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一种适于多种禾本科 植物高效组织培养的方法

阅读：577发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，针对禾本科植物中不同种属都能导致其愈伤组织形成和植物再生能力差异的问题，依照外植体-愈伤诱导分化同步-增殖壮苗生根(一步成苗方法)-完整植株这一技术路线，从外植体诱导产生愈伤、芽、根的完整植株只需20～40天，普适性强，特别适合于大规模工厂化育苗，实用性好。还开展了外植体-愈伤诱导-愈伤分化-增殖壮苗生根-完整植株这一技术路线，从外植体诱导产生愈伤、芽、根的完整植株只需30～60天，该方法特别适合建立禾本科植物基因转化受体系统，在实际生产应用中同样具有重要的指导意义。，下面是一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的选择及消毒：选择禾本科植物的幼穗、幼胚、幼嫩花药或成熟胚作为外植体进行消毒处理；
(2)愈伤组织诱导分化：外植体消毒后接种在含有MS培养基的大量元素+5倍B5培养基的微量元素+J3培养基中41.8mg/L的FeSO4·7H2O和55.9mg/L的Na2EDTA+B5培养基的有机成分+
1.0～6.0mg/L 2,4-D+0.1～1.0mg/L KT+0.1～0.6g/L 水解酪蛋白+0.1～0.6g/L水解乳蛋白+0.2～2.0g/L脯氨酸+0.2～2.0g/L谷氨酰胺+20～30g/L蔗糖+3-10g/L琼脂粉培养基上，培养获得丛生芽；
(3)增殖壮苗生根：将步骤(2)获得的丛生芽接种到MS+1.0～4.0mg/L 6-BA+0.1～
1.0mg/L KT+0.1～5.0mg/L矮壮素+20～30g/L蔗糖+3～10g/L琼脂粉培养基上进行增殖、壮苗和生根；
(4)炼苗移栽。
2.根据权利要求1所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，步骤(2)使用的培养基：
MS培养基的大量元素+5倍B5培养基的微量元素+J3培养基中41.8mg/L的FeSO4·7H2O和
55.9mg/L的Na2 EDTA+B5培养基的有机成分+3.0-4.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.3-0.5g/L水解酪蛋白+0.3-0.5g/L水解乳蛋白+1.0g/L脯氨酸+0.3-0.5g/L谷氨酰胺+20～30g/L蔗糖+3-10g/L琼脂粉培养基上培养。
3.根据权利要求1所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，MS+1.0mg/L 6-BA+0.4-0.6mg/L KT+1.0-2.0mg/L矮壮素+20～30.0g/L蔗糖+3-10g/L琼脂粉。
4.根据权利要求1所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，将步骤(2)获得的愈伤组织经过单独的分化过程后再进行增殖壮苗生根，单独的分化过程为：将步骤(2)获得的愈伤组织接在含有N6培养基的大量元素+N6培养基的铁盐+B5培养基的维生素+CuSO4 3.0mg/L+0.1～1.0g/L谷胺酰氨+0.1～1.0g/L脯氨酸+0.1～0.6g/L水解乳蛋白+0.1～4.0mg/L 6-BA+0.1～2.0mg/L NAA+20～30.0g/L蔗糖+20.0g/L山梨醇+3～
10g/L琼脂粉培养基上，培养获得丛生芽；
优选单独的分化过程使用的培养基：
N6培养基的大量元素+N6培养基的铁盐+B5培养基的维生素+CuSO4 3.0mg/L+0.5g/L谷胺酰氨+0.5g/L脯氨酸+0.3g/L水解乳蛋+2.0-2.5mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L NAA+蔗糖20.0-
30.0g/L+山梨醇20.0g/L+琼脂粉3-10g/L培养基上培养。
5.根据权利要求4所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，将步骤(2)获得的20d以内的愈伤组织进行农杆菌介导转基因，经过单独的分化过程后再进行增殖壮苗生根；
农杆菌介导转基因以及单独的分化过程：
1)农杆菌介导转化：将步骤(2)的愈伤组织转移到菌液中浸泡，转移到共培养基，共培养基为步骤(2)的诱导培养基+As，暗培养；
2)筛选培养：共培养后，将愈伤组织用抗生素浸泡，然后转移到抗生素筛选培养基中暗培养筛选，获得优质颗粒状抗性愈伤组织，所述的抗生素筛选培养基为步骤(2)的诱导培养基+抗生素；
3)转基因抗性愈伤分化培养：将抗生素筛选培养基中长出的抗性愈伤，转移到含抗生素的分化培养基中培养，分化出幼苗，所述的含抗生素的分化培养基为权利要求4中所述的单独的分化过程使用的培养基+抗生素。
6.根据权利要求1-5任一项所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，
步骤(1)选取不同外植体进行消毒处理的具体过程：
幼穗：在孕穗早期，选取禾本科植物材料的幼穗,保留苞叶，直接在超净工作台上用
0.1％升汞消毒7～15分钟，无菌水清洗5～6次，然后取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,剥开苞叶取出幼穗，然后用无菌手术刀片将幼穗切成0.8-1.2cm长的穗段，一簇一簇穗段直接接种，或者将其分离，单个接种在步骤(2)愈伤组织诱导分化培养基上；
幼胚：在灌浆结实初期，选取禾本科植物材料开花后6-15d带壳的幼胚，用70％乙醇灭菌30s，再用30％次氯酸钠灭菌20～30min，无菌水清洗5～6次，然后取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,然后将幼胚挤压出来，立即置于步骤(2)愈伤组织诱导分化培养基上来防止幼胚褐化；
幼嫩花药：在孕穗中期，选取禾本科植物生长健壮的幼穗，经检测，取花粉细胞处于单核早期的幼嫩花药，剥去叶鞘和外层苞叶，保留两层苞叶，然后在超净工作台上用0.1％升汞消毒7～15分钟，无菌水清洗5～6次，然后取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,然后将花药挤出，立即置于步骤(2)愈伤组织诱导分化培养基上来防止幼胚褐化；
成熟胚：在成熟期或其它时期，选取禾本科植物材料籽粒饱满的种子，剥去种皮，用无菌水清洗4～5次，然后用70％乙醇灭菌30s，再用30％次氯酸钠灭菌20～30min，无菌水清洗
5～6次，然后取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,并在超净工作台上吹30～
60min，种子均不粘在一起为止，再接种到步骤(2)愈伤组织诱导分化培养基上。
7.根据权利要求1-5任一项所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，
步骤(2)将步骤(1)消毒处理好的外植体接种在步骤(2)使用的培养基上，每个培养瓶外植体个数为10～50个，愈伤组织诱导分化出丛生芽时，直接转入到步骤(3)使用的培养基中进行增殖壮苗生根培养获得大量根叶俱全有效苗；
或者将步骤(2)获得的愈伤组织经过单独的分化过程后再进行增殖壮苗生根，具体是将单独的分化过程获得的丛生芽切下来，分成1～5株一丛，每瓶1～7丛，转入步骤(3)培养基中，将获得的5～10cm高根叶俱全有效苗进行移栽。
8.根据权利要求1所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，步骤(4)将具有3～5片叶子的生根苗，打开瓶盖炼苗2～4d，从培养瓶中取出，分成单株，用流水清洗黏附在根部的培养基后用于移栽；
优选：稻属植物和稗属植物室内水培炼苗2～4d,直接移栽到大田中；芒属植物移至黄土:营养土按照体积比3:1为介质的盆钵中，早期使用有顶玻璃罩保持湿度；狼尾草属植物移至以椰糠：泥炭土：珍珠岩按照体积比3:1:1为介质的有盖移栽容器中，进行室内炼苗，并选择阴天或傍晚时分移栽至大田；
步骤(4)芒属和狼尾草属植物在温度为20～30℃，湿度80～90％的条件下炼苗室生长
20-30d。
9.根据权利要求1-5任一项所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，
配制好的培养基高压灭菌后，均需放置超净工作台上7d，或打开培养皿瓶盖吹4h，再接种外植体；
培养温度为24±2℃，愈伤组织诱导时置于暗培养室培养，愈伤组织分化和增殖壮苗生根时需提供10～12h/d光照，在1000～2000Lux环境中培养。
10.根据权利要求1-5任一项所述的适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，其特征在于，所述的禾本科植物包括：稻属、芒属、狼尾草属和稗属中的一种或多种；稻属植物优选包括旱稻、日本晴、9311，P88S中的一种或多种；芒属植物优选包括芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹中的一种或多种；狼尾草属植物优选包括四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草中的一种或多种；稗属植物优选包括稗草。

