酶产物

阅读:719发布:2020-05-08

专利汇可以提供酶产物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及重组酶产物的、特别是食品酶产物的制备和纯化方法及所述酶产物的用途。本发明特别涉及通过分离、酶处理和过滤步骤加工来自 微 生物 发酵 液的酶产物的方法。,下面是酶产物专利的具体信息内容。

1.一种制备重组酶制剂的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)提供包含重组酶、核酸和任选的细胞碎片的组合物I;
(ii)向所述组合物I中加入核酸酶以分解核酸,从而得到包含所述重组酶、分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物II;
(iii)向所述组合物II中加入针对所述分解的核酸的沉淀剂,以与所述分解的核酸复合,从而得到包含所述重组酶、复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物III;
(iv)任选地,通过固/液分离纯化所述组合物III,从而得到包含所述复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的分离的固相,和包含所述重组酶的液体组合物IV;以及
(v)通过微滤纯化所述组合物III或所述组合物IV,从而得到包含所述重组酶的组合物V。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸酶选自核酸内切酶、核酸外切酶或混合的核酸外切酶/核酸内切酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述核酸酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少
99%的同一性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)中,每克生物质当量的所述组合物II中以50U-2000U、50U-1000U、50U-500U、100U-300U、150U-300U、优选200U-300U的量加入所述核酸酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组酶
-选自化还原酶、转移酶、解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶;和/或-选自(b-1)水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;(b-2)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和(b-3)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶;和/或
-碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述重组酶是野生型酶或通过酶工程技术由其衍生的改良变体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(v)中的微滤涉及除去残留的固体和/或具有比所述重组酶更高的分子量的组分。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(v)中的微滤涉及
a)具有以下尺寸排阻极限的膜
-大于1000kDa、大于500kDa、大于400kDa,大于300kDa、大于200kDa、大于150kDa、大于
100kDa、大于90kDa、大于80kDa、大于70kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa或大于20kDa;和/或
-大于5μm、大于4μm、大于3μm、大于2μm、大于1μm、大于0.5μm、大于0.4μm、大于0.3μm、大于0.2μm或大于0.1μm;或
b)过滤器,优选具有等效分子量排阻特性的深层过滤器,
其中在每种情况下,所述组合物V是所述微滤的滤液。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其包括以下其他步骤
(vi)通过另外的微滤或超滤纯化所述组合物V,从而得到包含所述重组酶的组合物VI。
10.根据权利要求9所述的方法,其中步骤(vi)中所述另外的微滤或超滤涉及
a)具有大于100kDa、大于80kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa、大于
20kDa、大于15kDa、大于10kDa、大于5kDa或大于1kDa的尺寸排阻极限的膜;或
b)过滤器,优选具有等效分子量排阻特性的深层过滤器;
其中所述组合物VI是所述微滤的滤液或所述超滤的保留物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述沉淀剂是阳离子聚合物
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述沉淀剂选自壳聚糖、聚胺、聚氨基酸和聚丙烯酰胺。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述沉淀剂是选自聚烯丙基胺、聚乙烯胺、聚乙烯亚胺和聚-N-甲基乙烯胺的聚胺。
14.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述沉淀剂是选自聚精氨酸和聚赖氨酸的聚氨基酸。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述沉淀剂选自聚乙烯亚胺和聚二烯丙基二甲基氯化铵
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述沉淀剂为或包含选自下组的絮凝剂
-阳离子聚胺基絮凝剂,优选选自二甲胺-表氯醇共聚物、甲胺-表氯醇共聚物和二甲胺-表氯醇-乙二胺三元共聚物;和
-阳离子聚丙烯酰胺基絮凝剂,优选选自通过与甲和二甲胺缩合而改性的聚丙烯酰胺以及丙烯酰胺-丙烯酰氧乙基-三甲基-氯化铵共聚物;和
-阴离子聚胺基絮凝剂,优选丙烯酰胺-丙烯酸共聚物;和
-硫酸铵;和
-氯化
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在步骤(vi)的超滤之后不涉及用核酸酶处理保留物(组合物VI)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在步骤(vi)的微滤之后不涉及用核酸酶处理滤液(组合物VI)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在步骤(v)的微滤之后不涉及用核酸酶处理滤液(组合物VI)。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,分别地,在液/固分离步骤之后、在微滤步骤之后和/或在超滤步骤之后,所述方法不涉及用核酸酶处理澄清的溶解产物、滤液或保留物。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,除了步骤(ii)之外,不涉及用核酸酶进行的任何其他处理。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(i)涉及以下子步骤中的一个或多个:
(i-a)将所述重组酶的基因克隆到表达载体中;
(i-b)将携带所述基因的表达载体导入微生物宿主中;
(i-c)在微生物宿主中细胞内表达所述重组酶,即在所述重组酶的细胞内表达条件下使所述微生物宿主进行发酵;和
(i-d)通过细胞破碎将所述重组酶从所述微生物宿主中释放出来,从而得到所述组合物I,即通过细胞破碎破坏经发酵的细胞以释放出所述重组酶,得到包含重组酶产物的粗溶解产物。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述微生物宿主
-是大肠杆菌(Escherichia coli),优选实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株,最优选LE1B109;和/或
-通过缺失选自编码以下酶的基因中的一个或多个其他基因进行修饰:优选大肠杆菌酶、磷酸葡萄糖变位酶、性磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸磷酸酶、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、纤维素合成酶(UDP形成)、α,α-海藻糖-磷酸合成酶(UDP形成)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-糖二磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、脂多糖N-乙酰甘露糖氨基醛酸基转移酶(lipopolysaccharide N-acetylmannosaminouronosyltransferase)、脂质-A-二糖合成酶、十一异戊烯-二磷酸-胞壁酰五肽β-N-乙酰葡糖胺基转移酶、十一异戊烯-磷酸4-脱氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、6-磷酸果糖激酶、丙酸激酶、尿苷激酶、UMP激酶、核苷-二磷酸激酶、多核糖核苷酸核苷酸转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶(非水解)、β-半乳糖苷酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰转移酶。
24.一种制备食品级酶产物的方法,其包括以下步骤:
a.)在微生物宿主中细胞内表达重组酶;
b.)通过细胞破碎释放所述重组酶,得到粗溶解产物;
c.)添加核酸酶以分解含有酶产物的处理溶液中的核酸,得到经酶处理的溶解产物;
d.)加入沉淀剂以与核酸复合,得到复合的溶解产物;
e.)进行液/固分离以从液相中除去细胞碎片和核酸/沉淀剂复合物,得到澄清的溶解产物;和
f.)进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分,得到滤液。
25.根据权利要求24所述的方法,其中分别地,在液/固分离步骤e.)之后和/或在微滤步骤f.)之后,所述方法不涉及用核酸酶处理粗溶解产物或滤液。
26.一种制备重组酶产物的方法,其中所述方法包括以下一个或多个步骤:
a.)将酶产物基因克隆到表达载体中;
b.)将携带所述酶产物基因的所述表达载体导入微生物宿主中;
c.)在所述重组酶产物的细胞内表达条件下使步骤b.)的所述微生物宿主进行发酵;
d.)通过细胞破碎破坏步骤c.)的经发酵的细胞以释放出所述重组酶产物,得到含有重组酶产物的粗溶解产物;
e.)将澄清的溶解产物与核酸酶一起温育,以使所述澄清的溶解产物中的核酸分解,得到经酶处理的溶解产物;
f.)向溶解产物中加入沉淀剂以形成核酸复合物,得到含有重组酶产物的复合的溶解产物;
g.)对所述复合的溶解产物进行液体和/或固体分离,以从液相中除去细胞碎片以及核酸和沉淀剂的复合物,得到含有重组酶产物的澄清的溶解产物;和
h.)对所述经酶处理的溶解产物进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分。
27.根据权利要求26所述的方法,其中分别地,在液/固分离步骤g.)之后,和/或在微滤步骤h.)之后,所述方法不涉及用核酸酶处理粗溶解产物或滤液。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述微生物宿主是大肠杆菌,优选实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株,最优选LE1B109。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述表达载体基于载体pRSF-1b。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述表达载体不携带抗生素抗性基因。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法,其中在权利要求24的步骤(a)或在权利要求26的步骤(c)中添加合适的消泡剂,其中所述消泡剂选自由以下消泡剂组成的组:聚丙二醇(CAS登记号25322-69-4)、聚甘油聚乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(CAS登记号78041-14-2)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(CAS登记号9003-11-6)、聚丙二醇单丁醚(CAS登记号9003-
13-8)、聚二甲基氧烷(CAS登记号63148-62-9;CAS登记号68083-18-1)、二氧化硅(CAS登记号7631-86-9;CAS登记号63231-67-4)、硬脂酸(CAS登记号57-11-4)、脱水山梨糖醇倍半油酸酯(CAS登记号8007-43-0)、甘油单硬脂酸酯(CAS登记号123-94-4)、聚山梨醇酯(聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯,例如聚山梨醇酯60(CAS登记号9005-67-8)、聚山梨醇酯65(CAS登记号9005-71-4)和聚山梨醇酯80(CAS登记号9005-65-6))、菜籽油单甘油酯和双甘油酯(CAS登记号93763-31-6)和白色矿物油(CAS登记号64742-47-8)。
32.根据权利要求24-31中任一项所述的方法,其中在权利要求24的步骤(d)或在权利要求26的步骤(f)中加入一种或多种合适的絮凝剂,其中所述絮凝剂优选选自以下絮凝剂:
a.)阳离子聚胺基絮凝剂,包括二甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号25988-97-0)、甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号31568-35-1)、二甲胺-表氯醇-乙二胺三元共聚物(CAS登记号
42751-79-1);
b.)阳离子聚丙烯酰胺基絮凝剂,包括通过与甲醛和二甲胺缩合而改性的聚丙烯酰胺(CAS登记号67953-80-4)、丙烯酰胺-丙烯酰氧乙基-三甲基-氯化铵共聚物(CAS登记号
69418-26-4);
c.)阴离子聚胺基絮凝剂,包括丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(CAS登记号25987-30-8;CAS登记号9003-06-9);
d.)硫酸铵(CAS登记号10043-01-3);
e.)氯化钙(CAS登记号10035-04-8;CAS登记号10043-52-4)。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述沉淀剂选自聚乙烯亚胺和聚二烯丙基二甲基氯化铵。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述沉淀剂选自由以下沉淀剂组成的组: 781  G、 C448、 C581 G、 C752、
SD-2081和聚乙烯亚胺
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所用的核酸酶选自核酸内切酶、核酸外切酶或混合的核酸外切酶/核酸内切酶。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所用的功能活性核酸酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中每毫升的发酵液使用的核酸酶的量大于200U、大于100U、大于50U、大于40U、大于30U、大于20U、大于15U、大于10U、大于5U、大于
3U、大于2U、大于1U、大于0.5U或大于0.1U。
38.根据权利要求24-37中任一项所述的方法,其中对于对应于权利要求24的步骤(f)或权利要求26的步骤(h)的微滤步骤,使用了膜,所述膜的特征在于尺寸排阻极限为大于
1000kDa、大于500kDa、大于400kDa、大于300kDa、大于200kDa、大于150kDa、大于100kDa、大于90kDa、大于80kDa、大于70kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa或大于
20kDa,其中在所述微滤步骤的滤液中获得所述重组酶产物。
39.根据权利要求24-38中任一项所述的方法,其中对于对应于权利要求24的步骤(f)或权利要求26的步骤(h)的微滤步骤,所使用的膜的尺寸排阻极限为大于5μm、大于4μm、大于3μm、大于2μm、大于1μm、大于0.5μm、大于0.4μm、大于0.3μm、大于0.2μm或大于0.1μm,其中在所述微滤步骤的滤液中获得所述重组酶产物。
40.根据权利要求24-39中任一项所述的方法,其中在对应于权利要求24的步骤(f)或权利要求26的步骤(h)的微滤步骤之后,任选地,应用另外的超滤步骤,其特征在于,使用具有大于100kDa、大于80kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa、大于20kDa、大于
15kDa、大于10kDa、大于5kDa或大于1kDa的尺寸排阻极限的膜,其中在所述超滤步骤的保留物中获得所述重组酶产物。
41.根据权利要求24-40中任一项所述的方法,其中对应于权利要求24的步骤(e)或权利要求26的步骤(g)的固/液分离步骤通过离心、压滤机和/或微滤技术实现。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中表达至少5种、优选至少4种、更优选至少3种、还更优选至少2种、最优选至少1种细胞内蛋白。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中由生产菌株表达的一种或多种重组酶单独或共同构成所述酶产物的总蛋白含量的至少50%、优选至少40%、更优选至少30%、还更优选至少20%、最优选至少10%。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酶产物是食品酶。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酶产物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酶产物选自下组:
a.)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;
b.)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和c.)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组酶是野生型酶或通过酶工程技术由野生型酶衍生的改良变体。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过缺失选自例如编码以下酶的基因中的一个或多个其他基因对所述微生物生产宿主进行修饰:优选大肠杆菌酶、磷酸葡萄糖变位酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸磷酸酶、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、纤维素合成酶(UDP形成)、α,α-海藻糖-磷酸合成酶(UDP形成)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-糖二磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、脂多糖N-乙酰甘露糖氨基醛酸基转移酶、脂质-A-二糖合成酶、十一异戊烯-二磷酸-胞壁酰五肽β-N-乙酰葡糖胺基转移酶、十一异戊烯-磷酸-4-脱氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、尿苷激酶、UMP激酶、核苷-二磷酸激酶、多核糖核苷酸核苷酸转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶(非水解)、β-半乳糖苷酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰转移酶。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包括以下步骤:
a.)用核酸酶处理含有重组酶产物的细胞破碎粗溶解产物;
b.)加入沉淀剂以与核酸复合;
c.)进行液/固分离以从液相中除去细胞碎片和核酸/沉淀剂复合物;和
d.)进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分。
51.一种制备酶制剂的方法,其包括以下步骤:
A)提供大肠杆菌菌株;
B)任选地,添加营养培养基;
C)进行发酵,从而获得发酵液;
D)任选地,对所述发酵液进行固/液分离,从而获得生物质;
E)任选地,进行均质化;
F)用核酸酶进行处理;
G)进行固/液分离,从而获得上清液;和
H)任选地,进行过滤从而获得酶制剂。
52.重组酶制剂,其可通过前述权利要求中任一项所述的方法获得。
53.根据权利要求52所述的制剂,其特征在于残留的DNA浓度为0ng/g-50ng/g、0ng/g-
40ng/g、0ng/g-30ng/g、0ng/g-20ng/g、0ng/g-10ng/g、0ng/g-9ng/g、0ng/g-8ng/g、0ng/g-
7ng/g、0ng/g-6ng/g、0ng/g-5ng/g、0ng/g-4ng/g、0ng/g-3ng/g、0ng/g-2ng/g、0ng/g-1ng/g,优选0ng/g-0.9ng/g、0ng/g-0.8ng/g、0ng/g-0.7ng/g、0ng/g-0.6ng/g、0ng/g-0.5ng/g、
0ng/g-0.4ng/g、0ng/g-0.3ng/g、0ng/g-0.2ng/g、0ng/g-0.1ng/g或更优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g。
54.根据权利要求1-51中任一项所述的方法制备的酶的制剂,其特征在于残留的DNA浓度为0.01ng/g-50ng/g、0.01ng/g-40ng/g、0.01ng/g-30ng/g、0.01ng/g-20ng/g、0.01ng/g-
10ng/g、0.01ng/g-9ng/g、0.01ng/g-8ng/g、0.01ng/g-7ng/g、0.01ng/g-6ng/g、0.01ng/g-
5ng/g、0.01ng/g-4ng/g、0.01ng/g-3ng/g、0.01ng/g-2ng/g、0.01ng/g-1ng/g,优选0.01ng/g-0.9ng/g、0.01ng/g-0.8ng/g、0.01ng/g-0.7ng/g、0.01ng/g-0.6ng/g、0.01ng/g-0.5ng/g、0.01ng/g-0.4ng/g、0.01ng/g-0.3ng/g、0.01ng/g-0.2ng/g、0.01ng/g-0.1ng/g或更优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g,重组DNA浓度通过基于代表性DNA片段的基于聚合酶链式反应的扩增的方法测定,所述代表性DNA片段包含长度为至少100个碱基对的重组DNA,使用来自生产宿主的总DNA制剂进行校准。
55.根据权利要求1-51中任一项所述的方法制备的酶的制剂,其中所述酶产物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
56.根据权利要求1-51中任一项所述的方法制备的酶的制剂,其中所述酶产物选自由以下组成的组:
a.)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;
b.)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和c.)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
57.根据权利要求1-51中任一项所述的方法制备的酶的制剂,其中所述酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
58.根据权利要求52-57中任一项所述的酶制剂,其中所述重组酶是野生型酶或通过酶工程技术由野生型酶衍生的改良变体。
59.一种细胞内表达的重组酶产物的酶制剂,其重组DNA浓度小于50ng/g,其含有生产宿主的至少3种不同的细胞内宿主细胞蛋白,所述蛋白占所述酶制剂的总蛋白含量的至少
10%。
60.根据权利要求52-59中任一项所述的酶制剂,其中所述生产宿主是大肠杆菌,优选实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株,最优选LE1B109。
61.根据权利要求52-60中任一项所述的酶制剂,其中所述酶制剂含有表达的酶产物,此外还含有可检测量的核酸酶,所述核酸酶与SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的核酸酶具有至少70%的同一性。
62.根据权利要求52-61中任一项所述的酶制剂,其中所述重组酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
63.根据权利要求52-62中任一项所述的酶制剂,其中所述重组酶产物选自下组:
a.)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;
b.)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和c.)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
64.根据权利要求52-63中任一项所述的酶制剂,其中所述重组酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。

