菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用
阅读：1020发布：2020-08-25
专利汇可以提供菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种菲 牛 蛭(Hirudinaria manillensis)Kazal型胰蛋白酶 抑制剂 Bdellin-HM及其编码基因和应用，属 生物 医学技术领域。该菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM,分子量17432.8道尔顿，等电点4.84，全序列如SEQ ID NO:1所示，其第1位与第5位，第2位与第4位，第3位与第6位的半胱 氨 酸形成3对分子内二硫键。如SEQ ID NO:2所示编码的基因由504个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第54-501为核苷酸。本发明的有益效果在于:分离纯化得到菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM,并克隆得到其cDNA序列；该抑制剂表现出显著的胰蛋白酶抑制活性(Ki～8.45nM)，但未观察到弹性蛋白酶、胰凝 乳蛋白 酶、激肽释放酶、凝血酶、血 纤维 蛋白溶酶、FXIIa、FXIa和FXa的抑制作用，能作为制备胰蛋白酶抑制剂的应用。，下面是菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用专利的具体信息内容。
菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和
应用
技术领域：
[0002] 蛭类是我国的一种传统中药，对于水蛭抗凝血作用的记载是公元前2世纪的“尔雅”、明朝李时珍的《本草纲目》和《神农本草经》。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。蛭类疗法有很长的历史，在公元前1500年的埃及法老陵墓中就有使用蛭类治疗的图画。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。
[0003] 菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)，别名马尼拟医蛭，俗称金边蚂蟥。蛭纲,医蛭科牛蛭属，是目前常见吸血蛭类中个体较大的品种。该物种的模式产地在菲律宾吕宋岛。分布于印度尼西亚、菲律宾、印度、孟加拉、斯里兰卡、缅甸、泰国、越南、台湾岛以及中国大陆的福建、广东、广西、海南等地。主要栖息于弱酸性(pH值5.5～7.0)的水田、水沟或池塘里。当人畜经过时，就附着吸食血液。菲牛蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能，因此被菲牛蛭咬过的伤口常流血不止。民间也利用这一性质，用菲牛蛭来治疗病人的局部血流不畅，但是人们对这些治疗作用的物质基础和分子机制还了解很少。
[0004] 丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)广泛分布于动植物和微生物中，现有超过500个家族成员被发现。通过调节丝氨酸蛋白酶的活性，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与调节体内许多重要的生命活动过程，具有抗凝、抗炎、抗感染、抗肿瘤等生理活性，现已广泛应用于急性胰腺炎、外科手术、肿瘤、脑血管疾病等疾病治疗。此外，在凝血系统和补体系统中发挥作用的蛋白酶也会受丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控以避免其蛋白酶活性对周围组织造成破坏。Kunitz,Kazal,Bowman-Birk,a-2-macroglobulin和serpin是研究较为广泛的丝氨酸蛋白酶抑制剂类型。
[0005] 来自欧洲医蛭的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂LDTI是第一个人类肥大细胞类胰蛋白酶紧密结合的蛋白酶抑制剂，可能作为一个药理探针来评估肥大细胞类胰蛋白酶在哮喘、关节炎、牙周疾病、皮肤疾病和血液凝固障碍中的病理生理作用。另外从欧洲医蛭中发现的Bdellin B-3和日本医蛭中发现的Bdellin-KL都表现出对胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和精子头粒蛋白的抑制作用，暗示它们可能在生物繁殖过程中起作用。
[0006] 目前，国内外尚未见菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的有关研究报道
[0007] 发明人将本发明的菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。发明内容：
[0008] 本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有显著胰蛋白酶抑制活性的菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用。
[0009] 本发明通过使用阴离子交换柱DEAE Sephadex A-50、反向高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分离纯化获得菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM。根据Edman降解法测得编码菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂的N-端部分氨基酸序列，再通过构建菲牛蛭头部cDNA文库并进行cDNA文库筛选，获得了菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂的全序列以及编码基因。该菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂是首次发现的具有Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂特点和显著胰蛋白酶抑制活性的菲牛蛭丝氨酸蛋白酶抑制剂。
[0010] 本发明的主要技术方案如下：
[0011] 菲牛蛭的分离纯化方法：
[0012] 收集的菲牛蛭头部粗提取液首先过阴离子交换柱DEAE Sephadex A-50，收集具有胰蛋白酶抑制活性的峰，冻干，过反向高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱，最后将具有胰蛋白酶抑制活性峰用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，纯化得到菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂。