说明书全文

一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法

技术领域

[0001] 本发明属于禾本科植物的组培技术领域，具体涉及一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法。

背景技术

[0002] 水稻(Oryza sativa L.)是禾本科稻属(Oryza)植物，是中国最主要的粮食作物之一，保障我国粮食安全和维护社会的稳定要求水稻生产不断稳产和增产。随着人口的增加和水稻生长环境的恶化，如何解决日益增长的水稻总产需求和水稻生产逆境之间的矛盾已是中国21世纪面临的最严重问题之一。因而改进与提高现有水稻品种的抗逆性和品质将成为水稻育种工作者面临的重大课题。因此，水稻遗传改良除坚持常规育种方法外，以转基因育种技术为核心技术的现代生物技术应用于水稻新品种培育已成为现代水稻育种技术发展的一种必然趋势。

[0003] 芒属植物(M iscanthus spp.)为禾本科的多年生高大草本，我国是芒属植物的分布中心，主要有芒(M.sinensis)、五节芒(M.floridulus)、荻(M.sacchariflorus)、南荻(M.lutarioriparia)、尼泊尔芒(M.nepalensis)、双药芒(M.nudipes)、红山茅(M.paniculatus)等七个种。目前，在欧洲和美国对这类植物的研究、开发和利用正进行得如火如荼，倍受瞩目的能源草种有柳枝稷(Panicum virgatum L.)、奇岗(Miscanthus giganteus)、芒类(Miscanthus spp.)、草(Phalaris arundinacea L.)和芦竹(Arundo donax L.)等。因为这类植物具备发展为第二代非粮能源作物的巨人潜力：遗传适应性强、耐低温，植株高、高光效、年产生物量高，碳中和，即在生长期吸收和释放的C02是等量的，纤维素含量高、品质好，在收获期营养回流至根部，种植和管理成本相对较低，适应盐碱、山地、旱地等不宜种植粮食作物的边际土地(marginal land)。纵观能源作物这一新兴的研发领域，欧美发达国家已进入开发与利用的初级阶段，中国也已在资源开发与品种选育上起步。尽管目前中国在产业化应用方面与欧美有一定的差距，但中国有着丰富的资源优势。因此，应抓住机遇，充分利用中国的资源优势，积极推进特异种质资源的发掘和利用，迅速提升中国在能源植物领域的研究水平和创新能力，使中国在全球生物质能源领域的竞争中处于领先地位。

[0004] 三倍体杂交狼尾草(Pennisetum americanum×P.purpureum)和四倍体象草(Pennisetum purpureum Schumach)均属于禾本科狼尾草属(Pennisetum)，是我国热带、亚热带和部分温带地区最重要的2个牧草种。两者具有较高的光合速率，分蘖能力强，根系较发达，鲜草中粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、无氮浸出物和灰分的含量高，营养丰富，是一种优质高产适合饲喂牛、羊、鱼等多种草食动物的优质青饲料，还可作为优质纸浆和人造板原料，还是重要的生物质能源作物。目前，研究人员对其继续进行品种遗传改良工作，以期得到生物产量更高、适应能力强和能源利用品质优良的新品种。

[0005] 稗草(Echinochloa crusgalli)是禾本科稗属(Echinochloa beauv)植物，全球大概有35种，是农业生产中影响最大的杂草之一。稗草适应性强、产量高，营养物质丰富、草质柔嫩，可作为牧草；稗草还具有抗重金属镉、铅、砷的能力。前人通过转录组学技术已筛选出与稗草抗药性相关的众多基因，试图通过克隆筛选出的抗性基因,从分子水平上验证该基因的生理功能。因此,开展稗草的组织培养技术研究是建立良好的稗草基因转化受体系统的基础,同时也是开展稗草抗药性机理研究的有效手段之一,在实际生产应用中同样具有重要的指导意义。

[0006] 由于禾本科植物中不同种属(不同基因型)都能导致其愈伤组织形成和植物再生能力的差异是一种较为普遍的现象。外植体的生理状态对植物愈伤组织形成和植株再生影响很大，取材部位和发育阶段不同，再生率也有差异。除了以上因素外，其它因素如培养基的碳源、维生素、pH值以及培养的温度、光周期、继代时间等也都对植物胚性愈伤组织的形成和变化有一定程度的影响。通过其内源激素含量调整使各种内外因素达到一个最佳的平衡状态，能促使禾本科植物在胚性细胞的形成和再生。因此，进一步加强禾本科植物离体培养下体细胞胚胎发育过程中内源激素代谢和各种激素间相互关系的研究，是十分关键的。

[0007] 本发明针对上述问题，进一步优化禾本科植物组织培养过程，以期建立起一种针对禾本科植物的普适性的组培快繁方法，在高效的工厂化育苗领域有广阔的应用前景。同时，建立起一个稳定高效的再生系统也是实现禾本科植物外源基因转化的先决条件，而良好再生系统的建立主要依赖于植物组织培养技术的改进。因此，本发明为禾本科植物的外源基因转化与再生奠定坚实基础。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种普适性的高效低耗量的针对禾本科植物组织培养技术体系，适用于多种禾本科植物的组培快繁。该方法培养效果佳，稳定性强、愈伤组织诱导时间短，胚性愈伤多，质量好，分化率高，关键是能够在短时间内高效获得大量组培苗，特别适合于工厂化育苗，显著节约时间和成本。

[0009] 本发明的目的是通过以下方式实现的：

[0010] 一种适于多种禾本科植物高效组织培养的方法，包括以下步骤：

[0011] (1)外植体的选择及消毒：选择禾本科植物的幼穗、幼胚、幼嫩花药或成熟胚作为外植体进行消毒处理；

[0012] (2)愈伤组织诱导与分化：外植体消毒后接种在含有MS培养基的大量元素+5倍B5培养基的微量元素+J3培养基中41.8mg/L的FeSO4·7H2O和55.9mg/L的Na2EDTA+B5培养基的有机成分+1.0～6.0mg/L 2,4-D+0.1～1.0mg/L KT+0.1～0.6g/L 水解酪蛋白+0.1～0.6g/L水解乳蛋白+0.2～2.0g/L脯氨酸+0.2～2.0g/L谷氨酰胺+20～30g/L蔗糖+3～10g/L琼脂粉培养基上诱导与分化；不同基因型的不同外植体均能在同一培养基上同步获得愈伤组织和芽，且除幼嫩花药外的外植体诱导率均达到90％以上，最高达到100％；幼穗、幼嫩花药、幼胚、成熟胚培养接种后最快3d左右开始形成愈伤，10d左右陆续形成大量优质愈伤组织，同步分化出绿色芽点并成苗，最快15d左右同步获得愈伤组织和芽，最慢30d左右同步形成愈伤和芽；