说明书全文

酶产物

[0001] 本申请要求于2017年5月15日提交的第62/506,357号美国专利申请,于2017年11月6日提交的第62/581,880号美国专利申请,于2017年11月8日提交的第17 200 572.0号欧洲专利申请,和于2018年3月16日提交的第18162 420.6号欧洲专利申请的优先权。

技术领域

[0002] 本发明涉及重组酶产物、特别是食品酶产物的制备和纯化方法及所述酶产物的用途。本发明特别涉及通过分离、酶处理和过滤步骤加工来自生物发酵液的酶产物的方法。

背景技术

[0003] 利用微生物菌株来制备重组酶已在现有技术中得到了广泛的描述。大肠杆菌是一种众所周知的从实验室到工业规模的重组酶的表达宿主。
[0004] 酶产物的制备,特别是用于食品或制药应用的酶产物的制备,需要达到安全和授权使用这种酶产物的特定规格要求。
[0005] 由于法规要求旨在用于食品应用的酶产物应该不含重组DNA或减少重组DNA的含量。许多酶不能被分泌出来,因此需要表达为细胞内酶。为了从表达宿主释放它们,需要细胞破碎步骤。这种细胞破碎与从表达宿主释放大量DNA有关。在重组生产方法的情况下,伴随着这种DNA释放,重组DNA也被释放出来。需要再次除去这种重组DNA。
[0006] GRAS公告第GRN 126号描述了从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Biovar I制备α-淀粉酶制剂,荧光假单胞菌Biovar  I表达编码源于热球菌目(Thermococcales)的三种微生物的杂合α-淀粉酶的基因。α-淀粉酶可用作解食用淀粉的酶,以产生各种淀粉水解产物,并产生可发酵的糖,用于生产用于酒精饮料的蒸馏乙醇
[0007] 源自重组生产的酶产物广泛用于食品工业。作为酶产物提供的酶的种类包括属于由化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶组成的组的酶,以及例如选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶或木糖异构酶的酶。具体而言,这种酶产物可以是水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶,氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶,和脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0008] 此外,食品酶产物通常用于某些底物的酶促转化,用于生产食品成分,例如某些二糖、三糖或寡糖。酶的这种酶促转化应用在下文中也称为“下游酶促转化”。
[0009] 为了满足监管批准要求以及提高酶产物的安全性及其在下游酶促转化中的用途,由生产宿主和/或发酵液制备和加工酶产物需要许多单独的步骤以达到符合各监管要求的目的。在工业酶生产中,希望避免昂贵的纯化步骤,例如色谱法。理想地,可以使用粗酶制剂。当在细胞内表达酶时,需要有效且低成本的下游加工,其使得能够产生不含重组DNA的酶产物。然而,现有技术的方法在各方面都不令人满意,并且考虑到要遵守的监管机构越来越多的义务和先决条件要求,对酶产物的高效和合规的制备和加工方法提出了要求。

发明内容

[0010] 本发明的目的是提供酶产物的改进的制备和加工方法。
[0011] 该问题已通过本专利权利要求的主题、序列文件和附图得到解决。
[0012] SEQ ID NO:1是源自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸酶的氨基酸序列。SEQ ID NO:2是源自粘质沙雷氏菌的核酸酶的、在其N-末端具有一个额外的蛋氨酸的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的蔗糖合成酶1(NCBI参考序列:NP_197583.1)。SEQ ID NO:4是源自甜叶菊(Stevia rebaudiana)的UDP-糖基转移酶76G1(Genbank登录号AAR06912.1)。SEQ ID NO:5是源自番茄(Solanum lycopersicum)的β-D-糖基西红花酸-β-1,6-糖基转移酶样酶(Genbank登录号XP_004250485.1)。

