一种快速高效猪肺炎支原体培养基及其配制方法
阅读：25发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种快速高效猪肺炎支原体培养基及其配制方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种快速高效的猪 肺 炎支原体增菌培养基以及制备方法，属于兽医 生物 学技术范畴。培养基包括I、II和III共3部分；其主要成分包括DMEM、 水 解 乳蛋白 、HEPES、 酵母 提取物、PPLO、BHI、精 氨 酸、谷氨酰胺、丙 酮 酸 钠、DNA以及 酸化 猪血清等；该发明培养基在培养猪肺炎支原体时快速高效并且稳定，在实验室将猪肺炎支原体 种子 液按1∶13接种至该培养基100ml体系内，在40-48小时内可使猪肺炎支原体的CCU达到1011/ml；其培养基不仅提高了猪肺炎支原体的培养滴度，更是提高了猪肺炎支原体的生长速率，采用该培养基生产 疫苗 用 抗原 时，提高了生产效益并且降低了生产成本，经济效益显著。，下面是一种快速高效猪肺炎支原体培养基及其配制方法专利的具体信息内容。
1.一种猪肺炎支原体基础培养基干粉，其特征在于：它包括如下3个部分：
I部分：
II部分：
PPLO粉 42-60重量份，
BHI粉 40-60重量份；
III部分：
重量份为g时，摩尔份为nmol。
2.如权利要求1所述的培养基干粉，其特征在于，它包括如下3个部分：
I部分：
II部分：
PPLO粉 42重量份，
BHI粉 40重量份；
III部分：
3.一种猪肺炎支原体基础培养基的配制方法，其特征在于，它是按权利要求1或2所述的配比取I部分、II部分和III部分分别溶于水，调节pH，配制成4400-5400、2500-3500和100体积份的pH值为7.4-7.6的水溶液，再将水溶液混合即得；
优选地，调节pH用的试剂是NaOH或HCl溶液；
当重量份为g时，体积份为ml。
4.如权利要求3所述的猪肺炎支原体基础培养基的配制方法，其特征在于，它是按权利要求1或2所述的配比取I部分、II部分和III部分分别溶于水，调节pH，配制成4900、3000和
100体积份的pH值为7.4-7.6的水溶液，再将水溶液混合即得；
当重量份为g时，体积份为ml。
5.如权利要求3或4所述的猪肺炎支原体基础培养基的配制方法，其特征在于：
还需在I部分对应水溶液中添加pH指示剂；优选地，所述的pH指示剂是酚红；
和/或，还需在I部分对应水溶液中添加抗生素；优选地，所述抗生素是青霉素。
6.权利要求3-5任一所述方法制备得到的猪肺炎支原体基础培养基。
7.一种猪肺炎支原体增菌培养基，其特征在于，它包括如权利要求6所述的基础培养基，以及酸化猪血清；基础培养基和酸化猪血清的体积比是(4～6)∶1；
所述酸化猪血清的制备方法如下：
1)将猪血清在56℃下灭活，
2)调节pH值到4.3～4.5进行酸化，
3)去除沉淀，得上清，
4)pH调回到7～8，即得。
8.如权利要求7所述的猪肺炎支原体增菌培养基，其特征在于：
基础培养基与酸化猪血清的体积比是5∶1。
9.如权利要求7或8所述的猪肺炎支原体增菌培养基，其特征在于：所述酸化猪血清的制备方法的步骤2)中，酸化持续时间为4～24h；和/或，酸化温度是4℃。
10.权利要求6-9任一所述的猪肺炎支原体基础培养基或猪肺炎支原体增菌培养基在培养猪肺炎支原体中的用途。
一种快速高效猪肺炎支原体培养基及其配制方法
技术领域
背景技术
[0002] 猪肺炎支原体主要引起猪的慢性呼吸道疾病，常呈继发感染特性，并且会加剧其他传染病的临床症状，造成猪体严重的代谢功能障碍和机能衰弱，是造成养猪业经济损失的最主要传染病之一。一般针对此病主要采取综合防治的措施，包括较理想的饲养环境和药物以及疫苗的使用；理想的环境主要涉及到适当的饲养密度、饲养方式以及温度和通风等等；另外，抗生素等药物虽然在临床疾病方面具有较好的效果，但亦存在较大的副反应和不良后果，耐药性，药物残留和肉制品不良等都是面临的挑战；因此，疫苗预防会不断的成为未来疾病防治的主要手段。