[0013] (3)增殖壮苗生根：将步骤(2)获得的2cm左右高的小芽丛接种到MS+6-BA 1.0～4.0mg/L+KT 0.1～1.0mg/L+矮壮素0.1～5.0mg/L+蔗糖20～30.0g/L+琼脂粉3～10g/L固体培养基上进行增殖、壮苗和生根培养；最快培养3d左右，分化芽伸长生长为5～10cm高的健壮苗，同时从基部长出5条以上的根系，最慢20d左右形成根叶俱全的试管苗；培养过程中，增殖倍数控制在5～10以内，防止丛芽数过多过密，从而影响试管苗的质量；

[0014] (4)炼苗移栽。

[0015] 步骤(1)选取不同外植体进行消毒处理的具体过程：

[0016] 幼穗：在孕穗早期，选取禾本科植物材料的幼穗,剥去主茎外层、叶鞘，但保留3-4层苞叶，然后在超净工作台上用0.1％升汞消毒7～15分钟(不经过乙醇表面消毒阶段)，无菌水清洗5～6次，然后取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,剥开苞叶取出幼穗，然后用无菌手术刀片将幼穗切成0.8-1.2cm长的穗段，一簇一簇接种，或者将其分离，单个接种在步骤(2)诱导和分化培养基上培养。

[0017] 幼嫩花药：在孕穗中期，选取禾本科植物生长健壮的幼穗，经检测，取花粉细胞处于单核早期的幼嫩花药，剥去叶鞘和外层苞叶，保留1～2苞叶，在超净工作台上用0.1％升汞消毒7～15分钟(不经过乙醇表面消毒阶段)，无菌水清洗5～6次，然后在灭菌滤纸上小心挤出花药，接种在步骤(2)诱导和分化培养基上培养。

[0018] 幼胚：在灌浆结实初期，选取禾本科植物材料开花后6～15d的幼穗，剥去主茎外层、叶鞘，将穗子剪成小段，在超净工作台上用70％乙醇灭菌30s，再用30％次氯酸钠灭菌20～30min，无菌水清洗5～6次，然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，放于步骤(2)诱导培养基培养。

[0019] 成熟胚(种子)：在成熟期或其它时期，分别挑选禾本科植物健康籽粒剥去颖壳，先用无菌水清洗4～5次，然后用70％乙醇表面灭菌30s，再放入30％次氯酸钠摇床震荡消毒20～30min，无菌水清洗5～6次，于灭菌的滤纸上晾干30～60min，然后接种到步骤(2)诱导和分化培养基上培养。

[0020] 步骤(2)优选使用的培养基：

[0021] MS培养基的大量元素+5倍B5培养基的微量元素+J3培养基中41.8mg/L的FeSO4·7H2O和55.9mg/L的Na2 EDTA+B5培养基的有机成分+3.0～4.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.3～0.5g/L水解酪蛋白+0.3～0.5g/L水解乳蛋白+1.0g/L脯氨酸+0.3～0.5g/L谷氨酰胺+20～30g/L蔗糖+3-10g/L琼脂粉培养基上培养；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选8.5g/L)[0022] 进一步优选：

[0023] MS培养基的大量元素+5倍B5培养基的微量元素+J3培养基中41.8mg/L的FeSO4·7H2O和55.9mg/L的Na2 EDTA+B5培养基的有机成分+3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5g/L水解酪蛋白+0.3g/L水解乳蛋白+1.0g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+20～30g/L蔗糖+3～10g/L琼脂粉培养基上培养；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选8.5g/L)

[0024] 或者进一步优选：

[0025] MS培养基的大量元素+5倍B5培养基的微量元素+J3培养基中41.8mg/L的FeSO4·7H2O和55.9mg/L的Na2 EDTA+B5培养基的有机成分+4.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.3g/L水解酪蛋白+0.5g/L水解乳蛋白+1.0g/L脯氨酸+0.3g/L谷氨酰胺+20～30g/L蔗糖+3～10g/L琼脂粉培养基上培养；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选8.5g/L)

[0026] 步骤(3)优选使用的培养基：

[0027] MS+1.0～1.5mg/L 6-BA+0.4～0.5mg/L KT+1.0～1.5mg/L矮壮素+蔗糖20～30.0g/L+琼脂粉3～10g/L；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选5.5g/L)进一步优选：

[0028] MS+1.0mg/L 6-BA+0.4mg/L KT+1.0mg/L矮壮素+蔗糖20～30.0g/L+琼脂粉3～10g/L；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选5.5g/L)

[0029] 或者进一步优选：

[0030] MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+1.5/L矮壮素+蔗糖20～30.0g/L+琼脂粉3～10g/L。(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选5.5g/L)

[0031] 本发明方法还进行了愈伤组织单独分化的研究，目的一方面是为了进一步探索提升快繁方法的效率；另一方面是为了进行高效的农杆菌介导的转基因体系的构建。而这种经过愈伤组织单独分化的技术路线，特别适合于农杆菌介导转基因体系构建。

[0032] 具体是将前述方法的步骤(2)获得的愈伤组织经过单独的分化过程后再进行增殖壮苗生根，单独的分化过程为：将步骤(2)获得的愈伤组织接在含有N6培养基的大量元素+N6培养基的铁盐+B5培养基的维生素+CuSO4 3.0mg/L+0.1～1.0g/L谷胺酰氨+0.1～1.0g/L脯氨酸+0.1～0.6g/L水解乳蛋白+0.1～4.0mg/L 6-BA+0.1～2.0mg/L NAA+蔗糖20～30.0g/L+山梨醇20.0g/L+琼脂粉3～10g/L培养基上，培养获得再生芽。

[0033] 该分化过程中发现不同基因型愈伤组织分化率达到95％以上，尤其是带绿色芽点的愈伤组织，最快分化成苗仅需3d左右，继续培养同步伸长生长和生根。

[0034] 单独的分化过程使用的培养基优选：N6培养基的大量元素+N6培养基的铁盐+B5培养基的维生素+CuSO4 3.0mg/L+0.5g/L谷胺酰氨+0.5g/L脯氨酸+0.3g/L水解乳蛋+2.0～2.5mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L NAA+蔗糖20～30.0g/L+山梨醇20.0g/L+琼脂粉3～10g/L培养基上培养；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选8.5g/L)。

[0035] 进一步优选：N6培养基的大量元素+N6培养基的铁盐+B5培养基的维生素+CuSO4 3.0mg/L+0.5g/L谷胺酰氨+0.5g/L脯氨酸+0.3g/L水解乳蛋白+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖20.0～30.0g/L+山梨醇20.0g/L+琼脂粉3～10g/L培养基上培养；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选8.5g/L)。

[0036] 或者进一步优选：

[0037] N6培养基的大量元素+N6培养基的铁盐+B5培养基的维生素+CuSO4 3.0mg/L+0.5g/L谷胺酰氨+0.5g/L脯氨酸+0.3g/L水解乳蛋白+2.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+蔗糖20.0～30.0g/L+山梨醇20.0g/L+琼脂粉3～10g/L培养基上培养；(蔗糖优选30g/L，琼脂粉优选
8.5g/L)。