附图说明

[0013] 图1为酶产物的制备方法的示意图。

具体实施方式

[0014] 可以表明几种工艺设计不适合以足以满足成本效率和法规要求的方式减少重组DNA含量。令人惊讶的是,已经表明,只有以下三个工艺步骤的组合才能实现所需的重组DNA的减少:
[0015] 1.用核酸酶处理以使DNA水解;
[0016] 2.使用沉淀剂和/或絮凝剂通过形成不溶性复合物使水解的DNA沉淀;和
[0017] 3.进行随后的微滤步骤。
[0018] 任选地,步骤2中形成的不溶性复合物可以在步骤3之前通过液/固分离技术除去。
[0019] 被用于表达重组酶的宿主细胞的处理(work-up)通常涉及各种步骤,其中将加工添加剂(例如盐、化学添加剂、酶或其它加工助剂)加入培养基或发酵液中,可以对发酵液进行稀释或浓缩或者物理或机械处理,例如,进行超声处理。现在已经令人惊讶地发现,几种这样的常规添加的加工添加剂和处理可以抑制核酸酶,使得由于这些添加剂和工艺条件的存在,所需的在这些核酸酶的酶促催化下的DNA(和/或RNA)水解被抑制或至少明显地被阻止。因此,令人惊讶地发现,当在使用这种常规加工添加剂之前,在整个处理过程的相对早期步骤中使用这种核酸酶时,所需的、核酸酶对DNA(和/或RNA)的酶促水解可得到明显改善。
[0020] 此外,令人惊讶地发现,当将这种核酸酶的早期使用与沉淀剂(例如絮凝剂)结合时,可以进一步改善整个处理过程,从而有助于去除水解的DNA(和/或RNA)片段
[0021] 在第一方面,本发明涉及制备酶产物、优选食品级酶产物的方法。
[0022] 优选地,根据本发明的制备重组酶制剂的方法包括以下步骤:
[0023] (i)提供包含重组酶、核酸和任选的细胞碎片的组合物I;
[0024] (ii)向所述组合物I中加入核酸酶以分解核酸,从而得到包含所述重组酶、分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物II;
[0025] (iii)向所述组合物II中加入针对所述分解的核酸的沉淀剂,以使所述分解的核酸复合,从而得到包含所述重组酶、复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物III;
[0026] (iv)任选地,通过固/液分离纯化所述组合物III,从而得到包含所述复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的分离的固相,和包含所述重组酶的液体组合物IV;以及[0027] (v)通过微滤纯化所述组合物III或所述组合物IV,从而得到包含所述重组酶的组合物V。
[0028] 步骤(i)中提供的组合物I中细胞碎片的存在是任选的。步骤(i)中提供的组合物I可含有微生物宿主的破碎细胞,在随后的步骤(ii)中向其中加入核酸酶。或者,步骤(i)中提供的组合物I可含有微生物宿主的完整细胞,在随后的步骤(ii)中向其中加入核酸酶。然后优选在核酸酶存在下进行微生物宿主细胞的破碎,例如通过超声处理。
[0029] 步骤(iv)是任选的。因此,根据本发明的方法至少包括步骤(i)、(ii)、(iii)和(v),优选(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)。
[0030] 该过程可以分批或连续进行。虽然通常可能在前一步骤终止之前开始后续步骤,但各个步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)优选按数字顺序连续进行,其中后续步骤在前一步骤完全终止之后开始。然而,还设想了在步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)和/或(v)中的任何两个步骤之间执行在步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中未提及的额外中间步骤。额外中间步骤可以例如涉及组合物的任何物理或化学处理,例如,调节温度、pH值或组合物的稀释度或浓度、改变组合物的缓冲液组成(buffer composition)。因此,步骤(ii)中的核酸酶处理优选在步骤(i)之后,并且在步骤(iii)、(iv)和(v)中的任一个之前进行。
[0031] 优选地,核酸酶选自核酸内切酶、核酸外切酶或混合的核酸外切酶/核酸内切酶。优选地,核酸酶可以水解DNA、RNA或两者。优选地,核酸酶选自具有以下国际生物化学和分子生物学联合会赋予的EC编号的核酸酶:EC 3.1.11.2、EC 3.1.11.5、EC 3.1.11.6、EC 
3.1.13.4、EC 3.1.14.1、EC 3.1.21.1、EC 3.1.21.2、EC 3.1.21.3、EC 3.1.21.4、EC 
3.1.21.6、EC 3.1.25.1、EC 3.1.26.3、EC 3.1.26.4、EC 3.1.26.5、EC 3.1.26.8、EC 
3.1.26.9、EC 3.1.26.11、EC 3.1.27.1、EC 3.1.27.3、EC 3.1.27.5、EC 3.1.30.1、EC 
3.1.30.2、EC 3.1.31.1,优选EC 3.1.30.2。
[0032] 优选地,核酸酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性。
[0033] 优选地,在步骤(ii)中,基于组合物II的每克生物质当量,核酸酶的加入量为50U-2000U、50U-1000U、50U-500U、100U-300U、150U-300U,优选200U-300U。
[0034] 优选地,重组酶
[0035] -选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶、优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶;和/或[0036] -选自(b-1)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;(b-2)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和(b-3)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶;和/或
[0037] -碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0038] 优选地,重组酶是通过已知的酶工程技术由野生型酶衍生的改良变体。
[0039] 优选地,步骤(v)中的微滤涉及除去残留的固体和/或具有比重组酶更高的分子量的组分。
[0040] 优选地,步骤(v)中的微滤涉及
[0041] a)具有以下尺寸排阻极限的膜
[0042] -大于1000kDa、大于500kDa、大于400kDa,大于300kDa、大于200kDa、大于150kDa、大于100kDa、大于90kDa、大于80kDa、大于70kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa或大于20kDa;和/或
[0043] -大于5μm、大于4μm、大于3μm、大于2μm、大于1μm、大于0.5μm、大于0.4μm、大于0.3μm、大于0.2μm或大于0.1μm;或
[0044] b)过滤器,优选具有等效分子量排阻特性的深层过滤器,
[0045] 其中在每种情况下,组合物V是微滤的滤液。
[0046] 优选地,根据本发明的方法包括其他步骤
[0047] (vi)通过另外的微滤或超滤纯化组合物V,从而得到包含重组酶的组合物VI。
[0048] 优选地,步骤(vi)中的另外的微滤或超滤涉及
[0049] a)具有大于100kDa、大于80kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa、大于20kDa、大于15kDa、大于10kDa、大于5kDa或大于1kDa的尺寸排阻极限的膜;或[0050] b)过滤器,优选具有等效分子量排阻特性的深层过滤器;
[0051] 其中组合物VI是微滤的滤液或超滤的保留物。
[0052] 优选地,除了步骤(ii)之外,根据本发明的方法不涉及用核酸酶进行的任何其他处理。优选地,除了步骤(ii)之外,根据本发明的方法在步骤(v)的微滤之后不涉及用核酸酶处理滤液(组合物VI),和/或在步骤(vi)的微滤之后不涉及用核酸酶处理滤液(组合物VI),和/或在步骤(vi)的超滤之后用核酸酶处理保留物(组合物VI)。
[0053] 优选地,本发明的方法分别地,在液/固分离步骤之后、在微滤步骤之后和/或在超滤步骤之后,不涉及用核酸酶处理澄清的溶解产物、滤液或保留物。
[0054] 优选地,沉淀剂是阳离子聚合物或包含阳离子聚合物,优选选自壳聚糖;聚胺,例如聚烯丙基胺(例如聚二烯丙基二甲基氯化铵(pDADMAC))、聚乙烯胺、聚乙烯亚胺或聚-N-甲基乙烯胺(PMVA);聚氨基酸,例如聚精氨酸或聚赖氨酸;和聚丙烯酰胺。
[0055] 优选沉淀剂是或包含选自聚乙烯亚胺和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pDADMAC)的沉淀剂。
[0056] 优选地,沉淀剂是絮凝剂或包含絮凝剂。优选的絮凝剂包括但不限于:
[0057] a.阳离子聚胺基絮凝剂,包括二甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号25988-97-0)、甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号31568-35-1)、二甲胺-表氯醇-乙二胺三元共聚物(CAS登记号42751-79-1);和
[0058] b.阳离子聚丙烯酰胺基絮凝剂,包括通过与甲和二甲胺缩合而改性的聚丙烯酰胺(CAS登记号67953-80-4)、丙烯酰胺-丙烯酰氧乙基-三甲基-氯化铵共聚物(CAS登记号69418-26-4);和
[0059] c.阴离子聚胺基絮凝剂,包括丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(CAS登记号25987-30-8;CAS登记号9003-06-9);和
[0060] d.硫酸铵(CAS登记号10043-01-3);和
[0061] e.氯化(CAS登记号10035-04-8;CAS登记号10043-52-4)。
[0062] 优选地,步骤(v)中获得的组合物V和/或任选步骤(vi)中获得的组合物VI的特征在于残留的DNA浓度为0ng/g-50ng/g、0ng/g-40ng/g、0ng/g-30ng/g、0ng/g-20ng/g、0ng/g-10ng/g、0ng/g-9ng/g、0ng/g-8ng/g、0ng/g-7ng/g、0ng/g-6ng/g、0ng/g-5ng/g、0ng/g-4ng/g、0ng/g-3ng/g、0ng/g-2ng/g、0ng/g-1ng/g,优选0ng/g-0.9ng/g、0ng/g-0.8ng/g、0ng/g-
0.7ng/g、0ng/g-0.6ng/g、0ng/g-0.5ng/g、0ng/g-0.4ng/g、0ng/g-0.3ng/g、0ng/g-0.2ng/g、0ng/g-0.1ng/g,或更优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g。
[0063] 优选地,步骤(i)涉及以下子步骤中的一个或多个:
[0064] (i-a)将重组酶的基因克隆到表达载体中;
[0065] (i-b)将携带所述基因的表达载体导入微生物宿主中;
[0066] (i-c)在微生物宿主中在细胞内表达重组酶,即在重组酶的细胞内表达条件下使所述微生物宿主进行发酵;和
[0067] (i-d)通过细胞破碎将所述酶(和核酸)从所述微生物宿主中释放出来,从而得到所述组合物I,即通过细胞破碎破坏经发酵的细胞以释放出所述重组酶,得到包含重组酶产物的粗溶解产物。
[0068] 因此,根据该优选实施方案,在步骤(i)、子步骤(i-d)中破坏微生物宿主的细胞,并在随后的步骤(ii)中加入核酸酶。
[0069] 然而,或者也可以考虑将微生物宿主的细胞悬浮在例如含有核酸酶的细胞溶解缓冲液中,然后,例如通过超声处理在核酸酶的存在下进行破碎。因此,根据该实施方案,步骤(ii)优选地涉及以下子步骤:
[0070] (ii-a)向组合物I中加入核酸酶;
[0071] (ii-b)通过细胞破碎从微生物宿主释放重组酶和核酸,以分解核酸,从而得到包含重组酶、分解的核酸和细胞碎片的组合物II,即通过细胞破碎破坏经发酵的细胞以释放出重组酶和核酸,得到包含重组酶、分解的核酸和细胞碎片(和核酸酶)的粗溶解产物。
[0072] 优选地,微生物宿主
[0073] -是大肠杆菌(Escherichia coli),优选实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株,最优选LE1B109;和/或
[0074] -通过缺失选自编码以下酶的基因中的一个或多个其他基因进行修:优选大肠杆菌酶、磷酸葡萄糖变位酶、性磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸磷酸酶、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、纤维素合成酶(UDP形成)、α,α-海藻糖-磷酸合成酶(UDP形成)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-糖二磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、脂多糖N-乙酰甘露糖氨基醛酸基转移酶、脂质-A-二糖合成酶、十一异戊烯-二磷酸-胞壁酰五肽β-N-乙酰葡糖胺基转移酶、十一异戊烯-磷酸-4-脱氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、6-磷酸果糖激酶、丙酸激酶、尿苷激酶、UMP激酶、核苷-二磷酸激酶、多核糖核苷酸核苷酸转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶(非水解)、β-半乳糖苷酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、推定的(putative)N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰转移酶。
[0075] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第一实施方案或第1项中,本发明涉及制备食品级酶产物的方法,该方法包括以下步骤:
[0076] a.在微生物宿主中的细胞内表达重组酶;
[0077] b.通过细胞破碎释放重组酶,得到粗溶解产物;
[0078] c.添加核酸酶以分解含有酶产物的处理溶液中的核酸,得到经酶处理的溶解产物;
[0079] d.加入沉淀剂以与核酸复合,得到复合的溶解产物;
[0080] e.进行液/固分离以从液相中除去细胞碎片和核酸/沉淀剂复合物,得到澄清的溶解产物;和
[0081] f.进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分,得到滤液;
[0082] 其中该方法优选在液/固分离步骤e.之后不涉及用核酸酶处理澄清的溶解产物,或在微滤步骤f.之后,不涉及用核酸酶处理滤液。
[0083] 该过程可以分批或连续进行。虽然通常可能在前一步骤终止之前开始后续步骤,但各个步骤a.)、b.)、c.)、d.)、e.)和f.)优选按字母顺序连续进行,其中后续步骤在前一步骤完全终止之后开始。然而,还设想了在步骤a.)、b.)、c.)、d.)、e.)和/或f.)中的任何两个步骤之间执行在步骤a.)、b.)、c.)、d.)、e.)和f.)中未提及的其他中间步骤。
[0084] 优选地,在本发明的第一方面的优选实施方案中,本发明涉及制备重组酶制剂的方法,所述方法包括以下步骤:
[0085] (i)提供包含重组酶产物、核酸和任选的细胞碎片的组合物I;
[0086] (ii)向组合物I中加入核酸酶以分解核酸,从而得到包含所述重组酶产物、分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物II;
[0087] (iii)向组合物II中加入针对所述分解的核酸的沉淀剂,以使所述分解的核酸复合,从而得到包含所述重组酶产物、复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物III;
[0088] (iv)任选地,通过固/液分离纯化组合物III,从而得到包含所述复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的分离的固相,和包含所述重组酶产物的液体组合物IV;以及[0089] (v)通过微滤纯化组合物III或组合物IV,从而得到包含所述重组酶产物的组合物V;
[0090] 其中该方法优选在步骤(iv)的液/固分离之后不涉及用核酸酶处理澄清的溶解产物(组合物IV),或在微滤步骤(v)之后,不涉及用核酸酶处理滤液(组合物V)。
[0091] 优选地,在本发明的第一方面的优选实施方案中,本发明涉及制备重组酶制剂的方法,所述方法包括以下步骤:
[0092] (i)提供包含重组酶产物、核酸和任选的细胞碎片的组合物I;
[0093] (ii)向组合物I中加入核酸酶以分解核酸,从而得到包含所述重组酶产物、分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物II;
[0094] (iii)向组合物II中加入针对所述分解的核酸的沉淀剂,以使所述分解的核酸复合,从而得到包含所述重组酶产物、复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物III;
[0095] (iv)任选地,通过固/液分离纯化组合物III,从而得到分离的固相和液体组合物IV,其中该固相主要包含源自组合物III的复合的分解的核酸、任选的细胞碎片以及任选的所述重组酶产物的残余物,该液体组合物IV主要包含源自组合物III的所述重组酶产物,以及任选的细胞碎片和复合的分解的核酸的残余物;以及
[0096] (v)通过微滤纯化组合物III或组合物IV,从而得到包含所述重组酶产物的组合物V;
[0097] 其中该方法优选在步骤(iv)的液/固分离之后,不涉及用核酸酶处理澄清的溶解产物(组合物IV),或在微滤步骤(v)之后,不涉及用核酸酶处理滤液(组合物V)。
[0098] 在本发明的第一方面的优选的实施方案中,或在第一方面的任何实施方案中,本发明涉及制备重组酶产物的方法,其包括在步骤(v)之后,通过另外的微滤或超滤纯化组合物V的其他步骤(vi),从而得到包含酶产物的组合物VI。
[0099] 以下情况在本发明的范围内:在步骤(v)的微滤之后和/或步骤(vi)的微滤之后,获得含有酶产物的滤液(组合物V或组合物VI)。下述情况也在本发明的范围内:在步骤(vi)的超滤之后,获得含有酶产物的保留物(组合物VI)。
[0100] 优选地,该方法在步骤(v)的微滤之后不涉及用核酸酶处理滤液(组合物VI),和/或在步骤(vi)的微滤之后不涉及用核酸酶处理滤液(组合物VI),和/或在步骤(vi)的超滤之后不涉及用核酸酶处理保留物(组合物VI)。
[0101] 在本发明的第一方面的优选的实施方案中,或在第一方面的任何实施方案中,本发明涉及制备重组酶产物的方法,其中酶产物可以通过在酶产物的制剂中不存在DNA片段而区别于其他制剂。