[0003] 目前在猪肺炎支原体疫苗抗原制备方面，其使用的猪肺炎支原体培养基亦有很多种；有猪沸猪肺组织的灭活细胞培养基，猪肺埋块无细胞培养基，有江苏农业科学院发明的KM2培养基，有赛默飞世尔(Thermo fisher)商品化的支原体培养基(OXID品牌)等等。
[0004] 上述传统培养基或者是商品化以及实验室用培养基都存在生长慢，浓度不高，培养时间长以及成本高等问题，制约着猪肺炎支原体抗原的生产并最终影响着疫苗的免疫效果。
发明内容
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的猪肺炎支原体的培养基。
[0006] 本发明的技术方案包括：
[0007] 一种猪肺炎支原体基础培养基干粉，其特征在于：它包括如下3个部分：
[0008] I部分：
[0009]
[0010]
[0011] II部分：
[0012] PPLO粉 42-60重量份，
[0013] BHI粉 40-60重量份；
[0014] III部分：
[0015]
[0016] 重量份为g时，摩尔份为nmol。
[0017] 如前述的培养基干粉，其特征在于，它包括如下3个部分：
[0018] I部分：
[0019]
[0020] II部分：
[0021] PPLO粉 42重量份，
[0022] BHI粉 40重量份；
[0023] III部分：
[0024]
[0025] 一种猪肺炎支原体基础培养基的配制方法，它是将前述培养基干粉按所述配比取I部分、II部分和III部分，溶于水，调节pH，分别配制成4400-5400、2500-3500和100体积份的pH值为7.4-7.6的水溶液，再将水溶液混合即得；
[0026] 优选地，调节pH的试剂是NaOH和HCl溶液；
[0027] 当重量份为g时，体积份为ml。
[0028] 进一步地，它是将前述培养基干粉按所述配比取I部分、II部分和III部分，溶于水，调节pH，分别配制成4900、3000和100体积份的pH值为7.4-7.6的水溶液，再将水溶液混合即得；
[0029] 当重量份为g时，体积份为ml。
[0030] 更进一步地，还需在I部分对应水溶液中添加pH指示剂；优选地，所述的pH指示剂是酚红；
[0031] 和/或，还需在I部分对应水溶液中添加抗生素；优选地，所述抗生素是青霉素。
[0032] 前述任一方法制备得到的猪肺炎支原体基础培养基。
[0034] 所述酸化猪血清的制备方法如下：
[0035] 1)将猪血清在56℃下灭活，
[0036] 2)调节pH值到4.3～4.5进行酸化，
[0037] 3)去除沉淀，得上清，
[0038] 4)pH调回到7～8，即得。
[0039] 前述的猪肺炎支原体增菌培养基中，
[0040] 基础培养基与酸化猪血清的体积比是5∶1；
[0041] 和/或，所述酸化猪血清的制备方法中，步骤2)的酸化持续时间为4～24h；
[0042] 和/或，所述酸化猪血清的制备方法中，步骤2)的温度是4℃。
[0043] 前述的猪肺炎支原体基础培养基或猪肺炎支原体增菌培养基在培养猪肺炎支原体中的用途。
[0044] 本发明的快速高效猪肺炎支原体培养基是基于对无机、有机化学和生物化学以及微生物学等知识的综合分析和运用所优化出来的；对培养基的渗透压、pH值、缓冲体系、碳源、氮源、维生素、胆固醇和无机盐等诸多营养组份进行了分析组合和筛选；研发出了高效快速培养猪肺炎支原体的培养基；其既能显著增加猪肺炎支原体培养滴度又兼顾培养时间短的特点，所表现出的优势较为全面。在基础培养基中，除了进一步丰富基本的氮源和碳源营养成分外，又创新性的加入了BHI、酵母提取物等增加胆固醇和维生素的物质，并引入了有害物质更少的酸处理猪血清和更加温和的HEPES缓冲体系；其结果就是研发的培养基使支原体的活菌滴度达到了1011次方，而培养时间也缩短至36-48h(30ml培养体系)。因此，该发明培养基显著的提高了猪肺炎支原体的抗原产量和生产效率，为预防猪肺炎支原体疾病做出更进一步的贡献。
[0046] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0047] 实施例1本发明培养基的制备
[0048] 基础培养基的制备：
[0049] 培养基I部分：
[0050]