[0013] 菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因的克隆包括:
[0014] 菲牛蛭头部总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因。两对扩增引物为：Primer 1 5’-GAYWSNGARTGYGTNTGYAC-3’和Primer 2 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；Primer 3 5’-CTYACRCANACRTGNTTY-3’和Primer 4 5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGA-3’(R＝A/G；Y＝C/T；S＝C/G；W＝A/T；N＝A/C/G/T)。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因由504个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为(SEQ ID NO:
1):
1):
[0015]ATGAAGCTGTTGCTTGCTTTGGCCCTTTTCGGTGCATTTGTCACAATCAACGCCGACTCAGAATGTGTCTGCACCAAAGAATTGAACCAGGTTTGCGGAAGTGATGGACATACCTACGACAACCCTTGTCTAGCTACGTGCCACGGGGCGTCTGTCGCCCACGAACACGCCTGCGAAGGACACGAAGAGGAACATCACGAAGAAGACCACCATGACGGTGAGCACAATAATGGTGACCACCATGAAGGTGAGCACAATAATGGTGAACACCATGACGACGAGCACAAGGATGACCACCATGGAGAGGACCACCACGAAGACGGGGAACACAATGAAGAGCACAAGAATGACCATCACGATGATGGTCATGATGATCATCACAACAATGGCGACCACAAGGATGACCACCATGAAGAAGAACACCATGAAGAAGAACACCACGAAGGGGACCACCACGAAGAGGAGCATCACGAAGAAGAGCACAAAGACGACCATCACGATTAA
[0016] 其中54-501的片段编码菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂成熟肽。菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因作为基因工程制备菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂的应用。
[0017] 本发明的有益效果在于:
[0018] 分离纯化得到菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM,并通过克隆得到其cDNA序列；该菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂表现出显著的胰蛋白酶抑制活性(Ki～8.45nM)，但未观察到弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、FXIIa、FXIa和FXa的抑制作用，能作为制备胰蛋白酶抑制剂的应用。
附图说明：
附图说明：
[0019] 图1显示菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM的蛋白酶抑制活性。
[0020] 图2显示菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM的胰蛋白酶抑制类型与抑制常数。具体实施方式:
[0021] 下面通过实施例对本发明的实质性内容作进一步详细说明。
[0022] 菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM分离纯化：
[0023] Ⅰ、DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱:
[0024] 将3g冻干的菲牛蛭头部粗提取液溶于20ml 50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.9),12000rpm离心10分钟，取上清上样于已平衡好的DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱(5×
60cm)，用含不同浓度的氯化钠的Tris盐酸缓冲液梯度洗脱，洗脱200管(用自动部分收集器进行收集，每管15ml、流速1.5ml/min)。具体氯化钠浓度为：0-0.2M NaCl(0、0.2M NaCl各
1L)、0.2-0.4M NaCl(0.2、0.4M NaCl各1L)、0.4-0.6M NaCl(0.4、0.6M NaCl各1L)、1M NaCl。于280nm和215nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，合并具有胰蛋白酶抑制活性的部分，冻干，-20℃保存备用。
60cm)，用含不同浓度的氯化钠的Tris盐酸缓冲液梯度洗脱，洗脱200管(用自动部分收集器进行收集，每管15ml、流速1.5ml/min)。具体氯化钠浓度为：0-0.2M NaCl(0、0.2M NaCl各
1L)、0.2-0.4M NaCl(0.2、0.4M NaCl各1L)、0.4-0.6M NaCl(0.4、0.6M NaCl各1L)、1M NaCl。于280nm和215nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，合并具有胰蛋白酶抑制活性的部分，冻干，-20℃保存备用。
[0025] Ⅱ、反向高压液相层析(RP-HPLC):
[0026] 将DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱所得到的活性峰用2ml Tris盐酸缓冲液(pH 8.9)重新溶解，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液上样于反相高压液相C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)：乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为1ml/min。收集具有胰蛋白酶抑制活性的峰。
[0027] Ⅲ、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测
[0028] 从具有胰蛋白酶抑制活性峰中取10ul进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测分子量，其余冻干，-20℃保存。
