～58r/min。
[0019] 进一步地，将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，至细胞活率下降至60％～80％时，收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
[0020] 优选培养至细胞活率下降至74％～76％时，收获培养液上清；
[0021] 优选地，将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，至细胞密度达到5.0×106～7.0×106cells/mL时，收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
[0022] 优选培养至细胞密度达到5.8×106～6.2×106cells/mL时，收获培养液上清；
[0023] 优选地，培养时间为48～96小时，优选为60～72小时，更优选为65～70小时。
[0024] 进一步地，所述分离包括离心分离；
[0025] 优选地，所述离心的条件满足如下条件中的至少一个：
[0026] 温度为3～5℃，转速为3000-8000r/min，时间为25-35分钟。
[0027] 本发明还提供了上述的小反刍兽疫病毒在制备小反刍兽疫疫苗中的应用。
[0028] 本发明还提供了一种小反刍兽疫疫苗，所述小反刍兽疫疫苗包括上述小反刍兽疫病毒的制备方法中制备得到的小反刍兽疫病毒。
[0029] 进一步地，将所述小反刍兽疫疫苗稀释后喷鼻免疫；
[0030] 优选地，使用稀释液进行稀释，所述稀释液优选为PBS，优选稀释至103.0TCID50/头5.0 4.0
份-10 TCID50/头份，更优选稀释至10 TCID50/头份；
份-10 TCID50/头份，更优选稀释至10 TCID50/头份；
[0031] 优选地，所述稀释液包括1％w/w～10％w/w的鞭毛素蛋白，更优为5％；
[0032] 优选地，所述稀释液包含5％w/w～20％w/w的甘露聚肽糖，更优为10％。
[0033] 本发明还提供了上述的小反刍兽疫疫苗的制备方法，向上述得到的培养液上清中加入冻干保护剂，得到所述小反刍兽疫疫苗。
[0034] 进一步地，所述冻干保护剂的加入量为培养液上清体积的10％～30％，优选为20％；
[0036] 优选地，所述冻干保护剂包含1％w/w～5％w/w的A酶水解酪素，更优为3％w/w；
[0037] 优选地，所述冻干保护剂包含0.1％w/w～0.5％w/w的谷氨酸，磷酸二氢钾，更优为0.3％w/w。
[0038] 优选地，所述冻干保护剂包含15％w/w～25％w/w的蔗糖，更优为20％w/w；
[0039] 优选地，所述冻干保护剂包含10％w/w～30％w/w的水解乳蛋白，更优为20％w/w；
[0040] 优选地，所述冻干保护剂包含1％w/w～10％w/w的Gelatin，更优为5％w/w；
[0041] 优选地，所述疫苗病毒含量为106.0～107.0TCID50/头份，优选为107.0TCID50/头份。
[0042] 本发明提供的小反刍兽疫病毒的制备方法，包括将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，然后分离并收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒。本发明采用Vero全悬浮细胞对小反刍兽疫病毒进行培养，充分利用了Vero全悬浮细胞对小反刍兽疫病毒的敏感性，对目标产物没有不良作用。并且，该方法操作简单，工艺先进，能够有效地提高小反刍兽疫病毒培养滴度。此外，通过对小反刍兽疫病毒的接种量及Vero全悬浮细胞的细胞密度进行特定的限定，能够有效地提高小反刍兽疫病毒在细胞上的培养效价。
[0044] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
具体实施方式
[0046] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0047] 除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
[0048] 一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