[0051] 配制培养基I部分：将上述(1)-(6)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用5M NaOH调至pH为7.6，在用蒸馏水定容至490ml，然后过滤除菌，-20℃备用。
[0052] 培养基II部分：
[0053] (8)PPLO粉 4.2g
[0054] (9)BHI粉 4.0g
[0055] (10)蒸馏水 300ml
[0056] 配制培养基II部分：将(8)-(9)成分逐一溶于一定量水中，用5M NaOH调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至300ml；在110℃高压15min，4℃储存备用。
[0057] 培养基III部分：
[0058]
[0059] 配制培养基III部分：将(11)-(14)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用40％发烟HCl调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至10ml，再过滤除菌，-20℃储存备用。
[0060] 将培养基I、II和III部分按照体积比49∶30∶1混合后，即得到基础培养基800ml。
[0061] 酸化猪血清制备方法：
[0062] 1)将160ml猪血清56℃水浴灭活30min；
[0063] 2)用40％HCl调节猪血清pH为4.3，4℃静置4-24h。
[0064] 3)2000rpm离心沉淀15min，滤纸过滤。
[0065] 4)以5M NaOH调节pH为7.0，过滤除菌，-20℃储存备用。
[0066] 猪血清经过1)-4)步骤后，即可得到160ml酸化猪血清。
[0067] 将基础培养基800ml与酸化猪血清160ml混合后，即可得到完全培养基，分装后，-70℃储存备用。
[0068] 实施例2本发明培养基的制备
[0069] 基础培养基的制备：
[0070] 培养基I部分：
[0071]
[0072]
[0073] 配制培养基I部分：将上述(1)-(6)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用5M NaOH调至pH为7.6，在用蒸馏水定容至490ml，然后过滤除菌，-20℃备用。
[0074] 培养基II部分：
[0075] (8)PPLO粉 6g
[0076] (9)BHI粉 6g
[0077] (10)蒸馏水 定容至300ml
[0078] 配制培养基II部分：将(8)-(9)成分逐一溶于一定量水中，用5M NaOH调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至300ml；在110℃高压15min，4℃储存备用。
[0079] 培养基III部分：
[0080]
[0081] 配制培养基III部分：将(11)-(14)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用40％发烟HCl调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至6.25ml，再过滤除菌，-20℃储存备用。
[0082] 将培养基I、II和III部分按照体积比49∶30∶1混合后，即得到基础培养基800ml。
[0083] 酸化猪血清制备方法：
[0084] 1)将100ml猪血清56℃水浴灭活30min；
[0085] 2)用40％HCl调节猪血清pH为4.3，4℃静置4-24h。
[0086] 3)2000rpm离心沉淀15min，滤纸过滤。
[0087] 4)以5M NaOH调节pH为7.0，过滤除菌，-20℃储存备用。
[0088] 猪血清经过1)-4)步骤后，即可得到100ml酸化猪血清。
[0089] 将基础培养基500ml与酸化猪血清100ml混合后，即可得到完全培养基，分装后，-70℃储存备用。
[0090] 实施例3本发明培养基的制备
[0091] 基础培养基的制备：
[0092] 培养基I部分：
[0093]
[0094] 配制培养基I部分：将上述(1)-(6)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用5M NaOH调至pH为7.6，在用蒸馏水定容至490ml，然后过滤除菌，-20℃备用。