[0038] 将步骤(2)获得的20d以内的愈伤组织进行农杆菌介导转基因，经过单独的分化过程后再进行增殖壮苗生根。

[0039] 农杆菌介导转基因以及单独的分化过程：

[0040] 1)农杆菌介导转化：将步骤(2)的愈伤组织转移到菌液中浸泡，转移到共培养基，共培养基为步骤(2)的诱导培养基+As(乙酰丁香酮)，暗培养；

[0041] 2)筛选培养：共培养后，将愈伤组织用抗生素浸泡，然后转移到抗生素筛选培养基中暗培养筛选，获得优质颗粒状抗性愈伤组织，所述的抗生素筛选培养基为步骤(2)的诱导培养基+抗生素；

[0042] 3)转基因抗性愈伤分化培养：将抗生素筛选培养基中长出的抗性愈伤，转移到含抗生素的分化培养基中培养，分化出幼苗，所述的含抗生素的分化培养基为前述的单独的分化过程使用的培养基+抗生素。

[0043] 农杆菌介导转基因以及单独的分化过程进一步详细的优选过程如下：

[0044] A,农杆菌介导转化：挑选培养表面干爽结构致密的愈伤组织，于灭菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移到菌液中浸泡30min，摇床震荡；用灭菌滤纸吸干水分，稍稍吹干转移到共培养基(步骤(2)优化诱导培养基+As 0.1mM)其上放一张灭菌滤纸，保证愈伤充分与滤纸接触，在24～26℃条件下，暗培养3天；

[0045] B,筛选培养：共培养3d后，将愈伤转入灭过菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L(或400mg/L)头胞和400mg/L(或500mg/L)羧苄青霉素的灭菌水浸泡30min，摇床震荡；用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白，是抑制农杆菌关键的步骤；然后转移到筛选培养基(筛选培养基是步骤(2)诱导培养基+500mg/L(或400mg/L)头胞+400mg/L(或500mg/L)羧苄青霉素+50mg/L潮霉素)中上暗培养，20天左右将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中，不需要进行分离这样能减少对抗性愈伤的伤害；第二次筛选培养20d左右，获得0.5cm左右大小的颗粒状抗性愈伤；

[0046] C,转基因抗性愈伤分化培养：经过两次筛选后，将筛选培养基中长出的抗性愈伤，整体转移到单独的分化培养基(单独的分化培养基+500mg/L(或400mg/L)头胞+400mg/L(或500mg/L)羧苄青霉素)中培养20d左右，分化出幼苗，继续培养一段时间，待幼苗长成5cm左右高时，基部同步诱导出5条以上的根系。

[0047] 上述方法中，步骤(2)将步骤(1)消毒处理好的外植体接种在步骤(2)使用的培养基上，每个培养瓶外植体个数为10～50个，愈伤组织诱导分化出丛生芽时，直接转入到步骤(3)使用的培养基中进行增殖壮苗生根培养获得大量根叶俱全有效苗。

[0048] 或者将步骤(2)获得的0.5～1cm大小的愈伤组织，经过单独的分化过程后再进行增殖壮苗生根，具体是将单独的分化过程获得的丛生芽切下来，分成1～5株一丛，每瓶1～7丛，转入步骤(3)培养基中，将获得的5～10cm高根叶俱全有效苗进行移栽。

[0049] 本发明步骤(4)：将具有3～5片叶子的生根苗，打开瓶盖炼苗2～4d，从培养瓶中取出，分成单株，用流水清洗黏附在根部的培养基后用于移栽，移栽成活率达到95％以上。

[0050] 具体是将稻属植物和稗属植物室内水培炼苗2～4d,直接移栽到大田中；芒属植物移至黄土:营养土按照体积比3:1为介质的盆钵中，早期使用有顶玻璃罩保持湿度；狼尾草属植物移至以椰糠：泥炭土：珍珠岩按照体积比3:1:1为介质的有盖移栽容器中，进行室内炼苗，并选择阴天或傍晚时分移栽至大田；

[0051] 步骤(4)芒属和狼尾草属移栽苗在温度为20～30℃，湿度80～90％的条件下炼苗室炼苗，20-30d长出新根即已成活，然后移栽到大田自然生长。

[0052] 上述方法中配制好的培养基高压灭菌后，需放置超净工作台上7d，或打开培养皿瓶盖吹4h，再接种外植体；

[0053] 上述方法中培养温度24～26℃，愈伤组织诱导置于暗培养室培养，愈伤组织分化和增殖壮苗生根时需提供10～12h/d光照，光强1000～2000lux。

[0054] 本发明所述的禾本科植物包括：稻属、芒属、狼尾草属和稗属中的一种或多种；稻属植物优选包括旱稻、日本晴、9311，P88S中的一种或多种；芒属植物优选包括芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹中的一种或多种；狼尾草属植物优选包括四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草中的一种或多种；稗属植物优选包括稗草。

[0055] 本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0056] 1、本发明的方法适用于稻属植物、芒属植物、狼尾草属植物、稗属植物等多种禾本科植物建立稳定高效的再生系统，而且不同基因型的不同外植体均能在同一培养基上形成愈伤组织；不同时期还能选择不同外植体进行培养，孕穗早期幼穗为最佳外植体，孕穗中期幼嫩花药为最佳外植体，灌浆结实初期幼胚为最佳外植体，成熟期及其它时间成熟胚为最佳外植体，为禾本科植物快速繁殖提供更有效的方法。

[0057] 2、本发明方法从外界取回的外植体无需进行特殊处理，只要进行常规消毒处理，尤其是幼穗和花药无需乙醇进行表面消毒，污染率均能控制在10％以内，而且幼穗和花药包裹多层苞叶灭菌，能保护其完整不受损，幼穗剥开呈乳白色，花药呈淡黄绿色，利于愈伤组织形成；该两种外植体不仅培养时间短，诱变率高，而且愈伤组织质量好，特别是一簇幼穗接种，接种方法简单，培养时间短，出愈速度快，愈伤数量比单个幼穗接种多2～5倍。

[0058] 3、本发明针对禾本科植物中不同种属(不同基因型)能导致其愈伤组织形成和植物再生能力差异的问题，开展了外植体-愈伤诱导分化同步-增殖壮苗生根同步-完整植株这一技术路线，从外植体诱导产生愈伤、芽、根的完整植株只需15～40天，普适性强，该方法特别适合于大规模工厂化育苗，实用性好；还开展了外植体-愈伤诱导-愈伤分化-增殖壮苗生根-完整植株这一技术路线，从外植体诱导产生愈伤、芽、根的完整植株只需30～60天，该方法特别适合建立禾本科植物基因转化受体系统，在实际生产应用中同样具有重要的指导意义。

[0059] 4、本发明方法不仅适于禾本科植物中旱稻、日本晴、9311，P88S、芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹，稗草等二倍体植物再生体系建立，还适于四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草等多倍体植物的再生体系建立。

[0060] 5、本发明方法禾本科植物中不同种属(不同基因型)，不同外植体在相同培养基上培养，均能获得高频率的愈伤组织形成，获得的不同颜色类型的愈伤组织，质量不受影响，诱导率和分化率均达到了90％和95％以上，还能同步诱导愈伤和芽，或芽和根；在相同增殖壮苗生根培养基培养，不同基因型材料均在短期内获得了根叶俱全的健壮试管苗，不仅增殖率高，且移栽成活率也高。本发明为禾本科植物的高效工厂化育苗提供了一种普适性的非常有前景的方法。

[0061] 6、本发明方法获得的高质量愈伤组织，用于农杆菌浸染后，恢复时间短，外源基因转化获得抗性愈伤多，分化率高，移栽成活率高，而且适合禾本科植物中不同种属(不同基因型)材料建立农杆菌介导转基因体系，为禾本科植物外源基因转化新品种改良提供更有效的方法。附图说明