[0049] 根据本发明的一个方面，提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，所述制备方法包括：
[0050] 将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，然后分离并收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；
[0051] 其中，所述小反刍兽疫病毒的接种量MOI为10-2～10-6；
[0052] 所述Vero全悬浮细胞的细胞密度为2.0×106～4.0×106cells/mL。
[0053] Vero细胞为非洲绿猴肾细胞，体外培养呈贴壁生长，可进行连续传代培养。Vero细胞对多种病毒比较敏感，如猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、小反刍兽疫病毒等。通过培养基的改变和培养方式的改变进行无血清驯化，使原有贴壁生长的细胞株能够全悬浮高密度生长，无任何基因导入，保持细胞原有的生物特性。
[0054] 本发明采用Vero全悬浮细胞对小反刍兽疫病毒进行培养，充分利用了Vero全悬浮细胞对小反刍兽疫病毒的敏感性，对目标产物没有不良作用。并且，该方法操作简单，工艺先进，能够有效地提高小反刍兽疫病毒培养滴度。此外，通过对小反刍兽疫病毒的接种量及Vero全悬浮细胞的细胞密度进行特定的限定，能够有效地提高小反刍兽疫病毒在细胞上的培养效价。
[0055] 其中，将小反刍兽疫病毒进行病毒含量测定，然后纯净性检验合格，得到所述提供小反刍兽疫病毒，根据细胞数量计算接种病毒量MOI。在一些实施例中，所述MOI还可以为10-2、10-3、10-4、10-5或10-6，优选为10-4。
[0056] 接种Vero全悬浮细胞，接种时优选用培养基将细胞密度调整为2.0×106～4.0×106cells/mL，例如可以为，但不限于2.0×106cells/mL、2.5×106cells/mL、3.0×
106cells/mL、3.5×106cells/mL、3.8×106cells/mL或4.0×106cells/mL，优选为3.0×
106cells/mL。
106cells/mL、3.5×106cells/mL、3.8×106cells/mL或4.0×106cells/mL，优选为3.0×
106cells/mL。
[0057] 在一些优选的实施方式中，所述培养的pH值为7.0～7.6，例如可以为，但不限于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6；更优选为7.5～7.6；
[0058] 优选地，所述培养的DO值为40～100，例如可以为，但不限于40、50、60、70、80、90或100；更优选为58～62；
[0059] 所述培养的温度优选为34℃～38℃，例如可以为，但不限于34℃、35℃、36℃、37℃或38℃；更优选为34℃～35℃；
[0060] 所述培养的转速优选为30r/min～100r/min，例如可以为，但不限于30r/min、40r/min、50r/min、60r/min、70r/min、80r/min、90r/min或100r/min；更优选为52～58r/min。
[0061] 在上述适宜的培养条件下培养，对病毒的培养效果更好。
[0062] 在一些优选的实施方式中，将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，至细胞活率下降至60％～80％时，收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；其中，细胞活率例如可以为，但不限于60％、65％、70％、75％或80％。
[0063] 优选培养至细胞活率下降至74％～76％时，收获培养液上清。
[0064] 优选地，将小反刍兽疫病毒在Vero全悬浮细胞上培养，至细胞密度达到5.0×106～7.0×106cells/mL时，收获培养液上清，得到所述小反刍兽疫病毒；其中，细胞密度例如可以为，但不限于5.0×106cells/mL、5.5×106cells/mL、6.0×106cells/mL、6.5×106cells/mL或7.0×106cells/mL。
[0065] 优选培养至细胞密度达到5.8×106～6.2×106cells/mL时，收获培养液上清。