[0095] 培养基II部分：
[0096] (8)PPLO粉 4.2g
[0097] (9)BHI粉 4.0g
[0098] (10)蒸馏水 300ml
[0099] 配制培养基II部分：将(8)-(9)成分逐一溶于一定量水中，用5M NaOH调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至300ml；在110℃高压15min，4℃储存备用。
[0100] 培养基III部分：
[0101]
[0102]
[0103] 配制培养基III部分：将(11)-(14)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用40％发烟HCl调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至10ml，再过滤除菌，-20℃储存备用。
[0104] 将培养基I、II和III部分按照体积比44∶35∶1混合后，即得到基础培养基800ml。
[0105] 酸化猪血清制备方法：
[0106] 1)将133.3ml猪血清56℃水浴灭活30min；
[0107] 2)用40％HCl调节猪血清pH为4.3，4℃静置4-24h。
[0108] 3)2000rpm离心沉淀15min，滤纸过滤。
[0109] 4)以5M NaOH调节pH为7.0，过滤除菌，-20℃储存备用。
[0110] 猪血清经过1)-4)步骤后，即可得到133.3ml酸化猪血清。
[0111] 将基础培养基800ml与酸化猪血清133.3ml混合后，即可得到完全培养基，分装后，-70℃储存备用。
[0112] 实施例4本发明培养基的制备
[0113] 基础培养基的制备：
[0114] 培养基I部分：
[0115]
[0116] 配制培养基I部分：将上述(1)-(6)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用5M NaOH调至pH为7.6，在用蒸馏水定容至490ml，然后过滤除菌，-20℃备用。
[0117] 培养基II部分：
[0118] (8)PPLO粉 4.2g
[0119] (9)BHI粉 4.0g
[0120] (10)蒸馏水 300ml
[0121] 配制培养基II部分：将(8)-(9)成分逐一溶于一定量水中，用5M NaOH调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至300ml；在110℃高压15min，4℃储存备用。
[0122] 培养基III部分：
[0123]
[0124] 配制培养基III部分：将(11)-(14)成分逐一溶于一定量的蒸馏水中，用40％发烟HCl调至pH为7.6，再用蒸馏水定容至10ml，再过滤除菌，-20℃储存备用。
[0125] 将培养基I、II和III部分按照体积比54∶25∶1混合后，即得到基础培养基800ml。
[0126] 酸化猪血清制备方法：
[0127] 1)将200ml猪血清56℃水浴灭活30min；
[0128] 2)用40％HCl调节猪血清pH为4.3，4℃静置4-24h。
[0129] 3)2000rpm离心沉淀15min，滤纸过滤。
[0130] 4)以5M NaOH调节pH为7.0，过滤除菌，-20℃储存备用。
[0131] 猪血清经过1)-4)步骤后，即可得到200ml酸化猪血清。
[0132] 将基础培养基800ml与酸化猪血清200ml混合后，即可得到完全培养基，分装后，-70℃储存备用。
[0133] 实验例1猪肺炎支原体的培养和检测
[0134] 通过本发明培养基、KM2培养基和商品化培养基(mycoplasm broth base)对猪肺炎支原体进行培养比较试验。
[0135] 本发明培养基的制备，同实施例1。
[0136] 培养、检测步骤如下：
[0137] 1)猪肺炎支原体菌株和培养条件