[0102] 在本发明的范围内,术语组合物I和粗溶解产物、术语组合物II和经酶处理的溶解产物、术语组合物III和复合的溶解产物、以及术语组合物IV和澄清的溶解产物分别被认为是等同的并且以等同的方式使用,并描述本发明的相同要素。
[0103] 在本发明的范围内,术语“酶产物”和“重组酶制剂”被认为是等同的并且以等同的方式使用,并描述本发明的相同要素。
[0104] 进一步的,在本发明的范围内,本发明的酶产物包含在液体组合物I、液体组合物II、液体组合物III、液体组合物IV、液体组合物V和液体组合物IV中,并且优选本发明的酶产物是液体组合物V、组合物VI或由它们衍生的任何其他的液体、冻干或稳定的制剂。
[0105] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第二实施方案或第2项(其也是第一方面的第一实施方案和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及制备重组酶产物的方法,该方法的特征在于包括以下一个或多个步骤:
[0106] a.将酶产物的基因克隆到表达载体中;
[0107] b.将携带所述酶产物的基因的表达载体导入微生物宿主中;
[0108] c.在所述重组酶产物的细胞内表达条件下,使上述步骤(b)的微生物宿主进行发酵;
[0109] d.通过细胞破碎破坏上述步骤(c)的经发酵的细胞以释放出重组酶产物,得到含有重组酶产物的粗溶解产物;
[0110] e.将粗溶解产物与核酸酶一起温育,以使粗溶解产物中的核酸分解,得到经酶处理的溶解产物;
[0111] f.向经酶处理的溶解产物中加入沉淀剂以形成核酸复合物,得到含有重组酶产物的复合的溶解产物;
[0112] g.对复合的溶解产物进行液体和/或固体分离,以从液相中除去细胞碎片以及核酸和沉淀剂的复合物,得到含有重组酶产物的澄清的溶解产物;和
[0113] h.对经酶处理的任选澄清的溶解产物进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分;
[0114] 其中该方法优选在步骤g的液/固分离之后不涉及用核酸酶处理澄清的溶解产物,或在微滤步骤h之后,不涉及用核酸酶处理滤液。
[0115] 该过程可以分批或连续进行。虽然通常可能在前一步骤终止之前开始后续步骤,但各个步骤a.)、b.)、c.)、d.)、e.)、f.)、g.)和h.)优选按字母顺序连续进行,其中后续步骤在前一步骤完全终止之后开始。然而,还设想了在步骤a.)、b.)、c.)、d.)、e.)、f.)、g.)和/或h.)中的任何两个步骤之间执行在步骤a.)、b.)、c.)、d.)、e.)、f.)、g.)和h.)中未提及的其他中间步骤。
[0116] 在本发明的优选的实施方案中,优选在本发明第一方面的优选实施方案(其也是第一方面的任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及制备重组酶产物的方法,其中省略步骤(iv)、步骤(e)(用于第1项)或步骤(g)(用于第2项)中的固/液分离。
[0117] 在本发明的第一方面的第一、第二和任何其他实施方案的发明内容中,该方法可包括其中的一个或多个步骤。在本发明的第一方面的第一、第二和任何其他实施方案的发明内容中,该方法包括其中的每个步骤。在本发明的第一方面的第一和任何其他实施方案的发明内容中,步骤(c)或(ii)中的核酸酶处理步骤必须是在步骤(a、b)或(i)中的任一步骤之后,并且在步骤(d、e、f)或(iii、iv、v)中的任一步骤之前执行。在本发明的第一方面的第二实施方案的发明内容中,步骤(e)中的核酸酶处理步骤必须是在步骤(a、b、c、d)中的任一步骤之后,并且在步骤(f、g、h)中的任一步骤之前执行。
[0118] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是第一方面的任何其他实施方案的实施方案)中,本发明在液/固分离之后,在微滤步骤之后,在超滤步骤之后,不涉及用核酸酶分别处理澄清的溶解产物、滤液或保留物。优选地,在本发明的第一方面的第一实施方案的步骤(f)或(v)之后实现第一方面的第一实施方案的步骤(c)或(ii),并且优选地,在第一方面的第二实施方案的步骤(h)之后实现第一方面的第二实施方案的步骤(e)。
[0119] 出于本发明的目的,在本发明的第1项的步骤(b)或第一方面的第一实施方案的(i)、或第2项或第一方面的第二实施方案的步骤(d)中获得的粗溶解产物是酶产物,其是细胞内表达的酶的重组粗酶制剂,并且被定义为在对将重组酶表达为细胞内蛋白的微生物进行细胞破碎之后获得的酶制剂。除了重组酶产物之外,粗溶解产物可以包含例如脂质、代谢物、碳水化合物、膜碎片、来自这些生物分子中任一个的衍生物,和/或细胞内宿主细胞蛋白,其可以通过例如宿主特异性免疫测定法检测被检测到。针对宿主细胞蛋白(例如来自大肠杆菌)的相应抗体可从不同来源获得。可以应用Western Blot。重组粗酶制剂在蛋白水平上的纯度,例如可通过基于SDS-PAGE的方法测定的纯度为≤50%,优选≤60%,更优选≤70%,还更优选≤80%,最优选≤90%。
[0120] 出于本发明的目的,发酵条件是pH为6-8,温度为25℃-37℃。继续发酵过程,直到实验室测试数据显示达到所需的酶产量。然后,通常在至少15小时之后,停止发酵。在随后的回收过程中,将酶从生物质中分离。在第一次固/液分离中,通过标准技术(例如,离心和/或过滤)将生物质与培养液分离。将生物质均质化以破坏细菌细胞并用核酸酶处理以降解细胞破裂时释放出的DNA/RNA核酸。然后进行固/液分离步骤以进一步除去细胞碎片和其他不溶物质。过滤无细胞上清液,得到纯化的酶制剂。用于发酵和回收的所有原材料均为食品级质量或被评估为适合其预期用途。然后可以将获得的酶产物用于下游酶促转化。图1示出了下文描述的酶产物的制备方案。
[0121] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第三实施方案(其也是本发明的第一方面的第一和第二以及任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中所述微生物宿主是大肠杆菌,优选实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株,最优选LE1B109。
[0122] 优选地,本发明还涉及一种方法,其中重组酶
[0123] -选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶;和/或[0124] -选自(b-1)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;(b-2)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和(b-3)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶;和/或
[0125] -碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶;
[0126] 在微生物宿主大肠杆菌中表达重组酶,优选在实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株中表达,最优选在LE1B109中表达。
[0127] 优选地,在微生物宿主大肠杆菌中表达的,优选在实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株中表达的,最优选在LE1B109中表达的重组酶是已知的野生型酶或通过已知的酶工程技术由野生型酶衍生的任何改良变体。
[0128] 在本发明的第一方面的第三实施方案的发明内容中,生产菌株LE1B109是实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株。
[0129] K-12菌株,特别是W3110亚株,已经被安全地用作实验室微生物超过50年,并且是被最全面表征的细菌之一(Bachmann,1972;Jensen,1993)。
[0130] 大肠杆菌K-12在专用化学品和人类药物的工业生产中具有长期安全使用的历史(U.S.EPA,1997)。例如,由基因修饰的大肠杆菌K-12菌株获得的食品酶制剂(凝乳酶)在1990年由美国FDA确认为GRAS(Flamm,1991;Olempska-Beer et al.,2006)并且在全世界被安全地用于生产奶酪。在欧盟,目前有3种源自大肠杆菌K-12的食品酶制剂正在由EFSA进行评估,该评估是根据1331/2008法规(EC)(欧洲委员会,2016)的授权要求的部分作出的。其中的一种,D阿洛酮糖3-表异构酶,最近已成为GRAS通告的主题,未收到美国FDA(美国FDA,
2016)的任何质疑。另外两种源自大肠杆菌K-12的食品酶制剂,两种不同的环麦芽糖糊精葡萄糖转移酶,已经安全地用于生产新的食品成分α-环糊精和γ-环糊精多年,分别由欧洲委员会在2008年和2012年授权。
[0131] 大肠杆菌K-12不被认为是人或动物病原体,因此在NIH指南(NIH,2016)中被归类为属于险组1。此外,在研究致病性大肠杆菌菌株的毒因子时,它经常被用作非致病性参照物(Blanc-Potard et al.,2002;Kaper et al.,2004)。大肠杆菌K-12及其衍生物基本上不能在哺乳动物的胃肠道中定殖,摄入后不会产生包括志贺毒素在内的引起疾病的毒素,并且不能在水或土壤中持续存在(Bogosian et al.,1996;U.S.EPA,1997)。亲本实验室菌株W3110不携带任何引入的抗微生物抗性基因。已对大肠杆菌K-12,特别是亚株W3110的完整基因组进行了测序,证实了不存在产毒潜力(Blattner et al.,1997;Hayashi et al.,2006)。
[0132] 亲本菌株大肠杆菌K-12W3110属于明确定义的分类学的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。大肠杆菌的主要栖息处是温血动物的下肠道,其中它是主要的好氧微生物的代表。大肠杆菌的非致病性菌株被认为是共生的,尽管主要通过防止病原体的定植对宿主也产生一些有益效果(Tenaillon et al.,2010)。
[0133] 在本发明的范围内,为产生生产菌株LE1B109,通过在不同染色体位点的定点重组对亲本菌株大肠杆菌K-12W3110进行了修饰,以在遗传稳定性,尤其是质粒稳定性、表达效率和下游酶促转化方面适应生产目的。通过缺失相应的基因已经消除了多种蛋白酶的表达。通过缺失一个基因已经实现了靶克隆的无抗生素选择。缺失另一个基因以防止不需要的重组效应。源自大肠杆菌T7噬菌体的T7 RNA聚合酶的编码基因和lacI(天然存在于大肠杆菌K-12W3110中的阻遏物)的另一基因拷贝被插入W3110的基因组中以实现强的且受控的酶表达。
[0134] 优选地,酶生产菌株大肠杆菌LE1B109是亲本菌株大肠杆菌K-12W3110的衍生株也在本发明的范围内。在使用之前,已经分析了其基因组,并且已经证实不存在抗生素抗性基因或任何其他关注的序列以满足食品酶法规要求。使用由Pariza和Johnson(2001)开发的决策树评估酶生产菌株,并且该菌株基于酶促转化的最终产物符合JECFA规范的结论而被接受。根据产品规格,证明每种酶批次中最终酶产物制剂中不存在生产微生物,以符合食品质量要求。
[0135] 此外,在本发明的范围内,生产菌株可携带与下游酶转化中某些反应物或中间体的降解相关的内源酶基因的某些缺失,以避免副反应。染色体DNA的缺失通常通过同源重组技术(例如通过整合携带抗生素抗性基因或其他选择标记的基于质粒的片段)去除靶基因来进行。类似地,如果需要,可以获得新基因的插入。在选择正确的染色体突变体后,通过瞬时表达的酶切除抗性基因。或者,丢失了不需要的序列(例如,质粒编码的基因或整个质粒)的细胞可以通过负选择压力(例如自杀标记的表达)进行选择。根据食品酶的要求,最终细胞中没有残留的载体序列或抗生素抗性基因。
[0136] 在第一方面的第三实施方案的发明内容中,在酶产物的制备过程中,将携带相应关注的酶的表达载体的大肠杆菌生产菌株LE1B109接种于由作为发酵营养素的葡萄糖和确定的矿物质成分组成的灭菌培养基中,并进行发酵。
[0137] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第四实施方案(其也是本发明的第一方面的第一、第二、第三和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中表达载体基于众所周知的载体pRSF-1b(Novagen)。出于本发明的目的,将酶产物的基因克隆到表达载体中,并通过补充异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)作为酶表达的诱导物在发酵过程中诱导基因的表达。
[0138] 在本发明的第一方面的第四实施方案和任何其他实施方案的发明内容中,用于制备特定酶的最终生产菌株是通过引入携带所需酶的特定基因的表达载体由LE1B109受体菌株产生的。用于转化大肠杆菌受体菌株的质粒基于众所周知的载体pRSF-1b。已经对质粒进行完全测序,该质粒不携带抗生素抗性基因或任何其他关注的序列。此后,对生产菌株LE1B109进行测序以确认不存在抗生素抗性基因或任何其他关注的序列。
[0139] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是任何其他实施方案的实施方案)中,基于同源重组技术利用合适的整合载体或DNA片段,将所需酶的特定基因整合到LE1B109的基因组中,从而由LE1B109受体菌株产生用于制备特定酶的最终生产菌株。
[0140] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第五实施方案(其也是本发明的第一、第二、第三、第四和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中表达载体不携带抗生素抗性基因或任何其他的关注序列。
[0141] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第六实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中在第一方面的第一实施方案(第1项)的步骤(a)或第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(c)中加入合适的消泡剂。出于本发明的目的,选择这样的消泡剂,其符合制备酶产物的特定质量要求。具体地,在本发明的发明内容中,消泡剂在美国FDA于2003年9月11日致FTA的信中被列为可用于制备酶产物。出于本发明的目的,消泡剂可选自以下消泡剂:聚丙二醇(CAS登记号25322-69-4)、聚甘油聚乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(CAS登记号78041-14-2)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(CAS登记号9003-11-6)、聚丙二醇单丁醚(CAS登记号9003-13-8)、聚二甲基氧烷(CAS登记号63148-62-9;CAS登记号68083-18-1)、二氧化硅(CAS登记号7631-86-9;CAS登记号63231-67-4)、硬脂酸(CAS登记号57-11-4)、脱水山梨糖醇倍半油酸酯(CAS登记号8007-43-0)、甘油单硬脂酸酯(CAS登记号123-94-4)、聚山梨醇酯(聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯,例如聚山梨醇酯60(CAS登记号9005-67-8)、聚山梨醇酯65(CAS登记号9005-
71-4)和聚山梨醇酯80(CAS登记号9005-65-6))、菜籽油单甘油酯和双甘油酯(CAS登记号
93763-31-6)和白色矿物油(CAS登记号64742-47-8)。
[0142] 根据本发明,优选的沉淀剂是絮凝剂。优选地,例如在本发明的第一方面的第七实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中,优选在第一方面的第一实施方案(第1项)的步骤(a)或步骤(d)中,或优选在第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(c)或步骤(f)中加入一种或多种合适的絮凝剂。出于本发明的目的,选择这样的絮凝剂,其符合制备酶产物的特定质量要求。具体地说,在本发明的发明内容中,絮凝剂在美国FDA于2003年9月11日致FTA的信中被列为可用于制备酶产物。
[0143] 出于本发明的目的,絮凝剂选自以下:
[0144] a.阳离子聚胺基絮凝剂,包括二甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号25988-97-0)、甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号31568-35-1)、二甲胺-表氯醇-乙二胺三元共聚物(CAS登记号42751-79-1);和
[0145] b.阳离子聚丙烯酰胺基絮凝剂,包括通过与甲醛和二甲胺缩合而改性的聚丙烯酰胺(CAS登记号67953-80-4)、丙烯酰胺-丙烯酰氧乙基-三甲基-氯化铵共聚物(CAS登记号69418-26-4);和
[0146] c.阴离子聚胺基絮凝剂,包括丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(CAS登记号25987-30-8;CAS登记号9003-06-9);和
[0147] d.硫酸铵(CAS登记号10043-01-3);和
[0148] e.氯化钙(CAS登记号10035-04-8;CAS登记号10043-52-4)。
[0149] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第八实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中沉淀剂选自聚乙烯亚胺和聚二烯丙基二甲基氯化铵。
[0150] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第九实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中沉淀剂选自 781G、 C448、 C581G、C752、 SD-2081和聚乙烯亚胺
[0151] 在本发明的优选第一方面的或其任何实施方案的优选实施方案中,根据第一方面的第一实施方案(第1项)的步骤(b)或第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(d),从微生物宿主释放酶以提供组合物I是通过现有技术中已知的细胞破碎技术实现的,包括(仅用于举例说明)均质化、法式压榨(French press)、珠磨机、化学处理、酶处理、冻融循环或声波处理。
[0152] 在本发明的范围内,通过均质化得到的组合物I可以直接从发酵液获取。在本发明的范围内,在细胞破碎之前可以进一步加工发酵液,特别是可以将发酵液浓缩至更高的细胞密度(单位体积的细胞量)或者可以稀释至更低的细胞密度。然后可以对得到的“经浓缩的细胞”制剂或“经稀释的细胞”制剂进行细胞破碎,以得到本发明的组合物I。