[0066] 优选地，培养时间为48～96小时，例如可以为，但不限于48小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时、75小时、80小时、85小时、90小时或96小时，优选为60～72小时，更优选为65～70小时。
[0067] 当培养至上述条件下收获上清液时，病毒的培养效率更高。
[0068] 在一些优选的实施方式中，所述分离包括离心分离；
[0069] 优选地，所述离心的条件满足如下条件中的至少一个：
[0070] 温度为3～5℃，例如可以为，但不限于3℃、4℃或5℃；
[0071] 转速为3000-8000r/min，例如可以为，但不限于3000r/min、4000r/min、5000r/min、6000r/min、7000r/min或8000r/min；
[0072] 时间为25-35分钟，例如可以为，但不限于25分钟、28分钟、30分钟、32分钟或35分钟。
[0073] 根据本发明的第二个方面，提供了上述小反刍兽疫病毒在制备小反刍兽疫疫苗中的应用。
[0074] 根据本发明的第三个方面，提供了一种小反刍兽疫疫苗，包括上述小反刍兽疫病毒的制备方法中制备得到的小反刍兽疫病毒。
[0075] 在一些优选的实施方式中，将所述小反刍兽疫疫苗稀释后喷鼻免疫。
[0076] 现有疫苗免疫方式为肌肉注射，过程繁杂、动物免疫应急大等缺点，稀释疫苗喷鼻免疫，能调高免疫效果，减小动物免疫应激反应。
[0077] 优选地，使用稀释液进行稀释，所述稀释液优选为PBS，优选稀释至103.0TCID50/头份-105.0TCID50/头份，例如可以为，但不限于103.0TCID50/头份、104.0TCID50/头份或105.0TCID50/头份，更优选稀释至104.0TCID50/头份；
[0078] 稀释液，用于稀释疫苗。在本发明中，在PBS液中添加一定比例的鞭毛素蛋白和甘露聚肽糖，有免疫佐剂功效，增强免疫效果。
[0079] 优选地，所述稀释液包括1％w/w～10％w/w的鞭毛素蛋白，更优为5％w/w；
[0080] 鞭毛素蛋白，是构成细菌的鞭毛纤维的粒状蛋白质，有报道称，鼻腔黏膜上皮细胞在启动机体对细菌鞭毛素这一病原相关分子模式的免疫应答及其应答特性上具有重要的指导作用，其中鼻腔黏膜上皮细胞TLR5通路激活产生的GM-CSF是关键介导分子。其含量例如可以为，但不限于1％w/w、2％w/w、3％w/w、4％w/w、5％w/w、6％w/w、7％w/w、8％w/w、9％w/w或10％w/w。
[0081] 优选地，所述稀释液包含5％w/w～20％w/w的甘露聚肽糖，更优为10％w/w。
[0082] 甘露聚肽糖，为白色或微黄色无定形粉末，无臭、无味、易溶于水，本品进入机体后，具有激活吞噬细胞、NK细胞、T.B细胞亚群作用，有诱生干扰素和白介素等作用，没有致癌性、生殖毒性、遗传毒性和长期毒性，用于机体免疫增强剂。其含量例如可以为，但不限于5％w/w、10％w/w、15％w/w或20％w/w。
[0083] 根据本发明的第四个方面，提供了上述小反刍兽疫疫苗的制备方法，向培养液上清中加入冻干保护剂，得到所述小反刍兽疫疫苗。
[0084] 本发明提供的小反刍兽疫疫苗的制备方法，包括向培养液上清中加入冻干保护剂，操作简单，工艺先进。通过合理添加冻干保护剂冻干保藏，使得保藏时间更长。
[0085] 在一些优选的实施方式中，所述冻干保护剂的加入量为培养液上清体积的10％w/w～30％w/w，例如可以为，但不限于10％w/w、15％w/w、20％w/w、25％w/w或30％w/w，优选为20％w/w。
[0086] 冻干保护剂，防止、减少蛋白活性在冻干过程中的损失。在本发明中，通过改变冻干保护剂的成份和配比，不仅能减少病毒在冻干过程中的损失，而且在保藏过程中也能减少病毒的对温度的耐受，延长疫苗的保存期。
[0087] 在一些优选的实施方式中，所述冻干保护剂包括A酶水解酪素(NZ-AmineType AS)、谷氨酸、磷酸二氢钾(Monopotassium Salt)、蔗糖、水解乳蛋白(Lactabumin Hydrolysate)或明胶中的一种或多种。
[0088] 应用特有的冻干保护剂冻干保藏，能使病毒在4℃保藏，抗原效价损失明显减少；疫苗稀释液有免疫佐剂功效，提高免疫效果。