[0062] 图1为五节芒幼穗经乙醇灭菌对照培养基上生长情况；

[0063] 图2为五节芒幼穗经乙醇灭菌优化培养基上愈伤生长情况；

[0064] 图3为五节芒幼穗不经乙醇灭菌对照培养基愈伤生长情况；

[0065] 图4为五节芒幼穗不经乙醇灭菌优化培养基愈伤生长情况；

[0066] 图5为芒单个幼穗培养18d的愈伤组织生长情况；

[0067] 图6为荻单个幼穗培养18d的愈伤组织生长情况；

[0068] 图7为芒一簇幼穗培养18d的愈伤组织生长情况；

[0069] 图8为芒一簇幼穗获得的愈伤组织分开后的情况；

[0070] 图9为水稻9311幼穗愈伤组织生长情况；

[0071] 图10为芒幼穗愈伤组织生长情况；

[0072] 图11为柳枝稷幼穗愈伤组织生长情况；

[0073] 图12为四倍体象草幼穗愈伤组织生长情况；

[0074] 图13为芒对照培养基花药愈伤组织生长情况；

[0075] 图14为芒优化培养基花药愈伤组织生长情况；

[0076] 图15为芦竹对照培养基花药愈伤组织生长情况；

[0077] 图16为芦竹优化培养基花药愈伤组织生长情况；

[0078] 图17为柳枝稷对照培养基花药愈伤组织生长情况；

[0079] 图18为柳枝稷优化培养基花药愈伤组织生长情况；

[0080] 图19为水稻9311对照培养基花药愈伤组织生长情况；

[0081] 图20为水稻9311优化培养基花药愈伤组织生长情况；

[0082] 图21为水稻旱稻优化培养基幼胚愈伤组织生长情况；

[0083] 图22为水稻9311优化培养基幼胚愈伤组织生长情况；

[0084] 图23为芒对照培养基种子愈伤组织生长情况；

[0085] 图24为芒优化培养基种子愈伤组织生长情况；

[0086] 图25为水稻9311优化培养基种子愈伤组织生长情况；

[0087] 图26为稗草优化培养基种子愈伤组织生长情况；

[0088] 图27为四倍体象草优化培养基种子愈伤组织生长情况；

[0089] 图28为三倍体狼尾草优化培养基种子愈伤组织生长情况；

[0090] 图29为荻幼穗愈伤组织同步分化生长情况；

[0091] 图30为芦竹花药愈伤组织同步分化生长情况；

[0092] 图31为荻幼穗愈伤组织同步分化苗和根的生长情况；

[0093] 图32为六倍体狼尾草种子愈伤组织同步分化苗和根生长情况；

[0094] 图33为芒幼穗颗粒状愈伤组织刚转入分化培养基上生长情况；

[0095] 图34为芒幼穗愈伤组织分化培养3d左右分化苗生长情况；

[0096] 图35为芒幼穗愈伤组织分化培养10d左右分化苗生长情况；

[0097] 图36为芒幼穗愈伤组织分化培养15d左右同步生根情况；

[0098] 图37为六倍体狼尾草对照培养基分化情况；

[0099] 图38为六倍体狼尾草优化培养基分化情况；

[0100] 图39为芒大量增殖苗生长情况；

[0101] 图40为芒根叶俱全增殖苗生长情况；

[0102] 图41为水稻9311健壮生根苗生长情况；

[0103] 图42为水稻9311健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0104] 图43为稗草健壮生根苗生长情况；

[0105] 图44为稗草生根苗移栽大田生长情况；

[0106] 图45为芒健壮生根苗生长情况；

[0107] 图46为芒健壮生根苗移栽炼苗室生长情况；

[0108] 图47为芒健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0109] 图48为荻健壮生根苗生长情况；

[0110] 图49为荻健壮生根苗移栽炼苗室生长情况；

[0111] 图50为荻健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0112] 图51为奇岗健壮生根苗生长情况；

[0113] 图52为奇岗健壮生根苗移栽炼苗室生长情况；

[0114] 图53为奇岗健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0115] 图54为芦竹健壮生根苗生长情况；

[0116] 图55为芦竹健壮生根苗移栽炼苗室生长情况；

[0117] 图56为芦竹健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0118] 图57为柳枝稷健壮生根苗生长情况；

[0119] 图58为柳枝稷健壮生根苗移栽炼苗室生长情况；

[0120] 图59为柳枝稷健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0121] 图60为四倍体象草健壮生根苗生长情况；

[0122] 图61为四倍体象草健壮生根苗移栽炼苗室生长情况；

[0123] 图62为四倍体象草健壮生根苗移栽大田生长情况；

[0124] 图63为三倍体狼尾草健壮生根苗生长情况；

[0125] 图64为六倍体狼尾草健壮生根苗生长情况；

[0126] 图65为狼尾草组培苗炼苗生长情况(左为三倍体杂交狼尾草，右为六倍体杂交狼尾草)；

[0127] 图66为三倍体狼尾草大田生长情况；

[0128] 图67为六倍体狼尾草大田生长情况；

[0129] 图68为六倍体杂交狼尾草开花成苗生长情况；

[0130] 图69为水稻9311转化培养3d左右愈伤组织生长情况；

[0131] 图70为水稻9311筛选培养第一代的抗性愈伤生长情况；

[0132] 图71为水稻9311筛选培养第二代的抗性愈伤生长情况；

[0133] 图72为水稻9311筛选培养褐化死亡的愈伤组织生长情况；

[0134] 图73为水稻9311抗性愈伤优化培养基分化情况；

[0135] 图74为水稻9311抗性愈伤优化培养基分化苗生根情况；

[0136] 图75为水稻9311抗性愈伤对照培养基分化情况；

[0137] 图76为水稻9311抗性愈伤分化苗移栽苗生长情况；

[0138] 图77为旱稻幼穗愈伤生长情况；

[0139] 图78为日本晴幼穗愈伤生长情况；

[0140] 图79为P88S幼穗愈伤生长情况；

[0141] 图80为奇岗幼穗愈伤生长情况；

[0142] 图81为芦竹幼穗愈伤生长情况；

[0143] 图82为南荻幼穗愈伤生长情况；

[0144] 图83为荻幼穗愈伤生长情况；

[0145] 图84为三倍体杂交狼尾草幼穗愈伤生长情况；

[0146] 图85为六倍体杂交狼尾草幼穗愈伤生长情况；

[0147] 图86为南荻种子愈伤生长情况；

[0148] 图87为芦竹种子愈伤生长情况；

[0149] 图88为旱稻种子愈伤人工分化生长情况；

[0150] 图89为P88S种子愈伤人工分化生长情况；

[0151] 图90为日本晴种子愈伤人工分化生长情况；

[0152] 图91为奇岗种子愈伤人工分化生长情况；

[0153] 图92为五节芒种子愈伤人工分化生长情况；

[0154] 图93为南荻种子愈伤人工分化生长情况；

[0155] 图94为荻种子愈伤人工分化生长情况；

[0156] 图95为六倍体杂交狼尾草种子愈伤人工分化生长情况。

具体实施方式

[0157] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0158] 实施例1、适于多种禾本科植物高效组织培养的方法

[0159] 一、培养基配制和灭菌

[0160] 愈伤组织诱导同步分化优化培养基：MS大量+5倍B5微量+J3的FeSO4·7H2O(41.8mg/L)和Na2-EDTA(55.9mg/L)+B5有机+2,4-D(3.0mg/L)+KT(0.5mg/L)+水解酪蛋白(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+脯氨酸(1.0g/L)+谷氨酰胺(0.5g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8.5g/L)。