[0153] 在本发明的范围内,通过本发明的细胞破碎技术获得的组合物I可以构成细胞匀浆,或源自这种细胞匀浆的任何其他部分纯化或完全纯化的无细胞制剂。
[0154] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十实施方案(其也是本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中加入核酸酶,该核酸酶选自核酸内切酶、核酸外切酶或核酸内切酶和核酸外切酶的混合物。优选地,核酸酶可以水解DNA、RNA或两者。优选地,核酸酶选自具有国际生物化学和分子生物学联合会赋予的以下EC编号的核酸酶:EC 3.1.11.2、EC 3.1.11.5、EC 3.1.11.6、EC 3.1.13.4、EC 3.1.14.1、EC 3.1.21.1、EC 3.1.21.2、EC 3.1.21.3、EC 
3.1.21.4、EC 3.1.21.6、EC 3.1.25.1、EC 3.1.26.3、EC 3.1.26.4、EC 3.1.26.5、EC 
3.1.26.8、EC 3.1.26.9、EC 3.1.26.11、EC 3.1.27.1、EC 3.1.27.3、EC 3.1.27.5、EC 
3.1.30.1、EC 3.1.30.2、EC 3.1.31.1,优选EC 3.1.30.2。
[0155] 现有技术中已知几种核酸酶,其可以从3'末端或5'末端或内部切割DNA和/或RNA分子,或者显示两种活性。出于本发明的目的,核酸酶能够在任何微滤和/或超滤处理之前有效地切割DNA/RNA。核酸的切割或分解应意指DNA或RNA多核苷酸的核苷酸单体之间的酯键的水解切割,导致形成缩短的多核苷酸,和/或任何长度的寡核苷酸,该长度低至三核苷酸、二核苷酸或单核苷酸大小。在本发明的范围内,多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的任何化学修饰,或它们中任何一种的组合。
[0156] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十一实施方案(其也是本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和任何其它的实施方案的实施方案)中,本发明涉及其中加入核酸酶的方法,其中核酸酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70%的同一性。可以利用针对本发明的核酸酶的抗体的免疫测定法检测本发明的核酸酶。例如,相应的ELISA试剂盒可从Merck商购获得。
[0157] 在本发明的范围内,根据本发明的核酸酶包含与本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有限定的同一性的氨基酸序列。这意味着本发明的核酸酶可以包含所述氨基酸序列作为其整体氨基酸序列的子序列,或者根据本发明的核酸酶可以基本上由所述氨基酸序列组成。当本发明的核酸酶包含所述氨基酸序列作为其整体氨基酸序列的子序列时,所述整体氨基酸序列可以延伸,即在所述子序列的N末端和/或C末端,可以包含其他氨基酸残基。当例如出于净化目的而将核酸酶固定在固体支持物上时,这种延伸可能是有利的。此外,这种延伸也可以在SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的成熟核酸酶的酶前体分子中发生,例如天然存在的或添加的信号肽序列或酶的前肽序列。特别地,本发明的核酸酶可以通过在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70%的同一性的氨基酸序列的N末端的添加一个氨基酸蛋氨酸而得到延伸,该蛋氨酸残基可以源自微生物宿主(例如大肠杆菌)中的相应核酸酶的重组表达,即SEQ ID NO:2。
[0158] 已知如何分别确定氨基酸残基聚合物的同一性和同源性。出于本发明的目的,同源性和同一性被理解为同义词。同一性百分比计算如下:序列同一性[%]=匹配数/L×100,其中L是对齐位(即相同位(identity)和不相同位(non-identity),包括空位,如果有的话)的数量。在本发明的含义中,优选使用BLASTP计算同一性(参见例如Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A. Jinghui Zhang,Zheng Zhang,
Webb Miller,and David J.Lipman(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new 
generation of protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-
3402;Stephen F.Altschul,John C.Wootton,E.Michael Gertz,Richa Agarwala,Aleksandr Morgulis,Alejandro A. and Yi-Kuo Yu(2005)“Protein database 
searches using compositionally adjusted substitution matrices.”FEBS J.272:
5101-5109),优选以下算法参数:矩阵:BLOSUM62;空位罚分(Gap Costs):存在:11,延伸:1,期望阈值:10,字长(word size):6。对结果进行过滤以获取查询覆盖率(query coverage)超过35%的序列。可以在NCBI主页上在线访问BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)。可以根据需要调整其他程序设置,例如使用以下设置:
[0159] -字段“输入查询序列”:查询子范围:无
[0160] -字段“选择搜索集”:数据库:非冗余蛋白序列(nr);可选参数:无
[0161] -字段“程序选择”:算法:blastp(蛋白-蛋白BLAST)
[0162] -算法参数:字段“一般参数”:最大靶序列:100-20000,优选20000;
[0163] 短查询:对于短的输入序列自动调整参数;期望阈值:10;字长:6;查询范围中的最大匹配数:0
[0164] -算法参数:字段“打分参数”:矩阵:BLOSUM62;空位罚分:存在:11,延伸:1;成分调整:条件成分得分矩阵调整
[0165] -算法参数:字段“过滤和屏蔽”:过滤:无;屏蔽:无。
[0166] 优选地,核酸酶包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少93.1%、至少93.2%、至少93.3%、至少93.4%、至少93.5%、至少93.6%、至少93.7%、至少93.8%、至少93.9%,更优选至少94%、至少94.1%、至少94.2%、至少94.3%、至少94.4%、至少94.5%、至少
94.6%、至少94.7%、至少94.8%、至少94.9%,还更优选至少95%、至少95.1%、至少
95.2%、至少95.3%、至少95.4%、至少95.5%、至少95.6%、至少95.7%、至少95.8%、至少
95.9%,还更优选至少96%、至少96.1%、至少96.2%、至少96.3%、至少96.4%、至少
96.5%、至少96.6%、至少96.7%、至少96.8%、至少96.9%,还更优选至少97%、至少
97.1%、至少97.2%、至少97.3%、至少97.4%、至少97.5%、至少97.6%、至少97.7%、至少
97.8%、至少97.9%,最优选至少98%、至少98.1%、至少98.2%、至少98.3%、至少98.4%、至少98.5%、至少98.6%、至少98.7%、至少98.8%、至少98.9%,特别是至少99%、至少
99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少
99.8%、至少99.9%的同一性的氨基酸序列。在优选的实施方案中,核酸酶包含基本上由本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的氨基酸序列。在优选的实施方案中,核酸酶由本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
[0167] 在一个优选的实施方案中,根据本发明的核酸酶是本发明的SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列与融合到N-末端和/或C-末端的任何其他氨基酸、寡肽或多肽构成的融合蛋白。最优选地,根据本发明的核酸酶是具有融合到N-末端的蛋氨酸的融合蛋白。
[0168] 下述情况在本发明的范围内:在计算延伸的氨基酸序列和非延伸的氨基酸序列之间的序列同一性时,不考虑本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的融合蛋白中的任何N-末端或C-末端氨基酸延伸,并且融合序列不应对使用本文描述的算法计算非融合蛋白和融合蛋白之间的序列同一性有贡献。
[0169] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十二实施方案(其也是本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中每毫升经处理的制剂(包括发酵液、细胞浓缩物、匀浆或本发明的任何其他制剂,优选组合物II)使用的核酸酶的量为大于1000U、大于900U、大于800U、大于700U、大于600U、大于500U、大于400U、大于300U、大于200U、大于100U、大于50U、大于40U、大于30U、大于20U、大于15U、大于10U、大于5U、大于3U、大于2U、大于1U、大于0.5U或大于0.1U;或0.1U-1000U、0.1U-900U、0.1U-800U、0.1U-700U、0.1U-600U、0.1U-500U、
0.1U-400U、0.1U-300U、0.1U-200U、0.1U-100U、0.1U-90U、0.1U-80U、0.1U-70U、0.1U-60U、
0.1U-50U、0.1U-40U、0.1U-30U、0.1U-20U、0.1U-19U、0.1U-18U、0.1U-17U、0.1U-16U、0.1U-
15U、0.1U-14U、0.1U-13U、0.1U-12U、0.1U-11U、0.1U-10U、0.1U-9U、0.1U-8U、0.1U-7U、
0.1U-6U、0.1U-5U、0.1U-4U、0.1U-3U、0.1U-2U、0.1U-1U,或5U-1000U、5U-900U、5U-800U、
5U-700U、5U-600U、5U-500U、5U-400U、5U-200U、5U-100U、5U-90U、5U-80U、5U-70U、5U-60U、
5U-50U、5U-40U、5U-30U、5U-20U、5U-19U、5U-18U、5U-17U、5U-16U、5U-15U、5U-14U、5U-13U、
5U-12U、5U-11U、5U-10U,或10U-1000U、10U-900U、10U-800U、10U-600U、10U-500U、10U-
400U、10U-300U、10U-200U、10U-100U、10U-90U、10U-80U、10U-70U、10U-60U、10U-50U,或
50U-1000U、50U-900U、50U-800U、50U-700U、50U-600U、50U-500U、50U-400U、50U-300U、50U-
200U、50U-150U,或每毫升制剂100U。
[0170] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是第一方面的任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中基于本文中经处理的每克生物质当量,优选基于本文中的发酵液、细胞浓缩物、匀浆或任何其他制剂且优选组合物II的每克生物质当量,所使用的核酸酶的量为大于2000U、大于1900U、大于1800U、大于1700U、大于1600U、大于1500U、大于1400U、大于1300U、大于1200U、大于1100U、大于1000U、大于900U、大于800U、大于700U、大于600U、大于500U、大于400U、大于350U、大于300U、大于250U、大于200U、大于
150U、大于100U、大于50U、大于25U、大于10U、大于5U、大于3U、大于2U、大于1U、大于0.5U或大于0.1U;或0.1U-2000U、0.1U-1900U、0.1U-1800U、0.1U-1700U、0.1U-1600U、0.1U-1500U、
0.1U-1400U、0.1U-1300U、0.1U-1200U、0.1U-1100U、0.1U-1000U、0.1U-900U、0.1U-800U、
0.1U-700U、0.1U-600U、0.1U-500U、0.1U-400U、0.1U-350U、0.1U-300U;或5U-2000U、5U-
1900U、5U-1800U、5U-1700U、5U-1600U、5U-1500U、5U-1400U、5U-1300U、5U-1200U、5U-
1100U、5U-1000U、5U-900U、5U-800U、5U-600U、5U-600U、5U-500U、5U-400U、5U-350U、5U-
300U;或10U-2000U、10U-1900U、10U-1800U、10U-1600U、10U-1500U、10U-1400U、10U-1300U、
10U-1200U、10U-10U-1100U、10U-1000U、10U-900U、10U-700U、10U-600U、10U-500U、10U-
500U、10U-400U、10U-350U、10U-300U;或50U-2000U、50U-1900U、50U-1800U、50U-1700U、
50U-1600U、50U-1500U、50U-1400U、50U-1300U、50U-1200U、50U-1100U、50U-1000U、50U-
900U、50U-800U、50U-700U、50U-600U、50U-500U、50U-400U、50U-350U、50U-300U;优选100U-
300U、120U-300U、150U-300U、200U-300U,最优选220U-280U,最优选250U/克生物质当量。
[0171] 出于本发明的目的,“生物质当量”是指最初从发酵液收集的、作为“生物湿物质”的、收获的生物质的以克计的量,以及包含在任何匀浆、无细胞制剂或源自这种最初收集的收获的生物质的任何其他部分纯化或完全纯化的制剂中的、来自这种收获的生物质的以克计的相应当量,而不必考虑这种发酵液、匀浆、无细胞制剂或其他制剂的特定体积,并且不必考虑这种发酵液、匀浆、无细胞制剂或其它制剂是稀释的、浓缩的或既不是稀释的也不是浓缩的。本发明意义上的“生物湿物质”是指细胞的克重,该细胞被从发酵液中沉淀出来并从上清液中分离,但没有对这种沉淀的细胞进行任何特定干燥。为了澄清的目的:测得的生物湿物质为200g/L发酵液的发酵液可以3倍浓缩至生物质当量为600g/L的细胞浓缩物用于细胞均质,然后获得的匀浆可稀释1.5倍至生物质当量为400g/L的匀浆,用于用核酸酶处理。
[0172] 出于本发明的目的,U表示单位。1核酸酶单位被定义为在50mM Tris HCl、1mM MgCl2、0.1mg/ml BSA、1mg/ml DNA中,在pH 8.0和37℃的温度下,在30分钟内可从鲑鱼精子DNA中释放出1μmol酸溶性寡糖(相当于使Δ260nm为1)的核酸酶的量。
[0173] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十三实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第八、第九、第十、第十一、第十二和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中对应于第一方面的第一实施方案(第1项)的步骤(f)或步骤(v)和根据第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(h)的微滤步骤,涉及基于膜的或基于过滤器的方法,或用于液体的粒度依赖性分离的其他合适的方法。在本发明的范围内,使用的膜的特征在于其尺寸排阻极限大于1000kDa、大于500kDa、大于400kDa、大于300kDa、大于200kDa、大于150kDa、大于100kDa、大于90kDa、大于80kDa、大于70kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa、大于20kDa、大于10kDa或者大于5kDa,和/或使用具有等效分子量排阻特性的过滤器,优选深层过滤器,其中在微滤步骤的滤液中获得重组酶产物。出于本发明的目的,kDa表示千道尔顿。
[0174] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十四实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中对应于第一方面的第一实施方案(第1项)的步骤(f)或步骤(v)和根据第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(h)的微滤步骤涉及基于膜的或基于过滤器的方法、或用于液体的粒度依赖性分离的其他合适的方法。在本发明的范围内,使用的膜的尺寸排阻极限大于5μm、大于4μm、大于3μm、大于2μm、大于1μm、大于0.5μm、大于0.4μm、大于0.3μm、大于0.2μm或大于0.1μm,和/或使用具有等效尺寸排阻特性的过滤器,优选深层过滤器,其中在微滤步骤的滤液中获得重组酶产物。
[0175] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十五实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中在对应于第一实施方案(第1项)的步骤(f)或(v)和对应于第二实施方案(第2项)的步骤(h)的微滤步骤之后,任选地应用另外的超滤步骤,其中超滤涉及基于膜的或基于过滤器的方法,或用于液体的粒度依赖性分离的其他合适的方法。在本发明的范围内,使用的膜的尺寸排阻极限大于100kDa、大于80kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa、大于20kDa、大于15kDa、大于10kDa、大于5kDa或大于1kDa,和/或使用具有等效分子量排阻特性的过滤器,优选深层过滤器,其中在超滤步骤的保留物中获得重组酶产物。
[0176] 优选地,本发明涉及一种方法,其中在对应于第一实施方案(第1项)的步骤(f)或(v)和根据第一方面(第2项)的第二实施方案的步骤(h)的微滤步骤之后,任选地应用另外的超滤步骤,其中超滤步骤涉及基于膜的或基于过滤器的方法,或用于液体的粒度依赖性分离的其他合适的方法。在本发明的范围内,使用的膜的尺寸排阻极限大于0.1μm、大于0.09μm、大于0.08μm、大于0.07μm、大于0.06μm、大于0.05μm、大于0.04μm、大于0.03μm、大于