[0089] 优选地，所述冻干保护剂包含1％w/w～5％w/w的A酶水解酪素，例如可以为，但不限于1％、2％、3％、4％或5％，更优为3％；
[0090] 优选地，所述冻干保护剂包含0.1％w/w～0.5％w/w的谷氨酸，磷酸二氢钾，例如可以为，但不限于0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％，更优为0.3％。优选地，所述谷氨酸和磷酸二氢钾的质量比为1:1。
[0091] 优选地，所述冻干保护剂包含15％w/w～25％w/w的蔗糖，例如可以为，但不限于15％w/w、18％w/w、20％w/w、22％w/w或25％w/w，更优为20％w/w；
[0092] 优选地，所述冻干保护剂包含10％w/w～30％w/w的水解乳蛋白，例如可以为，但不限于10％w/w、15％w/w、20％w/w、25％w/w或30％w/w，更优为20％w/w；
[0093] 优选地，所述冻干保护剂包含1％w/w～10％w/w的明胶，例如可以为，但不限于1％w/w、2％w/w、5％w/w、8％w/w或10％w/w，更优为5％w/w；
[0094] 优选地，所述疫苗病毒含量为106.0～107.0TCID50/头份，优选为107.0TCID50/头份。
[0095] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0096] 本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
[0097]
[0098] 实施例1
[0099] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，包括如下步骤：
[0100] (a)、取小反刍兽疫病毒进行病毒含量测定，计算接种病毒的Vero全悬浮细胞密-4度。按MOI为10 的接种量准备病毒液，备用。
[0101] (b)、将Vero全悬浮细胞用无血清培养基，调节至3.0×106cells/mL的密度，加入(a)得到的病毒液，使其在35℃、转速55r/min、pH7.5、DO值为60的条件下培养。
[0102] (c)、待步骤(b)培养至65～70小时，细胞密度下降至6.0×106cells/mL时收获培养物。
[0103] (d)、将步骤(c)得到的培养物在4℃、5000r/min条件下离心30分钟，取上清液，得到小反刍兽疫病毒。
[0104] 实施例2
[0105] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，包括如下步骤：
[0106] (a)、取小反刍兽疫病毒进行病毒含量测定，计算接种病毒的Vero全悬浮细胞密度。按MOI为10-2的接种量准备病毒液，备用。
[0107] (b)、将Vero全悬浮细胞用无血清培养基，调节至4.0×106cells/mL的密度，加入(a)得到的病毒液，使其在34℃、转速100r/min、pH7.0、DO值为100的条件下培养。
[0108] (c)、待步骤(b)培养至48小时，细胞密度下降至6.2×106cells/mL时收获培养物。
[0109] (d)、将步骤(c)得到的培养物在3℃、8000r/min条件下离心25分钟，取上清液，得到小反刍兽疫病毒。
[0110] 实施例3
[0111] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，包括如下步骤：
[0112] (a)、取小反刍兽疫病毒进行病毒含量测定，计算接种病毒的Vero全悬浮细胞密-6度。按MOI为10 的接种量准备病毒液，备用。
[0113] (b)、将Vero全悬浮细胞用无血清培养基，调节至2.0×106cells/mL的密度，加入(a)得到的病毒液，使其在38℃、转速30r/min、pH7.6、DO值为40的条件下培养。
[0114] (c)、待步骤(b)培养至96小时，细胞密度下降至5.0×106cells/mL时收获培养物。
[0115] (d)、将步骤(c)得到的培养物在5℃、3000r/min条件下离心35分钟，取上清液，得到小反刍兽疫病毒。
[0116] 实施例4
[0117] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(c)至细胞活率下降至80％时收获培养物。
[0118] 实施例5