[0161] 愈伤组织分化优化培养基：N6大量+CuSO4(3.0mg/L)+N6铁盐+B5维生素+谷胺酰氨(0.5g/L)+脯氨酸(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+6BA(2.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)+蔗糖(30.0g/L)+山梨醇(20.0g/L)+琼脂粉(8.5g/L)。

[0162] 增殖壮苗生根优化培养基：MS+6-BA(1.0mg/L)+KT(0.4mg/L)+矮壮素(1.0mg/L)+蔗糖(30.0g/L)+琼脂粉(5.5g/L)。

[0163] 农杆菌介导转基因：

[0164] 共培养优化培养基：MS大量+5倍B5微量+J3的FeSO4·7H2O 41.8mg/L和Na2-EDTA 55.9mg/L+B5有机+2,4-D(3.0mg/L)+KT(0.5mg/L)+水解酪蛋白(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+脯氨酸(1.0g/L)+谷氨酰胺(0.5g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8.5g/L)+As 0.1mM；

[0165] 筛选培养优化培养基：MS大量+5倍B5微量+J3的FeSO4·7H2O 41.8mg/L和Na2-EDTA 55.9mg/L+B5有机+2,4-D(3.0mg/L)+KT(0.5mg/L)+水解酪蛋白(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+脯氨酸(1.0g/L)+谷氨酰胺(0.5g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8.5g/L)+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素；

[0166] 转基因抗性愈伤分化生根优化培养基：N6大量+CuSO4(3.0mg/L)+N6铁盐+B5维生素+谷胺酰氨(0.5g/L)+脯氨酸(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+6BA(2.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)+蔗糖(30.0g/L)+山梨醇(20.0g/L)+琼脂粉(8.5g/L)+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素。

[0167] 以上培养基121℃下，灭菌20分钟，放置超净工作台7d左右，或打开培养皿瓶盖吹4h左右。

[0168] 二、材料与方法

[0169] (1)愈伤组织同步诱导与分化

[0170] 在孕穗早期，选取旱稻、日本晴、9311，P88S、芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹、四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草、稗草等植物的幼穗，剪取茎秆上端,保留多层苞叶，以防幼穗外露，然后在超净工作台上直接用0.1％升汞消毒7～15分钟(对照先用70％乙醇表面灭菌30s左右，再用0.1％升汞消毒7～15分钟)，然后用无菌水清洗5～6次备用。将灭菌后外植体取出放置无菌滤纸上，吸干表面水分，用无菌手术刀片切开苞叶取出幼穗，切成1cm左右长的穗段，接种在愈伤组织诱导同步分化优化和对照诱导培养基上(对照培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉培养基)。每个培养皿或培养瓶外植体个数为20～50个。

[0171] 结果如下：

[0172] 不同灭菌方法和不同培养基培养：①幼穗经过乙醇表面灭菌阶段，接种在对照或优化后诱导同步分化培养基上培养，对照培养基上的幼穗褐化率均达到100％，而且愈伤诱导率在10％以下；在优化的诱导同步分化培养基上的幼穗同样会褐化，但是仍然获得愈伤诱导率高于50％；以五节芒为例，幼穗经过乙醇表面灭菌在对照培养基上生长情况如图1所示，幼穗经过乙醇表面灭菌在优化诱导同步分化培养基上愈伤生长情况如图2所示。②幼穗不经过乙醇表面灭菌阶段，接种在对照或优化后诱导同步分化培养基上培养，培养过程中幼穗不受任何损伤，幼穗褐化率明显降低，尤其在优化诱导同步分化培养基上始终保持鲜嫩状态，愈伤诱导率达到90％以上，效果明显优于对照培养基；以五节芒为例，幼穗不经过乙醇表面灭菌阶段在对照培养基愈伤生长情况如图3所示，幼穗不经过乙醇表面灭菌优化诱导同步分化培养基愈伤生长情况如图4所示。

[0173] 不同分切方法：①不经过乙醇表面灭菌的幼穗，用无菌手术刀在无菌滤纸上分成2～3段/个，然后用镊子分成单个接种，一个幼穗分开需花15～20min，接种5～6个培养瓶或培养皿；培养10d左右，从幼穗切口开始形成愈伤，培养18d左右形成0.5～1.0cm淡黄色颗粒状愈伤组织，逐渐同步分化绿色芽点并成苗，直观效果佳，愈伤组织数目一目了然，且外植体诱导率均达到90％以上，每瓶获得愈伤组织数为10～30粒；以芒为例，单个幼穗培养18d左右的愈伤组织生长情况如图5所示，以荻为例，单个幼穗培养18d左右的愈伤组织生长情况如图6所示。②幼穗分成2-3段/簇，直接接种在诱导培养基上，然后用镊子从中间摊开，充分与培养基接触，一个幼穗接种仅花费2min左右，接种1个培养瓶或培养皿；培养7d左右，开始从切口处形成愈伤，逐渐增殖出大量愈伤组织，逐渐同步分化绿色芽点并成苗，且外植体诱导率均达到100％，每瓶获得愈伤组织数达到50～80粒，培养效率明显优于单个幼穗培养；但是该方法愈伤在原培养基时间不宜超过30d，时间过长，愈伤数目过多，挤压在中间的愈伤生长不良，从而影响分化率。以芒为例，一簇幼穗培养18d左右的愈伤组织生长情况如图7所示，一簇幼穗诱导的愈伤组织分开后的情况如图8所示。

[0174] 不同基因型愈伤组织颜色差异：相同诱导培养基，不同基因型愈伤组织质量和诱导频率差异并不显著，但是愈伤组织颜色差异显著。如旱稻、日本晴、9311，P88S、芒、五节芒、奇岗、芦竹等基因型愈伤组织呈淡黄色颗粒状，以水稻9311和芒为例，幼穗愈伤组织生长情况如图9和图10所示；荻、南荻、柳枝稷等基因型愈伤组织呈浅紫色颗粒状，以柳枝稷为例，幼穗愈伤组织生长情况如图11所示；四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草等基因型愈伤组织呈淡黄绿色颗粒状，以四倍体象草为例，幼穗愈伤组织生长情况如图12所示。

[0175] 2、在孕穗早中期，选取旱稻、日本晴、9311，P88S、芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹、四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草、稗草等植物生长健壮的幼穗，镜检取花粉细胞处于单核早期的幼嫩花药，剥去叶鞘和外层苞叶，保留1～2层苞叶，然后在超净工作台上用0.1％升汞消毒7～15分钟(外植体不经过乙醇表面灭菌阶段)，无菌水清洗5～6次备用。取出幼穗吸干表面水分,然后在灭菌滤纸上小心挤出花药，置于诱导同步分化培养基上(对照培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉培养基)。每个培养皿接种外植体个数为20～50个。培养10d左右，在优化诱导同步分化培养基上幼嫩花药开始形成愈伤，继续培养长成0.5～1cm大小的愈伤组织块，逐渐同步分化绿色芽点并成苗，且诱导率均在60％以上(花药培养诱导率一般在30％以下)，尤其芦竹花药愈伤诱导率达到90％以上，最高达到100％；在对照培养基中培养，至少需要30d左右花药才能极少数愈伤组织，诱导率低于10％，甚至为O。以芒为例，对照培养基花药愈伤组织生长情况如图13所示，优化诱导同步分化培养基花药愈伤组织生长情况如图14所示；以芦竹为例，对照培养基花药愈伤组织生长情况如图15所示，优化诱导同步分化培养基花药愈伤组织生长情况如图16所示；以柳枝稷为例，对照培养基花药愈伤组织生长情况如图17所示，优化诱导同步分化培养基花药愈伤组织生长情况如图18所示；以水稻9311为例，对照培养基花药愈伤组织生长情况如图19所示，优化诱导同步分化培养基花药愈伤组织生长情况如图20所示。