0.02μm或大于0.01μm,和/或使用具有等效尺寸排阻特性的过滤器,优选深层过滤器,其中在微滤步骤的滤液中获得重组酶产物。
[0177] 优选地,对于对应于第一实施方案(第1项)的步骤(f)或(v)和根据第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(h)的微滤步骤,和/或任选的超滤步骤,可以使用现有技术中已知的过滤方法。
[0178] 过滤方法包括基于膜的或基于过滤器的技术,包括例如切向流过滤、错流过滤、中空纤维过滤、具有合适的过滤器或膜材料的压滤机。微滤通常包括尺寸排阻截止范围大于0.1μm(>0.1μm)的过滤,而超滤通常包括尺寸排阻截止范围小于0.1μm(<0.1μm)的过滤。
[0179] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十六实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中对应于第一实施方案(第1项)的步骤(e)或(iv)和根据第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(g)的固/液分离步骤,通过离心、流动离心、压滤机、过滤方法和/或任何其他适用于部分或完全分离液相和固相的技术来实现。基于要在该步骤中处理的体积规模来选择方法。
[0180] 优选地,对应于第一实施方案(第1项)的步骤(e)或(iv)和根据第一方面的第二实施方案(第2项)的步骤(g)的方法的固/液分离步骤,在对应于本发明的第一实施方案的步骤(d)或(iii)和根据第一方面的第二实施方案的步骤(f)的沉淀剂添加步骤之后发生。
[0181] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十七实施方案(其也是本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中表达至少5种、优选至少4种、更优选至少3种、还更优选至少2种、最优选至少1种细胞内蛋白。
[0182] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十八实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中由生产菌株表达的一种或多种重组酶单独或共同构成酶产物的总蛋白含量的至少50%,优选至少40%,更优选至少30%,更优选至少20%,还更优选至少10%,还更优选至少5%,还更优选至少1%,和最优选至少0.1%。
[0183] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第十九实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中酶产物是食品酶。出于本发明的目的,食品酶是指添加到食物中的酶,其用作制备或加工食物的加工剂,或者用于下游酶促转化以制备食物成分。对于食品酶,已经定义了制备质量标准,要求符合某些规范,包括例如食品化学品或等同的国际食品或药典标准中规定的规格和推荐的纯度标准[例如,JECFA、食品化学法典(FCC)、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)],用于食品的cGMP和/或关键控制点危害分析原则(HACCP)。
[0184] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第二十实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九以及任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中酶产物选自下组:氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶、优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。这些类别的酶在现有技术中得到了充分的描述,例如在专利申请WO2008/151807、WO2012/048865、WO2015/162064、WO2016/198660或WO2016/198665的序列ID号(SEQ ID NO)中,这些序列ID号被引入本文作为本发明内容的参考。
[0185] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第二十一实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九和第二十实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中酶产物选自下组:
[0186] a.碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;
[0187] b.氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和[0188] c.脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0189] 出于本发明的目的,碳水化合物修饰酶是在底物上发挥其催化活性的酶,该底物(i)是碳水化合物或碳水化合物衍生物或(ii)可伴随酶的催化活性形成碳水化合物或碳水化合物衍生物产物。碳水化合物修饰酶是食品工业中非常有用的酶。例如,它们可用于在下游酶转化中合成碳水化合物食物成分。
[0190] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第二十二实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一以及任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中酶产物是一种碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0191] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第二十三实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中微生物生产宿主通过缺失一个或多个选自下组的其他基因进行修饰:例如,编码酶的基因,优选大肠杆菌酶、磷酸葡萄糖变位酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸磷酸酶、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、纤维素合成酶(UDP形成)、α,α-海藻糖-磷酸合成酶(UDP形成)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-糖二磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、脂多糖N-乙酰甘露糖氨基醛酸基转移酶、脂质-A-二糖合成酶、十一异戊烯-二磷酸-胞壁酰五肽β-N-乙酰葡糖胺基转移酶、十一异戊烯-磷酸-4-脱氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、尿苷激酶、UMP激酶、核苷-二磷酸激酶、多核糖核苷酸核苷酸转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶(非水解)、β-半乳糖苷酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰转移酶。
[0192] 重组酶的粗酶制剂可能含有来自生产宿主代谢的酶的副活性。对于碳水化合物修饰酶,这种干扰副酶活性可以源自碳水化合物代谢,对于需要与核苷酸单磷酸基、二磷酸基或三磷酸基(例如腺嘌呤苷酸、尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸的)连接的活化的碳水化合物部分的酶,这种干扰副酶活性可以源自碳水化合物和/或核苷酸代谢。在一个优选的实施方案中,通过基因工程或DNA编辑方法使来自宿主的相应碳水化合物修饰酶基因缺失或失活。这种基因缺失或失活可以包括一种或多种选自下述的基因:例如编码酶的基因,优选大肠杆菌酶、磷酸葡萄糖变位酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸磷酸酶、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、纤维素合成酶(UDP形成)、α,α-海藻糖-磷酸合成酶(UDP形成)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-糖二磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、脂多糖N-乙酰甘露糖氨基醛酸基转移酶、脂质-A-二糖合成酶、十一异戊烯-二磷酸-胞壁酰五肽β-N-乙酰葡糖胺基转移酶、十一异戊烯-磷酸-4-脱氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、尿苷激酶、UMP激酶、核苷-二磷酸激酶、多核糖核苷酸核苷酸转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶(非水解)、β-半乳糖苷酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰转移酶。
[0193] 优选地,例如,在本发明的第一方面的第二十四实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种方法,其中,所述方法包括以下步骤:
[0194] a.用核酸酶处理含有重组酶产物的细胞破碎粗溶解产物,从而得到包含重组酶产物、分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物II;
[0195] b.向复合的核酸中加入沉淀剂,从而得到包含酶产物、复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的组合物III;
[0196] c.进行液/固分离以从液相中除去细胞碎片和核酸/沉淀剂复合物,从而得到包含复合的分解的核酸和任选的细胞碎片的分离的固相,和包含酶产物的液体组合物IV;和[0197] d.进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分,从而得到包含酶产物的组合物V。
[0198] 在另一个实施方案中,本发明涉及制备重组酶制剂的方法,其中在步骤(iv)中的固/液分离之后,分离的固相主要包含源自组合物III的复合的分解的核酸、任选的细胞碎片以及任选的酶产物的残余物;并且其中所获得的分离的液相,特别是组合物IV,主要包含源自组合物III的酶产物、任选的细胞碎片残余物和复合的分解的核酸。
[0199] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是第一方面的任何前述实施方案的实施方案)中,该方法的特征在于:
[0200] a.与组合物I相比,组合物V中的核酸含量降低;和/或
[0201] b.与组合物I相比,组合物V中的酶产物的催化活性恢复。
[0202] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是本发明的任何前述实施方案的实施方案)中,该方法的特征在于,与组合物I相比,组合物V或任选的组合物VI中核酸含量降低的倍数(factor)为2至1亿、2至5000万、2至3000万、2至2000万、2至1500万、2至1000万、100至1亿、100至5000万、100至3000万、100至2000万、100至1500万、100至1000万、1000至1亿、1000至5000万、1000至3000万、1000至2000万、1000至1500万、1000至1000万、1万至1亿、
1万至5000万、1万至3000万、1万至2000万、1万至1500万、1万至1000万、10万至1亿、10万至
5000万、10万至3000万、10万至2000万、10万至1500万、10万至1000万、1百万至1亿、1百万至
5000万、1百万至3000万、1百万至2000万、1百万至1500万、1百万至1000万。
[0203] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是本发明任何前述实施方案中的一个实施方案)中,该方法的特征在于酶产物、组合物V或任选的组合物VI中的核酸含量,该含量的特征在于,分别相对于直接酶产物、组合物V或组合物VI,或由它们衍生的任何液体、冻干或稳定的制剂,每一酶产物或每一组合物V或每一组合物VI的DNA浓度为0.01ng/g-50ng/g、0.01ng/g-40ng/g、0.01ng/g-30ng/g、0.01ng/g-20ng/g、0.01ng/g-10ng/g、0.01ng/g-9ng/g、0.01ng/g-8ng/g、0.01ng/g-7ng/g、0.01ng/g-6ng/g、0.01ng/g-5ng/g、0.01ng/g-
4ng/g、0.01ng/g-3ng/g、0.01ng/g-2ng/g、0.01ng/g-1ng/g,优选0.01ng/g-0.9ng/g、
0.01ng/g-0.8ng/g、0.01ng/g-0.7ng/g、0.01ng/g-0.6ng/g、0.01ng/g-0.5ng/g、0.01ng/g-
0.4ng/g、0.01ng/g-0.3ng/g、0.01ng/g-0.2ng/g、0.01ng/g-0.1ng/g,或优选0.001ng/g-
50ng/g、0.001ng/g-40ng/g、0.001ng/g-30ng/g、0.001ng/g-20ng/g、0.001ng/g-10ng/g、
0.001ng/g-9ng/g、0.001ng/g-8ng/g、0.001ng/g-7ng/g、0.001ng/g-6ng/g、0.001ng/g-
5ng/g、0.001ng/g-4ng/g、0.001ng/g-3ng/g、0.001ng/g-2ng/g、0.001ng/g-1ng/g,优选
0.001ng/g-0.9ng/g、0.001ng/g-0.8ng/g、0.001ng/g-0.7ng/g、0.001ng/g-0.6ng/g、
0.001ng/g-0.5ng/g、0.001ng/g-0.4ng/g、0.001ng/g-0.3ng/g、0.001ng/g-0.2ng/g、
0.001ng/g-0.1ng/g,或更优选0ng/g-50ng/g、0ng/g-40ng/g、0ng/g-30ng/g、0ng/g-20ng/g、0ng/g-10ng/g、0ng/g-9ng/g、0ng/g-8ng/g、0ng/g-7ng/g、0ng/g-6ng/g、0ng/g-5ng/g、
0ng/g-4ng/g、0ng/g-3ng/g、0ng/g-2ng/g、0ng/g-1ng,更优选0ng/g-0.9ng/g、0ng/g-
0.8ng/g、0ng/g-0.7ng/g、0ng/g-0.6ng/g、0ng/g-0.5ng/g、0ng/g-0.4ng/g、0ng/g-0.3ng/g、0ng/g-0.2ng/g或0ng/g-0.1ng/g,最优选0ng/g-0.09ng/g、0ng/g-0.08ng/g、0ng/g-
0.07ng/g、0ng/g-0.06ng/g、0ng/g-0.05ng/g、0ng/g-0.04ng/g、0ng/g-0.03ng/g、0ng/g-
0.02ng/g、0ng/g-0.01ng/g,最优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g,。
[0204] 在本发明的第一方面的优选的实施方案(其也是本发明的任何前述实施方案的实施方案)中,该方法的特征在于,与组合物I相比,在组合物V中或任选的组合物VI中的酶产物的催化活性恢复的比率为至少1%-100%、至少5%-100%、至少10%-100%、至少15%-100%、至少20%-100%、至少25%-100%、至少30%-100%、至少35%-100%、至少40%-
100%、至少45%-100%、至少50%-100%、至少55%-100%、至少60%-100%、至少65%-
100%、至少70%-100%、至少75%-100%、至少80%-100%、至少85%-100%、至少90%-
100%、至少95%-100%或至少96%-100%、至少97%-100%、至少98%-100%、至少99%-
100%,更优选至少25%-99%、至少30%-99%、至少35%-99%、至少40%-99%、至少45%-
99%、至少50%-99%、至少55%-99%、至少60%-99%、至少65%-99%、至少70%-99%、至少75%-99%、至少80%-99%、至少85%-99%、至少90%-99%、至少95%-99%或至少
96%-99%、至少97%-99%、至少98%-99%,还更优选至少25%-95%、至少30%-95%、至少35%-95%、至少40%-95%、至少45%-95%、至少50%-95%、至少55%-95%、至少60%-
95%、至少65%-95%、至少70%-95%、至少75%-95%、至少80%-95%、至少85%-95%、至少90%-95%,还更优选至少50%-90%、至少55%-90%、至少60%-90%、至少65%-90%、至少70%-90%、至少75%-90%、至少80%-90%、至少85%-90%,还更优选至少55%-
85%、至少60%-85%、至少65%-85%、至少70%-85%、至少75%-85%、至少80%-85%,最优选至少60%-80%、至少65%-80%、至少70%-80%、至少75%-80%。
[0205] 本发明还涉及可通过本发明方法获得的重组酶制剂。
[0206] 优选地,制剂的特征在于残留的DNA浓度为0ng/g-50ng/g、0ng/g-40ng/g、0ng/g-30ng/g、0ng/g-20ng/g、0ng/g-10ng/g、0ng/g-9ng/g、0ng/g-8ng/g、0ng/g-8ng/g、0ng/g-
7ng/g、0ng/g-6ng/g、0ng/g-5ng/g、0ng/g-4ng/g、0ng/g-3ng/g、0ng/g-2ng/g、0ng/g-1ng/g,优选0ng/g-0.9ng/g、0ng/g-0.8ng/g、0ng/g-0.7ng/g、0ng/g-0.6ng/g、0ng/g-0.5ng/g、
0ng/g-0.4ng/g、0ng/g-0.3ng/g、0ng/g-0.2ng/g和0ng/g-0.1ng/g,或更优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g。
[0207] 在本发明的第二方面,本发明涉及酶产物的制剂,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案制备。