[0119] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(c)至细胞活率下降至75％时收获培养物。
[0120] 实施例6
[0121] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(c)至细胞活率下降至60％时收获培养物。
[0122] 实施例7
[0123] 本实施例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，包括如下步骤：
[0124] (a)、取小反刍兽疫病毒进行病毒含量测定，计算接种病毒的Vero全悬浮细胞密度。按MOI为10-4的接种量准备病毒液，备用。
[0125] (b)、将Vero全悬浮细胞用无血清培养基，调节至3.0×106cells/mL的密度，加入(a)得到的病毒液，使其在30℃、转速120r/min、pH6.8、DO值为120的条件下培养。
[0126] (c)、待步骤(b)培养至细胞活率下降至55％时收获培养物。
[0127] (d)、将步骤(c)得到的培养物在6℃、2500r/min条件下离心40分钟，取上清液，得到小反刍兽疫病毒。
[0128] 实施例8-13
[0129] 本实施例提供了一种小反刍兽疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0130] (a)、将A酶水解酪素、谷氨酸、蔗糖、水解乳蛋白按顺序加入到预热纯水中溶解，通过≤0.22μ滤膜过滤除菌。
[0131] (b)、将明胶加入到预热纯水中，121℃、15磅高压30分至4小时灭菌和水解。
[0132] (c)、将步骤(a)与步骤(b)体积比为4:1的比例混合，得到含有3.0％w/w A酶水解酪素、0.3％w/w谷氨酸、20％w/w蔗糖、20％w/w水解乳蛋白和5％w/w明胶的冻干保护剂。
[0133] 将实施例1-7提供的小反刍兽疫病毒液加入冻干保护剂中，搅拌均匀，进行冻干，得到所述小反刍兽疫疫苗。其中，小反刍兽疫病毒液的体积占总体积的80％。
[0134] 实施例14
[0135] 本实施例提供了一种小反刍兽疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0136] (a)、将A酶水解酪素、谷氨酸、蔗糖、水解乳蛋白按顺序加入到预热纯水中溶解，通过≤0.22μ滤膜过滤除菌。
[0137] (b)、将明胶加入到预热纯水中，121℃、15磅高压30分至4小时灭菌和水解。
[0138] (c)、将步骤(a)与步骤(b)体积比为4:1的比例混合，得到含有1％w/w A酶水解酪素、0.5％w/w谷氨酸、15％w/w蔗糖、30％w/w水解乳蛋白和1％w/w明胶的冻干保护剂。
[0139] 将实施例1提供的小反刍兽疫病毒液加入冻干保护剂中，搅拌均匀，进行冻干，得到所述小反刍兽疫疫苗。其中，小反刍兽疫病毒液的体积占总体积的90％。
[0140] 实施例15
[0141] 本实施例提供了一种小反刍兽疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0142] (a)、将A酶水解酪素、谷氨酸、蔗糖、水解乳蛋白按顺序加入到预热纯水中溶解，通过≤0.22μ滤膜过滤除菌。
[0143] (b)、将明胶加入到预热纯水中，121℃、15磅高压30分至4小时灭菌和水解。
[0144] (c)、将步骤(a)与步骤(b)体积比为4:1的比例混合，得到含有5％w/w A酶水解酪素、0.1％w/w谷氨酸、25％w/w蔗糖、10％w/w水解乳蛋白和10％w/w明胶的冻干保护剂。
[0145] 将实施例1提供的小反刍兽疫病毒液加入冻干保护剂中，搅拌均匀，进行冻干，得到所述小反刍兽疫疫苗。其中，小反刍兽疫病毒液的体积占总体积的70％。
[0146] 实施例16
[0147] 本实施例提供了一种小反刍兽疫弱毒疫苗稀释液的制备方法，包括如下步骤：
[0148] (a)、将5％鞭毛素蛋白加入到PBS溶液中，搅拌溶解。
[0149] (b)、将10％甘露聚肽糖加入到步骤(a)溶液中，搅拌溶解。
[0150] (c)、将步骤(b)液通过≤0.22μ滤膜过滤除菌，得疫苗稀释剂。
[0151] (d)、根据培养液上清中的病毒含量及动物的免疫剂量，将配制好的稀释液注射到疫苗瓶中摇匀使用。
[0152] 实施例17