[0029] Ⅳ、Edman降解法测序
[0030] 通过Edman降解法对纯化所得的胰蛋白酶抑制剂纯品进行N-端测序(model491,ABI,美国)。
[0031] 菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因克隆：
[0032] Ⅰ、菲牛蛭头部总RNA提取：
[0033] A.活体菲牛蛭用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取头部组织，称重，取300mg组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国life technologies公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
[0034] B.加入等体积氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
[0035] C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗涤三次，室温晾干，管底沉淀物即为菲牛蛭头部总RNA。
[0036] Ⅱ、菲牛蛭头部mRNA的纯化：
[0038] A.取菲牛蛭头部总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。
[0040] C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.lml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的菲牛蛭头部mRNA。
[0041] D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
[0043] A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
[0044] 1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl菲牛蛭头部mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
[0045] 2.混匀离心管中的试剂并离心，72℃孵育2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。
[0046] 3.紧接着在上述离心管中加入2μl 5×第一链缓冲液、1μl 20mM二硫苏糖醇、1μl 10mM dNTP混合物、1μl PowerScript反转录酶。
[0047] 4.混匀并离心，在42℃孵育1小时。将离心管置于冰上中止反应。
[0048] 5.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
[0049] B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
[0050] 1. 95℃预热PCR仪。
[0051] 2.将2μl cDNA第一链、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶于离心管混匀进行扩增。
[0052] 3.在PCR仪中按以下程序扩增：
[0053] ①95℃ 1分钟
[0054] ②30个循环：
[0055] 95℃ 15秒钟
[0056] 65℃ 30秒钟
[0057] 68℃ 3分钟
[0058] 4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
[0059] C.PCR产物用PROMEGA公司的 SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
[0061] 2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
[0062] 3.重复步骤2。
[0063] 4. 16,000g离心5分钟。
[0064] 5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
[0065] 6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
[0066] 7. 16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
[0067] Ⅳ、菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因克隆筛选：
[0068] A.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
[0069] 1.挑取单个DH5α菌落，接种于1ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于1ml LB培养液中，37℃振荡培养2-3小时。当OD600值达到0.5时，收获细菌培养物。
[0070] 2.将离心管在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
[0071] 3.于4℃以4100r/min离心5min，回收细胞。
[0072] 4.倒出培养液，将管倒置于滤纸上1min以使最后的培养液流尽。
[0073] 5.每1ml初始培养物用600μl预冷的CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2,20mmol/L CaCl2)，重悬每份细胞沉淀。
[0074] 6.于4℃以4100r/min离心5min，以回收细胞。
[0075] 7.倒出培养液，将管倒置于滤纸上1min以使最后的培养液流尽。
[0076] 8.每1ml初始培养物用100μl预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，放置于4℃备用。
[0077] B.从菲牛蛭cDNA中克隆目标序列
[0078] 以合成的cDNA为模板，两对扩增引物：Primer 1 5’-GAYWSNGARTGYGTNTGYAC-3’和Primer 2 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；Primer 3 5’-CTYACRCANACRTGNTTY-3’和Primer 4 5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGA-3’(R＝A/G；Y＝C/T；S＝C/G；W＝A/T；N＝A/C/G/T),其中Primer 1和Primer 3根据Edman降解法测定的N-端序列设计。PCR反应在如下条件下进行：95℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃60秒钟，30个循环。