[0208] 优选地,例如,在本发明的第二方面的第一实施方案中,本发明涉及酶产物的制剂,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案制备,其特征在于,相对于直接酶产物、组合物V或组合物VI,或由它们衍生的任何液体、冻干和稳定的制剂,酶产物或组合物V或组合物VI中的残留的DNA浓度为0.01ng/g-50ng/g、0.01ng/g-40ng/g、0.01ng/g-30ng/g、0.01ng/g-20ng/g、0.01ng/g-10ng/g、0.01ng/g-9ng/g、0.01ng/g-8ng/g、0.01ng/g-7ng/g、0.01ng/g-6ng/g、0.01ng/g-5ng/g、0.01ng/g-4ng/g、0.01ng/g-3ng/g、
0.01ng/g-2ng/g、0.01ng/g-1ng/g,优选0.01ng/g-0.9ng/g、0.01ng/g-0.8ng/g、0.01ng/g-
0.7ng/g、0.01ng/g-0.6ng/g、0.01ng/g-0.5ng/g、0.01ng/g-0.4ng/g、0.01ng/g-0.3ng/g、
0.01ng/g-0.2ng/g、0.01ng/g-0.1ng/g,或更优选0.001ng/g-50ng/g、0.001ng/g-40ng/g、
0.001ng/g-30ng/g、0.001ng/g-20ng/g、0.001ng/g-10ng/g、0.001ng/g-9ng/g、0.001ng/g-
8ng/g、0.001ng/g-7ng/g、0.001ng/g-6ng/g、0.001ng/g-5ng/g、0.001ng/g-4ng/g、
0.001ng/g-3ng/g、0.001ng/g-2ng/g、0.001ng/g-1ng/g,优选0.001ng/g-0.9ng/g、
0.001ng/g-0.8ng/g、0.001ng/g-0.7ng/g、0.001ng/g-0.6ng/g、0.001ng/g-0.5ng/g、
0.001ng/g-0.4ng/g、0.001ng/g-0.3ng/g、0.001ng/g-0.2ng/g、0.001ng/g-0.1ng/g,或还更优选0ng/g-50ng/g、0ng/g-40ng/g、0ng/g-30ng/g、0ng/g-20ng/g、0ng/g-10ng/g、0ng/g-
9ng/g、0ng/g-8ng/g、0ng/g-7ng/g、0ng/g-6ng/g、0ng/g-5ng/g、0ng/g-4ng/g、0ng/g-3ng/g、0ng/g-2ng/g、0ng/g-1ng/g,优选0ng/g-0.9ng/g、0ng/g-0.8ng/g、0ng/g-0.7ng/g、0ng/g-0.6ng/g、0ng/g-0.5ng/g、0ng/g-0.4ng/g、0ng/g-0.3ng/g、0ng/g-0.2ng/g、0ng/g-
0.1ng/g,或最优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g。
[0209] 出于本发明的目的,重组DNA浓度通过基于聚合酶链式反应(PCR)的代表性DNA片段扩增的方法测定,所述代表性DNA片段包含至少50-5000个碱基对,或至少100-5000个碱基对,或至少1000-5000个碱基对,或完整的酶基因序列的长度的重组DNA。使用源自生产宿主的总DNA制剂进行校准。标准PCR技术,包括实时PCR,可用于测定重组DNA浓度,其中PCR引物可针对微生物宿主DNA和/或表达载体DNA。
[0210] 产物或制剂中残留的DNA的浓度可以进一步通过现有技术中确立的方法测定。例如,对于食品酶制剂,在EFSA Journal 2011;9(6):2193中或EFSA未来可能发布的任何更新文献中描述了可能实现的方法。
[0211] 在本发明的范围内,本发明的残留的DNA浓度通过使用选自或基于[EFSA Journal 2011;9(6):2193]的指导的方法来测定,该文献通过引用并入本文。
[0212] 本发明的第二方面的优选的实施方案或第二方面的任何实施方案,涉及酶产物的制剂,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案来制备,其中酶产物可以通过在酶产物的制剂中不存在DNA片段而区别于其他制剂。
[0213] 优选地,例如,在本发明的第二方面的第二实施方案(其也是第二方面的第一和任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及酶产物的制备,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案来制备,其中酶产物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶、优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
[0214] 优选地,例如,在本发明的第二方面的第三实施方案(其也是第二方面的第一、第二以及任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及酶产物的制剂,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案来制备,其中酶产物选自由以下组成的组:
[0215] a.碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;
[0216] b.氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和[0217] c.脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0218] 优选地,例如,在本发明的第二方面的第四实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三和任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及酶产物的制剂,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案来制备,其中酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0219] 优选地,本发明涉及酶产物的制剂,其根据本发明的第一方面或本发明的第一方面的任何实施方案来制备,其中酶产物是糖基转移酶,即UDP-糖基转移酶(2.4.1.X),或蔗糖合成酶(EC 2.4.1.13)。优选地,酶产物是已知的野生型酶或通过酶工程技术由其衍生的任何改良变体。
[0220] 在本发明的范围内,通过使用本发明的方法制备的酶产物可以是已知的野生型酶或通过酶工程技术由其衍生的任何改良变体。
[0221] 本发明还涉及制备酶制剂的方法,其包括以下步骤:
[0222] A)提供大肠杆菌菌株;
[0223] B)任选地,添加营养培养基;
[0224] C)进行发酵,从而获得发酵液;
[0225] D)任选地,对所述发酵液进行固/液分离,从而获得生物质;
[0226] E)任选地,进行均质化;
[0227] F)用核酸酶进行处理,任选地随后加入沉淀剂;
[0228] G)进行固/液分离,从而获得上清液;和
[0229] H)任选地,进行过滤从而获得酶制剂。
[0230] 在本发明的第三方面,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂。
[0231] 优选地,例如,在本发明的第三方面的第一个实施方案中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂含有小于50ng/g的重组DNA浓度,其中酶制剂含有生产宿主的至少1种不同的细胞内宿主细胞蛋白,其占酶制剂的总蛋白含量的至少0.1%。
[0232] 在本发明的第三方面的优选的实施方案(其也是第一方面的第一实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂包含的重组DNA浓度为小于50ng/g、小于40ng/g、小于30ng/g、小于20ng/g、小于10ng/g、小于5ng/g、小于1ng/g,优选小于0.5ng/ml、小于0.4ng/ml、小于0.3ng/ml、小于0.2ng/ml、小于0.1ng/ml,最优选小于0.09ng/ml、小于0.08ng/ml、小于0.07ng/ml、小于0.06ng/ml、小于0.05ng/ml、小于0.04ng/ml、小于0.03ng/ml、小于0.02ng/ml、小于0.01ng/ml,最优选为0ng/ml。
[0233] 在本发明的第三方面的优选的实施方案(其也是第一方面的第一实施方案和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂含有至少1种或更多种,至少2种或更多种,至少3种或更多种,至少4种或更多种,或至少5种或更多种不同的细胞内宿主细胞蛋白,并且优选含有1、2、3、4或5种不同的细胞内宿主细胞蛋白。
[0234] 在本发明的第三方面的优选的实施方案(其也是第一方面的第一实施方案和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂含有至少1种或更多种不同的细胞内宿主细胞蛋白,其占酶制剂的总蛋白含量的至少0.1%、至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。
[0235] 在本发明的第三方面的优选的实施方案(其也是第一方面的第一实施方案和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂含有小于50ng/g的重组DNA浓度,其中酶制剂含有生产宿主的至少3种不同的细胞内宿主细胞蛋白,其占酶制剂的总蛋白含量的至少10%。
[0236] 优选地,例如,在本发明的第三方面的第二实施方案(其也是第三方面的第一或任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂在生产宿主大肠杆菌中制备。
[0237] 优选地,例如,在本发明的第三方面的第三实施方案(其也是第三方面的第一、第二以及任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂含有表达的酶产物,此外还含有可检测量的核酸酶,所述核酸酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸酶具有至少70%的同一性。
[0238] 在本发明的第三方面的优选的实施方案中,或第三方面的任何实施方案中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂可以通过在酶产物中不存在DNA片段而区别于其他酶制剂。
[0239] 优选地,例如,在本发明的第三方面的第四实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三以及任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及重组细胞内表达的酶的酶制剂,其中酶制剂选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶、优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
[0240] 优选地,例如,在本发明的第三方面的第五实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四和任何其它实施方案的实施方案)中,本发明涉及酶制剂,其中酶制剂选自由以下组成的组:
[0241] a.碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;
[0242] b.氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和[0243] c.脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0244] 优选地,例如,在本发明的第三方面的第六实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五和任何其他实施方案的实施方案)中,本发明涉及一种酶制剂,其中重组酶产物是一种碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0245] 本发明的进一步优选的实施方案及它们彼此的组合在下文中概述为第1项至第32项:
[0246] 第1项:制备食品级酶产物的方法,其包括以下步骤:a.)在微生物宿主中细胞内表达重组酶;b.)通过细胞破碎释放重组酶,得到粗溶解产物;c.)添加核酸酶以分解含有酶产物的处理溶液中的核酸,得到经酶处理的溶解产物;d.)加入沉淀剂以与核酸复合,得到复合的溶解产物;e.)进行液/固分离以从液相中除去细胞碎片和核酸/沉淀剂复合物,得到澄清的溶解产物;f.)进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分,得到滤液;优选地,其中在液/固分离步骤e.)之后和/或在微滤步骤f.)之后,所述方法不涉及用核酸酶分别处理粗溶解产物或滤液。
[0247] 第2项:制备重组酶产物的方法,其特征在于包括以下一个或多个步骤:a.)将酶产物基因克隆到表达载体中;b.)将携带酶产物基因的表达载体导入微生物宿主中;c.)在重组酶产物的细胞内表达条件下使步骤b.)的微生物宿主进行发酵;d.)通过细胞破碎破坏步骤c.)的经发酵的细胞以释放出重组酶产物,得到含有重组酶产物的粗溶解产物;e.)将澄清的溶解产物与核酸酶一起温育,以使澄清的溶解产物中的核酸分解,得到经酶处理的溶解产物;f.)向溶解产物中加入沉淀剂以形成核酸复合物,得到含有重组酶产物的复合的溶解产物;g.)对复合的溶解产物进行液体和/或固体分离,以从液相中除去细胞碎片以及核酸和沉淀剂的复合物,得到含有重组酶产物的澄清的溶解产物;h.)对经酶处理的溶解产物进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分;优选地,其中在液/固分离步骤g.)之后,和/或在微滤步骤h.)之后,所述方法不涉及用核酸酶分别处理粗溶解产物或滤液。
[0248] 第3项:根据第1或2中任一项所述的方法,其中微生物宿主是大肠杆菌(Escherichia coli),优选实验室菌株大肠杆菌K-12W3110的基因修饰的衍生菌株,最优选LE1B109。
[0249] 第4项:根据第1-3项中任一项所述的方法,其中表达载体基于载体pRSF-1b。
[0250] 第5项:根据第1-4项中任一项所述的方法,其中表达载体不携带抗生素抗性基因。
[0251] 第6项:根据第1-5项中任一项所述的方法,其中在第1项的步骤(a)或第2项的步骤(c)中添加合适的消泡剂,其中所述消泡剂选自由以下消泡剂组成的组:聚丙二醇(CAS登记号25322-69-4)、聚甘油聚乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(CAS登记号78041-14-2)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(CAS登记号9003-11-6)、聚丙二醇单丁醚(CAS登记号9003-13-8)、聚二甲基硅氧烷(CAS登记号63148-62-9;CAS登记号68083-18-1)、二氧化硅(CAS登记号7631-86-9;CAS登记号63231-67-4)、硬脂酸(CAS登记号57-11-4)、脱水山梨糖醇倍半油酸酯(CAS登记号8007-43-0)、甘油单硬脂酸酯(CAS登记号123-94-4)、聚山梨醇酯(聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯,例如聚山梨醇酯60(CAS登记号9005-67-8)、聚山梨醇酯65(CAS登记号9005-
71-4)和聚山梨醇酯80(CAS登记号9005-65-6))、菜籽油单甘油酯和双甘油酯(CAS登记号
93763-31-6)和白色矿物油(CAS登记号64742-47-8)。
[0252] 第7项:根据第1-6项中任一项所述的方法,其中在第1项的步骤(d)或第2项的步骤(f)中添加一种或多种合适的絮凝剂,其中絮凝剂是选自由以下絮凝剂组成的组:a.)阳离子聚胺基絮凝剂,包括二甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号25988-97-0)、甲胺-表氯醇共聚物(CAS登记号31568-35-1)、二甲胺-表氯醇-乙二胺三元共聚物(CAS登记号42751-79-1);b.)阳离子聚丙烯酰胺基絮凝剂,包括通过与甲醛和二甲胺缩合而改性的聚丙烯酰胺(CAS登记号67953-80-4)、丙烯酰胺-丙烯酰氧乙基-三甲基-氯化铵共聚物(CAS登记号69418-26-4);c.)阴离子聚胺基絮凝剂,包括丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(CAS登记号25987-30-8;CAS登记号
9003-06-9);d.)硫酸铵(CAS登记号10043-01-3);e.)氯化钙(CAS登记号10035-04-8;CAS登记号10043-52-4)。
[0253] 第8项:根据第1-7项中任一项所述的方法,其中沉淀剂选自聚乙烯亚胺和聚二烯丙基二甲基氯化铵。
[0254] 第9项:根据第1-8项中任一项所述的方法,其中沉淀剂选自由以下沉淀剂组成的组: 781G、 C448、 C581G、 C752、SD-2081和聚乙烯亚胺
[0255] 第10项:根据第1-9项中任一项所述的方法,其中所用的核酸酶选自核酸内切酶、核酸外切酶或混合的核酸外切酶/核酸内切酶。
[0256] 第11项:根据第1-10项中任一项所述的方法,其中所用的功能活性核酸酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
[0257] 第12项:根据第1-11项中任一项所述的方法,其中每ml的发酵液使用的核酸酶的量大于200U、大于100U、大于50U、大于40U、大于30U、大于20U、大于15U、大于10U、大于5U、大于3U、大于2U、大于1U、大于0.5U或大于0.1U。
[0258] 第13项:根据第1-12项中任一项所述的方法,其中对于对应于第1项的步骤(f)和根据第2项的步骤(h)的微滤步骤,使用了膜,其特征在于所述膜的尺寸排阻极限为大于1000kDa、大于500kDa、大于400kDa、大于300kDa、大于200kDa、大于150kDa、大于100kDa、大于90kDa、大于80kDa、大于70kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa或大于
20kDa,其中在所述微滤步骤的滤液中获得所述重组酶产物。
[0259] 第14项:根据第1-13项中任一项所述的方法,其中对于对应于第1项的步骤(f)和根据第2项的步骤(h)的微滤步骤,所使用的膜的尺寸排阻极限为大于5μm、大于4μm、大于3μm、大于2μm、大于1μm、大于0.5μm、大于0.4μm、大于0.3μm、大于0.2μm或大于0.1μm,其中在所述微滤步骤的滤液中获得所述重组酶产物。
[0260] 第15项:根据第1-14项中任一项所述的方法,其中在对应于第1项的步骤(f)和根据第2项的步骤(h)的微滤步骤之后,任选地,应用另外的超滤步骤,其特征在于,使用具有大于100kDa、大于80kDa、大于60kDa、大于50kDa、大于40kDa、大于30kDa、大于20kDa、大于15kDa、大于10kDa、大于5kDa或大于1kDa的尺寸排阻极限的膜,其中在所述超滤步骤的保留物中获得所述重组酶产物。