[0153] 本实施例提供了一种小反刍兽疫弱毒疫苗稀释液的制备方法，与实施例16的不同之处在于不包括鞭毛素蛋白。
[0154] 实施例18
[0155] 本实施例提供了一种小反刍兽疫弱毒疫苗稀释液的制备方法，与实施例16的不同之处在于不包括甘露聚肽糖。
[0156] 实施例19
[0157] 本实施例提供了一种小反刍兽疫弱毒疫苗稀释液的制备方法，与实施例16的不同之处在于仅用PBS稀释。
[0158] 对比例1
[0159] 本对比例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，与实施例1的不同之处在于，小反刍兽疫病毒的接种量MOI改为10-1。
[0160] 对比例2
[0161] 本对比例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，与实施例1的不同之处在于，Vero全悬浮细胞的细胞密度为1.0×106cells/mL
[0162] 对比例3
[0163] 本对比例提供了一种小反刍兽疫病毒的制备方法，与实施例1的不同之处在于，在步骤(b)中，将vero全悬浮细胞改Vero贴壁细胞静置培养。
[0164] 实验例
[0165] 为了对本发明提供的小反刍兽疫病毒的培养方法、应用该方法培养得到的小反刍兽疫病毒及应用上述病毒制备得到的小反刍兽疫活疫苗的有益效果进行进一步的说明，进行如下实验，实验流程如图1所示：
[0166] 实验例一培养病毒含量的测定
[0167] 将实施例1～6及对比例1和2提供的病毒液用MEM将毒种作10倍系列稀释，取10-4、-5 -6 -710 、10 、10 4个稀释度，分别接种已长成良好单层的Vero细胞96孔培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照8孔，置37℃5％CO2培养箱中培养并观察5日，按Spearman-Karber法计算TCID50。结果见表1。
[0168] 表1病毒含量检测结果
[0169]
[0170]
[0171] 由表1数据结果表明，应用本发明实施例1-7提供的小反刍兽疫病毒病毒含量相对于对比例1-3提供的小反刍兽疫病毒病毒含量高，说明应用本发明提供的方法制备得到的病毒含量高，小反刍兽疫病毒能在Vero全悬浮细胞上很好的增殖；而相比较实施例1-7的结果可知，培养过程中各参数在本发明优选范围内的，制备得到的小反刍兽疫病毒病毒含量更高。
[0172] 实验例二疫苗检验
[0173] 1、疫苗支原体检验、无菌检验按“兽用生物制品规程”(2015版)附录对五种疫苗进行无菌检验，应符合规定。
[0174] 2、安全检验。
[0175] 选取小反刍兽疫病毒阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感羊50头，将实验用羊分成10组，作为免疫组，每组5头，免疫组分别鼻孔喷雾实用实施例5稀释的实施例1-7及对比例1-3提供的小反刍兽疫病毒制备得到的活疫苗，另取5头作为对照组，鼻孔喷雾生理盐水，观察三周，无任何临床症状，无死亡。
[0176] 3、小反刍兽疫病毒中和抗体检验。
[0177] 选取小反刍兽疫病毒阴性，中和抗体不高于1∶4的健康易感羊40头，将实验动物分成8组，作为免疫组，每组5头，免疫组分别用实施例16-19稀释实施例1及对比例1-3提供的小反刍兽疫病毒制备得到的疫苗喷鼻，另取5头作为对照组，鼻孔喷雾生理盐水，免疫前和免疫后三周进行采血，进行中和抗体测定。结果见表2。
[0178] 表2中和抗体检验
[0179]
[0180]
[0181] 注：中和抗体检测用毒株：疫苗株(clone9株)。中和抗体检测用细胞：vero细胞。
[0182] 由表2数据结果表明，应用本发明实施例1提供的小反刍兽疫病毒的培养方法得到的小反刍兽疫病毒制备得到的小反刍兽疫活疫苗能使免疫羊产生整齐、较高的中和抗体，相对于对比例1-3提供的小反刍兽疫病毒的培养方法得到的小反刍兽疫泻病毒制备得到的小反刍兽疫活疫苗有较高的中和抗体。比较实施例17-19，说明疫苗稀释液中的纤毛素蛋白和甘露聚肽糖对疫苗免疫效果十分重要。
[0183] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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