[0079] C.酶切、连接以及连接产物的转化：
[0080] 1.在微量离心管中加入1μl Promega公司的 载体、4μl菲牛蛭cDNA双链溶液，全量为5μl。
[0081] 2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
[0082] 3. 16℃反应2小时。
[0083] 4.取5μl加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
[0084] 5. 42℃加热90秒钟后，再在冰中放置2分钟。
[0085] 6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃100rpm振荡培养60分钟。
[0086] 7.取200μ涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。
[0087] 8.挑取单克隆进行菌液PCR。
[0088] Ⅴ、菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM基因序列测定和结果：
[0089] 用美国Applied Biosystems 377全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为M13R：CAGGAAACAGCTATGACC；M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0090] 基因测序结果自5’端至3’端序列为(SEQ ID NO:1):
[0091]ATGAAGCTGTTGCTTGCTTTGGCCCTTTTCGGTGCATTTGTCACAATCAACGCCGACTCAGAATGTGTCTGCACCAAAGAATTGAACCAGGTTTGCGGAAGTGATGGACATACCTACGACAACCCTTGTCTAGCTACGTGCCACGGGGCGTCTGTCGCCCACGAACACGCCTGCGAAGGACACGAAGAGGAACATCACGAAGAAGACCACCATGACGGTGAGCACAATAATGGTGACCACCATGAAGGTGAGCACAATAATGGTGAACACCATGACGACGAGCACAAGGATGACCACCATGGAGAGGACCACCACGAAGACGGGGAACACAATGAAGAGCACAAGAATGACCATCACGATGATGGTCATGATGATCATCACAACAATGGCGACCACAAGGATGACCACCATGAAGAAGAACACCATGAAGAAGAACACCACGAAGGGGACCACCACGAAGAGGAGCATCACGAAGAAGAGCACAAAGACGACCATCACGATTAA
[0092] 编码菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Bdellin-HM成熟序列为第54-501位核苷酸，其氨基酸序列为(SEQ ID NO:2)：NH2-DSECVCTKELNQVCGSDGHTYDNPCLATCHGASVAHEHACEGHEEEHHEEDHHDGEHNNGDHHEGEHNNGEHHDDEHKDDHHGEDHHEDGEHNEEHKNDHHDDGHDDHHNNGDHKDDHHEEEHHEEEHHEGDHHEEEHHEEEHKDDHHD-COOH。
[0093] 菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM基因作为基因工程制备菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂的应用。
[0094] 菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdell in-HM的蛋白酶抑制实验：
[0095] A.试剂与材料
[0096] 1.缓冲液(pH 7.4)
[0097] 10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA and 0.05％v/v Surfactant P20
[0098] 2.蛋白酶与相应发色底物：
[0099] 400nM胰蛋白酶(SIGMA)与0.2mM Gly-Arg-p-nitroanilide dihydrochloride(SIGMA)
[0100] 400nM血纤维蛋白溶酶(SIGMA)与0.2mM Gly-Arg-p-nitroanilide dihydrochloride(SIGMA)
[0101] 400nM弹性蛋白酶(SIGMA)与0.2mM N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide(SIGMA)
[0102] 400nM胰凝乳蛋白酶(SIGMA)与0.2mM N-Succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide(SIGMA)
[0103] 400nM激肽释放酶、10nM FXIIa、400nM FXIa(Enzyme Research Laboratories,USA)与0.2mM H-D-Pro-Phe-Arg-pNA·2HCl (Hyphen Biomed,France)
[0104] 10nM凝血酶(SIGMA)与0.2mM H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl(Hyphen Biomed,France)
[0105] 10nM FXa(Enzyme Research Laboratories,USA)与0.2mM CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH(SIGMA)。
[0106] B.蛋白酶抑制实验
[0107] 1.在96孔板中加入10μL Bdellin-HM(终浓度为11.5μM)、10μL蛋白酶和40μL缓冲液，37℃孵育5分钟。
[0108] 2.随即加入30μL缓冲液与10μL发色底物的混合液，终体积为100μL。
[0110] C.对胰蛋白酶抑制类型与抑制常数的测定
[0111] Dixon plot曲线：不同浓度的胰蛋白酶(0,2.3,4.6,6.9,9.2,and 11.5nM)与不同浓度的Gly-Arg-p-nitroanilide dihydrochloride(131.99and263.98μM)，步骤如前所诉。以抑制剂浓度为横坐标，纵坐标为反应速率的倒数绘制Dixon plot曲线。2条直线延长线交点的横坐标值为抑制剂对胰蛋白酶的抑制常数。交点在横坐标上方表示抑制类型为竞争性抑制，在横坐标下方表示混合性抑制。
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