[0261] 第16项:根据第1-15项中任一项所述的方法,其中对应于第1项的步骤(e)和根据第2项的步骤(g)的固/液分离步骤通过离心、压滤机和/或微滤技术实现。
[0262] 第17项:根据第1-16项中任一项所述的方法,其中表达至少5种、优选至少4种、更优选至少3种、还更优选至少2种、最优选至少1种细胞内蛋白。
[0263] 第18项:根据第1-17项中任一项所述的方法,其中由生产菌株表达的一种或多种重组酶单独或共同构成所述酶产物的总蛋白含量的至少50%,优选至少40%,更优选至少30%,还更优选至少20%,最优选至少10%。
[0264] 第19项:第1-18项中任一项所述的方法,其中酶产物是食品酶。
[0265] 第20项:第1-19项中任一项所述的方法,其中酶产物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
[0266] 第21项:第1-20项中任一项所述的方法,其中酶产物选自:a.)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;b.)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和c.)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0267] 第22项:第1-21项中任一项所述的方法,其中酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0268] 第23项:第1-22项中任一项所述的方法,其中通过缺失选自例如编码所述酶的基因中的一种或多种其他基因对所述微生物生产宿主进行修饰,所述酶优选大肠杆菌酶、磷酸葡萄糖变位酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸磷酸酶、UDP-葡萄糖-6-脱氢酶、纤维素合成酶(UDP形成)、α,α-海藻糖-磷酸合成酶(UDP形成)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-糖二磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、核糖核苷-二磷酸还原酶、脂多糖N-乙酰甘露糖氨基醛酸基转移酶、脂质-A-二糖合成酶、十一异戊烯-二磷酸-胞壁酰五肽β-N-乙酰葡糖胺基转移酶、十一异戊烯-磷酸-4-脱氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、尿苷激酶、UMP激酶、核苷-二磷酸激酶、多核糖核苷酸核苷酸转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶(非水解)、β-半乳糖苷酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、N-乙酰甘露糖胺激酶、推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰转移酶。
[0269] 第24项:第1-23项中任一项所述的方法,其中该方法包括以下步骤:a.)用核酸酶处理含有重组酶产物的细胞破碎粗溶解产物;b.)加入沉淀剂以与核酸复合;c.)进行液/固分离以从液相中除去细胞碎片和核酸/沉淀剂复合物;和d.)进行微滤步骤以除去残留的固体和/或高分子量组分。
[0270] 第25项:根据第1-24项中任一项所述制备的酶的制剂,其特征在于残留的DNA浓度为0.01ng/g-50ng/g、0.01ng/g-40ng/g、0.01ng/g-30ng/g、0.01ng/g-20ng/g、0.01ng/g-10ng/g、0.01ng/g-9ng/g、0.01ng/g-8ng/g、0.01ng/g-7ng/g、0.01ng/g-6ng/g、0.01ng/g-
5ng/g、0.01ng/g-4ng/g、0.01ng/g-3ng/g、0.01ng/g-2ng/g、0.01ng/g-1ng/g,更优选
0.01ng/g-0.9ng/g、0.01ng/g-0.8ng/g、0.01ng/g-0.7ng/g、0.01ng/g-0.6ng/g、0.01ng/g-
0.5ng/g、0.01ng/g-0.4ng/g、0.01ng/g-0.3ng/g、0.01ng/g-0.2ng/g,0.01ng/g-0.1ng/g,或最优选低于0.1ng/g,或最优选低于0.01ng/g。重组DNA浓度通过基于聚合酶链式反应的代表性DNA片段扩增的方法测定,所述代表性DNA片段包含长度为至少100个碱基对的重组DNA。使用来自生产宿主的总DNA制剂进行校准。
[0271] 第26项:根据第1-24项中任一项所述制备的酶的制剂,其中酶产物选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
[0272] 第27项:根据第1-24项中任一项所述制备的酶的制剂,其中酶产物选自:a.)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;b.)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和c.)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0273] 第28项:根据第1-24项中任一项制备的酶的制剂,其中酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0274] 第29项:重组细胞内表达的酶产物的酶制剂,其重组DNA浓度小于50ng/g,其含有生产宿主的至少3种不同的细胞内宿主细胞蛋白,所述蛋白占所述酶制剂的总蛋白含量的至少10%。
[0275] 第30项:根据第29项所述的酶制剂,其中生产宿主是大肠杆菌。
[0276] 第31项:根据第30项所述的酶制剂,其中酶制剂含有表达的酶产物,此外还含有可检测量的核酸酶,所述核酸酶与SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的核酸酶具有至少70%的同一性。
[0277] 第32项:根据第29-31项中任一项所述的酶制剂,其中重组酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶,优选选自醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、巯基氧化酶、氨基转移酶、糖基转移酶、磷酸化酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、腈水解酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、磷脂酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酯酶、鞣酸酶、脲酶、纤维素酶、脱羧酶和木糖异构酶。
[0278] 第33项:根据第29-32项中任一项所述的酶制剂,其中重组酶产物选自a.)碳水化合物修饰酶,例如糖基水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶;b.)氨基酸修饰酶、肽修饰酶或蛋白修饰酶,例如氨基转移酶、蛋白酶和肽酶;和c.)脂质修饰酶,例如脂肪酶或磷脂酶。
[0279] 第34项:根据第29-33项中任一项所述的酶制剂,其中重组酶产物是碳水化合物修饰酶,并且属于以下种类的酶中的至少一种:糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、海藻糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、糖基转移酶即UDP-糖基转移酶、葡糖基转移酶、蔗糖合成酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、乙酰葡糖胺转移酶或N-乙酰基-半乳糖基转移酶。
[0280] 以下实施例用于进一步说明本发明,但不应解释为限制其范围。
[0281] 实施例1-使用组合物I的重组酶产物的处理
[0282] 通过重组表达宿主LE1B109的生物质的均质化来制备源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的重组蔗糖合成酶(NCBI参考序列:NP_197583.1,SEQ ID NO:3)的粗细胞提取物,其中所述重组表达宿主LE1B109携带在表达质粒pLE1A27(已知载体pRSF-1b的衍生物)上编码的蔗糖合酶基因,并细胞内表达蔗糖合成酶。待均质化的生物质是通过浓缩被调节至生物量当量600g/L的发酵液而获得的浓缩细胞制剂。均化后,得到组合物I。
[0283] 将该组合物I分成单独的部分(fraction),其中按照指示的数字顺序,对每一部分独立地进行以下的对应于本发明的第一方面的方法步骤的工艺处理之一:
[0284]
[0285] 简而言之,对于第1部分,通过添加15mM MgCl2将组合物I稀释至终浓度为5mM MgCl2。将稀释的组合物I补充NuCLEANase(c-LEcta GmbH,Leipzig)至终浓度为200U/g-300U/g生物质当量,并在室温或25℃下温育6小时。将制剂稀释两倍,并补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的
最终浓度为0.1%-2%(w/v)。将制剂在室温下温育30分钟-90分钟。然后将溶液以12.000xg离心60分钟,以分离固相和液相。分离出液相并使用截留尺寸(cut-off)为0.1-0.8μm的深层过滤器(depth filter)在室温下进行微滤。然后将制剂与制备获得的所有其他部分一起用于如下所示的进一步分析。
[0286] 简而言之,对于第2部分,将组合物I稀释三倍,从而将组合物I调节至终浓度为5mM MgCl2。向该制剂补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最终浓度为0.1%-2%(w/v)。将制剂在室温下温育30分钟-90分钟。然后将溶液以12.000xg离心60分钟,以分离固相和液相。分离出液相并使用截留尺寸(cut-off)为0.1-0.8μm的深层过滤器(depth filter)在室温下进行微滤。然后将制剂与制备获得的所有其他部分一起用于如下所示的进一步分析。
[0287] 简而言之,对于第3部分,通过添加15mM MgCl2将组合物I稀释至终浓度为5mM MgCl2。向稀释的组合物I补充NuCLEANase(c-LEcta GmbH,Leipzig)至终浓度为200U/g-300U/mg生物质当量,并在室温或25℃下温育6小时。将制剂稀释两倍。然后将制剂以
12.000xg离心60分钟,以分离固相和液相。分离出液相并使用截留尺寸为0.1-0.8μm的深层过滤器在室温下进行微滤。然后将制剂与制备获得的所有其他部分一起用于如下所示的进一步分析。
[0288] 简而言之,对于第4部分,通过添加15mM MgCl2将组合物I稀释至终浓度为5mM MgCl2。将稀释的组合物I补充NuCLEANase(c-LEcta GmbH,Leipzig)至终浓度为200U/g-300U/mg生物质当量,并在室温或25℃下温育6小时。将制剂稀释两倍,并补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最
终浓度为0.1%-2%(w/v)。将制剂在室温下温育30分钟-90分钟。然后将溶液以12.000xg离心60分钟,以分离固相和液相。然后将制剂与制备获得的所有其他部分一起用于如下所示的进一步分析。
[0289] 简而言之,对于第5部分,将组合物I稀释三倍。向制剂补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最终浓度为0.1%-2%(w/v)。将制剂在室温下温育30分钟-90分钟。然后将溶液以12.000xg离心60分钟,以分离固相和液相。使用100mM MgCl2将液相调节至终浓度为5mM MgCl2,然后补充NuCLEANase(c-LEcta GmbH,Leipzig)至终浓度为200U/g-300U/mg生物质当量,并在室温或
25℃下温育6小时。分离出液相并使用截留尺寸为0.1-0.8μm的深层过滤器在室温下进行微滤。然后将制剂与制备获得的所有其他部分一起用于如下所示的进一步分析。
[0290] 简而言之,对于第6部分,将组合物I稀释三倍,从而将组合物I调节至终浓度为5mM MgCl2。向该制剂补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最终浓度为0.1%-2%(w/v)。将制剂在室温下温育30分钟-90分钟。然后将溶液以12.000xg离心60分钟,以分离固相和液相。分离出液相并使用截留尺寸为0.1-0.8μm的深层过滤器在室温下进行微滤。然后向液相补充NuCLEANase(c-LEcta GmbH,Leipzig)至终浓度为200U/g生物质当量-300U/mg生物质当量,并在室温或25℃下温育6小时。然后将制剂与制备获得的所有其他部分一起用于如下所示的进一步分析。
[0291] 根据相同的方案进一步处理由第1部分-第6部分获得的所有酶制剂,以调节最终的制剂体积,以确保可进行比较分析。处理是通过对样品执行超滤步骤(使用30kDa的排阻尺寸)并进行约5-10倍的浓缩至达到所有部分(fraction)的调整体积来完成的。或者,通过冷冻干燥相当体积量的每一部分,并将冻干物重新溶解在适于随后的DNA和活性分析的相同体积的缓冲液中来处理由第1部分-第6部分获得的获得的酶制剂。
[0292] 使用PCR技术对由经处理的第1部分-第6部分获得的最终重组酶制剂进行DNA检测,其中两个寡核苷酸引物针对微生物宿主DNA。
[0293] 此外,使用耦合分光光度测定法(coupled photometric assay)分析从各个部分的处理过程获得的中间体制剂或最终制剂的重组酶制剂的酶活性,所述耦合分光光度测定法测得通过蔗糖合成酶将蔗糖非水解分解为果糖和UDP-活化的葡萄糖(UDP-葡萄糖)。在与己糖激酶(HK)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6P-DH)的偶联反应中检测到形成的果糖。通过在340nm处的光度检测来测量在G6P-DH反应中形成的NADPH。
[0294] 结果显示在下表中:
[0295]
[0296] 从上述结果可看出,第1部分的工艺处理优于其他的工艺处理。
[0297] 实施例2-野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)的蔗糖合酶的表达和制剂[0298] 将编码野生型拟南芥的蔗糖合酶(NCBI参考序列:NP_197583.1,SEQID NO:3)的基因克隆到表达载体pLE1A17(pRSF-1b的衍生物,Novagen)中。所得质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
[0299] 在补充有卡那霉素(50mg/l)的ZYM505培养基(F.William Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207-234)中,在37℃下对细胞进行培养。通过IPTG(0.2mM)在对数期诱导基因的表达,并在30℃和200rpm下进行16-18小时。
[0300] 通过离心(3220xg,20分钟,4℃)收获细胞,并用细胞溶解缓冲液(100mm Tris-HCl pH 7.0;2mm MgC12,DNA核酸酶20U/mL,溶菌酶0.5mg/ml)重新悬浮至光密度200(在600nm(OD600)处测量)。然后通过超声处理破碎细胞。然后在制剂中补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最终浓度为0.1%-2%(w/v)。通过离心(18000xg 40分钟,4℃)将粗提物与细胞碎片分离。通过0.2μm过滤器过滤将上清液灭菌,得到酶活性制剂。
[0301] 实施例3-野生型番茄(Solanum lycopersicum)的UDP-糖基转移酶的表达和制剂[0302] 将编码野生型番茄(UGTSL2)的UDP-糖基转移酶(GenBank登录号XP_004250485.1,SEQ ID NO:5)的基因克隆到表达载体pLE1A17(pRSF-1b的衍生物,Novagen)中。所得质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
[0303] 在补充有卡那霉素(50mg/l)的ZYM505培养基(F.William Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207-234)中,在37℃下对细胞进行培养。通过IPTG(0.1mM)在对数期诱导基因的表达,并在30℃和200rpm下进行16-18小时。
[0304] 通过离心(3220xg,20分钟,4℃)收获细胞,并用细胞溶解缓冲液(100mM Tris-HCl pH7.0;2mM MgCl2,DNA核酸酶20U/mL,溶菌酶0.5mg/mL)重新悬浮至光密度200(在600nm(OD600)处测量)。然后通过超声处理破碎细胞。然后在制剂中补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最终浓度为0.1%-2%(w/v)。通过离心(18000xg 40分钟,4℃)将粗提物与细胞碎片分离。通过0.2μm过滤器过滤将上清液灭菌,得到酶活性制剂。
[0305] 实施例4-野生型甜叶菊(Stevia rebaudiana)的糖基转移酶的表达和制剂
[0306] 将编码野生型甜叶菊(UGT76G1)的糖基转移酶(GenBank登录号AAR06912.1 SEQ ID NO:4)的基因克隆到表达载体pLE1A17(pRSF-1b的衍生物,Novagen)中。所得质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
[0307] 在补充有卡那霉素(50mg/l)的ZYM505培养基(F.William Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207-234)中,在37℃下对细胞进行培养。通过IPTG(0.1mM)在对数期诱导基因的表达,并在30℃和200rpm下进行16-18小时。
[0308] 通过离心(3220xg,20分钟,4℃)收获细胞,并用细胞溶解缓冲液(100mM Tris-HCl pH7.0;2mM MgCl2,DNA核酸酶20U/mL,溶菌酶0.5mg/mL)重新悬浮至光密度200(在600nm(OD600)处测量)。然后通过超声处理破碎细胞。在制剂中补充适当的沉淀剂(选自聚乙烯亚胺 或 系列的任何带正电荷的沉淀剂),至制剂中的最终浓度为0.1%-2%(w/v)。通过离心(18000xg 40分钟,4℃)将粗提物与细胞碎片分离。通过0.2μm过滤器过滤将上清液灭菌,得到酶活性制剂。
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