[0138] 将实验室保存的猪肺炎支原体菌株SA从-70℃冰箱取出溶解后，分别以8％(V/V)接种在本发明的快速高效的培养基、KM2培养基和商品化支原体培养基(mycoplasm broth base)进行37℃复苏培养，各自培养体系为2ml；等各自培养基颜色变黄后，分别以相同的接种方式传两代复壮；复壮后，将各自培养基菌液以8％(V/V)接种在各自相对应的20ml培养基中进行扩增培养，当培养基颜色有红变黄后(ph由7.6变为6.5)，取出培养物。
[0139] 2)猪肺炎支原体活菌滴度(CCU)的测定
[0140] (1)准备好一块96孔细胞培养板和一定量的快速高效猪肺炎支原体培养基。
[0141] (2)用排枪将培养基加入到96孔板中，每孔加入180ul，做11个稀释梯度和1个阴性对照，每种猪肺炎支原体菌液做3个平行组。
[0142] (3)将培养好的3种相应猪肺炎支原体菌液各吸取20ul加入到第1列孔中并混均，弃去枪头。
[0143] (4)从第一列孔连续10倍梯度稀释到第11孔(每次稀释完1孔后，弃去枪头换上新的枪头吸取液体在加入到后一孔中并混均)
[0144] 3)BCA法(bicinchonininc acid)测定猪肺炎支原体菌体蛋白浓度[0145] a.猪肺炎支原体菌体蛋白的准备
[0146] (1)3种培养基菌液各取10ml，8000转离心30分钟后弃去上清。
[0147] (2)用等体积磷酸盐缓冲液重悬3种菌体，8000转离心30分钟后弃去上清。
[0148] (3)重复2步骤2次。
[0149] (4)再等体积蒸馏水重悬各支原体菌体。
[0151] b.标准曲线绘制
[0152] (1)取7个PCR试管，从第2管开始，每管加入60ul ddH2O(做3个平行组)。
[0153] (2)吸取120ul BSA标准蛋白溶液加入第1个PCR试管中。
[0154] (3)再从第1个PCR试管中吸取60u BSA加入第2试管中，做倍比稀释，以此类推。
[0155] (4)再将各浓度BSA溶液20ul移取到96孔板中，每个梯度做3个重复。
[0156] (5)每个标准蛋白样孔相应加入160ul AB工作液，振荡混均。
[0157] (6)盖上盖子，37℃温育30min。
[0158] (7)用562nm波长测吸光度。
[0159] (8)绘制蛋白量与吸光度的标准曲线。
[0160] c.测定菌体蛋白含量
[0161] 将菌具体裂解液吸取20ul与160ulAB工作液混合均匀，37℃孵育30min后，测定562nm处的吸光度，根据标准曲线，得菌体的蛋白浓度。
[0162] 4)结果
[0163] (1)猪肺炎支原体接种3种培养基3次生长试验CCU(颜色变化单位)以及BCA法测定相对应菌体蛋白浓度平均值结果见表1。
[0164] 表1猪肺炎支原体SA株接种3种培养基3次生长试验CCU测定以及BCA法测定菌体蛋白浓度平均值结果
[0165]
[0166]
[0167] 从猪肺炎支原体(SA株)使用本发明培养基、KM2培养基和支原体营养肉汤(MYCOPLASMA BROTH BASE(OXID))培养的活菌滴度(CCU)测定结果可知，本发明培养基(ADH)和KM2培养基在培养时间上基本一致，都可达到各自培养基生长的最大值(CCU)，但本发明培养基(ADH)比KM2培养基所培养的猪肺炎支原体活菌滴度(CCU)高出至少100倍；并且通过BCA法测定的菌体蛋白含量可知，本发明培养基是KM2培养基的2.57倍；支原体营养肉汤(MYCOPLASMABROTH BASE(OXID))为商品化培养基，购买自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，此培养基所培养的支原体无论从活菌滴度(CCU)还是菌体蛋白含量，都无法与上述2者比较。另外，本法明培养基(ADH)所测的活菌滴度(CCU)为5*1010，考虑到测量方法的误差以及根据菌体蛋白含量与国外文献所描述值的比较(菌体蛋白含量0.3mg/ml相对应于CCU为1011)，因此，本次试验结果亦可推断本发明培养基(ADH)所培养的猪肺炎支原体活菌滴度(CCU)可达到1011。
[0168] 综上可知，本发明的猪肺炎支原体增菌培养基在培养猪肺炎支原体时具有培养效率高，生长速度快等特点，应用前景良好。
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