[0176] 3、在灌浆结实初期，选取旱稻、日本晴、9311，P88S等不同基因型开花后6-15d带壳的幼胚，用30％次氯酸钠灭菌20～30min，无菌水清洗5～6次备用。接种前，取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，置于优化诱导同步分化培养基上培养；每个培养皿外植体个数为20～50个，培养3d左右，从幼胚萌芽逐渐形成愈伤，继续培养长成0.5～1cm大小的愈伤组织块，逐渐同步分化绿色芽点并成苗，且愈伤组织诱导率均达到90％以上，最高达到100％；以水稻旱稻为例，优化诱导同步分化培养基幼胚愈伤组织生长情况如图21所示；以水稻9311为例，优化诱导同步分化培养基幼胚愈伤组织生长情况如图22所示。

[0177] 4、在植物生长后期或其它时间，选取旱稻、日本晴、9311，P88S、芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹、四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草、稗草等基因型籽粒饱满的成熟胚(即种子)为外植体，首先剥去种皮，用无菌水清洗4～5次，然后用70％乙醇灭菌30s，再用30％次氯酸钠灭菌20～30min，无菌水清洗5～6次，然后取出放置在无菌滤纸上，吸干外植体表面水分,并在超净工作台上吹30～60min，种子干燥不粘在一起时，再接种在优化诱导同步分化和对照诱导培养基上(对照培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+
30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉培养基)。每个培养皿接种外植体个数为20～50个，优化诱导同步分化培养基培养7d左右，种子萌发的同时形成愈伤，继续培养长成0.5～1cm大小的愈伤组织块，同步分化绿色芽点并成苗，且诱导率达到90％以上，最高达到100％；；但是在对照培养基上，种子萌发率高，但基部形成愈伤的数量很少。芒属植物以芒为例，对照培养基种子愈伤生长情况如图23所示，优化诱导同步分化培养基种子愈伤组织生长情况如图24所示；稻属植物以水稻9311为例，优化诱导同步分化培养基种子愈伤组织生长情况如图25所示；稗属植物以稗草为例，优化诱导同步分化培养基愈伤组织生长情况如图26所示；狼尾草属植物以四倍体象草为例，优化诱导同步分化培养基种子愈伤组织生长情况如图27所示；狼尾草属植物以三倍体狼尾草为例，优化诱导同步分化培养基种子愈伤组织生长情况如图28所示。

[0178] 三、分化培养

[0179] 同步分化：步骤二不同外植体获得的愈伤组织继续在优化诱导和分化培养基上，愈伤组织同步分化大量芽点并成苗，培养时间长，不仅能分化成苗且长出根系，但是整齐度不够，此方法适于快速繁殖。以荻幼穗培养为例，愈伤组织同步分化生长情况如图29所示；以芦竹花药培养为例，愈伤组织同步分化生长情况如图30所示；以荻幼穗培养为例，愈伤组织同步分化苗和根的生长情况如图31所示；以六倍体狼尾草种子培养为例，愈伤组织同步分化苗和根的生长情况如图32所示。

[0180] 人工分化：挑选表面干爽结构致密的未分化愈伤组织或刚分化绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基，每瓶接种20～50个，培养3～20d，愈伤组织表面分化大量绿色芽点且成苗，逐渐长成5～10cm高的小苗，尤其是带绿色芽点的愈伤分化率高，分化时间最快为3d左右，且同步形成大量根系。不同基因型，不同外植体获得的愈伤组织分化率均能达到95％以上，甚至达到100％，均能同步形成根叶俱全的试管苗；愈伤组织在对照培养基上培养，愈伤组织逐渐褐化死亡，导致分化效率低。以芒为例，幼穗颗粒状愈伤组织刚转入分化培养基上的生长情况如图33所示，分化培养3d左右愈伤组织分化苗生长情况如图34所示，分化培养10d分化苗生长情况如图35所示，分化培养15d左右同步生根情况如图36所示；以六倍体狼尾草为例，对照培养基分化情况如图37所示，优化培养基分化情况如图38所示。

[0181] 四、增殖壮苗生根及移栽

[0182] 将步骤三获得的1～5cm高的丛生芽切下来，分成1～5株一丛，每瓶1～7丛，转入增殖壮苗生根培养基中，培养10d左右，从基部诱导少量丛生芽，增殖系数一般控制在5～10以内，如果增殖系数超过10以上，能获得大量增殖苗，适合大规模增殖，但是苗数量过多，质量就变差，且不能同步形成根系，从而影响有效苗的形成；以芒为例，大量增殖苗生长情况如图39所示。那么，严格控制增殖系数，促进增殖芽同步伸长和壮苗，逐渐长成5～10cm高的健壮苗，随后从基部长出5条以上根系，甚至达到20条；以芒为例，根叶俱全增殖苗生长情况如图40所示。选择具有3～5片叶子的生根苗，打开瓶盖炼苗2～4d，从培养瓶中取出，分成单株，用流水清洗黏附在根部的培养基备用。具体情况如下：

[0183] 1、稻属植物和稗属植物增殖苗生长速度快，15d以内形成根叶俱全健壮苗，且根系发达。然后选择健壮且根系发达的苗，清洗干净根部培养基，水培3d左右，再移栽水田中，培养15d左右，长出新叶新根，即已成活，成活率达到95％以上；稻属植物中，水稻9311生长情况如图41-42所示；稗属植物中，稗草生长情况如图43-44所示。

[0184] 2、芒属植物增殖苗生长速度较快，18d以内形成根叶俱全健壮苗，且根系发达，然后移入装有基质的盆钵(黄土:营养土＝3:1,v/v)中，早期使用有顶玻璃罩保持湿度。室内培养20～30d左右，待新叶长出，新根形成即已成活，成活率达95％以上，且生长旺盛。选择阴天或傍晚时分移栽至大田，带基质移栽根系不会受到伤害，种植后立即浇定根水，成活率达95％以上。大田种植中根系从原来容器狭小的空间中解脱出来，有利于对养分的吸收，生长迅速，顶端优势十分明显，苗长势整齐一致，株形美观挺拔，植株高大，平均生长高度达1m以上。芒属植物中，芒生长情况如图45-47所示；荻生长情况如图48-50所示；奇岗生长情况如图51-53所示；芦竹生长情况如图54-56所示；柳枝稷生长情况如图57-59所示。

[0185] 3、狼尾草属植物增殖苗生长速度较快，18d以内形成根叶俱全健壮苗，且根系发达，然后移入装有基质的有盖移栽容器(以椰糠：泥炭土：河沙＝3:1:1，v/v)中，进行室内炼苗10d左右恢复生长，20d左右长出新叶新根成活；选择阴天或傍晚时分移栽至大田，7d左右恢复生长，成活率达95％以上。大田种植中根系从原来容器狭小的空间中解脱出来，有利于对养分的吸收，生长迅速，顶端优势十分明显，苗长势整齐一致，株形美观挺拔，植株高大，平均生长高度达2m以上，尤其是六倍体狼尾草优势更明显，株高达到4米以上。四倍体象草生长情况如图60-62所示；三倍体与六倍体狼尾草的主要形态特征比较如63-68所示。

[0186] 小结：本发明方法选择稻属中的旱稻、日本晴、9311，P88S为代表植物，芒属中的芒、五节芒、荻、南荻、柳枝稷、奇岗、芦竹为代表植物，狼尾草属中的四倍体象草、三倍体和六倍体杂交狼尾草为代表植物，稗属植物中的稗草为代表植物，针对禾本科植物中不同种属，(不同基因型)都能导致其愈伤组织形成和植物再生能力的差异问题，以及外植体的生理状态对植物愈伤组织形成和植株再生影响很大，还有取材部位和发育阶段不同，再生率也有差异。开展了一系列研究，结果表明，不同基因型的不同外植体均能在同一培养基上培养,同步获得愈伤组织和芽，且能同步形成根系；幼穗、幼嫩花药、幼胚、成熟胚培养接种后最快3d左右开始形成愈伤，继续10d左右陆续形成大量优质愈伤组织，同步分化出绿色芽点且分化成苗；不同基因型的不同外植体诱导最快15d左右，最慢30d左右同步形成愈伤和芽。该发明方法，进一步优化了禾本科植物组织培养方法，建立了一套适合于禾本科植物不同种属植物的组培高效的工厂化育苗方法。

[0187] 五、农杆菌介导转基因

[0188] (1)转化培养：挑选表面干爽结构致密的愈伤组织，于灭菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移到菌液中浸泡30min，摇床震荡；用灭菌滤纸吸干水分，稍稍吹干转移到共培养基(愈伤诱导培养基+As 0.1mM)其上放一张灭菌滤纸，保证愈伤充分与滤纸接触，在24～26℃条件下，暗培养3天备用；以水稻9311为例，转化培养3d左右愈伤组织生长情况如图69所示。

[0189] (2)筛选培养：将共培养3d的愈伤转入灭过菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞和400mg/L羧苄青霉素的灭菌水浸泡30min，摇床震荡；用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白，是抑制农杆菌关键的步骤；然后转移到筛选培养基中培养，20天后将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中，不需要进行分离这样能减少对抗性愈伤的伤害；若操作不当，或愈伤组织质量差，或培养基不适合，都很难获得抗性愈伤组织，导致其褐化死亡；以水稻9311为例，筛选培养第一代的抗性愈伤生长情况如图70所示，筛选培养第二代抗性愈伤生长情况如图71所示，褐化死亡的愈伤组织生长情况如图72所示。

[0190] (3)转基因抗性愈伤分化培养：经过两次筛选后，将筛选培养基中长出的0.5cm左右大小抗性愈伤整体转移到转基因分化培养基中(对照培养基为MS+6BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30.0g/L+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)，优化培养基培养分化培养20d左右分化成苗，基部同步诱导出5条以上的根系；转基因抗性愈伤分化培养是农杆菌介导转基因最大瓶颈。对照培养基虽成功获得了抗性愈伤，培养过程中大部分抗性愈伤组织只是不断形成新的愈伤，难以分化成苗；以水稻9311为例，抗性愈伤优化培养基分化情况如图73所示，生根苗生长情况如图74所示，抗性愈伤对照培养基分化情况如图75所示。然后将生根苗移入以稻田土为介质的移栽容器中，进行室内炼苗7d左右恢复生长，15d左右长出新叶新根成活，成活率在95％以上；以水稻9311为例，移栽苗生长情况如图76所示。

[0191] 上述培养温度24～26℃，转化和筛选置于暗培养室培养，胚性愈伤分化和生根时需提供10～12h/d光照，光强1000～1500lux。

[0192] 本发明所提供的禾本科植物组织培养繁殖方法，根据禾本科植物不同品种的特性，不同时期选择最适宜的外植体，如幼穗、幼胚、幼嫩花药和成熟胚，取材容易，数量大，遗传稳定性高，生长良好，优势互补。初代培养不仅愈伤组织质量高，且诱导率高，继续培养还能同步分化和生根；分化培养，分化时间短，且分化率高，继续培养还能同步生根；增殖壮苗生根采用多步合一的培养方法，在培养过程中，降低生长素和分裂素浓度，控制增殖系数过大，降低无效苗的形成；同时添加矮壮素成分促进其壮苗与生根。培养短期高质量愈伤组织，用于农杆菌介导转基因，获得抗性愈伤多，转基因苗多。本发明方法不仅简化了健康种苗生产程序，而且节约了培养室空间，降低了生产成本，提高了生产效率。本发明技术已成功应用到稻属植物、芒属植物、狼尾草属植物、稗属植物等多种禾本科植物建立稳定高效的再生系统和基因转化受体系统，且获得非常好的应用效果。

[0193] 实施例2、适于多种禾本科植物高效组织培养的方法

[0194] 一、培养基配制和灭菌

[0195] 愈伤组织诱导同步分化优化培养基：MS大量+5倍B5微量+J3的FeSO4·7H2O 41.8mg/L和Na2-EDTA 55.9mg/L+B5有机+2,4-D(4.0mg/L)+KT(0.5mg/L)+水解酪蛋白(0.3g/L)+水解乳蛋白(0.5g/L)+脯氨酸(1.0g/L)+谷氨酰胺(0.3g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8.5g/L)；

[0196] 愈伤组织分化优化培养基：N6大量+CuSO4(3.0mg/L)+N6铁盐+B5维生素+谷胺酰氨(0.5g/L)+脯氨酸(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+6BA(2.5mg/L)+NAA(1.0mg/L)+蔗糖(30.0g/L)+山梨醇(20.0g/L)+琼脂粉(8.5g/L)；

[0197] 增殖壮苗优化生根培养基：MS+6-BA(1.5mg/L)+KT(0.5mg/L)+矮壮素(1.5mg/L)+蔗糖(30.0g/L)+琼脂粉(5.5g/L)。

[0198] 2、农杆菌介导转基因

[0199] 共培养优化培养基：MS大量+5倍B5微量+J3的FeSO4·7H2O 41.8mg/L和Na2-EDTA 55.9mg/L+B5有机+2,4-D(4.0mg/L)+KT(0.5mg/L)+水解酪蛋白(0.3g/L)+水解乳蛋白(0.5g/L)+脯氨酸(1.0g/L)+谷氨酰胺(0.3g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8.5g/L)+As 0.1mM；

[0200] 筛选优化培养基：MS大量+5倍B5微量+J3的FeSO4·7H2O 41.8mg/L和Na2-EDTA 55.9mg/L+B5有机+2,4-D(4.0mg/L)+KT(0.5mg/L)+水解酪蛋白(0.3g/L)+水解乳蛋白(0.5g/L)+脯氨酸(1.0g/L)+谷氨酰胺(0.3g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8.5g/L)+400mg/L头胞+500mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素；

[0201] 转基因抗性愈伤分化生根优化培养基：N6大量+CuSO4(3.0mg/L)+N6铁盐+B5维生素+谷胺酰氨(0.5g/L)+脯氨酸(0.5g/L)+水解乳蛋白(0.3g/L)+6BA(2.5mg/L)+NAA(1.0mg/L)+蔗糖(30.0g/L)+山梨醇(20.0g/L)+琼脂粉(8.5g/L)+400mg/L头胞+500mg/L羧苄青霉素。

[0202] 以上培养基121℃下，灭菌20分钟，放置超净工作台7d左右，或打开培养皿瓶盖吹4h左右。

[0203] 取稻属植物、芒属植物、狼尾草属植物、稗属植物等多种禾本科植物的幼穗、幼胚、幼嫩花药和成熟胚为外植体，基本操作方法同实施例1一致；效果与实施例1相差不大。部分外植体愈伤诱导和分化的结果见图77-95。

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